CN106153418A - 一种丙交酯标准物质及其制备方法和检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种丙交酯标准物质的制备方法，包括:加热下将丙交酯加热，待溶液冷却结晶后过滤得到结晶产物，减压干燥，其中溶解是取丙交酯原料置于三颈烧瓶中，添加1‑2倍原料重醇类或酯类溶剂的一种或多种，经50～80℃水浴加热使完全搅拌溶解后静置保温20‑40min；再对溶液在3‑10℃条件下冷却，析晶1‑3小时。本发明制备工艺流程简单,操作方便,丙交酯纯度达99％以上,符合国家标准物质的要求，制得的标准物质均匀性好，准确度和稳定性高，具备溯源性与量值传递功能，而且可批量生产。

Description

一种丙交酯标准物质及其制备方法和检测方法

技术领域

本发明涉及计量测试的量值传递领域，特备涉及丙交酯标准物质及其计量测试的量值传递。

背景技术

丙交酯是合成聚乳酸的中间体，主要用于生产医用高聚乳酸，环酯化剂，是一种国内外公认的最具发展潜力的无毒高分子化合物和生物材料，具有良好生物相容性、降解产物可参与人体的新陈代谢等优点，被广泛用于外科手术缝线、药物缓释胶囊、骨科内固定材料等，是经美国食品和药物管理局(FDA)批准可用于人体的可降解聚合物材料，丙交酯做为合成聚乳酸的中间体亦具有重要的应用价值。因此提高丙交酯的纯度质量的控制对拓宽聚乳酸的应用领域具有重要作用，对医药行业及国内外严重的“白色污染问题”具有重大现实意义。

标准物质作为各类检测目标化合物量值溯源的实物载体发挥着极重要的作用，成为了众多学者争相研究的热点。但是，国内目前没有丙交酯的法定标准物质，既然丙交酯应用广泛，为迎合市场需求，并且便于相关企事业单位的分析方法确认评价、仪器校准、质量控制等，研制丙交酯标准物质十分必要。

现有技术中，有大量关于丙交酯纯化及精制的工艺和方法，例如申请号为201010180379.0《丙交酯连续高真空精馏提纯方法》公开了一种丙交酯精制方法，但该方法工艺设备均较为复杂；有如申请号为200510094845.2《一种丙交酯重结晶的方法》、申请号为200710302479.4《丙交酯的提纯方法》公开了丙交酯纯化方法，产品的得率有了一定的提高，但其纯度均未能达到标准物质级，因此，仍需要一种能够通过简单方法制备并大规模生产丙交酯标准物质的方法，需经过严格结构检测、均匀性检测、稳定性检测以及联合定值检测。

发明内容

针对现有技术中并无丙交酯纯度物质供应的现状，本发明提供了由丙交酯粗品制备高纯度丙交酯标准物质的方法以及丙交酯标准物质的质量检测，采用本发明的制备方法能够快速简便获得纯度高达99％以上的丙交酯，能够满足标准物质的纯度要求，很好的解决了现有技术中并无丙交酯纯度物质的的问题。

本发明的目的是提高一种可用作标准物质的丙交酯的制备方法，其含有纯度≥99.7％的丙交酯，该产品均匀性好，准确度和稳定性高，该方法操作简捷，工艺简便，可大批量生产，使用的方法严谨，具备溯源性与量值传递功能。

本发明所提供的丙交酯标准物质，是按照包括以下步骤制备的：(1)溶解、(2)析晶、(3)过滤、(4)干燥和(5)混匀及均匀性预检。

步骤(1)所述的溶解方法为：取丙交酯原料置于三颈烧瓶中，添加1-2倍原料重醇类或酯类溶剂的一种或多种，经50～80℃水浴加热使完全搅拌溶解后静置保温20-40min。步骤(2)所述析晶方法为：将上述溶液置3-10℃条件下冷却，析晶1-3小时。步骤(3)所述过滤方法为：砂芯漏斗抽滤，结晶物用1/8～1/5倍原料量溶剂润洗1-4次，将结晶物置于托盘中，室温条件下挥干溶剂。步骤(4)所述干燥方法为真空减压干燥,干燥温度为30-60℃，真空度为-0.08～-0.09Mpa，干燥时间为10-24h。步骤(5)所述混匀及均匀性预检方法为:将干燥好的的丙交酯样品，置于玻璃烧杯中，搅拌、混匀在产物的的上部、中部、下部三个部位分别取样，共取9份样品，供下述含量测定合格。

本丙交酯标准物质是在进行均匀性预检，判断分布均匀后进行分装、并经结构确证、均匀性检验、稳定性检验、定值以及不确定度评定筛选后获得。

本标准物质，均匀性检查是采用气相色谱法测定，以丙交酯的含量作为指标，考察样品瓶内以及瓶间的均匀性情况，数据用方差分析法(F检验法)处理并判定。即取本品适量，精密称定，加色谱乙腈稀释制成每1ml中约含2mg的溶液，摇匀，分别量取1μl，注入气相色谱仪，测定，并以面积归一化法计算含量。

在上、中、下3组样品的测定结果中进行了最大值和最小值的异常值检验。依据Pearson-Stephens检验，计算极差(R)和标准偏差(S)的比值R/S，当该值大于Pearson-Stephens表中的舍弃界限值时，则认为测定的最大值或最小值为异常值，即样品的含量分布不均匀。反之即判断为均匀。

$\frac{R}{S}=\frac{x_n-x_1}{\sqrt{\frac{\mathrm{\Σ}{(x_i-\stackrel{\‾}{x})}^2}{n-1}}}$

上述丙交酯标准物质采用红外光谱、紫外光谱、质谱、核磁氢谱和核磁碳谱进行结构确证，确证其结构为丙交酯。

上述丙交酯标准物质瓶间和瓶内随机抽样取样，采用气相色谱法测定，以面积归一化法计算丙交酯的含量作为指标，考察样品瓶间以及瓶内的均匀性情况，数据用方差分析法(F检验法)处理。S₁为瓶间方差，即标准物质的不均匀误差和测定方法的随机误差的综合，S₂为瓶内方差，即测定方法的随机误差的近似值，若(F_0.05是5％显著水平下的临界值)，则认为标准物质的均匀性符合标准物质的要求。若则认为其均匀性不符合要求。其中，瓶间方差的计算公式如下：

$S_1^2=\frac{\underset{i=1}{\overset{m}{\Σ}}{n}_i{({\stackrel{\‾}{X}}_i-\stackrel{\‾}{\stackrel{\‾}{X}})}^2}{(m-1)}$

—均匀性检验中所得的瓶间方差；

—m个单元测量结果的总平均值；

—第i个瓶内的测定平均值；

n—每一瓶内重复测定的次数；

m—均匀性检验抽取的单元数

瓶内方差的计算公式如下：

$S_2^2=\frac{\underset{i=1}{\overset{m}{\Σ}}\underset{j=1}{\overset{n}{\Σ}}{(X_{ij}-{\stackrel{\‾}{X}}_i)}^2}{m(n-1)}$

—均匀性检验中所得的瓶内方差；

X_ij—第i个瓶内的第j个测定值；其余符号意义同前。

设定短期和长期稳定性试验的相应条件，通过气相色谱法考察丙交酯含量变化情况，采取平均值的一致性检验方法评价上述丙交酯标准物质的稳定性，分别采用t检验法及直线拟合法处理分析试验数据，其中，

$t=\frac{|\stackrel{\‾}{x_1}-\stackrel{\‾}{x_2}|}{s_{(\stackrel{\‾}{x_1}-\stackrel{\‾}{x_2})}}=\frac{|\stackrel{\‾}{x_1}-\stackrel{\‾}{x_2}|}{\sqrt{\frac{\underset{j=1}{\overset{n}{\Σ}}{(x_{1j}-\stackrel{\‾}{x_1})}^2+\underset{j=1}{\overset{n}{\Σ}}{(x_{2j}-\stackrel{\‾}{x_2})}^2}{n(n-1)}}}$

若t＜t_临界值，说明两者的均值一致，样品稳定；反之则说明样品不稳定。

以时间为X轴，以样品含量为Y轴，描绘出含量与时间的关系。斜率可用下式计算：

$b_1=\frac{\underset{i=1}{\overset{n}{\Σ}}(X_i-\stackrel{\‾}{X})(Y_i-\stackrel{\‾}{Y})}{\underset{i=1}{\overset{n}{\Σ}}{(X_i-\stackrel{\‾}{X})}^2}$

截距由下式计算：

直线之中的点的标准差可由下式计算：

$S^2=\frac{\underset{i=1}{\overset{n}{\Σ}}{(Y_i-b_0-b_1{X}_i)}^2}{n-2}$

与斜率有关的不确定度用下式计算：

$S\left(b_1\right)=\frac{S}{\sqrt{\underset{i=1}{\overset{n}{\Σ}}{(X_i-\stackrel{\‾}{X})}^2}}$

若|b₁|＜t_0.95,n-2*S(b₁)，表明斜率是不显著的，未观测到不稳定性，反之则说明不稳定。

采用单个实验室多种定值方法的方式对上述丙交酯标准物质进行定值，即气相色谱法(GC-FID)和差示扫描量热法(DSC)，并通过方法学验证确定试验条件。

气相色谱法定值为扣除水分和炽灼残渣的含量值，计算公式为P＝(1-W_水分-W_残渣)P_气相

差示扫描量热法定值用自带纯度分析软件分析。

用t检验法(参见8)检查两种方法所测值的一致性，若t＜t_临界值，则气相色谱法与差示扫描量热法所得数据是一致的。

本标准物质所采用的方法均为满足计量学特性的通用方法。所使用的测量仪器和玻璃仪器均经过湖南省质量技术监督局和广州广电计量检测股份有限公司的计量检定，保证了数据的溯源性。

上述丙交酯标准物质的不确定度包括定值方法引入的不确定度、均匀性引入的不确定度和稳定性引入的不确定度。定值方法引入的不确定度又包括水分、炽灼残渣测定引入的不确定度和气相色谱法、差示扫描量热法引入的不确定度。合成上述丙交酯标准物质的不确定度分量，取扩展因子k＝2(置信概率95％)，计算扩展不确定度。

本发明的丙交酯标准物质的检测方法，以及上述方法制备的丙交酯标准物质的检测方法，其包括以下步骤：结构检测、测定丙交酯含量的气相色谱法、均匀性检测、稳定性检测、以及气相色谱法和差示扫描量热法联合定值检测。并进一步包括定值以及不确定度检测方法。

上述丙交酯标准物质采用红外光谱、紫外光谱、质谱、核磁氢谱和核磁碳谱进行结构确证，确证其结构为丙交酯。

上述气相色谱法测定法：仪器：气相色谱仪岛津GC2010-Plus；检测器：FID；色谱柱：HP-5(30m×0.32mm×0.25μm)；

b)色谱条件：进样口温度：250℃；检测器温度：300℃；

柱温：初始温度60℃保持2min后，以10℃/min的速率升温至120℃，保持4min。

压力：50kPa保持2分钟，以10kPa/min的速率升压至100kPa，保持5分钟；

分流比：10:1；进样方式：直接进样，进样量1μl。

上述均匀性检测方法，上述丙交酯标准物质瓶间和瓶内随机抽样取样，采用气相色谱法测定，以面积归一化法计算丙交酯的含量作为指标，计算样品瓶间以及瓶内的均匀性情况，数据用方差分析法(F检验法)处理。S₁为瓶间方差，即标准物质的不均匀误差和测定方法的随机误差的综合，S₂为瓶内方差，即测定方法的随机误差的近似值，其中若(F_0.05是5％显著水平下的临界值)，则认为标准物质的均匀性符合标准物质的要求，选取作为标准物质。若则认为其均匀性不符合要求。其中，瓶间方差的计算公式如下：

$S_1^2=\frac{\underset{i=1}{\overset{m}{\Σ}}{n}_i{({\stackrel{\‾}{X}}_i-\stackrel{\‾}{\stackrel{\‾}{X}})}^2}{(m-1)}$

—均匀性检验中所得的瓶间方差；

—m个单元测量结果的总平均值；

—第i个瓶内的测定平均值；

n—每一瓶内重复测定的次数；

m—均匀性检验抽取的单元数

瓶内方差的计算公式如下：

$S_2^2=\frac{\underset{i=1}{\overset{m}{\Σ}}\underset{j=1}{\overset{n}{\Σ}}{(X_{ij}-{\stackrel{\‾}{X}}_i)}^2}{m(n-1)}$

—均匀性检验中所得的瓶内方差；

X_ij—第i个瓶内的第j个测定值；其余符号意义同前。

上述稳定性检测方法：设定短期和长期稳定性试验的相应条件，通过气相色谱法考察丙交酯含量变化情况，采取平均值的一致性检验方法评价上述丙交酯标准物质的稳定性，分别采用t检验法及直线拟合法处理分析试验数据，其中，

$t=\frac{|\stackrel{\‾}{x_1}-\stackrel{\‾}{x_2}|}{s_{(\stackrel{\‾}{x_1}-\stackrel{\‾}{x_2})}}=\frac{|\stackrel{\‾}{x_1}-\stackrel{\‾}{x_2}|}{\sqrt{\frac{\underset{j=1}{\overset{n}{\Σ}}{(x_{1j}-\stackrel{\‾}{x_1})}^2+\underset{j=1}{\overset{n}{\Σ}}{(x_{2j}-\stackrel{\‾}{x_2})}^2}{n(n-1)}}}$

其中标准物质的稳定性t＜t_临界值。若t＜t_临界值，说明两者的均值一致，样品稳定，；反之则说明样品不稳定。

以时间为X轴，以样品含量为Y轴，描绘出含量与时间的关系。斜率可用下式计算：

$b_1=\frac{\underset{i=1}{\overset{n}{\Σ}}(X_i-\stackrel{\‾}{X})(Y_i-\stackrel{\‾}{Y})}{\underset{i=1}{\overset{n}{\Σ}}{(X_i-\stackrel{\‾}{X})}^2}$

截距由下式计算：

直线之中的点的标准差可由下式计算：

$S^2=\frac{\underset{i=1}{\overset{n}{\Σ}}{(Y_i-b_0-b_1{X}_i)}^2}{n-2}$

与斜率有关的不确定度用下式计算：

$S\left(b_1\right)=\frac{S}{\sqrt{\underset{i=1}{\overset{n}{\Σ}}{(X_i-\stackrel{\‾}{X})}^2}}$

若|b₁|＜t_0.95,n-2*S(b₁)，表明斜率是不显著的，未观测到不稳定性，选择|b₁|＜t_0.95,n-2*S(b₁)作为标准物质，反之则说明不稳定。

采用单个实验室多种定值方法的方式对上述丙交酯标准物质进行定值，即气相色谱法(GC-FID)和差示扫描量热法(DSC)，并通过方法学验证确定试验条件。

气相色谱法定值为扣除水分和炽灼残渣的含量值，计算公式为P＝(1-W_水分-W_残渣)P_气相。

差示扫描量热法定值用自带纯度分析软件分析。

用t检验法(参见8)检查两种方法所测值的一致性，该方法中t＜t_临界值。若t＜t_临界值，则气相色谱法与差示扫描量热法所得数据是一致的，并选择t＜t_临界值作为标准物质。

上述丙交酯标准物质的不确定度包括定值方法引入的不确定度、均匀性引入的不确定度和稳定性引入的不确定度。定值方法引入的不确定度又包括水分、炽灼残渣测定引入的不确定度和气相色谱法、差示扫描量热法引入的不确定度。合成上述丙交酯标准物质的不确定度分量，取扩展因子k＝2(置信概率95％)，计算扩展不确定度。

实施例1

丙交酯标准物质的制备:

(1)溶解方法：取丙交酯原料300g，置于1000mL的三颈烧瓶中，加无水乙酸乙酯400ml，搅拌，置65℃水浴加热使完全溶解，并保温30min。

(2)析晶方法：将上述溶液置4℃条件下冷却，析晶2小时。

(3)滤过方法：取上述析晶液，用砂芯漏斗抽滤，结晶物用无水乙酸乙酯50ml，分3次润洗，将结晶物置于托盘中，室温条件下挥干溶剂。

(4)干燥方法：将结晶物置于真空烘箱中，于40℃，-0.085Mpa下，减压干燥20小时，得精制丙交酯。

(5)混匀方法：将上述干燥好的的丙交酯样品，置于玻璃烧杯中，搅拌、混匀，制得成品量约为240g。

(6)均匀性预检：取上述混合均匀的丙交酯样品进行均匀性预检，检验合格后进行分装。

实施例2

(1)溶解方法：取丙交酯原料300g，置于1000mL的三颈烧瓶中，加无水乙醇600ml，搅拌，置50℃水浴加热使完全溶解，保温20min。

(2)析晶方法：将上述溶液置10℃条件下冷却，析晶3小时。

(3)滤过方法：取上述析晶液，用砂芯漏斗抽滤，结晶物用无水乙醇120ml，分4次润洗，将结晶物置于托盘中，室温条件下挥干溶剂。

(4)干燥方法：将结晶物置于真空烘箱中，于30℃，-0.080Mpa下，减压干燥24小时，得精制丙交酯。

实施例3

(1)溶解方法：取丙交酯原料300g，置于1000mL的三颈烧瓶中，加无水乙酸乙酯300ml，搅拌，置80℃水浴加热使完全溶解，保温40min。

(2)析晶方法：将上述溶液置3℃条件下冷却，析晶1小时。

(3)滤过方法：取上述析晶液，用砂芯漏斗抽滤，结晶物用无水乙酸乙酯37.5ml润洗，将结晶物置于托盘中，室温条件下挥干溶剂。

(4)干燥方法：将结晶物置于真空烘箱中，于60℃，-0.090Mpa下，减压干燥10小时，得精制丙交酯。

实施例4

取实施例一进行检测

一、丙交酯标准物质候选物精制过程中所使用的主要设备见表1。

表1丙交酯标准物质候选物制备设备

二、均匀性预检

申请人对混匀后的样品进行了均匀性预检，其取样方法为：在容器的上部、中部、下部三个部位分别取样，共取9份样品，各约0.2g，供含量测定用。

丙交酯标准物质的均匀性预检验测试结果见表2。经查Pearson-Stephens表，当n＝3，α＝0.05时R/S临界值为1.999，由表6的测定结果可以看出，丙交酯标准物质含量的R/S值小于表中的临界值，即判断丙交酯标准物质的分布均匀。

表2丙交酯标准物质预检验测试结果

三、结构确证

申请人对本次制备的丙交酯标准物质进行了结构确证的研究，主要进行了红外光谱、质谱和核磁共振的测试，通过解析图谱数据，并与标准谱图进行比较，确证其结构为丙交酯。确证方法及结果如下：

1、红外光谱

仪器型号：PE Spectrum-65型红外光谱仪

测试条件：KBr压片法

测试结果：测试结果与对照图谱一致，结果见表3。

表3红外光谱数据列表

结构解析：

3004,2925cm^-1为-CH₃和-CH的伸缩振动峰。

1764cm^-1为C＝O的伸缩振动峰。

1261,1097和1056cm^-1为C-O-C的伸缩振动峰。

1446cm^-1为-CH₃的弯曲振动峰。

650,930cm^-1为环骨架振动峰。

样品的红外光谱显示了丙交酯结构的信息且与对照图谱一致。

2.核磁共振谱

仪器型号：Varian INOVA-300核磁共振仪

测试条件：溶剂DMSO ¹HNMR、¹³C NMR谱

测试结果：测试结果见下图及表4-5。

表4核磁共振¹H谱数据列表

1H NMR(300MHz,DMSO)δ:1.451(d,J＝7.5Hz,6H),5.454(d,J＝6.5Hz,2H)；13CNMR(300MHz,DMSO)δ:14.988,72.060,168.383；

HRMS(ESI,m/z)calcd for[C13H8N2S]H+:225.0481；found 225.0469.

结构解析：δ＝5.454处为四重峰，强度比为1:3:3:1；δ＝1.451处为二重峰，强度比为1:1。由此可知它们分别为相互邻接的甲基(-CH₃)和亚甲基(-CH)。

表5核磁共振¹³C谱数据列表

3质谱(ESI)

仪器型号：BrukerAmazonX质谱仪

测试条件：ESI(-)

测试结果：该化合物的分子量为144.1(M)，但丙交酯在质谱中离子化时，质谱中测得基峰m/z＝145.1，[M+H]⁺。

综上所述：丙交酯的红外光谱与有机化合物光谱数据库(SDBS)中的丙交酯红外谱图一致，NMR谱显示质子数、碳原子数和碳的类型与该化学结构相符。MS(ESI源)显示的基峰m/z＝145.1，[M+H]⁺，与该化合物的质谱离解情况相符。因而，本次研制的丙交酯标准物质可以确证为丙交酯。

四、均匀性检验

标准物质的均匀性是对标准物质样品总体空间分布的一种评价，它是标准物质研制的重要内容之一。通常，标准物质均匀性是指特殊量值在空间分布的均匀程度。为了进一步了解检测样品在瓶内以及瓶间的均匀性情况。申请人采用气相色谱法测定样品，以面积归一化法计算丙交酯的含量，并以含量测定结果作为样品均匀性的考察指标。随机抽取丙交酯标准物质样品15瓶，在每瓶中取样3次，各次取样量约为10mg，共取样45份。取精密称定的丙交酯标准物质适量，加乙腈制成每1ml中约含2mg的溶液。检验结果见表6

表6丙交酯标准物质均匀性检验结果

均匀性结果表明：瓶内与瓶间测定的平均值与其标准偏差均无显著性差异。而且其测定的精密度在定值精度范围之内，同时定值和稳定性试验均为随机抽取的样品，其结果均未见显著性差异，从而可以判定标准物质是均匀的。

根据表6均匀性检验中瓶间和瓶内的方差，按照下式计算样品不均匀性引起的标准不确定度u_H:

$u_H=\sqrt{\frac{s_1^2-s_2^2}{n}}$

式中n—均匀性检验中瓶内重复测定次数；

S₁ ²—为瓶间测定值的方差值，S₂ ²—为瓶内测定值的方差值，

根据均匀性的方差分析结果，可以计算出丙交酯标准物质的不均匀性带来的标准偏差为0.0096％。

在标准物质均匀性考察试验中，系采用气相色谱法测定，并以面积归一法计算含量，其样品的取样量为10mg。实验结果表明，当取样量为10mg时，样品含量测定结果分布均匀，其标准偏差小，说明该取样量能满足该方法含量测定精度的需要，因而将本品含量测定的最小取样量定为10mg。

四、稳定性考察

短期稳定性是指在指定的运输条件下，运输期间标准物质特性量的稳定性。因此，设定相应的条件，通过考察丙交酯含量变化情况，评价样品的短期稳定性。试验方法及结果如下：

1)试验方法

①样品储存条件

将丙交酯标准物质分装于棕色西林瓶中，塞上橡皮塞，铝帽密封后，放置在不同温度(-5℃，0℃，20℃和40℃)的条件下，并在不同时间点(0，1，2，3和4周)分别取样。通过检测丙交酯含量变化情况，评价样品的稳定性。

②含量测定方法

采用气相色谱法进行含量测定，每个温度参数随机选取3瓶。分别取样适量，精密称定，加乙腈稀释制成每1ml中约含2mg的溶液，摇匀，分别量取1μl，注入气相色谱仪，测定，并以面积归一化法计算含量。

2)评价方法：

采用平均值的一致性检验方法来评价样品的短期稳定性，以0周的数据为标准，通过比较每个考察温度下不同时间点样品的的含量平均值与0周含量平均值的一致性，判断样品的短期稳定性情况。

3)评价标准：

根据试验的取样方式，选取显著性水平为0.05，自由度为n₁+n₂-2＝4。

1.t<t_0.05,4时，说明两者的均值一致，样品稳定；

2.t>t_0.05,4时，说明两者的均值不一致，样品不稳定；

其中：

4)试验结果

按上述拟定的短期稳定性试验方案中的样品处理及含量测定方法，进行试验，结果见表7。

表7短期稳定性结果

结论：上述试验结果表明：样品在-5℃，0℃，20℃，40℃储存4周后，丙交酯含量测定结果均无明显变化，质量稳定。因此，丙交酯标准物质可在常温下运输。

长期稳定性是指在该物质所要求的特定储存条件下，标准物质特性量的稳定性。因此，设定了相应的条件，通过考察丙交酯含量变化情况，评价样品的长期稳定性。试验方法及结果如下：

1)试验方法

①样品储存条件

将分装于棕色西林瓶中的密封样品，放置于温度20±2℃的存储环境中，进行长期稳定性考察，考察时间段为2013年12月30日至2014年12月30日，在不同时间点0(2013年12月30日)，1，3，6，9，12(2014年12月30日)月随机选取5瓶，每瓶取样1份。

②含量测定方法

采用气相色谱法进行含量测定。分别取样适量，精密称定，加乙腈稀释制成每1ml中约含2mg的溶液，摇匀，分别量取1μl，注入气相色谱仪，测定，并以面积归一化法计算含量。

2)评价方法：

值的一致性，判断样品的稳定性情况。

3)评价标准：根据采取的取样方式，选取显著性水平为0.05，自由度为n₁+n₂-2＝8。

①.t<t_0.05,8时，说明两者的均值一致，样品稳定；

②.t>t_0.05,8时，说明两者的均值不一致，样品不稳定；

4)试验结果

按上述拟定的长期稳定性试验的样品处理及含量测定方法，进行试验，结果见表8。

表8长期稳定性结果

5)分析与结论

分别采用t检验及直线拟合法对上述试验结果进行评价，以确定样品的长期稳定性情况。

①t检验

采用表10的稳定性试验数据，通过t检验分析表明，丙交酯标准物质在20±2℃下储存12个月，其含量结果未发生显著变化，因此丙交酯标准物质可以20±2℃下储存12个月。

②直线拟合法

采用表10的稳定性试验数据，以x代表时间，以y代表样品的含量，拟合成一条直线，则有斜率b₁，

$b_1=\frac{\underset{i=1}{\overset{n}{\&Sigma;}}(x_i-\stackrel{\&OverBar;}{x})(Y_i-\stackrel{\&OverBar;}{Y})}{\underset{i=1}{\overset{n}{\&Sigma;}}(x_i-\stackrel{\&OverBar;}{x})}=-0.0011\%$

式中：

截距

直线的标准差：

取其平方根s＝0.62×10-²％，

斜率的不确定度：

当自由度为n-2＝4和p＝0.95(95％置信水平)的学生分布，t_0.05,4＝2.78

由于|b₁|＜t_0.05,4·s(b₁)＝0.0016％，故斜率是不显著的。

②研究结论

上述分析结果表明：丙交酯标准物质在20±2℃下储存12个月基本稳定。

稳定性的不确定度贡献采用公式u_t＝S(b₁)*t。有效期t＝12个月的长期稳定性的不确定度贡献计算为：

u_t＝S(b₁)×t＝5.90×10^-4％×12＝0.0071％≈0.008％

五、标准物质的定值：

1)气相色谱法定值

采用气相色谱法测定时，随机抽取10瓶标准物质，每瓶取样3个，配制成供试品溶液后，每个样品平行进样两次，取平均值，扣除水分、炽灼残渣后即为所测含量值：

标准物质含量＝(1-W_水分-W_残渣)P_气相＝P_气相*(100％-0.075％)

数据汇总如下：

表9丙交酯标准物质含量分析结果单位：％

*该表格中的含量测定值均已扣除水分、残渣。

2)定值的统计学处理

同一种方法的各组测量视为等精度测量，不同方法之间的测量视为不等精度测量。首先采用科克伦准则判断每种方法中是否有可疑数据组。判断方法如下

根据科克伦准则，计算统计量其中，S_max为S_i中的最大值。

若C≤C(0.05，m，n)，则无可疑数据组；若C>C(0.01，m，n)则最大方差组数据应作为可疑值弃去，若C(0.05，m，n)<C(α，m，n)<C(0.01，m，n)则最大方差组数据进行认真研究后决定取舍。

对于气相色谱法，C＝0.2435<C(0.05，10，3)＝0.3733，说明无可疑数据组；再用狄克逊准则对平均值进行统计检验，判断是否有界外值。

将气相色谱法的10个平均值按由小到大顺序排列(单位：％)：99.693，99.713，99.713，99.723，99.723，99.747，99.747，99.747，99.750，99.753

n＝10，查表可知f(0.05,10)＝0.530，f(0.01,10)＝0.635

$r_1=\frac{x_{\left(2\right)}-x_{\left(1\right)}}{x_{(n-1)}-x_{\left(1\right)}}=\frac{99.713-99.693}{99.750-99.693}=0.350,r_2=\frac{x_{\left(n\right)}-x_{(n-1)}}{x_{\left(n\right)}-x_{\left(2\right)}}=\frac{99.753-99.750}{99.753-99.713}=0.075$

r₁<f(0.05,10)，且r₂<f(0.05,10)，故全部数据均应保留。

再用格拉布斯准则对平均值进行异常值进行判别和剔除：由表15可知气相色谱法10组定值数据的平均值＝99.731％；s＝0.0204％

$G{{(}_{GC})}_{max}=\frac{99.731-99.693}{0.0204}=1.862<G(0.95,10)=2.176$

3)差示扫描量热法定值

采用差示扫描量热法测定时，随机抽取10瓶标准物质，用自带纯度分析软件分析，升温速率为每分钟1K，丙交酯取样量为2-4mg，本研究使用美国TA公司差示扫描量热仪DSCQ200进行试验，用标准物质铟作温度和热流校正。纯度数据见表14。

表10DSC测定丙交酯纯度结果

用格拉布斯(Grubbs)准则进行异常值的判别和剔除：

G(_DSC)_max＝1.939＜G(0.95,10)＝2.176

所以数据中没有异常值，不应剔除。

由上表得:s＝0.040％

用t检验法检查两种方法所测值的一致性。

气相色谱法和差示扫描量热法之间

$t=\frac{99.758-99.731}{\sqrt{\frac{{0.020}^2}{10}+\frac{{0.040}^2}{10}}}=1.91,\mathrm{\&upsi;}=\frac{{(\frac{{0.020}^2}{10}+\frac{{0.040}^2}{10})}^2}{\frac{{\left(\frac{{0.020}^2}{10}\right)}^2}{10+1}+\frac{{\left(\frac{{0.040}^2}{10}\right)}^2}{10+1}}-2=14.2$

查表得t_0.05(14)＝2.14，t<t_0.05(14)。

因而气相色谱法和差示扫描量热法所得数据是一致的。

由两种方法给出测量结果的平均值为：

$\stackrel{\&OverBar;}{\stackrel{\&OverBar;}{x}}=\frac{99.758\%+99.731\%}{2}=99.744\%\&ap;99.7\%$

六、不确定度评价

丙交酯标准物质的不确定度包含四部分；定值方法引入的不确定度、均匀性引入的不确定度、长期稳定性引入的不确定度以及短期稳定性引入的不确定度。样品不均匀性引入的相对不确定度

1、标准物质的均匀性不确定度按照方差分析法进行检验，结果表明该批标准物质的均匀性良好。

$u_H=\sqrt{\frac{s_1^2-s_2^2}{n}}\&times;100\%=\sqrt{\frac{6.37\&times;{10}^{-8}-3.62\&times;{10}^{-8}}{3}}\&times;100\%=0.0096\%$

2、气相色谱法引入的不确定度

气相色谱法定值引入的不确定度由3部分组成：

(1)A类标准不确定度u1：主要由色谱仪器、峰面积测量、溶液浓度和进样体积等重复性引起，采用气相色谱法定值测量计算得到单次测量标准偏差0.020％。

(2)B类不确定度u2：主成分及杂质在FID检测器上的响应因子差异引入的不确定度，为估计值。由于气相色谱对丙交酯样品的定量结果为99.731％，杂质含量在样品中约占0.269％。其杂质可能为丙交酯的聚合物，在FID检测器上的响应因子接近。估计杂质与丙交酯响应因子不同产生的误差约为100％，因此，估计此不确定度为u2＝0.269％。

(3)检测线性引入的不确定度：仪器在检测过程中未超出丙交酯样品的线性范围，因此，检测线性引入的不确定度可忽略。

因此，气相色谱分析不确定度为

$u_{GC}=\sqrt{u_1^2+u_2^2}=0.270\%$

3、差示扫描量热法定值的不确定度由5部分组成，现将不确定度评价说明如下：

A类标准不确定度u_A：标准物质铟的熔融焓测量重复性(u_(DSC)A1)；

B类标准不确定度u_B：主要由标准物质铟的熔融焓测量重复性(u_(DSC)B1)、天平的称量误差(u_(DSC)B2)、仪器的温度误差(u_(DSC)B3)、仪器的摩尔熔融热焓误差(u_(DSC)B4)等引起。

则：

其中：P为差示扫描量热法测定的丙交酯标准物质纯度

为测定的标准物质铟的平均熔融焓

u₂由可由4个相互独立的标准不确定度合并计算得到：

$\begin{array}{c}{u}_2=\sqrt{u_{\left(DSC\right)A1}^2+u_{\left(DSC\right)B2}^2+u_{\left(DSC\right)B3}^2+u_{\left(DSC\right)B4}^2}\\ =\sqrt{u_{\left(DSC\right)A1}^2+{\left(\frac{\&part;P}{\&part;m}\right)}^2{u}^2\left(m\right)+{(\frac{\&part;P}{\&part;T_0}+\frac{\&part;P}{\&part;T_m})}^2{u}^2\left(T\right)+{\left(\frac{\&part;P}{\&part;\mathrm{\&Delta;}H}\right)}^2{u}^2\left(\mathrm{\&Delta;}H\right)}\end{array}$

其中：P为差示扫描量热法测定的样品纯度

天平称量误差引入的标准不确定度

仪器的温度误差引入的标准不确定度

仪器的摩尔熔融热焓误差的标准不确定度

(1)铟重复性测量产生的不确定度

铟重复性测量产生的标准不确定度为A类不确定度，用符号u_(DSC)B1表示。

在相同的条件下，对标准物质铟的熔融焓进行多次测量，测定结果见表16。

表11DSC法测定标准物质铟熔融焓结果

测量结果：铟的平均值测量重复性的标准不确定度u_(DSC)B1＝s＝0.03J.g-¹。铟重复性测定带来的相对不确定度为：

$u_{\left(DSC\right)B1}/\stackrel{\&OverBar;}{X_1}=1.1\&times;{10}^{-3}$

(2)样品重复性测定产生的不确定度

样品重复性测定产生的不确定度为A类不确定度，用符号u_(DSC)A1表示，用DSC定值测量的10个数据的标准偏差表示，s＝0.040％，样品重复性测量的标准不确定度：

u_(DSC)A1＝s＝0.040％

(3)天平称量误差产生的不确定度及标准不确定度

DSC的纯度分析软件是根据样品的摩尔熔融热焓来拟合的。样品的摩尔熔融热焓以单位摩尔样品所吸收的热量来表示，样品的摩尔数为样品的质量与样品的摩尔质量之比，因此，天平的称量误差会给纯度测量结果带来不确定度。该不确定度属B类不确定度，其标准不确定度用符号u_(DSC)B2表示。

样品摩尔熔融热焓的计算公式为：

$\mathrm{\&Delta;}H=\frac{Q}{m/M}---\left(1\right)$

式中：Q-样品吸收的热量，J；m-样品的质量，g；

M-样品的摩尔质量，g.mol^-1。

因天平称量误差产生的摩尔熔融热焓偏差可通过△H对m求偏导得到，

即计算公式为：

$\frac{\&part;\mathrm{\&Delta;}H}{\&part;m}dm=-\frac{QM}{m^2}dm=-\frac{\mathrm{\&Delta;}H}{m}dm---\left(2\right)$

在试样称量过程中，使用感量为0.01mg的XS-205分析天平，其称量误差dm＝0.02mg，由于每次称量样品质量为2-4mg，取m＝3.00mg。实验结果得知丙交酯的△H＝26.788kJ.mol^-1。

由Van，t Hoff方程得：

计算公式

式中：P为样品纯度

$P=1-\frac{(T_0-T_M)\mathrm{\&Delta;}H}{{\mathrm{RT}}_0^2}=1-\frac{(T_0-T_M)Q}{{\mathrm{RT}}_0^{2}m/M}---\left(4\right)$

则天平产生的不确定度为计算公式5：

$\frac{\&part;P}{\&part;m}dm=\frac{(T_0-T_m)Q}{{\mathrm{RT}}_0^2{m}^2/M}dm=\frac{(T_0-T_m)\mathrm{\&Delta;}H}{{\mathrm{RT}}_0^{2}m}dm---\left(5\right)$

根据实验结果，丙交酯的T₀＝398.563K，T_m＝398.032(试验结果的平均值，下同)。其中R＝8.314J.mol^-1.K^-1(热力学常数)。将各数据带入计算公式5得：

丙交酯：

则天平称量误差产生的标准不确定度为：

(4)仪器温度误差产生的不确定度及标准不确定度

该不确定度属B类不确定度，其标准不确定度用符号u_(DSC)B3表示。由计算公式5得到仪器温度误差产生的不确定度计算公式7：

$(\frac{\&part;P}{\&part;T_0}+\frac{\&part;P}{\&part;T_m})dT=\frac{2\mathrm{\&Delta;}H}{{\mathrm{RT}}_0^2}(1-\frac{T_m}{T_0})dT---\left(6\right)$

用标准物质铟对仪器进行校准，仪器对样品的温度偏差为dT＝0.23K，将各数据代入计算公式6得：

$u_{\left(DSC\right)B3}=(\frac{\&part;P}{\&part;T_0}+\frac{\&part;P}{\&part;T_m})dT=1.2\&times;{10}^{-5}$

(5)仪器的摩尔熔融热焓误差产生的不确定度及标准不确定度

该不确定度属B类不确定度，其标准不确定度用符号u_(DSC)B4表示。由计算公式5式得到仪器温度误差产生的不确定度计算公式7：

$\frac{\&part;P}{\&part;\mathrm{\&Delta;}H}d\mathrm{\&Delta;}H=\frac{(T_m-T_0)}{{\mathrm{RT}}_0^2}d\mathrm{\&Delta;}H---\left(7\right)$

采用国家二级标准物质铟(GBW(E)130182)对仪器进行校准，标准物质铟的熔融热焓测量平均值为3275.8J.mol^-1，仪器对样品的摩尔熔融热焓误差d△H＝34.4J.mol^-1。将丙交酯各数据带入计算公式7取正值得：

$\frac{\&part;P}{\&part;\mathrm{\&Delta;}H}d\mathrm{\&Delta;}H=1.4\&times;{10}^{-5}$

故

(6)合成不确定度

由于上述样品测定的4个不确定度产生的原因不同，所以彼此线性无关。

根据JJF1059-1999，其合成标准不确定度u₂由各分量相对不确定度合成计算：

$\begin{array}{c}{u}_2=\sqrt{u_{\left(DSC\right)A1}^2+u_{\left(DSC\right)B2}^2+u_{\left(DSC\right)B3}^2+u_{\left(DSC\right)B4}^2}\\ =\sqrt{{\left(0.040\right)}^2+{(4.2\&times;{10}^{-5})}^2+{(7.2\&times;{10}^{-6})}^2+{(8.1\&times;{10}^{-6})}^2}\\ =0.040\%\end{array}$

则DSC测量不确定度为：

$u_{DSC}=P\sqrt{{\left(\frac{u_{\left(DSC\right)B1}}{\stackrel{\&OverBar;}{X_1}}\right)}^2+{\left(\frac{u_2}{P}\right)}^2}=99.758\%\sqrt{{(1.11\&times;{10}^{-3})}^2+{\left(\frac{0.040\%}{99.758\%}\right)}^2}=0.117\%$

4、样品稳定性引入的相对不确定度

标准物质的短期稳定性，采用平均值的一致性进行检验，通过每个考察时间点的数据与样品第0周的数据比较，确定样品在常温条件下运输一个月是稳定的。

对于标准物质的长期稳定性，通过每个考察时间点的数据与样品第0月的数据比较，确定样品在室温下保存12个月是稳定的。

对于稳定性检验，也可以采用趋势分析，即线性拟合，对长稳、短稳数据进行分析计算。结果见表12。

表12稳定性数据分析表

5、水分、炽灼残渣测定引入的不确定度：

水分在样品中占0.043％，估计水分测定的误差约为100％，因此，水分的不确定度为uwater＝Pwater×100％＝0.043％。炽灼残渣在样品中占0.032％，估计炽灼残渣测定的误差约为100％，因此，炽灼残渣的不确定度-uash＝Pash×100％＝0.032％。

合成上述丙交酯的不确定度分量，取扩展因子k＝2(置信概率95％)，计算扩展不确定度。

$\begin{array}{c}{u}_{CRM}=\sqrt{u_t^2+u_H^2+{u_{GC}}^2+{u_{DSC}}^2+{u_{water}}^2+{u_{ash}}^2+{u_{solvent}}^2}\\ U_{CRM}=k\&times;u_{CRM}\\ U_{rel}=U_{CRM}/y\end{array}$

表12丙交酯标准物质的不确定度(％)

综合上述结果，得到丙交酯标准物质含量、不确定度与稳定时间见下表：

表18丙交酯标准物质含量、不确定度与稳定时间

Claims (6)

1.一种丙交酯标准物质的制备方法，其特征在于，按照包括以下步骤制备的：

(1)溶解：取丙交酯原料置于三颈烧瓶中，添加1-2倍原料重醇类或酯类溶剂的一种或多种，经50～80℃水浴加热使完全搅拌溶解后静置保温20-40min；

(2)析晶：将上述溶液置3-10℃条件下冷却，析晶1-3小时；

(3)过滤：砂芯漏斗抽滤，结晶物用1/8～1/5倍原料量溶剂润洗1-4次，将结晶物置于托盘中，室温条件下挥干溶剂；

(4)干燥：真空减压干燥,干燥温度为30-60℃，真空度为-0.08～-0.09Mpa，干燥时间为10-24h；

(5)混匀及均匀性预检：步骤(2)将干燥好的丙交酯样品，置于玻璃烧杯中，搅拌、混匀在产物的的上部、中部、下部三个部位分别取样，共取9份样品，供含量测定。

2.一种根据权利要求1所述的丙交酯标准物质的制备方法制得的丙交酯标准物质的检测方法,其特征在于：所述丙交酯标准物质是在进行均匀性预检，判断分布均匀后进行分装、并经结构确证、均匀性检验、稳定性检验、定值以及不确定度评定筛选后获得。

3.根据权利要求2所述的丙交酯标准物质的检测方法，其特征在于均匀性检查是采用方气相色谱法测定，以丙交酯的含量作为指标，考察样品瓶内以及瓶间的均匀性情况，数据用方差分析法处理并判定。

4.根据权利要求2所述的丙交酯标准物质的检测方法，其特征在于采用气相色谱法和差示扫描量热法进行联合定值，两种方法所得数据一致，扣除水分和炽灼残渣后得到所测含量值，数据具有溯源性。

5.根据权利要求2所述丙交酯标准物质的检测方法，其特征在于：有给定置信水平的不确定度。

6.一种根据权利要求1所述的丙交酯标准物质的制备方法制得的丙交酯标准物质的检测方法，其特征在于包括以下步骤：结构检测、测定丙交酯含量的气相色谱法、均匀性检测、稳定性检测、以及气相色谱法和差示扫描量热法联合定值检测。