CN114088820B - 一种治疗痛风药物的指纹图谱的建立方法 - Google Patents

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Abstract

一种治疗痛风药物指纹图谱的建立方法，痛风药物由肿节风、虎杖、忍冬藤、车前草、粉萆薢、徐长卿、透骨草、甘草组成，所述建立方法包括采用高效液相色谱法检测所述痛风药物成分，具体地，以虎杖苷为参照峰的指纹图谱的制定：精密吸取对照品溶液和供试品溶液，分别注入高效液相色谱仪，依据所得的图谱，制定标准指纹图谱。以上述方法作为待测定痛风立安颗粒样品中虎杖、忍冬藤、肿节风等药材中一种或几种成分指纹图谱的测试手段，将待测定痛风立安颗粒样品指纹图谱与上述标准指纹图谱对比，计算相似度在0.992～0.999之间。

Description

一种治疗痛风药物的指纹图谱的建立方法
技术领域
本发明涉及药物分析检测技术领域，具体涉及一种治疗痛风药物的指纹图谱的建立方法。
背景技术
中药指纹图谱分析是对原药材、半成品、最终产品判断其真实性、质量一致性与稳定性的可行而有效的手段，在中药的药材鉴别、工艺生产、药效部位筛选、质量控制等方面的研究中应用广泛。利用标准指纹图谱追踪工艺过程及监测原药材与最终产品质量的稳定性、一致性，色谱指纹图谱可以较为全面地检测其多种成分在药材中分布的全貌，使药材的内在质量情况可控。
痛风立安颗粒由肿节风、虎杖、忍冬藤、车前草、粉萆薢、徐长卿、透骨草、甘草8味中药组成，具有清热利湿、祛风通络的功效。适用于风湿热痹阻所致的痛风。症见：关节疼痛、红肿、灼热、屈伸不利等。
痛风立安颗粒为广西国际壮医医院的院内制剂痛风立安胶囊进一步优化制备而成，经研究证明，痛风立安颗粒有较好利尿、降尿酸作用。临床上用于治疗风湿热痹阻所致的痛风，痛风急性期和慢性期均可治疗，与治疗急性期痛风相比，痛风立安颗粒对慢性期痛风治疗效果更显著，其治疗效果已经得到临床的验证。如何保证药物的质量以及痛风立安颗粒中有效成分的含量，是决定痛风立安颗粒疗效的基础。现行的痛风立安颗粒质量标准规定了甘草、粉萆薢的薄层色谱鉴别方法和虎杖苷、马钱苷、异嗪皮啶高效液相色谱含量测定方法。为保证控制痛风立安颗粒的功效，还需根据中药多组分、多靶点、多途径作用的特点，对其物质整体予以控制，从整体上有效地表征中药的质量，建立安全、有效、稳定的质量标准体系。指纹图谱作为中药及其成方制剂的质量控制的有效方法，目前已经很普遍。采用中药指纹图谱方式，一方面可以通过指纹图谱的特征性，有效的鉴别样品的真伪，另一方面通过对主要指纹图谱特征峰的面积或比例的控制，能有效控制产品的质量，确保产品质量的稳定一致，从而保证产品安全有效。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种建立痛风药物，如痛风立安颗粒内容物的指纹图谱的方法，该方法建立的指纹图谱能够全面表征这种痛风药物的药物活性组分及其含量，从而表征和控制其内在质量。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：一种治疗痛风药物指纹图谱的建立方法，所述痛风药物由肿节风、虎杖、忍冬藤、车前草、粉萆薢、徐长卿、透骨草、甘草组成，所述建立方法包括采用高效液相色谱法检测所述痛风药物成分，其中，所述高效液相色谱法的条件包括：
色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充材料；
流动相：流动相A为乙腈，流动相B为体积分数为0.1%的磷酸水溶液，进行梯度洗脱，所述梯度洗脱程序如下，其中流动相比例均为体积百分比：
0～2min，流动相A为3%，流动相B为97%；
2～6min，流动相A为3%～7%，流动相B为93%～97%；
6～30min，流动相A为7%～10%，流动相B为90%～93%；
30～46min，流动相A为10%～15%，流动相B为85%～90%；
46～89min，流动相A为15%～22%，流动相B为78%～85%；
89～95min，流动相A为22%～27%，流动相B为73%～78%；
95～125min，流动相A为27%～80%，流动相B为20%～73%；
125～128min，流动相A为3%～80%，流动相B为20%～97%；
128～135min，流动相A为3%，流动相B为97%；
所述高效液相色谱法的条件还包括：
流速：1.0mL/min；柱温：40℃；
检测波长：320nm；
理论塔板数按虎杖苷峰计算，应不低于6000；并且
所述高效液相色谱法检测所述痛风药物成分包括以下步骤：
（1）制备对照品溶液：分别称取绿原酸1.72mg、迷迭香酸4.07mg、异嗪皮啶4.24mg及虎杖苷4.20mg，将称取的绿原酸、迷迭香酸、异嗪皮啶及虎杖苷置于50ml容量瓶中，再加甲醇溶解并稀释至刻度，作为混合对照品溶液；
（2）制备供试品溶液：取所述痛风药物成分0.5～1.0g，置于锥形瓶中，加入甲醇18～22ml，称重，超声处理0.8～1.2h，放冷，用甲醇补足失重，滤过，取续滤液即得；
（3）测定：精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl注入高效液相色谱仪，根据所述高效液相色谱法的色谱条件进行测定，得到指纹图谱。
进一步地，所述步骤（2）中取所述痛风药物成分0.8g，置于锥形瓶中，加入甲醇20ml，称重，超声处理1h，放冷，用甲醇补足失重，滤过，取续滤液即得。
进一步地，所述步骤（2）中超声处理时，超声波振荡发生器超声频率为35～40KHz。
进一步地，所述步骤（2）中超声处理时，超声波振荡发生器超声频率为38KHz。
进一步地，所述建立方法得到的指纹图谱中共有15个吸收峰，其中峰7为虎杖苷，各峰以峰7为参照峰的相对保留时间和相对峰面积如下：
相对保留时间：
峰1：0.1569～0.1571；峰2：0.42471～0.2474；峰3：0.3060～0.3065；峰4：0.4663～0.4666；峰5：0.5185～0.5191；峰6：0.9527～0.9530；峰7：1.000；峰8：0.1910~0.1917；峰9：1.1239～1.1249；峰10：1.2979～1.2992；峰11：1.4405～1.4417；峰12：1.5862～1.5870；峰13：1.9447～1.9461；峰14：2.0888～2.0904；峰15：0.2929~0.2947；
相对峰面积：
峰1：0.3215～0.3252；峰2：0.0561～0.0602；峰3：0.0577～0.0626；峰4：0.0902～0.0920；峰5：0.0802～0.0821；峰6：0.0850～0.0868；峰7：1.0000；峰8：0.0828~0.0841；峰9：0.0843～0.0851；峰10：0.1740~0.1782；峰11：0.1976~0.1994；峰12：0.0716~0.0728；峰13：0.0589~0.0605；峰14：0.0204~0.0211；峰15：0.0266~0.0267。
进一步地，所述指纹图谱的吸收峰中，单峰面积超过5%的吸收峰有12个：
峰1，相对保留时间为0.1570，RSD为0.07%，相对峰面积为0.3235，RSD为0.56%；
峰2，相对保留时间为0.2473，RSD为0.05%，相对峰面积为0.0575，RSD为2.46%；
峰3，相对保留时间为0.3062，RSD为0.05%，相对峰面积为0.0591，RSD为3.00%；
峰4，相对保留时间为0.4664，RSD为0.04%，相对峰面积为0.0913，RSD为0.74%；
峰5，相对保留时间为0.5188，RSD为0.05%，相对峰面积为0.0812，RSD为0.91%；
峰6，相对保留时间为0.95288，RSD为0.01%，相对峰面积为0.0858，RSD为0.72%；
峰8，相对保留时间为1.1913，RSD为0.03%，相对峰面积为0.0834，RSD为0.54%；
峰9，相对保留时间为1.1245，RSD为0.03%，相对峰面积为0.0851，RSD为0.75%；
峰10，相对保留时间为1.2989，RSD为0.04%，相对峰面积为1.1765，RSD为0.93%；
峰11，相对保留时间为1.4413，RSD为0.03%，相对峰面积为0.1984，RSD为0.35%；
峰12，相对保留时间为1.5867，RSD为0.02%，相对峰面积为0.0723，RSD为0.65%；
峰13，相对保留时间为1.9455，RSD为0.03%，相对峰面积为0.0600，RSD为1.02%。
进一步地，所述指纹图谱的吸收峰中，单峰面积超过10%的吸收峰有2个：
峰10，相对保留时间为1.2989，RSD为0.04%，相对峰面积为1.1765，RSD为0.93%；
峰11，相对保留时间为1.4413，RSD为0.03%，相对峰面积为0.1984，RSD为0.35%。
进一步地，通过对所述痛风药物复方与全方药材的相关性研究，确认了所述痛风药物HPLC指纹图谱的15个共有特征峰的来源。所述指纹图谱的吸收峰中，峰6、峰11归属于所述痛风药物中的肿节风，峰7归属于虎杖，峰4归属于忍冬藤；并且，采用与对照品色谱图对比及高效液相色谱—质谱（HPLC-MS）法对色谱峰进行了指认，其中峰6为异嗪皮啶，峰11为迷迭香酸，峰7为虎杖苷，峰4为绿原酸；并且，峰4为绿原酸，约在24min出峰；峰6为异嗪皮啶，约在50min出峰；峰11为迷迭香酸，约在75min出峰；峰7为虎杖苷，约在52min出峰；
在检测待测产品痛风药物，如痛风立安颗粒的质量时，可以将待测产品的指纹图谱与上文所获得的标准指纹图谱进行比较，计算相似度，识别两者所具有的共同吸收峰的数量，以确定产品是否合格。
因此，本发明还提供了一种检测痛风药物的方法，所述痛风药物由肿节风、虎杖、忍冬藤、车前草、粉萆薢、徐长卿、透骨草、甘草组成，所述方法包括根据权利要求1至5中任一项所述方法建立待测样品指纹图谱并与根据所述方法建立的标准指纹图谱比较。
以下是本发明的详细描述。
色谱条件：由于本样品为大复方，药味多，成分复杂，故采用梯度洗脱的方式；根据各药味成分的特点先后尝试了乙腈-磷酸水溶液不同浓度和比例的流动相系统，并且尝试了多种不同梯度条件，经过对各种色谱图比较，最后确定乙腈-0.1％磷酸水溶液系统，采用梯度洗脱方式，得到的多个色谱峰有较好的分离效果。
供试品溶液采用二极管阵列检测器(DAD)在200～400nm波长范围内进行全梯度扫描，并对203、250、290、320、350nm波长下的色谱图进行分析比较。结果表明，在320nm波长处，各色谱峰分离良好，特征峰明显且峰型较好，从图谱中可以尽可能的获取色谱组分信息及反映整体系组成的全貌，因此选定320nm为指纹图谱测定波长，结果见附图1。通过对Diamonsil、月旭色，COSMOSIL等C18色谱柱比较，最终确定用COSMOSILC18(5μm，2.5×460mm)；柱温：40℃；检测波长：320nm；流动相A为乙腈，流动相B为0.1％磷酸水溶液；洗脱方式：梯度洗脱；洗脱梯度程序为：0-2min，流动相A为3%，流动相B为97%；2-6min，流动相A为3%~7%，流动相B为97%~93%；6-30min，流动相A为7%~10%，流动相B为93%-90%；30-46min，流动相A为10%~15%，流动相B为90%-85%；46-89min，流动相A为15%~22%，流动相B为85%-78%；89-95min，流动相A为22%~27%，流动相B78%~73%；95-125min，流动相A为27%~80%，流动相B为73%-20%；125-128min，流动相A为80%~3%，流动相B20%-97%；128-135min，流动相A为3%，流动相B97%；并记录135分钟色谱图。流速：1.0ml/min；进样量10μL。
优选对照品溶液的制备方法为：分别精密称定绿原酸1.72mg、迷迭香酸4.07mg、异嗪皮啶4.24mg及虎杖苷4.20mg，置于50ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，即得。
优选供试品溶液的制备方法：通过多次的试验考察确定了本质量控制方法中供试品溶液的制备方法，试验比较了用50％甲醇水溶液、甲醇做提取溶剂对指纹图谱的影响，甲醇提取的成分更多，主要特征峰强，确定用甲醇作溶剂效果佳，同时对超声和回流不同提取方法和不同提取时间做了比较；结果表明使用甲醇超声1h，所得色谱峰较多，峰面积较大。因此，优选条件为取本品内容物约0.7g，精密称定，精密称定，加甲醇20ml，称重，超声60分钟，放冷，用甲醇补足失重，滤过，取续滤液作为供试品溶液。
以虎杖苷为参照峰的指纹图谱的制定：
精密吸取对照品溶液和供试品溶液，分别注入高效液相色谱仪，依据所得的图谱，制定标准指纹图谱。以上述方法作为待测定痛风立安颗粒样品中虎杖、忍冬藤、肿节风等药材中一种或几种成分指纹图谱的测试手段，将待测定痛风立安颗粒样品指纹图谱与上述标准指纹图谱对比，计算相似度在0.992～0.999之间，能有效的鉴别样品的真伪，通过对主要指纹图谱特征峰的面积或比例的控制，能有效控制产品的质量，确保产品质量的稳定一致，从而保证产品安全有效；精密度高，重现性好。
附图说明
图1为本发明实施例3中15批痛风立安颗粒内容物供试品的指纹图谱叠图；
图2为本发明实施例3中痛风立安颗粒的HPLC对照指纹图谱；
图3为本发明实施例4中痛风立安颗粒15个共有峰峰面积聚类树状关系图；
图4为本发明实施例4中痛风立安颗粒15个共有峰峰面积碎石图；
图5为本发明实施例4中偏最小二乘法-判别分析的PLS-DA图；
图6为本发明实施例4中偏最小二乘法-判别分析的VIP图。
具体实施方式
下面的实施例可以帮助本领域的技术人员更全面地理解本发明，但不可以以任何方式限制本发明。
以下各实施例中所使用的对照品来源如下：
虎杖苷，中国食品药品检定研究院，批号111575-201603。
以下各实施例中所使用的供试品痛风立安颗粒为广西国际壮医医院的院内制剂，制备过程中充分注重了处方中各药材的产地属性、采收季节特征、工艺控制特征。制得的产品批号见下表1：
表1实施例中采用的痛风立安颗粒的批号
表1
编号 批号
S1 20190916
S2 20190926
S3 20191014
S4 20191015
S5 20191017
S6 20191031
S7 20191107
S8 20191108
S9 20191109
S10 20191211
S11 20191212
S12 20191213
S13 20200701
S14 20200702
S15 20200703
其它仪器及试剂：
采用岛津LC-20AT超快速高效液相色谱仪，包括四元泵，在线脱气装置，自动进样器，DAD检测器，柱温箱，Chemstation工作站；AUW2200十万分之一天平（SHIMADZU岛津)；KQ250DB型数控超声波清洗器（巩义市予华仪器有限责任公司）；电热恒温水浴锅(上海喆图科学仪器有限公司)；KQ5200型水浴锅（昆山市超声仪器有限公司）。
乙腈(色谱纯)购自山东丰仓化工有限公司；磷酸(优级纯)购自济宁博诚化工有限公司；甲醇(优级纯)购自河北齐工环保科技有限公司。
实施例1采用HPLC法建立痛风立安颗粒内容物的指纹图谱
对照品溶液的制备：分别精密称定绿原酸1.72mg、迷迭香酸4.07mg、异嗪皮啶4.24mg及虎杖苷4.20mg，置于50ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，即得混合对照品溶液(0.1016mg/mL)。
供试品溶液制备：称取痛风立安颗粒内容物0.7g，精密称定，加甲醇20ml，称重，超声60分钟，超声处理时，超声波振荡发生器超声频率为38KHz；放冷，用甲醇补足失重，滤过，取续滤液备用。
指纹图谱的测定：吸取上述混合对照品溶液和痛风立安颗粒供试品溶液注入液相色谱仪，按照高效液相色谱法测定，得到痛风立安颗粒HPLC标准指纹图谱，其中测定色谱条件包括：
色谱柱为COSMOSILC18(5μm，2.5×460mm)，采用流动相A为乙腈，流动相B为0.1％磷酸水溶液，梯度洗脱程序见下表1；检测波长为320nm；柱温：40℃；流速：1.0ml/min，进样量10μL。
表2 HPLC梯度洗脱程序
表2
时间（min） 乙腈（%） 0.1%磷酸水溶液（%）
0~2 3 97
2~6 3~7 97~93
6~30 7~10 93~90
30~46 10~15 90~85
46~89 15~22 85~78
89~95 22~27 78~73
95~125 27~80 73~20
125~128 80~3 20~97
128~135 3 97
实施例2指纹图谱建立方法的方法学考察
1)精密度试验
采用和实施例1相同的操作和条件，精密量取同一供试品溶液，连续进样6次，考察色谱峰相对保留时间和相对峰面积的一致性。虎杖苷为参照峰，计算其中各个色谱峰相对保留时间和相对峰面积。
结果表明，各个色谱峰相对保留时间RSD≤0.1%，各个色谱峰相对峰面积RSD≤3.00%，符合指纹图谱要求。
2)稳定性考察
采用和实施例1相同的操作和条件，制备供试品溶液，室温密闭放置，分别在0h、16h、19h、36h、38h、41h进样分析，考察色谱峰相对保留时间和相对峰面积的一致性。以虎杖苷为参照峰，计算其中15个色谱峰相对保留时间和相对峰面积。
结果表明，相对保留时间RSD≤0.14%，相对峰面积RSD≤4.74%。表明供试品溶液在41h内基本稳定。
3)重复性试验
采用和实施例1相同的操作和条件，取同一批号样品，制备供试品溶液6份，考察色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的一致性。
结果表明，计算其中14个色谱峰相对保留时间RSD≤0.16%，相对峰面RSD≤4.20%，符合指纹图谱要求。
实施例3痛风立安颗粒的对照指纹图谱的建立
按照实施例1所述方法对S1至S15批次痛风立安颗粒进行分析测定，获得指纹图谱。
所获得指纹图谱中，共有化学成分吸收峰15个，其中单峰面积超过5％的吸收峰有12个，以7号峰为标准，其特征如下：
峰1，相对保留时间为0.1570，RSD为0.07%，相对峰面积为0.3235，RSD为0.56%；
峰2，相对保留时间为0.2473，RSD为0.05%，相对峰面积为0.0575，RSD为2.46%；
峰3，相对保留时间为0.3062，RSD为0.05%，相对峰面积为0.0591，RSD为3.00%；
峰4，相对保留时间为0.4664，RSD为0.04%，相对峰面积为0.0913，RSD为0.74%；
峰5，相对保留时间为0.5188，RSD为0.05%，相对峰面积为0.0812，RSD为0.91%；
峰6，相对保留时间为0.9528，RSD为0.01%，相对峰面积为0.0858，RSD为0.72%；
峰8，相对保留时间为1.1913，RSD为0.03%，相对峰面积为0.0834，RSD为0.54%；
峰9，相对保留时间为1.1245，RSD为0.03%，相对峰面积为0.0851，RSD为0.75%；
峰10，相对保留时间为1.2989，RSD为0.04%，相对峰面积为1.1765，RSD为0.93%；
峰11，相对保留时间为1.4413，RSD为0.03%，相对峰面积为0.1984，RSD为0.35%；
峰12，相对保留时间为1.5867，RSD为0.02%，相对峰面积为0.0723，RSD为0.65%；
峰13，相对保留时间为1.9455，RSD为0.03%，相对峰面积为0.0600，RSD为1.02%；
其中，单峰面积超过10％的吸收峰有2个：
峰10，相对保留时间为1.2989，RSD为0.04%，相对峰面积为1.1765，RSD为0.93%；
峰11，相对保留时间为1.4413，RSD为0.03%，相对峰面积为0.1984，RSD为0.35%；
其中，通过对所述痛风药物复方与全方药材的相关性研究，确认了所述痛风药物的化学成分：峰6为异嗪皮啶，峰11为迷迭香酸，峰7为虎杖苷，峰4为绿原酸。
痛风立安颗粒与组成复方的各个全方药材相关性研究：采用HPLC法，照痛风立安颗粒指纹图谱测定方法获取痛风立安颗粒供试品、各个药材样品以及其阴性复方供试品的指纹图谱，利用色谱峰保留时间相对偏差指标考察其相关性，对痛风立安颗粒化学指纹图谱的峰归属进行分析；在此基础上，取异嗪皮啶、迷迭香酸、虎杖苷、绿原酸对照品，制备单一成分的对照品溶液，分别照痛风立安颗粒指纹图谱测定方法获取指纹图谱，利用相同成分色谱峰保留时间的一致性确定各成分；经分析比较确定15个峰为共有峰来源，其中以52min处虎杖苷色谱峰为自身对照峰，峰4为绿原酸，约在24min出峰；峰6为异嗪皮啶，约在50min出峰；峰11为迷迭香酸，约在75min出峰；
用《中药色谱图的指纹谱评价系统》软件(2004A)进行色谱峰的匹配，计算了15批痛风立安颗粒的相似度，评价结果见表3。
15批痛风立安颗粒内容物的相似度评价结果见表3。
表3
样品号 S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10 S11 S12 S13 S14 S15
相似度 0.999 0.999 0.998 0.999 0.999 0.999 0.999 0.998 0.999 0.995 0.999 0.999 0.992 0.993 0.993
15批痛风立安颗粒的HPLC色谱结果的叠加图见图1。
将这15批痛风立安颗粒的HPLC色谱数据导入《中药色谱图的指纹谱评价系统》软件(2004A)中，进行色谱峰的匹配，软件自动生成痛风立安颗粒内容物的标准指纹图谱，见图2。
本发明提供的对照指纹图谱可以用于检测痛风药物(即痛风立安颗粒)的质量，可以计算待测样品的指纹图谱与对照指纹图谱的相似度，如相似度大于0.9以上，则为合格产品。
实施例4痛风立安颗粒的化学模式识别研究
1)聚类分析（HCA）和主成分分析（PCA）
将15批次痛风立安颗粒色谱图的15个共有峰峰面积，导入IBMSPSSStatistics软件进行组间聚类分析，样品间距离采用Euclidean距离法计算，将15个批次痛风立安颗粒进行分类。结果见图3，15个批次可分为2类，2019年批次样品为一类，2020年批次样品为一类，可见不同时间段制备的样品、不同批量的样品存在着一定的差异。
同时，对15个共有峰峰面积进行主成分因子分析，计算相关系数矩阵、主成分特征值、累积贡献率、主成分综合得分，对15批次痛风立安颗粒进行评价。结果如图4碎石图、表3所示，15个共有成分中，只有第1、2个成分的特征值较大（＞1）且连线较陡峭，累积方差贡献率91.587%，以因子的方差累计贡献率80%以上，第1、2个成分可整体反映指标80%以上的信息。
表4主成分因子的特征值和方差贡献率
表4
Figure DEST_PATH_IMAGE001
2)偏最小二乘法-判别分析（PLS-DA）
将共有的15个共有峰峰面积数据导入SIMCA13.0（Umetrics，Sweden）软件中进行PLS-DA等多变量统计分析。根据分布15批样品可分为2类，2019年批次样品为一类，2020年批次样品为一类，详见图5。
分类结果与聚类分析（HCA）结果一致。第1主成分的变量重要性投影（VIP）值（阈值＞1），质量稳定VIP值越大，表明对样品分类贡献越大，由图6可见，VIP值＞1的有12种成分，依次是色谱峰10、11（迷迭香酸）、13、9、14、3、5、1、7（虎杖苷）、15、4（绿原酸）、2，说明这12种成分是影响不同批次的差异性物质，在制备过程中应重点关注。
一种治疗痛风药物指纹图谱的建立方法，精密吸取对照品溶液和供试品溶液，分别注入高效液相色谱仪，依据所得的图谱，制定标准指纹图谱。以上述方法作为待测定痛风立安颗粒样品中虎杖、忍冬藤、肿节风等药材中一种或几种成分指纹图谱的测试手段，将待测定痛风立安颗粒样品指纹图谱与上述标准指纹图谱对比，计算相似度在0.992～0.999之间，能有效的鉴别样品的真伪，通过对主要指纹图谱特征峰的面积或比例的控制，能有效控制产品的质量，确保产品质量的稳定一致，从而保证产品安全有效；精密度高，重现性好。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (9)

1.一种治疗痛风药物指纹图谱的建立方法，所述治疗痛风药物由肿节风、虎杖、忍冬藤、车前草、粉萆薢、徐长卿、透骨草、甘草组成，其特征在于，所述建立方法包括采用高效液相色谱法检测所述治疗痛风药物成分，其中，所述高效液相色谱法的条件包括：
色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充材料，COSMOSILC18，5μm，2.5×460mm；
流动相：流动相A为乙腈，流动相B为体积分数为0.1%的磷酸水溶液，进行梯度洗脱，所述梯度洗脱程序如下，其中流动相比例均为体积百分比：
0～2min，流动相A为3%，流动相B为97%；
2～6min，流动相A为3%～7%，流动相B为97%～93%；
6～30min，流动相A为7%～10%，流动相B为93%～90%；
30～46min，流动相A为10%～15%，流动相B为90%～85%；
46～89min，流动相A为15%～22%，流动相B为85%～78%；
89～95min，流动相A为22%～27%，流动相B为78%～73%；
95～125min，流动相A为27%～80%，流动相B为73%～20%；
125～128min，流动相A为80%～3%，流动相B为20%～97%；
128～135min，流动相A为3%，流动相B为97%；
所述高效液相色谱法的条件还包括：
流速：1.0mL/min；柱温：40℃；
检测波长：320nm；
理论塔板数按虎杖苷峰计算，应不低于6000；并且
所述高效液相色谱法检测所述治疗痛风药物成分包括以下步骤：
（1）制备对照品溶液：分别称取绿原酸1.72mg、迷迭香酸4.07mg、异嗪皮啶4.24mg及虎杖苷4.20mg，将称取的绿原酸、迷迭香酸、异嗪皮啶及虎杖苷置于50ml容量瓶中，再加甲醇溶解并稀释至刻度，作为混合对照品溶液；
（2）制备供试品溶液：取所述治疗痛风药物0.5～1.0g，置于锥形瓶中，加入甲醇18～22ml，称重，超声处理0.8～1.2h，放冷，用甲醇补足失重，滤过，取续滤液即得；
（3）测定：精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl注入高效液相色谱仪，根据所述高效液相色谱法的色谱条件进行测定，得到指纹图谱。
2.根据权利要求1所述的一种治疗痛风药物指纹图谱的建立方法，其特征在于，所述步骤（2）中取所述治疗痛风药物0.8g，置于锥形瓶中，加入甲醇20ml，称重，超声处理1h，放冷，用甲醇补足失重，滤过，取续滤液即得。
3.根据权利要求1所述的一种治疗痛风药物指纹图谱的建立方法，其特征在于，所述步骤（2）中超声处理时，超声波振荡发生器超声频率为35～40KHz。
4.根据权利要求3所述的一种治疗痛风药物指纹图谱的建立方法，其特征在于，所述步骤（2）中超声处理时，超声波振荡发生器超声频率为38KHz。
5.根据权利要求1所述的一种治疗痛风药物指纹图谱的建立方法，其特征在于，所述建立方法得到的指纹图谱中共有15个吸收峰，其中峰7为虎杖苷，各峰以峰7为参照峰的相对保留时间和相对峰面积如下：
相对保留时间：
峰1：0.1569～0.1571；峰2：0.42471～0.2474；峰3：0.3060～0.3065；峰4：0.4663～0.4666；峰5：0.5185～0.5191；峰6：0.9527～0.9530；峰7：1.000；峰8：0.1910~0.1917；峰9：1.1239～1.1249；峰10：1.2979～1.2992；峰11：1.4405～1.4417；峰12：1.5862～1.5870；峰13：1.9447～1.9461；峰14：2.0888～2.0904；峰15：0.2929~0.2947；
相对峰面积：
峰1：0.3215～0.3252；峰2：0.0561～0.0602；峰3：0.0577～0.0626；峰4：0.0902～0.0920；峰5：0.0802～0.0821；峰6：0.0850～0.0868；峰7：1.0000；峰8：0.0828~0.0841；峰9：0.0843～0.0851；峰10：0.1740~0.1782；峰11：0.1976~0.1994；峰12：0.0716~0.0728；峰13：0.0589~0.0605；峰14：0.0204~0.0211；峰15：0.0266~0.0267。
6.根据权利要求1-5任意一项所述的一种治疗痛风药物指纹图谱的建立方法，其特征在于，所述指纹图谱的吸收峰中，单峰面积超过5%的吸收峰有12个：
峰1，相对保留时间为0.1570，RSD为0.07%，相对峰面积为0.3235，RSD为0.56%；
峰2，相对保留时间为0.2473，RSD为0.05%，相对峰面积为0.0575，RSD为2.46%；
峰3，相对保留时间为0.3062，RSD为0.05%，相对峰面积为0.0591，RSD为3.00%；
峰4，相对保留时间为0.4664，RSD为0.04%，相对峰面积为0.0913，RSD为0.74%；
峰5，相对保留时间为0.5188，RSD为0.05%，相对峰面积为0.0812，RSD为0.91%；
峰6，相对保留时间为0.95288，RSD为0.01%，相对峰面积为0.0858，RSD为0.72%；
峰8，相对保留时间为1.1913，RSD为0.03%，相对峰面积为0.0834，RSD为0.54%；
峰9，相对保留时间为1.1245，RSD为0.03%，相对峰面积为0.0851，RSD为0.75%；
峰10，相对保留时间为1.2989，RSD为0.04%，相对峰面积为1.1765，RSD为0.93%；
峰11，相对保留时间为1.4413，RSD为0.03%，相对峰面积为0.1984，RSD为0.35%；
峰12，相对保留时间为1.5867，RSD为0.02%，相对峰面积为0.0723，RSD为0.65%；
峰13，相对保留时间为1.9455，RSD为0.03%，相对峰面积为0.0600，RSD为1.02%。
7.根据权利要求1-5任意一项所述的一种治疗痛风药物指纹图谱的建立方法，其特征在于，所述指纹图谱的吸收峰中，单峰面积超过10%的吸收峰有2个：
峰10，相对保留时间为1.2989，RSD为0.04%，相对峰面积为1.1765，RSD为0.93%；
峰11，相对保留时间为1.4413，RSD为0.03%，相对峰面积为0.1984，RSD为0.35%。
8.根据权利要求5所述的一种治疗痛风药物指纹图谱的建立方法，其特征在于，所述指纹图谱的吸收峰中，峰6、峰11归属于所述治疗痛风药物中的肿节风，峰7归属于虎杖，峰4归属于忍冬藤；
并且，其中峰6为异嗪皮啶，峰11为迷迭香酸，峰7为虎杖苷，峰4为绿原酸。
9.一种检测治疗痛风药物的方法，所述治疗痛风药物由肿节风、虎杖、忍冬藤、车前草、粉萆薢、徐长卿、透骨草、甘草组成，其特征在于，所述方法包括根据权利要求1至5中任一项所述方法建立待测样品指纹图谱并与根据所述方法建立的标准指纹图谱比较。
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