CN117969731A - 一种核桃仁药材、饮片、标准汤剂、配方颗粒hplc特征图谱的构建方法及其应用 - Google Patents
一种核桃仁药材、饮片、标准汤剂、配方颗粒hplc特征图谱的构建方法及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于检测技术领域，尤其涉及一种核桃仁药材、饮片、标准汤剂、配方颗粒HPLC特征图谱的构建方法及其应用。本发明提供的HPLC特征图谱构建方法包括以下步骤：准备供试品，所述供试品为核桃仁药材、核桃仁饮片、核桃仁标准汤剂或核桃仁配方颗粒；将所述供试品溶解，得到供试品溶液；将所述供试品溶液采用高效液相色谱法测定，得到对应供试品的HPLC特征图谱；所述高效液相色谱法的色谱条件为：色谱柱为C18柱；流动相A为乙腈，流动相B为0.1wt％磷酸溶液，梯度洗脱。本发明提供的特征图谱构建方法可以为核桃仁药材、饮片、标准汤剂及配方颗粒的鉴别提供更为科学的依据。
Description
技术领域
本发明属于检测技术领域，尤其涉及一种核桃仁药材、饮片、标准汤剂、配方颗粒HPLC特征图谱的构建方法及其应用。
背景技术
核桃仁为胡桃科植物胡桃Juglans regiaL.的干燥成熟种子，具有补肾、温肺、润肠等功效，用于治疗或改善肾阳不足、腰膝酸软、阳痿遗精、虚寒喘嗽、肠燥便秘等病症。为了确保核桃仁药材、饮片标准汤剂及配方颗粒其质量的均一、稳定，建立一种新的特征图谱方法对其质量进行把控，是十分必要的。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种核桃仁药材、饮片、标准汤剂、配方颗粒HPLC特征图谱的构建方法及其应用，本发明提供的构建方法可为核桃仁药材、饮片、标准汤剂及配方颗粒的鉴别提供更为科学的依据。
本发明提供了一种核桃仁药材、饮片、标准汤剂、配方颗粒HPLC特征图谱的构建方法，包括以下步骤：
准备供试品，所述供试品为核桃仁药材、核桃仁饮片、核桃仁标准汤剂或核桃仁配方颗粒；
将所述供试品溶解，得到供试品溶液；
将所述供试品溶液采用高效液相色谱法测定，得到对应供试品的HPLC特征图谱；
所述高效液相色谱法的色谱条件为：色谱柱为C18柱；流动相A为乙腈，流动相B为0.1wt％磷酸溶液，梯度洗脱。
在本发明提供的构建方法中，所述核桃仁饮片为核桃仁药材的炮制加工品；所述核桃仁标准汤剂是由核桃仁药材经炮制后制备而成的冻干粉；所述核桃仁配方颗粒是核桃仁药材经炮制并按标准汤剂的主要质量指标加工制成的配方颗粒。
在本发明提供的构建方法中，所述溶解的溶剂优选为50vol％甲醇溶液，该溶剂条件下获得的色谱图峰形好，分离度适中。
在本发明提供的构建方法中，当所述供试品为核桃仁药材或核桃仁饮片时，溶解制备供试品溶液的具体过程优选包括：将供试品加水煎煮，放冷，滤过，滤液蒸干，蒸干残渣与溶剂混合溶解，滤过，得到的续滤液即为供试品溶液；其中，所述供试品与水的用量比优选为(0.8～1.2)g:30mL，更优选为1g:30mL；所述煎煮的时间优选为25～35min，更优选为28～32min，再优选为30min；所述溶剂与供试品的用量比优选为10mL:(0.8～1.2)g，更优选为10mL:1g。
在本发明提供的构建方法中，当所述供试品为核桃仁标准汤剂时，溶解制备供试品溶液的具体过程优选包括：将供试品与溶剂混合，超声辅助溶解，放冷，摇匀，滤过，得到的续滤液即为供试品溶液；其中，所述供试品与溶剂的用量比优选为(0.2～0.4)g:50mL，更优选0.3g:50mL；所述超声辅助的功率优选为580～620W，更优选为600W；所述超声辅助的频率优选为35～45kHz，更优选为40kHz；所述超声辅助的时间优选为25～35min，更优选为30min。
在本发明提供的构建方法中，当所述供试品为核桃仁配方颗粒时，溶解制备供试品溶液的具体过程优选包括：将供试品研细后与溶剂混合，超声辅助溶解，放冷，摇匀，滤过，得到的续滤液即为供试品溶液；其中，所述供试品与溶剂的用量比优选为(0.2～0.4)g:20mL，更优选0.3g:20mL；所述超声辅助的功率优选为580～620W，更优选为600W；所述超声辅助的频率优选为35～45kHz，更优选为40kHz；所述超声辅助的时间优选为25～35min，更优选为30min。
在本发明提供的构建方法中，进行所述高效液相色谱法测定时，所述梯度洗脱具体过程优选为：
0～5min，A相：2vol％，B相：98vol％；
5～13min，A相：2～10vol％，B相：98～90vol％；
13～17min，A相：10～13.5vol％，B相：90～86.5vol％；
17～24min，A相：13.5～19.5vol％，B相：86.5～80.5vol％；
24～30min，A相：19.5～25vol％，B相：80.5～75vol％。
在本发明提供的构建方法中，进行所述高效液相色谱法测定时，流动相的流速优选为0.3mL/min，在此流速条件下获得的色谱图峰形较好，分离度适中。
在本发明提供的构建方法中，进行所述高效液相色谱法测定时，检测波长优选为254nm，在此检测波长条件下获得的色谱图的色谱峰信息量较大，基线更平稳。
在本发明提供的构建方法中，进行所述高效液相色谱法测定时，进样量优选为1μL。
在本发明提供的构建方法中，进行所述高效液相色谱法测定时，色谱柱中的填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶。
在本发明提供的构建方法中，进行所述高效液相色谱法测定时，所述色谱柱的柱温优选为25℃，在此柱温条件下获得的色谱图的峰形较为对称，分离度较好，出峰较完全。
在本发明提供的构建方法中，进行所述高效液相色谱法测定时，理论板数按鞣花酸峰计算应不低于5000。
在本发明提供的构建方法中，优选还包括以下步骤：
将核桃仁对照药材溶解，得到对照药材参照物溶液；将没食子酸溶解，得到没食子酸对照品参照物溶液；将鞣花酸溶解，得到鞣花酸对照品参照物溶液；
将所述对照药材参照物溶液和对照品参照物溶液采用高效液相色谱法测定，得到参照物的色谱图；并根据所述参照物的色谱图对供试品的HPLC特征图谱的成分进行定性。
在本发明提供的构建方法中，溶解制备所述对照药材参照物溶液的具体过程优选包括：将核桃仁对照药材加水煎煮，放冷，滤过，滤液蒸干，蒸干残渣与溶剂混合溶解，滤过，得到的续滤液即为对照药材参照物溶液；其中，所述核桃仁对照药材与水的用量比优选为(0.8～1.2)g:30mL，更优选为1g:30mL；所述煎煮的时间优选为25～35min，更优选为28～32min，再优选为30min；所述溶剂优选为50vol％甲醇溶液；所述溶剂与核桃仁对照药材的用量比优选为10mL:(0.8～1.2)g，更优选为10mL:1g。
在本发明提供的构建方法中，溶解制备所述没食子酸对照品参照物溶液的具体过程优选包括：将没食子酸与溶剂混合，得到没食子酸对照品参照物溶液；其中，所述溶剂优选为甲醇；所述没食子酸与溶剂的用量比优选为(10～30)μg:1mL，更优选为20μg:1mL。
在本发明提供的构建方法中，溶解制备所述鞣花酸对照品参照物溶液的具体过程优选包括：将鞣花酸与溶剂混合，得到鞣花酸对照品参照物溶液；其中，所述溶剂优选为甲醇；所述鞣花酸与溶剂的用量比优选为(30～70)μg:1mL，更优选为50μg:1mL。
在本发明提供的构建方法中，优选还包括以下步骤：
采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统对核桃仁药材的HPLC特征图谱的相似度进行评价，得到由6个特征峰构成的核桃仁药材的HPLC标准特征图谱；在所述HPLC标准特征图谱中，与没食子酸对照品参照物峰相对应的峰1为S1峰，计算峰2、峰3与S1峰的相对保留时间，其相对保留时间在规定值的±10％范围之内，规定值为：1.00(峰1)、2.23(峰2)、3.97(峰3)，与鞣花酸对照品参照物峰相对应的峰5为S2峰，计算峰4、峰6与S2峰的相对保留时间，其相对保留时间在规定值的±10％范围之内，规定值为：0.96(峰4)、1.00(峰5)、1.16(峰6)。
在本发明提供的构建方法中，优选还包括以下步骤：
采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统对核桃仁饮片的HPLC特征图谱的相似度进行评价，得到由6个特征峰构成的核桃仁饮片的HPLC标准特征图谱；在所述HPLC标准特征图谱中，与没食子酸对照品参照物峰相对应的峰1为S1峰，计算峰2、峰3与S1峰的相对保留时间，其相对保留时间在规定值的±10％范围之内，规定值为：1.00(峰1)、2.23(峰2)、3.98(峰3)，与鞣花酸对照品参照物峰相对应的峰5为S2峰，计算峰4、峰6与S2峰的相对保留时间，其相对保留时间在规定值的±10％范围之内，规定值为：0.96(峰4)、1.00(峰5)、1.16(峰6)。
在本发明提供的构建方法中，优选还包括以下步骤：
采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统对核桃仁标准汤剂的HPLC特征图谱的相似度进行评价，得到由6个特征峰构成的核桃仁标准汤剂的HPLC标准特征图谱；在所述HPLC标准特征图谱中，与没食子酸对照品参照物峰相对应的峰1为S1峰，计算峰2、峰3与S1峰的相对保留时间，其相对保留时间在规定值的±10％范围之内，规定值为：1.00(峰1)、2.22(峰2)、3.98(峰3)，与鞣花酸对照品参照物峰相对应的峰5为S2峰，计算峰4、峰6与S2峰的相对保留时间，其相对保留时间在规定值的±10％范围之内，规定值为：0.96(峰4)、1.00(峰5)、1.16(峰6)。
在本发明提供的构建方法中，优选还包括以下步骤：
采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统对核桃仁配方颗粒的HPLC特征图谱的相似度进行评价，得到由6个特征峰构成的核桃仁配方颗粒的HPLC标准特征图谱；在所述HPLC标准特征图谱中，与没食子酸对照品参照物峰相对应的峰1为S1峰，计算峰2、峰3与S1峰的相对保留时间，其相对保留时间在规定值的±10％范围之内，规定值为：1.00(峰1)、2.23(峰2)、3.98(峰3)，与鞣花酸对照品参照物峰相对应的峰5为S2峰，计算峰4、峰6与S2峰的相对保留时间，其相对保留时间在规定值的±10％范围之内，规定值为：0.96(峰4)、1.00(峰5)、1.16(峰6)。
本发明还提供了一种核桃仁药材、饮片、标准汤剂、配方颗粒的鉴别方法，该方法采用上述技术方案所述的构建方法获得的HPLC特征图谱作为鉴别核桃仁药材、饮片、标准汤剂、配方颗粒的依据。
与现有技术相比，本发明提供了一种核桃仁药材、饮片、标准汤剂、配方颗粒HPLC特征图谱的构建方法及其应用，本发明提供的方法能够用于建立核桃仁药材、饮片、标准汤剂以及配方颗粒的HPLC特征图谱，具有良好的重复性、精密度和稳定性，可以为核桃仁药材、饮片、标准汤剂及配方颗粒的鉴别提供更为科学的依据。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例1提供的核桃仁标准汤剂不同波长色谱图；
图2是本发明实施例1提供的核桃仁标准汤剂的柱温考察色谱图；
图3是本发明实施例1提供的核桃仁标准汤剂的流速考察色谱图；
图4是本发明实施例1提供的核桃仁标准汤剂的延迟性考察色谱图；
图5是本发明实施例1提供的核桃仁标准汤剂供试品溶液制备过程中溶解溶剂考察的实验结果图；
图6是本发明实施例1提供的核桃仁标准汤剂供试品溶液制备过程中溶解方式考察的实验结果图；
图7是本发明实施例1提供的核桃仁标准汤剂供试品溶液制备过程中溶解时间考察的实验结果图；
图8是本发明实施例1提供的核桃仁标准汤剂供试品溶液制备过程中溶剂加入量考察的实验结果图；
图9是本发明实施例1提供的核桃仁标准汤剂特征图谱色谱峰指认图；
图10是本发明实施例1提供的没食子酸对照品的紫外吸收光谱图；
图11是本发明实施例1提供的供试品中没食子酸的紫外吸收光谱图；
图12是本发明实施例1提供的鞣花酸对照品的紫外吸收光谱图；
图13是本发明实施例1提供的供试品中鞣花酸的紫外吸收光谱图；
图14是本发明实施例1提供的核桃仁标准汤剂不同仪器考察的实验结果图；
图15是本发明实施例1提供的核桃仁标准汤剂不同色谱柱考察的实验结果图；
图16是本发明实施例1提供的16批核桃仁标准汤剂的特征图谱验证图；
图17是本发明实施例1提供的核桃仁标准汤剂特征图谱的对照图谱；
图18是本发明实施例2提供的核桃仁药材不同波长色谱图；
图19是本发明实施例2提供的核桃仁药材的柱温考察色谱图；
图20是本发明实施例2提供的核桃仁药材的流速考察色谱图；
图21是本发明实施例2提供的核桃仁药材的延迟性考察色谱图；
图22是本发明实施例2提供的核桃仁药材供试品溶液制备过程中溶解溶剂考察的实验结果图；
图23是本发明实施例2提供的核桃仁药材供试品溶液制备过程中煎煮时间考察的实验结果图；
图24是本发明实施例2提供的核桃仁药材供试品溶液制备过程中溶剂加入量考察的实验结果图；
图25是本发明实施例2提供的核桃仁药材供试品溶液制备过程中溶解方式考察的实验结果图；
图26是本发明实施例2提供的核桃仁药材特征图谱色谱峰指认图；
图27是本发明实施例2提供的核桃仁药材不同仪器考察的实验结果图；
图28是本发明实施例2提供的核桃仁药材不同色谱柱考察的实验结果图；
图29是本发明实施例2提供的16批核桃仁药材的特征图谱验证图；
图30是本发明实施例1提供的核桃仁药材特征图谱的对照图谱；
图31是本发明实施例2提供的16批核桃仁饮片的特征图谱验证图；
图32是本发明实施例2提供的核桃仁饮片特征图谱的对照图谱；
图33是本发明实施例3提供的核桃仁配方颗粒不同波长色谱图；
图34是本发明实施例3提供的核桃仁配方颗粒的柱温考察色谱图；
图35是本发明实施例3提供的核桃仁配方颗粒的流速考察色谱图；
图36是本发明实施例3提供的核桃仁配方颗粒的延迟性考察色谱图；
图37是本发明实施例3提供的核桃仁配方颗粒供试品溶液制备过程中溶解溶剂考察的实验结果图；
图38是本发明实施例3提供的核桃仁配方颗粒供试品溶液制备过程中溶解方式考察的实验结果图；
图39是本发明实施例3提供的核桃仁配方颗粒供试品溶液制备过程中溶解时间考察的实验结果图；
图40是本发明实施例3提供的核桃仁配方颗粒供试品溶液制备过程中溶剂加入量考察的实验结果图；
图41是本发明实施例3提供的核桃仁配方颗粒特征图谱色谱峰指认图；
图42是本发明实施例3提供的核桃仁配方颗粒不同仪器考察的实验结果图；
图43是本发明实施例3提供的核桃仁配方颗粒不同色谱柱考察的实验结果图；
图44是本发明实施例3提供的3批核桃仁配方颗粒的特征图谱验证图；
图45是本发明实施例3提供的核桃仁配方颗粒特征图谱的对照图谱。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
核桃仁标准汤剂HPLC特征图谱的构建：
1)实验仪器及材料
高效液相色谱仪：安捷伦、赛默飞、Waters型高效液相色谱仪，如无特别说明，默认使用安捷伦高效液相色谱仪；
电子天平：ME204E/02、MS205DU、XP26(梅特勒-托利多仪器有限公司)；
超纯水机：细胞型1810A(上海摩勒科学仪器有限公司)；
超声波清洗器：KQ600-DB型(600W，40KHz；昆山市超声仪器有限公司)；
色谱柱：Agilent C18-1、Agilent C18-2、岛津C18色谱柱，如无特别说明，默认使用Agilent C18-1色谱柱。
2)试剂及试药
乙腈、磷酸为色谱纯，水为超纯水，其余试剂如无特别说明均为分析纯；
没食子酸对照品(中国食品药品检定研究院，批号：110831-201906，纯度：91.5％)；
鞣花酸对照品(中国食品药品检定研究院，批号：111959-201903，纯度：88.8％)
核桃仁对照药材(成都德思特生物技术有限公司，批号：DSTYH005301)；
核桃仁标准汤剂(四川新绿色药业科技发展有限公司制备，批号：HTRBT01、HTRBT02、HTRBT03、HTRBT04、HTRBT05、HTRBT06、HTRBT07、HTRBT08、HTRBT09、HTRBT10、HTRBT11、HTRBT12、HTRBT13、HTRBT4、HTRBT15、HTRBT16)。
3)特征图谱检测方法
色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以0.1wt％磷酸溶液为流动相B，按表1中的规定进行梯度洗脱；流速为每分钟0.3mL；柱温25℃；检测波长为254nm；理论板数按鞣花酸峰计算应不低于5000。
表1梯度洗脱程序
| 时间(分钟) | 流动相A(vol％) | 流动相B(vol％) |
| 0～5 | 2 | 98 |
| 5～13 | 2→10 | 98→90 |
| 13～17 | 10→13.5 | 90→86.5 |
| 17～24 | 13.5→19.5 | 86.5→80.5 |
| 24～30 | 19.5→25 | 80.5→75 |
参照物溶液的制备：取核桃仁对照药材1.0g，置具塞锥形瓶中，加水30mL，煎煮30分钟，放冷，离心(转速为每分钟6000转)4分钟，取上清液，蒸干，残渣加50vol％甲醇溶液10mL使溶解，过滤，取续滤液，作为对照药材参照物溶液；另取没食子酸对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含20μg没食子酸的溶液，作为没食子酸对照品参照物溶液；另取鞣花酸对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含50μg鞣花酸的溶液，作为鞣花酸对照品参照物溶液。
供试品溶液的制备：取本品粉末0.3g，置具塞锥形瓶中，加入50vol％甲醇溶液50mL，密塞，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
测定法：分别精密吸取参照物溶液和供试品溶液各1μL，注入液相色谱仪，测定，即得。
4)色谱条件的考察
4.1)波长选择
在以上拟定的实验条件基础上，利用二极管阵列检测器对供试品溶液进行全波段扫描，并分别提取供试品溶液在204nm、224nm、254nm、274nm、294nm、314nm波长下的色谱图，结果见图1，图1是本发明实施例1提供的核桃仁标准汤剂不同波长色谱图。通过图1可以看出，在检测波长为254nm时色谱峰信息量较大，色谱图基线更平稳，故检测波长确定为254nm。
4.2)柱温考察
在以上拟定的实验条件基础上，分别在柱温为20℃、25℃、30℃条件下对供试品溶液进行色谱检测，结果见图2，图2是本发明实施例1提供的核桃仁标准汤剂的柱温考察色谱图。通过图2可以看出，在柱温为25℃时，色谱图峰形较为对称，分离度较好，出峰较完全，故柱温确定为25℃。
4.3)流速考察
在以上拟定的实验条件基础上，分别在流速为0.25mL/min、0.3mL/min、0.25mL/min条件下对供试品溶液进行色谱检测，结果见图3，图3是本发明实施例1提供的核桃仁标准汤剂的流速考察色谱图。通过图3可以看出，流速为0.3mL/min时，色谱图峰形较好，分离度适中，故流速确定为0.3mL/min。
4.4)延迟性考察
在以上拟定的实验条件基础上，进行延迟性试验，结果见图4，图4是本发明实施例1提供的核桃仁标准汤剂的延迟性考察色谱图。通过图4可以看出，样品在30min后基本无有用色谱峰，故样品检测时间定为30min。
5)供试品溶液的制备考察
5.1)溶解溶剂的考察
取本品粉末0.3g，置具塞锥形瓶中，分别加水、甲醇、70vol％甲醇、50vol％甲醇、乙醇、50vol％乙醇各20mL，密塞，分别超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。
按以上拟定的实验条件，分别对使用不同溶剂制成的供试品溶液进行色谱测定，结果见图5，图5是本发明实施例1提供的核桃仁标准汤剂供试品溶液制备过程中溶解溶剂考察的实验结果图。通过图5可知，溶剂为50vol％甲醇时，色谱图中的各特征峰峰形好，分离度适中，溶剂确定为50vol％甲醇。
5.2)溶解方式的考察
取本品粉末0.3g，置具塞锥形瓶中，加入50vol％甲醇20mL，密塞，分别超声处理(功率600W，频率40kHz)和加热回流30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。
按以上拟定的实验条件，分别对超声处理和加热回流的供试品溶液进行色谱测定，结果见图6，图6是本发明实施例1提供的核桃仁标准汤剂供试品溶液制备过程中溶解方式考察的实验结果图。通过图6可知，对供试品进行回流和超声处理时的效果差异不大，由于超声处理快速简便，故供试品的溶解方式确定为超声溶解。
5.3)溶解时间的考察
取本品粉末0.3g，置具塞锥形瓶中，加50vol％甲醇20mL，密塞，分别超声处理(功率600W，频率40kHz)15分钟、30分钟、45分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。
按以上拟定的实验条件，分别对超声处理不同时间的供试品溶液进行色谱测定，结果见图7，图7是本发明实施例1提供的核桃仁标准汤剂供试品溶液制备过程中溶解时间考察的实验结果图。通过图7可知，超声溶解时间为30min时，色谱图峰形与分离度较好，故溶解时间确定为30min。
5.4)溶剂加入量的考察
取本品粉末0.3g，置具塞锥形瓶中，分别加入50vol％甲醇10mL、20mL、50mL，密塞，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。
按以上拟定的实验条件，分别对不同溶剂加入量的供试品溶液进行色谱测定，结果见图8，图8是本发明实施例1提供的核桃仁标准汤剂供试品溶液制备过程中溶剂加入量考察的实验结果图。通过图8可知，在溶剂加入量为50mL时，各个色谱峰峰形与分离度较好，故溶剂量选择50mL。
6)方法学考察
6.1)色谱峰指认
按以上拟定的实验条件，制备核桃仁标准汤剂供试品溶液、核桃仁对照药材参照物溶液、没食子酸对照品参照物溶液、鞣花酸对照品参照物溶液，同时，参照以上拟定的实验条件，制备缺核桃仁标准汤剂的阴性对照溶液(即，空白溶液)，进行色谱检测。
对核桃仁标准汤剂特征图谱峰进行定位，结果见图9～13，图9是本发明实施例1提供的核桃仁标准汤剂特征图谱色谱峰指认图，图10是本发明实施例1提供的没食子酸对照品的紫外吸收光谱图，图11是本发明实施例1提供的供试品中没食子酸的紫外吸收光谱图，图12是本发明实施例1提供的鞣花酸对照品的紫外吸收光谱图，图13是本发明实施例1提供的供试品中鞣花酸的紫外吸收光谱图。结果表明，峰1为没食子酸，峰5为鞣花酸。在以下方法学考察中，将与没食子酸峰相对应的峰1设为S1峰，计算峰2、峰3与S1峰的相对保留时间，将与鞣花酸峰相对应的峰5设为S2峰，计算峰4、峰6与S2峰的相对保留时间，对样品中的6个特征峰进行考察。
6.2)精密度试验
取核桃仁标准汤剂供试品溶液，按拟定实验方法连续进样6次，每次1μL，计算各特征峰的保留时间，结果见表2。
表2精密度考察-保留时间
通过表2可知，各峰保留时间的RSD值为0.01％～0.08％，该仪器精密度良好。
6.3)重复性考察
精密称取核桃仁标准汤剂6份，按拟定实验方法进行供试品溶液制备及色谱测定，结果见表3。
表3重复性考察—特征峰相对保留时间
通过表3可知，各特征峰相对保留时间的RSD在0.01％～0.13％，表明本方法重复性良好。
6.4)中间精密度考察
6.4.1)不同仪器考察
在以上拟定的实验条件基础上，分别精密称取核桃仁标准汤剂(批号：HTR-BT-230816)0.3g，3份，制备供试品溶液，分别在Waters、安捷伦、赛默飞高效液相色谱仪上进行测定，计算各特征峰的相对保留时间，结果见图14和表4，图14是本发明实施例1提供的核桃仁标准汤剂不同仪器考察的实验结果图。
表4不同仪器考察—特征峰相对保留时间
通过表4可以看出，用上述3种仪器对供试品进行检测时，各特征峰相对保留时间的RSD在0.29％～6.56％，表明仪器耐用性良好。
6.4.2)不同人员和时间考察
在以上拟定的实验条件基础上，由不同人员(A、B)在不同时间(T1、T2)分别精密称取核桃仁标准汤剂各两份，制备供试品，进行测定，结果见表5。
表5不同人员与时间考察—特征峰相对保留时间
通过表5可以看出，不同样品制备人员和不同样品制备时间条件下，各特征峰相对保留时间的RSD在0.02％～0.13％，方法稳定性良好。
6.5)耐用性考察
6.5.1)色谱柱耐用性考察
在以上拟定的实验条件基础上，分别对不同品牌色谱柱Agilent C18-1、AgilentC18-2、岛津C18色谱柱进行考察，结果见图15和表6，图15是本发明实施例1提供的核桃仁标准汤剂不同色谱柱考察的实验结果图。
表6色谱柱耐用性考察—特征峰相对保留时间
通过表6可以看出，不同品牌色谱柱各特征峰相对保留时间的RSD在0.10～8.70％，色谱柱耐用性良好。
6.5.2)稳定性考察
在以上拟定的实验条件基础上，取同一供试品溶液，分别于0h、4h、8h、12h、16h、24h时测定，结果见表7。
表7稳定性考察—保留时间
通过表7可以看出，其相对应的特征峰保留时间的RSD在0.02％～0.27％，样品溶液在24小时内较稳定。
综上所述，各特征峰相对保留时间的RSD在以上各项考察中均符合要求，该方法良好。将上述6个特征峰纳入后续考察。
7)特征峰的确定及对照图谱的建立
7.1)16批核桃仁标准汤剂验证结果
采用拟定的方法，对16批样品进行特征图谱分析，计算相对保留时间，结果见图16和表8，图16是本发明实施例1提供的16批核桃仁标准汤剂的特征图谱验证图，图16中，S1～S16分别为：HTRBT01、HTRBT02、HTRBT03、HTRBT04、HTRBT05、HTRBT06、HTRBT07、HTRBT08、HTRBT09、HTRBT10、HTRBT11、HTRBT12、HTRBT13、HTRBT14、HTRBT15、HTRBT16。
表816批核桃仁标准汤剂的相对保留时间
根据相对保留时间稳定及各批次样品均能检出且峰相对较高的原则，共选择了6个耐用性较好的峰作为特征峰。根据方法学考察结果和16批标准汤剂验证结果，确定理论塔板数按鞣花酸峰计算应不低于5000。
7.2)相对保留时间规定值限度的制定
方法学各考察项目及验证结果汇总见表9：
表9方法学各项目结果RSD(％)汇总标准—相对保留时间(保留时间)
各特征峰的保留时间或相对保留时间稳定，且在平均值±10％范围内，故将各峰的相对保留时间规定值范围确定为±10％。
最终规定：供试品色谱中应呈现6个特征峰，并应与对照药材参照物色谱中的6个特征峰保留时间相对应，其中峰1、峰5应分别与没食子酸对照品、鞣花酸对照品参照物峰保留时间相对应，与没食子酸对照品参照物峰相应的峰为S1峰，计算峰2、峰3与S1峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10％范围之内，规定值为：1.00(峰1)、2.22(峰2)、3.98(峰3)；与鞣花酸对照品参照物峰相应的峰为S2峰，计算峰4、峰6与S2峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10％范围之内，规定值为：0.96(峰4)、1.00(峰5)、1.16(峰6)。
采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)对16批核桃仁标准汤剂进行合成，建立了核桃仁标准汤剂特征图谱的对照图谱，如图17所示，图17是本发明实施例1提供的核桃仁标准汤剂特征图谱的对照图谱。
8)核桃仁标准汤剂特征图谱方法确定
色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以0.1wt％磷酸溶液为流动相B，按表1中的规定进行梯度洗脱；流速为每分钟0.3mL；柱温25℃；检测波长为254nm；理论板数按鞣花酸峰计算应不低于5000。
参照物溶液的制备：取核桃仁对照药材1.0g，置具塞锥形瓶中，加水30mL，煎煮30分钟，放冷，离心(转速为每分钟6000转)4分钟，取上清液，蒸干，残渣加50vol％甲醇溶液10mL使溶解，过滤，取续滤液，作为对照药材参照物溶液；另取没食子酸对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含20μg没食子酸的溶液，作为没食子酸对照品参照物溶液；另取鞣花酸对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含50μg鞣花酸的溶液，作为鞣花酸对照品参照物溶液。
供试品溶液的制备：取本品粉末0.3g，置具塞锥形瓶中，加入50vol％甲醇溶液50mL，密塞，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
测定法：分别精密吸取参照物溶液和供试品溶液各1μL，注入液相色谱仪，测定，即得。
实施例2
核桃仁药材、饮片HPLC特征图谱的构建：
1)实验仪器及材料
同实施例1，不再赘述。
2)试剂及试药
核桃仁药材(四川新绿色药业科技发展有限公司制备，批号：HTR01、HTR02、HTR03、HTR04、HTR05、HTR06、HTR07、HTR08、HTR09、HTR10、HTR11、HTR12、HTR13、HTR14、HTR15、HTR16)；
核桃仁饮片(四川新绿色药业科技发展有限公司制备，批号：HTR17、HTR18、HTR19、HTR20、HTR21、HTR22、HTR23、HTR24、HTR25、HTR26、HTR27、HTR28、HTR29、HTR30、HTR31、HTR32)；
其他试剂及试药同实施例1，不再赘述。
3)特征图谱检测方法
色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以0.1wt％磷酸溶液为流动相B，按表1中的规定进行梯度洗脱；流速为每分钟0.3mL；柱温25℃；检测波长为254nm；理论板数按鞣花酸峰计算应不低于5000。
参照物溶液的制备：取核桃仁对照药材1.0g，置具塞锥形瓶中，加水30mL，煎煮30分钟，放冷，离心(转速为每分钟6000转)4分钟，取上清液，蒸干，残渣加50vol％甲醇溶液10mL使溶解，过滤，取续滤液，作为对照药材参照物溶液；另取没食子酸对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含20μg没食子酸的溶液，作为没食子酸对照品参照物溶液；另取鞣花酸对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含50μg鞣花酸的溶液，作为鞣花酸对照品参照物溶液。
供试品溶液的制备：取本品粉末1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加水30mL，煎煮30分钟，放冷，离心(转速为每分钟6000转)4分钟，取上清液，蒸干，残渣加50vol％甲醇溶液10mL使溶解，过滤，取续滤液，即得。
测定法：分别精密吸取参照物溶液和供试品溶液各1μL，注入液相色谱仪，测定，即得。
4)色谱条件的考察
4.1)波长选择
在以上拟定的实验条件基础上，利用二极管阵列检测器对供试品溶液进行全波段扫描，并分别提取供试品溶液在204nm、224nm、254nm、274nm、294nm、314nm波长下的色谱图，结果见图18，图18是本发明实施例2提供的核桃仁药材不同波长色谱图。通过图18可以看出，在检测波长为254nm时色谱峰信息量较大，色谱图基线更平稳，故检测波长确定为254nm。
4.2)柱温考察
在以上拟定的实验条件基础上，分别在柱温为20℃、25℃、30℃条件下对供试品溶液进行色谱检测，结果见图19，图19是本发明实施例2提供的核桃仁药材的柱温考察色谱图。通过图19可以看出，在柱温为25℃时，色谱图峰形较为对称，分离度较好，出峰较完全，故柱温确定为25℃。
4.3)流速考察
在以上拟定的实验条件基础上，分别在流速为0.25mL/min、0.3mL/min、0.25mL/min条件下对供试品溶液进行色谱检测，结果见图20，图20是本发明实施例2提供的核桃仁药材的流速考察色谱图。通过图20可以看出，流速为0.3mL/min时，色谱图峰形较好，分离度适中，故流速确定为0.3mL/min。
4.4)延迟性考察
在以上拟定的实验条件基础上，进行延迟性试验，结果见图21，图21是本发明实施例2提供的核桃仁药材的延迟性考察色谱图。通过图21可以看出，样品在30min后基本无有用色谱峰，故样品检测时间定为30min。
5)供试品溶液的制备考察
5.1)溶解溶剂的考察
取本品粉末1.0g，置具塞锥形瓶中，加水30ml，煎煮30分钟，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣分别用甲醇、70vol％甲醇、50vol％甲醇、50vol％乙醇、乙醇、水各10mL溶解，过滤，取续滤液，即得供试品溶液。
按以上拟定的实验条件，分别对使用不同溶剂制成的供试品溶液进行色谱测定，结果见图22，图22是本发明实施例2提供的核桃仁药材供试品溶液制备过程中溶解溶剂考察的实验结果图。通过图22可知，溶剂为50vol％甲醇时，色谱图中的各特征峰峰形好，分离度适中，溶剂确定为50vol％甲醇。
5.2)煎煮时间的考察
取本品粉末1.0g，置具塞锥形瓶中，加水30mL，分别煎煮15分钟、30分钟、45分钟，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣用50vol％甲醇10mL溶解，过滤，取续滤液，即得供试品溶液。
按以上拟定的实验条件，分别对煎煮不同时间的供试品溶液进行色谱测定，结果见图23，图23是本发明实施例2提供的核桃仁药材供试品溶液制备过程中煎煮时间考察的实验结果图。通过图23可知，煎煮时间为30min时，色谱图峰形与分离度较好，故煎煮时间确定为30min。
5.3)溶剂加入量的考察
取本品粉末1.0g，置具塞锥形瓶中，加水30mL，煎煮30分钟，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣分别加入50vol％甲醇10mL、20mL、50mL溶解，过滤，取续滤液，即得供试品溶液。
按以上拟定的实验条件，分别对不同溶剂加入量的供试品溶液进行色谱测定，结果见图24，图24是本发明实施例2提供的核桃仁药材供试品溶液制备过程中溶剂加入量考察的实验结果图。通过图24可知，在溶剂加入量为10mL时，各个色谱峰峰形与分离度较好，故溶剂量选择10mL。
5.4)溶解方式的考察
取本品粉末1.0g，置具塞锥形瓶中，加水30mL，煎煮30分钟，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣用50vol％甲醇10ml溶解，过滤，取续滤液，作为供试品溶液；另外取本品约1.0g，置具塞锥形瓶中，加入甲醇10mL，密塞，称定重量，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，作为供试品溶液。
按以上拟定的实验条件，分别对煎煮和超声处理制得的供试品溶液进行色谱测定，结果见图25，图25是本发明实施例2提供的核桃仁药材供试品溶液制备过程中溶解方式考察的实验结果图。通过图25可知，煎煮获得的供试品溶液的各峰形分离较好，故供试品的溶解方式确定为煎煮。
6)方法学考察
6.1)色谱峰指认
按以上拟定的实验条件，制备核桃仁药材供试品溶液、核桃仁对照药材参照物溶液、没食子酸对照品参照物溶液、鞣花酸对照品参照物溶液，同时，参照以上拟定的实验条件，制备缺核桃仁药材的阴性对照溶液(即，空白溶液)，进行色谱检测。
对核桃仁药材特征图谱峰进行定位，结果见图26，图26是本发明实施例2提供的核桃仁药材特征图谱色谱峰指认图。结果表明，峰1为没食子酸，峰5为鞣花酸。在以下方法学考察中，将与没食子酸峰相对应的峰1设为S1峰，计算峰2、峰3与S1峰的相对保留时间，将与鞣花酸峰相对应的峰5设为S2峰，计算峰4、峰6与S2峰的相对保留时间，对样品中的6个特征峰进行考察。
6.2)精密度试验
取核桃仁药材1.0g制备供试品溶液，按拟定实验方法连续进样6次，每次1μL，计算各特征峰的保留时间，结果见表10。
表10精密度考察-保留时间
/>
通过表10可知，精密度考察中各特征峰保留时间的RSD在0.00％～0.06％，精密度良好。
6.3)重复性考察
取核桃仁药材(过三号筛)约1.0g，6份，按拟定实验方法进行供试品溶液制备及色谱测定，结果见表11。
表11重复性考察—特征峰相对保留时间
通过表11可知，特征峰相对保留时间的RSD在0.08％～1.50％，重复性良好。
6.4)中间精密度考察
6.4.1)不同人员和时间考察
在以上拟定的实验条件基础上，由不同人员(A、B)在不同时间(T1、T2)分别称取核桃仁药材约1.0g，各两份，制备供试品，进行测定，结果见表12。
表12不同人员与时间考察—特征峰相对保留时间
通过表12可以看出，不同样品制备人员和不同样品制备时间条件下，各特征峰相对保留时间的RSD在0.01％～0.08％，方法稳定性良好。
6.4.2)不同仪器考察
在以上拟定的实验条件基础上，分别称取核桃仁药材约1.0g，各3份，制备供试品溶液，分别在Waters、安捷伦、赛默飞高效液相色谱仪上进行测定，计算各特征峰的相对保留时间，结果见图27和表13，图27是本发明实施例2提供的核桃仁药材不同仪器考察的实验结果图。
表13不同仪器考察—特征峰相对保留时间
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通过表13可以看出，用上述3种仪器对供试品进行检测时，各特征峰相对保留时间的RSD在0.30％～6.32％，表明仪器耐用性良好。
6.5)耐用性考察
6.5.1)色谱柱耐用性考察
在以上拟定的实验条件基础上，分别对不同品牌色谱柱Agilent C18-1、AgilentC18-2、岛津C18色谱柱进行考察，结果见图28和表14，图28是本发明实施例2提供的核桃仁药材不同色谱柱考察的实验结果图。
表14色谱柱耐用性考察—特征峰相对保留时间
通过表14可以看出，用上述3种色谱柱对样品进行检测，特征峰相对保留时间的RSD在0.10％～8.78％，表明色谱柱耐用性良好。
6.5.2)稳定性考察
在以上拟定的实验条件基础上，取同一供试品溶液，分别于0h、4h、8h、12h、16h、24h时测定，结果见表15。
表15稳定性考察—保留时间
通过表15可以看出，其相对应的特征峰保留时间的RSD在0.09％～1.54％，样品溶液在24小时内较稳定。
综上所述，各特征峰相对保留时间的RSD在以上各项考察中均符合要求，该方法良好。将上述6个特征峰纳入后续考察。
7)特征峰的确定及对照图谱的建立
7.1)16批核桃仁药材验证结果
采用拟定的方法，对16批样品进行特征图谱分析，计算相对保留时间，结果见图29和表16，图29是本发明实施例2提供的16批核桃仁药材的特征图谱验证图，图29中，S1～S16分别为：HTR01、HTR02、HTR03、HTR04、HTR05、HTR06、HTR07、HTR08、HTR09、HTR10、HTR11、HTR12、HTR13、HTR14、HTR15、HTR16。
表1616批核桃仁药材的相对保留时间
根据相对保留时间稳定及各批次样品均能检出且峰相对较高的原则，共选择了6个重复性较好的峰作为特征峰。
7.2)相对保留时间规定值限度的制定
最终规定：供试品色谱中应呈现6个特征峰，并应与对照药材参照物色谱中的6个特征峰保留时间相对应，其中峰1、峰5应分别与没食子酸对照品、鞣花酸对照品参照物峰保留时间相对应，与没食子酸对照品参照物峰相应的峰为S1峰，计算峰2、峰3与S1峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10％范围之内，规定值为：1.00(峰1)、2.23(峰2)、3.97(峰3)；与鞣花酸对照品参照物峰相应的峰为S2峰，计算峰4、峰6与S2峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10％范围之内，规定值为：0.96(峰4)、1.00(峰5)、1.16(峰6)。
采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)对16批核桃仁药材进行合成，建立了核桃仁药材特征图谱的对照图谱，如图30所示，图30是本发明实施例1提供的核桃仁药材特征图谱的对照图谱。
7.3)核桃仁饮片特征图谱验证
采用拟定的方法，对16批核桃仁饮片样品进行特征图谱分析，计算相对保留时间，结果见图31和表17，图31是本发明实施例2提供的16批核桃仁饮片的特征图谱验证图，图29中，S1～S21分别为：HTR17、HTR18、HTR19、HTR20、HTR21、HTR22、HTR23、HTR24、HTR25、HTR26、HTR27、HTR28、HTR29、HTR30、HTR31、HTR32。
表1716批核桃仁饮片的相对保留时间
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根据相对保留时间稳定及各批次样品均能检出且峰相对较高的原则，共选择了6个重复性较好的峰作为特征峰。
最终规定：供试品色谱中应呈现6个特征峰，并应与对照药材参照物色谱中的6个特征峰保留时间相对应，其中峰1、峰5应分别与没食子酸对照品、鞣花酸对照品参照物峰保留时间相对应，与没食子酸对照品参照物峰相应的峰为S1峰，计算峰2、峰3与S1峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10％范围之内，规定值为：1.00(峰1)、2.23(峰2)、3.98(峰3)；与鞣花酸对照品参照物峰相应的峰为S2峰，计算峰4、峰6与S2峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10％范围之内，规定值为：0.96(峰4)、1.00(峰5)、1.16(峰6)。
采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)对16批核桃仁饮片进行合成，建立了核桃仁饮片特征图谱的对照图谱，如图32所示，图32是本发明实施例2提供的核桃仁饮片特征图谱的对照图谱。
8)核桃仁标准汤剂特征图谱方法确定
色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以0.1wt％磷酸溶液为流动相B，按表1中的规定进行梯度洗脱；流速为每分钟0.3mL；柱温25℃；检测波长为254nm；理论板数按鞣花酸峰计算应不低于5000。
参照物溶液的制备：取核桃仁对照药材1.0g，置具塞锥形瓶中，加水30mL，煎煮30分钟，放冷，离心(转速为每分钟6000转)4分钟，取上清液，蒸干，残渣加50vol％甲醇溶液10mL使溶解，过滤，取续滤液，作为对照药材参照物溶液；另取没食子酸对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含20μg没食子酸的溶液，作为没食子酸对照品参照物溶液；另取鞣花酸对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含50μg鞣花酸的溶液，作为鞣花酸对照品参照物溶液。
供试品溶液的制备：取本品粉末1.0g，置具塞锥形瓶中，加水30mL，煎煮30分钟，放冷，离心(转速为每分钟6000转)4分钟，取上清液，蒸干，残渣加50vol％甲醇溶液10mL使溶解，过滤，取续滤液，即得。
测定法：分别精密吸取参照物溶液和供试品溶液各1μL，注入液相色谱仪，测定，即得。
实施例3
核桃仁配方颗粒HPLC特征图谱的构建：
1)实验仪器及材料
同实施例1，不再赘述。
2)试剂及试药
核桃仁配方颗粒(四川新绿色药业科技发展有限公司制备，批号：KL1、KL2、KL3)；
其他试剂及试药同实施例1，不再赘述。
3)特征图谱检测方法
色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以0.1wt％磷酸溶液为流动相B，按表1中的规定进行梯度洗脱；流速为每分钟0.3mL；柱温25℃；检测波长为254nm；理论板数按鞣花酸峰计算应不低于5000。
参照物溶液的制备：取核桃仁对照药材1.0g，置具塞锥形瓶中，加水30mL，煎煮30分钟，放冷，离心(转速为每分钟6000转)4分钟，取上清液，蒸干，残渣加50vol％甲醇溶液10mL使溶解，过滤，取续滤液，作为对照药材参照物溶液；另取没食子酸对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含20μg没食子酸的溶液，作为没食子酸对照品参照物溶液；另取鞣花酸对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含50μg鞣花酸的溶液，作为鞣花酸对照品参照物溶液。
供试品溶液的制备：取本品适量，研细，取约0.3g，置具塞锥形瓶中，加入50vol％甲醇10mL，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
测定法：分别精密吸取参照物溶液和供试品溶液各1μL，注入液相色谱仪，测定，即得。
4)色谱条件的考察
4.1)波长选择
在以上拟定的实验条件基础上，利用二极管阵列检测器对供试品溶液进行全波段扫描，并分别提取供试品溶液在204nm、224nm、254nm、274nm、294nm、314nm波长下的色谱图，结果见图33，图33是本发明实施例3提供的核桃仁配方颗粒不同波长色谱图。通过图33可以看出，在检测波长为254nm时色谱峰信息量较大，色谱图基线更平稳，故检测波长确定为254nm。
4.2)柱温考察
在以上拟定的实验条件基础上，分别在柱温为20℃、25℃、30℃条件下对供试品溶液进行色谱检测，结果见图34，图34是本发明实施例3提供的核桃仁配方颗粒的柱温考察色谱图。通过图34可以看出，在柱温为25℃时，色谱图峰形较为对称，分离度较好，出峰较完全，故柱温确定为25℃。
4.3)流速考察
在以上拟定的实验条件基础上，分别在流速为0.25mL/min、0.3mL/min、0.25mL/min条件下对供试品溶液进行色谱检测，结果见图35，图35是本发明实施例3提供的核桃仁配方颗粒的流速考察色谱图。通过图35可以看出，流速为0.3mL/min时，色谱图峰形较好，分离度适中，故流速确定为0.3mL/min。
4.4)延迟性考察
在以上拟定的实验条件基础上，将色谱图采集时间延长至60min，结果见图36，图36是本发明实施例3提供的核桃仁配方颗粒的延迟性考察色谱图。通过图36可以看出，在色谱图采集到30分钟时，已将色谱峰采集完全，故将色谱图采集时间确定为30min。
5)供试品溶液的制备考察
5.1)溶解溶剂的考察
取本品适量，研细，取0.3g，置具塞锥形瓶中，分别加入甲醇、70vol％甲醇、50vol％甲醇、乙醇、50vol％乙醇、水各10mL，密塞，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。
按以上拟定的实验条件，分别对使用不同溶剂制成的供试品溶液进行色谱测定，结果见图37，图37是本发明实施例3提供的核桃仁配方颗粒供试品溶液制备过程中溶解溶剂考察的实验结果图。通过图22可知，溶剂为50vol％甲醇时，各特征峰峰形好，分离度适中，溶剂确定为50vol％甲醇。
5.2)溶解方式的考察
取本品适量，研细，取0.3g，置具塞锥形瓶中，加入50vol％甲醇10mL，密塞，分别回流、超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。
按以上拟定的实验条件，分别对回流、超声处理制得的供试品溶液进行色谱测定，结果见图38，图38是本发明实施例3提供的核桃仁配方颗粒供试品溶液制备过程中溶解方式考察的实验结果图。通过图38可知，超声处理获得的供试品溶液的各峰形分离较好，故供试品的溶解方式确定为超声。
5.3)溶解时间的考察
取本品适量，研细，取0.3g，置具塞锥形瓶中，加入50vol％甲醇10mL，密塞，分别超声处理(功率600W，频率40kHz)15分钟、30分钟、45分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。
按以上拟定的实验条件，分别对超声处理不同时间的供试品溶液进行色谱测定，结果见图39，图39是本发明实施例3提供的核桃仁配方颗粒供试品溶液制备过程中溶解时间考察的实验结果图。通过图39可知，超声溶解时间为30min时，色谱图峰形与分离度较好，故溶解时间确定为30min。
5.4)溶剂加入量的考察
取本品适量，研细，取0.3g，置具塞锥形瓶中，分别加入50vol％甲醇10mL、20mL、50mL，密塞，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。
按以上拟定的实验条件，分别对不同溶剂加入量的供试品溶液进行色谱测定，结果见图40，图40是本发明实施例3提供的核桃仁配方颗粒供试品溶液制备过程中溶剂加入量考察的实验结果图。通过图40可知，在溶剂加入量为20mL时，各个色谱峰峰形与分离度较好，故溶剂量选择20mL。
6)方法学考察
6.1)色谱峰指认
按以上拟定的实验条件，制备核桃仁配方颗粒供试品溶液、核桃仁对照药材参照物溶液、没食子酸对照品参照物溶液、鞣花酸对照品参照物溶液，同时，参照以上拟定的实验条件，制备缺核桃仁配方颗粒的阴性对照溶液(即，空白溶液)，进行色谱检测。
对核桃仁配方颗粒特征图谱峰进行定位，结果见图41，图41是本发明实施例3提供的核桃仁配方颗粒特征图谱色谱峰指认图。结果表明，峰1为没食子酸，峰5为鞣花酸。在以下方法学考察中，将与没食子酸峰相对应的峰1设为S1峰，计算峰2、峰3与S1峰的相对保留时间，将与鞣花酸峰相对应的峰5设为S2峰，计算峰4、峰6与S2峰的相对保留时间，对样品中的6个特征峰进行考察。
6.2)精密度试验
取本品适量，研细，取0.3g，制备核桃仁配方颗粒供试品溶液，按拟定实验方法连续进样6次，每次1μL，计算各特征峰的保留时间，结果见表18。
表18精密度考察-保留时间
通过表18可知，精密度考察中各特征峰保留时间的RSD在0.01％～0.06％，精密度良好。
6.3)重复性考察
取本品适量，研细，取0.3g，6份，按拟定实验方法进行制备及测定，结果见表19。
表19重复性考察—特征峰相对保留时间
通过表19可知，特征峰相对保留时间的RSD在0.02％～0.10％，重复性良好。
6.4)中间精密度考察
6.4.1)不同人员和时间考察
在以上拟定的实验条件基础上，由不同人员(A、B)在不同时间(T1、T2)分别称取核桃仁配方颗粒，研细，取0.3g，各两份，制备供试品，进行测定，结果见表20。
表20不同人员与时间考察—特征峰相对保留时间
通过表20可以看出，不同样品制备人员和不同样品制备时间条件下，各特征峰相对保留时间的RSD在0.01％～0.11％，方法稳定性良好。
6.4.2)不同仪器考察
取本品适量，研细，取0.3g，制备供试品溶液，分别在安捷伦、Waters、赛默飞高效液相色谱仪上进行测定，结果见图42和表21，图42是本发明实施例3提供的核桃仁配方颗粒不同仪器考察的实验结果图。
表21不同仪器考察—特征峰相对保留时间
通过表21可以看出，用上述3种仪器对供试品进行检测时，各特征峰相对保留时间的RSD在0.44％～5.94％，表明仪器耐用性良好。
6.5)耐用性考察
6.5.1)色谱柱耐用性考察
在以上拟定的实验条件基础上，分别对不同品牌色谱柱Agilent C18-1、AgilentC18-2、岛津C18色谱柱进行考察，结果见图43和表22，图43是本发明实施例3提供的核桃仁配方颗粒不同色谱柱考察的实验结果图。
表22色谱柱耐用性考察—特征峰相对保留时间
通过表22可以看出，用上述3种色谱柱对样品进行检测，特征峰相对保留时间的RSD在0.05％～8.44％，表明色谱柱耐用性良好。
6.5.2)稳定性考察
在以上拟定的实验条件基础上，取同一供试品溶液，分别于0h、4h、8h、12h、16h、24h时测定，结果见表15。
表23稳定性考察—保留时间
通过表23可以看出，其相对应的特征峰保留时间的RSD在0.01％～0.11％，样品溶液在24小时内较稳定。
综上所述，各特征峰相对保留时间的RSD在以上各项考察中均符合要求，该方法良好。将上述6个特征峰纳入后续考察。
7)特征峰的确定及对照图谱的建立
7.1)3批核桃仁配方颗粒验证结果
采用拟定的方法，对3批样品进行特征图谱分析，计算相对保留时间，结果见图44和表24，图44是本发明实施例3提供的3批核桃仁配方颗粒的特征图谱验证图。
表243批核桃仁配方颗粒的相对保留时间
根据相对保留时间稳定及各批次样品均能检出且峰相对较高的原则，共选择了6个重复性较好的峰作为特征峰。
7.2)相对保留时间规定值限度的制定
方法学各考察项目及验证结果汇总见表25：
表25方法学各项目结果RSD(％)汇总标准—相对保留时间(保留时间)
最终规定：供试品色谱中应呈现6个特征峰，并应与对照药材参照物色谱中的6个特征峰保留时间相对应，其中峰1、峰5应分别与没食子酸对照品、鞣花酸对照品参照物峰保留时间相对应，与没食子酸对照品参照物峰相应的峰为S1峰，计算峰2、峰3与S1峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10％范围之内，规定值为：1.00(峰1)、2.23(峰2)、3.98(峰3)；与鞣花酸对照品参照物峰相应的峰为S2峰，计算峰4、峰6与S2峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10％范围之内，规定值为：0.96(峰4)、1.00(峰5)、1.16(峰6)。
采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)对3批核桃仁配方颗粒进行合成，建立了核桃仁配方颗粒特征图谱的对照图谱，如图45所示，图45是本发明实施例3提供的核桃仁配方颗粒特征图谱的对照图谱。
8)核桃仁配方颗粒特征图谱方法确定
色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以0.1wt％磷酸溶液为流动相B，按表1中的规定进行梯度洗脱；流速为每分钟0.3mL；柱温25℃；检测波长为254nm；理论板数按鞣花酸峰计算应不低于5000。
参照物溶液的制备：取核桃仁对照药材1.0g，置具塞锥形瓶中，加水30mL，煎煮30分钟，放冷，离心(转速为每分钟6000转)4分钟，取上清液，蒸干，残渣加50vol％甲醇溶液10mL使溶解，过滤，取续滤液，作为对照药材参照物溶液；另取没食子酸对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含20μg没食子酸的溶液，作为没食子酸对照品参照物溶液；另取鞣花酸对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含50μg鞣花酸的溶液，作为鞣花酸对照品参照物溶液。
供试品溶液的制备：取本品适量，研细，取约0.3g，置具塞锥形瓶中，精密加入50vol％甲醇20mL，密塞，称定重量，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用50vol％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
测定法：分别精密吸取参照物溶液和供试品溶液各1μL，注入液相色谱仪，测定，即得。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种核桃仁药材、饮片、标准汤剂、配方颗粒HPLC特征图谱的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
准备供试品，所述供试品为核桃仁药材、核桃仁饮片、核桃仁标准汤剂或核桃仁配方颗粒；
将所述供试品溶解，得到供试品溶液；
将所述供试品溶液采用高效液相色谱法测定，得到对应供试品的HPLC特征图谱；
所述高效液相色谱法的色谱条件为：色谱柱为C18柱；流动相A为乙腈，流动相B为0.1wt％磷酸溶液，梯度洗脱。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述梯度洗脱具体为：
0～5min，A相：2vol％，B相：98vol％；
5～13min，A相：2～10vol％，B相：98～90vol％；
13～17min，A相：10～13.5vol％，B相：90～86.5vol％；
17～24min，A相：13.5～19.5vol％，B相：86.5～80.5vol％；
24～30min，A相：19.5～25vol％，B相：80.5～75vol％。
3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述溶解的溶剂为50vol％甲醇溶液。
4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述高效液相色谱法的色谱条件还包括：流动相的流速为0.3mL/min；检测波长为254nm；进样量为1μL；柱温25℃；理论板数按鞣花酸峰计算不低于5000。
5.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，还包括以下步骤：
将核桃仁对照药材溶解，得到对照药材参照物溶液；将没食子酸溶解，得到没食子酸对照品参照物溶液；将鞣花酸溶解，得到鞣花酸对照品参照物溶液；
将所述对照药材参照物溶液和对照品参照物溶液采用高效液相色谱法测定，得到参照物的色谱图；并根据所述参照物的色谱图对供试品的HPLC特征图谱的成分进行定性。
6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，还包括以下步骤：
采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统对核桃仁药材的HPLC特征图谱的相似度进行评价，得到由6个特征峰构成的核桃仁药材的HPLC标准特征图谱；在所述HPLC标准特征图谱中，与没食子酸对照品参照物峰相对应的峰1为S1峰，计算峰2、峰3与S1峰的相对保留时间，其相对保留时间在规定值的±10％范围之内，规定值为：1.00(峰1)、2.23(峰2)、3.97(峰3)，与鞣花酸对照品参照物峰相对应的峰5为S2峰，计算峰4、峰6与S2峰的相对保留时间，其相对保留时间在规定值的±10％范围之内，规定值为：0.96(峰4)、1.00(峰5)、1.16(峰6)。
7.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，还包括以下步骤：
采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统对核桃仁饮片的HPLC特征图谱的相似度进行评价，得到由6个特征峰构成的核桃仁饮片的HPLC标准特征图谱；在所述HPLC标准特征图谱中，与没食子酸对照品参照物峰相对应的峰1为S1峰，计算峰2、峰3与S1峰的相对保留时间，其相对保留时间在规定值的±10％范围之内，规定值为：1.00(峰1)、2.23(峰2)、3.98(峰3)，与鞣花酸对照品参照物峰相对应的峰5为S2峰，计算峰4、峰6与S2峰的相对保留时间，其相对保留时间在规定值的±10％范围之内，规定值为：0.96(峰4)、1.00(峰5)、1.16(峰6)。
8.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，还包括以下步骤：
采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统对核桃仁标准汤剂的HPLC特征图谱的相似度进行评价，得到由6个特征峰构成的核桃仁标准汤剂的HPLC标准特征图谱；在所述HPLC标准特征图谱中，与没食子酸对照品参照物峰相对应的峰1为S1峰，计算峰2、峰3与S1峰的相对保留时间，其相对保留时间在规定值的±10％范围之内，规定值为：1.00(峰1)、2.22(峰2)、3.98(峰3)，与鞣花酸对照品参照物峰相对应的峰5为S2峰，计算峰4、峰6与S2峰的相对保留时间，其相对保留时间在规定值的±10％范围之内，规定值为：0.96(峰4)、1.00(峰5)、1.16(峰6)。
9.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，还包括以下步骤：
采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统对核桃仁配方颗粒的HPLC特征图谱的相似度进行评价，得到由6个特征峰构成的核桃仁配方颗粒的HPLC标准特征图谱；在所述HPLC标准特征图谱中，与没食子酸对照品参照物峰相对应的峰1为S1峰，计算峰2、峰3与S1峰的相对保留时间，其相对保留时间在规定值的±10％范围之内，规定值为：1.00(峰1)、2.23(峰2)、3.98(峰3)，与鞣花酸对照品参照物峰相对应的峰5为S2峰，计算峰4、峰6与S2峰的相对保留时间，其相对保留时间在规定值的±10％范围之内，规定值为：0.96(峰4)、1.00(峰5)、1.16(峰6)。
10.一种核桃仁药材、饮片、标准汤剂、配方颗粒的鉴别方法，其特征在于，采用权利要求1～9任一项所述的构建方法获得的HPLC特征图谱作为鉴别核桃仁药材、饮片、标准汤剂、配方颗粒的依据。
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