CN115541793A - 一种蕤仁药材及蕤仁配方颗粒的质量控制方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种蕤仁药材及蕤仁配方颗粒的质量控制方法,所述质量控制方法包括以下步骤:将蕤仁药材或蕤仁配方颗粒进行提取,配制成供试品溶液;将原儿茶酸和乙醇水溶液混合,配制成对照品溶液;将供试品溶液与对照品溶液分别采用高效液相色谱检测,得到蕤仁药材或蕤仁配方颗粒中原儿茶酸的含量及蕤仁药材或蕤仁配方颗粒的特征图谱。本发明构建了蕤仁药材及蕤仁配方颗粒的HPLC特征图谱,充分展示了蕤仁药材及蕤仁配方颗粒的化学成分特征;同时本发明建立了蕤仁药材及蕤仁配方颗粒中原儿茶酸HPLC含量测定方法,该方法操作简单,准确度高,稳定性好。
Description
技术领域
本发明属于中药鉴别技术领域,具体涉及一种蕤仁药材及蕤仁配方颗粒的质量控制方法。
背景技术
蕤仁为蔷薇科植物蕤核Prinsepia uniflora Batal或齿叶扁核木Prinsepiauniflora Batal.var.serrata Rehd的干燥成熟果核。味甘,性微寒。归肝经。主要含有不饱和脂肪酸类等多种化学物质,具有疏风散热、养肝明目、安神之功效,主治目赤肿痛、眦烂多泪、昏暗羞明、夜寐不安等症。药理研究表明其具有具有降压和镇定等作用。
目前法定记载的质量标准仅有性状鉴别、薄层鉴别及水分测定。关于蕤仁药材指纹图谱鉴别领域几乎没有任何报道。
蕤仁中的亚油酸可以软化人类的心脑血管,加快血液循环,降低血压与血脂,促进新陈代谢,起到保护心脑血管的作用。刘慧灵,马国需,孙忠浩,杨峻山,许旭东,反相高效液相色谱-蒸发光散射检测法测定不同产地蕤仁药材中亚油酸的含量,中国药学杂志,2014,49(15)公开了测定不同产地蕤仁药材中亚油酸的含量的方法,色谱柱:AichromaBond-AQC8色谱柱(4.6mm×250mm,5um);流动相:乙腈-0.1%甲酸水(90:10);流速:1.0mL/min;柱温:25℃;检测器条件:雾化温度21.0℃,漂移管温度40.0℃,载气压力145Pa,增益值设置为20。
现有技术对蕤仁的成分研究主要针对于脂肪酸类中的亚油酸成分进行检测,而忽视了其他类有效成分的含量,且方法耗能大。没有相关技术对蕤仁药材及配方颗粒特征图谱进行鉴别。
因此如何提供一种蕤仁药材及配方颗粒的质量控制方法,使其既能够提供特征图谱,又可以测定除亚油酸外其他有效成分的含量,成为目前亟待解决的问题。
发明内容
针对现有技术的不足,本发明的目的在于提供一种蕤仁药材及蕤仁配方颗粒的质量控制方法。本发明提供一种蕤仁药材及蕤仁配方颗粒中原儿茶酸的含量测定方法、蕤仁药材或蕤仁配方颗粒的特征图谱测定方法。本方法提供的测定方法操作简单,准确度高,稳定性好,加强专属性鉴别和整体质量控制,建立了蕤仁药材及蕤仁配方颗粒的特征图谱,从而进行全面质量控制。
为达到此发明目的,本发明采用以下技术方案:
本发明提供一种蕤仁药材及蕤仁配方颗粒的质量控制方法,所述质量控制方法包括以下步骤:
(1)将蕤仁药材或蕤仁配方颗粒进行提取,配制成供试品溶液;将原儿茶酸和乙醇水溶液混合,配制成对照品溶液;
(2)将步骤(1)得到的供试品溶液与对照品溶液分别采用高效液相色谱检测,得到蕤仁药材或蕤仁配方颗粒中原儿茶酸的含量及蕤仁药材或蕤仁配方颗粒的特征图谱。
本发明选取了蕤仁中除亚油酸外的另一类有效成分有机酸中的原儿茶酸做为待测指标。与亚油酸不同的是,原儿茶酸可通过降低冠状血管及心肌耗氧量、提高心肌耐缺氧力、使心脏和外周血管升压,进而达到保护心血管的作用。
为了更全面的评价蕤仁的质量,本发明采用HPLC针对蕤仁药材建立了特征图谱,利用3批蕤仁药材建立对照图谱,进行共有峰的确定,同时利用原儿茶酸对照品进行比对,指认了特征峰,并进行方法学验证。实验结果表明本发明提供的方法重复性好,耐用性佳,提供的信息更加丰富,能够为规范蕤仁药材质量提供更加全面有效的质量控制手段。用本方法提供的方法对3批蕤仁配方颗粒进行验证,结果证明方法同样适用,对蕤仁配方颗粒提供了有效的质量控制手段。此外,本研究采用HPLC针对蕤仁建立了原儿茶酸含量测定方法,以原儿茶酸对照品为含测指标,并进行方法学验证。实验结果表明该方法重复性好。
在本发明中,步骤(1)中,所述供试品溶液的配制具体包括以下步骤:
(a)将蕤仁药材或蕤仁配方颗粒与石油醚混合,超声,过滤,收集滤渣;
(b)将步骤(a)得到的滤渣和乙醇水溶液混合,回流,得到提取液;
(c)将步骤(b)得到的提取液,蒸干,然后用甲醇溶解,得到供试品溶液。
在本发明中,步骤(a)中,所述石油醚的沸点为60-90℃(例如可以是60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃、90℃等)。
优选地,步骤(a)中,所述蕤仁药材和石油醚的固液比为(1.0-2.5):50g/mL,其中“1.0-2.5”可以是1.0、1.3、1.5、1.7、1.9、2、2.1、2.3、2.5等。
优选地,步骤(a)中,所述蕤仁配方颗粒和石油醚的固液比为(0.05-0.15):50g/mL,其中“0.05-0.15”可以是0.05、0.07、0.09、0.1、0.13、0.15等。
优选地,步骤(a)中,所述超声的功率为200-400W(例如可以是200W、230W、260W、290W、300W、330W、360W、390W、400W等),所述超声的频率为30-50kHz(例如可以是30kHz、33kHz、36kHz、39kHz、40kHz、43kHz、46kHz、49kHz、50kHz等),所述超声的时间为30-50min(例如可以是30min、33min、36min、39min、43min、46min、49min、50min等)。
在本发明中,步骤(b)中,所述乙醇水溶液中乙醇的体积分数为30-80%(例如可以是30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%等)。
优选地,步骤(b)中,所述回流的时间为30-70min(例如可以是30min、35min、40min、45min、50min、55min、60min、65min、70min等)。
在本发明中,步骤(1)中,所述乙醇水溶液中乙醇的体积分数为60-80%(例如可以是60%、62%、64%、66%、68%、70%、72%、74%、76%、78%、80%等)。
优选地,步骤(1)中,所述原儿茶酸和乙醇水溶液的固液比为(80-100):1μg/mL,其中“80-100”可以是80、83、86、89、90、93、96、99、100等。
在本发明中,步骤(2)中,所述高效液相色谱检测中色谱柱采用的填充剂包括十八烷基硅烷键合硅胶。
在本发明中,步骤(2)中,所述高效液相色谱检测中色谱柱的柱长为250mm,内径为4.6mm,粒径为5μm。
优选地,步骤(2)中,所述高效液相色谱检测中柱温为28-32℃(例如可以是28℃、29℃、30℃、31℃、32℃等)。
在本发明中,步骤(2)中,所述高效液相色谱检测中流动相的流速为0.9-1.1mL/min(例如可以是0.9mL/min、0.93mL/min、0.96mL/min、0.99mL/min、1.03mL/min、1.06mL/min、1.09mL/min、1.1mL/min等)。
优选地,步骤(2)中,所述高效液相色谱检测中检测波长为254nm。
优选地,步骤(2)中,所述高效液相色谱检测中进样量为8-15μL(例如可以是8μL、9μL、10μL、11μL、12μL、13μL、14μL、15μL等)。
在本发明中,所述高效液相色谱检测中以甲醇为流动相A,以0.1%-0.3%(例如可以是0.1%、0.15%、0.2%、0.25%、0.3%等)甲酸水溶液为流动相B,按照下表进行梯度洗脱:
时间(min) | 流动相A | 流动相B |
0-10 | 15→22 | 85→78 |
10-15 | 22→30 | 78→70 |
15-30 | 30→40 | 70→60 |
。
在本发明中,按照下表进行梯度洗脱:
时间(min) | 流动相A | 流动相B |
0-10 | 15→22 | 85→78 |
10-15 | 22→30 | 78→70 |
15-30 | 30→40 | 70→60 |
30-45 | 40→65 | 60→35 |
45-60 | 65 | 35 |
。
在本发明中,所述蕤仁药材或蕤仁配方颗粒共有6个特征峰,按照出峰时间由短至长依次为峰1、峰2、峰3、峰4、峰5和峰6,以峰1为S峰,峰2-6的相对保留时间在规定值的±10%之内,所述规定值分别为:1.62、2.44、2.50、2.82和2.95;其中峰1为原儿茶酸。
相对于现有技术,本发明具有以下有益效果:
(1)本发明构建了蕤仁药材及蕤仁配方颗粒的HPLC特征图谱,充分展示了蕤仁药材及蕤仁配方颗粒的化学成分特征;
(2)本发明构建的特征图谱能够全面地反应样品的特征峰信息,且方法稳定,精密度高,重现性较好;
(3)本发明建立的蕤仁药材及蕤仁配方颗粒的HPLC特征图谱,可以用来鉴别蕤仁药材及蕤仁配方颗粒,为蕤仁药材及蕤仁配方颗粒的鉴别提供一种快速、可靠的检测方法。
(4)本发明建立了蕤仁药材及蕤仁配方颗粒中原儿茶酸HPLC含量测定方法,该方法操作简单,准确度高,稳定性好,为蕤仁药材及蕤仁配方颗粒提供一种快速、可靠的检测方法,能够在一定程度上完善蕤仁药材及配方颗粒的相关质量标准,为更好的开发利用蕤仁中药材提供科学指导。
附图说明
图1为实施例1得到的蕤仁药材的含量测定及特征图谱;其中,峰1为原儿茶酸。
图2为实施例1中原儿茶酸对照品、蕤仁药材201001和蕤仁配方颗粒KL201001的含量测定及特征图谱;
其中,S1为原儿茶酸对照品,S2为蕤仁药材201001,S3为蕤仁配方颗粒KL201001。
图3为3批蕤仁药材HPLC特征图谱;
其中,S1为201001,S2为201006,S3为201012,S4为蕤仁药材对照特征图谱。
图5为采用色谱柱2 ZORBAX SB-C18(4.6*250mm,5μm)得到的色谱图;其中,峰1为原儿茶酸。
图7为3批蕤仁配方颗粒HPLC特征图谱;
其中,S1为KL201001,S2为KL201006,S3为KL201012,S4为蕤仁配方颗粒对照特征图谱。
图8为原儿茶酸标准曲线图。
图9为实验A得到的蕤仁药材的特征图谱。
图10为实验B得到的蕤仁药材的特征图谱。
图11为实验C得到的蕤仁药材的特征图谱。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了,所述实施例仅仅是帮助理解本发明,不应视为对本发明的具体限制。
以下实施例中仪器、试剂及试药来源如下:
仪器:Waters ACQUITY ArC高效液相色谱仪;TUV Detector检测器;Empower 3色谱工作站;JA1002电子天平(上海浦春计量仪器有限公司)ML204T电子天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司);MSA6 6S-OCE-DM电子天平(赛多利斯科技仪器(北京)有限公司);KQ-300DB超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);DK-S26电热恒温水浴锅(中仪国科(北京)科技有限公司);
色谱柱:Agilent ZORBAX SB-C18(4.6×250mm,5μm)色谱柱;
原儿茶酸对照品:(批号:110809-201906,纯度97.7%,厂家:中国食品药品检定研究院);
蕤仁配方颗粒:KL201001、KL201006、KL201012;
蕤仁药材:201001、201006、201012;
试剂:甲醇(色谱纯,批号:I1 106007 032,厂家:Merck KGaA(德国默克集团));
乙腈(色谱纯,批号:JB100130,厂家:Merck KGaA(德国默克集团));
乙醇(分析纯,批号:20210114,厂家:天津市永大化学试剂有限公司);
水(蒸馏水,批号:20210113H,厂家:广州屈臣氏食品饮料有限公司);
甲酸(色谱纯,批号:186899,厂家:赛默飞世尔科技(中国)有限公司);
石油醚60-90℃(分析纯,批号:20190929,厂家:国药集团化学试剂有限公司)。
以下实施例中保留时间均为分钟(min)计。
实施例1
本实施例提供一种蕤仁药材及蕤仁配方颗粒的质量控制方法,所述质量控制方法包括以下步骤:
对照品溶液的配制:取原儿茶酸对照品适量,精密称定,加70%乙醇水溶液制成每1mL含90μg原儿茶酸对照品的对照品溶液;
蕤仁药材供试品溶液的配制:取蕤仁药材粉末2.0g,精密称定,置具塞锥形瓶中,加入石油醚(沸点60-90℃)50mL,密塞,超声处理(功率300W,频率40kHz)40分钟,滤过,收集滤渣;滤渣加入70%乙醇水溶液50mL,称定重量,回流40分钟,放冷,再称定重量,用70%乙醇水溶液补足减失的重量,摇匀,滤过,收率滤液;取续滤液25mL,至蒸发皿中,蒸干,用甲醇溶解,定容至5mL,摇匀,滤过,取续滤液,得到蕤仁药材供试品溶液。
蕤仁配方颗粒供试品溶液的配制:与蕤仁药材供试品溶液的区别仅在于,将2.0g蕤仁药材粉末替换为0.1g蕤仁配方颗粒粉末。
采用高效液相色谱对对照品溶液、蕤仁药材供试品溶液和蕤仁配方颗粒供试品溶液进行检测;
色谱条件:Agilent ZORBAX SB-C18,以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为250mm,内径为4.6mm,粒径为5μm);以甲醇为流动相A,以0.2%甲酸为流动性B;检测波长为254nm;柱温为30℃;流速1.0mLmin,进样量10μL;理论塔板数按原儿茶酸计算不低于1000。
按照下表进行梯度洗脱:
时间(min) | 流动相A | 流动相B |
0-10 | 15→22 | 85→78 |
10-15 | 22→30 | 78→70 |
15-30 | 30→40 | 70→60 |
30-45 | 40→65 | 60→35 |
45-60 | 65 | 35 |
蕤仁药材的批号为201001,蕤仁配方颗粒的批号为KL201001。
蕤仁药材的特征图谱如图1所示,样品共呈现6个特征峰,其中峰1与原儿茶酸对照品保留时间一致,以1号峰为S峰,计算峰2-6的相对保留时间;其相对保留时间应在规定值的±10%之内。规定值分别为:1.62(峰2)、2.44(峰3)、2.50(峰4)、2.82(峰5)、2.95(峰6)。
图2为原儿茶酸对照品、蕤仁药材201001和蕤仁配方颗粒KL201001的特征图谱,从图中可以确定峰1为原儿茶酸。
利用外标法测定蕤仁药材及蕤仁配方颗粒中原儿茶酸的含量。
实验例
(一)蕤仁药材及蕤仁配方颗粒的特征图谱研究
实验例1不同批次蕤仁药材特征图谱的测定
测试方法:取不同批次蕤仁药材样品(批号分别为201001、201006和201012),按照实施例1提供的方法进行高效液相色谱测定,获得其液相图谱,将图谱导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”进行数据匹配,建立蕤仁药材的对照特征图谱。
3批蕤仁药材保留时间及相对保留时间如下表1所示,3批蕤仁药材HPLC特征图谱如图3(S1为201001,S2为201006,S3为201012,S4为蕤仁药材对照特征图谱)所示。其中,蕤仁药材对照特征图谱为按照实施例1测得的3批蕤仁药材样品图谱经“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”匹配后,得到的蕤仁药材对照特征图谱。
表1
结果表明3批蕤仁药材HPLC特征图谱中呈现6个特征峰,其中峰1与原儿茶酸对照品参照物保留时间一致,以1号峰为S峰,计算各特征峰与S峰的相对保留时间,其相对保留时间在规定值的±10%之内。规定值为:1.62(峰2)、2.44(峰3)、2.50(峰4)、2.82(峰5)、2.95(峰6)。
本方法能快速、直观地鉴别蕤仁药材,为蕤仁药材的质量控制提供了更科学的依据。
实验例2方法学验证
2.1精密度实验
2.1.1重复性
测试方法:取蕤仁药材(批号:201001)6份,按照实施例1提供的方法进行高效液相色谱测定,获得其特征图谱,以1号峰为参照峰,计算其相对峰面积和相对保留时间,并计算RSD。蕤仁药材重复性考察保留时间及相对保留时间测试结果如表2所示。
表2
根据重复性考察结果(表2),各特征峰的相对保留时间RSD为0.0%~0.0%,表明该方法特征图谱的重复性较好。
2.1.2中间精密度
采用Waters ACQUITY ArC,TUV检测器,取蕤仁药材(批号:201001)6份,按照实施例1提供的方法进行高效液相色谱测定,获得其特征图谱,以1号峰为参照峰,计算其相对峰面积和相对保留时间,并计算RSD。蕤仁中间精密度考察保留时间及相对保留时间测试结果如下表3所示。
表3
根据中间精密度考察结果(表3),各特征峰的相对保留时间RSD在0.0%~0.0%范围内。不同仪器间相对保留时间RSD在0.0%~0.0%范围内,实验结果表明该特征图谱方法符合中间精密度分析要求,建议将相对保留时间作为标准。
2.2溶液稳定性考察
测试方法:取蕤仁药材(批号:201001),分别于0h、2h、4h、6h、8h、10h、12h、24h按照实施例1提供的方法进行高效液相色谱测定,获得其特征图谱,以1号峰为参照峰,计算其和相对保留时间,并计算RSD,蕤仁稳定性考察保留时间及相对保留时间如下表4所示。
表4
稳定性实验结果可知(表4),供试品溶液中化学成分在24小时稳定性,各特征峰的相对保留时间RSD均为0.0%,表明分析方法稳定可靠。
2.3耐用性实验
2.3.1不同柱温的考察
测试方法:考察柱温的微小变化对检测方法的影响程度,分别采用28℃、30℃、32℃按照按照实施例1提供的方法对蕤仁药材供试品溶液进行特征图谱检测,不同柱温各峰保留时间及相对保留时间测试结果如下表5所示。
表5
表5数据表明,不同柱温条件下,相对保留时间均在规定值±10%以内,相对保留时间RSD值在0.0~2.1%范围内,表明本发明提供的方法对柱温有较好的耐用性。
2.3.2不同流速的考察
测试方法:考察流速的微小变化对检测方法的影响程度,分别采用0.9mL/min、1.0mL/min及1.1mL/min的流速,按照按照实施例1提供的方法对蕤仁药材供试品溶液进行特征图谱检测,不同流速各峰保留时间及相对保留时间测试结果如下表6所示。
表6
由表6数据可知,不同流速条件下,相对保留时间均在规定值±10%以内,相对保留时间RSD值在1.2%~5.1%范围内,表明本发明提供的方法对流速有较好的耐用性。
2.3.3不同色谱柱的考察
测试方法:按照实施例1提供的方法对蕤仁药材(批号:201001)供试品溶液进行特征图谱检测,与实施例1的区别仅在于,色谱柱不同。
分别采用不同的色谱柱,具体色谱柱的型号如下所示:
色谱柱2:ZORBAX SB-C18(柱长250mm,柱内径4.6mm,粒径为5μm,SN:USCL099141);
色谱柱3:Waters Xselect HSS T3(柱长250mm,柱内径4.6mm,粒径为5μm,SN:01443905012921)。
以1号峰原儿茶酸(S)为参照峰,计算峰2、峰3、峰4、峰5、峰6的保留时间及相对保留时间,并计算RSD值,结果见表7。
表7
采用色谱柱1 WatersHSS T3(4.6*250mm,5μm)得到的色谱图如图4所示。采用色谱柱2 ZORBAX SB-C18(4.6*250mm,5μm)得到的色谱图如图5所示。采用色谱柱3WatersC18(4.6*250mm,5μm)得到的色谱图如图6所示。
采用不同色谱柱结果显示,各特征峰的相对保留时间的RSD值在
1.9%~5.8%范围内,均在规定值±10%以内,表示该分析方适用于不同型号的十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱。
2.4三批(KL201001、KL201006、KL201012)蕤仁配方颗粒验证
测试方法:按照实施例1提供的方法对蕤仁配方颗粒供试品溶液进行特征图谱检测,将图谱导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”进行数据匹配,建立蕤仁配方颗粒的对照特征图谱。
3批蕤仁配方颗粒(KL201001、KL201006、KL201012)验证保留时间及相对保留时间的结果如下表8所示,3批蕤仁配方颗粒HPLC特征图谱如图7所示(S1为KL201001,S2为KL201006,S3为KL201012,S4为蕤仁配方颗粒对照特征图谱)。其中,蕤仁配方颗粒对照特征图谱为按照实施例1测得的3批蕤仁配方颗粒样品图谱经“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”匹配后,得到的蕤仁配方颗粒对照特征图谱。
表8
由表8和图7数据表明,三批颗粒验证结果说明本发明提供方法不仅适用于蕤仁药材,还可实现对蕤仁配方颗粒的质量控制。
(二)蕤仁药材及蕤仁配方颗粒中原儿茶酸含量的测定
实验例3不同批次蕤仁药材中原儿茶酸含量的测定
测试方法:取不同批次蕤仁药材样品(批号分别为201001、201006和201012),按照实施例1提供的方法进行高效液相色谱测定,采用外标法测定蕤仁药材中原儿茶酸含量的测定,3批蕤仁药材原儿茶酸含量测定结果如下表9所示:
表9
由表9数据可知,3批蕤仁药材HPLC含量测定结果的平行样稳定,方法可靠。本发明提供的方法能快速地测定蕤仁药材中原儿茶酸的含量,为蕤仁药材的质量控制提供了更科学的依据。
实验例4方法学验证
4.1准确性
测试方法:精密称取原儿茶酸(纯度:97.7%)9.270mg于200mL容量瓶中,加入70%乙醇水溶液使其溶解并定容至刻度配制成混合对照品母液,从中精密量取25.0mL、50.0mL、60mL分别于250mL、250mL、200mL容量瓶中,加入70%乙醇水溶液定容至刻度,作为对照品溶液①、②、③。取重复性项下已知含量的蕤仁样品(201001,原儿茶酸含量为0.050mg/g)9份,每份约2.0g,精密称定,分别精密加入含有原儿茶酸0.2264mg、0.4528mg、0.6793mg的对照品溶液50mL,按照实施例1提供的方法进行高效液相色谱测定,按照下式计算回收率,原儿茶酸回收率测试结果如下表10所示。
表10
回收率试验(表10)测得原儿茶酸回收率范围为98.50%~108.80%,平均回收率为102.5%。符合方法学验证回收率要求,表明利用本发明提供的方法测得的结果准确可靠。
4.2精密度实验
4.2.1重复性
测试方法:取蕤仁药材(批号:201001)6份,按实施例1提供的方法进行测定,计算原儿茶酸的含量,并计算RSD。蕤仁药材重复性考察原儿茶酸含量测定结果如下表11所示。
表11
由表11数据可知,重复性试验测得蕤仁药材中原儿茶酸含量均值为0.046mg/g,RSD值为5.8%,小于6%,符合方法学验证重复性要求。
4.2.2中间精密度
不同分析人员在不同时间采用另一台Waters ACQUITY ArC,TUV检测器,取蕤仁药材(批号:201001)6份,按实施例1提供的方法进行测定,计算原儿茶酸的含量,并计算RSD。结果如表12所示。
表12
中间精密度试验(表12)测得蕤仁药材中原儿茶酸含量均值为0.052mg/g,RSD值为1.5%,与重复性试验检测结果的RSD为8.7%,小于11%,符合方法学验证精密度的要求。
4.3溶液稳定性考察
测试方法:取蕤仁药材(批号:201001),分别于0h、2h、4h、6h、8h、10h、12h、24h按实施例1提供的方法进行测定,计算原儿茶酸的含量,并计算RSD,蕤仁稳定性考察原儿茶酸含量测定结果如下表13所示:
表13
由表13数据可知,原儿茶酸峰面积变化的RSD值为0.7%,符合系统分析的要求,因此样品中原儿茶酸含量在48小时内较稳定。
4.4耐用性实验
4.4.1不同柱温的考察
测试方法:考察柱温的微小变化对检测方法的影响程度,分别采用28℃、30℃、32℃按照实施例1提供的方法对蕤仁药材供试品溶液进行含量测定,记录原儿茶酸峰面积的变化情况,计算原儿茶酸的含量,并计算RSD,不同柱温原儿茶酸含量测定结果如下表14所示:
表14
由表14数据可知,原儿茶酸峰面积变化的RSD值为1.3%,表明本发明提供的方法对28~32℃之间的柱温耐用性较好。
4.4.2不同流速的考察
测试方法:考察流速的微小变化对检测方法的影响程度,分别采用0.9mL/min、1.0mL/min及1.1mL/min的流速,按照按照实施例1提供的方法对蕤仁药材供试品溶液进行含量测定,记录原儿茶酸峰面积的变化情况,计算原儿茶酸的含量,并计算RSD,不同流速原儿茶酸含量测定结果如下表15所示:
表15
由表15数据可知,原儿茶酸峰面积变化的RSD值为1.3%,表明本发明提供的方法对0.9~1.1mL/min之间的流速耐用性较好。
4.4.3不同色谱柱的考察
测试方法:按照实施例1提供的方法对蕤仁药材(批号:201001)供试品溶液进行含量测定,记录原儿茶酸峰面积的变化情况,计算原儿茶酸的含量,并计算RSD。与实施例1的区别仅在于,色谱柱不同。
分别采用不同的色谱柱,具体色谱柱的型号如下所示:
色谱柱2:ZORBAX SB-C18(柱长250mm,柱内径4.6mm,粒径为5μm,SN:USCL099141);
色谱柱3:Waters Xselect HSS T3(柱长250mm,柱内径4.6mm,粒径为5μm,SN:01443905012921)。
蕤仁不同色谱柱考察原儿茶酸含量测定结果如下表16所示:
表16
由表16可知,不同型号色谱柱检测结果显示,原儿茶酸平均含量为0.055mg/g,RSD值为5.9%,表明该方法适用于不同型号的十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱。
4.5线性
测试方法:精密称取原儿茶酸(纯度:97.7%)对照品9.270mg于200mL容量瓶中,加入70%乙醇水溶液使溶解并定容至刻度制成对照品溶液⑤,从中精密量取1.0mL、25.0mL、50.0mL、2.0mL分别于20mL、250mL、250mL、5mL容量瓶中,加入70%乙醇水溶液定容至刻度,分别作为线性对照品溶液①、②、③、④。取上述各浓度对照品溶液①~⑤滤过,精密吸取续滤液10μL,注入液相色谱仪,按实施例1提供的方法测定原儿茶酸色谱峰峰面积。以色谱峰的峰面积为纵坐标,对照品浓度为横坐标,观察是否呈线性,以最小二乘法进行线性回归,求得原儿茶酸的线性回归方程为Y=36,360,706.5344X-1,034.7458,R2=1.0000,其线性范围为2.2642~45.2840μg/mL。
原儿茶酸线性结果如下表17所示,原儿茶酸标准曲线如下图8所示。
表17
由表17和图8数据可知,采用本发明提供的方法,测得的原儿茶酸含量具有很好的线性。
4.6三批(KL201001、KL201006、KL201012)蕤仁配方颗粒验证
测试方法:按照实施例1提供的方法对蕤仁配方颗粒供试品溶液进行含量测定,3批蕤仁配方颗粒原儿茶酸含量测定结果如下表18所示:
表18
由表18数据可知,三批颗粒验证结果说明此方法不仅适用于药材,还可实现对配方颗粒的质量控制。
(三)不同洗脱梯度的对比实验
实验A
测试样本为蕤仁药材(批号为201001)供试品溶液,其他测试步骤同实施例1。
表19
时间(分钟) | 流动相A(%) | 流动相B(%) |
0~35 | 15→45 | 85→54 |
35~36 | 46→85 | 54→15 |
36~40 | 85 | 15 |
实验A得到的蕤仁药材的特征图谱如图9所示,该方法获得的色谱图,色谱峰均较小,且峰形不好,部分峰分离度差。
实验B
测试样本为蕤仁药材(批号为201001)供试品溶液,其他测试步骤同实施例1。
表20
时间(分钟) | 流动相A(%) | 流动相B(%) |
0~5 | 12→35 | 88→65 |
5~25 | 35→60 | 65→40 |
25~45 | 60→65 | 40→35 |
45~48 | 65→75 | 35→25 |
48~50 | 75 | 25 |
实验B得到的蕤仁药材的特征图谱如图10所示,该方法获得的色谱图,峰形稍有拖尾且分离度差。
实验C
实验方法:ZORBAX SB-C18(4.6*250mm,5μm)色谱柱,以甲醇为流动相A,0.2%甲酸为流动相B,按下表21中的洗脱梯度检测,检测波长为254nm;柱温30℃;流速1.0mL/min。
测试样本为蕤仁药材(批号为201001)供试品溶液,其他测试步骤同实施例1。
表21
时间(min) | 流动相(A) | 流动相(B) |
0~70 | 10→65 | 90→35 |
70~80 | 65 | 35 |
实验C得到的蕤仁药材的特征图谱如图11所示,采用该方法分离时间较长。
通过本发明提供的蕤仁药材的特征图谱(图1)与实验A(图9)、实验B(图10)、实验C(图11)的对比可知,本发明提供的色谱图峰形佳,各峰分离效果较好,且采用本发明提供的方法获得色谱图的重现性好。
申请人声明,本发明通过上述实施例来说明本发明的工艺方法,但本发明并不局限于上述工艺步骤,即不意味着本发明必须依赖上述工艺步骤才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了,对本发明的任何改进,对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等,均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
Claims (10)
1.一种蕤仁药材及蕤仁配方颗粒的质量控制方法,其特征在于,所述质量控制方法包括以下步骤:
(1)将蕤仁药材或蕤仁配方颗粒进行提取,配制成供试品溶液;将原儿茶酸和乙醇水溶液混合,配制成对照品溶液;
(2)将步骤(1)得到的供试品溶液与对照品溶液分别采用高效液相色谱检测,得到蕤仁药材或蕤仁配方颗粒中原儿茶酸的含量及蕤仁药材或蕤仁配方颗粒的特征图谱。
2.根据权利要求1所述的质量控制方法,其特征在于,步骤(1)中,所述供试品溶液的配制具体包括以下步骤:
(a)将蕤仁药材或蕤仁配方颗粒与石油醚混合,超声,过滤,收集滤渣;
(b)将步骤(a)得到的滤渣和乙醇水溶液混合,回流,得到提取液;
(c)将步骤(b)得到的提取液,蒸干,然后用甲醇溶解,得到供试品溶液。
3.根据权利要求2所述的质量控制方法,其特征在于,步骤(a)中,所述石油醚的沸点为60-90℃;
优选地,步骤(a)中,所述蕤仁药材和石油醚的固液比为(1.0-2.5):50g/mL;
优选地,步骤(a)中,所述蕤仁配方颗粒和石油醚的固液比为(0.05-0.15):50g/mL;
优选地,步骤(a)中,所述超声的功率为200-400W,所述超声的频率为30-50kHz,所述超声的时间为30-50min。
4.根据权利要求2或3所述的质量控制方法,其特征在于,步骤(b)中,所述乙醇水溶液中乙醇的体积分数为30-80%;
优选地,步骤(b)中,所述回流的时间为30-70min。
5.根据权利要求1-4任一项所述的质量控制方法,其特征在于,步骤(1)中,所述乙醇水溶液中乙醇的体积分数为60-80%;
优选地,步骤(1)中,所述原儿茶酸和乙醇水溶液的固液比为(80-100):1μg/mL。
6.根据权利要求1-5任一项所述的质量控制方法,其特征在于,步骤(2)中,所述高效液相色谱检测中色谱柱采用的填充剂包括十八烷基硅烷键合硅胶;
优选地,步骤(2)中,所述高效液相色谱检测中柱温为28-32℃。
7.根据权利要求1-6任一项所述的质量控制方法,其特征在于,步骤(2)中,所述高效液相色谱检测中流动相的流速为0.9-1.1mL/min;
优选地,步骤(2)中,所述高效液相色谱检测中检测波长为254nm;
优选地,步骤(2)中,所述高效液相色谱检测中进样量为8-15μL。
8.根据权利要求1-7任一项所述的质量控制方法,其特征在于,所述高效液相色谱检测中以甲醇为流动相A,以0.1%-0.3%甲酸水溶液为流动相B,按照下表进行梯度洗脱:
。
9.根据权利要求8所述的质量控制方法,其特征在于,按照下表进行梯度洗脱:
。
10.根据权利要求1-9任一项所述的质量控制方法,其特征在于,所述蕤仁药材或蕤仁配方颗粒共有6个特征峰,按照出峰时间由短至长依次为峰1、峰2、峰3、峰4、峰5和峰6,以峰1为S峰,峰2-6的相对保留时间在规定值的±10%之内,所述规定值分别为:1.62、2.44、2.50、2.82和2.95;其中峰1为原儿茶酸。
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