CN118032977A - 一种葱白药材、标准汤剂、配方颗粒特征图谱的构建方法及其应用 - Google Patents
一种葱白药材、标准汤剂、配方颗粒特征图谱的构建方法及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于检测技术领域，尤其涉及一种葱白药材、标准汤剂、配方颗粒特征图谱的构建方法及其应用。本发明提供的特征图谱构建方法包括以下步骤：准备供试品，所述供试品为葱白药材、葱白标准汤剂或葱白配方颗粒；将所述供试品溶解，得到供试品溶液；将所述供试品溶液采用高效液相色谱法测定，得到对应供试品的特征图谱；所述高效液相色谱法的色谱条件为：色谱柱为C18柱；流动相A为乙腈，流动相B为0.1vol％甲酸溶液，梯度洗脱。本发明提供的特征图谱构建方法可以为葱白药材、标准汤剂及配方颗粒的鉴别提供更为科学的依据。
Description
技术领域
本发明属于检测技术领域，尤其涉及一种葱白药材、标准汤剂、配方颗粒特征图谱的构建方法及其应用。
背景技术
葱白为葱白药材剥去外膜，洗净而得的干燥鳞茎；葱白标准汤剂是由药材经炮制后按固定的制备工艺而成的冻干粉；葱白配方颗粒是葱白药材经炮制并按标准汤剂的主要质量指标加工制成的配方颗粒。为了确保葱白饮片、标准汤剂、配方颗粒质量的均一、稳定，建立一种新的特征图谱方法对其质量进行控制，是十分必要的。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种葱白药材、标准汤剂、配方颗粒特征图谱的构建方法及其应用，本发明提供的构建方法可为葱白药材、标准汤剂及配方颗粒的鉴别提供更为科学的依据。
本发明提供了一种葱白药材、标准汤剂、配方颗粒特征图谱的构建方法，包括以下步骤：
准备供试品，所述供试品为葱白药材、葱白标准汤剂或葱白配方颗粒；
将所述供试品溶解，得到供试品溶液；
将所述供试品溶液采用高效液相色谱(HPLC)法测定，得到对应供试品的特征图谱；
所述高效液相色谱法的色谱条件为：色谱柱为C18柱；流动相A为乙腈，流动相B为0.1vol％甲酸溶液，梯度洗脱。
在本发明提供的构建方法中，所述溶解的溶剂优选为50vol％的甲醇溶液，该溶剂的溶解效率高，所得色谱图的色谱峰信息量大，分离度好；所述供试品与溶剂的用量比优选为(0.5～2)g:50mL，该用量比例调节下获得色谱图峰形与分离度较好，峰大小适宜。
在本发明提供的构建方法中，所述溶解优选在超声辅助下进行，以提高溶解的效率；所述超声辅助的功率优选为580～620W，更优选为600W；所述超声辅助的频率优选为35～45kHz，更优选为40kHz；所述超声辅助的时间优选为25～35min，更优选为30min。
在本发明提供的构建方法中，当所述供试品为葱白药材时，溶解制备供试品溶液的具体过程优选包括：将供试品与溶剂混合，超声辅助溶解，放冷，摇匀，滤过，得到的续滤液即为供试品溶液；其中，所述供试品与溶剂的用量比优选为更优选2g:50mL。
在本发明提供的构建方法中，当所述供试品为葱白标准汤剂时，溶解制备供试品溶液的具体过程优选包括：将供试品研细后与溶剂混合，超声辅助溶解，放冷，摇匀，滤过，得到的续滤液即为供试品溶液；其中，所述供试品与溶剂的用量比优选为0.5g:50mL。
在本发明提供的构建方法中，当所述供试品为葱白配方颗粒时，溶解制备供试品溶液的具体过程优选包括：将供试品研细后与溶剂混合，超声辅助溶解，放冷，摇匀，滤过，得到的续滤液即为供试品溶液；其中，所述供试品与溶剂的用量比优选为0.5g:50mL。
在本发明提供的构建方法中，进行所述高效液相色谱法测定时，所述梯度洗脱具体过程优选为：
0～5min，A相：1vol％，B相：99vol％；
5～28min，A相：1～5vol％，B相：99～95vol％；
28～44min，A相：5～20vol％，B相：95～80vol％；
44～60min，A相：20～35vol％，B相：80～65vol％。
在本发明提供的构建方法中，进行所述高效液相色谱法测定时，流动相的流速优选为1.0mL/min，在此流速条件下获得的色谱图峰形较好，基线较平稳，出峰较完全。
在本发明提供的构建方法中，进行所述高效液相色谱法测定时，检测波长优选为258nm，在此检测波长条件下获得的色谱图信息量较大，基线更平稳。
在本发明提供的构建方法中，进行所述高效液相色谱法测定时，进样量优选为5μL。
在本发明提供的构建方法中，进行所述高效液相色谱法测定时，色谱柱中的填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶；所述色谱柱的柱长优选为200～300mm，更优选为为250mm；所述色谱柱的内径优选为4～5mm，更优选为4.6mm；所述色谱柱的填充剂粒径优选为3～7μm，更优选为3.5μm或5μm。
在本发明提供的构建方法中，进行所述高效液相色谱法测定时，所述色谱柱的柱温优选为30℃，在此柱温条件下获得的色谱图的峰形较为对称，分离度较好，出峰较完全。
在本发明提供的构建方法中，进行所述高效液相色谱法测定时，理论板数按腺苷峰计算应不低于5000。
在本发明提供的构建方法中，优选还包括以下步骤：
将葱白对照药材溶解，得到对照药材参照物溶液；将腺苷溶解，得到对照品参照物溶液；
将所述对照药材参照物溶液和对照品参照物溶液采用高效液相色谱法测定，得到参照物的色谱图；并根据所述参照物的色谱图对供试品的特征图谱的成分进行定性。
在本发明提供的构建方法中，溶解制备所述对照药材参照物溶液的具体过程优选包括：将葱白对照药材与溶剂混合，超声辅助溶解，摇匀，滤过，得到的续滤液即为对照药材参照物溶液；其中，所述溶剂优选为50vol％甲醇溶液；所述葱白对照药材与溶剂的用量比优选为更优选2g:50mL；所述超声辅助的功率优选为580～620W，更优选为600W；所述超声辅助的频率优选为35～45kHz，更优选为40kHz；所述超声辅助的时间优选为25～35min，更优选为30min。
在本发明提供的构建方法中，溶解制备所述对照品参照物溶液的具体过程优选包括：将腺苷与溶剂混合，得到对照品参照物溶液；其中，所述溶剂优选为50vol％甲醇溶液；所述腺苷与溶剂的用量比优选为(5～20)μg:1mL，更优选为10μg:1mL。
在本发明提供的构建方法中，优选还包括以下步骤：
采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统对葱白药材的特征图谱的相似度进行评价，得到由8个特征峰构成的葱白药材的标准特征图谱；在所述标准特征图谱中，与腺苷对照品参照物峰相对应的峰3为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间在规定值的±10％范围之内，规定值为：0.65(峰1)、0.92(峰2)、1.00(峰3)、1.13(峰4)、1.89(峰5)、2.43(峰6)、2.71(峰7)、3.60(峰8)。
在本发明提供的构建方法中，优选还包括以下步骤：
采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统对葱白标准汤剂的特征图谱的相似度进行评价，得到由8个特征峰构成的葱白标准汤剂的标准特征图谱；在所述标准特征图谱中，与腺苷对照品参照物峰相对应的峰3为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间在规定值的±10％范围之内，规定值为：0.65(峰1)、0.92(峰2)、1.00(峰3)、1.13(峰4)、1.89(峰5)、2.43(峰6)、2.71(峰7)、3.60(峰8)。
在本发明提供的构建方法中，优选还包括以下步骤：
采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统对葱白配方颗粒的特征图谱的相似度进行评价，得到由8个特征峰构成的葱白配方颗粒的标准特征图谱；在所述标准特征图谱中，与葱白对照品参照物峰相对应的峰3为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间在规定值的±10％范围之内，规定值为：0.65(峰1)、0.92(峰2)、1.00(峰3)、1.13(峰4)、1.89(峰5)、2.43(峰6)、2.71(峰7)、3.60(峰8)。
本发明还提供了一种葱白药材、标准汤剂、配方颗粒的鉴别方法，该方法采用上述技术方案所述的构建方法获得的特征图谱作为鉴别葱白药材、标准汤剂、配方颗粒的依据。
与现有技术相比，本发明提供了一种葱白药材、标准汤剂、配方颗粒特征图谱的构建方法及其应用，本发明提供的方法能够用于建立葱白药材、标准汤剂以及配方颗粒的HPLC特征图谱，具有良好的重复性、精密度和稳定性，可以为葱白药材、标准汤剂及配方颗粒的鉴别提供更为科学的依据。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例1提供的葱白药材供试品溶液制备过程中溶解方式考察的实验结果图；
图2是本发明实施例1提供的葱白药材供试品溶液制备过程中溶解溶剂考察的实验结果图；
图3是本发明实施例1提供的葱白药材供试品溶液制备过程中溶剂加入量考察的实验结果图；
图4是本发明实施例1提供的葱白药材供试品溶液制备过程中溶解时间考察的实验结果图；
图5是本发明实施例1提供的葱白药材特征图谱色谱峰指认图；
图6是本发明实施例1提供的葱白药材不同色谱柱考察的实验结果图；
图7是本发明实施例1提供的16批葱白药材中CB01～CB08样品的特征图谱验证图；
图8是本发明实施例1提供的16批葱白药材中CB09～CB16样品的特征图谱验证图；
图9是本发明实施例1提供的葱白药材特征图谱的对照图谱；
图10是本发明实施例2提供的葱白标准汤剂特征图谱色谱峰指认图；
图11是本发明实施例2提供的葱白标准汤剂不同色谱柱考察的实验结果图；
图12是本发明实施例2提供的16批葱白标准汤剂中CB-BT01～CB-BT08样品的特征图谱验证图；
图13是本发明实施例2提供的16批葱白标准汤剂中CB-BT09～CB-BT16样品的特征图谱验证图；
图14是本发明实施例2提供的葱白标准汤剂特征图谱的对照图谱；
图15是本发明实施例3提供的葱白配方颗粒不同波长色谱图；
图16是本发明实施例3提供的葱白配方颗粒不同流动相色谱图；
图17是本发明实施例3提供的葱白配方颗粒的柱温考察色谱图；
图18是本发明实施例3提供的葱白配方颗粒的流速考察色谱图；
图19是本发明实施例3提供的葱白配方颗粒的延迟性考察色谱图；
图20是本发明实施例3提供的葱白配方颗粒供试品溶液制备过程中溶解方式考察的实验结果图；
图21是本发明实施例3提供的葱白配方颗粒供试品溶液制备过程中溶解溶剂考察的实验结果图；
图22是本发明实施例3提供的葱白配方颗粒供试品溶液制备过程中溶剂加入量考察的实验结果图；
图23是本发明实施例3提供的葱白配方颗粒供试品溶液制备过程中溶解时间考察的实验结果图；
图24是本发明实施例3提供的葱白配方颗粒特征图谱色谱峰指认图；
图25是本发明实施例3提供的葱白配方颗粒不同色谱柱考察的实验结果图；
图26是本发明实施例3提供的葱白配方颗粒(CB-KL01)的特征图谱验证图；
图27是本发明实施例3提供的葱白配方颗粒(CB-KL02)的特征图谱验证图；
图28是本发明实施例3提供的葱白配方颗粒(CB-KL03)的特征图谱验证图；
图29是本发明实施例3提供的葱白配方颗粒特征图谱的对照图谱。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
葱白药材UPLC特征图谱的构建：
1)实验仪器及材料
高液相色谱仪：安捷伦1260型高效液相色谱仪；
电子天平：ME204E/02、MS205DU、XP26(梅特勒-托利多仪器有限公司)；
超纯水机：细胞型1810A(上海摩勒科学仪器有限公司)；
超声波清洗器：KQ600DB型(600W，40KHz；昆山市超声仪器有限公司)；
色谱柱：色谱柱1、色谱柱2、色谱柱3(均以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，柱长250mm，内径为4.6mm，填充剂粒径为3.5μm)；
乙腈、甲酸为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯；
腺苷(中国食品药品检定研究院，批号：110879-202204，纯度：99.7％)；
鸟苷(中国食品药品检定研究院，批号：111977-202202，纯度：88.6％)；
葱白对照药材(上海鸿永生物科技有限公司，批号：230149-202303)；
葱白药材(四川新绿色药业科技发展有限公司制备，批号：CB01、CB02、CB03、CB04、CB05、CB06、CB07、CB08、CB09、CB10、CB11、CB12、CB13、CB14、CB15、CB16)。
2)特征图谱检测方法
色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长250mm、内径为4.6mm、粒径为3.5μm)；以乙腈为流动相A，以0.1vol％甲酸溶液为流动相B，按表1中的规定进行梯度洗脱；流速为每分钟1.0mL；柱温30℃；检测波长为258nm；理论板数按腺苷峰计算应不低于5000。
表1梯度洗脱程序
| 时间(分钟) | 流动相A(vol％) | 流动相B(vol％) |
| 0～5 | 1 | 99 |
| 5～28 | 1→5 | 99→95 |
| 28～44 | 5→20 | 95→80 |
| 44～60 | 20→35 | 80→65 |
参照物溶液的制备：取葱白对照药材2g，置具塞锥形瓶中，加50vol％甲醇溶液50mL，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，摇匀，滤过，取续滤液，作为对照药材参照物溶液；另取腺苷对照品适量，精密称定，加50vol％甲醇溶液制成每1mL含10μg腺苷的溶液，作为对照品参照物溶液。
供试品溶液的制备：取本品粉末(过二号筛)约2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50vol％甲醇溶液50mL，密塞，称定重量，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用50vol％甲醇溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
测定法：分别精密吸取参照物溶液和供试品溶液各5μL，注入液相色谱仪，测定，即得。
3)供试品溶液的制备考察
3.1)溶解方式的考察
取本品粉末(批号：CB01)2g，置具塞锥形瓶中，加入50vol％甲醇溶液25mL，密塞，分别加热回流和超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。
按以上拟定的实验条件，分别对回流处理和超声处理的供试品溶液进行色谱测定，结果见图1，图1是本发明实施例1提供的葱白药材供试品溶液制备过程中溶解方式考察的实验结果图。通过图1可知，供试品进行回流和超声处理的效果差异不大，超声方法快速简便，故供试品的溶解方式确定为超声辅助溶解。
3.2)溶解溶剂的考察
取本品粉末(批号：CB01)2g，置具塞锥形瓶中，分别加甲醇、50vol％甲醇、70vol％甲醇、水各25mL，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。
按以上拟定的实验条件，分别对使用不同溶剂制成的供试品溶液进行色谱测定，结果见图2，图2是本发明实施例1提供的葱白药材供试品溶液制备过程中溶解溶剂考察的实验结果图。通过图2可知，溶剂为50vol％甲醇时，提取效率较高，提取溶剂确定为50vol％甲醇。
3.3)溶剂加入量的考察
取本品粉末(批号：CB01)2g，置具塞锥形瓶中，分别加50vol％甲醇25mL、50mL、100mL，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。
按以上拟定的实验条件，分别对不同溶剂加入量的供试品溶液进行色谱测定，结果见图3，图3是本发明实施例1提供的葱白药材供试品溶液制备过程中溶剂加入量考察的实验结果图。通过图3可知，溶剂加入量为50mL时，各个色谱峰峰形与分离度较好，峰大小适宜，故溶剂量选择50mL。
3.4)溶解时间的考察
取本品粉末(批号：CB01)2g，置具塞锥形瓶中，加50vol％甲醇25mL，分别超声处理(功率600W，频率40kHz)15分钟、30分钟、60分钟，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。
按以上拟定的实验条件，分别对超声处理不同时间的供试品溶液进行色谱测定，结果见图4，图4是本发明实施例1提供的葱白药材供试品溶液制备过程中溶解时间考察的实验结果图。通过图4可知，超声辅助溶解时间为30min时，药材成分已提取完全，故溶解时间确定为30分钟。
4)方法学考察
4.1)色谱峰指认
按以上拟定的实验条件，制备葱白药材供试品溶液、葱白对照药材参照物溶液、腺苷对照品参照物溶液；
鸟苷对照品参照物溶液的制备：取鸟苷对照品适量，精密称定，加50vol％甲醇溶液制成每1mL含鸟苷50μg的溶液，作为鸟苷对照品参照物溶液。
阴性对照溶液的制备：参照以上拟定的实验条件，制备缺葱白药材的阴性对照溶液(即，空白溶液)。
对上述溶液进行色谱检测，根据检测结果对葱白药材特征图谱峰进行定位，结果见图5，图5是本发明实施例1提供的葱白药材特征图谱色谱峰指认图。结果表明，峰3(S)为腺苷峰、峰4为鸟苷峰。在以下方法学考察中，对样品中的8个特征峰进行考察。
4.2)精密度试验
取葱白药材(CB01)供试品溶液，按拟定实验方法连续进样6次，每次5μL，计算各特征峰的保留时间，结果见表2。
表2精密度考察-保留时间
通过表2可知，各峰保留时间的RSD值为0.11％～1.82％，该仪器精密度良好。
4.3)重复性考察
精密称取葱白药材(CB01)6份，按拟定实验方法进行供试品溶液制备及色谱测定，结果见表3。
表3重复性考察—特征峰相对保留时间
通过表3可知，6份样品的相对保留时间RSD范围为0.00％～0.16％，说明该方法重复性良好。
4.4)中间精密度考察
在以上拟定的实验条件基础上，由不同人员(A、B)在不同时间(T1、T2)分别精密称取葱白药材(CB01)各1份，制备供试品，进行测定，结果见表4。
表4不同人员与时间考察—特征峰相对保留时间
通过表4可以看出，由不同的人员在不同的时间对同一个样品进行测定，各特征峰相对保留时间的RSD为0.51％～6.88％，方法稳定性较好。
4.5)色谱柱耐用性考察
在以上拟定的实验条件基础上，分别以色谱柱1、色谱柱2、色谱柱3进行分析考察，结果见图6，图6是本发明实施例1提供的葱白药材不同色谱柱考察的实验结果图。结果表明，用上述3种色谱柱对样品进行检测，特征峰相对保留时间的RSD在0.51％～3.39％，该方法色谱柱耐用性良好。
4.6)稳定性考察
在以上拟定的实验条件基础上，取同一供试品溶液，分别于0h、3h、6h、12h、16h、24h时测定，结果见表5。
表5稳定性考察—保留时间
通过表5可以看出，其相对应的特征峰保留时间的RSD在0.06％～0.20％，样品溶液在24小时内较稳定。
综上所述，各特征峰相对保留时间的RSD在以上各项考察中均符合要求，该方法良好。将上述8特征峰纳入后续考察。
4.7)特征峰的确定及对照图谱的建立
采用拟定的方法，对16批葱白药材样品进行特征图谱分析，计算相对保留时间，结果见图7～8、表6，图7是本发明实施例1提供的16批葱白药材中CB01～CB08样品的特征图谱验证图，图7中，S1～S8分别为：CB01、CB02、CB03、CB04、CB05、CB06、CB07、CB08；图8是本发明实施例1提供的16批葱白药材中CB09～CB16样品的特征图谱验证图，图8中，S1～S8分别为：CB09、CB10、CB11、CB12、CB13、CB14、CB15、CB16。
表616批葱白药材的相对保留时间
根据相对保留时间稳定及各批次样品均能检出且峰相对较高的原则，共选择了8个耐用性较好的峰作为特征峰。根据方法学考察结果和16批药材验证结果，确定理论塔板数按腺苷峰计算应不低于5000。
最终规定：供试品色谱中应呈现8个特征峰，并应与对照药材参照物色谱中的8个特征峰保留时间相对应，其中峰3应与腺苷对照品参照物峰保留时间相对应；与腺苷对照品参照物峰相应的峰为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10％范围之内，规定值为：0.65(峰1)、0.92(峰2)、1.00(峰3)、1.13(峰4)、1.89(峰5)、2.43(峰6)、2.71(峰7)、3.60(峰8)。
采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)对16批葱白药材进行合成，建立了葱白药材特征图谱的对照图谱，如图9所示，图9是本发明实施例1提供的葱白药材特征图谱的对照图谱。
5)葱白药材特征图谱方法确定
色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长250mm、内径为4.6mm、粒径为3.5μm)；以乙腈为流动相A，以0.1vol％甲酸溶液为流动相B，按表1中的规定进行梯度洗脱；流速为每分钟1.0mL；柱温30℃；检测波长为258nm；理论板数按腺苷峰计算应不低于5000。
参照物溶液的制备：取葱白对照药材2g，置具塞锥形瓶中，加50vol％甲醇溶液50mL，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，摇匀，滤过，取续滤液，作为对照药材参照物溶液；另取腺苷对照品适量，精密称定，加50vol％甲醇溶液制成每1mL含10μg腺苷的溶液，作为对照品参照物溶液。
供试品溶液的制备：取本品粉末(过二号筛)约2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50vol％甲醇溶液50mL，密塞，称定重量，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用50vol％甲醇溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
测定法：分别精密吸取参照物溶液和供试品溶液各5μL，注入液相色谱仪，测定，即得。
供试品色谱中应呈现8个特征峰，并应与对照药材参照物色谱中的8个特征峰保留时间相对应，其中峰3应与腺苷对照品参照物峰保留时间相对应；与腺苷对照品参照物峰相应的峰为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10％范围之内，规定值为：0.65(峰1)、0.92(峰2)、1.00(峰3)、1.13(峰4)、1.89(峰5)、2.43(峰6)、2.71(峰7)、3.60(峰8)。
实施例2
葱白标准汤剂UPLC特征图谱的构建：
1)实验仪器及材料
葱白标准汤剂(四川新绿色药业科技发展有限公司制备，批号：CB-BT01、CB-BT02、CB-BT03、CB-BT04、CB-BT05、CB-BT06、CB-BT07、CB-BT08、CB-BT09、CB-BT10、CB-BT11、CB-BT12、CB-BT13、CB-BT14、CB-BT15、CB-BT16)；
其他实验仪器及材料同实施例1，不再赘述。
2)特征图谱检测方法
色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长250mm、内径为4.6mm、粒径为3.5μm)；以乙腈为流动相A，以0.1vol％甲酸溶液为流动相B，按表1中的规定进行梯度洗脱；流速为每分钟1.0mL；柱温30℃；检测波长为258nm；理论板数按腺苷峰计算应不低于5000。
参照物溶液的制备：取葱白对照药材2g，置具塞锥形瓶中，加50vol％甲醇溶液50mL，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，摇匀，滤过，取续滤液，作为对照药材参照物溶液；另取腺苷对照品适量，精密称定，加50vol％甲醇溶液制成每1mL含10μg腺苷的溶液，作为对照品参照物溶液。
供试品溶液的制备：取本品适量，研细，取约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50vol％甲醇溶液50mL，密塞，称定重量，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用50vol％甲醇溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
测定法：分别精密吸取参照物溶液和供试品溶液各5μL，注入液相色谱仪，测定，即得。
3)方法学考察
3.1)色谱峰指认
按以上拟定的实验条件，制备葱白标准汤剂供试品溶液、葱白对照药材参照物溶液、腺苷对照品参照物溶液；
鸟苷对照品参照物溶液的制备：取鸟苷对照品适量，精密称定，加50vol％甲醇溶液制成每1mL含鸟苷50μg的溶液，作为鸟苷对照品参照物溶液。
阴性对照溶液的制备：参照以上拟定的实验条件，制备缺葱白标准汤剂的阴性对照溶液(即，空白溶液)。
对上述溶液进行色谱检测，根据检测结果对葱白标准汤剂特征图谱峰进行定位，结果见图10，图10是本发明实施例2提供的葱白标准汤剂特征图谱色谱峰指认图。结果表明，峰3(S)为腺苷峰、峰4为鸟苷峰。在以下方法学考察中，对样品中的8个特征峰进行考察。
3.2)精密度试验
取葱白标准汤剂(批号：CB-BT01)供试品溶液，按拟定实验方法连续进样6次，每次5μL，计算各特征峰的保留时间，结果见表7。
表7精密度考察-保留时间
通过表7可知，各峰保留时间的RSD值为0.06％～2.64％，该仪器精密度良好。
3.3)重复性考察
精密称取葱白标准汤剂(批号：CB-BT01)6份，按拟定实验方法进行供试品溶液制备及色谱测定，结果见表8。
表8重复性考察—特征峰相对保留时间
通过表8可知，6份样品的相对保留时间RSD范围为0.00％～0.17％，说明该方法重复性良好。
3.4)中间精密度考察
在以上拟定的实验条件基础上，由不同人员(A、B)在不同时间(T1、T2)分别精密称取葱白标准汤剂(批号：CB-BT01)各1份，制备供试品，进行测定，结果见表9。
表9不同人员与时间考察—特征峰相对保留时间
通过表9可以看出，由不同的人员在不同的时间对同一个样品进行测定，各特征峰相对保留时间的RSD为0.72％～9.98％，方法稳定性较好。
3.5)色谱柱耐用性考察
在以上拟定的实验条件基础上，分别以色谱柱1、色谱柱2、色谱柱3进行分析考察，结果见图11，图11是本发明实施例2提供的葱白标准汤剂不同色谱柱考察的实验结果图。结果表明，用上述3种色谱柱对样品进行检测，特征峰相对保留时间的RSD在0.51％～4.10％，该方法色谱柱耐用性良好。
3.6)稳定性考察
在以上拟定的实验条件基础上，取同一供试品溶液，分别于0h、3h、6h、12h、16h、24h时测定，结果见表10。
表10稳定性考察—保留时间
通过表10可以看出，其相对应的特征峰保留时间的RSD在0.06％～0.27％，样品溶液在24小时内较稳定。
综上所述，各特征峰相对保留时间的RSD在以上各项考察中均符合要求，该方法良好。将上述8特征峰纳入后续考察。
3.7)特征峰的确定及对照图谱的建立
采用拟定的方法，对16批葱白标准汤剂样品进行特征图谱分析，计算相对保留时间，结果见图12～13、表11，图12是本发明实施例2提供的16批葱白标准汤剂中CB-BT01～CB-BT08样品的特征图谱验证图，图12中，S1～S8分别为：CB-BT01、CB-BT02、CB-BT03、CB-BT04、CB-BT05、CB-BT06、CB-BT07、CB-BT08；图13是本发明实施例2提供的16批葱白标准汤剂中CB-BT09～CB-BT16样品的特征图谱验证图，图13中，S1～S8分别为：CB-BT09、CB-BT10、CB-BT11、CB-BT12、CB-BT13、CB-BT14、CB-BT15、CB-BT16。
表1116批葱白标准汤剂的相对保留时间
根据相对保留时间稳定及各批次样品均能检出且峰相对较高的原则，共选择了8个耐用性较好的峰作为特征峰。根据方法学考察结果和16批标准汤剂验证结果，确定理论塔板数按腺苷峰计算应不低于5000。
最终规定：供试品色谱中应呈现8个特征峰，并应与对照药材参照物色谱中的8个特征峰保留时间相对应，其中峰3应与腺苷对照品参照物峰保留时间相对应。与腺苷对照品参照物峰相应的峰为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10％范围之内。规定值为：0.65(峰1)、0.92(峰2)、1.00(峰3)、1.13(峰4)、1.89(峰5)、2.43(峰6)、2.71(峰7)、3.60(峰8)。
采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)对16批葱白标准汤剂进行合成，建立了葱白标准汤剂特征图谱的对照图谱，如图14所示，图14是本发明实施例2提供的葱白标准汤剂特征图谱的对照图谱。
5)葱白标准汤剂特征图谱方法确定
色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长250mm、内径为4.6mm、粒径为3.5μm)；以乙腈为流动相A，以0.1vol％甲酸溶液为流动相B，按表1中的规定进行梯度洗脱；流速为每分钟1.0mL；柱温30℃；检测波长为258nm；理论板数按腺苷峰计算应不低于5000。
参照物溶液的制备：取葱白对照药材2g，置具塞锥形瓶中，加50vol％甲醇溶液50mL，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，摇匀，滤过，取续滤液，作为对照药材参照物溶液；另取腺苷对照品适量，精密称定，加50vol％甲醇制成每1mL含10μg腺苷的溶液，作为对照品参照物溶液。
供试品溶液的制备：取本品适量，研细，取约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50vol％甲醇溶液50mL，密塞，称定重量，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用50vol％甲醇溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
测定法：分别精密吸取参照物溶液和供试品溶液各5μL，注入液相色谱仪，测定，即得。
供试品色谱中应呈现8个特征峰，并应与对照药材参照物色谱中的8个特征峰保留时间相对应，其中峰3应与腺苷对照品参照物峰保留时间相对应。与腺苷对照品参照物峰相应的峰为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10％范围之内。规定值为：0.65(峰1)、0.92(峰2)、1.00(峰3)、1.13(峰4)、1.89(峰5)、2.43(峰6)、2.71(峰7)、3.60(峰8)。
实施例3
葱白配方颗粒UPLC特征图谱的构建：
1)实验仪器及材料
葱白配方颗粒(四川新绿色药业科技发展有限公司，批号CB-KL01、CB-KL02、CB-KL03)；
其他实验仪器及材料同实施例1，不再赘述。
2)特征图谱检测方法
色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长250mm、内径为4.6mm、粒径为3.5μm)；以乙腈为流动相A，以0.1vol％甲酸溶液为流动相B，按表1中的规定进行梯度洗脱；流速为每分钟1.0mL；柱温30℃；检测波长为258nm；理论板数按腺苷峰计算应不低于5000。
参照物溶液的制备：取葱白对照药材2g，置具塞锥形瓶中，加50vol％甲醇溶液50mL，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，摇匀，滤过，取续滤液，作为对照药材参照物溶液；另取腺苷对照品适量，精密称定，加50vol％甲醇溶液制成每1mL含10μg腺苷的溶液，作为对照品参照物溶液。
供试品溶液的制备：取本品适量，研细，取约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50vol％甲醇溶液50mL，密塞，称定重量，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用50vol％甲醇溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
测定法：分别精密吸取参照物溶液和供试品溶液各5μL，注入液相色谱仪，测定，即得。
3)色谱条件的考察
3.1)波长选择
在以上拟定的实验条件基础上，利用二极管阵列检测器对白藜芦醇、供试品溶液进行全波段扫描，并分别提取供试品溶液在220nm、258nm、290nm、310nm、330nm波长下的色谱图，结果见图15，图15是本发明实施例3提供的葱白配方颗粒不同波长色谱图。通过图15可以看出，在检测波长为258nm时色谱峰信息量较大，色谱图基线更平稳，故检测波长确定为258nm。
3.2)流动相选择
在以上拟定的实验条件基础上，考察了3种不同流动相的分离效果，分别为：乙腈(A相)-0.1vol％甲酸(B相)、乙腈(A相)-0.1vol％磷酸(B相)、甲醇(A相)-0.1vol％甲酸(B相)，结果见图16，图16是本发明实施例3提供的葱白配方颗粒不同流动相色谱图。通过图16可以看出，乙腈-0.1vol％甲酸溶液梯度洗脱条件下色谱图基线较平稳，色谱峰多，故将乙腈-0.1vol％甲酸溶液梯度洗脱作为葱白配方颗粒特征图谱测定方法的流动相。
3.3)柱温考察
在以上拟定的实验条件基础上，分别在柱温为25℃、30℃、35℃条件下对供试品溶液进行色谱检测，结果见图17和表12，图17是本发明实施例3提供的葱白配方颗粒的柱温考察色谱图。
表12柱温考察—相对保留时间
通过图17和表12可以看出，柱温25℃～35℃时，相对保留时间RSD为1.76％～3.08％，耐用性较好；柱温为30℃时，色谱图峰形较为对称，分离度较好，出峰较完全，故柱温确定为30℃。
3.4)流速考察
在以上拟定的实验条件基础上，分别在流速为0.8mL/min、1.0mL/min、1.2mL/min条件下对供试品溶液进行色谱检测，结果见图18和表13，图18是本发明实施例3提供的葱白配方颗粒的流速考察色谱图。
表13流速考察—相对保留时间
通过图18和表13可以看出，流速为0.8mL/min～1.2mL/min时，相对保留时间RSD值为1.34％～11.57％；流速为0.8mlL/min时，峰8未出峰，当流速为1.0mL/min时，色谱图峰形较好，基线较平稳，出峰较完全，故流速确定为1.0mL/min。
3.5)延迟性考察
在以上拟定的实验条件基础上，进行延迟性试验，结果见图19，图19是本发明实施例3提供的葱白配方颗粒的延迟性考察色谱图。通过图19可以看出，样品在60min后基本无有用色谱峰，故样品检测时间定为60min。
4)供试品溶液的制备考察
4.1)溶解方式的考察
取本品(批号：CB-KL01)适量，研细，取0.5g，置具塞锥形瓶中，加入50vol％甲醇溶液25mL，密塞，分别加热回流和超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。
按以上拟定的实验条件，分别对回流处理和超声处理的供试品溶液进行色谱测定，结果见图20，图20是本发明实施例3提供的葱白配方颗粒供试品溶液制备过程中溶解方式考察的实验结果图。通过图20可知，供试品进行回流和超声处理的效果差异不大，超声方法快速简便，故供试品的溶解方式确定为超声辅助溶解。
4.2)溶解溶剂的考察
取本品(批号：CB-KL01)适量，研细，取0.5g，置具塞锥形瓶中，分别加甲醇、50vol％甲醇、70vol％甲醇、水各25mL，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。
按以上拟定的实验条件，分别对使用不同溶剂制成的供试品溶液进行色谱测定，结果见图21，图21是本发明实施例3提供的葱白配方颗粒供试品溶液制备过程中溶解溶剂考察的实验结果图。通过图21可知，用50vol％甲醇作为提取溶剂所得的色谱峰信息量大，分离度好，提取溶剂确定为50vol％甲醇。
4.3)溶剂加入量的考察
取本品(批号：CB-KL01)适量，研细，取0.5g，置具塞锥形瓶中，分别加50vol％甲醇10mL、25mL、50mL，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。
按以上拟定的实验条件，分别对不同溶剂加入量的供试品溶液进行色谱测定，结果见图22，图22是本发明实施例3提供的葱白配方颗粒供试品溶液制备过程中溶剂加入量考察的实验结果图。通过图22可知，溶剂加入量为50mL时，色谱峰大小较为适宜，故溶剂量选择50mL。
4.4)溶解时间的考察
取本品(批号：CB-KL01)适量，研细，取0.5g，置具塞锥形瓶中，加50vol％甲醇50mL，分别超声处理(功率600W，频率40kHz)15分钟、30分钟、60分钟，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。
按以上拟定的实验条件，分别对超声处理不同时间的供试品溶液进行色谱测定，结果见图23，图23是本发明实施例3提供的葱白配方颗粒供试品溶液制备过程中溶解时间考察的实验结果图。通过图23可知，超声辅助溶解时间为30min时，药材成分已提取完全，故溶解时间确定为30分钟。
5)方法学考察
5.1)色谱峰指认
按以上拟定的实验条件，制备葱白配方颗粒供试品溶液、葱白对照药材参照物溶液、腺苷对照品参照物溶液；
鸟苷对照品参照物溶液的制备：取鸟苷对照品适量，精密称定，加50vol％甲醇溶液制成每1mL含鸟苷50μg的溶液，作为鸟苷对照品参照物溶液。
阴性对照溶液的制备：参照以上拟定的实验条件，制备缺葱白配方颗粒的阴性对照溶液(即，空白溶液)。
对上述溶液进行色谱检测，根据检测结果对葱白配方颗粒特征图谱峰进行定位，结果见图24，图24是本发明实施例3提供的葱白配方颗粒特征图谱色谱峰指认图。结果表明，峰3(S)为腺苷峰、峰4为鸟苷峰。在以下方法学考察中，对样品中的8个特征峰进行考察。
5.2)精密度试验
取葱白配方颗粒(批号：CB-KL01)供试品溶液，按拟定实验方法连续进样6次，每次5μL，计算各特征峰的保留时间，结果见表14。
表14精密度考察-保留时间
通过表14可知，各峰保留时间的RSD值为0.01％～0.31％，该仪器精密度良好。
5.3)重复性考察
精密称取葱白配方颗粒(批号：CB-KL01)6份，按拟定实验方法进行供试品溶液制备及色谱测定，结果见表15。
表15重复性考察—特征峰相对保留时间
通过表15可知，6份样品的相对保留时间RSD范围为0.00％～0.16％，说明该方法重复性良好。
5.4)中间精密度考察
在以上拟定的实验条件基础上，由不同人员(A、B)在不同时间(T1、T2)分别精密称取葱白配方颗粒(批号：CB-KL01)各1份，制备供试品，进行测定，结果见表4。
表16不同人员与时间考察—特征峰相对保留时间
通过表16可以看出，由不同的人员在不同的时间对同一个样品进行测定，各特征峰相对保留时间的RSD为0.72％～3.89％，方法稳定性较好。
5.5)色谱柱耐用性考察
在以上拟定的实验条件基础上，分别以色谱柱1、色谱柱2、色谱柱3进行分析考察，结果见图25，图25是本发明实施例3提供的葱白配方颗粒不同色谱柱考察的实验结果图。结果表明，用上述3种色谱柱对样品进行检测，特征峰相对保留时间的RSD在0.51％～4.10％，该方法色谱柱耐用性良好。
5.6)稳定性考察
在以上拟定的实验条件基础上，取同一供试品溶液，分别于0h、3h、6h、12h、16h、24h时测定，结果见表17。
表17稳定性考察—保留时间
通过表17可以看出，其相对应的特征峰保留时间的RSD在0.06％～0.27％，样品溶液在24小时内较稳定。
综上所述，各特征峰相对保留时间的RSD在以上各项考察中均符合要求，该方法良好。将上述8特征峰纳入后续考察。
5.7)特征峰的确定及对照图谱的建立
采用拟定的方法，对3批葱白配方颗粒样品进行特征图谱分析，计算相对保留时间，结果见图26～28、表18，图26是本发明实施例3提供的葱白配方颗粒(CB-KL01)的特征图谱验证图，图27是本发明实施例3提供的葱白配方颗粒(CB-KL02)的特征图谱验证图，图28是本发明实施例3提供的葱白配方颗粒(CB-KL03)的特征图谱验证图。
表183批葱白配方颗粒的相对保留时间
根据相对保留时间稳定及各批次样品均能检出且峰相对较高的原则，共选择了8个峰作为特征峰。根据方法学考察结果和3批颗粒验证结果，确定理论塔板数按腺苷峰计算应不低于5000。
最终规定：供试品色谱中应呈现8个特征峰，并应与对照药材参照物色谱中的8个特征峰保留时间相对应，其中峰3应与腺苷对照品参照物峰保留时间相对应；与腺苷对照品参照物峰相应的峰为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10％范围之内，规定值为：0.65(峰1)、0.92(峰2)、1.00(峰3)、1.13(峰4)、1.89(峰5)、2.43(峰6)、2.71(峰7)、3.60(峰8)。
采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)对3批葱白配方颗粒进行合成，建立了葱白配方颗粒特征图谱的对照图谱，如图29所示，图29是本发明实施例3提供的葱白配方颗粒特征图谱的对照图谱。
5)葱白配方颗粒特征图谱方法确定
色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长250mm、内径为4.6mm、粒径为3.5μm)；以乙腈为流动相A，以0.1vol％甲酸溶液为流动相B，按表1中的规定进行梯度洗脱；流速为每分钟1.0mL；柱温30℃；检测波长为258nm；理论板数按腺苷峰计算应不低于5000。
参照物溶液的制备：取葱白对照药材2g，置具塞锥形瓶中，加50vol％甲醇溶液50mL，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，摇匀，滤过，取续滤液，作为对照药材参照物溶液；另取腺苷对照品适量，精密称定，加50vol％甲醇溶液制成每1mL含10μg腺苷的溶液，作为对照品参照物溶液。
供试品溶液的制备：取本品适量，研细，取约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50vol％甲醇溶液50mL，密塞，称定重量，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用50vol％甲醇溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
测定法：分别精密吸取参照物溶液和供试品溶液各5μL，注入液相色谱仪，测定，即得。
供试品色谱中应呈现8个特征峰，并应与对照药材参照物色谱中的8个特征峰保留时间相对应，其中峰3应与腺苷对照品参照物峰保留时间相对应；与腺苷对照品参照物峰相应的峰为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10％范围之内，规定值为：0.65(峰1)、0.92(峰2)、1.00(峰3)、1.13(峰4)、1.89(峰5)、2.43(峰6)、2.71(峰7)、3.60(峰8)。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种葱白药材、标准汤剂、配方颗粒特征图谱的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
准备供试品，所述供试品为葱白药材、葱白标准汤剂或葱白配方颗粒；
将所述供试品溶解，得到供试品溶液；
将所述供试品溶液采用高效液相色谱法测定，得到对应供试品的特征图谱；
所述高效液相色谱法的色谱条件为：色谱柱为C18柱；流动相A为乙腈，流动相B为0.1vol％甲酸溶液，梯度洗脱。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述梯度洗脱具体为：
0～5min，A相：1vol％，B相：99vol％；
5～28min，A相：1～5vol％，B相：99～95vol％；
28～44min，A相：5～20vol％，B相：95～80vol％；
44～60min，A相：20～35vol％，B相：80～65vol％。
3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述溶解的溶剂为50vol％甲醇溶液；所述供试品与溶剂的用量比为(0.5～2)g:50mL。
4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述溶解在超声辅助下进行，所述超声辅助的功率为580～620W，频率为35～45kHz，时间为25～35min。
5.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述高效液相色谱法的色谱条件还包括：流动相的流速为1.0mL/min；检测波长为258nm；进样量为5μL；柱温30℃；理论板数按腺苷峰计算不低于5000。
6.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，还包括以下步骤：
将葱白对照药材溶解，得到对照药材参照物溶液；将腺苷溶解，得到对照品参照物溶液；
将所述对照药材参照物溶液和对照品参照物溶液采用高效液相色谱法测定，得到参照物的色谱图；并根据所述参照物的色谱图对供试品的特征图谱的成分进行定性。
7.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，还包括以下步骤：
采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统对葱白药材的特征图谱的相似度进行评价，得到由8个特征峰构成的葱白药材的标准特征图谱；在所述标准特征图谱中，与腺苷对照品参照物峰相对应的峰3为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间在规定值的±10％范围之内，规定值为：0.65(峰1)、0.92(峰2)、1.00(峰3)、1.13(峰4)、1.89(峰5)、2.43(峰6)、2.71(峰7)、3.60(峰8)。
8.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，还包括以下步骤：
采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统对葱白标准汤剂的特征图谱的相似度进行评价，得到由8个特征峰构成的葱白标准汤剂的标准特征图谱；在所述标准特征图谱中，与腺苷对照品参照物峰相对应的峰3为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间在规定值的±10％范围之内，规定值为：0.65(峰1)、0.92(峰2)、1.00(峰3)、1.13(峰4)、1.89(峰5)、2.43(峰6)、2.71(峰7)、3.60(峰8)。
9.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，还包括以下步骤：
采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统对葱白配方颗粒的特征图谱的相似度进行评价，得到由8个特征峰构成的葱白配方颗粒的标准特征图谱；在所述标准特征图谱中，与葱白对照品参照物峰相对应的峰3为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间在规定值的±10％范围之内，规定值为：0.65(峰1)、0.92(峰2)、1.00(峰3)、1.13(峰4)、1.89(峰5)、2.43(峰6)、2.71(峰7)、3.60(峰8)。
10.一种葱白药材、标准汤剂、配方颗粒的鉴别方法，其特征在于，采用权利要求1～9任一项所述的构建方法获得的特征图谱作为鉴别葱白药材、标准汤剂、配方颗粒的依据。
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