CN112362763B - 石榴补血糖浆检测方法及其指纹图谱、构建方法及应用 - Google Patents

石榴补血糖浆检测方法及其指纹图谱、构建方法及应用 Download PDF

Info

Publication number
CN112362763B
CN112362763B CN202010663058.XA CN202010663058A CN112362763B CN 112362763 B CN112362763 B CN 112362763B CN 202010663058 A CN202010663058 A CN 202010663058A CN 112362763 B CN112362763 B CN 112362763B
Authority
CN
China
Prior art keywords
syrup
enriching
fingerprint
pomegranate
solution
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202010663058.XA
Other languages
English (en)
Other versions
CN112362763A (zh
Inventor
尹强
尹海龙
周琴
穆丹丹
鲜开来木·买买江
刘子甲
田芳
孙莹
金彩娜
姜大军
张鹏
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Xinjiang Uygur Pharmaceutical Co ltd
Original Assignee
Xinjiang Uygur Pharmaceutical Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Xinjiang Uygur Pharmaceutical Co ltd filed Critical Xinjiang Uygur Pharmaceutical Co ltd
Priority to CN202010663058.XA priority Critical patent/CN112362763B/zh
Publication of CN112362763A publication Critical patent/CN112362763A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN112362763B publication Critical patent/CN112362763B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
    • G01N30/06—Preparation
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/26—Conditioning of the fluid carrier; Flow patterns
    • G01N30/28—Control of physical parameters of the fluid carrier
    • G01N30/34—Control of physical parameters of the fluid carrier of fluid composition, e.g. gradient
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/26—Conditioning of the fluid carrier; Flow patterns
    • G01N30/28—Control of physical parameters of the fluid carrier
    • G01N30/36—Control of physical parameters of the fluid carrier in high pressure liquid systems
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/86—Signal analysis
    • G01N30/8675—Evaluation, i.e. decoding of the signal into analytical information
    • G01N30/8686—Fingerprinting, e.g. without prior knowledge of the sample components

Landscapes

  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Library & Information Science (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Heterocyclic Carbon Compounds Containing A Hetero Ring Having Oxygen Or Sulfur (AREA)

Abstract

本发明公开了一种石榴补血糖浆检测方法及其指纹图谱、构建方法及应用。该指纹图谱如图6所示。该指纹图谱可用于石榴补血糖浆的质量控制，合格的石榴补血糖浆的指纹图谱与标准指纹图谱的相似度不低于0.969，能有效地表征其质量，有利于全面监控药物的质量，保证产品质量均一稳定；指纹图谱注重各个构成指纹特征峰的前后顺序和相互关系，注重整体面貌特征，既避免了因测定个别化学成分而判定石榴补血糖浆质量的片面性，又减少了为质量达标而人为处理的可能性。本发明提供的石榴补血糖浆指纹图谱的检测方法，具有方法简便、稳定性好、精密度高、重现性好等优点。

Description

石榴补血糖浆检测方法及其指纹图谱、构建方法及应用
技术领域
本发明涉及中药分析领域，具体涉及一种石榴补血糖浆检测方法及其指纹图谱、构建方法及应用。
背景技术
石榴补血糖浆原名为“阿娜尔补血糖浆”，“阿娜尔”为维语“石榴”之意，用于补血、止血、养心强身的常规药品，该品种系医保品种，也是新疆维吾尔药业有限责任公司独家品种，标准号：WS-10785(ZD-0785)-2002-2011Z，处方由石榴、酸石榴两味药材组成。功能主治为：补血健脑。用于异常胆液质偏盛引起的贫血，心悸、气短、焦虑、头晕等。中医：补气血。用于气血虚引起的气短、头晕、心悸、健忘等。
药品的质量是保证临床用药安全有效的前提，该制剂现行执行标准已经对没食子酸进行定量分析，现有文献未有对石榴补血糖浆的成分研究报道。由于中药成分复杂，个别成分的定性定量分析仍难以全面反应药品的全面信息。指纹图谱作为整体上对某药物进行质量控制比起单一组分甚至多组分定性定量方法更加明显。然而目前文献中尚未见到关于石榴补血制剂指纹图谱的研究报道。因此，为了更好的监控石榴补血糖浆中各成分含量，本领域迫切需要建立简单、方便的石榴补血糖浆的指纹图谱。同时对更有效地控制石榴补血糖浆的质量，全面客观评价石榴补血糖浆具有重大的意义。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是为了克服现有技术中缺乏有效的针对石榴补血糖浆指纹图谱的缺陷，提供了一种石榴补血糖浆检测方法及其指纹图谱、构建方法及应用。该检测方法可以客观、全面、准确的评价石榴补血的质量，对控制石榴补血的质量和保证临床疗效具有重要意义。本发明针对石榴补血糖浆成分建立了制剂的指纹图谱，对全面客观评价康石榴补血糖浆的质量具有重要的意义。
本发明通过以下技术方案解决上述技术问题。
本发明提供了一种石榴补血糖浆的指纹图谱，所述指纹图谱中包括11个共有特征峰，以10号峰为对照峰，共有特征峰的相对保留时间分别为：
1号共有特征峰为没食子酸，相对保留时间为0.194，RSD为0.058％；
2号峰共有特征相对保留时间为0.230，RSD为0.150％；
3号峰共有特征相对保留时间为0.241，RSD为0.094％；
4号峰共有特征相对保留时间为0.345，RSD为0.034％；
5号峰共有特征相对保留时间为0.359，RSD为0.035％；
6号共有特征峰为安石榴苷α，相对保留时间为0.451，RSD为0.048％；
7号共有特征峰为安石榴苷β，相对保留时间为0.624，RSD为0.036％；
8号峰共有特征相对保留时间为0.778，RSD为0.021％；
9号峰共有特征相对保留时间为0.880，RSD为0.047％；
10号共有特征峰为鞣花酸，相对保留时间为1.00，RSD为0％；
11号峰，相对保留时间为1.029，RSD为0.011％。
上述11个共有特征峰构成了石榴补血糖浆的指纹特征，可作为石榴补血糖浆的标注指纹图谱。
本发明中，所述石榴补血糖浆可通过市售获得。一般通过下述步骤制得：由石榴和酸石榴分别去皮，剥取种子，榨汁，滤过，石榴汁和酸石榴汁按体积比为1:1的比例，加入适量的蔗糖煮沸溶解后(蔗糖用量可为200～300g/800mL石榴汁)，加入适量防腐剂，搅匀，静置24h，加水定容(定容体积可为1000mL/800mL石榴汁)，滤过即得。
本发明中，所述石榴补血糖浆的指纹图谱为1个高效液相色谱图，较佳地如图6所示。
本发明提供了一种所述石榴补血糖浆的指纹图谱构建方法，其包括下述步骤：利用高效液相色谱检测供试品溶液，将检测结果生成指纹图谱即可；
所述供试品溶液为含有所述石榴补血糖浆的溶液；所述供试品溶液中的溶剂为甲醇或甲醇水溶液；所述供试品溶液中，所述石榴补血糖浆和溶剂的体积比为1mL/(5～20)mL；
所述高效液相色谱中，采用的流动相A为甲醇，流动相B为体积浓度为0.05％～0.2％的磷酸水溶液；所述流动相A和所述流动相B的梯度洗脱条件如下所示：
时间min 流动相A％ 流动相B％
0～15 3 97
15～17 3→6 97→94
17～30 6～10 94～90
30～42 10 90
42～43 10→14 90→86
43～58 14 86
58～60 14→25 86→75
60～80 25→37 75→63
80～83 37→45 63→55
83～93 45→55 55→45
93～100 3 97
其中，表格中的百分比为各组分分别占流动相A和流动相B总体积的体积百分比。
本发明中，所述供试品溶液中的溶剂较佳地为甲醇。
本发明中，所述甲醇水溶液的体积百分数较佳地为50～100％，例如60％、70％或者80％。
本发明中，所述供试品溶液中，所述石榴补血糖浆和所述溶剂的体积比较佳地为1mL/(8～15)mL，更佳地为1mL/(8～12)mL，例如1mL/10mL。
本发明中，所述供试品溶液可通过本领域常规方法制得，较佳地，通过下述步骤制得：将所述石榴补血糖浆和溶剂混合均匀、静置、过滤即可。
其中，所述混合均匀的方式可为本领域常规，一般超声振荡2～5min，例如超声振荡3min。所述静置的时间一般为8～15min，例如10min。所述过滤的操作和条件可为本领域常规，较佳地为采用0.45μm微孔滤膜过滤。所述过滤的目的为除去杂质。
本发明中，所述指纹图谱构建方法中，对照品溶液中的溶剂较佳地为甲醇或甲醇水溶液，更佳地为甲醇。
本发明中，所述指纹图谱构建方法中，对照品溶液中含有鞣花酸，较佳地还包括没食子酸和/或安石榴苷。
所述对照品溶液中含有鞣花酸，鞣花酸的浓度较佳地为15～23μg/mL，例如19.68μg/mL。
当所述对照品溶液中含有没食子酸时，没食子酸的浓度较佳地为8～14μg/mL，例如11.72μg/mL。
当所述对照品溶液中含有安石榴苷时，安石榴苷的浓度较佳地为80～90μg/mL，例如84.64μg/mL。
本发明中，所述高效液相色谱检测中，进样体积可为本领域常规，较佳地为5～20μL，例如10～15μL。
本发明中，所述高效液相色谱检测中，柱温较佳地为25～40℃，更佳地为30℃。
本发明中，所述高效液相色谱检测中，所述供试品溶液的流速较佳地为0.5～1.5mL/min，更佳地为1mL/min。
本发明中，较佳地，所述高效液相色谱检测中，记录100min内的色谱图。
本发明中，所述高效液相色谱检测中，色谱柱较佳地为十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱，例如岛津Inertsil-ODS-3C18或者Waters SunfireC18。所述十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱的规格较佳地为250nm×4.6mm，5μm。
本发明中，所述流动相B较佳地为体积浓度为0.08％-0.15％的磷酸水溶液，更佳地为体积浓度为0.1％的磷酸水溶液，上述百分比为溶质磷酸的体积占流动相B体积的百分比，也即体积百分比浓度。
本发明一较佳实施例中，所述石榴补血糖浆的指纹图谱构建方法包括下述步骤：
S1.配制所述供试品溶液；
S2.配制对照品溶液；所述对照品溶液中包括没食子酸、安石榴苷和鞣花酸，所述对照品溶液中，没食子酸的浓度为8～14μg/mL，安石榴苷的浓度为80～90μg/mL，鞣花酸的浓度为15～23μg/mL；
S3.分别配制安石榴苷对照品母液、没食子酸对照品母液、鞣花酸对照品母液；所述安石榴苷对照品母液中，安石榴苷的浓度为0.1～0.3mg/mL，所述没食子酸对照品母液中，没食子酸的浓度为0.05～0.2mg/mL，所述鞣花酸对照品母液的浓度为0.1～0.3mg/mL；
S4.所述供试品溶液、所述对照品溶液、所述安石榴苷对照品母液、所述没食子酸对照品母液和所述鞣花酸对照品母液分别按照如前所述的高效液相色谱进行检测；
根据所述对照品溶液、所述安石榴苷对照品母液、所述没食子酸对照品母液和所述鞣花酸对照品母液中各物质的保留时间，确定所述供试品溶液中各峰归属，并将所述供试品溶液的检测结果生成指纹图谱；
所述指纹图谱中有11个共有峰，由这11个共有峰构成石榴补血糖浆的指纹特征，作为石榴补血糖浆的标准指纹图谱，所述石榴补血糖浆的指纹图谱为1个高效液相色谱图，如图6所示。
本发明还提供了一种石榴补血糖浆质量的检测方法，所述检测方法为根据如前所述的石榴补血糖浆的指纹图谱的构建方法生成待测样品的指纹图谱，所述待测样品即为石榴补血糖浆的合格产品。
本发明还提供了一种所述石榴补血糖浆的指纹图谱作为标准指纹图谱用于石榴补血糖浆质量控制中。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：
1、本发明提供的石榴补血糖浆指纹图谱检测方法，建立的石榴补血糖浆指纹图谱与对照图谱的相似度在0.969～0.998，能有效地表征其质量，有利于全面监控药物的质量，保证产品质量均一稳定。
2、指纹图谱注重各个构成指纹特征峰的前后顺序和相互关系，注重整体面貌特征，既避免了因测定个别化学成分而判定石榴补血糖浆质量的片面性，又减少了为质量达标而人为处理的可能性。
3、本发明提供的石榴补血糖浆指纹图谱的检测方法，具有方法简便、稳定性好、精密度高、重现性好等优点。
附图说明
图1为实施例1中采用不同提取溶剂制得的供试品溶液的HPLC色谱图。其中，图1A的提取溶剂为甲醇，图1B的提取溶剂为50％甲醇水溶液，图1C的提取溶剂为乙醇。
图2为实施例1中采用不同料液比制得的供试品溶液的HPLC色谱图。其中，图2A为定容至50ml，图2B为定容至25ml，图2C为定容至10ml。
图3为实施例2中采用不同流动相时，供试品溶液的HPLC色谱图，其中，图3A为0.1％磷酸水溶液与甲醇，图3B为0.2％磷酸水溶液与甲醇，图3C为0.05％磷酸水溶液与甲醇，图3D为三氟乙酸与甲醇。
图4为实施例2中不同色谱柱时，供试品溶液的HPLC色谱图，其中，图4A为AgilentEclipse PlusC18，图4B为岛津inertsil ODS C18，图4C为Waters Sunfire C18。
图5为实施例2中不同柱温时，供试品溶液的HPLC色谱图，其中，图5A为25℃，图5B为30℃，图5C为40℃。
图6为实施例3中供试品溶液(石榴补血糖浆)的HPLC色图谱。
图7为实施例3中混合对照品溶液、安石榴苷对照品母液、没食子酸对照品母液、鞣花酸对照品母液的HPLC图谱。其中，图7A为混合对照品溶液，图7B为安石榴苷对照品母液，图7C为没食子酸对照品母液，图7D为鞣花酸对照品母液。
图8为实施例4中16批次石榴补血糖浆构建的对照指纹图谱，图中S1至32分别对应批号0160216、0160216、0160502、0160502、0161026、0161026、0171150、0171150、0170112、0170112、0170415、0170415、0170911、0170911、0180134、0180134、0180613、0180613、0181038、0181038、0190105、0190105、0190706、0190706、0181259、0181259、0190815、0190815、0190348、0190348、0190940、0190940，也就是说，上述16个批次，每个批次重复进样两次。
图9为实施例5中批号0190815的石榴补血糖浆平行6次进样的HPLC指纹谱图。S1-S6分别表示平行6次进样。
图10为实施例5中批号0190815的石榴补血糖浆平行6次进样的HPLC指纹谱图。S1-S6分别表示平行6次进样。
图11为实施例5中批号0190815的石榴补血糖浆分别在0～48h内进样的HPLC指纹谱图。S1-S12分别对应供试品溶液放置0、2、4、6、8、10、12、14、19、24、36、48h。
图12为对比例1的供试品溶液的HPLC色谱图。
图13为对比例2的供试品溶液的HPLC色谱图。
图14为对比例3的供试品溶液的HPLC色谱图。
图15为对比例4的供试品溶液的HPLC色谱图。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
实施例用到的仪器与试剂如下：
1仪器与试药
1.1仪器
Waters AcQuity Arc高效液相，2998PDA检测器(美国WATERS公司)；Waters e2695液相色谱仪，Waters 2998二极管阵列检测器，alliance柱温箱，empower3色谱工作站(美国WATERS公司)；METTLER TOLEDO AL204电子天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司)；SK250HP型超声波清洗器(上海科导超声仪器有限公司)。
1.2试药
对照品：没食子酸(110831-201605)、鞣花酸(111959-201602)均购于中国食品药品检定研究院，安石榴苷(19040804,18022604)来自于成都普菲德生物技术有限公司。
试剂：甲醇、乙腈为色谱纯(Fisher Scientific)，分析甲醇(天津北联精细化学品开发有限公司)、磷酸(天津市大茂化学市试剂厂)、乙醇(国药集团化学试剂有限公司)、三氟乙酸(天津市大茂化学市试剂厂)，所用水为娃哈哈纯净水。
样品：共收集16批次石榴补血糖浆样品，均由新疆维吾尔药业有限责任公司生产，为市售产品。批号分别为：0160216、0160502、0161026、0171150、0170112、0170415、0170911、0180134、0180613、0181038、0190105、0190706、0181259、0190815、0190348、0190940。
实施例1石榴补血糖浆指纹图谱样品制备方法的选择
1、不同溶剂的考察
精密量取3份石榴补血糖浆1mL，分别加入乙醇、甲醇、体积百分比浓度为50％甲醇作为提取溶剂定容至10mL，摇匀、静置、过滤分别制得供试品溶液。按照实施例3公开的HPLC检测方法进行测试。
以色谱峰峰型、色谱峰个数和主峰峰面积除以取样量为评价指标进行分析，试验结果见图1(图1为实施例1中采用不同提取溶剂制得的供试品溶液的HPLC色谱图，其中，图1A的提取溶剂为甲醇，图1B的提取溶剂为50％甲醇水溶液，图1C的提取溶剂为乙醇)，乙醇提取缺少了1个峰，丢失2号峰，并且各峰峰面积整体减小，不适合做提取溶剂。浓度为50％甲醇和甲醇提取的样品信息较全面，将10峰鞣花酸作为参照峰，与提取溶剂为50％甲醇相比，提取溶剂为甲醇时峰面积较大，结果见表1。因此，最终选择甲醇为提取溶剂。
表1不同提取溶剂下鞣花酸峰面积
不同溶剂 甲醇 50％甲醇
鞣花酸峰面积 342735 285344
2不同料液比的考察
精密量取3份石榴补血糖浆1mL，加甲醇分别定容至10mL、25mL、50mL，摇匀，静置，过滤，分别制得供试品溶液。按照实施例3公开的HPLC检测方法进行测试。结果见图2(其中，图2A为定容至50ml，图2B为定容至25ml，图2C为定容至10ml)。以主峰峰面积(10号峰为参照峰—鞣花酸)除以取样量为评价指标进行分析，试验结果表明，溶剂用量在10mL时，各色谱峰均提取较充分，而溶剂用量为50mL时，样品浓度较低，峰面积较小，仪器不能自动积分，不易检测；溶剂体积为25mL时，不能精确检测，也不适用；因此选择溶剂用量为10mL。不同料液比时，各峰面积具体数据如表2所示。
综合上述实验结果，确定石榴补血糖浆指纹图谱供试液的制备方法为：精密量取石榴补血糖浆1ml，分别加甲醇定容至10mL，摇匀，静置，过滤，进样测定。
表2不同料液比各峰面积具体数据
Figure GDA0002639787500000101
注：“—”表示，此峰峰面积小，导致仪器无法自动积分。
实施例2石榴补血糖浆指纹图谱色谱条件的选择
1.流动相的考察
除洗脱溶剂的种类以外，供试品溶液的制备、HPLC色谱条件均与实施例3相同。洗脱溶剂的种类分别为以下几组：
对流动相A甲醇-流动相B为0.1％三氟乙酸、流动相A甲醇-流动相B为0.05％磷酸水溶液、流动相A甲醇-流动相B为0.1％磷酸水溶液，流动相A甲醇-流动相B为0.2％磷酸水溶液等体系进行了考察(上述百分比均为体积百分比浓度)，结果表明甲醇-0.1％磷酸水溶液峰面积高，系统分离度良好，峰形对称佳，且与其含测流动相相同，可简化实际应用时的步骤，故选择甲醇-0.1％磷酸系统进行梯度洗脱。结果见图3(图3A为0.1％磷酸水溶液与甲醇，图3B为0.2％磷酸水溶液与甲醇，图3C为0.05％磷酸水溶液与甲醇，图3D为三氟乙酸与甲醇)。
不同洗脱溶剂时，各峰面积、分离度具体数据如表3所示。
表3
Figure GDA0002639787500000102
Figure GDA0002639787500000111
注：“—”表示，此峰峰面积小，导致仪器无法自动积分。
2.色谱柱的考察
除色谱柱的种类以外，供试品溶液的制备、HPLC色谱条件均与实施例3相同。色谱柱分别选择以下三种品牌：
(1)岛津Inertsil-ODS-3C18(250nm×4.6mm，5μm)
(2)安捷伦Eclipse PlusC18(250nm×4.6mm，5μm)
(3)Waters SunfireC18(250nm×4.6mm，5μm)
图4为实施例2中不同色谱柱时，供试品溶液的HPLC色谱图，其中，图4A为AgilentEclipse PlusC18，图4B为岛津inertsil ODS C18，图4C为Waters Sunfire C18。
结果表明：Inertsil-ODS-3C18(250nm×4.6mm，5μm)和Waters SunfireC18(250nm×4.6mm，5μm)色谱柱对样品的分离效果较好，上述两个柱子均可用于本发明。
下述实施例中，选择Inertsil-ODS-3C18(250nm×4.6mm，5μm)色谱柱为石榴补血糖浆指纹图谱分析柱。
3.柱温的考察
除柱温条件外，供试品溶液的制备、HPLC色谱条件均与实施例3相同。
考察柱温分别为25℃、30℃和40℃。图5为实施例2中不同柱温时，供试品溶液的HPLC色谱图，其中，图5A为25℃，图5B为30℃，图5C为40℃。由图5可知，上述3个温度均能出峰，柱温为30℃时，比较容易控制，全部峰的出峰时间相对较好，综合应用和方便考虑最终确定柱温为30℃。
实施例3石榴补血糖浆指纹图谱的建立方法
1.供试品溶液的制备：精密量取石榴补血糖浆1ml，加甲醇定容至10ml，摇匀，静置过滤，既得。
2.对照品溶液的制备：
精密称定没食子酸对照品0.01142g，加甲醇定容至100ml的容量瓶中，摇匀，即得没食子酸对照品母液。
精密称定安石榴苷对照品0.02116g，加甲醇定容至100ml的容量瓶中，摇匀，即得安石榴苷对照品母液。
精密称定鞣花酸对照品0.01968g，加甲醇定容至100ml的容量瓶中，摇匀，即得鞣花酸对照品母液。
精密量取安石榴苷对照品母液，没食子酸对照品母液，鞣花酸对照品母液各4ml，1ml，1ml加甲醇定容至10ml的容量瓶，即得每1ml分别含没食子酸、安石榴苷、鞣花酸为11.42μg、84.64μg、19.68μg，过滤，取过滤液作为对照品溶液。
3.HPLC色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以甲醇为流动相A，以0.1％磷酸水溶液为流动相B，梯度洗脱，流动相A、B的比例变化见表4；体积流量1mL/min；柱温30℃；进样量10μL，运行时间100min，色谱柱规格为inertsil ODS-C18色谱柱(250nm×4.6mm，5μm)。
表4梯度洗脱程序
Figure GDA0002639787500000121
Figure GDA0002639787500000131
4.精密吸取供试品溶液10μL、对照品溶液10μL、安石榴苷对照品母液10μL、没食子酸对照品母液10μL、鞣花酸对照品母液10μL，分别注入高效液相色谱仪，测定，记录100分钟内的色谱图。
用指纹图谱软件对图谱进行处理，既得石榴补血糖浆的指纹图谱中有11个共有峰，由这11个共有峰构成石榴补血糖浆的指纹特征，作为石榴补血糖浆的标准指纹图谱。
图6为实施例3中供试品溶液(石榴补血糖浆)的HPLC图谱，其中11个共有峰中：没食子酸为1号峰，保留时间为17.7501min，安石榴苷α、β分别为6号峰、7号峰，保留时间分别为41.0523、56.8105min，鞣花酸为10号峰，保留时间为91.087min；2号峰保留时间20.9491，3号峰保留时间21.9994，4号峰保留时间31.4494，5号峰保留时间32.6806，8号峰保留时间70.9199，9号峰保留时间80.2188，11号峰保留时间93.8039。
图7为实施例3中混合对照品溶液、安石榴苷对照品母液、没食子酸对照品母液、鞣花酸对照品母液的HPLC图谱。其中，图7A为混合对照品溶液，图7B为安石榴苷对照品母液，图7C为没食子酸对照品母液，图7D为鞣花酸对照品母液。
实施例4
相似度评价：
分别精密量取16批石榴补血糖浆1mL，加甲醇定容至10mL，摇匀，静置，过滤即得供试品溶液。
所得16批供试品溶液分别按照实施例3的HPLC色谱条件进行检测生成对照指纹图谱，确定共有峰11个(共有峰是指16个批次的色谱图中均存在的色谱峰)。
对共有峰的相对保留时间及峰面积比值进行考察，其中S峰为鞣花酸峰(10号峰)，比较稳定，故将其作为参比峰，计算其他各峰的相对保留时间、相对峰面积，结果见表5、表6，利用中国药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统A版”，将HPLC图谱导入，经多点校正和数据匹配，以平均数法生成对照图谱，16批相似度分别为0.993、0.995、0.979、0.986、0.998、0.997、0.983,0.979、0.990、0.990、0.969、0.991、0.993、0.970、0.994、0.985。
图8为实施例4中16批次石榴补血糖浆构建的对照指纹图谱，图中S1至S32分别对应批号0160216、0160216、0160502、0160502、0161026、0161026、0171150、0171150、0170112、0170112、0170415、0170415、0170911、0170911、0180134、0180134、0180613、0180613、0181038、0181038、0190105、0190105、0190706、0190706、0181259、0181259、0190815、0190815、0190348、0190348、0190940、0190940，也就是说，上述16个批次，每个批次重复进样两次。
表5石榴补血糖浆指纹对照图谱16批次共有峰相对保留时间
Figure GDA0002639787500000141
Figure GDA0002639787500000151
表6石榴补血糖浆指纹对照图谱16批次共有峰相对峰面积
Figure GDA0002639787500000152
实施例5指纹图谱方法学考察
1.精密度试验：精密量取石榴补血糖浆(批号0190815)，按实施例3的供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，按实施例3中色谱条件连续进样6次(同一份供试品溶液连续进样6次)。
分别对共有峰的保留时间及峰面积进行考察，结果各共有峰保留时间RSD均小于0.1％(是指的11个峰的相对保留时间RSD均小于0.1％)，峰面积RSD均小于3.0％(是指共有峰的峰面积比值RSD均小于0.1％)。利用中国药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统A版”，将HPLC图谱导入，经多点校正和数据匹配，以平均数法生成对照图谱，相似度均为1.00。
图9为实施例5中批号0190815的石榴补血糖浆平行6次进样的HPLC指纹谱图。S1-S6分别表示6次平行进样。
2.重复性试验：精密量取石榴补血糖浆(批号0190815)6份，按实施例3的供试品溶液的制备方法制备相同浓度的供试品溶液，按实施例3中色谱条件分别进样。
分别对共有峰的保留时间及峰面积进行考察，结果各共有峰保留时间RSD小于0.18％，峰面积RSD小于8.43％。6号峰为安石榴苷-α，7号峰为安石榴苷-β相对峰面积RSD分别为7.86％，8.43％、安石榴苷(安石榴苷-α，安石榴苷-β)峰面积RSD小于2.7％。其余共有峰面积RSD小于1.6％。利用中国药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”，将HPLC图谱导入，经多点校正和数据匹配，以平均数法生成对照图谱，相似度分别为1.000、0.999、1.000、1.000、1.000、1.00。
图10为实施例5中批号0190815的石榴补血糖浆平行6次进样的HPLC指纹谱图。S1-S6分别表示6次平行进样。
3.稳定性试验：精密量取石榴补血糖浆(批号0190815)，按实施例3的供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，按实施例3中色谱条件，分别在供试品溶液放置0、2、4、6、8、10、12、14、19、24、36、48h进样分析。对共有峰的保留时间及峰面积进行考察，结果各共有峰保留时间RSD小于0.02％，峰面积RSD较大，从直观分析发现、其中6、7号峰峰面积RSD分别为4.70％，5.22％、安石榴苷(安石榴苷-α，安石榴苷-β)峰面积RSD小于1.37％，其余小于2.74％。利用中国药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统A版”，将HPLC图谱导入，经多点校正和数据匹配，以平均数法生成对照图谱，相似度分别为0.997、0.998、0.998、0.998、0.998、0.998、0.998、0.998、0.985、0.985、0.984、0.998。
图11为实施例5中批号0190815的石榴补血糖浆分别在0～48h内进样的HPLC指纹谱图。S1-S12分别对应供试品溶液放置0、2、4、6、8、10、12、14、19、24、36、48h。
对比例1
本对比例中，采用的是洗脱条件为甲醇：体积浓度0.1％磷酸水溶液＝2：98等度洗脱。除洗脱条件外，供试品溶液的制备、HPLC色谱条件均与实施例3相同。
图12为对比例1的供试品溶液的HPLC色谱图。由图12可知，在该条件下，石榴补血制剂中的各个成分不能有效进行分离，不能达到全面控制产品质量的目的。
对比例2
本对比例中，采用的流动相A为甲醇，流动相B为体积浓度为0.1％的磷酸水溶液，洗脱程序如下表所示。除洗脱程序外，供试品溶液的制备、HPLC色谱条件均与实施例3相同。
表7
Figure GDA0002639787500000171
图13为对比例2的供试品溶液的HPLC色谱图。由图13可知，0～10min出现的峰没有分开，而且峰对称性不好。能清楚地看到的共有峰只有4个。已知成分只有鞣花酸。
对比例3
本对比例中，采用的流动相A为甲醇，流动相B为体积浓度为0.1％的磷酸水溶液，洗脱程序如下表所示。除洗脱程序外，供试品溶液的制备、HPLC色谱条件均与实施例3相同。
表8
Figure GDA0002639787500000181
图14为对比例3的供试品溶液的HPLC色谱图。由图14可知，安石榴苷α，β峰分离出形，但有拖尾现象；而且0～10min仍有没有分离的峰。
对比例4
本对比例中，采用的流动相A为甲醇，流动相B为体积浓度为0.1％的磷酸水溶液，洗脱程序如下表所示。除洗脱程序外，供试品溶液的制备、HPLC色谱条件均与实施例3相同。
表9
Figure GDA0002639787500000182
Figure GDA0002639787500000191
图15为对比例4的供试品溶液的HPLC色谱图。由图15可知，11个共有峰虽然已经出峰，但是峰形不好、分离度不好，例如没食子酸分离度低，安石榴苷α，β没分开。

Claims (15)

1.一种石榴补血糖浆的指纹图谱的构建方法，其特征在于，其包括下述步骤：利用高效液相色谱检测供试品溶液，将检测结果生成指纹图谱即可；
所述供试品溶液为含有所述石榴补血糖浆的溶液；所述供试品溶液中的溶剂为甲醇或甲醇水溶液；所述供试品溶液中，所述石榴补血糖浆和溶剂的体积比为1mL/（5~20）mL；
所述高效液相色谱检测中，色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱；
所述高效液相色谱中，采用的流动相A为甲醇，流动相B为体积浓度为0.05%~0.2%的磷酸水溶液；所述流动相A和所述流动相B的梯度洗脱条件如下所示：
Figure DEST_PATH_IMAGE002
其中，表格中的百分比为各组分分别占流动相A和流动相B总体积的体积百分比；所述高效液相色谱检测中，柱温为25~40℃；所述指纹图谱包括11个共有特征峰，以10号峰为对照峰，共有特征峰的相对保留时间分别为：
1号共有特征峰为没食子酸，相对保留时间为0.194，RSD为0.058%；
2号共有特征峰相对保留时间为0.230，RSD为0.150%；
3号共有特征峰相对保留时间为0.241，RSD为0.094%；
4号共有特征峰相对保留时间为0.345，RSD为0.034%；
5号共有特征峰相对保留时间为0.359，RSD为0.035%；
6号共有特征峰为安石榴苷α，相对保留时间为0.451，RSD为0.048%；
7号共有特征峰为安石榴苷β，相对保留时间为0.624，RSD为0.036%；
8号共有特征峰相对保留时间为0.778，RSD为0.021%；
9号共有特征峰相对保留时间为0.880，RSD为0.047%；
10号共有特征峰为鞣花酸，相对保留时间为1.00，RSD为0%；
11号共有特征峰，相对保留时间为1.029，RSD为0.011%。
2.如权利要求1所述的石榴补血糖浆的指纹图谱的构建方法，其特征在于，所述石榴补血糖浆通过下述步骤制得：由石榴和酸石榴分别去皮，剥取种子，榨汁，滤过，石榴汁和酸石榴汁按体积比为1:1的比例，加入蔗糖煮沸溶解后，加入防腐剂，搅匀，静置，加水定容，滤过即得；
和/或，所述石榴补血糖浆的指纹图谱为1个高效液相色谱图。
3.如权利要求1所述的石榴补血糖浆的指纹图谱的构建方法，其特征在于，所述供试品溶液中的溶剂为甲醇；
和/或，所述供试品溶液中，所述石榴补血糖浆和溶剂的体积比为1mL/（8~15）mL；
和/或，所述供试品溶液通过下述步骤制得：将所述石榴补血糖浆和溶剂混合均匀、静置、过滤即可。
4.如权利要求3所述的石榴补血糖浆的指纹图谱的构建方法，其特征在于，所述供试品溶液中，所述石榴补血糖浆和溶剂的体积比为1mL/（8~12）mL；
和/或，所述供试品溶液的制备方法中，所述混合均匀的方式为超声振荡2~5min；所述静置的时间为8~15min；所述过滤采用0.45μm微孔滤膜。
5.如权利要求4所述的石榴补血糖浆的指纹图谱的构建方法，其特征在于，所述供试品溶液中，所述石榴补血糖浆和溶剂的体积比为1mL/10mL。
6.如权利要求1所述的石榴补血糖浆的指纹图谱的构建方法，其特征在于，所述指纹图谱构建方法中，对照品溶液中的溶剂为甲醇或甲醇水溶液；
和/或，所述指纹图谱构建方法中，对照品溶液中含有鞣花酸，还包括没食子酸和/或安石榴苷。
7.如权利要求6所述的石榴补血糖浆的指纹图谱的构建方法，其特征在于，所述指纹图谱构建方法中，对照品溶液中的溶剂为甲醇。
8.如权利要求6所述的石榴补血糖浆的指纹图谱的构建方法，其特征在于，所述对照品溶液中，鞣花酸的浓度为15~23 μg/mL；
当所述对照品溶液中含有没食子酸时，没食子酸的浓度为8~14 μg/mL；
当所述对照品溶液中含有安石榴苷时，安石榴苷的浓度为80~90 μg/mL。
9.如权利要求8所述的石榴补血糖浆的指纹图谱的构建方法，其特征在于，所述对照品溶液中，鞣花酸的浓度为19.68 μg/mL；
当所述对照品溶液中含有没食子酸时，没食子酸的浓度为11.72μg/mL；
当所述对照品溶液中含有安石榴苷时，安石榴苷的浓度为84.64 μg/mL。
10.如权利要求1所述的石榴补血糖浆的指纹图谱的构建方法，其特征在于，所述高效液相色谱检测中，进样体积为5~20μL；
和/或，所述高效液相色谱检测中，柱温为30℃；
和/或，所述高效液相色谱检测中，所述供试品溶液的流速为0.5~1.5mL/min；
和/或，所述高效液相色谱检测中，记录100min内的色谱图；
和/或，所述高效液相色谱检测中，色谱柱为岛津Inertsil-ODS-3C18或者WatersSunfireC18；和/或，所述流动相B为体积浓度为0.08%-0.15%的磷酸水溶液。
11.如权利要求10所述的石榴补血糖浆的指纹图谱的构建方法，其特征在于，所述高效液相色谱检测中，进样体积为10~15μL；
和/或，所述高效液相色谱检测中，所述供试品溶液的流速为1mL/min；
和/或，所述高效液相色谱检测中，所述十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱的规格为250nm×4.6mm，5μm；
和/或，所述流动相B为体积浓度为0.1%的磷酸水溶液。
12.如权利要求1所述的石榴补血糖浆的指纹图谱的构建方法，其特征在于，所述甲醇水溶液的体积百分数为大于等于50%且小于100%。
13.如权利要求12所述的石榴补血糖浆的指纹图谱的构建方法，其特征在于，所述甲醇水溶液的体积百分数为60%、70%或者80%。
14.如权利要求1~13任一项所述的石榴补血糖浆的指纹图谱的构建方法，其特征在于，所述石榴补血糖浆的指纹图谱构建方法包括下述步骤：
S1. 配制所述供试品溶液；
S2. 配制对照品溶液；所述对照品溶液中包括没食子酸、安石榴苷和鞣花酸，所述对照品溶液中，没食子酸的浓度为8~14 μg/mL，安石榴苷的浓度为80~90 μg/mL，鞣花酸的浓度为15~23 μg/mL；
S3. 分别配制安石榴苷对照品母液、没食子酸对照品母液、鞣花酸对照品母液；所述安石榴苷对照品母液中，安石榴苷的浓度为0.1~0.3mg/mL，所述没食子酸对照品母液中，没食子酸的浓度为0.05~0.2mg/ mL，所述鞣花酸对照品母液的浓度为0.1~0.3mg/mL；
S4. 所述供试品溶液、所述对照品溶液、所述安石榴苷对照品母液、所述没食子酸对照品母液和所述鞣花酸对照品母液分别进行所述的高效液相色谱检测；
根据所述对照品溶液、所述安石榴苷对照品母液、所述没食子酸对照品母液和所述鞣花酸对照品母液中各物质的保留时间，确定所述供试品溶液中各峰归属，并将所述供试品溶液的检测结果生成指纹图谱；
所述指纹图谱中有11个共有峰，由这11个共有峰构成石榴补血糖浆的指纹特征，作为石榴补血糖浆的标准指纹图谱，所述石榴补血糖浆的指纹图谱为1个高效液相色谱图。
15.一种如权利要求1~14中任一项所述的石榴补血糖浆的指纹图谱的构建方法得到的指纹图谱在石榴补血糖浆质量控制中的应用。
CN202010663058.XA 2020-07-10 2020-07-10 石榴补血糖浆检测方法及其指纹图谱、构建方法及应用 Active CN112362763B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010663058.XA CN112362763B (zh) 2020-07-10 2020-07-10 石榴补血糖浆检测方法及其指纹图谱、构建方法及应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010663058.XA CN112362763B (zh) 2020-07-10 2020-07-10 石榴补血糖浆检测方法及其指纹图谱、构建方法及应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN112362763A CN112362763A (zh) 2021-02-12
CN112362763B true CN112362763B (zh) 2022-10-18

Family

ID=74516666

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010663058.XA Active CN112362763B (zh) 2020-07-10 2020-07-10 石榴补血糖浆检测方法及其指纹图谱、构建方法及应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN112362763B (zh)

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102253154B (zh) * 2011-04-27 2013-12-11 江苏大学 石榴中没食子酸、鞣花酸和安石榴甙a&b的分析方法及应用
CN103505480A (zh) * 2012-06-21 2014-01-15 新疆医科大学 石榴皮抗肿瘤多酚有效部位及其制备方法和应用
CN108956825A (zh) * 2018-02-08 2018-12-07 杭州师范大学 一种石榴皮的微提取方法
CN110794064A (zh) * 2019-11-23 2020-02-14 北京中医药大学 余甘子药材和鞣质部位九种成分的一测多评含量检测方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN112362763A (zh) 2021-02-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN104749269B (zh) 一种利用hplc测定阿格列汀原料药及制剂中对映异构体杂质的方法
CN110850019B (zh) 明葛舒清饮指纹图谱的检测方法
CN113049700A (zh) 五味消毒饮的指纹图谱检测方法
CN109900819A (zh) 一种uplc/ms-ms联用检测人血清中替诺福韦的方法
CN110927311B (zh) 一种罗布麻叶药材uplc特征图谱的构建方法及其黄酮类成分含量测定方法
CN113960203B (zh) 检测天龙配方颗粒特征图谱的方法
CN107315058A (zh) 一种检测银杏叶提取液中总银杏酸的方法
CN107449846B (zh) Hplc-ms测定小儿安神补脑颗粒中有效成分的方法
CN112362763B (zh) 石榴补血糖浆检测方法及其指纹图谱、构建方法及应用
CN110806457B (zh) 四君甘露饮指纹图谱的检测方法
CN109709222B (zh) 一种感冒灵和复方感冒灵的成分检测方法
CN115372497B (zh) 一种小活络丸中6种生物碱成分的含量测定方法
CN105866268A (zh) 一种同时测定滴眼液中多种抑菌剂的检测方法
CN113092640B (zh) 肝素钠注射液中苯甲醇与苯甲醛的检测方法
CN111896637B (zh) 一种金青中间体的检测方法及其指纹图谱构建方法
CN114910583A (zh) 一种桔贝合剂的检测方法
CN113671099A (zh) 一种紫叶丹胶囊的检测方法
CN113655165A (zh) 产后康膏的指纹图谱检测方法
CN107941940B (zh) 一种山萮菜药材的hplc-dad指纹图谱质量测定方法
CN113237961A (zh) 一种药物制剂中肉桂与苏合香的主要药效成分的检测方法
CN107807182B (zh) 灵芝糖浆中灵芝酸a成分的含量测定方法
CN112394117B (zh) 一种牡蛎散指纹图谱的建立方法及其指纹图谱
CN109632984B (zh) 一种银杏二内酯注射液的检测方法
CN117517533B (zh) 一种醒脑益智胶囊的质量检测方法
CN108956835A (zh) 一种清咽解热口服药物的指纹图谱检测方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant