CN102426211A - 大麦籽粒中酚酸类化合物的定量测定方法 - Google Patents

Abstract

一种大麦籽粒中酚酸类化合物的定量测定方法，本发明针对酚酸的理化性质采用一定浓度的甲醇水溶液提取大麦籽粒中的酚酸类化合物，然后将提取液离心、浓缩、过滤，取制备好的样品提取液上机，用甲醇—甲酸水溶液进行洗脱分离。本发明的分析方法准确、简便，灵敏度高，选择性、重复性好，在一次性测定大麦籽粒中酚酸类化合物的种类上比较全面，而且分析时间与以往方法相比大大缩短，可以满足生产中对大麦籽粒中酚酸类化合物进行大批量快速测定和评价的基本要求，适用于任何大麦品种的籽粒。

Description

大麦籽粒中酚酸类化合物的定量测定方法

技术领域

本发明属于农业领域，尤其是涉及一种大麦籽粒中酚酸类化合物的定量测定方法。

背景技术

酚酸是指具有某种羧酸功能的酚类，它是植物中仅次于黄酮类化合物的第二大次生代谢物，也是谷物中主要的结合态酚。酚酸是一种良好的抗氧化剂，广泛应用于医药和保健领域，具有预防心血管疾病、抗癌、抗菌、消炎、抗突变和抗艾滋病病毒等多种生物活性。

大麦是一种在世界范围内广泛种植的作物，价格低廉，目前主要用作饲料工业和酿造啤酒的原料。大麦籽粒中酚酸类化合物含量较高且种类丰富，其组成成分主要有没食子酸、原儿茶酸、对羟基苯甲酸、间羟基苯甲酸、香草酸、丁香酸、藜芦酸、水杨酸、间没食子酰没食子酸、绿原酸、咖啡酸、对香豆酸、邻香豆酸、阿魏酸等，因此，将大麦作为一种提取天然酚酸的重要原材料具有独特的优势，这一产业的发展前景十分广阔。另外，原料大麦中的酚酸是啤酒多酚的重要来源，对啤酒的质量有着很大的影响，对原料大麦籽粒中的酚酸类化合物进行测定十分必要。因此，建立一种简单、快速测定大麦籽粒中酚酸类化合物含量的方法十分重要。

目前，大麦籽粒中酚酸类化合物的测定方法主要有高效液相色谱法、毛细管电泳、薄层色谱法、气相色谱法等。毛细管电泳重现性差，薄层色谱操作复杂且灵敏度较低，气相色谱检测酚酸类化合物需要进行衍生化处理，而高效液相色谱法操作简单、重现性好、灵敏度高、准确度高，在大麦籽粒中酚酸类化合物的检测中应用最为广泛。但是以往大多数高效液相色谱法分析的大麦籽粒酚酸类化合物成分均较少，而当所分析的成分较多时，往往分析条件复杂，分析时间较长，从而使分析成本大大增加，不利于大批量样品的测定。因此，有必要建立一种简单、快速、测定酚酸种类齐全的大麦籽粒中酚酸类化合物的测定方法，以利于生产企业的原料质量评价。

发明内容

本发明的目的是提供一种方法准确、简便、灵敏度高、选择性、重复性好、快速，可以满足生产中对大麦籽粒中酚酸类化合物进行大批量快速测定和评价的基本要求，适用于任何大麦品种的酚酸类化合物的定量测定方法。

本发明主要分析方法步骤如下：

1、样品预处理

大麦籽粒烘干，粉碎，精确称取一定量粉碎后的大麦粉，按液固比40:1~60:1加入浓度为40~95%用0.2NHCl调节PH值至4.2的甲醇水溶液，并加入重量为大麦粉样品重量的1/10~1/20抗坏血酸作为抗氧化剂，在超声频率25~85KHz、超声功率300~600W、50~75℃条件下提取30~50min，然后迅速冰浴以终止酸解，4000~5000g离心，上清液旋转蒸发至近干，残余物用甲醇溶解，15000~18000g离心，上清液于棕色容量瓶中定容，进样前用微孔滤膜过滤；

2、色谱条件：

（1）色谱柱：以高纯硅胶为填充剂的反相C18色谱柱；

（2）检测器：紫外检测器；

（3）检测波长：270-280nm；

（4）流动相：采用甲醇－甲酸水溶液做为流动相，流动相A为100%甲醇，流动相B为浓度0.1%-2%甲酸水溶液，HPLC分析前经真空脱气，采用梯度洗脱，洗脱程序为0-20min，25%-50%B；20-22min，50%-25%B；22-27min，25%B；

（5）流速：0.6~0.8mL/min；

（6）柱温：40~50℃；

3、浓度计算方法

用酚酸类化合物标准品，包括没食子酸、原儿茶酸、绿原酸、对羟基苯甲酸、咖啡酸、香草酸、丁香酸、间羟基苯甲酸、对香豆酸、阿魏酸、藜芦酸、邻香豆酸和水杨酸等13种配制成一定梯度浓度的混合标准溶液，取5~20μl进样，按外标法，以峰面积-浓度做线性回归，得出线性回归方程，利用该方程和测得的样品提取液中酚酸类化合物的峰面积计算样品提取液中酚酸类化合物的浓度；

4、样品检测

（1）按照1中的方法进行样品预处理，取处理好的样品提取液5~20μl进样，为保证根据保留时间定性的准确性，可在每一批次样品检测的过程中取5~20μl一定浓度的混合标准品溶液一起进样；

（2）按照2中的色谱条件进行检测，分别得到样品提取液和混合标准品的色谱图，将样品提取液色谱图和同一批次检测的混合标准品色谱图进行比较，样品提取液色谱图中与标准品保留时间相近误差范围：标准品保留时间±0.5min的色谱峰即为相应的酚酸类化合物成分；

（3）将样品提取液中酚酸类化合物各成分的色谱峰面积代入3中的线性回归方程中，计算样品提取液中酚酸类化合物各成分的浓度；

5、大麦籽粒样品中酚酸类化合物成分含量的计算

通过以下公式计算大麦籽粒样品中酚酸类化合物成分的含量：

式中：

W—大麦籽粒样品中酚酸类化合物成分的含量，mg/kg；

C—样品提取液中酚酸类化合物成分的浓度，mg/mL；

V—样品提取液的最终定容体积，mL；

m—大麦籽粒样品重量，g。

本发明的分析方法准确、简便，灵敏度高，选择性、重复性好，在一次性测定大麦籽粒中酚酸类化合物的种类上比较全面，而且分析时间与以往方法相比大大缩短，可以满足生产中对大麦籽粒中酚酸类化合物进行大批量快速测定和评价的基本要求，适用于任何大麦品种的籽粒。

附图说明

图1是13种酚酸的保留时间、回归方程和相关系数。

图2是12个大麦品种（系）籽粒中各酚酸类化合物成分的含量。

图3是大麦籽粒样品酚酸类化合物提取液的色谱图之一。

图4是酚酸类化合物混合标准品的色谱图。

图中所标注的各色谱峰分别为：1、没食子酸；2、原儿茶酸；3、绿原酸；4、对羟基苯甲酸；5、咖啡酸；6、香草酸；7、丁香酸；8、间羟基苯甲酸；9、对香豆酸；10、阿魏酸；11、藜芦酸；12、邻香豆酸；13、水杨酸。

具体实施方式

实施例1：

1材料

1.1仪器

安捷伦LC1200高效液相色谱仪：包括Agilent1200四元泵带在线脱气机、1200系列自动样品管理系统、智能化柱温箱、1200可编程可变波长紫外检测器和安捷伦化学工作站B.04.01版色谱数据处理系统；SUPELCOAscentis^??C18色谱柱（150mm×4.6mm，5μm）。

1.2试剂和样品

无水甲醇和无水甲酸为Fisher公司产品；超纯水由实验室专用超纯水机（台湾艾柯成都康宁实验专用纯水设备厂）制取。没食子酸、原儿茶酸、绿原酸、对羟基苯甲酸、咖啡酸、香草酸、丁香酸、间羟基苯甲酸、对香豆酸、阿魏酸、藜芦酸、邻香豆酸和水杨酸等13种酚酸标准品均购自Sigma公司，纯度95%以上。

供试样品为12个大麦品种（系），即2B98-5754-d、2B98-5754-c、99PD10、Z173U047V、G061T006U、G065T007U、94PJ107、A-6、Empress、Fallon、Nobell、Jaeger的籽粒。所有材料均在2009年3月20日种植于石河子大学农学院试验站，管理措施同大田，2009年7月2日成熟期收获籽粒供试。

1.3标准品储备液

精密称取13种酚酸类化合物标准品各100.00mg混合置于50mL容量瓶中，加少许无水甲醇溶解，并用甲醇定容至刻度，摇匀，配制成浓度为2.00mg/mL的混合标准液作为储备液，于-20℃冰箱中存放备用。

2方法

2.1色谱条件

色谱柱：SUPELCOAscentis^??C18色谱柱（150mm×4.6mm，5μm）；

检测器：可变波长紫外检测器；

检测波长：275nm；

流动相：采用甲醇－甲酸水溶液做为流动相。流动相A为100%甲醇，流动相B为0.1%甲酸水溶液，HPLC分析前经真空脱气。采用梯度洗脱，洗脱程序为0-20min，25%-50%B；20-22min，50%-25%B；22-27min，25%B。

流速：0.7mL/min；

柱温：40℃；

2.2样品预处理

大麦籽粒80℃下烘干24h，粉碎，精确称粉碎后的大麦粉2.000g，加入120mL80%甲醇水溶液（用0.2NHCl调节PH值至4.2），并加入0.2g抗坏血酸作为抗氧化剂，在超声频率45KHz、超声功率500W、70℃条件下提取40min，然后迅速冰浴10min以终止酸解，4000g离心15min，上清液旋转蒸发至近干，残余物用甲醇溶解，15000g离心10min，上清液于棕色容量瓶中定容至10mL，进样前过0.45μm微孔滤膜。

2.3样品检测

取10μl样品提取液进样，利用2.1中的色谱条件进行检测，获得样品提取液的色谱图（图3）。再取1.3中的混合标准品储备液稀释至200μg/mL的浓度，取10μl进样，同样检测条件下，获得混和标准品的色谱图（图4）。

2.4标准曲线制作

用无水甲醇将1.3中的混合标准品储备液稀释成如下浓度梯度的混合标准品溶液：4μg/mL、40μg/mL、80μg/mL、160μg/mL、240μg/mL、320μg/mL、400μg/mL，取各浓度的混合标准品溶液10μl进样，得到各浓度下各酚酸类化合物成分的峰面积，做峰面积（A）—浓度（C）标准曲线，得到其线性回归方程。

2.5大麦籽粒样品中酚酸类化合物成分含量的计算

将大麦籽粒样品提取液各酚酸类化合物成分的色谱峰面积代入相应的线性回归方程中，计算得样品提取液中各酚酸类化合物成分的浓度，再按如下公式计算大麦籽粒样品中各酚酸类化合物成分的含量：

式中：

W—大麦籽粒样品中酚酸类化合物成分的含量，mg/kg；

C—样品提取液中酚酸类化合物成分的浓度，mg/mL；

V—样品提取液的最终定容体积，mL；

m—大麦籽粒样品重量，g。

3结果分析

从酚酸类化合物混合标准品的色谱图（图4）可以看出，利用2.1中的色谱条件所得到的没食子酸、原儿茶酸、绿原酸、对羟基苯甲酸、咖啡酸、香草酸、丁香酸、间羟基苯甲酸、对香豆酸、阿魏酸、藜芦酸、邻香豆酸和水杨酸标准品的保留时间依次为：2.90min、4.53min、5.52min、6.98min、7.72min、7.98min、8.43min、9.02min、11.42min、12.47min、13.44min、17.48min和18.55min，所有组分在20min内得到了很好的分离。从表3可以看出，12个大麦品种（系）籽粒中含量最高的酚酸类化合物均为原儿茶酸，咖啡酸均未检测到，不同品种（系）大麦籽粒中各酚酸类化合物成分的含量差异显著。利用本方法可以准确地检测到不同品种大麦籽粒中酚酸类化合物含量的差异，从而为大麦制品生产企业的原料质量控制和评价提供了科学的理论和方法依据。 

Claims (3)

1.一种大麦籽粒中酚酸类化合物的定量测定方法，其特征在于主要测定方法步骤如下：

一、样品预处理

大麦籽粒烘干，粉碎，精确称取一定量粉碎后的大麦粉，按液固比40:1~60:1加入浓度为40~95%用0.2NHCl调节PH值至4.2的甲醇水溶液，并加入重量为大麦粉样品重量的1/10~1/20抗坏血酸作为抗氧化剂，在超声频率25~85KHz、超声功率300~600W、50~75℃条件下提取30~50min，然后迅速冰浴以终止酸解，4000~5000g离心，上清液旋转蒸发至近干，残余物用甲醇溶解，15000~18000g离心，上清液于棕色容量瓶中定容，进样前用微孔滤膜过滤；

二、色谱条件：

（1）色谱柱：以高纯硅胶为填充剂的反相C18色谱柱；

（2）检测器：紫外检测器；

（3）检测波长：270-280nm；

（4）流动相：采用甲醇－甲酸水溶液做为流动相，流动相A为100%甲醇，流动相B为浓度0.1%-2%甲酸水溶液，HPLC分析前经真空脱气，采用梯度洗脱，洗脱程序为0-20min，25%-50%B；20-22min，50%-25%B；22-27min，25%B；

（5）流速：0.6~0.8mL/min；

（6）柱温：40~50℃；

三、浓度计算方法

用酚酸类化合物标准品，包括没食子酸、原儿茶酸、绿原酸、对羟基苯甲酸、咖啡酸、香草酸、丁香酸、间羟基苯甲酸、对香豆酸、阿魏酸、藜芦酸、邻香豆酸和水杨酸等13种配制成一定梯度浓度的混合标准溶液，取5~20μl进样，按外标法，以峰面积-浓度做线性回归，得出线性回归方程，利用该方程和测得的样品提取液中酚酸类化合物的峰面积计算样品提取液中酚酸类化合物的浓度；

四、样品检测

（1）按照1中的方法进行样品预处理，取处理好的样品提取液5~20μl进样；

（2）按照2中的色谱条件进行检测，分别得到样品提取液和混合标准品的色谱图，将样品提取液色谱图和同一批次检测的混合标准品色谱图进行比较，样品提取液色谱图中与标准品保留时间相近误差范围：标准品保留时间±0.5min的色谱峰即为相应的酚酸类化合物成分；

（3）将样品提取液中酚酸类化合物各成分的色谱峰面积代入3中的线性回归方程中，计算样品提取液中酚酸类化合物各成分的浓度；

五、大麦籽粒样品中酚酸类化合物成分含量的计算

通过以下公式计算大麦籽粒样品中酚酸类化合物成分的含量：

式中：

W—大麦籽粒样品中酚酸类化合物成分的含量，mg/kg；

C—样品提取液中酚酸类化合物成分的浓度，mg/mL；

V—样品提取液的最终定容体积，mL；

m—大麦籽粒样品重量，g。

2.如权利要求1所述的大麦籽粒中酚酸类化合物的定量测定方法，其特征在于所述的样品预处理中所用的超声频率为45~50KHz。

3.如权利要求1或2所述的大麦籽粒中酚酸类化合物的定量测定方法，其特征在于所述的样品预处理中所用的超声功率为500~550W。

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