CN113899829B - 一种草果的hplc指纹图谱检测方法及其酚类物质含量测定方法 - Google Patents

一种草果的hplc指纹图谱检测方法及其酚类物质含量测定方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种草果的HPLC指纹图谱检测方法，它包括如下步骤：1)对照品溶液制备；2)供试品溶液制备；3)分别吸取对照品溶液和供试品溶液注入高效液相色谱仪，记录色谱图。本发明的检测方法，可以定量检测草果中的酚酸类物质原儿茶酸、对羟基苯甲酸、龙胆酸、香草酸、对羟基苯丙酸，以及酚醛类物质原儿茶醛、并通过对指纹图谱中21个共有特征峰的标定，用更全面的化学成分实现了对草果的质量质量控制，保障了草果的临床疗效，具备实际推广应用价值。

Description

一种草果的HPLC指纹图谱检测方法及其酚类物质含量测定 方法
技术领域
本发明涉及一种草果的质量分析评价方法，具体涉及采用中药指纹图谱分析方法对草果样品进行成分分析。
背景技术
草果为姜科豆蔻属植物多年生草本植物草果Amomum tsaoko Crevost etLemaire的干燥成熟果实，主要分布于贵州、广西、云南等地。现代研究表明主要含有挥发油、黄酮类、酚酸类、甾体类以及二苯庚烷类等化学成分，具有燥湿温中、截疟除痰之功效。中药质量控制研究一直是中药研究与发展的关键，草果的质量评价目前主要侧重于外观品质以及挥发油含量指标等项目，但这不足以说明草果的内在品质，更不能对草果质量从整体上进行分析和评价。
指纹图谱作为整体、稳定的化学鉴别手段，是当今国际公认的控制中药质量的质控模式。随着现代分析技术的发展以及中药质量控制要求的提高，多指标成分含量测定已成为中药质量控制的关键。专利CN104297373公开了一种草果的指纹图谱检测方法，但该方法也仅限于对挥发油成分的分析，目前还没有基于HPLC对草果中不能气化的成分如酚类物质的分析方法的研究。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种草果的HPLC指纹图谱检测方法，它包括如下步骤：
1)对照品溶液制备：取原儿茶酸、原儿茶醛、对羟基苯甲酸、龙胆酸、香草酸和/或对羟基苯丙酸对照品，加甲醇溶解，即得对照品溶液；
2)供试品溶液制备：取待检样品，加乙醇溶液提取，即得供试品溶液；
3)分别吸取对照品溶液和供试品溶液注入高效液相色谱仪，记录色谱图；色谱条件如下：
色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；检测波长：270nm；流动相：以0.2％磷酸溶液为流动相A，以甲醇为流动相B；梯度洗脱程序0～5min，10％～15％B；5～10min，15％～20％B；10～30min，20％～40％B；30～40min，40％～60％B；40～50min，60％～70％B；50～60min，70％～80％B。
进一步地，步骤1)所述对照品溶液每1ml含原儿茶酸2～5μg、原儿茶醛1～3μg、对羟基苯甲酸1～3μg、龙胆酸80～120μg、香草酸3～8μg和/或对羟基苯丙酸30～80μg。
进一步地，步骤2)所述待检样品与乙醇溶液的质量体积比为1g：5～250ml。
更进一步地，所述乙醇溶液的浓度为50-95％(v/v)，优选70％。
进一步地，步骤2)所述提取为超声提取，时间30min。
进一步地，步骤3)所述色谱条件中色谱柱：Eclipse Plus C18，4.6×150mm，3.5μm，柱温25～35℃，进样量5～15μL，流速为0.8～1.2mL·min-1。
更进一步地，步骤3)所述色谱条件中柱温30℃，进样量10μL，流速为1mL·min-1。
更进一步地，所述指纹图谱中应有21个共有特征峰，与原儿茶酸相应的色谱峰为峰3，与原儿茶醛相应的色谱峰为峰4，与对羟基苯甲酸相应的色谱峰为峰5，与龙胆酸相应的色谱峰为峰6，与香草酸相应的色谱峰为峰8，与对羟基苯丙酸相应的色谱峰为峰10，以峰10为参照峰，规定值1.000，计算其余各特征峰与参照峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±5％范围之内；规定值为：峰1：0.102，峰2：0.127，峰7：0.794，峰9：0.891，峰11：1.039，峰12：1.203，峰13：1.353，峰14：1.880，峰15：2.049，峰16：2.072，峰17：2.225，峰18：2.393，峰19：2.465，峰20：2.513，峰21：2.623。
本发明还提供了一种草果中6种酚类物质的含量测定方法，它包括如下步骤：
a、取待检草果；
b、按前述方法检测；
c、按外标法计算酚类物质的含量。
进一步地，所述酚类物质为原儿茶酸、原儿茶醛、对羟基苯甲酸、龙胆酸、香草酸和/或对羟基苯丙酸。
本发明的检测方法，可以定量检测草果中的酚酸类物质原儿茶酸、对羟基苯甲酸、龙胆酸、香草酸、对羟基苯丙酸，以及酚醛类物质原儿茶醛、并通过对指纹图谱中21个共有特征峰的标定，用更全面的化学成分实现了对草果的质量质量控制，保障了草果的临床疗效，具备实际推广应用价值。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1 15批草果样品的指纹图谱
图2 15批草果药材样品的聚类分析图
图3 15批草果药材正交偏最小二乘判别分析得分图
图4 15批次草果21个共有峰VIP值
图5专属性试验的HPLC色谱图(A混合对照品溶液、B供试品溶液及C阴性对照，3-原儿茶酸；4-原儿茶醛；5-对羟基苯甲酸；6-龙胆酸；8-香草酸；10-对羟基苯丙酸)
图6 HPLC指纹图谱各指标成分含量测定箱线图
具体实施方式
本发明具体实施方式中使用的试剂、试药、设备均为已知产品，通过购买市售产品获得。
实施例1本发明草果的指纹图谱检测
1)对照品溶液的制备
分别精密称定原儿茶酸、原儿茶醛、对羟基苯甲酸、龙胆酸、香草酸、对羟基苯丙酸对照品适量，加入甲醇溶解并定容，制成质量浓度分别为3.45、1.46、4.72、107.83、5.61、54.36μg/mL的混合对照品储备液，备用。
2)供试品溶液的制备
取草果粉末(过二号筛)约5.0g，精密称定。置具塞三角瓶中，精密加入70％乙醇50mL，称定质量，超声处理30min，放至室温，用70％乙醇补足减失的质量、摇匀，0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。
3)分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。色谱条件如下：
色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，规格4.6×150mm，3.5μm；检测波长：270nm；柱温30℃，进样量10μL，流速为1mL·min-1；流动相：以0.2％磷酸溶液为流动相A，以甲醇为流动相B；梯度洗脱程序0～5min，10％～15％B；5～10min，15％～20％B；10～30min，20％～40％B；30～40min，40％～60％B；40～50min，60％～70％B；50～60min，70％～80％B。
4)分析色谱图
草果指纹图谱中有21个共有特征峰，与原儿茶酸相应的色谱峰为峰3，与原儿茶醛相应的色谱峰为峰4，与对羟基苯甲酸相应的色谱峰为峰5，与龙胆酸相应的色谱峰为峰6，与香草酸相应的色谱峰为峰8，与对羟基苯丙酸相应的色谱峰为峰10，以峰10为参照峰，即峰S，规定值1.000，计算其余各特征峰与参照峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±5％范围之内；规定值为：峰1：0.102，峰2：0.127，峰7：0.794，峰9：0.891，峰11：1.039，峰12：1.203，峰13：1.353，峰14：1.880，峰15：2.049，峰16：2.072，峰17：2.225，峰18：2.393，峰19：2.465，峰20：2.513，峰21：2.623。
实施例2本发明草果中酚类物质含量测定
1)对照品溶液的制备
分别精密称定原儿茶酸、原儿茶醛、对羟基苯甲酸、龙胆酸、香草酸、对羟基苯丙酸对照品适量，加入甲醇溶解并定容，制成质量浓度分别为3.45、1.46、4.72、107.83、5.61、54.36μg/mL的混合对照品储备液，备用。
2)供试品溶液的制备
取草果粉末(过二号筛)约5.0g，精密称定。置具塞三角瓶中，精密加入70％乙醇50mL，称定质量，超声处理30min，放至室温，用70％乙醇补足减失的质量、摇匀，0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。
3)分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。色谱条件如下：
色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，规格4.6×150mm，3.5μm；检测波长：270nm；柱温30℃，进样量10μL，流速为1mL·min-1；流动相：以0.2％磷酸溶液为流动相A，以甲醇为流动相B；梯度洗脱程序0～5min，10％～15％B；5～10min，15％～20％B；10～30min，20％～40％B；30～40min，40％～60％B；40～50min，60％～70％B；50～60min，70％～80％B。
4)按外标法计算原儿茶酸、原儿茶醛、对羟基苯甲酸、龙胆酸、香草酸、对羟基苯丙酸的含量。
以下通过实验例来说明本发明的有益效果：
实验例1
1仪器和材料
1.1仪器
Agilent 1260Infinity II高效液相色谱仪(G7114A 1260VWD Detector，LC-12602.4.0.628色谱工作站，美国Agilent公司)；ME204型万分之一分析天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司)；SB25-12D超声波清洗仪(宁波新艺超声设备有限公司)；MiLi-Q纯水仪(美国milipore公司)。
1.2材料
原儿茶醛(批号：PS020016)、对羟基苯甲酸(批号：PS010279)对照品均购自成都普思生物科技有限公司，质量分数≥98％。原儿茶酸(批号：MUST-20110310)、龙胆酸(批号：MUST-20082605)、香草酸(批号：MUST-20072701)、对羟基苯丙酸(批号：MUST-20091902)对照品均购自成都曼思特生物科技有限公司，质量分数≥98％；甲醇(色谱级，Sigma公司)；其余试剂均为分析纯。
1.3药材
共收集草果药材15批，分别来自主产区贵州(5批)、广西(5批)和云南(5批)等地。所有药材经成都医学院药学院李羿教授鉴定为姜科豆蔻属多年生草本植物草果A.tsaokoCrevost et Lemaire的干燥成熟果实。具体信息详见表1。
表1草果药材来源信息
Figure BDA0003290468700000051
2方法与结果
2.1色谱条件
色谱柱：Eclipse Plus C18(4.6×150mm，3.5μm)；流动相为0.2mol/L磷酸(A)-甲醇(B)；梯度洗脱：0～5min，10％～15％B；5～10min，15％～20％B；10～30min，20％～40％B；30～40min，40％～60％B；40～50min，60％～70％B；50～60min，70％～80％B。流速1mL/min，检测波长270nm，柱温30℃，进样量10μL。
2.2溶液的制备
2.2.1供试品溶液
取草果粉末(过二号筛)约5.0g，精密称定。置具塞三角瓶中，精密加入70％乙醇50mL，称定质量，超声处理30min，放至室温，用70％乙醇补足减失的质量、摇匀，0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。
2.2.2混合对照品溶液
分别精密称定原儿茶酸、原儿茶醛、对羟基苯甲酸、龙胆酸、香草酸、对羟基苯丙酸对照品适量，加入甲醇溶解并定容，制成质量浓度分别为3.45、1.46、4.72、107.83、5.61、54.36μg/mL的混合对照品储备液，备用。
2.2.3空白溶液
按“2.2.1”项下方法制备不含草果药材的阴性样品，即得阴性对照溶液。
2.3指纹图谱的建立及分析
2.3.1精密度试验
精密称取草果药材粉末(S2)约5g(过二号筛)，按“2.1.2”项下方法制备供试品，按“2.1.1项下”色谱条件测定，连续进样6次，记录色谱图，以10号峰(对羟基苯丙酸)为参照峰(S，该峰分离良好，保留时间合适)，计算得到各共有峰的相对保留时间的RSD均小于0.39％(n＝6)，相对峰面积RSD均小于1.18％(n＝6)，表明仪器精密度良好。
2.3.2重复性实验
精密称取同一草果药材粉末(S2)约5g(过二号筛)，按“2.1.2”项下方法平行制备6份供试品溶液，按“2.1.1项下”色谱条件测定，以10号峰对羟基苯丙酸为参照峰(S)，计算得到各共有峰的相对保留时间的RSD均小于0.67％(n＝6)，相对峰面积RSD均小于1.84％(n＝6)，表明方法重复性好。
2.3.3稳定性实验
取同一草果供试品溶液，按“2.1.1项下”色谱条件测定，分别在0、2、4、8、12、24h进行测定，以10号峰对羟基苯丙酸为参照峰(S)，计算得到各共有峰的相对保留时间的RSD均小于0.83％(n＝6)，相对峰面积RSD均小于1.48％(n＝6)，表明供试品溶液在24h内稳定性良好。
2.4指纹图谱建立及相似度评价
精密称取15批草果粉末各5.0g，按照“2.2.1”项下方法制备供试品溶液，然后分别按照“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图。将15批草果样品的HPLC图谱导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2008A版)》中，以S11号样品的色谱图为参照图谱，时间窗宽度为0.5min中位数法生成对照图谱R，经多点校正后进行色谱峰匹配生成样品叠加指纹图谱(图1)；然后以对照指纹图谱为参照，进行各样品图谱的相似度评价。同时，通过将对照指纹图谱与对照品色谱图进行比对，进行色谱峰的指认。结果，15批草果样品中共标定了21个共有峰；通过与对照品色谱图比对，指认了其中6个成分，分别为原儿茶酸(3号峰)、原儿茶醛(4号峰)、对羟基苯甲酸(5号峰)、龙胆酸(6号峰)、香草酸(8号峰)、对羟基苯丙酸(10号峰)。以峰10为参照峰，即峰S，规定值1.000，计算其余各特征峰与参照峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±5％范围之内；规定值为：峰1：0.102，峰2：0.127，峰7：0.794，峰9：0.891，峰11：1.039，峰12：1.203，峰13：1.353，峰14：1.880，峰15：2.049，峰16：2.072，峰17：2.225，峰18：2.393，峰19：2.465，峰20：2.513，峰21：2.623。
各样品图谱与对照指纹图谱的相似度为0.737～0.991，说明15批草果样品具有很高的相似性，相似度评价结果见表2。
表2 15批草果样品HPLC指纹图谱相似度评价结果
Figure BDA0003290468700000071
Figure BDA0003290468700000081
2.5化学模式识别
2.5.1聚类分析
采用多元统计分析软件SIMCA-P 14.0对15批样品中21个共有峰的标准化峰面积聚类分析，结果见图2。样品被分为3类：第一类为S8、S13～S15；第二类为S2；第三类为S1、S3～S7、S9～S12。聚类分析结果表明不同产区草果药材的质量存在一定地域差异性，广西和贵州的大部分草果具有一定的相似性。
2.5.2主成分分析
进一步探讨3个主产区草果化学成分之间的差异，将15批样品21个共有峰的峰面积导入SPSS.26软件进行PCA分析，计算相关矩阵的特征值及其方差贡献率以特征值＞1为提取标准，得到草果药材指纹图谱共有峰特征值(表3)，4个主成分的累积方差贡献率达到85.941％，说明4个主成分在反映三个主产地草果样品共有成分关系中起到主导作用。其中第1～4个主成分贡献率分别为为45.632％、18.466％、12.320％和9.523％。由主成分矩阵(表4)可知各个共有峰对4个主成分不同的独立方差贡献率，第1主成分主要代表了峰1、2、4、5、9、10、12；第2主成分主要代表了峰3、15、20、21；第3主成分代表了峰8、11；第4主成分代表了峰17、19。
表3 15批草果样品主成分特征值及贡献率
Figure BDA0003290468700000082
表4 15批草果样品共有峰成分矩阵
Figure BDA0003290468700000083
Figure BDA0003290468700000091
2.5.3正交偏最小二乘判别分析
在PCA的基础上进一步选择有监督模式的OPLS-DA对不同产区15份草果样品进行分析，筛选出对引起组间差异贡献率较大的成分。在建立的OPLS-DA模型中，累计解释能力参数R2X和R2Y分别为0.712和0.744，预测能力参数(Q2)为0.916，提示本实验所建立OPLS-DA模型的稳定性及预测能力较好。由OPLS-DA得分图(图3)可知，不同批次样品可分为3类，贵州和广西大部分样品可以聚为一类，与HCA结果一致。贵州和广西位置毗邻，环境气候条件具有更多的相似性，均属于亚热带气候区。对3组数据的差异性进行整体分析变量重要性投影值(variable importance in projection，VIP)。VIP是筛选差异性化合物的重要指标，值越大，表明该色谱峰的贡献越大。在0.95的置信区间内，提取模型中21个变量的VIP，见图4。选取VIP＞1的14个化合物作为差异性标志物，按VIP大小排序依次为20号峰＞15号峰＞3号峰(原儿茶酸)＞4号峰(原儿茶醛)＞2号峰＞9号峰＞5号峰(对羟基苯甲酸)＞10号峰(对羟基苯丙酸)＞21号峰＞1号峰＞7号峰＞19号峰＞12号峰＞13号峰，这些成分是区分不同产地草果差异的主要标志性物质，在将来的研究中需多关注。
2.6含量测定
2.6.1专属性试验
取“2.2”项下制备供试品溶液、混合对照品溶液以及空白溶液，0.45μm滤膜滤过，分别按“2.1”项下色谱条件进样分析，记录色谱图。结果，各待测成分的色谱峰与相邻色谱峰间的分离度均大于1.5，以各成分计的理论板数均在6000以上，且空白溶液对测定无干扰，说明此方法专属性良好。专属性试验的HPLC色谱图见图5。
2.6.2线性关系考察
精密吸取“2.2.2”项下的混合对照品溶液适量，用甲醇稀释制成系列浓度的混合对照品溶液溶液。经0.45μm微孔滤膜滤过后，取续滤液10μL，按“2.1”项下色谱条件进样分析，记录峰面积。以进样量X(μg)为横坐标，峰面积Y为纵坐标，进行线性回归，结果，各待测成分均在其相应质量范围内与其峰面积的线性关系良好(r均不低于0.999 1)，详见表5。
表5草果药材中6个成分线性关系考察
Figure BDA0003290468700000101
2.6.3精密度试验
取混合对照品储备液适量，按“2.1”项下色谱条件连续进样测定6次，记录峰面积。计算得到原儿茶酸、原儿茶醛、对羟基苯甲酸、龙胆酸、香草酸、对羟基苯丙酸峰面积的RSD分别为0.94％、1.18％、0.83％、0.68％、1.04％、1.05％(n＝6)，表明仪器精密度良好。
2.6.4重复性试验
精密称取同一产地(S8)的草果粉末1.0g，按“2.2”项下方法平行制备6份供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件连续测定6次，记录峰面积并按标准曲线法计算样品中6种成分含量。结果，原儿茶酸、原儿茶醛、对羟基苯甲酸、龙胆酸、香草酸、对羟基苯丙酸峰面积含量的RSD分别为1.13％、0.81％、1.14％、0.90％、0.61％、1.84％(n＝6)，表明方法重复性良好。
2.6.5稳定性试验
取草果供试品溶液(S8)适量，按“2.1”项下色谱条件分别于0、2、4、8、12、24h进样测定，记录峰面积。结果，原儿茶酸、原儿茶醛、对羟基苯甲酸、龙胆酸、香草酸、对羟基苯丙酸峰面积的RSD分别为RSD分别为1.13％、0.79％、1.19％、1.09％、0.98％、1.48％(n＝6)，表明供试品溶液在24h内稳定性良好。
2.6.6加样回收率试验
精密称取不同产地草果药材粉末1.0g(过二号筛)已知成分含量的草果供试品(S8)9份，分别按已知含量的50％、100％、150％加入各对照品(按“2.3”项下方法制备)，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，计算得到原儿茶酸、原儿茶醛、对羟基苯甲酸、龙胆酸、香草酸、对羟基苯丙酸的平均加样回收率分别为95.43％、97.57％、95.05％、97.28％、97.13％、95.76％，RSD分别为1.97％、1.75％、2.35％、2.69％、1.84％、2.36％，表明该方法准确度良好。
2.6.7样品含量测定
精密称取15批不同产地草果药材粉末(过二号筛)1.0g，分别按“2.2项”下方法制备样品溶液，按“2.1项”下色谱条件进样测定，计算6种有效成分含量，结果见表6，可见不同产地草果化学成分含量存在明显差异。通过含量测定结果箱线图分析(图6)，可明确各产地草果中代表性化学成分。原儿茶酸在云南怒江(S12)采收的草果中含量最高，达到0.1328mg.g-1，云南腾冲(S15)则为最低；云南草果原儿茶醛和对羟基苯甲酸含量均在0.0318和0.0322mg.g-1以上，整体高于其他产地，可作为区分云南草果与其他产地草果的2个指标成分；云南草果龙胆酸量在1.5896～3.4213mg.g-1，整体高于其它产区，也可作为区分云南草果与其他产地草果的差异性成分；云南产区的香草酸含量相对较高，云南怒江含量最高，达0.0481mg.g-1；贵州产区对羟基苯丙酸的含量明显高于其它产区，可作为区分贵州草果与其他产地草果的差异性成分。广西草果龙胆酸和对羟基苯丙酸含量整体偏低。
表6草果中6个成分的含量测定(mg.g-1)
Figure BDA0003290468700000111
Figure BDA0003290468700000121
3讨论
指纹图谱是基于对中药物质群整体作用的认识，该技术的应用实现了中药中化学成分定性分析的最大化，但指纹图谱也有自身的缺点，无法明确具体成分的含量。中药成分复杂，单指标定量测定具有一定的局限性，多指标定量测定可以更全面地对中药质量进行整体评价。在色谱峰未明确具体成分的情况下，结合化学模式识别技术仍能给出充分、可靠的信息，再佐以多成分含量测定可用于中药材质量评价。因此，本研究选择贵州、广西、云南3个草果主产区15批样品，以指纹图谱质量控制模式定性，多指标质量控制模式定量，结合化学模式识别全面评价不同产地草果的质量。结果表明15批草果药材指纹图谱的相似度在0.737～0.991，确定21个共有峰，指认了6个成分。通过HCA、PCA和OPLS-DA等化学计量法分析表明15批草果样品明显分为3类，4个主成分累计方差贡献率为85.941％；通过变量权重要性排序发现共有峰20、15、2、9、10(对羟基苯丙酸)、5(对羟基苯甲酸)、1、21、3(原儿茶酸)、7、19、12，这些成分可作为区分和鉴别不同产区草果香药材质量的主要标志性成分。
中药化学成分是其产生生物效应的物质基础，药材有效成分的含量与其产地密切相关。因此，可从化学成分入手探究不同产地草果的质量差异性，从而有效用于草果的品质鉴别和溯源，更好地控制市场上草果的质量。酚酸类化合物是草果一类重要化学成分，根据前期实验研究结果和文献数据表明草果中主要为苯甲酸为母核的C6-C1型酚酸类成分。其中原儿茶酸、原儿茶醛、对羟基苯甲酸、龙胆酸、香草酸等酚酸类成分是草果发挥抗菌抗炎、抗氧化等作用的主要物质基础，因此本研究主要对草果中酚酸类成分进行了含量测定。在流动相选择上发现0.2mol/L的磷酸溶液比0.02mol/L的稀磷酸溶液色谱峰信息量多，响应值更高。含量测定结果表明草果药材随产地不同，在成分的含量上存在显著差异。通过对产地间的差异成分分析，明确了不同产地草果各自的成分特征。云南草果原儿茶醛、对羟基苯甲酸和龙胆酸含量均整体高于广西和贵州产区，可作为区分云南草果与其他产地草果的3个差异性成分，贵州产区对羟基苯丙酸的含量明显高于其它产区，可作为贵州草果的差异性成分，广西草果龙胆酸和对羟基苯丙酸含量整体较低。究其成分差异可能与药材基原、种植技术、生长环境、采收时间等多因素有关。今后在制定不同产地草果药材的质量标准过程中，应充分考虑产地差异，从特征图谱、含量、生物效应、临床用途等多方面综合考虑，选择适宜的指标，建立全面科学的草果质量评价体系。
综上，本发明所建立的不同产地草果HPLC指纹图谱及多指标成分含量测定方法的专属性较强，且准确、可靠。结合指纹图谱和酚类成分的定量研究，可以为区分草果的产地以及全面、准确地控制草果的质量提供参考。

Claims (7)

1.一种草果的HPLC指纹图谱检测方法，其特征在于：它包括如下步骤：
1）对照品溶液制备：取原儿茶酸、原儿茶醛、对羟基苯甲酸、龙胆酸、香草酸和对羟基苯丙酸对照品，加甲醇溶解，即得对照品溶液；
2）供试品溶液制备：取待检样品，加70%乙醇溶液提取，即得供试品溶液；
3）分别吸取对照品溶液和供试品溶液注入高效液相色谱仪，记录色谱图；色谱条件如下：
色谱柱：Eclipse Plus C18，4.6 ×150 mm，3.5μm；检测波长：270 nm；柱温30 ℃，进样量10 μL，流速为1 mL∙min-1；流动相：以0.2%磷酸溶液为流动相A，以甲醇为流动相B；梯度洗脱程序0～5 min，10%～15% B；5～10 min，15%～20% B；10～30 min，20%～40% B；30～40min，40%～60% B；40～50 min，60%～70% B；50～60 min，70%～80% B。
2.根据权利要求1所述的HPLC指纹图谱检测方法，其特征在于：步骤1）所述对照品溶液每1ml含原儿茶酸2~5μg、原儿茶醛1~3μg、对羟基苯甲酸1~3μg、龙胆酸80~120μg、香草酸3~8μg和/或对羟基苯丙酸30~80μg。
3.根据权利要求1所述的HPLC指纹图谱检测方法，其特征在于：步骤2）所述待检样品与乙醇溶液的质量体积比为1g：5~250 ml。
4.根据权利要求1所述的HPLC指纹图谱检测方法，其特征在于：步骤2）所述提取为超声提取，时间30min。
5.根据权利要求1~4任意一项所述的HPLC指纹图谱检测方法，其特征在于：所述指纹图谱中应有21个共有特征峰，与原儿茶酸相应的色谱峰为峰3，与原儿茶醛相应的色谱峰为峰4，与对羟基苯甲酸相应的色谱峰为峰5，与龙胆酸相应的色谱峰为峰6，与香草酸相应的色谱峰为峰8，与对羟基苯丙酸相应的色谱峰为峰10，以峰10为参照峰，规定值1.000，计算其余各特征峰与参照峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±5％范围之内；规定值为：峰1：0.102，峰2：0.127，峰7：0.794，峰9：0.891，峰11：1.039，峰12：1.203，峰13：1.353，峰14：1.880，峰15：2.049，峰16：2.072，峰17：2.225，峰18：2.393，峰19：2.465，峰20：2.513，峰21：2.623。
6.一种草果中6种酚类物质的含量测定方法，其特征在于：它包括如下步骤：
a、取待检草果，按权利要求1-4任意一项所述方法检测；
b、按外标法计算酚类物质的含量。
7.根据权利要求6所述的含量测定方法，其特征在于：所述酚类物质为原儿茶酸、原儿茶醛、对羟基苯甲酸、龙胆酸、香草酸和/或对羟基苯丙酸。
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