CN117491522B - 一种n-羟基琥珀酰亚胺残留量的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于分析检测技术领域，具体涉及一种N‑羟基琥珀酰亚胺残留量的检测方法；采用色谱柱为Ultimate AQ‑C18，柱温为25‑35℃；流动相为磷酸水溶液；本发明针对小分子NHS极性大，优选了色谱柱，并结合控制柱温，提高了仪器使用效率，缩短了数据采集以及分析时间，提高了检测效率；同时创造性的选择磷酸水溶液为流动相，具备极性大、与NHS结合能力强、稳定性高的优势，而且其配制简单，洗脱更加方便。进一步结合优化流动相pH、流速、进样体积等参数，设计了针对NHS残留量检测的整体化方案，出峰时间合适、稳定，样品峰和溶剂峰分离度好，实现了高效、精准检测，检测精度可达10‑2ng/mL，应用前景广阔。
Description
技术领域
本发明属于分析检测技术领域，具体涉及一种N-羟基琥珀酰亚胺残留量的检测方法。
背景技术
N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，白色至类白色结晶，用于合成氨基酸保护剂、半合成卡那霉素及医药中间体；N-羟基琥珀酰亚胺作为一种重要的有机合成中间体，在医药生产领域中应用非常广泛，同时也可以用于合成丁胺卡那霉素、放射性药物的标记、制造生物医学材料。此外，NHS也是一种生物相容性较好的新型交联剂，可用作胶原、明胶等三维网状结构的生成，其交联效率高，交联较为稳定，毒性低，近年来越来越受到关注。
交联工艺完成后，交联剂本身的残留定量检测是个亟待解决的技术难题；目前NHS残留含量的检测方法并不成熟，如反相色谱法和体积排阻色谱法，发现均不能满足检测需求；即便也有文献报道利用高效液相色谱法实现了NHS的检测，但是也往往面临操作繁琐、检测精度不高等技术问题。因此，亟需研究一种高效、精准的NHS残留检测方法。
发明内容：
针对现有技术的不足，本发明旨在解决所述问题，提供一种N-羟基琥珀酰亚胺残留量的检测方法，通过优化流动相、色谱柱、柱温、流速等，设计了针对N-羟基琥珀酰亚胺残留量检测的整体化方案，显著提升了检测精度，实现了NHS残留的高效、精准检测。
为实现上述目的，本发明的具体方案如下：
一种N-羟基琥珀酰亚胺残留量的检测方法，采用色谱柱为Ultimate AQ-C18，色谱柱的柱温为25-35℃；流动相为0.05％-0.15％磷酸水溶液，pH为2-3；流速为0.3-0.7ml/min，检测波长为208-210nm；进样体积15μL-20μL；记录时间为20-40min；
优选的，所述色谱柱的直径为4.6mm，长为250mm，粒径为5μm。
优选的，磷酸水溶液的浓度为0.1％，pH为2.12。
优选的，流速为0.5ml/min。
优选的，色谱柱柱温为30℃。
优选的，进样体积15μL。
优选的，记录时间为20min。
本发明所述方案包括配制NHS的对照品溶液和供试品溶液；
(1)NHS的对照品(标准品)溶液的制备：
精密称定NHS，加水溶解，并稀释为一系列梯度浓度的稀释液，最后经微孔滤膜滤过，得到NHS的对照品溶液。
(2)供试品溶液的制备：
取供试品加入水中溶解，得到溶液记为混合溶液A；其中供试品与水的用量比为1-3g:10ml，对混合溶液A称重记为M1，再经25-50℃加热1-24小时后，冷却至室温，再次称定重量记为M2，然后用纯水补足减失的重量，即M1-M2；摇匀，经离心取上清液用微孔滤膜滤过，即得供试品溶液。
优选的，步骤(1)中稀释液的浓度范围为0.02μg/ml-2μg/ml(本发明取值范围0.03125μg/ml-2μg/ml)。
优选的，步骤(1)中微孔滤膜的孔径为0.22μm。
优选的，步骤(2)中，供试品与水的用量比为2g：10ml。
优选的，步骤(2)中，加热的温度为37℃，加热时间为2h。
优选的，步骤(2)中，离心的条件为：8000转，离心10-15分钟。
所述方案还包括如下步骤：
首先将NHS的对照品溶液注入色谱仪，记录色谱图，以NHS对照品溶液的浓度对应其相应的峰面积作直线回归，绘制NHS的标准曲线；然后将供试品溶液按照与对照品溶液相同的条件进行HPLC检测，根据标准曲线确定供试样中NHS的含量。
注：以NHS对照品溶液的浓度对应其相应的峰面积作直线回归，求得直线回归方程，计算出供试品溶液中NHS含量(μg/g)。
(1)供试品NHS残留量(μg/g)＝供试品溶液NHS的平均浓度×稀释倍数。
(2)直线回归相关系数应不低于0.99。
本发明具备如下有益效果：
(1)本发明针对小分子NHS极性大，选择色谱柱为Ultimate AQ-C18，直径为4.6mm，长为250mm，粒径为5μm；其系统适应性好，提高了仪器使用效率，缩短了数据采集以及数据分析时间，在很大程度上提高了实验效率，更有利于NHS的分析检测。
(2)本发明通过优化，创造性的选择磷酸水溶液(0.1％)为流动相，其极性大，与NHS结合能力强；而且其配制简单，在使用过程中更加稳定，洗脱更加方便，有利于仪器的维护。
(3)本发明合理优化了色谱柱柱温(30℃)、流速(0.5ml/min)、进样体积(15μL)等条件，使得出峰时间合适、稳定，样品峰和溶剂峰分离度好，检测精度可达10-2ng/mL。
(4)本发明通过优化流动相、色谱柱、柱温、流速等参数，设计了针对N-羟基琥珀酰亚胺残留量检测的整体化方案，实现了NHS残留的高效检测，具有良好的应用前景。
附图说明
图1中a、b、c分别为稀释剂、NHS对照品溶液和供试品溶液的色谱图；d为NHS对照品标准品光谱图；e为供试品溶液光谱图。
图2为在流动相条件1情况下的色谱图；其中a、b、c分别为稀释剂、NHS对照品溶液和供试品溶液。
图3为在流动相条件2情况下的色谱图；其中a、b、c分别为稀释剂、NHS对照品溶液和供试品溶液。
图4为在流动相条件3情况下的色谱图；其中a、b、c分别为稀释剂、NHS对照品溶液和供试品溶液。
图5为在色谱柱条件1情况下的色谱图；其中a、b分别为NHS对照品溶液和供试品溶液。
图6为在色谱柱条件2情况下的色谱图；其中a、b分别为NHS对照品溶液和供试品溶液。
图7为在流动相为0.1％磷酸水溶液情况下的色谱图；其中a、b分别为NHS对照品溶液和供试品溶液。
图8为在流动相为0.1％三氟乙酸水溶液情况下的色谱图；其中a、b分别为NHS对照品溶液和供试品溶液。
图9为在流动相为0.1％乙酸水溶液情况下的色谱图；其中a、b分别为NHS对照品溶液和供试品溶液。
图10为在流动相为0.5％磷酸水溶液情况下的色谱图；其中a、b分别为NHS对照品溶液和供试品溶液。
图11为在流动相为0.1％磷酸水溶液情况下的色谱图；其中a、b分别为NHS对照品溶液和供试品溶液。
图12为在流动相为0.15％磷酸水溶液情况下的色谱图；其中a、b分别为NHS对照品溶液和供试品溶液。
图13为在柱温25℃情况下的色谱图；其中a、b分别为NHS对照品溶液和供试品溶液。
图14为在柱温30℃情况下的色谱图；其中a、b分别为NHS对照品溶液和供试品溶液。
图15为在柱温35℃情况下的色谱图；其中a、b分别为NHS对照品溶液和供试品溶液。
图16为在流速0.3ml/min情况下的色谱图；其中a、b分别为NHS对照品溶液和供试品溶液。
图17为在流速0.5ml/min情况下的色谱图；其中a、b分别为NHS对照品溶液和供试品溶液。
图18为在流速0.7ml/min情况下的色谱图；其中a、b分别为NHS对照品溶液和供试品溶液。
图19为在进样量10μL情况下的色谱图；其中a、b分别为NHS对照品溶液和供试品溶液。
图20为在进样量15μL情况下的色谱图；其中a、b分别为NHS对照品溶液和供试品溶液。
图21为在进样量20μL情况下的色谱图；其中a、b分别为NHS对照品溶液和供试品溶液。
图22为在不同提取溶剂情况下的色谱图；其中a、b分别为稀释剂和NHS对照品溶液，c为乙酸乙酯(峰1：NHS)，d为正丁醇(峰1：NHS)；e为纯水(峰1：NHS)。
图23为在不同提取条件(加热或超声)情况下的色谱图；其中a、b分别为稀释剂和NHS对照品溶液，c为加热0.5小时；d为超声0.5小时。
图24为在不同提取时间情况下的色谱图；其中a、b分别为稀释剂和NHS对照品溶液；c为加热0.5小时；d为加热1小时；e为加热2小时；f为加热4小时；g为加热24小时；h为加热36小时；i为加热72小时。
图25为在不同料液比情况下的色谱图；其中a、b分别为稀释剂和NHS对照品溶液；c为料液比1:10；d为料液比2:10；e为料液比3:10。
图26为在不同提取温度情况下的色谱图；其中a、b分别为稀释剂和NHS对照品溶液；c为温度25℃；d为温度37℃；e为温度50℃。
图27为为确定标准品浓度的色谱图；其中a、b、c分别为稀释剂、NHS对照品溶液和供试品溶液的色谱图。
图28为专属性验证情况下的色谱图；其中a、b、c分别为稀释剂、NHS对照品溶液和供试品溶液的色谱图。
图29为NHS的回归方程。
图30为检测限与定量限的色谱图；其中a、b、c分别为稀释剂、检测限和定量限的色谱图。
图31为人员精密度色谱图；其中a、b分别为稀释剂和NHS对照品溶液；c为甲提取供试品；d为乙提取供试品；e为丙提取供试品。
图32为流速耐用性色谱图；其中a为稀释剂，b为0.4ml/min，c为0.5ml/min，d为0.6ml/min。
图33为柱温耐用性色谱图；其中a为稀释剂，b为25℃，c为30℃，d为35℃。
图34为色谱柱耐用性色谱图；其中a为稀释剂，b为色谱柱1；c为色谱柱2；d为色谱柱3。
图35为不同型号色谱柱耐用性色谱图；其中a为稀释剂，b：Waters2695；c：Agilent1260；d：Aglient1290。
图36为加样回收试验色谱图；其中a、b、c分别为稀释剂、NHS对照品溶液和供试品溶液的色谱图；d为80％准确度溶液；e为100％准确度溶液；f为120％准确度溶液。
具体实施方式：
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述；在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。
1仪器与试药
1.1仪器
高效液相色谱仪：安捷伦1290系列包括VWD测器；安捷伦1260系列包括DAD测器；Waters 2695/2998；电子分析天平：Sartorius BSA224S，PRACTUM224-1CN；电子分析天平：Sartorius BSA224S，SECURA225D-1CN；数控超声波清洗器：KQ-5200E(功率52W，频率40KHz)；HH-1数显恒温水浴锅；Milli-Q超纯水设备；3500型久保田离心机。
色谱柱：(1)Ultimate AQ-C18(4.6mm×250mm，5um)，(2)HP-C18(4.6*250mm，5μm120A)，(3)ZORBAX SB-C18(4.6*150mm 5-Micron)。
1.2试剂
N-羟基琥珀酰亚胺作为对照品(批号：RH388680，纯度为：99.57％，上海融禾医药科技有限公司)；甲醇、甲酸、乙酸、磷酸为色谱纯；水为超纯水；正定醇；乙酸乙酯等其余试剂均为分析纯。
1.3供试品
以重组胶原蛋白植入剂作为供试品；本发明具体选择为重组Ⅲ型人源化胶原蛋白，来源于江苏创健医疗科技股份有限公司。
注：本实施例选择重组Ⅲ型人源化胶原蛋白作为具体实施呈现，但本发明不局限于此样品，使用N-羟基琥珀酰亚胺作为交联剂获得的重组胶原蛋白均可对此进行等同替换。
2色谱条件建立
2.1波长的选择
对照品溶液制备：精密称取NHS对照品适量，加纯水制成1μg/mL的溶液，用微孔滤膜(0.22μm)滤过，即得到NHS对照品溶液。
供试品溶液制备：参考GB/T 16886标准，取供试品0.2g，精密称定，加水1mL，称重记为M1，37℃加热72小时后，放冷，再称定重量记为M2，用纯水补足减失的重量(M1-M2)，摇匀，以8000转离心15分钟，取上清液用微孔滤膜(0.22μm)滤过，即得到供试品溶液。
操作：取稀释剂(纯水)、NHS对照品溶液和供试品溶液注入15μL至液相中，以纯水为对照进行190～460nm的全波长扫描。
图1中a、b、c分别为稀释剂、NHS对照品溶液和供试品溶液的色谱图；d为NHS对照品标准品光谱图；e为供试品溶液光谱图；结合图表和数据分析可以看出，在全波长扫描模式下分别比较对照品和供试品色谱图中目标峰的光谱图，如图所示两者光谱图一致，峰值在208-212nm区间，选择最优检测波长为210nm。
2.2流动相的条件
取供试品与NHS对照品注入15μL至液相中，考察了不同流动相的分离效果。试剂说明：流动相A为0.1％磷酸水溶液，流动相B为甲醇；
表2-1流动相条件1
表2-2流动相条件2
表2-3流动相条件3
表2-4流动相考察结果
图2-图4分别为在流动相条件1、2、3情况下的色谱图；其中a、b、c分别为稀释剂、NHS对照品溶液和供试品溶液。
结果分析：结合图表和数据分析可以看出，在流动相条件3测得色谱图基线较稳定，目标峰与其他色谱峰分离效果较好，且系统适应性参数更优，因此选择流动相3为NHS残留量测定方法流动相。
2.3色谱柱的选择
取供试品与标准品注入15μL至液相中，以0.1％磷酸水为流动相，流速为每分钟0.5ml，记录时间为20分钟。分别以(1)Ultimate AQ-C18(4.6mm×250mm，5um)，(2)ZORBAXSB-C18(4.6*150mm 5-Micron)为色谱柱在210波长处测定分析，以确定适宜色谱柱。
表2-5色谱柱考察结果
图5-图6分别为在色谱柱条件1、2情况下的色谱图；其中a、b分别为NHS对照品溶液和供试品溶液。
结合图表和数据分析可以看出，色谱柱1测得色谱峰分离效果较好，且测得供试品中NHS含量明显较高，因此选择色谱柱1为NHS残留量测定方法色谱柱。
2.4流动相酸的种类选择
分别以0.1％磷酸水溶液(pH:2.12)、0.1％三氟乙酸水溶液(pH:1.98)、0.1％乙酸水溶液(pH:3.22)为流动相；
按表2-2进行梯度洗脱，取标准品溶液和供试品进样分析，以确定适宜的流动相酸的种类。
表2-6流动性酸的种类考察结果
图7-图9分别为在流动相分别为0.1％磷酸水溶液、0.1％三氟乙酸水溶液、0.1％乙酸水溶液情况下的色谱图；其中a、b分别为NHS对照品溶液和供试品溶液。结合表2-6表明，流动相酸的种类为0.1％磷酸水溶液时，色谱系统适应性参数较好，故选择磷酸作为流动相的酸。
2.5流动相浓度的选择
分别以0.05％磷酸水溶液(pH:2.31)、0.1％磷酸水溶液(pH:2.12)、0.15％磷酸水溶液(pH:2.03)为流动相，按表2-2进行梯度洗脱，取对照品溶液和供试品溶液进样分析，确定适宜的流动相酸的浓度。
表2-7流动性酸的比例考察结果
图10-图12分别为在流动相为0.5％、0.1％、0.15％磷酸水溶液情况下的色谱图；其中a、b分别为NHS对照品溶液和供试品溶液。结合图表和数据分析可以看出，流动相酸的比例为0.1％磷酸水溶液时，色谱系统适应性参数较好，故选择0.1％磷酸水溶液作为流动相最终浓度。
2.6柱温考察
精密量取供试品，考察柱温为25℃、30℃、35℃时进样分析，以确定适宜的柱温。
表2-8柱温考察结果
图13-图15分别为在柱温25℃、30℃、35℃情况下的色谱图；其中a、b分别为NHS对照品溶液和供试品溶液。结合图表和数据分析可以看出，色谱柱柱温为30℃时，色谱系统适应性参数最好，且测得供试品中NHS含量最高，效果最为突出，故选择30℃作为色谱柱的柱温。
2.7流速考察
精密量取供试品，考察流速为0.3、0.5、0.7ml/min时，对测得的高效液相色谱图中所呈现的色谱峰的数目、分离度、峰对称性、信噪比、拖尾因子、理论塔板数等进行比较，以确定适宜的流速。
表2-9流速考察结果
图16-图18为在流速0.3ml/min、0.5ml/min、0.7ml/min情况下的色谱图；其中a、b分别为NHS对照品溶液和供试品溶液。
结合图表和数据分析可以看出，流速为0.5ml/min时，色谱系统适应性参数最好，且测得供试品中NHS含量较高，故选择0.5ml/min作为流动相的流速。
2.8进样体积
精密量取供试品，考察进样体积为10μL、15μL、20μL时，比较含量差异选择最佳进样量。
表2-10进样体积考察结果
图19-图21分别为在进样量10μL、15μL、20μL情况下的色谱图；其中a、b分别为NHS对照品溶液和供试品溶液。结合图表和数据分析可以看出，结合图表和数据分析可以看出，进样量为15μL色谱系统适应性参数较好，且测得供试品中NHS含量较高，故选择进样量15μL。
最终色谱条件确认：
综合以上实验数据，确定参数条件如下：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以0.1％磷酸水为流动相，流速为每分钟0.5ml，柱温30℃，检测波长为210nm，记录时间为20分钟。
3提取方法的建立
3.1提取溶剂选择
取供试品，考察不同溶剂纯水、乙酸乙酯、正丁醇对NHS浸提效果的影响。
表3-1提取溶剂考察结果
表3-2提取溶剂考察系统适应性参数
图22为在不同提取溶剂情况下的色谱图；其中a、b分别为稀释剂和NHS对照品溶液，c为乙酸乙酯(峰1：NHS)，d为正丁醇(峰1：NHS)；e为纯水(峰1：NHS)；结合表3-1、表3-2的数据分析可以看出，提取溶剂为纯水时，色谱系统适应性参数最好，且测得供试品中NHS含量较高，故选用纯水提取。
3.2提取方法选择
精密量取供试品，考察37℃加热0.5小时和超声0.5小时两种不同提取方式对NHS提取效果的影响。
表3-3提取方法考察结果
表3-4提取方法考察系统适应性参数
图23为在不同提取条件(加热或超声)情况下的色谱图；其中a、b分别为稀释剂和NHS对照品溶液，c为加热0.5小时；d为超声0.5小时；结合表3-3、表3-4结合图表的数据分析可以看出，提取方法为加热0.5小时的色谱系统适应性参数较好，且测得供试品中NHS含量较高，故选用提取方法为加热0.5小时。
3.3提取时间选择
精密量取供试品，考察不同提取时间为0.5小时、1小时、2小时、4小时、24小时、36小时、72小时，对NHS提取效果的影响。
表3-5提取时间考察结果
表3-6提取时间考察系统适应性参数
图24为在不同提取时间情况下的色谱图；其中a、b分别为稀释剂和NHS对照品溶液；c为加热0.5小时；d为加热1小时；e为加热2小时；f为加热4小时；g为加热24小时；h为加热36小时；i为加热72小时；结合表3-5、表3-6的数据分析可以看出，提取时间为2小时的色谱系统适应性参数较好，且测得供试品中NHS含量较高，故选用提取时间为2小时。
3.4料液比选择
精密量取供试品，考察不同料液比(g/ml)1:10、2：10、3：10时，对NHS提取效果的影响。
表3-7料液比考察结果
表3-8料液比考察系统适应性参数
图25为在不同料液比情况下的色谱图；其中a、b分别为稀释剂和NHS对照品溶液；c为料液比1:10；d为料液比2:10；e为料液比3:10；结合表3-7、表3-8的数据分析可以看出，料液比为2:10的色谱系统适应性参数最好，且测得供试品中NHS含量较高，故选用料液比为2:10。
3.5提取温度选择
精密量取供试品，考察不同提取温度为：常温(25℃)、37℃、50℃时，对NHS提取效果的影响。
表3-9提取温度考察结果
表3-10提取温度考察系统适应性参数
图26为在不同提取温度情况下的色谱图；其中a、b分别为稀释剂和NHS对照品溶液；c为温度25℃；d为温度37℃；e为温度50℃。结合表3-9、表3-10的数据分析可以看出，温度为37℃的色谱系统适应性参数最好，且测得供试品中NHS含量较高，故选用温度为37℃。
3.6标准品(对照品)浓度
按以上色谱条件和最佳提取条件，进样量为15μL，吸取同一供试品和不同浓度的对照品，以色谱峰峰面积接近的标准品选择适宜的对照品浓度。
表3-11对照品浓度考察结果
表3-12对照品浓度系统适应性参数
图27为确定标准品浓度的色谱图；其中a、b、c分别为稀释剂、NHS对照品溶液和供试品溶液的色谱图。结合表表3-11、表3-12来看，标准品浓度为1μg/ml时，标准品溶液的色谱峰面积与供试品峰面积接近，且色谱系统适应性较好，故选择标准品浓度为1μg/ml。
3.7供试品制备方法，最优条件确认：
取供试品精密称定后加水，料液比2:10；称重，37℃加热2小时后，放冷，再称定重量，用纯水补足减失的重量，摇匀，以8000转离心10-15分钟，取上清液用微孔滤膜(0.22μm)滤过，即得供试品溶液。
4方法学验证
4.1专属性
取空白溶剂、对照品溶液、供试品溶液依法测定，记录色谱图；图28为专属性验证情况下的色谱图；其中a、b、c分别为稀释剂、NHS对照品溶液和供试品溶液的色谱图；结合图表和数据分析可以看出，阴性对照与供试品的NHS色谱峰无干扰，专属性好，方法可用于供试品中NHS残留量测定。
表4-1专属性系统适应性参数
4.2线性关系
取NHS对照品分别配成2.020、1.010、0.252、0.126、0.063、0.032mg/ml，分别进样15μl按上述条件进行测定，以NHS浓度为横坐标，峰面积积分值为纵坐标，绘制标准曲线，求得NHS的回归方程。图29为NHS的回归方程，结果得到NHS的回归方程为y＝104.64+0.9765，R2＝0.9998。表明在0.032～2.020μg/ml范围内，NHS的浓度与色谱峰面积呈良好的线性关系。
表4-2线性关系结果
4.3检测限与定量限
取NHS对照品溶液进样15μL，依法测定，计算信噪比，稀释一定比例后，使信噪比达到3，该浓度即为检测限；稀释一定比例后，使信噪比达到10，该浓度即为定量限。
表4-3专属性系统适应性参数
图30为检测限与定量限的色谱图；其中a、b、c分别为稀释剂、检测限和定量限的色谱图；结合图表和数据分析可以看出，将对照品稀释51200倍即0.0000394μg/ml为检测限，将对照品稀释16640倍即0.0001214μg/ml为定量限。
4.4精密度
精密吸取供试品溶液15μL，连续进样6次，依法测定，记录峰面积。其RSD值小于2.0％，结果表明该法精密度良好。
表4-4精密度试验结果
4.5重复性
取同一供试品分为6份，按照3.7项下制备供试品溶液，依法测定，记录峰面积，计算NHS含量；其RSD值小于2％，说明该法重复性良好。
表4-5重复性试验结果
4.6稳定性
取同一供试品溶液分别在0h、2h、4h、8h、12h、24h测定，计算峰面积。其RSD值小于2.0％，表明供试品溶液在24h内稳定，满足测定需求。
表4-6稳定性试验结果
4.7人员精密度
由甲、乙、丙(实验室操作人员)三人分别按3.7项下提取同一批次的供试品溶液，依法测定，记录峰面积，计算NHS含量。图31为人员精密度色谱图；其中a、b分别为稀释剂和NHS对照品溶液；c为甲提取供试品；d为乙提取供试品；e为丙提取供试品；其结果RSD值小于2％，说明该法人员精密度良好。
表4-7人员精密度结果
4.8流速耐用性
按3.7项下提取同一批次的供试品溶液，依次设定流速为0.9ml/min、1ml/min、1.1ml/min测定并记录峰面积，计算NHS含量。图32为流速耐用性色谱图；其中a为稀释剂，b为0.4ml/min，c为0.5ml/min，d为0.6ml/min；结合表4-8结果来看，RSD值小于2％，说明该法流速耐用性良好。
表4-8流速耐用性结果
4.9柱温耐用性
按3.7项下提取同一批次的样品(批号：20221025)，依次设定柱温为25℃、30℃、35℃测定并记录峰面积，计算NHS含量。图33为柱温耐用性色谱图；其中a为稀释剂，b为25℃，c为30℃，d为35℃；结合表4-9结果来看，RSD值小于2％，说明该法柱温耐用性良好。
表4-9柱温耐用性结果
4.10色谱柱耐用性
按3.7项下提取同一批次的样品(批号：20221025)，依次使用色谱柱1：UltimateAQ-C18(4.6*250mm，5μm)；色谱柱2：HP-C18(4.6*250mm，5μm 120A)；色谱柱3：ZORBAX SB-C18(4.6*150mm 5-Micron)；测定并记录峰面积，计算NHS含量。
表4-10色谱柱耐用性结果
图34为色谱柱耐用性色谱图；其中a为稀释剂，b为色谱柱1；c为色谱柱2；d为色谱柱3，结合表4-10的结果来看，RSD值小于2％，说明该法色谱柱耐用性良好。
4.11仪器耐用性
按3.7项下提取同一批次的样品(批号：20221025)，依次采用Waters2695、Agilent1260、Aglient1290测定并记录峰面积，计算NHS含量。图35为不同型号色谱柱耐用性色谱图；其中a为稀释剂，b：Waters2695；c：Agilent1260；d：Aglient1290；结合表4-11的结果来看，RSD值小于2％，说明该法仪器耐用性良好。
表4-11仪器耐用性结果
4.12加标回收率
精密称量同一批次的样品(批号：20221025)0.1g，根据加标回收的范围80％～120％，配制三个浓度，分别为80％、100％、120％，各浓度平行配制3份；
将对照品溶液与供试品溶液(按3.7项下制备)并进样分析，记录峰面积，并计算NHS的含量与回收率限度，回收率限度应在80～115％之间。图36为加样回收试验色谱图；其中a、b、c分别为稀释剂、NHS对照品溶液和供试品溶液的色谱图；d为80％准确度溶液；e为100％准确度溶液；f为120％准确度溶液；结合表12结果来看，平均回收率为93.81％-96.90％，且RSD值小于2％。
表4-12加标回收率试验结果
说明：以上实施例仅用以说明本发明而并非限制本发明所描述的技术方案；因此，尽管本说明书参照上述的各个实施例对本发明已进行了详细的阐述说明，但是本领域的普通技术人员应当理解，仍可以对本发明进行修改或等同替换；而一切不脱离本发明的精神和范围的技术方案及其改进，其均应涵盖在本发明的权利要求范围内。
Claims (5)
1.一种N-羟基琥珀酰亚胺残留量的检测方法，其特征在于，
所述检测方法采用色谱柱为 Ultimate AQ-C18，色谱柱的直径为4.6mm，长为250mm，粒径为5μm；色谱柱的柱温为25-35℃；流动相为0.1%的磷酸水溶液，pH为2.12；流速为0.3-0.7ml/min；检测波长为208-210nm；进样体积15 μL-20 μL；记录时间为20-40min；
所述检测方法包括：配制NHS的对照品溶液和供试品溶液；
（1）NHS的对照品溶液的制备：
精密称定NHS，加水溶解，并稀释为一系列梯度浓度的稀释液，最后经微孔滤膜滤过，得到NHS的对照品溶液；所述稀释液的浓度范围为0.02μg/ml-2μg/ml；微孔滤膜的孔径为0.22μm；
（2）供试品溶液的制备：
取供试品加入水中溶解，得到溶液记为混合溶液A；其中供试品与水的用量比为2g:10ml，对混合溶液A称重记为M1，再经37℃加热2小时后，冷却至室温，再次称定重量记为M2，然后用纯水补足减失的重量，即M1- M2；摇匀，经离心取上清液用微孔滤膜滤过，即得供试品溶液；所述离心的条件为：8000转，离心10-15分钟；
所述检测方法还包括：首先将NHS的对照品溶液注入色谱仪，记录色谱图，以NHS对照品溶液的浓度对应其相应的峰面积作直线回归，绘制NHS的标准曲线；然后将供试品溶液按照与对照品溶液相同的条件进行HPLC检测，根据标准曲线确定供试样中NHS的含量。
2. 根据权利要求1所述的一种N-羟基琥珀酰亚胺残留量的检测方法，其特征在于，流速为0.5 ml/min。
3.根据权利要求1所述的一种N-羟基琥珀酰亚胺残留量的检测方法，其特征在于，色谱柱柱温为30℃。
4. 根据权利要求1所述的一种N-羟基琥珀酰亚胺残留量的检测方法，其特征在于，进样体积15 μL；记录时间为20min。
5.根据权利要求1~4任一项所述的检测方法在检测N-羟基琥珀酰亚胺残留量中的应用。
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- 2023-11-03 CN CN202311456468.7A patent/CN117491522B/zh active Active
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