CN117589898A - 十大功劳叶的指纹图谱检测方法及其鉴定和提取方法 - Google Patents

十大功劳叶的指纹图谱检测方法及其鉴定和提取方法 Download PDF

Info

Publication number
CN117589898A
CN117589898A CN202311548823.3A CN202311548823A CN117589898A CN 117589898 A CN117589898 A CN 117589898A CN 202311548823 A CN202311548823 A CN 202311548823A CN 117589898 A CN117589898 A CN 117589898A
Authority
CN
China
Prior art keywords
peak
mahonia
leaves
fingerprint
acid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202311548823.3A
Other languages
English (en)
Inventor
祝清灿
孙宜春
徐明珠
李慧馨
段丽
王杏
张敏
李慧
陈欢欢
石亚
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Guoyaojituan Tongjitang Guizhou Pharmaceutical Co ltd
Original Assignee
Guoyaojituan Tongjitang Guizhou Pharmaceutical Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Guoyaojituan Tongjitang Guizhou Pharmaceutical Co ltd filed Critical Guoyaojituan Tongjitang Guizhou Pharmaceutical Co ltd
Priority to CN202311548823.3A priority Critical patent/CN117589898A/zh
Publication of CN117589898A publication Critical patent/CN117589898A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
    • G01N30/06—Preparation
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/26—Conditioning of the fluid carrier; Flow patterns
    • G01N30/28—Control of physical parameters of the fluid carrier
    • G01N30/34—Control of physical parameters of the fluid carrier of fluid composition, e.g. gradient
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/86—Signal analysis
    • G01N30/8675—Evaluation, i.e. decoding of the signal into analytical information
    • G01N30/8686—Fingerprinting, e.g. without prior knowledge of the sample components
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
    • G01N2030/042—Standards
    • G01N2030/047—Standards external
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
    • G01N30/06—Preparation
    • G01N2030/062—Preparation extracting sample from raw material

Landscapes

  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Library & Information Science (AREA)
  • Medicines Containing Plant Substances (AREA)

Abstract

本发明属于中药现代化技术领域，具体涉及十大功劳叶的指纹图谱检测方法及其鉴定和提取方法。所述十大功劳叶的指纹图谱检测方法包括如下步骤：(1)对照品溶液的制备；(2)供试品溶液的制备：取十大功劳叶样品加入提取溶剂B进行提取；(3)将对照品溶液和供试品溶液进行超高效液相色谱分析；(4)建立十大功劳叶药材的指纹图谱。通过上述十大功劳叶的指纹图谱检测方法可以鉴定不同基原的十大功劳叶，筛选不同基原十大功劳叶的共有特征峰和/或潜在差异性成分。此外，所述提取方法可以通过色谱柱层分析提取十大功劳叶指标性成分。本发明的化学指纹图谱方法稳定、可靠，能显著区分不同基原十大功劳叶，可为其质量控制、评价和基原鉴别提供参考，为保证临床疗效具有重要意义。

Description

十大功劳叶的指纹图谱检测方法及其鉴定和提取方法
技术领域
本发明属于中药现代化技术领域，具体涉及十大功劳叶的指纹图谱检测方法及其鉴定和提取方法。
背景技术
十大功劳叶(Folium Mahoniae)多为贵州省民间用药，其味苦、寒，归肺、肝、肾经，具有滋阴、清热、止咳化痰的功效，可治疗肺痨咳嗽和骨蒸潮热等。现代研究表明，十大功劳属植物中主要含有生物碱类、黄酮类和酚酸类等化合物，发挥着抑菌消炎、抗氧化、抗肿瘤和保肝等生物活性。十大功劳属植物在我国有250种之多，主要分布于四川、云南、贵州和广州等，由于其基原繁多且大多为野生，现药材市场上存在掺伪混淆等现象；2003年版《贵州省中药材、民族药材质量标准》中收载了细叶十大功劳叶Mahonia fortunei(Lindl.)Fedde、长柱十大功劳叶M.duclouxiana Gagnep.、阔叶十大功劳叶M.bealei(Fort.)Carr.、小果十大功劳叶M.bodinieri Gagnep.、宽苞十大功劳叶M.eurybracteata Fedde 5个种为药材来源，但该标准中仅有性状描述和阔叶十大功劳叶的横切面显微鉴别。因此，建立合理可行的分析方法对多基原的十大功劳叶药材进行区分以及研究不同基源的化学成分差异，对于其种间质量评价和筛选优质资源等均有重要意义。
发明内容
本发明解决的技术问题：现有技术缺乏十大功劳叶的指纹图谱及区分鉴别不同基原十大功劳叶的分析方法的报道，这不利于十大功劳叶的质量控制，亟需建立十大功劳叶的指纹图谱检测方法，以控制十大功劳叶相关产品的质量。
针对上述技术问题，本发明提供了十大功劳叶的指纹图谱检测方法及其鉴定和提取方法，为十大功劳叶质量控制、评价和基原鉴别提供参考。
具体来说，本发明提供了如下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种十大功劳叶的指纹图谱检测方法，其包括如下步骤：
(1)对照品溶液的制备：
分别称取新绿原酸、隐绿原酸、绿原酸、盐酸药根碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱、异绿原酸A和异绿原酸C的对照品适量，加入溶剂A配制对照品溶液；
(2)供试品溶液的制备：
取十大功劳叶样品加入提取溶剂B进行提取，得到供试品溶液；
(3)超高效液相色谱分析
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相A为水相，流动相B为有机相，吸取对照品溶液和供试品溶液注入超高效液相色谱仪，采用梯度洗脱程序进行分析；
(4)建立不同基原的十大功劳叶的指纹图谱。
优选地，步骤(1)中，所述溶剂A为盐酸和甲醇的混合溶剂。
优选地，步骤(1)中，盐酸和甲醇的体积比为1：90～110。
优选地，步骤(1)中，盐酸和甲醇的体积比为1：100。
优选地，步骤(1)中，所述对照品溶液的浓度为：新绿原酸、隐绿原酸、绿原酸、盐酸药根碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱、异绿原酸A和异绿原酸C的质量浓度分别为14～15μg/mL、8～9μg/mL、320～321μg/mL、19～20μg/mL、35～36μg/mL、71～72μg/mL、18～19μg/mL和5～6μg/mL。
优选地，步骤(1)中，所述对照品溶液的浓度为：新绿原酸、隐绿原酸、绿原酸、盐酸药根碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱、异绿原酸A和异绿原酸C的质量浓度分别为14μg/mL、8μg/mL、320μg/mL、19μg/mL、35μg/mL、71μg/mL、18μg/mL和5.μg/mL。
优选地，步骤(1)中，所述对照品溶液的浓度为：新绿原酸、隐绿原酸、绿原酸、盐酸药根碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱、异绿原酸A和异绿原酸C的质量浓度分别为14.896μg/mL、8.722μg/mL、320.977μg/mL、19.010μg/mL、35.737μg/mL、71.520μg/mL、18.931μg/mL和5.076μg/mL。
优选地，步骤(2)中，供试品溶液制备步骤包括：取十大功劳叶样品，加入提取溶剂B进行提取，再称定重量，用提取溶剂B补足减失的重量，过滤，取续滤液，即得供试品溶液。其中，所述十大功劳叶样品为十大功劳叶药材、十大功劳叶饮片、十大功劳叶标准汤剂冻干粉和十大功劳叶配方颗粒中的一种或两种以上。
优选地，步骤(2)中，所述溶剂B为盐酸和低级醇的混合溶剂。
优选地，步骤(2)中，所述低级醇包括甲醇和/或乙醇。
优选地，步骤(2)中，盐酸和低级醇的体积比为1：90～110。
优选地，步骤(2)中，盐酸和低级醇的体积比为1：100。
优选地，步骤(2)中，所述十大功劳叶样品与溶剂B的质量体积比为1:30～50，其中质量的单位是g，体积的单位是mL。
优选地，步骤(2)中，所述十大功劳叶样品与溶剂B的质量体积比为1:40，其中质量的单位是g，体积的单位是mL。
优选地，步骤(2)中，所述提取采用振摇法、回流提取法或超声提取法。
优选地，步骤(2)中，所述提取物采用超声提取法。
优选地，步骤(2)中，所述提取的时间为15～60min。
优选地，步骤(2)中，所述提取的时间为45min。
优选地，步骤(3)中，所述梯度洗脱程序如下：
0～21min，流动相A的体积百分比由85％减少至82％，流动相B的体积百分比由15％增加至18％；
21～21.5min，流动相A的体积百分比由82％减少至78％，流动相B的体积百分比由18％增加至22％；
21.5～32min，流动相A的体积百分比由78％减少至77％，流动相B的体积百分比由22％增加至23％；
32～38min，流动相A的体积百分比由77％减少至72％，流动相B的体积百分比由23％增加至28％；
38～50min，流动相A的体积百分比由72％减少至63％，流动相B的体积百分比由28％增加至37％；
50～50.1min，流动相A的体积百分比由63％增加至85％，流动相B的体积百分比由37％减少至15％；
50.1～55min，流动相A的体积百分比为85％，流动相B的体积百分比为15％。
优选地，步骤(3)中，色谱的检测波长为330～340nm。
优选地，步骤(3)中，色谱的检测波长为336nm；
优选地，步骤(3)中，流速为0.8～1.2mL/min。
优选地，步骤(3)中，流速为1mL/min；
优选地，步骤(3)中，柱温为20～30℃。
优选地，步骤(3)中，柱温为25℃；
优选地，步骤(3)中，色谱柱的规格为：柱长250mm，内径4.6mm，粒径5μm。
优选地，步骤(3)中，色谱柱为2-JADE-PAKKP-C18-AQ。
优选地，步骤(3)中，所述有机相为乙腈或甲醇。
优选地，步骤(3)中，所述水相为水、含磷酸二氢钾的溶液、含磷酸二氢铵的溶液或含磷酸二氢钾和十二烷基硫酸钠的溶液。
优选地，步骤(3)中，所述水相的pH为2.0～4.0。
优选地，步骤(3)中，所述水相为0.05mol/L的磷酸二氢钾溶液；或所述水相为0.05mol/L的磷酸二氢铵溶液；或所述水相为0.05mol/L的磷酸二氢钾溶液和十二烷基硫酸钠。
优选地，步骤(3)中，所述水相为0.05mol/L的磷酸二氢钾溶液和十二烷基硫酸钠，其中每100mL水相含有0.2～0.4g十二烷基硫酸钠。
优选地，步骤(4)中，所述不同基原十大功劳叶分别为长柱十大功劳叶、细叶十大功劳叶、阔叶十大功劳叶、小果十大功劳叶和宽苞十大功劳叶，以及其他十大功劳叶属植物。
优选地，所述十大功劳叶的指纹图谱包含7个共有的指纹特征峰；以第2号共有的指纹特征峰(峰9)的保留时间为参照计算各共有峰的相对保留时间A，其中，所述第2号指纹特征峰为绿原酸的指纹特征峰；
第1号共有的指纹特征峰(峰5)的相对保留时间为0.61，
第2号共有的指纹特征峰(峰9)的相对保留时间为1.0，
第3号共有的指纹特征峰(峰11)的相对保留时间为1.41，
第4号共有的指纹特征峰(峰14)的相对保留时间为1.79，
第5号共有的指纹特征峰(峰15)的相对保留时间为1.9，
第6号共有的指纹特征峰(峰16)的相对保留时间为2.16，和
第7号共有的指纹特征峰(峰17)的相对保留时间为2.23；
所述指纹特征峰的相对保留时间的误差在±10％之内。
优选地，对指纹特征峰中进行归属，峰4为新绿原酸，峰7为隐绿原酸，峰9为绿原酸，峰15为盐酸药根碱，峰16为盐酸巴马汀，峰17为盐酸小檗碱，峰18为异绿原酸A和峰19为异绿原酸C。
优选地，按中药色谱指纹图谱相似度评价系统计算，供试品指纹图谱与对照指纹图谱的相似度不得低于0.90。
第二方面，本发明提供了一种所述十大功劳叶的指纹图谱检测方法在对十大功劳叶进行质量控制中的应用，在对不同基原十大功劳叶进行鉴定中的应用，或在对十大功劳叶中指标性成分含量检测中的应用。
优选地，本发明提供了一种所述十大功劳叶的指纹图谱检测方法在对十大功劳叶药材、十大功劳叶饮片、十大功劳叶标准汤剂冻干粉或十大功劳叶配方颗粒进行质量控制中的应用，在对不同基原十大功劳叶药材、十大功劳叶饮片、十大功劳叶标准汤剂冻干粉或十大功劳叶配方颗粒进行鉴定中的应用，或在对十大功劳叶药材、十大功劳叶饮片、十大功劳叶标准汤剂冻干粉或十大功劳叶配方颗粒中指标性成分含量检测中的应用。
第三方面，本发明提供了一种鉴别不同基原十大功劳叶的特征标志物的方法，所述鉴别不同基原十大功劳叶的特征标志物的方法通过所述十大功劳叶的指纹图谱检测方法进行检测。
优选地，其中，峰3，峰12，峰13，峰15，峰16，峰7和峰14为潜在差异性成分；以峰9的保留时间为参照计算各共有峰的相对保留时间，所述峰9为为绿原酸的指纹特征峰；峰3的相对保留时间为0.41，峰12的相对保留时间为1.52，峰13的相对保留时间为1.64，峰15的相对保留时间为1.90，峰16的相对保留时间为2.16，峰7的相对保留时间为0.78，峰14的相对保留时间为1.79；所述指纹特征峰的相对保留时间的误差在±10％之内。
优选地，峰3为阔叶十大功劳叶专属，可区分阔叶十大功劳叶与其他基原十大功劳叶。
优选地，峰12仅宽苞十大功劳叶缺失，可区分宽苞十大功劳叶与其他基原十大功劳叶。
优选地，含峰13但不含峰3者为小果十大功劳叶，可区分小果十大功劳叶与其他基原十大功劳叶。
优选地，含峰12但不含峰7者为细叶十大功劳叶，可区分细叶十大功劳叶与其他基原十大功劳叶。
优选地，含峰7但不含峰13者为长柱十大功劳叶，可区分长柱十大功劳叶与其他基原十大功劳叶。
第四方面，本发明提供了十大功劳叶指标性成分的色谱柱层提取方法，其特征在于，所述色谱柱层提取方法包括如下步骤：
(2)供试品溶液的制备
取十大功劳叶样品加入提取溶剂B进行提取，得到供试品溶液；
(5)色谱柱层分析提取
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相A为水相，流动相B为有机相，采用梯度洗脱程序进行提取，从而得到含有新绿原酸，隐绿原酸，绿原酸，盐酸药根盐酸巴马汀，盐酸小壁碱，异绿原酸A和异绿原酸C中的一种或两种以上的成分。
优选地，步骤(2)中，所述溶剂B为盐酸和低级醇的混合溶剂。
优选地，步骤(2)中，所述低级醇包括甲醇和/或乙醇。
优选地，步骤(2)中，盐酸和低级醇的体积比为1：90～110。
优选地，步骤(2)中，盐酸和低级醇的体积比为1：100。
优选地，步骤(2)中，所述十大功劳叶样品与溶剂B的质量体积比为1:30～50，其中质量的单位是g，体积的单位是mL。
优选地，步骤(2)中，所述十大功劳叶样品与溶剂B的质量体积比为1:40，其中质量的单位是g，体积的单位是mL。
优选地，步骤(2)中，所述提取采用振摇法、回流提取法或超声提取法。
优选地，步骤(2)中，所述提取物采用超声提取法。
优选地，步骤(2)中，所述提取的时间为15～60min。
优选地，步骤(2)中，所述提取的时间为45min。
优选地，步骤(5)中，所述梯度洗脱程序如下：
0～21min，流动相A的体积百分比由85％减少至82％，流动相B的体积百分比由15％增加至18％；
21～21.5min，流动相A的体积百分比由82％减少至78％，流动相B的体积百分比由18％增加至22％；
21.5～32min，流动相A的体积百分比由78％减少至77％，流动相B的体积百分比由22％增加至23％；
32～38min，流动相A的体积百分比由77％减少至72％，流动相B的体积百分比由23％增加至28％；
38～50min，流动相A的体积百分比由72％减少至63％，流动相B的体积百分比由28％增加至37％；
50～50.1min，流动相A的体积百分比由63％增加至85％，流动相B的体积百分比由37％减少至15％；
50.1～55min，流动相A的体积百分比为85％，流动相B的体积百分比为15％。
优选地，步骤(5)中，色谱的检测波长为330～340nm。
优选地，步骤(5)中，色谱的检测波长为336nm；
优选地，步骤(5)中，流速为0.8～1.2mL/min。
优选地，步骤(5)中，流速为1mL/min；
优选地，步骤(5)中，柱温为20～30℃。
优选地，步骤(5)中，柱温为25℃；
优选地，步骤(5)中，色谱柱的规格为：柱长250mm，内径4.6mm，粒径5μm。
优选地，步骤(5)中，色谱柱为2-JADE-PAKKP-C18-AQ。
优选地，步骤(5)中，所述有机相为乙腈或甲醇。
优选地，步骤(5)中，所述水相为水、含磷酸二氢钾的溶液、含磷酸二氢铵的溶液或含磷酸二氢钾和十二烷基硫酸钠的溶液。
优选地，步骤(5)中，所述水相的pH为2.0～4.0。
优选地，步骤(5)中，所述水相为0.05mol/L的磷酸二氢钾溶液；或所述水相为0.05mol/L的磷酸二氢铵溶液；或所述水相为0.05mol/L的磷酸二氢钾溶液和十二烷基硫酸钠。
优选地，步骤(5)中，所述水相为0.05mol/L的磷酸二氢钾溶液和十二烷基硫酸钠，其中每100mL水相含有0.2～0.4g十二烷基硫酸钠。
本发明的有益效果
(1)本发明根据十大功劳叶中所含的活性成分的结构性质特点，所述活性成分包括新绿原酸、隐绿原酸、绿原酸、盐酸药根碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱、异绿原酸A和异绿原酸C等，通过大量实验筛选出最佳的流动相组成，梯度洗脱程序，流速，检测波长、色谱柱及柱温等分析条件，经多次实验验证表明：本发明提供的十大功劳叶指纹图谱检测方法可以全面、客观及准确的检测和评价十大功劳叶的质量，为保证临床疗效具有重要意义。
(2)通过本发明提供的十大功劳叶HPLC指纹图谱检测得到：细叶十大功劳叶含有13个指纹特征峰、长柱十大功劳叶含有17个指纹特征峰、阔叶十大功劳叶含有确定11个指纹特征峰、小果十大功劳叶含有确定14个指纹特征峰、宽苞十大功劳叶含有确定10个指纹特征峰；并对其中8个指纹特征峰进行了化学成分指认。
(3)本发明通过建立十大功劳叶HPLC指纹图谱，并应用聚类分析及模式识别技术鉴别不同基原药材的差异性，可将不同基原的十大功劳叶进行有效区分，并发现7个种间显著差异成分。该化学指纹图谱方法稳定、可靠，能显著区分5种不同基原十大功劳叶，可为其质量控制、评价和基原鉴别提供参考。
附图说明
图1为十大功劳叶(长柱)药材指纹图谱有机相考察HPLC图谱。
图2为十大功劳叶(长柱)药材指纹图谱不同种类缓冲盐考察HPLC图谱。
图3为十大功劳叶(长柱)药材指纹图谱水相的不同pH值考察HPLC图谱。
图4为十大功劳叶(长柱)药材指纹图谱梯度考察HPLC图谱。
图5为十大功劳叶(长柱)药材指纹图谱不同品牌色谱柱考察HPLC图谱。
图6为十大功劳叶(长柱)药材指纹图谱不同柱温考察HPLC图谱。
图7为十大功劳叶(长柱)药材指纹图谱不同流速考察HPLC图谱。
图8为十大功劳叶(长柱)药材指纹图谱不同溶媒考察HPLC图谱。
图9为十大功劳叶(长柱)药材指纹图谱不同溶媒浓度考察HPLC图谱。
图10为18批细叶十大功劳叶药材HPLC指纹图谱。
图11为25批长柱十大功劳叶药材HPLC指纹图谱。
图12为15批阔叶十大功劳叶药材HPLC指纹图谱。
图13为16批小果十大功劳叶药材HPLC指纹图谱。
图14为13批宽苞十大功劳叶药材HPLC指纹图谱。
图15为共有峰归属HPLC图。
图16为87批十大功劳叶样品聚类分析图。
图17为十大功劳叶样品的PCA(A)和OPLS-DA(B)得分图。
图18为潜在种间差异成分的VIP值图。
图19为十大功劳叶(长柱)药材指纹图谱专属性考察HPLC图谱。
图20为十大功劳叶(长柱)药材指纹图谱整体性考察HPLC图谱。
具体实施方式
如上所述，本发明的目的在于提供一种十大功劳叶的指纹图谱检测方法及其鉴定和提取方法。
其中，所述潜在差异性成分又称为特征标志物，是指可用于区分不同基原十大功劳叶差异的化合物。
在一种具体实施方式中，本发明提供了一种十大功劳叶的指纹图谱检测方法，包括如下步骤：
(1)色谱条件
KP-C18-AQ色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)，体积流量1.0mL/min，柱温为25℃，检测波长为336nm，以乙腈(B)-0.05mol/L磷酸二氢钾溶液(磷酸调pH 3.0)(A)为流动相，进行梯度洗脱。
所述梯度洗脱的程序如下：
0～21min，流动相A的体积百分比由85％减少至82％，流动相B的体积百分比由15％增加至18％；
21～21.5min，流动相A的体积百分比由82％减少至78％，流动相B的体积百分比由18％增加至22％；
21.5～32min，流动相A的体积百分比由78％减少至77％，流动相B的体积百分比由22％增加至23％；
32～38min，流动相A的体积百分比由77％减少至72％，流动相B的体积百分比由23％增加至28％；
38～50min，流动相A的体积百分比由72％减少至63％，流动相B的体积百分比由28％增加至37％；
50～50.1min，流动相A的体积百分比由63％增加至85％，流动相B的体积百分比由37％减少至15％；
50.1～55min，流动相A的体积百分比为85％，流动相B的体积百分比为15％。
(2)对照品溶液制备
取新绿原酸、隐绿原酸、绿原酸、盐酸药根碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱、异绿原酸A和异绿原酸C对照品适量，精密称定，加盐酸-甲醇(盐酸和甲醇体积比为1：100)制成质量浓度分别为14.896μg/mL、8.722μg/mL、320.977μg/mL、19.010μg/mL、35.737μg/mL、71.520μg/mL、18.931μg/mL和5.076μg/mL的混合对照品溶液。
(3)供试品溶液制备
取样品粉末(过3号筛，孔径355±13μm)约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入盐酸-甲醇(盐酸和甲醇体积比为1：100)20mL，超声处理(功率500W、频率40kHz)45min，放冷，用盐酸-甲醇(盐酸和甲醇体积比为1:100)补足减失质量，摇匀，滤过，取续滤液过0.45μm微孔滤膜，即得。本发明所使用的盐酸是常规市售的盐酸，盐酸的浓度在36％～38％。
在第二种具体实施方式中，本发明提供了一种鉴别不同基原十大功劳叶的特征标志物的方法，包括如下步骤：
(1)对照品溶液的制备
分别称取新绿原酸、隐绿原酸、绿原酸、盐酸药根碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱、异绿原酸A和异绿原酸C的对照品适量，加入溶剂A配制对照品溶液；
(2)供试品溶液的制备
取十大功劳叶样品加入提取溶剂B进行提取，得到供试品溶液；
(3)超高效液相色谱分析
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相A为水相，流动相B为有机相，吸取对照品溶液和供试品溶液注入超高效液相色谱仪，采用梯度洗脱程序进行分析；
(4)建立不同基原的十大功劳叶的指纹图谱。
优选地，步骤(1)中，所述溶剂A为盐酸和甲醇的混合溶剂。
优选地，步骤(1)中，盐酸和甲醇的体积比为1：90～110。
优选地，步骤(2)中供试品溶液制备步骤包括：取十大功劳叶样品，加入提取溶剂B进行提取，再称定重量，用提取溶剂B补足减失的重量，过滤，取续滤液，即得供试品溶液。
优选地，步骤(2)中，所述溶剂B为盐酸和低级醇的混合溶剂。
优选地，步骤(2)中，所述低级醇包括甲醇和/或乙醇。
优选地，步骤(2)中，盐酸和低级醇的体积比为1：90～110。
优选地，步骤(2)中，所述十大功劳叶样品与溶剂B的质量体积比为1:30～50，其中质量的单位是g，体积的单位是mL。
优选地，步骤(2)中，所述提取采用振摇法、回流提取法或超声提取法。
优选地，步骤(2)中，所述提取的时间为15～60min。
优选地，步骤(3)中，所述梯度洗脱程序如下：
0～21min，流动相A的体积百分比由85％减少至82％，流动相B的体积百分比由15％增加至18％；
21～21.5min，流动相A的体积百分比由82％减少至78％，流动相B的体积百分比由18％增加至22％；
21.5～32min，流动相A的体积百分比由78％减少至77％，流动相B的体积百分比由22％增加至23％；
32～38min，流动相A的体积百分比由77％减少至72％，流动相B的体积百分比由23％增加至28％；
38～50min，流动相A的体积百分比由72％减少至63％，流动相B的体积百分比由28％增加至37％；
50～50.1min，流动相A的体积百分比由63％增加至85％，流动相B的体积百分比由37％减少至15％；
50.1～55min，流动相A的体积百分比为85％，流动相B的体积百分比为15％。
优选地，步骤(3)中，所述超高效液相色谱的检测波长为330～340nm。
优选地，步骤(3)中，流速为0.8～1.2mL/min。
优选地，步骤(3)中，柱温为20～30℃。
优选地，步骤(3)中，色谱柱的规格为：柱长250mm，内径4.6mm，粒径5μm。
优选地，步骤(3)中，色谱柱为2-JADE-PAK KP-C18-AQ。
优选地，步骤(3)中，所述有机相为乙腈或甲醇。
优选地，步骤(3)中，所述水相为水、含磷酸二氢钾的溶液、含磷酸二氢铵的溶液或含磷酸二氢钾和十二烷基硫酸钠的溶液。
优选地，步骤(3)中，所述水相的pH为2.0～4.0。
优选地，步骤(3)中，所述水相为0.05mol/L的磷酸二氢钾溶液；或所述水相为0.05mol/L的磷酸二氢铵溶液；或所述水相为0.05mol/L的磷酸二氢钾溶液和十二烷基硫酸钠。
优选地，步骤(3)中，所述水相为0.05mol/L的磷酸二氢钾溶液和十二烷基硫酸钠，其中每100mL水相含有0.2～0.4g十二烷基硫酸钠。
在第三种具体实施方式中，本发明提供了一种十大功劳叶指标性成分的色谱柱层提取方法，其中，所述指标性成分包括新绿原酸，隐绿原酸，绿原酸，盐酸药根碱，盐酸巴马汀，盐酸小檗碱，异绿原酸A和异绿原酸C中的一种或两种以上，包括如下步骤：
(2)供试品溶液的制备
取十大功劳叶样品加入提取溶剂B进行提取，得到供试品溶液；
(5)超高效液相色谱分析
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相A为水相，流动相B为有机相，吸取对照品溶液和供试品溶液注入超高效液相色谱仪，采用梯度洗脱程序进行分析提取。
优选地，步骤(2)中供试品溶液制备步骤包括：取十大功劳叶样品，加入提取溶剂B进行提取，再称定重量，用提取溶剂B补足减失的重量，过滤，取续滤液，即得供试品溶液。
优选地，步骤(2)中，所述溶剂B为盐酸和低级醇的混合溶剂。
优选地，步骤(2)中，所述低级醇包括甲醇和/或乙醇。
优选地，步骤(2)中，盐酸和低级醇的体积比为1：90～110。
优选地，步骤(2)中，所述十大功劳叶样品与溶剂B的质量体积比为1:30～50，其中质量的单位是g，体积的单位是mL。
优选地，步骤(2)中，所述提取采用振摇法、回流提取法或超声提取法。
优选地，步骤(2)中，所述提取的时间为15～60min。
优选地，步骤(5)中，所述梯度洗脱程序如下：
0～21min，流动相A的体积百分比由85％减少至82％，流动相B的体积百分比由15％增加至18％；
21～21.5min，流动相A的体积百分比由82％减少至78％，流动相B的体积百分比由18％增加至22％；
21.5～32min，流动相A的体积百分比由78％减少至77％，流动相B的体积百分比由22％增加至23％；
32～38min，流动相A的体积百分比由77％减少至72％，流动相B的体积百分比由23％增加至28％；
38～50min，流动相A的体积百分比由72％减少至63％，流动相B的体积百分比由28％增加至37％；
50～50.1min，流动相A的体积百分比由63％增加至85％，流动相B的体积百分比由37％减少至15％；
50.1～55min，流动相A的体积百分比为85％，流动相B的体积百分比为15％。
优选地，步骤(5)中，所述超高效液相色谱的检测波长为330～340nm。
优选地，步骤(5)中，流速为0.8～1.2mL/min。
优选地，步骤(5)中，柱温为20～30℃。
优选地，步骤(5)中，色谱柱的规格为：柱长250mm，内径4.6mm，粒径5μm。
优选地，步骤(5)中，色谱柱为2-JADE-PAK KP-C18-AQ。
优选地，步骤(5)中，所述有机相为乙腈或甲醇。
优选地，步骤(5)中，所述水相为水、含磷酸二氢钾的溶液、含磷酸二氢铵的溶液或含磷酸二氢钾和十二烷基硫酸钠的溶液。
优选地，步骤(5)中，所述水相的pH为2.0～4.0。
优选地，步骤(5)中，所述水相为0.05mol/L的磷酸二氢钾溶液；或所述水相为0.05mol/L的磷酸二氢铵溶液；或所述水相为0.05mol/L的磷酸二氢钾溶液和十二烷基硫酸钠。
优选地，步骤(5)中，所述水相为0.05mol/L的磷酸二氢钾溶液和十二烷基硫酸钠，其中每100mL水相含有0.2～0.4g十二烷基硫酸钠。
本发明实施例与对比例中使用的各种试剂/仪器，除非另作说明，都是常规市售产品。本发明所用到的实验材料和仪器信息来如下表所示：
表1实验材料/仪器及生产厂商
为了更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明的技术方案进行详细说明。
实施例1：色谱条件的筛选
1.流动相的优化
(1)对有机相的考察
流动相A为0.05mol/L磷酸二氢钾(磷酸调至pH为3.0)，流动相B为有机相，梯度洗脱程序如下表2所示。
表2梯度洗脱程序
时间(min) 流动相A(体积％) 流动相B(体积％)
0～60 95→50 5→50
60～60.1 50→95 50→5
60.1～65 95 5
有机相分别为甲醇和乙腈，按照上述梯度洗脱程序得到的色谱图如图1所示。从图1可以看出：乙腈-0.05mol/L磷酸二氢钾(磷酸调pH3.0)溶液洗脱能力较甲醇-0.05mol/L磷酸二氢钾(磷酸调pH3.0)溶液强，出峰早，整体峰型好且分离度更佳，故选择乙腈-0.05mol/L磷酸二氢钾(磷酸调pH3.0)溶液进行条件摸索，后期再对流动相中所用到的各种缓冲盐和不同的pH值进行考察。
(2)对水相的考察
固定有机相为乙腈，以不同的缓冲盐考察水相。流动相A为不同种类的缓冲盐，流动相B为乙腈，按照表2所示的梯度洗脱程序得到的色谱图如图2所示。从图2可以看出：加缓冲盐比不加缓冲盐效果好，流动相为乙腈-0.05mol/L磷酸二氢钾(磷酸调pH3.0)和乙腈-0.05mol/L磷酸二氢钾(每100ml中加十二烷基硫酸钠0.4g)(磷酸调pH3.0)系统时峰型最佳，但后者出峰时间晚，故选择乙腈-0.05mol/L磷酸二氢钾(磷酸调pH3.0)溶液进行洗脱。
(3)对水相的pH值进行考察
固定有机相为乙腈，水相为0.05mol/L的磷酸二氢钾溶液，分别考察其不调节pH值，和用磷酸调节至pH2.0、pH3.0和pH4.0，按照表2所示的梯度洗脱程序得到的色谱图如图3所示。从图3可以看出：用磷酸调节pH值比不调效果好，当pH值为4.0时有明显拖尾；用磷酸调节pH为3.0和2.0时，整体峰型最佳，且分离度最好。但考虑到pH为2.0时对色谱柱有一定损耗，因此选择乙腈-0.05mol/L磷酸二氢钾(磷酸调pH3.0)为最终的洗脱溶液。
2.梯度洗脱程序的选择
考察不同的洗脱梯度，流动相A为0.05mol/L的磷酸二氢钾(磷酸调节pH为3.0)，流动相B为乙腈，考察的梯度洗脱程序有如下4种。
表3第一种梯度洗脱程序
时间(min) 流动相A(体积％) 流动相B(体积％)
0～19 85→81.5 15→18.5
19～19.5 81.5→78 18.5→22
19.5～26 78→75 22→25
26～30 75→72 25→28
30～42 72→63 28→37
42～42.1 63→85 37→15
42.1～48 85 15
表4第二种梯度洗脱程序
时间(min) 流动相A(体积％) 流动相B(体积％)
0～8 85→78 15→22
8～18 78→76 22→24
18～28 76→68 24→32
28～28.1 68→85 32→15
28.1～32 85 15
表5第三种梯度洗脱程序
时间(min) 流动相A(％) 流动相B(％)
0～21 85→82 15→18
21～21.5 82→78 18→22
21.5～34 78→76 22→24
34～38 76→72 24→28
38～50 72→63 28→37
50～50.1 63→85 37→15
50.1～55 85 15
表6第四种梯度洗脱程序
利用上述四种梯度洗脱程序得到的色谱图如图4所示。从图4可以看出，第四种梯度洗脱程序中的各峰分离度最佳，整体出峰时间合适且基线平稳，因此选用第四种梯度洗脱程序为十大功劳叶(长柱)药材指纹图谱的洗脱梯度。
3.不同品牌色谱柱的考察
考察了3种色谱柱，分别是：色谱柱1-Diamonsil C18(柱长为250mm，内径为4.6mm，粒径为5μm)；2-JADE-PAKKP-C18-AQ(柱长为250mm，内径为4.6mm，粒径为5μm)，3-WatersAtlantis T3(柱长为250mm，内径为4.6mm，粒径为5μm)；考察三根色谱柱对十大功劳叶(长柱)药材指纹图谱出峰情况的影，如图5所示。从图5可以看出：色谱柱对指纹图谱影响较大。采用2-JADE-PAKKP-C18-AQ(柱长为250mm，内径为4.6mm，粒径为5μm)的超高效液相色谱柱进行洗脱，色谱峰峰型较好，分离效果最佳，因此本方法采用2-JADE-PAKKP-C18-AQ(柱长为250mm，内径为4.6mm，粒径为5μm)的液相色谱柱。
4.不同柱温的考察
对不同柱温(20℃、25℃、30℃)洗脱情况进行考察，如图6所示。从图6可以看出：柱温对出峰情况有一定影响，柱温为25℃时分离效果最佳，峰型较好，因此建议使用柱温25℃进行测定。
5.不同流速的考察
比较不同流速，分别为0.80ml/min、1.00ml/min和1.20ml/min对十大功劳叶(长柱)药材指纹图谱的影响，如图7所示。从图7可以看出：流速对出峰情况影响较小，主要影响出峰时间，流速为每分钟1.00ml/min峰型最佳且出峰时间合适，柱效最稳定。因此建议使用1.00ml/min作为测定流速。
6.最终色谱条件的确定
经过一系列条件探索，最终确定以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为250mm，内径为4.6mm，粒径为5μm)；以0.05mol/L磷酸二氢钾(磷酸调pH3.0)为流动相A，以乙腈为流动相B，梯度洗脱程序如表6所示；流速为每分钟1.0ml；柱温为25℃；检测波长为336nm。
实施例2：提取工艺的考察
1.提取溶媒种类考察
取十大功劳叶(长柱)0.5g，精密称定，置于50ml带塞的锥形瓶中，分别精密移取20ml的盐酸-甲醇溶液(1：100，v/v)、盐酸-乙醇溶液(1：100，v/v)，称重，超声提取45min，再称重，用盐酸-甲醇溶液(1：100，v/v)、盐酸-乙醇溶液(1：100，v/v)补失去的重量，充分摇匀，滤过，取续滤液，备用。采用实施例1中第6小结中的色谱条件进行检测，如图8所示。从图8中可以看出，当提取溶剂为盐酸-乙醇时，峰型不对称，且出峰个数明显少于盐酸-甲醇提取的色谱峰个数，因此选择盐酸-甲醇溶液作为十大功劳叶(长柱)药材指纹图谱的提取溶媒。
2.提取溶媒浓度考察
取十大功劳叶(长柱)药材0.5g，精密称定，置于50ml带塞的锥形瓶中，分别精密移取20ml的盐酸-30％甲醇溶液(1：100，v/v)、盐酸-50％甲醇溶液(1：100，v/v)、盐酸-75％甲醇溶液(1：100，v/v)、盐酸-甲醇溶液(1：100，v/v)、盐酸-水溶液(1：100，v/v)，称重，超声提取45min，再称重，用相应溶液补失去的重量，充分摇匀，滤过，取续滤液，备用。采用实施例1中第6小结中的色谱条件进行检测，如图9所示。从图9中可以看出，用盐酸-甲醇溶液(1：100，v/v)做溶媒提取的色谱分离度及响应值最好，且提取出来的化合物多于其他浓度的溶媒，因此选用盐酸-甲醇溶液(1：100，v/v)为十大功劳叶(长柱)药材的提取溶剂。
3.提取方法优选
(1)振摇法
取十大功劳叶(长柱)药材0.5g，精密称定，置于50ml带塞的锥形瓶中，精密移取20ml的盐酸-甲醇溶液(1：100，v/v)溶液，称重，室温下振摇45min，称重，用盐酸-甲醇溶液(1：100，v/v)溶液补失去的重量，充分摇匀，滤过，取续滤液，备用。
(2)超声提取法
取十大功劳叶(长柱)药材0.5g，精密称定，置于50ml带塞的锥形瓶中，精密移取20ml的盐酸-甲醇溶液(1：100，v/v)溶液，称重，室温下超声45min，称重，用盐酸-甲醇溶液(1：100，v/v)溶液补失去的重量，充分摇匀，滤过，取续滤液，备用。
(3)回流提取法
取十大功劳叶(长柱)药材0.5g，精密称定，置于50ml带塞的锥形瓶中，精密移取20ml的盐酸-甲醇溶液(1：100，v/v)溶液，称重，回流45min，称重，用盐酸-甲醇溶液(1：100，v/v)溶液补失去的重量，充分摇匀，滤过，取续滤液，备用。
采用实施例1中第6小结中的色谱条件进行检测，如表7所示。
表7不同提取方式的峰面积
峰序号 振摇 超声 回流
1 1269.324 57.638 35.682
2 44.982 88.832 102.197
3(S) 2073.172 3537.704 3421.717
4 93.274 156.591 109.023
5 637.118 665.240 699.565
6 5203.429 5068.422 4990.781
7 70.492 175.913 150.476
8 25.554 45.975 74.543
总峰面积 9417.345 9796.315 9583.984
从表7中可以看出，通过比较各峰面积和总峰面积，超声的总峰面积最高，因此确定十大功劳叶(长柱)药材的指纹图谱提取方式为超声提取。
(4)提取时间
取十大功劳叶(长柱)药材0.5g，精密称定，置于50ml带塞的锥形瓶中，精密移取20ml的盐酸-甲醇溶液(1：100，v/v)溶液，称重，分别超声15min、30min、45min、60min，称重，用盐酸-甲醇溶液(1：100，v/v)溶液补失去的重量，充分摇匀，滤过，取续滤液，备用。采用实施例1中第6小结中的色谱条件进行检测，如表8所示。
表8不同提取时间的峰面积
峰序号 15min 30min 45min 60min
1 59.491 59.773 57.638 64.177
2 84.639 85.331 88.832 90.405
3 3478.265 3569.774 3637.704 3678.368
4 138.463 128.306 156.591 83.910
5 680.371 679.072 685.240 663.192
6 5245.638 5235.906 5498.422 5456.816
7 165.478 160.415 175.913 172.195
8 41.649 38.139 45.975 45.969
总峰面积 9893.994 9956.716 10346.315 10255.032
从表8中可以看出，当超声时间为45min时，目标峰和总峰面积最大，因此选用超声45min作为十大功劳叶(长柱)药材指纹图谱的提取时间。
4.最终提取方法的确定
取十大功劳叶(长柱)药材0.5g，精密称定，置于50ml带塞的锥形瓶中，精密移取20ml的盐酸-甲醇溶液(1：100，v/v)溶液，称重，超声45min，称重，用盐酸-甲醇溶液(1：100，v/v)溶液补失去的重量，充分摇匀，滤过，取续滤液，备用。
实施例3
本实施例共收集87批十大功劳叶药材，经贵州中医药大学魏升华教授鉴定为小檗科功劳属细叶十大功劳叶Mahonia fortunei(Lindl.)Fedde、长柱十大功劳叶M.duclouxiana Gagnep.、阔叶十大功劳叶M.bealei(Fort.)Carr.、小果十大功劳叶M.bodinieri Gagnep.、宽苞十大功劳叶M.eurybracteata Fedde。样品信息详见表9。
表9十大功劳叶样品信息
十大功劳叶的指纹图谱检测方法，其包括如下步骤：
1.对照品溶液的制备
取新绿原酸、隐绿原酸、绿原酸、盐酸药根碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱、异绿原酸A、异绿原酸C对照品适量，精密称定，加盐酸-甲醇(1：100，v/v)制成质量浓度分别为14.896、8.722、320.977、19.010、35.737、71.520、18.931、5.076μg/mL的混合对照品溶液。
2.供试品溶液的制备
取样品粉末约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入盐酸-甲醇(1：100，v/v)20mL，超声处理(功率500W、频率40kHz)45min，放冷，用盐酸-甲醇(1:100，v/v)补足减失质量，摇匀，滤过，取续滤液过0.45μm微孔滤膜，即得。
其中，所述样品粉末的制备包括如下步骤：将新鲜的十大功劳叶药材晒干，磨成粉末，然后过3号筛(50目)，粉碎成粉末。
3.超高效液相色谱分析
KP-C18-AQ色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)，体积流量1.0mL/min，柱温为25℃，检测波长为336nm，以乙腈(B)-0.05mol/L磷酸二氢钾溶液(磷酸调pH 3.0)(A)为流动相；
梯度洗脱程序：0～21min，流动相A的体积百分比由85％减少至82％，流动相B的体积百分比由15％增加至18％；
21～21.5min，流动相A的体积百分比由82％减少至78％，流动相B的体积百分比由18％增加至22％；
21.5～32min，流动相A的体积百分比由78％减少至77％，流动相B的体积百分比由22％增加至23％；
32～38min，流动相A的体积百分比由77％减少至72％，流动相B的体积百分比由23％增加至28％；
38～50min，流动相A的体积百分比由72％减少至63％，流动相B的体积百分比由28％增加至37％；
50～50.1min，流动相A的体积百分比由63％增加至85％，流动相B的体积百分比由37％减少至15％；
50.1～55min，流动相A的体积百分比为85％，流动相B的体积百分比为15％。
4.指纹图谱的建立
(1)指纹图谱的建立及共有峰归属
将87批药材样品的HPLC色谱图以AIA格式导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”软件(2012年130723版本)进行分析。
如图10-14所示，长柱十大功劳叶的色谱峰信息最丰富，确定17个共有峰；以第8号指纹特征峰的保留时间为参照计算各共有峰的相对保留时间，其中，所述第8号指纹特征峰为绿原酸的指纹特征峰；第1号共有的指纹特征峰(峰1)的相对保留时间为0.31，第2号共有的指纹特征峰(峰2)的相对保留时间为0.35，第3号共有的指纹特征峰(峰4)的相对保留时间为0.52，第4号共有的指纹特征峰(峰5)的相对保留时间为0.61，第5号共有的指纹特征峰(峰6)的相对保留时间为0.68，第6号共有的指纹特征峰(峰7)的相对保留时间为0.78，第7号共有的指纹特征峰(峰8)的相对保留时间为0.91，第8号共有的指纹特征峰(峰9)的相对保留时间为1.00，第9号共有的指纹特征峰(峰10)的相对保留时间为1.08，第10号共有的指纹特征峰(峰11)的相对保留时间为1.41，第11号共有的指纹特征峰(峰12)的相对保留时间为1.52，第12号共有的指纹特征峰(峰14)的相对保留时间为1.77，第13号共有的指纹特征峰(峰15)的相对保留时间为1.90，第14号共有的指纹特征峰(峰16)的相对保留时间为2.16，第15号共有的指纹特征峰(峰17)的相对保留时间为2.23，第16号共有的指纹特征峰(峰18)的相对保留时间为2.57，和第17号共有的指纹特征峰(峰19)的相对保留时间为2.64；所述指纹特征峰的相对保留时间的误差在±10％之内。
细叶十大功劳叶确定13个共有峰；以第6号指纹特征峰的保留时间为参照计算各共有峰的相对保留时间，其中，所述第6号指纹特征峰为绿原酸的指纹特征峰；第1号共有的指纹特征峰(峰1)的相对保留时间为0.32，第2号共有的指纹特征峰(峰4)的保留时间为0.52，第3号共有的指纹特征峰(峰5)的保留时间为0.61，第4号共有的指纹特征峰(峰6)的保留时间为0.68，第5号共有的指纹特征峰(峰8)的保留时间为0.91，第6号共有的指纹特征峰(峰9)的保留时间为1.00，第7号共有的指纹特征峰(峰10)的保留时间为1.08，第8号共有的指纹特征峰(峰11)的保留时间为1.41，第9号共有的指纹特征峰(峰12)的保留时间为1.52，第10号共有的指纹特征峰(峰14)的保留时间为1.78，第11号共有的指纹特征峰(峰15)的保留时间为1.87，第12号共有的指纹特征峰(峰16)的保留时间为2.16，和第13号共有的指纹特征峰(峰17)的保留时间为2.22；所述指纹特征峰的相对保留时间的误差在±10％之内。
阔叶十大功劳叶确定11个共有峰；以第4号指纹特征峰的保留时间为参照计算各共有峰的相对保留时间，其中，所述第4号指纹特征峰为绿原酸的指纹特征峰；第1号共有的指纹特征峰(峰3)的相对保留时间为0.41，第2号共有的指纹特征峰(峰5)的相对保留时间为0.60，第3号共有的指纹特征峰(峰7)的相对保留时间为0.78，第4号共有的指纹特征峰(峰9)的相对保留时间为1.00，第5号共有的指纹特征峰(峰11)的相对保留时间为1.41，第6号共有的指纹特征峰(峰12)的相对保留时间为1.52，第7号共有的指纹特征峰(峰13)的相对保留时间为1.64，第8号共有的指纹特征峰(峰14)的相对保留时间为1.77，第9号共有的指纹特征峰(峰15)的相对保留时间为1.90，第10号共有的指纹特征峰(峰16)的相对保留时间为2.23，和第11号共有的指纹特征峰(峰17)的相对保留时间为2.28；所述指纹特征峰的相对保留时间的误差在±10％之内。
小果十大功劳叶确定14个共有峰；以第6号指纹特征峰的保留时间为参照计算各共有峰的相对保留时间，其中，所述第6号指纹特征峰为绿原酸的指纹特征峰；第1号共有的指纹特征峰(峰4)的相对保留时间为0.52，第2号共有的指纹特征峰(峰5)的相对保留时间为0.61，第3号共有的指纹特征峰(峰6)的相对保留时间为0.68，第4号共有的指纹特征峰(峰7)的相对保留时间为0.78，第5号共有的指纹特征峰(峰8)的相对保留时间为0.91，第6号共有的指纹特征峰(峰9)的相对保留时间为1.00，第7号共有的指纹特征峰(峰10)的相对保留时间为1.08，第8号共有的指纹特征峰(峰11)的相对保留时间为1.41，第9号共有的指纹特征峰(峰12)的相对保留时间为1.52，第10号共有的指纹特征峰(峰13)的相对保留时间为1.64，第11号共有的指纹特征峰(峰14)的相对保留时间为1.80，第12号共有的指纹特征峰(峰15)的相对保留时间为1.89，第13号共有的指纹特征峰(峰16)的相对保留时间为2.17，和第14号共有的指纹特征峰(峰17)的相对保留时间为2.23；所述指纹特征峰的相对保留时间的误差在±10％之内。
宽苞十大功劳叶确定10个共有峰。以第4号指纹特征峰的保留时间为参照计算各共有峰的相对保留时间，其中，所述第4号指纹特征峰为绿原酸的指纹特征峰；第1号共有的指纹特征峰(峰5)的相对保留时间为0.61，第2号共有的指纹特征峰(峰6)的相对保留时间为0.68，第3号共有的指纹特征峰(峰8)的相对保留时间为0.91，第4号共有的指纹特征峰(峰9)的相对保留时间为1.00，第5号共有的指纹特征峰(峰10)的相对保留时间为1.08，第6号共有的指纹特征峰(峰11)的相对保留时间为1.41，第7号共有的指纹特征峰(峰14)的相对保留时间为1.79，第8号共有的指纹特征峰(峰15)的相对保留时间为1.88，第9号共有的指纹特征峰(峰16)的相对保留时间为2.16，和第10号共有的指纹特征峰(峰17)的保留时间为2.23；所述指纹特征峰的相对保留时间的误差在±10％之内。
5种基原十大功劳叶的共有峰个数为7个。以第2号共有的指纹特征峰的保留时间为参照计算各共有峰的相对保留时间A，其中，所述第2号指纹特征峰为绿原酸的指纹特征峰；第1号共有的指纹特征峰(峰5)的相对保留时间为0.61，第2号共有的指纹特征峰(峰9)的相对保留时间为1.0，第3号共有的指纹特征峰(峰11)的相对保留时间为1.41，第4号共有的指纹特征峰(峰14)的相对保留时间为1.79，第5号共有的指纹特征峰(峰15)的相对保留时间为1.9，第6号共有的指纹特征峰(峰16)的相对保留时间为2.16，和第7号共有的指纹特征峰(峰17)的相对保留时间为2.23；所述指纹特征峰的相对保留时间的误差在±10％之内。
将5种基原(十大功劳叶药材分别为长柱十大功劳叶、细叶十大功劳叶、阔叶十大功劳叶、小果十大功劳叶和宽苞十大功劳叶)进行检测，共得到19个指纹特征峰，以峰9的保留时间为参照计算各共有峰的相对保留时间，其中，所述峰9为绿原酸的指纹特征峰。峰1的相对保留时间为0.31；峰2的相对保留时间为0.35，峰3的相对保留时间为0.41，峰4的相对保留时间为0.52，峰5的相对保留时间为0.61，峰6的相对保留时间为0.68，峰7的相对保留时间为0.78，峰8的相对保留时间为0.91，峰9的相对保留时间为1.00，峰10的相对保留时间为1.08，峰11的相对保留时间为1.41，峰12的相对保留时间为1.52，峰13的相对保留时间为1.64，峰14的相对保留时间为1.79，峰15的相对保留时间为1.90，峰16的相对保留时间为2.16，峰17的相对保留时间为2.23，峰18的相对保留时间为2.57，和峰19的相对保留时间为2.64。通过各对照品保留时间和等吸收线谱图对5基原药材中的8个特征峰进行归属，确定峰4为新绿原酸，峰7为隐绿原酸，峰9为绿原酸，峰15为盐酸药根碱，峰16为盐酸巴马汀，峰17为盐酸小檗碱，峰18为异绿原酸A，峰19为异绿原酸C(图15A)。峰4为新绿原酸，相对保留时间为0.52；峰7为隐绿原酸，相对保留时间为0.78；峰9为绿原酸，相对保留时间为1.00；峰15为盐酸药根碱，相对保留时间为1.90；峰16为盐酸巴马汀，相对保留时间为2.16；峰17为盐酸小檗碱，相对保留时间为2.23；峰18为异绿原酸A，相对保留时间为2.57；峰19为异绿原酸C；相对保留时间为2.64；所述指纹特征峰的相对保留时间的误差在±10％之内。
由图15B可知，峰2、18(异绿原酸A)、19(异绿原酸C)为长柱专属，峰3为阔叶专属；而峰6、8、10仅阔叶缺失，峰12仅宽苞缺失。细叶峰面积较其他基原高的有峰5、14、15(盐酸药根碱)、16(盐酸巴马汀)；小果峰面积较其他基原高的有峰17(盐酸小檗碱)。
(2)相似度评价结果及分析
采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”软件(2012年130723版本)分别对5种基原共87批次药材样品HPLC指纹图谱进行数据处理，采用中位数，时间窗口为0.2，多点矫正，Mark峰匹配，计算相似度系数。18批细叶十大功劳叶药材的相似度均在0.889～0.993，25批长柱十大功劳叶药材的相似度均在0.809～1.000，15批阔叶十大功劳叶药材的相似度均在0.953～1.000，16批小果十大功劳叶药材的相似度均在0.864～0.991，宽苞十大功劳叶药材的相似度均在0.954～0.997。87批样本中仅有7批低于0.9，此结果说明不同来源、相同基原的功劳属药材具有较好的一致性。
将5个基原样品的对照图谱导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”软件(2012年130723版本)，两两对比，细叶与阔叶、小果、宽苞的相似度分别为0.754、0.708、0.664、0.658；长柱与阔叶、小果、宽苞的相似度分别为0.953、0.269、0.120；阔叶与小果、宽苞的相似度分别为0.320、0.155；小果与宽苞的相似度为0.938。此结果说明同属药材、不同基原的指纹图谱共有峰信息和相似度均有差异。其中细叶十大功劳叶和其余4种基原样品相似度都低于0.76，可完全独立出来，由图15可知细叶中的生物碱类含量(峰15、16)较其他基原也都较高。
5.聚类分析
将十大功劳叶指纹图谱共有模式筛选出的19个共有峰峰面积数据(差异峰峰面积计为0)标准化处理，运用SPSS软件对87批药材样品进行系统聚类，采用组间平均数联结法，以余弦距离作为度量标准，如图16所示，样品聚为3类：XY1～XY18聚为第Ⅰ类，CZ1～CZ25聚为第Ⅱ类，所有KB、XG和KY样品聚为第Ⅲ类，结果表明细叶、长柱分别与其他样品存在明显区别，且阔叶、小果、宽苞3种基原较为相似。聚为第Ⅲ类的所有样品又可分别聚为3类，其中KB1～KB13聚为第Ⅲa，XG1～XG16聚为第Ⅲb类，KY1～KY15聚为第Ⅲc类，结果表明阔叶、小果、宽苞3种基原样品聚类有明显界限，各自具有较好的一致性，能相互区分。
6.模式识别分析
(1)PCA(主成分分析技术)分析
将标准化处理后的共有峰峰面积数据导入SIMCA14.1软件进行模式识别分析，分析中的自变量拟合指数(R2x)为1.000，模型预测指数(Q2)为0.993，R2x和Q2均大于0.5，表明该模型预测信度良好。PCA得分图见图17，与聚类分析结果一致，细叶和长柱各聚为一类，分别与其他基原有较好的分离，阔叶、小果、宽苞3者的相似度较高，但同种基原各聚为一类，有较好的一致性。其中，所述标准化处理是指利用SPSS软件进行处理，采用z-score标准化处理，以均值为0，标准差为1的正态分布。
(2)OPLS-DA(正交偏最小二乘法判别分析技术)分析
为进一步分析十大功劳叶不同基原的差异性，在PCA基础上采用有监督的模式识别方法OPLS-DA对所有样品进行分析，分析中的自变量拟合指数(R2x)为0.969，因变量拟合指数(R2y)为0.831，模型预测指数(Q2)为0.721，均大于0.5，表明该模型稳定可靠且预测良好。OPLS-DA得分图见图17，此方法的分析结果较PCA各基原样本间更为聚拢，且离域样本更靠近置信边界，进一步说明细叶、长柱的化学成分与其他3种基原(阔叶、小果、宽苞)存在一定的差异。
采用变量重要性投影值(variable importance inproject，VIP)筛选区分十大功劳叶5基原的潜在差异性成分，以VIP＞1.0作为筛选标准。由图18可知，共筛选得到7个潜在差异性成分，按VIP值由大到小排列分别为峰3＞峰12＞峰13＞峰15(盐酸药根碱)＞峰16(盐酸巴马汀)＞峰7(隐绿原酸)＞峰14。筛选出的7种成分中峰3为阔叶专属，可区分阔叶与其他4种基原；峰12仅宽苞缺失可区分宽苞与其他4种基原；含峰13但不含峰3者为小果；含峰12但不含峰7者为细叶；含峰7但不含峰13者为长柱，可分别与其他四种基原区分，符合图15的直观分析。因此峰3、峰12、峰13和峰7(隐绿原酸)可作为区分贵州省地标5种基原十大功劳叶的种间差异成分，另外峰15(盐酸药根碱)、峰16(盐酸巴马汀)和峰14作为5种基原共有的潜在差异性成分，并不能直观地判断观察其差异是否具有统计学意义，因此有必要进一步确认其差异的显著性。
本发明采用聚类分析与化学模式识别相结合的方法，可将十大功劳叶5个不同基原进行区分鉴别，2种化学识别结果基本一致，细叶和长柱可各聚为一类，与其他3种基原有较大的差异；阔叶、宽苞和小果3者间有较高的相似性，但3者的聚类结果也有明显的界限，可相互区分。
通过变量重要性投影值和方差分析找到7个差异成分：峰3、峰12、峰13和峰7(隐绿原酸)为5种基原药材各自的差异峰，可通过峰的有无对比来区分5种基原；峰15(盐酸药根碱)、峰16(盐酸巴马汀)和峰14为5种基原药材的共有峰，其峰面积相差较大，在种间有显著差异(P＜0.5)。峰3、峰13和峰7作为小峰，在指纹图谱的分析中常被允许有较大变化或直接忽略不计，但有研究指出指纹图谱中的细微差异可能才是质量评价的关键，因此这7个成分可共同作为十大功劳叶的种间差异标志物，对于目前未指认的共有峰，今后将采用植物化学分离及HPLC-MS等分析技术进一步鉴定。
实施例4：指纹图谱方法学考察
(1)精密度
取一份十大功劳叶(长柱)药材供试品溶液，重复进样6次，记录色谱图，并运用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》2012版软件进行评价。暂标定8个共有峰，以绿原酸(峰3)为参照峰，计算相对保留时间和相对峰面积，实验结果见下表。
表9十大功劳叶(长柱)药材指纹图谱精密度结果(相对峰面积)
表10十大功劳叶(长柱)药材指纹图谱精密度结果(相对保留时间)
表11十大功劳叶(长柱)药材指纹图谱精密度结果(相似度)
实验结果：各峰相对保留时间和相对峰面积的RSD＜3.0％，该仪器精密度良好，且符合指纹图谱的要求，相似度在0.990→1.00之间。
(2)重复性
取同一批十大功劳叶(长柱)0.5g，精密称定，平行6份，按供试品溶液制备方法制备成供试品溶液，进样，记录色谱图，并运用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》2012版软件进行评价。暂标定8个共有峰，以绿原酸(峰3)为参照峰，计算相对保留时间和相对峰面积，实验结果见下表。
表12十大功劳叶(长柱)药材指纹图谱重复性结果(相对峰面积)
表13十大功劳叶(长柱)药材指纹图谱重复性结果(相对保留时间)
表14十大功劳叶(长柱)药材指纹图谱重复性结果(相似度)
实验结果：各峰相对保留时间和相对峰面积的RSD＜3.0％，该仪器重复性良好，且符合指纹图谱的要求，相似度在0.990→1.00之间。
(3)稳定性
取十大功劳叶(长柱)药材按照供试品溶液，分别在0，2，4，8，12，24小时进样，记录色谱图，并运用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》2012版软件进行评价。暂标定8个共有峰，以绿原酸(峰3)为参照峰，计算相对保留时间和相对峰面积，实验结果见下表。
表15十大功劳叶(长柱)药材指纹图谱稳定性结果(相对峰面积)
表16十大功劳叶(长柱)药材指纹图谱稳定性结果(相对保留时间)
表17十大功劳叶(长柱)药材指纹图谱稳定性结果(相似度)
实验结果：各峰相对保留时间和相对峰面积的RSD＜3.0％，该仪器稳定性良好，且符合指纹图谱的要求，相似度在0.990→1.00之间。
(4)专属性
精密吸取十大功劳叶(长柱)药材供试品溶液与空白溶剂各10μL，注入液相色谱仪，按上述项下色谱条件测定，结果如图19所示。由实验结果可知，溶剂对十大功劳叶(长柱)药材指纹图谱中的色谱峰均没有干扰。
(5)整体性
取十大功劳叶(长柱)药材供试品溶液，注入液相色谱仪，在梯度终点的流动相比例下延长一倍洗脱时间，分析指纹图谱，结果如图20所示。结果表明，该色谱条件延长一倍洗脱时间后无明显色谱峰，表明该色谱条件基本满足了信息量最大的原则。
上述虽然对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围进行限制，在本发明技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。

Claims (12)

1.一种十大功劳叶的指纹图谱检测方法，其特征在于，所述检测方法包括如下步骤：
(1)对照品溶液的制备
分别称取新绿原酸、隐绿原酸、绿原酸、盐酸药根碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱、异绿原酸A和异绿原酸C的对照品适量，加入溶剂A配制对照品溶液；
(2)供试品溶液的制备
取十大功劳叶样品加入提取溶剂B进行提取，得到供试品溶液；
(3)超高效液相色谱分析
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相A为水相，流动相B为有机相，吸取对照品溶液和供试品溶液注入超高效液相色谱仪，采用梯度洗脱程序进行分析；
(4)建立不同基原的十大功劳叶的指纹图谱。
2.一种十大功劳叶指标性成分的色谱柱层提取方法，其特征在于，所述色谱柱层提取方法包括如下步骤：
(2)供试品溶液的制备
取十大功劳叶样品加入提取溶剂B进行提取，得到供试品溶液；
(5)色谱柱层分析提取
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相A为水相，流动相B为有机相，采用梯度洗脱程序进行提取，从而得到含有新绿原酸，隐绿原酸，绿原酸，盐酸药根盐酸巴马汀，盐酸小壁碱，异绿原酸A和异绿原酸C中的一种或两种以上的成分。
3.根据权利要求1所述的十大功劳叶的指纹图谱检测方法，其中，步骤(1)中，所述溶剂A为盐酸和甲醇的混合溶剂；
优选地，步骤(1)中，盐酸和甲醇的体积比为1：90～110；
更优选地，步骤(1)中，盐酸和甲醇的体积比为1：100；
进一步优选地，步骤(1)中，所述对照品溶液的浓度为：新绿原酸、隐绿原酸、绿原酸、盐酸药根碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱、异绿原酸A和异绿原酸C的质量浓度分别为14～15μg/mL、8～9μg/mL、320～321μg/mL、19～20μg/mL、35～36μg/mL、71～72μg/mL、18～19μg/mL和5～6μg/mL；
更进一步优选地，步骤(1)中，所述对照品溶液的浓度为：新绿原酸、隐绿原酸、绿原酸、盐酸药根碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱、异绿原酸A和异绿原酸C的质量浓度分别为14μg/mL、8μg/mL、320μg/mL、19μg/mL、35μg/mL、71μg/mL、18μg/mL和5μg/mL。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的十大功劳叶的指纹图谱检测方法或十大功劳叶指标性成分的色谱柱层提取方法，其中，步骤(2)中，供试品溶液制备步骤包括：取十大功劳叶样品，加入提取溶剂B进行提取，再称定重量，用提取溶剂B补足减失的重量，过滤，取续滤液，即得供试品溶液；其中，所述十大功劳叶样品为十大功劳叶药材、十大功劳叶饮片、十大功劳叶标准汤剂冻干粉和十大功劳叶配方颗粒中的一种或两种以上；
优选地，步骤(2)中，所述溶剂B为盐酸和低级醇的混合溶剂；
优选地，步骤(2)中，所述低级醇包括甲醇和/或乙醇；
和/或，优选地，步骤(2)中，盐酸和低级醇的体积比为1：90～110；
更优选地，步骤(2)中，盐酸和低级醇的体积比为1：100；
进一步优选地，步骤(2)中，所述十大功劳叶样品与溶剂B的质量体积比为1:30～50，优选1:40，其中质量的单位是g，体积的单位是mL。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的十大功劳叶的指纹图谱检测方法或十大功劳叶指标性成分的色谱柱层提取方法，其中，步骤(2)中，所述提取采用振摇法、回流提取法或超声提取法；
优选地，步骤(2)中，所述提取物采用超声提取法；
更优选地，步骤(2)中，所述提取的时间为15～60min；
进一步优选地，步骤(2)中，所述提取的时间为45min。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的十大功劳叶的指纹图谱检测方法或十大功劳叶指标性成分的色谱柱层提取方法，其中，所述梯度洗脱程序如下：
0～21min，流动相A的体积百分比由85％减少至82％，流动相B的体积百分比由15％增加至18％；
21～21.5min，流动相A的体积百分比由82％减少至78％，流动相B的体积百分比由18％增加至22％；
21.5～32min，流动相A的体积百分比由78％减少至77％，流动相B的体积百分比由22％增加至23％；
32～38min，流动相A的体积百分比由77％减少至72％，流动相B的体积百分比由23％增加至28％；
38～50min，流动相A的体积百分比由72％减少至63％，流动相B的体积百分比由28％增加至37％；
50～50.1min，流动相A的体积百分比由63％增加至85％，流动相B的体积百分比由37％减少至15％；
50.1～55min，流动相A的体积百分比为85％，流动相B的体积百分比为15％。
7.根据权利要求1-6中任所述十大功劳叶的指纹图谱检测方法或十大功劳叶指标性成分的色谱柱层提取方法，其中，色谱分析条件为：色谱的检测波长为330～340nm；
优选地，步骤(3)中，色谱的检测波长为336nm；
和/或，步骤(3)中，流速为0.8～1.2mL/min；优选地，流速为1mL/min；
和/或，步骤(3)中，柱温为20～30℃；优选地，柱温为25℃；
和/或，步骤(3)中，色谱柱的规格为：柱长250mm，内径4.6mm，粒径5μm；优选地，色谱柱为JADE-PAKKP-C18-AQ；
和/或，步骤(3)中，所述有机相为乙腈或甲醇；
和/或，步骤(3)中，所述水相为水、含磷酸二氢钾的溶液、含磷酸二氢铵的溶液或含磷酸二氢钾和十二烷基硫酸钠的溶液；
优选地，所述水相的pH为2.0～4.0；
更优选地，所述水相为0.05mol/L的磷酸二氢钾溶液，0.05mol/L的磷酸二氢铵溶液，或0.05mol/L的磷酸二氢钾溶液和十二烷基硫酸钠，优选地，每100mL水相中加入0.2～0.4g十二烷基硫酸钠。
8.根据权利要求1-7中任一项所述十大功劳叶的指纹图谱检测方法或十大功劳叶指标性成分的色谱柱层提取方法，其中，所述十大功劳叶为不同基原的十大功劳叶，包括长柱十大功劳叶、细叶十大功劳叶、阔叶十大功劳叶、小果十大功劳叶和宽苞十大功劳叶，以及其他十大功劳叶属植物；
优选地，所述不同基原的十大功劳叶的指纹图谱包含7个共有的指纹特征峰；以第2号共有的指纹特征峰(峰9)的保留时间为参照计算各共有峰的相对保留时间A，其中，所述第2号指纹特征峰为绿原酸的指纹特征峰；
第1号共有的指纹特征峰(峰5)的相对保留时间为0.61，
第2号共有的指纹特征峰(峰9)的相对保留时间为1.0，
第3号共有的指纹特征峰(峰11)的相对保留时间为1.41，
第4号共有的指纹特征峰(峰14)的相对保留时间为1.79，
第5号共有的指纹特征峰(峰15)的相对保留时间为1.9，
第6号共有的指纹特征峰(峰16)的相对保留时间为2.16，和
第7号共有的指纹特征峰(峰17)的相对保留时间为2.23；
所述指纹特征峰的相对保留时间的误差在±10％之内。
9.根据权利要求1-8中任一项所述十大功劳叶的指纹图谱检测方法或十大功劳叶指标性成分的色谱柱层提取方法，其中，对指纹特征峰中进行归属，峰4为新绿原酸，峰7为隐绿原酸，峰9为绿原酸，峰15为盐酸药根碱，峰16为盐酸巴马汀，峰17为盐酸小檗碱，峰18为异绿原酸A，峰19为异绿原酸C。
10.根据权利要求1-9中任一项所述十大功劳叶的指纹图谱检测方法，其中，按中药色谱指纹图谱相似度评价系统计算，供试品指纹图谱与对照品指纹图谱的相似度不得低于0.90。
11.权利要求1-10中任一项所述十大功劳叶的指纹图谱检测方法或十大功劳叶指标性成分的色谱柱层提取方法在对十大功劳叶进行质量控制中的应用，在对不同基原十大功劳叶进行鉴定中的应用，或在对十大功劳叶中指标性成分含量检测中的应用；
优选地，在对十大功劳叶药材、十大功劳叶饮片、十大功劳叶标准汤剂冻干粉或十大功劳叶配方颗粒进行质量控制中的应用，在对不同基原十大功劳叶药材、十大功劳叶饮片、十大功劳叶标准汤剂冻干粉或十大功劳叶配方颗粒进行鉴定中的应用，或对十大功劳叶药材、十大功劳叶饮片、十大功劳叶标准汤剂冻干粉或十大功劳叶配方颗粒中指标性成分含量检测中的应用；其中，所述指标性成分包括新绿原酸，隐绿原酸，绿原酸，盐酸药根碱，盐酸巴马汀，盐酸小檗碱，异绿原酸A和异绿原酸C中的一种或两种以上。
12.一种鉴别不同基原十大功劳叶的特征标志物的方法，其特征在于，所述鉴别不同基原十大功劳叶的特征标志物的方法通过权利要求1和3-10中任一项所述十大功劳叶的指纹图谱检测方法进行检测；
优选地，其中，指纹特征峰中，峰3，峰12，峰13，峰15，峰16，峰7和峰14为特征标志物的峰；以峰9的保留时间为参照计算各共有峰的相对保留时间，所述峰9为绿原酸的指纹特征峰；峰3的相对保留时间为0.41，峰12的相对保留时间为1.52，峰13的相对保留时间为1.64，峰15的相对保留时间为1.90，峰16的相对保留时间为2.16，峰7的相对保留时间为0.78，峰14的相对保留时间为1.79；所述指纹特征峰的相对保留时间的误差在±10％之内；
优选地，峰3为阔叶十大功劳叶专属，可区分阔叶十大功劳叶与其他基原十大功劳叶；
峰12仅宽苞十大功劳叶缺失，可区分宽苞十大功劳叶与其他基原十大功劳叶；
含峰13但不含峰3者为小果十大功劳叶，可区分小果十大功劳叶与其他基原十大功劳叶；
含峰12但不含峰7者为细叶十大功劳叶，可区分细叶十大功劳叶与其他基原十大功劳叶；
含峰7但不含峰13者为长柱十大功劳叶，可区分长柱十大功劳叶与其他基原十大功劳叶。
CN202311548823.3A 2023-11-20 2023-11-20 十大功劳叶的指纹图谱检测方法及其鉴定和提取方法 Pending CN117589898A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202311548823.3A CN117589898A (zh) 2023-11-20 2023-11-20 十大功劳叶的指纹图谱检测方法及其鉴定和提取方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202311548823.3A CN117589898A (zh) 2023-11-20 2023-11-20 十大功劳叶的指纹图谱检测方法及其鉴定和提取方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN117589898A true CN117589898A (zh) 2024-02-23

Family

ID=89910804

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202311548823.3A Pending CN117589898A (zh) 2023-11-20 2023-11-20 十大功劳叶的指纹图谱检测方法及其鉴定和提取方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN117589898A (zh)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN109633012B (zh) 一种浙麦冬的鉴别方法
CN102370891A (zh) 一种用hplc指纹图谱鉴别铁皮石斛真伪的方法
CN112051350A (zh) 一种多指标成分结合指纹图谱用于感冒止咳颗粒的质量评价方法
CN102539597B (zh) 一种羌活种子和宽叶羌活种子的快速鉴别方法
CN110297060B (zh) 一种山苦荬药材指纹图谱检测方法及其指纹图谱
CN110824068A (zh) 一种鸢都感冒颗粒指纹图谱的建立方法及应用
CN101091749A (zh) 头花蓼药材、提取物及其质量控制方法
CN111257456A (zh) 一种川芎地上部位的指纹图谱检测方法
CN112946132B (zh) 月季花药材指纹图谱及其构建方法和月季花药材的质量检测方法
CN110907555B (zh) 一种川芎乙酸乙酯部位的指纹图谱检测方法
CN118443811A (zh) 一种基于hplc指纹图谱的艾叶质量检测方法
CN117589898A (zh) 十大功劳叶的指纹图谱检测方法及其鉴定和提取方法
CN113899829B (zh) 一种草果的hplc指纹图谱检测方法及其酚类物质含量测定方法
CN110658295A (zh) 二冬汤组方中荷叶饮片指纹图谱测定方法
CN116148407A (zh) 咳敏胶囊指纹图谱的建立方法
CN106018647B (zh) 一种建立葵花盘hplc标准指纹图谱的方法
CN111272905B (zh) 茺蔚子药材的特征图谱构建方法和检测方法
CN114216980A (zh) 一种银柴胡hplc-elsd指纹图谱建立方法
CN109490450B (zh) 细叶石仙桃药材指纹图谱的建立方法及其指纹图谱
CN112924600B (zh) 一种治疗风湿痹阻所致关节肿痛制剂的指纹图谱建立方法
CN114034783B (zh) 个青皮、四花青皮的hplc特征图谱的构建方法及鉴别方法
CN113866298B (zh) 一种区分生青皮和醋青皮的质量评价方法
CN111766309B (zh) 一种安神宝颗粒特征图谱的检测方法
CN114088820B (zh) 一种治疗痛风药物的指纹图谱的建立方法
CN115060841B (zh) 一种白花泡桐叶的hplc指纹图谱鉴别方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination