CN110243970A

CN110243970A - 一种同时测定半夏中7种有机酸的hplc方法

Info

Publication number: CN110243970A
Application number: CN201910577492.3A
Authority: CN
Inventors: 李敏; 敬勇; 赖月月; 陈华林; 刘佳灵; 李巧
Original assignee: Chengdu University of Traditional Chinese Medicine
Current assignee: Chengdu University of Traditional Chinese Medicine
Priority date: 2019-06-28
Filing date: 2019-06-28
Publication date: 2019-09-17
Anticipated expiration: 2039-06-28
Also published as: CN110243970B

Abstract

本发明提供了一种同时测定半夏中4种有机酸(草酸、L‑苹果酸、枸橼酸和富马酸)的HPLC方法，该方法还能同时检测另外3种有机酸(琥珀酸、顺式乌头酸和反式乌头酸)。本发明的半夏HPLC检测方法，能同时测定半夏药材中的多种有机酸成分，且操作简单，灵敏度高，专属性好，准确度高，可以有效地评价半夏药材的质量。

Description

一种同时测定半夏中7种有机酸的HPLC方法

技术领域

本发明属于中药分析技术领域，具体涉及一种同时测定半夏中7种有机酸的HPLC方法。

背景技术

半夏来源于天南星科半夏属植物半夏Pinellia ternata(Thunb.)breit.的干燥块茎，其在全国大部分地区均有分布，主产于甘肃、四川、贵州、湖北、山西、河北、山东等地，以粒个大、粒圆、皮净、色白、质坚实、粉性足，无花、麻、油子者为佳。半夏在临床上主要以汤剂入药，用于痰多咳喘，痰饮眩悸，风痰眩晕，痰厥头痛，呕吐反胃，胸腕痞闷，梅核气；生用外治痈肿痰核。半夏化学成分复杂，具有多种活性成分，现代药理研究表明，半夏中含有的总游离有机酸具有止咳、祛痰、体外抑制肿瘤细胞的作用。

关于半夏药材及其制剂的成分含量测定已有许多报道，但只是测定其中的2～4种成分。众所周知中药的多效性源于其复杂的化学成分，仅靠一两个成分的含量测定不能反映其他成分的情况，难以真正控制其质量。选择更多的成分作为指标进行质量控制研究，更能合理、全面评价半夏药材质量。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一种同时测定半夏药材中4种有机酸：草酸、L-苹果酸、枸橼酸和富马酸的HPLC方法。

本发明的半夏中有机酸的HPLC测定方法，包括如下操作步骤：

1)对照品溶液制备：取对照品，溶解，即得对照品溶液；

2)供试品溶液制备：取半夏药材，提取，即得供试品溶液；

3)分别吸取对照品溶液和供试品溶液注入高效液相色谱仪，色谱条件如下：

色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；检测波长：190～260nm；流动相：乙腈为流动相A，0.1％磷酸溶液-甲醇-乙腈为流动相B；梯度洗脱程序如下：

其中，步骤1)所述对照品包括：草酸、L-苹果酸、枸橼酸和富马酸对照品。

更进一步地，该方法还能同时检测另外3种有机酸：琥珀酸、顺式乌头酸和反式乌头酸。

其中，步骤1)所述溶解是加入水溶解。

其中，步骤2)所述提取是指：加入水，超声提取，离心，取上清液，加入乙酸乙酯萃取。

其中，步骤2)所述提取方法如下：

取半夏药材，加入药材25～200w/v(g/mL)倍的水，超声提取30～90min，放冷，用水补足减失的质量，滤过或离心(10000r/min，离心5min，取上层清液再离心一次)，精密量取清液5mL，加磷酸(或盐酸)后，摇匀，用乙酸乙酯萃取5次，合并乙酸乙酯，减压浓缩至干，残渣加0.1％磷酸溶液使溶解，并定容，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

进一步地，所述提取方法如下：

取半夏药材粉末(过四号筛)0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入药材25w/v(g/mL)倍的水，称定质量，超声提取60min，放冷，用水补足减失的质量，滤过或离心(10000r/min，离心5min，取上层清液再离心一次)，精密量取上清液5mL，加磷酸(或盐酸)0.5mL，摇匀，用乙酸乙酯萃取5次，每次25mL，合并乙酸乙酯，减压浓缩至干，残渣加0.1％磷酸溶液使溶解，并定容至5mL，摇匀，滤过，取续滤液，过0.45μm微孔滤膜，即得供试品溶液。

其中，所用色谱柱为Intersil ODS-3 C₁₈色谱柱；规格为4.6mm×250mm，5μm。

其中，所述检测波长为210nm。

其中，所述流动相B中0.1％磷酸溶液、甲醇、乙腈比例为99:0.5:0.5。

其中，所述色谱条件还包括：

流速为0.5mL/min；和/或，柱温为25℃；和/或，进样量为20μL。

本发明的半夏的HPLC检测方法，能同时定量测定半夏药材中的7种成分，且本法操作简单，灵敏度高，专属性好，准确度高，可以有效地评价半夏药材的质量。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1A供试品HPLC图，1.草酸，2.L-苹果酸，3.枸橼酸，4.琥珀酸，5.富马酸，6.顺式乌头酸，7.反式乌头酸

图1B对照品HPLC图，1.草酸，2.L-苹果酸，3.枸橼酸，4.琥珀酸，5.富马酸，6.顺式乌头酸，7.反式乌头酸

具体实施方式

仪器与试药

1、仪器：安捷伦1200高效液相色谱仪(DAD检测器)；电子天平(赛多利斯科学仪器有限公司)；水浴锅(北京中兴伟业仪器有限公司)；旋转蒸发仪(德国Heldolph)；循环水式多用真空泵；离心机(美国Beckmancoulter)。

2、试药：对照品：草酸(批号101097-201101)，L-苹果酸(批号190014-201302)，枸橼酸(批号1003396-201302)，富马酸(批号111541-201102，纯度99.4％)，以上对照品均购于中国食品药品检定研究院；琥珀酸(批号wkq16081104，纯度≥98％)购于维克奇生物科技有限公司；顺式乌头酸、反式乌头酸均购于成都中科微大科技有限公司，纯度＞98％。甲醇、乙腈、磷酸为色谱纯，水为超纯水，其他为分析纯。16批半夏药材从四川、甘肃、贵州、湖北、河北、山西、重庆等地收集。

实施例1半夏药材的定量测定方法

1、对照品溶液制备：分别精密称取草酸、L-苹果酸、枸橼酸、琥珀酸、富马酸、顺式乌头酸、反式乌头酸对照品适量，加水制成每1mL含草酸200μg、L-苹果酸100μg、枸橼酸200μg、琥珀酸200μg、富马酸5μg、顺式乌头酸10μg、反式乌头酸10μg的混合对照品溶液。

2、供试品溶液制备：取样品粉末(过四号筛)约0.5g，精密称定，加水50mL，称定重量，超声处理60min，放冷，再称定重量，用水补足减失的重量，滤过或离心(10000r/min，离心5min，取上层清液再离心一次)，精密量取上清液5mL，加磷酸1mL，摇匀，用乙酸乙酯萃取5次，每次25mL，合并乙酸乙酯，减压浓缩至干，残渣加0.1％磷酸溶液使溶解，并定容至5mL，滤过，取续滤液，作为供试品溶液。

3、分别吸取对照品溶液和供试品溶液各20μL，注入高效液相色谱仪，色谱条件如下：色谱柱为Intersil ODS-3 C₁₈色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)；以乙腈为流动相A，0.1％磷酸溶液-甲醇-乙腈(99:0.5:0.5)为流动相B进行梯度洗脱；流速0.5mL/min；柱温25℃；检测波长为210nm；梯度洗脱如下：

4、绘制标准曲线：以对照品峰面积为纵坐标(Y)，以对照品浓度X(μg/mL)为横坐标。根据标准曲线，分别计算供试品中草酸、L-苹果酸、枸橼酸、琥珀酸、富马酸、顺式乌头酸、反式乌头酸的含量。供试品高效液相色谱图参见图1A，对照品高效液相色谱图参见图1B。

实施例2半夏药材含量测定方法的方法学考察

1、线性关系考察：精密吸取实施例1中的混合对照品溶液，加水稀释成系列不同浓度的混合对照品溶液，进样20μL，进行测定，记录色谱图，测定其峰面积，并以对照品浓度(μg/mL)为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)绘制标准曲线，得回归方程，结果见表1。

表1线性关系考察结果

结果显示草酸、L-苹果酸、枸橼酸、琥珀酸、富马酸、顺式乌头酸、反式乌头酸对照品线性范围良好。

2、精密度试验：精密吸取混合对照品溶液，按实施例1中的色谱条件重复进样6次，测定峰面积。草酸、L-苹果酸、枸橼酸、琥珀酸、富马酸、顺式乌头酸、反式乌头酸峰面积的RSD范围为0.19％～1.85％，表明仪器精密度良好。

3、稳定性试验：精密吸取同一份供试品溶液，分别于制备后0h、2h、4h、8h、16h、24h进样，按实施例1中的色谱条件测定峰面积。草酸、L-苹果酸、枸橼酸、琥珀酸、富马酸、顺式乌头酸、反式乌头酸峰面积的RSD范围为0.79％～2.44％，结果表明供试品溶液在室温下24h稳定。

4、重复性试验：取药材粉末6份，按实施例1中的供试品溶液制备方法制备，按实施例1中的色谱条件进行测定，结果草酸、L-苹果酸、枸橼酸、琥珀酸、富马酸、顺式乌头酸、反式乌头酸质量分数的RSD范围为1.61％～3.82％，表明该方法重复性良好。

5、加样回收率试验：取样品粉末(过4号筛)6份，每份约0.25g，精密称定，分别加入混合对照品溶液，按实施例1中供试品溶液制备方法制备，根据测得量和加入量计算各成分的加样回收率和RSD，结果草酸、L-苹果酸、枸橼酸、琥珀酸、富马酸、顺式乌头酸、反式乌头酸的平均回收率为105.3％、95.2％、99.0％、98.5％、86.8％、93.3％、96.8％。

实施例3半夏样品的含量测定

取半夏样品粉末(过4号筛)0.5g，精密称定，按实施例1中的方法制备供试品溶液，按实施例1中的色谱条件对7种有机酸进行定量分析，测定各成分的峰面积，代入回归方程计算各有机酸的含量，结果见表2。

表2 16批半夏中7种有机酸含量测定结果(n＝2)

综上，本发明的半夏药材HPLC检测方法，不仅能同时检测半夏药材中的4种有机酸成分：草酸、L-苹果酸、枸橼酸和富马酸，还能同时检测另外3种有机酸：琥珀酸、顺式乌头酸和反式乌头酸。该发明方法灵敏度高、专属性好、准确、简便，可以有效地评价半夏药材的质量，为半夏药材的质量控制、物质基础等研究奠定了基础。

Claims

1.一种同时测定半夏中4种有机酸的HPLC方法，其特征在于：它包括如下操作步骤：

1)对照品溶液制备：取对照品，溶解，即得对照品溶液；

2)供试品溶液制备：取半夏药材，提取，即得供试品溶液；

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤1)所述对照品包括：草酸、L-苹果酸、枸橼酸和富马酸对照品。

3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：该检测方法还能同时检测另外3种有机酸：琥珀酸、顺式乌头酸、反式乌头酸。

4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤1)所述溶解是加入水溶解。

5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤2)所述提取是指：加入水，超声提取，滤过或离心，取清液，酸化，加入乙酸乙酯萃取。

6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤2)所述提取方法如下：

取半夏药材，加入药材25～200w/v(g/mL)倍的水，超声提取30～90min，放冷，用水补足减失的质量，滤过或离心，取清液加磷酸(或盐酸)，摇匀，用乙酸乙酯萃取5次，合并乙酸乙酯，减压浓缩至干，残渣加0.1％磷酸溶液使溶解，并定容，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

7.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于：所述提取方法如下：

取半夏药材粉末(过四号筛)0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入药材100w/v(g/mL)倍的水，称定质量，超声提取60min，放冷，用水补足减失的质量，滤过或离心(10000r/min，离心5min，取上层清液再离心一次)，精密量取清液5mL，加磷酸(或盐酸)0.5mL，摇匀，用乙酸乙酯萃取5次，每次25mL，合并乙酸乙酯，减压浓缩至干，残渣加0.1％磷酸溶液使溶解，并定容至5mL，摇匀，滤过，取续滤液，过0.45μm微孔滤膜，即得供试品溶液。

8.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所用色谱柱为Intersil ODS-3 C₁₈色谱柱；规格为4.6mm×250mm，5μm。

9.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述检测波长为210nm。

10.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述流动相B中0.1％磷酸溶液、甲醇、乙腈比例为99:0.5:0.5。

11.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述色谱条件还包括：流速为0.5mL/min；和/或，柱温为25℃；和/或，进样量为20μL。