CN104849379B - 一种测定人血浆中丹参素，间位甲基丹参素，原儿茶醛及原儿茶酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种药物含量的测定方法，特别涉及一种测定人血浆中丹参素，间位甲基丹参素，原儿茶醛及原儿茶酸的方法。本发明所述的方法，包括以下步骤：1）对照品储备液的制备：称取丹参素、间位甲基丹参素、原儿茶醛和原儿茶酸对照品，用甲醇溶解，即得丹参素、间位甲基丹参素、原儿茶醛和原儿茶酸对照品储备液。2）内标溶液的制备：取内标物香草酸用甲醇溶解即得内标溶液。3）血浆样品处理方法：取血浆样品，加入内标溶液，甲醇，盐酸，乙酸乙酯，混合均匀后，离心取上清乙酸乙酯层，干燥，用甲醇复溶，离心，得血浆样品上清液。4）含量测定：采用LC‑MS/MS色谱法，将上述对照品储备液和血浆样品上清液注入色谱仪，得到色谱图，根据色谱图中色谱峰的面积计算丹参素、间位甲基丹参素、原儿茶醛和原儿茶酸在血浆中的浓度。
Description
技术领域：
本发明涉及一种药物含量的测定方法，特别涉及一种测定人血浆中丹参素，间位甲基丹参素，原儿茶醛及原儿茶酸的方法。
背景技术：
复方丹参滴丸为天士力公司开发的活血化瘀、理气止痛中药，用于胸中憋闷、心绞痛，其主要成分为丹参、三七、冰片，其药理作用包括1增加冠脉血流量，2增加心肌耐缺氧保护缺血心肌，3抗血小板聚集防止血栓形成，4改善微循环。
复方丹参滴丸中丹参味苦，性微寒，具有活血化瘀，养血安神，凉血排痈和排毒生肌的功效，是中药活血化瘀的常用药物。丹参药材主含脂溶性的二萜类成分和水溶性的酚酸类成分，尚含有黄酮类、三萜类、甾醇等其他成分。二萜类成分中属醌、酮型结构的有丹参酮I、ⅡA、ⅡR、V、Ⅵ，隐丹参酮，异丹参酮I、Ⅱ、IIB，二氢丹参酮I等。水溶性的酚酸类成分有丹参素，原儿茶醛，咖啡酸及丹参素与咖啡酸的衍生物或二聚物酯化而成的缩酚酸。
丹参素、原儿茶醛是复方丹参滴丸的主要成分，近年来，有关生物样品中丹参素、原儿茶醛、原儿茶酸的含量测定方法(如HPLC、LC-MS/MS等)有较多报道，但大多为上述化合物单独测定的方法。据文献报道，丹参素、原儿茶醛在人体会分别代谢生成间位丹参素和原儿茶酸。
中药药物代谢动力学是应用动力学原理，研究中药活性成分、组分、单味药和复方体内吸收、分布、代谢、排泄和毒性的动态变化规律及其体内时-量、时-效关系，并用数学函数加以定量描述的一门新兴学科。开展中药药物代谢动力学研究对阐明和揭示中药药效物质基础和作用机制，设计及优选中药给药方案，促进中药新药研发、剂型改进及质量控制，均具有重要意义。目前中药药动学研究方法归纳起来可分为两大类，一类是针对成分明确的中药及复方，即血药浓度法；另一类是化学基础研究薄弱成分尚不明确的中药及复方，该类主要以生物效应法为研究手段，包括药理效应法、药物累积法、效量半衰期法、微生物法等。液相色谱质谱法是最近十几年来发展起来的一种新的分离分析方法，由于其高选择性和高灵敏度已成为药代动力学研究的一种较理想的检测方法。
为深入研究复方丹参滴丸主要成分在人体内的吸收及代谢过程，需要建立一种丹参素、原儿茶醛及其代谢产物同时测定的方法。
本发明经过研究找到一种丹参素、原儿茶醛、间位丹参素和原儿茶酸人血浆中联测的LC-MS/MS方法，本方法具有专属性强、灵敏度高、准确性和重现性好等优点，满足人体药代动力学要求。
发明内容：
人在服用含有丹参的药物，如复方丹参滴丸后，经过吸收和代谢，血浆中含有丹参素，间位甲基丹参素，原儿茶醛及原儿茶酸。为检测服用复方丹参滴丸后人体血浆中上述成分的含量本发明提供了一种测定人血浆中丹参素，间位甲基丹参素，原儿茶醛及原儿茶酸的方法，所述方法，包括以下步骤：
1）对照品储备液的制备
称取丹参素、间位甲基丹参素、原儿茶醛和原儿茶酸对照品，用甲醇溶解，即得丹参素、间位甲基丹参素、原儿茶醛和原儿茶酸对照品储备液。
2）内标溶液的制备
取内标物香草酸用甲醇溶解即得内标溶液。
3）血浆样品处理方法
取血浆样品，加入内标溶液，甲醇，盐酸，乙酸乙酯，混合均匀后，离心取上清乙酸乙酯层，干燥，用甲醇复溶，离心，得血浆样品上清液。
4）含量测定
采用LC-MS/MS色谱法，将上述对照品储备液和血浆样品上清液注入色谱仪，得到色谱图，根据色谱图中色谱峰的面积计算丹参素、间位甲基丹参素、原儿茶醛和原儿茶酸在血浆中的浓度。
优选的，所述方法，包括以下步骤：
1）对照品储备液的制备
分别称取丹参素、间位甲基丹参素、原儿茶醛和原儿茶酸对照品，分别用甲醇配成浓度为150-250μg/ml的对照品储备液I。
分别取4种对照品储备液I，分别用40-60%（V/V）甲醇水溶液配制浓度均为2-6μg/ml的各自的对照品储备液II。
2）内标溶液的制备
称取内标物香草酸用甲醇配制成150-250μg/ml的内标储备液，进一步用甲醇配制成3-7μg/ml的香草酸内标溶液。
3）血浆样品处理方法
取血浆样品150-250μl，依次加入内标溶液30-70μl，40-60%（V/V）甲醇水溶液30-70μl，0.5-2mol/L的盐酸溶液10-30μl，涡旋均匀，加入0.5-2ml乙酸乙酯，涡旋振荡20-40s，离心，取上清乙酸乙酯层500-1200μl，用氮气流吹干，用100-150μl40-60%（V/V）甲醇水溶液复溶，离心，得血浆样品上清液。
4）含量测定
采用LC-MS/MS色谱法，将上述各自的对照品储备液II和血浆样品上清液注入色谱仪，得到色谱图，根据色谱图中色谱峰的面积计算丹参素、间位甲基丹参素、原儿茶醛和原儿茶酸在血浆中的浓度。
最优选的，所述方法，包括以下步骤：
1）对照品储备液的制备
分别精密称取丹参素对照品、间位甲基丹参素、原儿茶醛和原儿茶酸对照品各10.0mg分别置50ml容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得丹参素、间位甲基丹参素、原儿茶醛和原儿茶酸浓度均为200μg/ml的对照品储备液I。
精密量取200μl各自对照品储备液I，分别用50%甲醇水溶液定容至10ml，即得丹参素、间位甲基丹参素、原儿茶醛和原儿茶酸浓度均为4μg/ml的各自的对照品储备液II。
2）内标溶液的制备
精密量取内标物香草酸10.0mg置50ml容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得200μg/ml的内标储备液，精密量取此内标储备液125μl置于5ml容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，即得5μg/ml的内标溶液。
3）血浆样品处理方法
取血浆样品200μl，依次加入内标溶液50μl，50%甲醇水溶液50μl，1mol/L的盐酸溶液20μl，涡旋均匀，加入1ml乙酸乙酯，涡旋振荡30s，15000rpm离心1min，取上清乙酸乙酯层900μl，40℃下氮气流吹干，用120μl50%甲醇水溶液复溶，15000rpm离心3min，得血浆样品上清液。
4）含量测定
采用LC-MS/MS色谱法，将上述对照品储备液II和血浆样品上清液注入色谱仪，得到色谱图，根据色谱图中色谱峰的面积计算丹参素、间位甲基丹参素、原儿茶醛和原儿茶酸在血浆中的浓度。
其中所述LC-MS/MS色谱法，色谱条件如下：
色谱柱：C18柱（优选：DikmaDiamonsil C18柱，50×2.1mm,5μm)；预柱：菲罗门公司预柱(型号：KJO-4282)；流动相：A相为0.1%的甲酸水溶液和B相为含0.1%甲酸的甲醇，进行梯度洗脱：0-0.5min1%～4%(优选2%)(B)，0.5-4.5min1%～4%至75%～95%（优选2%至85%）(B)，4.51-5min75%～95%至95%（优选85%至95%）(B)，5.01-6.5min75%～95%至1%～4%（优选95%～2%）(B)；流速：0.2～0.5ml/min（优选：0.35ml/min）；柱温：15～35℃（优选：25℃）；进样器温度：2～10℃（优选：4℃）。
质谱条件：采用ESI离子源，负离子模式。选择多反应监测模式(MRM)进行二级质谱分析。相关质谱参数如下：Collision Gas：Medium；IonSpray Voltage：–3000～–5500V（优选：–4200V）；Temperature：400～700℃（优选600℃）；Curtain Gas：10.0～40.0（优选20.0；Ion Source Gas1：40.0～80.0（优选：60.0）；Ion SourcGas2：35.0～75.0（优选：55.0）。
在上述色谱条件下，丹参素、间位甲基丹参素、原儿茶醛和原儿茶酸分别在3.15min、3.92min、3.63min和3.25min左右出峰，内标(香草酸)在4.13min左右出峰，峰形良好，说明人血浆中无杂质峰干扰上述化合物的测定，表明该方法具有较强的专属性。色谱图详见图1。
本发明研究了液相色谱质谱法（LC-MS/MS法）同时测定人血浆中丹参素，间位甲基丹参素，原儿茶醛及原儿茶酸的方法。在实验确定的样品处理及一定色谱条件下,丹参素（DSS）在1.38-1000ng/ml范围内的r为0.9978，间位甲基丹参素（m-DSS）在0.46-1000ng/ml范围内的r为0.9977，原儿茶醛(PCA)在0.46-1000ng/ml范围内r为0.9975，原儿茶酸(PAA)在1.38-1000ng/ml范围内r为0.9948，4个化合物在各自浓度范围内具有良好的线性关系(r>0.994)；测定丹参素、间位甲基丹参素、原儿茶醛及原儿茶酸分别在低浓度4.13ng/ml、中浓度37ng/ml和高浓度333.3ng/ml时的提取回收率、日内和日间精密度和准确度，表明本法采用血浆样品处理方法对不同浓度的血浆样品具有较为稳定的提取效果，日内、日间精密度结果表明方法的重现性很好(RSD均小于13.54%，指导原则规定RSD值应小于15%)，此外，实侧浓度与理论浓度的相对误差也小于15%，表明方法的准确度很好；对于丹参素、间位甲基丹参素、原儿茶醛及原儿茶酸的三个冻融周期稳定性，对照品储备液II的稳定性以及拟进样样品的稳定性进行了实验，结果表明丹参素、间位甲基丹参素、原儿茶醛和原儿茶酸在上述存放或操作条件下具有良好的稳定性(相对误差均小于15%)，从而保证了实验数据的可靠。本实验所建立的同时测定人血浆中丹参素，间位甲基丹参素原儿茶醛和原儿茶酸的LC-MS/MS分析方法具有专属性强、灵敏度高、准确性和重现性好等优点，满足人体药代动力学要求，可应用于临床药代动力学研究。
相关术语的解释：
丹参素：化学名为[D(+)-B-(3,4二羟基苯基)乳酸]，具有抵抗血小板粘附聚集，清除氧自由基等作用，是中药丹参(Salvia miltiorrhiza Bunge)的有效成分之一。
原儿茶醛：化学名为Benzaldehyde,3,4-dihydroxy-,3,4-二羟基苯甲醛，存在于丹参的根部，具有扩张冠状动脉，增加冠脉血流量作用，扩张心脑血管，抑制血小板聚集等作用。
原儿茶酸：别名为3,4-二羟基苯甲酸，存在于鳞始蕨科植物乌蕨[Stenolomachusanum(L.)Ching]的叶，冬青科植物冬青(Ilex chi-nensis Sims)的叶等植物中。具有抗菌作用，体外试验时对绿脓杆菌、大肠杆菌、伤寒杆菌、痢疾杆菌、产碱杆菌及枯草杆菌和金黄色葡萄球菌均有不同程度的抑菌作用。亦有祛痰、平喘作用。临床用于治疗慢性气管炎。
液相色谱-质谱联用仪：是液相色谱与质谱联用的仪器。它结合了液相色谱仪有效分离热不稳性及高沸点化合物的分离能力与质谱仪很强的组分鉴定能力，是一种分离分析复杂有机混合物的有效手段。液相色谱（LC）能够有效的将有机物待测样品中的有机物成分分离开，而质谱（MS）能够对分开的有机物逐个的分析，得到有机物分子量，结构（在某些情况下）和浓度（定量分析）的信息。
本发明的方法是经过筛选获得的，以下数据用于说明本发明的有益效果：
1.仪器
LC-MS/MS联用仪，包括美国应用生物系统公司液质联用系统API4000QTRAP，岛津LC-20AD泵，SIL-20AC恒温自动进样器，CTO-20A柱温箱，CBM-20A控制器，ESI离子源，Analyst Software1.5.2色谱工作站。
2.LC-MS/MS分析方法建立
2.1色谱条件
色谱柱：C18柱（优选：DikmaDiamonsil C18柱，50×2.1mm,5μm)；预柱：菲罗门公司预柱(型号：KJO-4282)；流动相：A相为0.1%的甲酸水溶液和B相为含0.1%甲酸的甲醇，进行梯度洗脱：0-0.5min1%～4%(优选2%)(B)，0.5-4.5min1%～4%至75%～95%（优选2%至85%）(B)，4.51-5min75%～95%至95%（优选85%至95%）(B)，5.01-6.5min75%～95%至1%～4%（优选95%～2%）(B)；流速：0.2～0.5ml/min（优选：0.35ml/min）；柱温：15～35℃（优选：25℃）；进样器温度：2～10℃（优选：4℃）。
2.2质谱条件
采用ESI离子源，负离子模式。选择多反应监测模式(MRM)进行二级质谱分析。相关质谱参数如下：Collision Gas：Medium；IonSpray Voltage：–3000～–5500V（优选：–4200V）；Temperature：400～700℃（优选600℃）；Curtain Gas：10.0～40.0（优选20.0；IonSource Gas1：40.0～80.0（优选：60.0）；Ion Source Gas2：35.0～75.0（优选：55.0）。其它主要参数见表1。
表1丹参素、间位甲基丹参素、原儿茶醛、原儿茶酸和内标的主要质谱参数
2.3溶液的配制
2.3.1对照品储备液的制备
分别精密称取丹参素对照品、间位甲基丹参素、原儿茶醛和原儿茶酸对照品各10.0mg置50ml容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得丹参素、间位甲基丹参素、原儿茶醛和原儿茶酸浓度均为200μg/ml的对照品储备液I。精密量取200μl对照品储备液I，用50%甲醇水溶液定容至10ml，即得丹参素、间位甲基丹参素、原儿茶醛和原儿茶酸浓度均为4μg/ml的对照品储备液II。
2.3.2内标溶液的制备
精密量取香草酸(内标)10.0mg置50ml容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得200μg/ml的内标储备液，精密量取此内标储备液125μl置于5ml容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，即得5μg/ml的内标溶液。
2.4血浆样品处理方法
取血浆样品200μl，依次加入内标溶液50μl，50%甲醇水溶液50μl，1mol/L的盐酸或三氯乙酸或高氯酸（优选盐酸）溶液20μl，涡旋均匀，加入1ml乙酸乙酯，涡旋振荡30s，15000rpm离心1min，取上清乙酸乙酯层900μl，40℃下氮气流吹干，用120μl50%甲醇水溶液复溶，15000rpm离心3min，取上清液10μl进样分析。
在上述色谱条件下，丹参素、间位甲基丹参素、原儿茶醛和原儿茶酸分别在3.15min、3.92min、3.63min和3.25min左右出峰，内标(香草酸)在4.13min左右出峰，峰形良好，说明人血浆中无杂质峰干扰上述化合物的测定，表明该方法具有较强的专属性。色谱图详见图1。
2.5方法确证
2.5.1标准曲线和线性范围
用50%甲醇水溶液将4μg/ml的对照品储备液II分别稀释成浓度为4000，1333.3，444.4，148.1，49.4，16.5，5.5和1.83ng/ml的标准品溶液，各取50μl，分别加入空白人血浆200μl，即制得浓度分别为1000，333.3，111.1，37，12.4，4.13，1.38和0.46ng/ml的标准血浆样品，按“2.4血浆样品处理方法”项下所述操作，进样10μl分析。每个标准品浓度点各做5份，记录待测物峰面积(A1)和内标峰面积(A2)，以A1/A2对血药浓度做回归统计(权重：1/X2)，结果见表2，标准曲线见图2。
上述结果表明，4个化合物在各自浓度范围内具有良好的线性关系(r>0.994)，同时，丹参素和原儿茶酸的最低定量限仅为1.38ng/mL，间位甲基丹参素和原儿茶醛的最低定量限仅为0.46ng/mL，与文献报道方法比，本方法具有更好的灵敏度。
表2丹参素、间位甲基丹参素、原儿茶醛和原儿茶酸在人血浆中浓度测定的标准曲线
2.5.2精密度和准确度试验
分别取1333.3ng/ml、148.1ng/ml和16.5ng/ml的标准品溶液50μl，分别加入空白血浆200μl，即制得浓度分别为4.13ng/ml，37ng/ml和333.3ng/ml的低、中、高三种浓度的标准血浆样品，按“2.4血浆样品处理方法”项下所述操作，进样10μl分析。每个浓度点在日内和日间(5天)各做5份，计算方法的日内和日间精密度和准确度，结果见表3。日内、日间精密度结果表明方法的重现性很好(RSD均小于13.54%，指导原则规定RSD值应小于15%)，此外，实侧浓度与理论浓度的相对误差也小于15%，表明方法的准确度很好。
表3丹参素、间位甲基丹参素、原儿茶醛和原儿茶酸的日内及日间精密度和准确度(n=5)
2.5.3提取回收率
以对照品加入空白血浆中，按“血浆样品处理方法”处理后进样分析所得峰面积与空白血浆按“2.4血浆样品处理方法”处理后加入对照品进样分析所得峰面积的比例来表示提取回收率。对待测物丹参素、间位甲基丹参素、原儿茶醛和原儿茶酸低(4.13ng/ml)、中(37ng/ml)、高(333.3ng/ml)三个浓度，以及内标香草酸的提取回收率分别进行了考察，测定结果见表4。由表4结果看，本法采用血浆样品处理方法对不同浓度的血浆样品具有较为稳定的提取效果。
表4丹参素、间位甲基丹参素、原儿茶醛和原儿茶酸的提取回收率(n=5)
2.5.4稳定性试验
(A)三个冻融周期稳定性(Freeze and Thaw Stability)
丹参素、间位甲基丹参素、原儿茶醛和原儿茶酸在低浓度(4.13ng/ml)的三个冻融周期稳定性数据和RSD分别为89.2%，11.8%；105.2%，7.4%；86.2%，13.6%；108.7%，8.7%。
丹参素、间位甲基丹参素、原儿茶醛和原儿茶酸在高浓度(333.3ng/ml)的三个冻融周期稳定性数据和RSD分别为98.6%，7.2%；101.4%，4.2%；103.2%，8.7%；89.7%，4.6%。
(B)储备液稳定性(Stock Solution Stability)
丹参素、间位甲基丹参素、原儿茶醛和原儿茶酸的对照品储备液II在避光条件下，4℃储存24h稳定。丹参素、间位甲基丹参素、原儿茶醛和原儿茶酸在0h和24h的峰面积比值分别为98.2%，101.3%，99.2%和103.2%。
内标储备液在避光条件下，4℃储存24h稳定。内标香草酸在0h和24h的峰面积比值分别为98.6%。
(C)拟进样样品稳定性(Post-Preparative Stability)
拟进样样品即已完成前处理，拟进样分析的样品，丹参素、间位甲基丹参素、原儿茶醛和原儿茶酸在4℃自动进样器中保持24h稳定。其在0h和24h的测定浓度比值分别为94.2%，104.3%，89.2%和107.2%。
(D)血浆样品室温放置稳定性
对血浆样品中丹参素、间位甲基丹参素、原儿茶醛和原儿茶酸在低浓度(4.13ng/ml)和高浓度(333.3ng/ml)的室温放置稳定性进行了考察，血浆样品室温放置0h，0.5h，1h，2h后，分别进样，以N小时(N=0，0.5，1，2)的峰面积除以0h的峰面积所得百分比作为血浆样品室温放置N小时后的稳定性衡量标准，可知丹参素、间位甲基丹参素、原儿茶醛和原儿茶酸在低浓度(4.13ng/ml)、和高浓度(333.3ng/ml)的室温放置0.5h均稳定，0.5h后丹参素、间位甲基丹参素、原儿茶醛和原儿茶酸均有不同程度的降解，故血浆样品解冻后，室温放置不应超过0.5h。稳定性数据见表5。
表5丹参素、间位甲基丹参素、原儿茶醛和原儿茶酸的室温放置稳定性数据(n=3)
上述稳定性结果表明：丹参素、间位甲基丹参素、原儿茶醛和原儿茶酸在上述存放或操作条件下具有良好的稳定性(相对误差均小于15%)，从而保证了实验数据的可靠。
附图说明：
图1血浆样品测定色谱图：(A)空白人血浆色谱图；(B)空白人血浆加入丹参素、间位甲基丹参素、原儿茶醛、原儿茶酸和内标(香草酸)的色谱图；(C)人口服复方丹参滴丸后1.5h的血浆样品色谱图
图2丹参素(左上)、间位甲基丹参素(右上)、原儿茶醛(左下)和原儿茶酸(右下)在人血浆中的标准曲线图
具体实施方式：
以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为本发明的限制。
实施例1
1、内标溶液的制备
精密量取香草酸(内标)10.0mg置50mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得200μg/mL的内标储备液，精密量取此内标储备液125μL置于5mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，即得5μg/mL的内标溶液。
2、血浆样品处理方法
取血浆样品200μL，依次加入内标溶液50μL，50%甲醇水溶液50μL，1mol/L的盐酸溶液20μL，涡旋均匀，加入1mL乙酸乙酯，涡旋振荡30s，15000rpm离心1min，取上清乙酸乙酯层900μL，40℃下氮气流吹干，用120μL50%甲醇水溶液复溶，15000rpm离心3min，取上清液10μL进样分析。
3、测定条件
色谱条件：色谱柱：DikmaDiamonsil C18柱(50×2.1mm,5μm)；预柱：菲罗门公司预柱(型号：KJO-4282)；流动相：A相为0.1%的甲酸水溶液和B相为含0.1%甲酸的甲醇，梯度洗脱：0-0.5min2%(B)，0.5-4.5min2%-85%(B)，4.51-5min95%(B)，5.01-6.5min2%(B)；流速：0.35mL/min;柱温：25℃；进样器温度：4℃。
质谱条件：采用ESI离子源，负离子模式。选择多反应监测模式(MRM)进行二级质谱分析，Collision Gas：Medium，IonSpray Voltage：–4200V，Temperature：600℃，CurtainGas：20.0，Ion Source Gas1：60.0，Ion Source Gas2：55.0。
在上述色谱条件下，进样分析后，丹参素、间位甲基丹参素、原儿茶醛和原儿茶酸分别在3.15min、3.92min、3.63min和3.25min左右出峰，内标(香草酸)在4.13min左右出峰。
实施例2
1、内标溶液的制备
精密量取香草酸(内标)10.0mg置50mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得200μg/mL的内标储备液，精密量取此内标储备液125μL置于5mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，即得5μg/mL的内标溶液。
2、血浆样品处理方法
取血浆样品200μL，依次加入内标溶液50μL，50%甲醇水溶液50μL，1mol/L的盐酸溶液20μL，涡旋均匀，加入1mL乙酸乙酯，涡旋振荡30s，15000rpm离心1min，取上清乙酸乙酯层900μL，40℃下氮气流吹干，用120μL50%甲醇水溶液复溶，15000rpm离心3min，取上清液10μL进样分析。
3、测定条件
色谱条件：色谱柱：DikmaDiamonsil C18柱(50×2.1mm,5μm)；预柱：菲罗门公司预柱(型号：KJO-4282)；流动相：A相为0.1%的甲酸水溶液和B相为含0.1%甲酸的甲醇，梯度洗脱：0-0.5min1%(B)，0.5-4.5min1%-75%(B)，4.51-5min85%(B)，5.01-6.5min1%(B)；流速：0.35mL/min;柱温：15℃；进样器温度：2℃。
质谱条件：采用ESI离子源，负离子模式。选择多反应监测模式(MRM)进行二级质谱分析，Collision Gas：Medium，IonSpray Voltage：–3000V，Temperature：600℃，CurtainGas：10.0，Ion Source Gas1：40.0，Ion Source Gas2：35.0。
在上述色谱条件下，进样分析后，丹参素、间位甲基丹参素、原儿茶醛和原儿茶酸分别在4.22min、4.86min、4.58min和4.39min左右出峰，内标(香草酸)在5.62min左右出峰。实施例3
1、内标溶液的制备
精密量取香草酸(内标)10.0mg置50mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得200μg/mL的内标储备液，精密量取此内标储备液125μL置于5mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，即得5μg/mL的内标溶液。
2、血浆样品处理方法
取血浆样品200μL，依次加入内标溶液50μL，50%甲醇水溶液50μL，1mol/L的盐酸溶液20μL，涡旋均匀，加入1mL乙酸乙酯，涡旋振荡30s，15000rpm离心1min，取上清乙酸乙酯层900μL，40℃下氮气流吹干，用120μL50%甲醇水溶液复溶，15000rpm离心3min，取上清液10μL进样分析。
3、测定条件
色谱条件：色谱柱：DikmaDiamonsil C18柱(50×2.1mm,5μm)；预柱：菲罗门公司预柱(型号：KJO-4282)；流动相：A相为0.1%的甲酸水溶液和B相为含0.1%甲酸的甲醇，梯度洗脱：0-0.5min4%(B)，0.5-4.5min4%-95%(B)，4.51-5min95%(B)，5.01-6.5min4%(B)；流速：0.35mL/min;柱温：35℃；进样器温度：10℃。
质谱条件：采用ESI离子源，负离子模式。选择多反应监测模式(MRM)进行二级质谱分析，Collision Gas：Medium，IonSpray Voltage：–5500V，Temperature：600℃，CurtainGas：40.0，Ion Source Gas1：80.0，Ion Source Gas2：75.0。
在上述色谱条件下，进样分析后，丹参素、间位甲基丹参素、原儿茶醛和原儿茶酸分别在1.96min、2.98min、2.43min和2.15min左右出峰，内标(香草酸)在3.27min左右出峰。
Claims (3)
1.一种测定人血浆中丹参素，间位甲基丹参素，原儿茶醛及原儿茶酸的方法，其特征在于，所述方法，包括以下步骤：
1)对照品储备液的制备
称取丹参素、间位甲基丹参素、原儿茶醛和原儿茶酸对照品，用甲醇溶解，即得丹参素、间位甲基丹参素、原儿茶醛和原儿茶酸对照品储备液；
2)内标溶液的制备
取内标物香草酸用甲醇溶解即得内标溶液；
3)血浆样品处理方法
取血浆样品，加入内标溶液，甲醇，盐酸或三氯乙酸或高氯酸，乙酸乙酯，混合均匀后，离心取上清乙酸乙酯层，干燥，用甲醇复溶，离心，得血浆样品上清液；
4)含量测定
采用LC-MS/MS色谱法，将上述对照品储备液和血浆样品上清液注入色谱仪，得到色谱图，根据色谱图中色谱峰的面积计算丹参素、间位甲基丹参素、原儿茶醛和原儿茶酸在血浆中的浓度，
其中所述LC-MS/MS色谱法，色谱条件如下：
色谱柱：C18柱；预柱；菲罗门公司预柱，流动相：A相为0.1-0.5％的甲酸水溶液和B相为含0.1-0.5％甲酸的甲醇，进行梯度洗脱：
B相0-0.5min 1％～4％内平衡，
B相0.5-4.5min从1％～4％变成75％～95％，
B相4.51-5min从75％～95％变成95％，
B相5.01-6.5min从7 5％～95％变成1％～4％；
流速：0.2～0.5ml/min；
柱温：15～35℃；
进样器温度：2～10℃；
质谱条件：采用ESI离子源，负离子模式，
选择多反应监测模式MRM进行二级质谱分析，
相关质谱参数如下：Collision Gas：Medium；IonSpray Voltage：–3000～–5500V；
Temperature：400～700℃；
Curtain Gas：10.0～40.0；
Ion Source Gas1：40.0～80.0；
Ion Source Gas2：35.0～75.0。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)对照品储备液的制备
分别称取丹参素、间位甲基丹参素、原儿茶醛和原儿茶酸对照品，分别用甲醇配成浓度为150-250μg/ml的对照品储备液I，
分别取4种对照品储备液I，分别用40-60％(V/V)甲醇水溶液配制浓度均为2-6μg/ml的各自的对照品储备液II，
2)内标溶液的制备
称取内标物香草酸用甲醇配制成150-250μg/ml的内标储备液，进一步用甲醇配制成3-7μg/ml的香草酸内标溶液，
3)血浆样品处理方法
取血浆样品150-250μl，依次加入内标溶液30-70μl，40-60％(V/V)甲醇水溶液30-70μl，0.5-2mol/L的盐酸溶液10-30μl，涡旋均匀，加入0.5-2ml乙酸乙酯，涡旋振荡20-40s，离心，取上清乙酸乙酯层500-1200μl，用氮气流吹干，用100-150μl40-60％(V/V)甲醇水溶液复溶，离心，得血浆样品上清液，
4)含量测定
采用LC-MS/MS色谱法，将上述各自的对照品储备液II和血浆样品上清液注入色谱仪，得到色谱图，根据色谱图中色谱峰的面积计算丹参素、间位甲基丹参素、原儿茶醛和原儿茶酸在血浆中的浓度，
其中所述LC-MS/MS色谱法，色谱条件如下：
色谱柱：C18柱；预柱；菲罗门公司预柱，流动相：A相为0.1％的甲酸水溶液和B相为含0.1％甲酸的甲醇，进行梯度洗脱：
B相0-0.5min 1％～4％平衡，
B相0.5-4.5min从1％～4％变成75％～95％，
B相4.51-5min从75％～95％变成95％，
B相5.01-6.5min从75％～95％变成1％～4％；
流速：0.2～0.5ml/min；
柱温：15～35℃；
进样器温度：2～10℃；
质谱条件：采用ESI离子源，负离子模式，
选择多反应监测模式MRM进行二级质谱分析，
相关质谱参数如下：
Collision Gas：Medium；IonSpray Voltage：–3000～–5500V；
Temperature：400～700℃；
Curtain Gas：10.0～40.0；
Ion Source Gas1：40.0～80.0；
Ion Source Gas2：35.0～75.0。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)对照品储备液的制备
分别精密称取丹参素对照品、间位甲基丹参素、原儿茶醛和原儿茶酸对照品各10.0mg分别置50ml容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得丹参素、间位甲基丹参素、原儿茶醛和原儿茶酸浓度均为200μg/ml的对照品储备液I，
精密量取200μl各自对照品储备液I，分别用50％甲醇水溶液定容至10ml，即得丹参素、间位甲基丹参素、原儿茶醛和原儿茶酸浓度均为4μg/ml的各自的对照品储备液II，
2)内标溶液的制备
精密量取内标物香草酸10.0mg置50ml容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得200μg/ml的内标储备液，精密量取此内标储备液125μl置于5ml容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，即得5μg/ml的内标溶液，
3)血浆样品处理方法
取血浆样品200μl，依次加入内标溶液50μl，50％甲醇水溶液50μl，1mol/L的盐酸溶液20μl，涡旋均匀，加入1ml乙酸乙酯，涡旋振荡30s，15000rpm离心1min，取上清乙酸乙酯层900μl，40℃下氮气流吹干，用120μl 50％甲醇水溶液复溶，15000rpm离心3min，得血浆样品上清液，
4)含量测定
采用LC-MS/MS色谱法，将上述对照品储备液II和血浆样品上清液注入色谱仪，得到色谱图，根据色谱图中色谱峰的面积计算丹参素、间位甲基丹参素、原儿茶醛和原儿茶酸在血浆中的浓度，
其中所述LC-MS/MS色谱法，色谱条件如下：
色谱柱：C18柱，50×2.1mm,5μm；
预柱：菲罗门公司预柱；
流动相：A相为0.1％的甲酸水溶液和B相为含0.1％甲酸的甲醇，进行梯度洗脱：
B相0-0.5min 2％，
B相0.5-4.5min 2％变成85％，
B相4.51-5min 85％变成95％，
B相5.01-6.5min95％变成2％；
流速：0.35ml/min；
柱温：25℃；
进样器温度：4℃，
质谱条件：采用ESI离子源，负离子模式，选择多反应监测模式MRM进行二级质谱分析，相关质谱参数如下：
Collision Gas：Medium；IonSpray Voltage：–4200V；
Temperature：600℃；
Curtain Gas：20.0；
Ion Source Gas1：60.0；
Ion Source Gas2：55.0。
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