CN117214346A - 一种麸炒半夏曲特征图谱的构建方法和黄嘌呤含量的测定方法 - Google Patents
一种麸炒半夏曲特征图谱的构建方法和黄嘌呤含量的测定方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种麸炒半夏曲特征图谱的构建方法，包括以下步骤:A)将供试品原料和氨水溶液混合，超声处理，过滤，得到待测液；B)将所述待测液采用高效液相色谱法测定，得到麸炒半夏曲HPLC特征图谱；所述高效液相色谱法色谱条件为：色谱柱为C 18柱；流动相A为乙腈，流动相B为水，梯度洗脱。本发明提供的构建方法具有检测全面、操作简便的特点，能有效鉴别麸炒半夏曲配方颗粒，且能确保麸炒半夏曲配方颗粒质量的均一、稳定。本方法也适用于半夏曲药材、麸炒半夏曲饮片、标准汤剂。
Description
技术领域
本发明属于药物分析技术领域，尤其涉及一种麸炒半夏曲特征图谱的构建方法和黄嘌呤含量的测定方法。
背景技术
半夏曲是中药发酵炮制品中常用品种之一，具有止咳化痰，消食化滞之功，主治咳嗽痰多，恶心呕吐，食积泄泻等。临床应用的半夏曲是利用自然环境中的微生物(多为霉菌、酵母菌、细菌等)进行多种菌种混合固态发酵而成，这种半夏曲存在发酵菌种不纯、产品质量不稳定、不可控等缺点。目前未有半夏曲药材、麸炒半夏曲饮片、麸炒半夏曲标准汤剂、麸炒半夏曲配方颗粒相关含量测定、特征图谱等研究。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种麸炒半夏曲特征图谱的构建方法和黄嘌呤含量的测定方法，该构建方法对半夏曲药材、麸炒半夏曲饮片、标准汤剂、配方颗粒进行质量控制，保证其质量的均一、稳定；含量测定方法结果准确，分离度佳，稳定性良好。
本发明提供了一种麸炒半夏曲特征图谱的构建方法，包括以下步骤:
A)将供试品原料和氨水溶液混合，超声处理，过滤，得到待测液；
B)将所述待测液采用高效液相色谱法测定，得到麸炒半夏曲HPLC特征图谱；
所述高效液相色谱法色谱条件为：色谱柱为C18柱；流动相A为乙腈，流动相B为水，梯度洗脱。
本发明建立高效液相特征图谱方法用于半夏曲药材、麸炒半夏曲饮片、标准汤剂、配方颗粒及其相关制剂的检测；本发明在建立麸炒半夏曲的特征图谱过程中，确认了7个共有特征峰，指认了2个成分，并对其相对保留时间和相对峰面积进行了研究，保证了其化学组成稳定性和使用安全性。
本发明将供试品原料和氨水溶液混合，超声处理，过滤，得到待测液。所述供试品原料为半夏曲药材、麸炒半夏曲饮片、麸炒半夏曲标准汤剂、麸炒半夏曲配方颗粒。
在本发明中，所述氨水溶液的体积浓度为0.030～0.035％；具体实施例中，氨水溶液的浓度为0.032％。所述供试品原料的质量和氨水溶液的体积比为(1.8～2.3)g:25mL；具体实施例中，供试品原料的质量和氨水溶液的体积比为2g:25mL。所述超声处理的功率为550～650W，超声处理的频率为35～45kHz，超声处理的时间为25～35min；具体实施例中，超声处理的功率为600W，超声处理的频率为40kHz，超声处理的时间为30min。
本发明采用0.45μm微孔滤头进行过滤，得到待测液。
具体实施例中，供试品溶液的制备过程为：取本品适量，取约2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入0.032％氨水溶液25ml，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用0.032％氨水溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。
本发明还包括参照物溶液的制备：
取半夏曲对照药材和0.030～0.035％氨水溶液混合，超声处理，过滤，得到对照药材参照物溶液；
分别取黄嘌呤、鸟嘌呤对照品与0.030～0.035％氨水溶液混合，制得10μg/mL的对照品参照物溶液。
具体实施例中，参照物溶液的制备为:
取半夏曲对照药材和0.032％氨水溶液混合，超声处理，过滤，得到对照药材参照物溶液；
分别取黄嘌呤、鸟嘌呤对照品与0.032％氨水溶液混合，制得10μg/mL的对照品参照物溶液。
本发明将所述待测液采用高效液相色谱法测定，得到麸炒半夏曲HPLC特征图谱；所述高效液相色谱法色谱条件为：色谱柱为C18柱；流动相A为乙腈，流动相B为水，梯度洗脱。
本发明对同一供试品溶液采用拟定方法连续进样6次，每次10μL，根据各特征峰的保留时间，表明仪器精密度良好。本发明对同一供试品称取6份，按照拟定实验进行制备及测定，表明方法重复性好。本发明在不同仪器型号的高效液相色谱仪上进行测定，结果表明不同仪器均符合规定，也对不同人员和不同时间进行了考察，结果表明，方法稳定性较好。本发明对同样规格不同型号的C18柱进行耐用性考察，结果表明，色谱柱耐用性良好。本发明对同一供试品溶液分别于0h、2h、4h、8h、12h、16h和24h，表明，供试品溶液在24h内稳定。
在本发明中，所述梯度洗脱的程序为：
0～15min，流动相A：1～4％，流动相B：99～96％；
15～25min，流动相A：4～5％，流动相B：96～95％；
25～35min，流动相A：5～10％，流动相B：95～90％；
35～40min，流动相A：10％，流动相B：90％。
在本发明中，所述色谱柱的规格：柱长为250mm、内径为4.6mm、粒径为5μm，柱温为25～35℃；具体实施例中，采用的色谱柱型号为：色谱柱1：Agilent 5TC-C18(2)4.6*250mm，5μm；色谱柱2：Kromasil 100-5-C18 4.6*250mm，5μm；色谱柱3：Waters XBridge C18 4.6*250mm，5μm。
检测波长260～280nm；流动相的流速为0.8～1.2mL/min；理论板数按黄嘌呤峰计算应不低于5000；进样量8～12μl。
本发明采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统对麸炒半夏曲相似度进行评价，得到由7个峰构成的麸炒半夏曲HPLC标准特征图谱，其中，峰1、峰2应分别与相应的对照品参照物峰的保留时间相对应，与黄嘌呤参照物峰相对应的峰为S峰，计算其余各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10％范围之内，规定值为：1.10(峰3)、1.24(峰4)、1.41(峰5)、2.00(峰6)、2.16(峰7)。
本发明提供了一种麸炒半夏曲中黄嘌呤含量的测定方法，包括以下步骤：
S1、将麸炒半夏曲供试品与氨水溶液混合，超声处理，过滤，得到待测液；
S2、取黄嘌呤对照品和0.030～0.035％氨水溶液混合，得到10μg/mL的对照品参照物溶液；
S3、采用高效液相色谱法，在相同的检测条件下分别获得步骤S1中所述待测液和步骤S2中所述对照品参照物溶液中化学成分的色谱图，具体的色谱参数如下：色谱柱为C18柱；流动相A为乙腈，流动相B为水，梯度洗脱；
S4、根据所述对照品参照物的浓度、所述对照参照物品溶液在色谱图中的峰面积以及麸炒半夏曲中与所述对照品参照物溶液相对应的成分在色谱图中的峰面积，且基于步骤S3中的检测条件，以外标法计算麸炒半夏曲中黄嘌呤的含量。
该测定方法具有检测全面、操作简便的特点，能有效鉴别麸炒半夏曲配方颗粒、半夏曲药材、麸炒半夏曲饮片、麸炒半夏曲标准汤剂，且能确保麸炒半夏曲配方颗粒、半夏曲药材、麸炒半夏曲饮片、麸炒半夏曲标准汤剂质量的均一、稳定。
在本发明中，黄嘌呤溶液的进样浓度为1.09075～218.15μg/ml，黄嘌呤的回归方程为Y＝36.4178X+7.2240，R2＝0.9999。
在本发明中，步骤S3中检测条件具体为：梯度洗脱，具体程序为：
0～15min，流动相A：1～4％，流动相B：99～96％；
15～25min，流动相A：4～5％，流动相B：96～95％；
25～35min，流动相A：5～10％，流动相B：95～90％；
35～40min，流动相A：10％，流动相B：90％。
色谱柱规格为柱长为250mm、内径为4.6mm、粒径为5μm，柱温为30℃，检测波长为270nm，流动相的流速为1.0mL/min；理论板数按黄嘌呤峰计算应不低于5000；进样量8～12μl。
本发明提供了一种麸炒半夏曲特征图谱的构建方法，包括以下步骤:A)将供试品原料和氨水溶液混合，超声处理，过滤，得到待测液；B)将所述待测液采用高效液相色谱法测定，得到麸炒半夏曲HPLC特征图谱；所述高效液相色谱法色谱条件为：色谱柱为C18柱；流动相A为乙腈，流动相B为水，梯度洗脱。本发明提供的构建方法具有检测全面、操作简便的特点，能有效鉴别麸炒半夏曲配方颗粒，且能确保麸炒半夏曲配方颗粒质量的均一、稳定。本方法也适用于半夏曲药材、麸炒半夏曲饮片、标准汤剂及配方颗粒。
附图说明
图1为麸炒半夏曲配方颗粒不同仪器考察；
图2为麸炒半夏曲配方颗粒不同色谱柱考察；
图3为麸炒半夏曲配方颗粒色谱峰指认；
图4为黄嘌呤标准曲线图；
图5为3批麸炒半夏曲配方颗粒的验证图谱；
图6为3批半夏曲药材的验证图谱；
图7为3批麸炒半夏曲饮片的验证图谱；
图8为3批麸炒半夏曲标准汤剂的验证图谱；
图9为麸炒半夏曲配方颗粒的对照特征图谱；
图10为半夏曲药材的对照特征图谱；
图11为麸炒半夏曲饮片的对照特征图谱；
图12为麸炒半夏曲标准汤剂的对照特征图谱。
具体实施方式
为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的一种麸炒半夏曲特征图谱的构建方法和黄嘌呤含量的测定方法进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
【特征图谱】
1、实验仪器及材料
高效液相色谱仪：仪器1、仪器2、仪器3、仪器4；
电子天平：ME204E/02、MS205DU、XP26(梅特勒-托利多仪器有限公司)；
超纯水机：细胞型1810A(上海摩勒科学仪器有限公司)；
超声波清洗器：KQ5200DB型(600W，40KHz；昆山市超声仪器有限公司)；
色谱柱：色谱柱1、色谱柱2、色谱柱3；柱温为30℃，检测波长为270nm，流动相的流速为1.0mL/min。
甲醇、乙腈为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。
黄嘌呤(中国食品药品检定研究院，批号：140662-200802)；
鸟嘌呤(中国食品药品检定研究院，批号：140631-202008，含量以98.9％计)；
半夏曲对照药材(成都德思特生物技术有限公司，批号：DSTYB010901)；
麸炒半夏曲配方颗粒FCBXQ-01、FCBXQ-02、FCBXQ-03；
半夏曲药材：BXQ-YC-01、BXQ-YC-02、BXQ-YC-03；
麸炒半夏曲饮片：BXQ-YP-01、BXQ-YP-02、BXQ-YP-03；
麸炒半夏曲标准汤剂：BXQ-BT-01、BXQ-BT-02、BXQ-BT-03。
色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为250mm，内径为4.6mm，粒径为5μm)；以乙腈为流动相A，以水为流动相B，按下表1中的规定进行梯度洗脱；检测波长为270nm。理论板数按黄嘌呤峰计算应不低于5000。
表1
参照物溶液的制备取半夏曲对照药材2g，置具塞锥形瓶中，加0.032％氨水溶液25ml，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，滤过，取续滤液作为对照药材参照物溶液。
取黄嘌呤对照品适量，精密称定，加0.032％氨水溶液制成每1ml含10μg的溶液，即得。
再取鸟嘌呤对照品适量，精密称定，加0.032％氨水溶液制成每1ml各含10μg的溶液，作为对照品参照物溶液。
供试品溶液的制备取本品(FCBXQ-01)适量，取约2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入0.032％氨水溶液25ml，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用0.032％氨水溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
测定法分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
【含量测定】
色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为250mm，内径为4.6mm，粒径为5μm)；以乙腈为流动相A，以水为流动相B，按上表1中的规定进行梯度洗脱；检测波长为270nm。理论板数按黄嘌呤峰计算应不低于5000。
参照物溶液的制备取黄嘌呤对照品适量，精密称定，加0.032％氨水溶液制成每1ml含10μg的溶液，即得。
供试品溶液的制备取本品(FCBXQ-01)适量，取约2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入0.032％氨水溶液25ml，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用0.032％氨水溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
测定法分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
2、特征图谱方法学验证
2.1精密度试验
取麸炒半夏曲配方颗粒(批号：FCBXQ-01)供试品溶液，按拟定实验方法连续进样6次，每次10μL，计算各特征峰的保留时间及峰面积。如表2所示。
表2精密度考察-保留时间
结果表明，该仪器精密度良好。
2.2重复性考察
精密称取麸炒半夏曲配方颗粒(批号：FCBXQ-01)6份，按拟定实验方法进行制备及测定。如表3所示。
表3重复性考察-相对保留时间比值
结果表明，该方法重复性好。
2.3中间精密度考察
2.3.1不同仪器考察
在以上拟定的试验条件基础上，精密称取麸炒半夏曲配方颗粒(批号：FCBXQ-01)，制备供试品溶液，分别在仪器1、仪器2、仪器3、仪器4高效液相色谱仪上进行测定。如图1、表4所示。
表4仪器耐用性考察-相对保留时间比值
结果表明，不同仪器符合规定。
2.3.2不同人员和时间考察
在以上拟定的试验条件基础上，由不同人员(A、B)在不同时间(T1、T2)分别精密称取麸炒半夏曲配方颗粒(批号：FCBXQ-01)制备供试品，进行测定。如表5所示：
表5人员和时间考察-相对保留时间比值
结果表明，由不同的人员在不同的时间对同一个样品进行测定，方法稳定性较好。
2.4耐用性考察
2.4.1色谱柱耐用性考察
在以上拟定的实验条件基础上，分别以色谱柱1：Agilent 5TC-C18(2)4.6*250mm，5μm；色谱柱2：Kromasil 100-5-C18 4.6*250mm，5μm；色谱柱3：Waters XBridge C18 4.6*250mm，5μm，三个色谱柱进行分析考察。如图2、表6所示。
表6色谱柱耐用性考察-相对保留时间比值
结果表明，色谱柱耐用性良好。
2.4.2稳定性考察
在以上拟定的实验条件基础上，取同一供试品溶液，分别于0h，2h，4h，8h，12h，16h，24h时测定。如表7所示。
表7稳定性考察-保留时间
结果表明，样品溶液在24小时内稳定。
综上所述，各特征峰相对保留时间的RSD在以上各项考察中均符合要求，该方法良好。将上述7个特征峰纳入后续考察。
2.5色谱峰指认
供试品溶液的制备：按以上拟定的实验条件，制备麸炒半夏曲标准汤剂供试品溶液。
参照物溶液的制备：取半夏曲对照药材2g，置具塞锥形瓶中，加0.032％氨水溶液25ml，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，滤过，取续滤液作为对照药材参照物溶液。
另取黄嘌呤、鸟嘌呤对照品适量，精密称定，加0.032％氨水溶液分别制成每1ml含10μg溶液，作为对照品参照物溶液。
阴性对照溶液的制备：按以上拟定的实验条件，制备缺麸炒半夏曲标准汤剂阴性对照溶液。
对麸炒半夏曲配方颗粒特征图谱峰进行定位。见图3。结果表明，峰1为鸟嘌呤、峰2为黄嘌呤。在以下方法学考察中，对样品中的7个特征峰进行考察。
3、含量测定验证
3.1精密度考察
取对照品溶液连续进样6次，记录黄嘌呤的峰面积，计算RSD值，结果见表8。
表8精密度考察结果
结果表明，本方法的进样精密度良好。
3.2线性关系
取黄嘌呤适量4.363mg，置于20ml容量瓶，以甲醇为溶剂制成含盐酸麻黄碱218.15μg/ml的对照品储备液，再稀释至浓度为1.09075μg/ml、5.45375μg/ml、10.9075μg/ml、54.5375μg/ml、109.075μg/ml、218.15μg/ml。分别吸取溶液及母液10μl，得到峰面积，以进样量(X，μg)为横坐标，峰面积(Y)为纵坐标绘制响应曲线，结果见表9，图4。
表9黄嘌呤标准曲线分析结果
结果表明：黄嘌呤浓度范围在1.09075～218.15μg/ml，呈良好的线性关系。
3.3重复性实验
取麸炒半夏曲配方颗粒(批号：FCBXQ-01)约2g，精密称定6份，由同一操作人员按照确定的方法制成供试品溶液，计算6份供试品的黄嘌呤含量，结果见表10。
表10重复性实验结果
结果表明本方法重复性良好。
3.4稳定性实验
取同一供试品溶液(批号：FCBXQ-01)，分别在0h，2h，4h，8h，12h，16h，24h测定黄嘌呤色谱峰面积，结果见表11。
表11稳定性实验结果
结果表明，供试品溶液在24小时内稳定性良好。
3.5中间精密度
3.5.1不同人员和时间考察
取同一供试品(批号：FCBXQ-01)由不同人员(A、B)在不同时间(Ⅰ、Ⅱ)制备供试品溶液进行分析，计算供试品中黄嘌呤的含量，结果见表12。
表12中间精密度实验结果
结果表明，黄嘌呤的含量RSD值为0.5％，本方法中间精密度良好。
3.5.2加样回收率
取已知含量的供试品(批号：FCBXQ-01，黄嘌呤的含量0.128mg/g)约1g，共6份，精密称定，分别精密加入25ml含黄嘌呤(纯度：100％)混合对照溶液，按拟定的方法进行供试品溶液的制备并测定，计算回收率，结果见表13。计算公式如下：
表13黄嘌呤加样回收实验结果
结果表明，黄嘌呤平均回收率为97％。本方法准确度良好。
3.5.3耐用性考察
3.5.3.1不同仪器考察
按确定方法供试品溶液，精密取本品粉末(批号：FCBXQ-01)2g，精密称定，分别在仪器1、仪器2、仪器3、仪器4高效液相色谱仪上进行考察，计算黄嘌呤含量，所得结果见表14。
表14不同仪器实验结果
结果表明，说明本方法仪器耐用性良好。
3.5.3.2不同色谱柱考察
采用不同品牌C18：色谱柱1：Agilent 5TC-C18(2)4.6*250mm，5μm；色谱柱2：Kromasil 100-5-C18 4.6*250mm，5μm；色谱柱3：Waters XBridge C18 4.6*250mm，5μm，三个色谱柱对同一供试品(批号：FCBXQ-01)进行检测，结果见表15。
表15色谱柱耐用性考察结果
结果表明，不同色谱柱的分析色谱指标良好。理论塔板数按黄嘌呤峰计算应不得低于5000。
实施例2 3批麸炒半夏曲配方颗粒验证结果
采用拟定的方法对本品3批样品进行特征图谱、含量测定，计算相对保留时间，黄嘌呤含量。如图5、表16和表17所示。
表16 3批麸炒半夏曲配方颗粒相对保留时间
表17 3批麸炒半夏曲配方颗粒黄嘌呤含量
方法学各考察项目及验证结果汇总见表18：
表18方法学各项目结果RSD％汇总标准-相对保留时间
由上表可知不同仪器、不同色谱柱对各特征峰的相对保留时间影响较大，为了增加方法的重现性和适用性，故将各峰的相对保留时间规定值暂定为10％。
实施例3 3批半夏曲药材验证结果
采用拟定的方法对本品3批样品进行特征图谱、含量测定，计算相对保留时间，黄嘌呤含量。如图6、表19、表20所示。
表19 3批麸炒半夏曲药材相对保留时间
表20 3批半夏曲药材黄嘌呤含量
实施例4 3批麸炒半夏曲饮片验证结果
采用拟定的方法对本品3批样品进行特征图谱、含量测定，计算相对保留时间，黄嘌呤含量。如图7、表21和表22所示。
表21 3批麸炒半夏曲饮片相对保留时间
表22 3批麸炒半夏曲饮片黄嘌呤含量
实施例5 3批麸炒半夏曲标准汤剂证结果
采用拟定的方法对本品3批样品进行特征图谱、含量测定，计算相对保留时间，黄嘌呤含量。如图8、表23和表24所示。
表23 3批麸炒半夏曲标准汤剂相对保留时间
表24 3批麸炒半夏曲饮片黄嘌呤含量
实施例6：配方颗粒的特征图谱
色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为250mm，内径为4.6mm，粒径为5μm)；以乙腈为流动相A，以水为流动相B，按上表1中的规定进行梯度洗脱；检测波长为270nm。理论板数按黄嘌呤峰计算应不低于5000。
参照物溶液的制备取半夏曲对照药材2g，置具塞锥形瓶中，加0.032％氨水溶液25ml，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，滤过，取续滤液作为对照药材参照物溶液。取黄嘌呤对照品适量，精密称定，加0.032％氨水溶液制成每1ml含10μg的溶液，即得。再取鸟嘌呤对照品适量，精密称定，加0.032％氨水溶液制成每1ml各含10μg的溶液，作为对照品参照物溶液。
供试品溶液的制备取麸炒半夏曲配方颗粒适量，取约2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入0.032％氨水溶液25ml，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用0.032％氨水溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
测定法分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
图9为麸炒半夏曲配方颗粒的对照特征图谱；从图9可以看出：供试品色谱中应呈现7个特征峰，并应与对照药材参照物色谱中的7个特征峰保留时间相对应，其中峰1、峰2应分别与相应的对照品参照物峰保留时间相对应。与黄嘌呤参照物峰相对应的峰为S峰，计算其余各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10％范围之内，规定值为：1.10(峰3)、1.24(峰4)、1.41(峰5)、2.00(峰6)、2.16(峰7)。
实施例7：药材的特征图谱
色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为250mm，内径为4.6mm，粒径为5μm)；以乙腈为流动相A，以水为流动相B，按上表1中的规定进行梯度洗脱；检测波长为270nm。理论板数按黄嘌呤峰计算应不低于5000。
参照物溶液的制备取半夏曲对照药材2g，置具塞锥形瓶中，加0.032％氨水溶液25ml，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，滤过，取续滤液作为对照药材参照物溶液。取黄嘌呤对照品适量，精密称定，加0.032％氨水溶液制成每1ml含10μg的溶液，即得。再取鸟嘌呤对照品适量，精密称定，加0.032％氨水溶液制成每1ml各含10μg的溶液，作为对照品参照物溶液。
供试品溶液的制备取半夏曲药材适量，取约2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入0.032％氨水溶液25ml，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用0.032％氨水溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
测定法分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
图10为半夏曲药材的对照特征图谱；从图10可以看出：供试品色谱中应呈现7个特征峰，并应与对照药材参照物色谱中的7个特征峰保留时间相对应，其中峰1、峰2应分别与相应的对照品参照物峰保留时间相对应。与黄嘌呤参照物峰相对应的峰为S峰，计算其余各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10％范围之内，规定值为：1.10(峰3)、1.24(峰4)、1.41(峰5)、2.00(峰6)、2.16(峰7)。
实施例8：饮片的特征图谱
色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为250mm，内径为4.6mm，粒径为5μm)；以乙腈为流动相A，以水为流动相B，按上表1中的规定进行梯度洗脱；检测波长为270nm。理论板数按黄嘌呤峰计算应不低于5000。
参照物溶液的制备取半夏曲对照药材2g，置具塞锥形瓶中，加0.032％氨水溶液25ml，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，滤过，取续滤液作为对照药材参照物溶液。取黄嘌呤对照品适量，精密称定，加0.032％氨水溶液制成每1ml含10μg的溶液，即得。再取鸟嘌呤对照品适量，精密称定，加0.032％氨水溶液制成每1ml各含10μg的溶液，作为对照品参照物溶液。
供试品溶液的制备取麸炒半夏曲饮片适量，取约2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入0.032％氨水溶液25ml，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用0.032％氨水溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
测定法分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
图11为麸炒半夏曲饮片的对照特征图谱；从图11可以看出：供试品色谱中应呈现7个特征峰，并应与对照药材参照物色谱中的7个特征峰保留时间相对应，其中峰1、峰2应分别与相应的对照品参照物峰保留时间相对应。与黄嘌呤参照物峰相对应的峰为S峰，计算其余各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10％范围之内，规定值为：1.10(峰3)、1.24(峰4)、1.41(峰5)、2.00(峰6)、2.16(峰7)。
实施例9标准汤剂的特征图谱
色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为250mm，内径为4.6mm，粒径为5μm)；以乙腈为流动相A，以水为流动相B，按上表1中的规定进行梯度洗脱；检测波长为270nm。理论板数按黄嘌呤峰计算应不低于5000。
参照物溶液的制备取半夏曲对照药材2g，置具塞锥形瓶中，加0.032％氨水溶液25ml，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，滤过，取续滤液作为对照药材参照物溶液。取黄嘌呤对照品适量，精密称定，加0.032％氨水溶液制成每1ml含10μg的溶液，即得。再取鸟嘌呤对照品适量，精密称定，加0.032％氨水溶液制成每1ml各含10μg的溶液，作为对照品参照物溶液。
供试品溶液的制备取麸炒半夏曲标准汤剂适量，取约2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入0.032％氨水溶液25ml，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用0.032％氨水溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
测定法分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
图12为麸炒半夏曲标准汤剂的对照特征图谱；从图12可以看出：供试品色谱中应呈现7个特征峰，并应与对照药材参照物色谱中的7个特征峰保留时间相对应，其中，峰1、峰2应分别与相应的对照品参照物峰保留时间相对应。与黄嘌呤参照物峰相对应的峰为S峰，计算其余各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10％范围之内，规定值为：1.10(峰3)、1.24(峰4)、1.41(峰5)、2.00(峰6)、2.16(峰7)。
由以上实施例可知，本发明提供了一种麸炒半夏曲特征图谱的构建方法，包括以下步骤:A)将供试品原料和氨水溶液混合，超声处理，过滤，得到待测液；B)将所述待测液采用高效液相色谱法测定，得到麸炒半夏曲HPLC特征图谱；所述高效液相色谱法色谱条件为：色谱柱为C18柱；流动相A为乙腈，流动相B为水，梯度洗脱。本发明提供的构建方法具有检测全面、操作简便的特点，能有效鉴别麸炒半夏曲配方颗粒，且能确保麸炒半夏曲配方颗粒质量的均一、稳定。本方法也适用于半夏曲药材、麸炒半夏曲饮片、标准汤剂及配方颗粒。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (8)
1.一种麸炒半夏曲特征图谱的构建方法，包括以下步骤:
A)将供试品原料和氨水溶液混合，超声处理，过滤，得到待测液；
B)将所述待测液采用高效液相色谱法测定，得到麸炒半夏曲HPLC特征图谱；
所述高效液相色谱法色谱条件为：色谱柱为C18柱；流动相A为乙腈，流动相B为水，梯度洗脱。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，还包括参照物溶液的制备：
取半夏曲对照药材和0.030～0.035％氨水溶液混合，超声处理，过滤，得到对照药材参照物溶液；
分别取黄嘌呤、鸟嘌呤对照品与0.030～0.035％氨水溶液混合，制得10μg/mL的对照品参照物溶液。
3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述氨水溶液的体积浓度为0.030～0.035％；
所述供试品原料的质量和氨水溶液的体积比为(1.8～2.3)g：25mL；
超声处理的功率为550～650W，超声处理的频率为35～45kHz，超声处理的时间为25～35min。
4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述梯度洗脱的程序为：
0～15min，流动相A：1～4％，流动相B：99～96％；
15～25min，流动相A：4～5％，流动相B：96～95％；
25～35min，流动相A：5～10％，流动相B：95～90％；
35～40min，流动相A：10％，流动相B：90％。
5.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述色谱柱的规格：柱长为250mm、内径为4.6mm、粒径为5μm，柱温为25～35℃；
检测波长260～280nm；
流动相的流速为0.8～1.2mL/min；
理论板数按黄嘌呤峰计算应不低于5000。
6.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统对麸炒半夏曲相似度进行评价，得到由7个峰构成的麸炒半夏曲HPLC标准特征图谱，其中，峰1、峰2应分别与相应的对照品参照物峰的保留时间相对应，与黄嘌呤参照物峰相对应的峰为S峰，计算其余各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10％范围之内，规定值为：1.10(峰3)、1.24(峰4)、1.41(峰5)、2.00(峰6)、2.16(峰7)。
7.一种麸炒半夏曲中黄嘌呤含量的测定方法，包括以下步骤：
S1、将麸炒半夏曲供试品与氨水溶液混合，超声处理，过滤，得到待测液；
S2、取黄嘌呤对照品和0.030～0.035％氨水溶液混合，得到10μg/mL的对照品参照物溶液；
S3、采用高效液相色谱法，在相同的检测条件下分别获得步骤S1中所述待测液和步骤S2中所述对照品参照物溶液中化学成分的色谱图，具体的色谱参数如下：色谱柱为C18柱；流动相A为乙腈，流动相B为水，梯度洗脱；
S4、根据所述对照品参照物的浓度、所述对照参照物品溶液在色谱图中的峰面积以及麸炒半夏曲中与所述对照品参照物溶液相对应的成分在色谱图中的峰面积，且基于步骤S3中的检测条件，以外标法计算麸炒半夏曲中黄嘌呤的含量。
8.根据权利要求7所述的测定方法，其特征在于，黄嘌呤溶液的进样浓度为1.09075～218.15μg/ml，黄嘌呤的回归方程为Y＝36.4178X+7.2240，R2＝0.9999。
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