BRPI1006270B1 - Anticorpo anti-a5ss1, imunoconjugado, composição farmacêutica, método in vitro ou ex vivo para detectar a proteína a5ss1, uso de um anticorpo e kit para detectar a proteína a5ss1 - Google Patents

Anticorpo anti-a5ss1, imunoconjugado, composição farmacêutica, método in vitro ou ex vivo para detectar a proteína a5ss1, uso de um anticorpo e kit para detectar a proteína a5ss1 Download PDF

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Abstract

ANTICORPOS ANTl-(ALFA)5(BETA)1, MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLEICO ISOLADO,CÉLULA HOSPEDEIRA, MÉTODO PARA PRODUZIR UM ANTICORPO ANTl-(ALFA)5(BETA)1, IMUNOCONJUGADO, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, MÉTODO PARA DETECTAR A PROTEÍNA (ALFA)5(BETA)1, USO DE UM ANTICORPO E KÍT PARA DETECTAR A PROTEÍNA (ALFA)5(BETA)1. A presente invenção refere-se a novos anticorpos anti-(alfa)5(beta)1 composições e kits que compreendem os anticorpos e métodos de elaboração e uso dos anticorpos.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDO RELACIONADO
[001] O presente pedido reivindica o benefício do Pedido de Patente Provisório Norte-Americano n° 61/163.241, depositado em 25 de março de 2009, cujo relatório descritivo é integralmente incorporado ao presente como referência para todos os propósitos.
CAMPO DA INVENÇÃO
[002] A presente invenção refere-se a anticorpos α5β1 inovadores, composições e kits que compreendem os anticorpos e métodos de uso dos anticorpos.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
[003] Integrina α5β1 é uma glicoproteína da membrana celular que media interações entre célula e ECM por meio do seu ligante principal, a fibronectina. Integrina α5β1 desempenha um papel na migração, diferenciação e sobrevivência celular. Níveis de integrina α5β1 são elevados em endotélio vascular de tumor (tal como carcinomas gástricos, hepatocelulares colorretais, uterocervicais e da mama) e outros vasos angiogênicos. Integrina α5β1 modula a associação de células murais com células endoteliais e a montagem da matriz extracelular endotelial durante a angiogênese. Desta forma, integrina α5β1 é um alvo útil para inibição de angiogênese e sensibilização de células aos efeitos de um antagonista de VEGF.
[004] Existe, portanto, necessidade na técnica de composições e métodos de direcionamento de integrina α5β1. A presente invenção satisfaz esta e outras necessidades.
DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO
[005] A presente invenção refere-se a anticorpos anti-α5β1 inovadores derivados do anticorpo monoclonal 18C12, kits e composições que compreendem os anticorpos anti-α5β1 inovadores e métodos para sua elaboração e/ou utilização.
[006] Uma realização da presente invenção fornece um anticorpo anti-α5β1 que compreende um domínio VL que compreende uma CDR-L1 que compreende TL-S/T-S/P/T-Q/N-H-F/S-T/I-Y-K/T-I-G/D/S (SEQ ID NO: 15); uma CDR-L2 que compreende L/I-N/T-S-D/H/S-G/S-S/L/T-H/Y-N/K/Q/I-K/T-G/A- D/S/V (SEQ ID NO: 16); uma CDR-L3 que compreende G/A-S/A/Y-S/Y-Y-S/A/Y- S/Y/T-GY-V/I (SEQ ID NO: 17); e um domínio VH que compreende uma CDR-H1 que compreende GFTFS-N/A-RW-I/V-Y (SEQ ID NO: 18); uma CDR-H2 que compreende GIKTKP-N/A/T-I/R-YAT-E/Q-YADSVKG (SEQ ID NO: 19); e uma CDR-H3 que compreende L/V-TG-M/K-R/K-YFDY (SEQ ID NO: 20).
[007] Em algumas realizações, o anticorpo anti-α5β1 compreende um domínio VL que compreende CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3, em que cada um compreende uma sequência descrita na Figura 3 e um domínio VH que compreende CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3, em que cada um compreende uma sequência descrita na Figura 3, ou seja, um domínio VL que compreende CDR- L1 que compreende uma sequência descrita em SEQ ID NO: 21, 22, 23 ou 24, CDR-L2 que compreende uma sequência descrita em SEQ ID NO: 25, 26, 27 ou 28 e CDR-L3 que compreende uma sequência descrita em SEQ ID NO: 29, 30, 31 ou 32; e um domínio VH que compreende CDR-H1 que compreende uma sequência descrita em SEQ ID NO: 34 ou 35, CDR-H2 que compreende uma sequência descrita em SEQ ID NO: 36 ou 37 e uma CDR-H3 que compreende uma sequência descrita em SEQ ID NO: 38, 39 ou 40. Em algumas realizações, o anticorpo anti-α5β1 compreende um domínio VL que compreende qualquer um dentre SEQ ID NO: 3 a 8 e um domínio VH que compreende qualquer um dentre SEQ ID NO: 11 a 14. Em algumas realizações, o anticorpo anti-α5β1 compreende um domínio VL que compreende SEQ ID NO: 4 e um domínio VH que compreende SEQ ID NO: 11. Em algumas realizações, o anticorpo anti-α5β1 compreende um domínio VL que compreende SEQ ID NO: 5 e um domínio VH que compreende SEQ ID NO: 12. Em algumas realizações, o anticorpo anti-α5β1 compreende um domínio VL que compreende SEQ ID NO: 6 e um domínio VH que compreende SEQ ID NO: 13. Em algumas realizações, o anticorpo anti-α5β1 compreende um domínio VL que compreende SEQ ID NO: 7 e um domínio VH que compreende SEQ ID NO: 13. Em algumas realizações, o anticorpo anti-α5β1 compreende um domínio VL que compreende SEQ ID NO: 8 e um domínio VH que compreende SEQ ID NO: 14. Em algumas realizações, o anticorpo anti-α5β1 é humano, humanizado ou quimérico. Em uma realização, o anticorpo anti-α5β1 é um anticorpo monoclonal. Em algumas realizações, o anticorpo anti-α5β1 compete com o anticorpo 18C12 para ligação a integrina α5β1. Em algumas realizações, o anticorpo monoclonal é um anticorpo quimérico. Em algumas realizações, o anticorpo anti-α5β1 é um fragmento de anticorpo que liga α5β1. Em algumas realizações, o anticorpo anti-α5β1 é selecionado a partir de: Fab, Fab', F(ab)'2, Fv de fita única (scFv), fragmento de Fv; um diacorpo e um anticorpo linear. Em algumas realizações, o anticorpo anti-α5β1 é um IgG1 de comprimento total ou um IgG4 de comprimento total. Em algumas realizações, o anticorpo anti-α5β1 é um anticorpo biespecífico ou um anticorpo multiespecífico. Em algumas realizações, o anticorpo biespecífico liga VEGF e α5β1 e é um antagonista de VEGF. Em algumas realizações, o anticorpo anti-α5β1 possui uma função efetora alterada. Em algumas realizações, o anticorpo anti-α5β1 é alterado para reduzir ou evitar a atividade de citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) ou atividade de citotoxicidade dependente de complemento (CDC) (alterando-se, por exemplo, a sequência de ácido nucleico que codifica a porção Fc do anticorpo). Em algumas realizações, a porção Fc do anticorpo compreende uma substituição N297A. Em algumas realizações, o anticorpo anti- α5β1 foi modificado para aumentar ou reduzir a sua meia vida em seres humanos (alterando, por exemplo, a sequência de ácido nucleico que codifica a porção Fc do anticorpo). Em algumas realizações, o anticorpo α5β1 é parte de um imunoconjugado conjugado a uma outra entidade (tal como um agente terapêutico ou uma marca detectável). Em algumas realizações, a entidade terapêutica é um agente citotóxico (tal como isótopo radioativo, uma toxina, um agente inibidor de crescimento ou um agente quimioterápico). Em algumas realizações, a marca detectável é uma tinta fluorescente, um radioisótopo ou uma enzima.
[008] Realizações adicionais da presente invenção fornecem moléculas de ácido nucleico que codificam qualquer um dos anticorpos anti-α5β1 descritos no presente, vetores de expressão que compreendem os ácidos nucleicos e células hospedeiras que compreendem os ácidos nucleicos. Ainda outras realizações da presente invenção fornecem métodos de produção de qualquer um dos anticorpos anti-α5β1, em que os métodos compreendem o cultivo das células hospedeiras, para que o anticorpo seja produzido. Em algumas realizações, os métodos compreendem adicionalmente a recuperação do anticorpo da célula hospedeira.
[009] Realizações adicionais da presente invenção fornecem composições farmacêuticas que compreendem um anticorpo α5β1 de acordo com a presente invenção e um veículo farmaceuticamente aceitável. Em algumas realizações, as composições farmacêuticas compreendem adicionalmente pelo menos um, dois, três, quatro ou mais agentes adicionais que incluem, por exemplo, um antagonista de VEGF. Em algumas realizações, o(s) agente(s) adicional(is) é(são) selecionado(s) a partir de um agente citotóxico, um agente quimioterápico, um agente inibidor de crescimento ou um agente antiangiogênico. Em algumas realizações, o antagonista de VEGF é um anticorpo anti-VEGF. Em algumas realizações, o anticorpo anti-VEGF é bevacizumab. A presente invenção também fornece artigos industrializados e kits que compreendem instruções de detecção de α5β1 (por exemplo, em um paciente que tenha sido tratado com um antagonista de VEGF).
[010] Uma outra realização da presente invenção fornece métodos de tratamento de pacientes que sofrem de uma doença ou distúrbio que envolve angiogênese anormal, permeabilidade ou vazamento vascular. Os métodos que compreendem a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz dos anticorpos anti-α5β1 descritos no presente ao paciente, de forma a tratar a doença ou distúrbio (por exemplo, por meio da inibição completa ou parcial de angiogênese anormal, permeabilidade vascular ou vazamento vascular). Em algumas realizações, também é administrado um antagonista de VEGF ao paciente. Em algumas realizações, o antagonista de VEGF e o anticorpo anti-α5β1 são administrados simultaneamente. Em algumas realizações, o antagonista de VEGF e o anticorpo anti-α5β1 são administrados sequencialmente. Em algumas realizações, a doença ou distúrbio reage a terapias com antagonista de VEGF. Em algumas realizações, a doença ou distúrbio são selecionados a partir de: câncer, doença imune ou doença ocular. Segundo uma realização, a doença ou distúrbio são selecionados a partir de: um tumor sólido, tumor metastático, tumor de tecido mole, doença que possui neovascularização ocular, doença inflamatória que possui angiogênese anormal, doença decorrente após transplante no paciente e doença que possui proliferação anormal de tecido fibrovascular. Segundo uma outra realização, o câncer é selecionado a partir de: câncer de mama (incluindo câncer de mama metastático), câncer cervical, câncer colorretal (incluindo câncer colorretal metastático), câncer de pulmão (incluindo câncer de pulmão de células não pequenas), linfoma não Hodgkins (NHL), leucemia linfocítica crônica, câncer de células renais, câncer de próstata, incluindo câncer de próstata refratário hormonal, câncer de fígado, câncer de cabeça e pescoço, melanoma, câncer de ovário, mesotelioma, câncer de tecidos moles, tumor estromal gastrointestinal, glioblastoma multiforme e mieloma múltiplo. Segundo uma outra realização, a doença é selecionada a partir de: retinopatia, degeneração macular induzida pela idade (tal como AMD úmida), edema macular diabético, oclusão das veias da retina (RVO) e AMD/atrofia geográfica (para evitar o progresso para AMD úmida) rubeose; psoríase, uma doença renal inflamatória, síndrome urêmica hemolítica, nefropatia diabética (tal como retinopatia diabética proliferativa), artrite (tal como artrite psoriática, osteoartrite, artrite reumatoide), doença intestinal inflamatória, inflamação crônica, deslocamento crônico da retina, uveíte crônica, vitrite crônica, rejeição de enxertos da córnea, neovascularização da córnea, neovascularização de enxertos da córnea, mal de Crohn, miopia, doença neovascular ocular, mal de Pagets, penfigoide, poliartrite, ceratotomia radial pós-laser, neovascularização da retina, síndrome de Sogren, colite ulcerativa, rejeição de enxertos, inflamação dos pulmões, síndrome nefrótica, edema, ascite associada a malignidades, apoplexia, angiofibroma e glaucoma neovascular. Em uma realização, os métodos compreendem adicionalmente a administração de um agente terapêutico adicional (tal como um agente antineoplásico, agente quimioterápico, agente inibidor de crescimento ou agente citotóxico) ao paciente.
[011] Ainda outra realização da presente invenção fornece métodos de tratamento de câncer em pacientes, em que os métodos compreendem: administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um antagonista de VEGF e um anticorpo anti-α5β1 ao paciente. Em algumas realizações, o antagonista de VEGF e o anticorpo anti-α5β1 são administrados simultaneamente. Em algumas realizações, o antagonista de VEGF e o anticorpo anti-α5β1 são administrados sequencialmente. Em algumas realizações, o câncer reage a terapias com antagonista de VEGF.
[012] Uma realização adicional da presente invenção fornece métodos de tratamento de degeneração macular relacionada à idade (AMD) (incluindo, por exemplo, degeneração macular relacionada à idade úmida) em um paciente que sofre de AMD, em que os métodos compreendem: administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um antagonista de VEGF e um anticorpo anti-α5β1 ao paciente. Em algumas realizações, o antagonista de VEGF e o anticorpo anti-α5β1 são administrados simultaneamente. Em algumas realizações, o antagonista de VEGF e o anticorpo anti-α5β1 são administrados sequencialmente. Em ainda outra realização, é fornecido um método de tratamento de uma doença autoimune em pacientes que compreende a etapa de administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um antagonista de VEGF e um antagonista de α5β1 simultânea ou sequencialmente.
[013] Em algumas realizações, o antagonista de VEGF é administrado inicialmente ao paciente a ser tratado e o anticorpo anti-α5β1 é administrado em seguida ao paciente. Em algumas realizações, também são administrados o antagonista de VEGF e o antagonista de α5β1 ao paciente simultaneamente. Em algumas realizações, o antagonista de VEGF anticorpo anti-α5β1 é administrado inicialmente ao paciente a ser tratado e o antagonista de VEGF é administrado em seguida ao paciente. Em algumas realizações, o paciente é tratado com o antagonista de VEGF até que o paciente não reaja ao tratamento com antagonista de VEGF e, em seguida, o paciente é tratado com o anticorpo anti-α5β1. Em uma realização específica, o paciente é tratado com o antagonista de VEGF quando o câncer é não invasivo ou encontra-se em estágio precoce e é tratado com o antagonista anti-α5β1 quando o câncer é invasivo. Em uma outra realização, o paciente sendo tratado com o anticorpo anti-α5β1 possui níveis elevados de α5β1 em um tecido doente em comparação com tecido de um paciente que não sofre da doença ou em comparação com tecido não doente. Neste caso, o método pode incluir adicionalmente a etapa de detecção de α5β1 no paciente, tal como em um tecido doente após o tratamento com um antagonista de VEGF. Segundo uma realização, o câncer invasivo é um câncer que sofreu metástase. Segundo uma outra realização, o câncer em estágio precoce é um câncer tratado por meio de terapia com adjuvantes (tal como quimioterapia ou remoção cirúrgica).
[014] Segundo uma realização da presente invenção, o paciente a ser tratado com um anticorpo anti-α5β1 está sofrendo de reincidência após tratamento com antagonista de VEGF ou tornou-se refratário a tratamento com antagonista de VEGF. Segundo uma outra realização, o paciente a ser tratado com um anticorpo anti-α5β1 e um antagonista de VEGF está sofrendo de um câncer metastático ou foi tratado anteriormente com terapia adjuvante. Em uma realização, o possível paciente sofre reincidência, é refratário ou resistente a agentes quimioterápicos tais como irinotecan. Exemplos dessas doenças incluem, mas sem limitações, câncer colorretal metastático, câncer colorretal metastático reincidente, câncer de mama metastático, câncer de mama metastático reincidente, câncer de mama HER2+ metastático, câncer de mama adjuvante, câncer de mama HER2+ adjuvante, câncer pancreático metastático, câncer de cólon adjuvante, câncer de pulmão de células não pequenas adjuvante, câncer retal adjuvante, câncer de pulmão de células não pequenas adjuvante, câncer de pulmão de células não pequenas metastático, câncer de ovário metastático, câncer de células renais metastático e câncer de células renais adjuvante.
[015] Segundo uma realização, o paciente que sofre de uma doença descrita no presente recebe administração de uma terapia de manutenção após tratamento para a doença com um antagonista de VEGF, em que a terapia de manutenção é um antagonista de α5β1 isoladamente, sequencial ou simultaneamente com um antagonista de VEGF.
[016] Em algumas realizações, o antagonista de VEGF é selecionado a partir de: um anticorpo, uma imunoadesina, um corpo de peptídeo, uma molécula pequena e um ácido nucleico que se hibridiza em uma molécula de ácido nucleico que codifica VEGF sob condições estringentes (tal como ribozima, siRNA e aptâmero). Em algumas realizações, o antagonista de VEGF é um anticorpo (tal como um anticorpo monoclonal). Segundo uma realização, o anticorpo anti-VEGF é capaz de ter competitivamente inibida a sua ligação a VEGF humano pelo anticorpo Avastin®. Segundo uma outra realização, o anticorpo anti-VEGF é humano, humanizado ou quimérico. Segundo uma realização específica, o anticorpo anti-VEGF é o anticorpo Avastin®. Segundo outra realização, o anticorpo anti-VEGF é selecionado a partir do grupo que consiste em um fragmento de Fab, Fab', F(ab)’2, Fv de fita única (scFv), fragmento de Fv; um diacorpo e um anticorpo linear. Segundo uma outra realização, o antagonista de VEGF é um anticorpo biespecífico que liga VEGF e α5β1 e também é um antagonista de α5β1.
[017] Uma realização adicional da presente invenção fornece métodos para detectar a proteína α5β1 em uma amostra suspeita de conter a proteína α5β1. Os métodos compreendem colocar em contato os anticorpos descritos no presente com a amostra; e detectar a formação de um complexo entre o anticorpo anti-α5β1 e a proteína α5β1. Em algumas realizações, a amostra é de um paciente diagnosticado com uma doença caracterizada por angiogênese anormal, permeabilidade vascular anormal e/ou vazamento vascular.
[018] Estas e outras realizações da presente invenção são adicionalmente descritas na descrição detalhada que se segue.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[019] As Figuras 1A e 1B ilustram alinhamento de sequências de cadeia leve variável para os seguintes: lambda III humano; 18C12 humano; 18C12.v.1.1 quimérico; h18C12.v3; h18C12.v6; h18C12.v6.1.Lam3; h18C12.v6.2Lam3 e h18C12.v6.1.5.
[020] As Figuras 2A e 2B ilustram alinhamento de sequências do domínio variável de cadeia pesada para os seguintes: 18C12 de hamster; h18C12.v3; h18C12.v6; h18C12.v6.1.Lam3; h18C12.v6.2Lam3; e h18C12.v6.1.5.
[021] A Figura 3 ilustra sequências de CDR de variantes de h18C12.v3 e h18C12.v3 maturadas por afinidade h18C12.v6; h18C12.v7; h18C12.v9; h18C12.v15; h18C12.v16; h18C12.v28; h18C12.v30; h18C12.v51; h18C12.v54; h18C12.v70 e h18C12.v78.
[022] A Figura 4 ilustra os resultados de um ELISA de competição de fagos que demonstra a ligação de clone parental h18C12.v3 e variantes de 18C12 maturadas por afinidade h18C12.v6; h18C12.v7; h18C12.v9; h18C12.v15; h18C12.v16; h18C12.v28; h18C12.v30; h18C12.v51; h18C12.v54; h18C12.v70 e h18C12.v78 em integrina α5β1 humana.
[023] A Figura 5 ilustra os resultados de uma análise de BIACORE® da ligação de clone parental h18C12.v3 e variantes de h18C12.v3 maturadas por afinidade h18C12.v6; h18C12.v15; h18C12.v54; e h18C12.v70 em integrina α5β1 humana.
[024] A Figura 6 ilustra os resultados de uma análise de BIACORE® da ligação de 18C12 quimérico e h18C12.v6.1.Lam3 a integrina α5β1 humana.
[025] A Figura 7 ilustra os resultados de uma análise de BIACORE® da ligação de clones h18C12.v6.1 h18C12.v6.1.1, h18C12.v6.1.2, h18C12.v6.1.3, h18C12.v6.1.4 e h18C12.v6.1.5 e descreve a sequência de CDR-L2 nas posições 50a, 50b, 50c e 50d para cada um dos clones de h18C12.v6.1.
[026] A Figura 8 ilustra os resultados de um teste de ligação de fibronectina que compara a capacidade de 18C12 quimérico e h18C12.v6.1 de interferir com a ligação de células U937 a fibronectina.
[027] A Figura 9 ilustra os resultados de um teste de ligação de fibronectina que compara a capacidade de 18C12 de hamster e h18C12.v6.1.5 de interferir com a ligação de células U937 a fibronectina.
[028] A Figura 10 ilustra os resultados de um teste de ligação de fibronectina que compara a capacidade de 18C12 de hamster e h18C12.v6.1.5 de interferir com a ligação de células α5β1 a fibronectina.
[029] A Figura 11 ilustra os resultados de um teste de migração de HUVEC que compara a capacidade de 18C12 quimérico e h18C12.v6.1 de interferir com a migração de células HUVEC sobre fibronectina.
[030] A Figura 12 ilustra os resultados de um teste de xenoenxerto de tumores que mede a capacidade de aumento da sobrevivência de h18C12.v6.1.5 +/- anti-VEGF.
[031] A Figura 13 ilustra os resultados de um teste de xenoenxerto de tumores que mede a capacidade de reduzir o encargo de tumores de h18C12.v6.1.5 +/- anti-VEGF.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO I. INTRODUÇÃO
[032] A presente invenção é baseada na identificação de anticorpos inovadores que ligam integrina α5β1. Os anticorpos α5β1 são derivados do anticorpo monoclonal 18C12 e podem ser utilizados em uma série de métodos terapêuticos e de diagnóstico. Os anticorpos α5β1 podem ser utilizados, por exemplo, isoladamente ou em combinação com outros agentes de tratamento de angiogênese anormal, neoplasia, doenças oculares e doenças autoimunes. Os anticorpos podem também ser utilizados para a detecção de proteína α5β1 em pacientes ou amostras de pacientes por meio da administração dos anticorpos a proteína α5β1 em pacientes e detecção do anticorpo anti-α5β1 ligado à proteína α5β1 em uma amostra do paciente (tal como in vivo ou ex vivo) ou por meio de contato dos anticorpos com amostras de pacientes e detecção qualitativa ou quantitativa do anticorpo anti-α5β1 ligado à proteína α5β1.
II. DEFINIÇÕES
[033] “Alfa5beta1”, “α5β1”, “a5b1” ou “α5β1” é uma integrina que compreende duas proteínas diferentes (ou seja, subunidades alfa5 e beta1). Demonstrou-se que α5β1 liga-se a fibronectina, L1-CAM e fibrinogênio. A integrina α5β1 também foi denominada Ativação Muito Posterior-5, VLA-5, alfa5beta1, CD49e/CD29, receptor de fibronectina, FNR e GPIc-IIa. Segundo uma realização, α5β1 é α5β1 humana.
[034] “Alfa5” é utilizado no presente de forma intercambiável com CD49e, α5, subunidade integrina alfa5, subunidade alfa de VLA-5, subunidade IC de GPIc-IIa e cadeia alfa de FNR designa uma subunidade da integrina α5β1. Alfa5 contém quatro isoformas geradas por meio de divisão alternativa (A-D) e que variam dentro dos seus domínios citoplasmáticos. Sequências de aminoácidos para isoformas humanas de alfa5 podem ser encontradas, por exemplo, em números de acesso Genbank: X07979, U33879, U33882 e U33880, respectivamente.
[035] “Beta1” também é denominado CD29, beta1, Plaqueta GPIIa; cadeia beta de VLA; cadeia de integrina beta-1, CD29; FNRB; MDF2; VLAB; GPIIA; MSK12 e VLA5B. Sequências de aminoácidos para Beta1 humano podem ser encontradas, por exemplo, no número de acesso Genbank X06256.
[036] O termo “VEGF”, da forma utilizada no presente, designa o fator de crescimento de células endoteliais vasculares humanas com 165 aminoácidos e fatores de crescimento de células endoteliais vasculares humanas com121, 189 e 206 aminoácidos relacionados, conforme descrito por Leung et al., Science, 246: 1306 (1989) e Houck et al., Mol. Endocrin., 5: 1806 (1991), junto com as suas formas processadas e alélicas de ocorrência natural. O termo “VEGF” também designa VEGFs de espécies não humanas, tais como camundongo, rato ou primata. Às vezes, o VEGF de uma espécie específica é indicado por termos tais como hVEGF para VEGF humano, mVEGF para VEGF murino etc. O termo “VEGF” também é utilizado para designar formas truncadas do polipeptídeo que compreende os aminoácidos 8 a 109 ou 1 a 109 do fator de crescimento de células endoteliais vasculares humanas com 165 aminoácidos. Referência a qualquer dessas formas de VEGF pode ser identificada no presente pedido, tal como por “VEGF (8-109)”, “VEGF (1-109)” ou “VEGF165”. As posições de aminoácidos para um VEGF nativo “truncado” são numeradas conforme indicado na sequência de VEGF nativa. A posição de aminoácido 17 (metionina), por exemplo, em VEGF nativo truncado também é a posição 17 (metionina) em VEGF nativo. O VEGF nativo truncado possui afinidade de ligação para os receptores Flt-1 e KDR comparável com VEGF nativo. Segundo uma realização, o VEGF é um VEGF humano.
[037] “Antagonista de VEGF” designa uma molécula capaz de neutralizar, bloquear, inibir, anular, reduzir ou interferir nas atividades de VEGF, incluindo a sua ligação a VEGF, um ou mais receptores de VEGF ou o ácido nucleico que os codifica. Preferencialmente, o antagonista de VEGF liga VEGF ou um receptor de VEGF. Antagonistas de VEGF incluem anticorpos anti-VEGF e seus fragmentos de ligação de antígenos, polipeptídeos que ligam VEGF e receptores de VEGF e interação entre receptor e ligante de bloco (tais como imunoadesinas e corpos de peptídeos), anticorpos antirreceptores de VEGF e antagonistas receptores de VEGF tais como inibidores de moléculas pequenas das tirosina quinases de VEGFR, aptâmeros que ligam VEGF e ácidos nucleicos que se hibridizam sob condições estringentes em sequências de ácidos nucleicos que codificam VEGF ou um receptor de VEGF (tal como RNAi). Segundo uma realização, o antagonista de VEGF liga-se a VEGF e inibe a proliferação de células endoteliais induzidas por VEGF in vitro. Segundo uma realização, o antagonista de VEGF liga-se a VEGF ou um receptor de VEGF com maior afinidade que um não VEGF ou receptor não de VEGF. Segundo uma realização, o antagonista de VEG liga-se a VEGF ou um receptor de VEGF com Kd de 1 μM a 1 pM. Segundo outra realização, o antagonista de VEGF liga-se a VEGF ou um receptor de VEGF de 500 nM a 1 pM.
[038] Segundo uma realização, o antagonista de VEGF é selecionado a partir do grupo que consiste em um polipeptídeo tal como um anticorpo, um corpo de peptídeo, uma imunoadesina, uma molécula pequena ou um aptâmero. Em uma realização, o anticorpo é um anticorpo anti-VEGF tal como o anticorpo AVASTIN® ou um anticorpo receptor anti-VEGF tal como um anticorpo anti-VEGFR2 ou anti-VEGFR3. Outros exemplos de antagonistas de VEGF incluem: VEGF-Trap, Mucagen, PTK787, SU11248, AG-013736, Bay 439006 (sorafenib), ZD-6474, CP632, CP-547632, AZD-2171, CDP-171, SU- 14813, CHIR-258, AEE-788, SB786034, BAY579352, CDP-791, EG-3306, GW- 786034, RWJ-417975/CT6758 e KRN-633.
[039] “Anticorpo anti-VEGF” é um anticorpo que se liga a VEGF com suficiente afinidade e especificidade. Preferencialmente, o anticorpo anti- VEGF de acordo com a presente invenção pode ser utilizado como um agente terapêutico no direcionamento e interferência com doenças ou condições em que é envolvida a atividade de VEGF. Anticorpo anti-VEGF normalmente não se ligará a outros homólogos de VEGF tais como VEGF-B ou VEGF-C, nem outros fatores de crescimento tais como PlGF, PDGF ou bFGF. Um anticorpo anti-VEGF é um anticorpo monoclonal que se liga ao mesmo epítopo do anticorpo anti- VEGF monoclonal A4.6.1 produzido pelo hibridoma ATCC HB 10709. De maior preferência, o anticorpo anti-VEGF é um anticorpo monoclonal anti-VEGF humanizado recombinante gerado de acordo com Presta et al. (1997), Cancer Res. 57: 4593-4599, incluindo, mas sem limitações, o anticorpo conhecido como bevacizumab (BV; Avastin®). Segundo uma outra realização, anticorpos anti- VEGF que podem ser utilizados incluem, mas sem limitações, os anticorpos descritos em WO 2005/012359. Segundo uma realização, o anticorpo anti-VEGF compreende a região leve variável e pesada variável de qualquer um dos anticorpos descritos nas Figuras 24, 25, 26, 27 e 29 de WO 2005/012359 (tais como G6, G6-23, G6-31, G6-23.1, G6-23.2, B20, B20-4 e B20.4.1). Em uma outra realização, o anticorpo anti-VEGF conhecido como ranibizumab é o antagonista de VEGF administrado para doença ocular tal como neuropatia diabética e AMD úmido.
[040] O anticorpo anti-VEGF “Bevacizumab (BV)”, também conhecido como “rhuMAb VEGF” ou “Avastin®”, é um anticorpo monoclonal anti- VEGF humanizado recombinante gerado de acordo com Presta et al. (1997), Cancer Res. 57: 4593-4599. Ele compreende regiões de cadeia principal IgG1 humana que sofreu mutação e regiões determinantes de complementaridade de ligação de antígenos do anticorpo monoclonal anti-hVEGF murino A.4.6.1 que bloqueia a ligação de VEGF humano aos seus receptores. Cerca de 93% da sequência de aminoácidos de Bevacizumab, incluindo a maior porção das regiões de estrutura, são derivados de IgG1 humano e cerca de 7% da sequência são derivados do anticorpo A4.6.1 murino. Bevacizumab possui massa molecular de cerca de 149.000 daltons e é glicosilado. Outros anticorpos anti-VEGF incluem os anticorpos descritos na Patente Norte-Americana n° 6.884.879 e WO 2005/044853.
[041] O anticorpo anti-VEGF Ranibizumab ou o anticorpo LUCENTIS® ou rhuFab V2 é um fragmento de Fab anti-VEGF humano maturado por afinidade humanizado. Ranibizumab é produzido por meio de métodos de tecnologia recombinante padrão em vetor de expressão de E. coli e fermentação de bactérias. Ranibizumab não é glicosilado e possui uma massa molecular de cerca de 48.000 daltons. Vide WO 00/45331 e US 2003/0190317.
[042] Moléculas, tais como anticorpos, caracterizadas por ligação a sobreposição ou áreas similares sobre um alvo podem ser identificadas por meio de testes de ligação/inibição competitiva.
[043] Em uma realização, HUVEC ou outras células que expressam α5β1 são utilizadas em um teste de inibição competitiva e utiliza-se FACS para avaliar localidades de ligação de dois anticorpos anti-α5β1 entre si. Células HUVEC podem ser lavadas, por exemplo, em um tubo cônico e centrifugadas por cinco minutos a 1.000 rpm. O pellet é tipicamente lavado duas vezes. Em seguida, as células podem ser novamente suspensas, contadas e mantidas sobre gelo até a utilização. 100 μL de um primeiro anticorpo anti-α5β1 (tal como a partir de 1 μg/mL de concentração ou concentração inferior) podem ser adicionados ao recipiente. Em seguida, 100 μL (tal como 20 x 105 células) de células podem ser adicionados por cavidade e incubados sobre gelo por trinta minutos. 100 μL de um anticorpo anti-α5β1 biotinilado (5 μg/mL de padrão) podem ser adicionados a cada cavidade e incubados sobre gelo por trinta minutos. As células são lavadas em seguida e peletizadas por cinco minutos a 1000 rpm. O sobrenadante é aspirado. R-Ficoeritrina conjugada a estreptoavidina (Jackson 016-110-084) é adicionada à cavidade (100 μL a 1:1000). Em seguida, a placa pode ser embalada em folha metálica e incubada sobre gelo por trinta minutos. Após a incubação, o pellet pode ser lavado e peletizado por cinco minutos a 1000 rpm. O pellet pode ser novamente suspenso e transferido para tubos de microtítulo para análise de FACS.
[044] “Agente ou fator angiogênico" é um fator de crescimento ou seu receptor que está envolvido no estímulo ao desenvolvimento de vasos sanguíneos, por exemplo, promovendo a angiogênese, o crescimento de células endoteliais, a estabilidade de vasos sanguíneos e/ou vasculogênese etc. Fatores angiogênicos incluem, por exemplo, mas sem limitações, VEGF e membros da família de VEGF e seus receptores (VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, VEGFR1, VEGFR2 e VEGFR3), PlGF, família de PDGF, família de fatores de crescimento de fibroblastos (FGFs), ligantes TIE (angiopoietinas, ANGPT1, ANGPT2), TIE1, TIE2, efrinas, Bv8, ligante 4 similar a Delta (DLL4), Del-1, fatores de crescimento de fibroblastos: ácidos (aFGF) e básicos (bFGF), FGF4, FGF9, BMP9, BMP10, folistatina, fator de estímulo de colônia de granulócitos (G-CSF), GM-CSF, fator de crescimento de hepatócitos (HGF)/fator de difusão (SF), interleucina 8 (IL-8), CXCL12, leptina, midoquina, neuropilinas, NRP1, NRP2, fator de crescimento de placentas, fator de crescimento de células endoteliais derivadas de plaquetas (PD-ECGF), fator de crescimento derivado de plaquetas, especialmente PDGF- BB, PDGFR-alfa ou PDGFR-beta, pleiotrofina (PTN), progranulina, proliferina, fator de crescimento de transformação alfa (TGF-alfa), fator de crescimento de transformação beta (TGF-beta), fator de necrose tumoral alfa (TNF-alfa), Alk1, CXCR4, Notch1, Notch4, Sema 3A, Sema3C, Sema3F, Robo4 etc. Também seriam incluídos fatores que promovem a angiogênese, tais como ESM1 e Perlecan. Também seriam incluídos fatores que aceleram a cura de feridas, tais como hormônio do crescimento, fator de crescimento similar à insulina I (IGF-I), VIGF, fator de crescimento epidérmico (EGF), domínio similar a EGF, múltiplo 7 (EGL7), CTGF, membros da sua família, TGF-alfa e TGF-beta. Vide, por exemplo, Klagsbrun e D’Amore (1991), Annu. Rev. Physiol. 53: 217-39; Streit e Detmar (2003), Oncogene 22: 3172-3179; Ferrara & Alitalo (1999), Nature Medicine 5 (12): 1359-1364; Tonini et al. (2003), Oncogene 22: 6549-6556 (Tabela 1, por exemplo, que relaciona fatores angiogênicos); e Sato (2003), Int. J. Clin. Oncol. 8: 200-206.
[045] “Agente antiangiogênico” ou “inibidor da angiogênese” indica uma substância com baixo peso molecular, polinucleotídeo (incluindo, por exemplo, um RNA inibidor (RNAi ou siRNA)), polipeptídeo, proteína isolada, proteína recombinante, anticorpo ou seus conjugados ou proteínas de fusão, que inibe a angiogênese, vasculogênese ou permeabilidade vascular indesejável, seja direta ou indiretamente. Dever-se-á compreender que o agente antiangiogênico inclui os agentes que ligam e bloqueiam a atividade angiogênica do fator angiogênico ou seu receptor. Agente antiangiogênico, por exemplo, é um anticorpo ou outro antagonista para um agente angiogênico conforme definido acima, tal como anticorpos para VEGF-A ou para o receptor de VEGF-A (tal como receptor de KDR ou receptor de Flt-1), inibidores anti-PDGFR, moléculas pequenas que bloqueiam a sinalização do receptor de VEGF (tal como PTK787/ZK2284, SU6668, SUTENT®/SU11248 (malato de sunitinib), AMG706 ou os descritos, por exemplo, no Pedido de Patente Internacional n° WO 2004/113304). Agentes antiangiogênicos incluem, mas sem limitações, os agentes a seguir: Inibidores de VEGF tais como um antagonista específico de VEGF, inibidor de EGF, inibidores de EGFR, Erbitux® (cetuximab, ImClone Systems, Inc., Branchburg, NJ), Vectibix® (panitumumab, Amgen, Thousand Oaks, CA), inibidores de TIE2, inibidores de IGF1R, inibidores de COX-II (ciclo- oxigenase II), inibidores de MMP-2 (metaloproteinase de matrizes 2) e inibidores de MMP-9 (metaloproteinase de matrizes 9), CP-547.632 (Pfizer Inc., NY, Estados Unidos), Axitinib (Pfizer Inc., AG-013736), ZD-6474 (AstraZeneca), AEE788 (Novartis), AZD-2171), Armadilha de VEGF (Regeneron/Aventis), Vatalanib (também conhecido como PTK-787, ZK-222584: Novartis & Schering AG), Macugen (pegaptanib octassódio, NX-1838, EYE-001, Pfizer Inc./Gilead/Eyetech), IM862 (Cytran Inc. de Kirkland, Wash., Estados Unidos); e angiozima, uma ribozima sintética da Ribozyme (Boulder, Colo.) e Chiron (Emeryville, Calif.) e suas combinações. Outros inibidores da angiogênese incluem trombospondina 1, trombospondina 2, colágeno IV e colágeno XVIII. Os inibidores de VEGF são descritos nas Patentes Norte-Americanas n° 6.534.524 e 6.235.764, ambos os quais são integralmente incorporados para todos os propósitos. Os agentes antiangiogênicos também incluem inibidores da angiogênese nativa, tais como angiostatina, endostatina etc. Vide, por exemplo, Klagsbrun e D’Amore (1991), Annu. Rev. Physiol. 53: 217-39; Streit e Detmar (2003), Oncogene, 22: 3172-3179 (por exemplo, a Tabela 3, que relaciona terapia antiangiogênica em melanoma maligno); Ferrara e Alitalo (1999), Nature Medicine 5 (12): 1359-1364; Tonini et al. (2003), Oncogene 22: 6549-6556 (Tabela 2, por exemplo, que relaciona fatores angiogênicos); e Sato (2003), Int. J. Clin. Oncol. 8: 200-206 (por exemplo, a Tabela 1, que relaciona agentes antiangiogênicos utilizados em testes clínicos).
[046] A expressão “terapia antiangiogênica” designa uma terapia útil para inibir a angiogênese que compreende a administração de um agente antiangiogênico.
[047] “Kd” ou “valor Kd” para um anticorpo anti-VEGF de acordo com a presente invenção, em uma realização, é medido por meio de teste de ligação de VEGF radiomarcado (RIA) realizado com a versão Fab do anticorpo e uma molécula de VEGF, conforme descrito por meio do teste a seguir, que mede a afinidade de ligação de solução de Fabs para VEGF ou por meio de equilíbrio de Fab com uma concentração mínima de VEGF (109) marcado com (125I) na presença de uma série de titulação de VEGF não marcado e captura em seguida de VEGF ligado com uma placa revestida com anticorpo anti-Fab (Chen et al. (1999), J. Mol. Biol., 293, 865, 881). Para estabelecer condições para o teste, placas de microtítulos (Dynex) são revestidas por uma noite com 5 μg/mL de anticorpo anti-Fab de captura (Cappel Labs) em 50 mM de carbonato de sódio (pH 9,6) e bloqueadas em seguida com albumina de soro bovino a 2% (p/v) em PBS por duas a cinco horas à temperatura ambiente (cerca de 23 °C). Em uma placa não adsorvente (Nunc #269620), 100 pM ou 26 pM de [125I] VEGF (109) são misturados com diluições em série de um Fab de interesse (tal como Fab-12 (Presta et al. (1997), Cancer Res. 57: 4593-4599)). O Fab de interesse é incubado em seguida por uma noite; entretanto, a incubação pode prosseguir por 65 horas para garantir que o equilíbrio seja atingido. Em seguida, as misturas são transferidas para a placa de captura para incubação à temperatura ambiente por uma hora. A solução é removida em seguida e a placa é lavada por oito vezes com 0,1% Tween 20 em PBS. Após a secagem das placas, adiciona-se 150 μL/cavidade de cintilante (MicroScint-20; Packard) e as placas são contadas em um contador gama Topcount (Packard) por dez minutos. Concentrações de cada Fab que geram 20% ou menos de ligação máxima são selecionadas para uso em testes de ligação competitiva. Segundo uma outra realização, o Kd ou valor Kd é medido utilizando testes de ressonância de plasma de superfície empregando BIAcore® 2000 ou BIAcore® 3000 (BIAcore, Inc., Piscataway NJ) a 25 °C com lascas de CM5 de hVEGF (8-109) da molécula alvo imobilizada a cerca de dez unidades de resposta (RU). Resumidamente, lascas de biossensores de dextran carboximetilado (CM5, BIAcore Inc.) são ativadas com cloridrato de N-etil-N’-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC) e N- hidroxissuccinimida (NHS) de acordo com as instruções do fornecedor. VEGF humano é diluído com 10 mM de acetato de sódio, pH 4,8, em 5 μg/mL (cerca de 0,2 μM) antes da injeção em velocidade de fluxo de 5 μL/minuto para atingir cerca de dez unidades de resposta (RU) de proteína acoplada. Após a injeção de VEGF humano, 1 M de etanolamina é injetado para bloquear grupos não reagidos. Para medições cinéticas, diluições seriais em duas vezes de Fab (0,78 nM a 500 nM) são injetadas em PBS com 0,05% Tween 20 (PBST) a 25 °C sob velocidade de fluxo de cerca de 25 μL/min. Taxas de associação (kon) e taxas de dissociação (koff) são calculadas utilizando um modelo de ligação Langmuir um a um simples (Software de Avaliação BIAcore versão 3.2) por meio de configuração simultânea do sensograma de associação e dissociação. A constante de dissociação de equilíbrio (Kd) foi calculada como razão koff/kon, (vide, por exemplo, Chen, Y. et al. (1999), J. Mol. Biol., 293: 865-881). Caso a taxa de associação exceda 106 M-1 S-1 por meio do teste de ressonância de plasma de superfície acima, a taxa de associação pode ser determinada utilizando um método de resfriamento fluorescente que mede o aumento ou a redução da intensidade de emissão de fluorescência (excitação = 295 nm; emissão = 340 nm, passagem de faixa de 16 nm) a 25 °C de 20 nM de anticorpo anti-VEGF (forma de Fab) em PBS, pH 7,2, na presença de concentrações crescentes de forma curta de VEGF humano (8-109) ou VEGF de camundongo conforme medido em um espectrômetro, tal como um espectrômetro equipado com fluxo de parada (Aviv Instruments) ou um espectrofotômetro SLM-Aminco série 8000 (ThermoSpectronic) com uma cubeta agitada. Testes de ligação similares podem ser realizados para determinar o Kd de um anticorpo ou Fab anti-α5β1 utilizando α5β1 como alvo.
[048] Da forma utilizada no presente, um paciente a ser tratado é um mamífero (tal como ser humano, primata não humano, rato, camundongo, vaca, cavalo, porco, carneiro, cabra, cão, gato etc.). O paciente pode ser um paciente clínico, um voluntário de teste clínico, um animal experimental etc. O paciente pode ser suspeito de ter ou estar em risco de ter câncer, doença imune ou qualquer outra doença que possua angiogênese anormal, ser diagnosticado com câncer, doença imune ou qualquer outra doença que possua angiogênese anormal. Vários métodos de diagnóstico para câncer, doença imune ou qualquer outra doença que exibe angiogênese anormal e a delineação clínica dessas doenças são conhecidos na técnica. Segundo uma realização, o paciente a ser tratado segundo a presente invenção é um ser humano.
[049] “Angiogênese anormal” ocorre quando novos vasos sanguíneos crescem excessivamente ou de outra forma inadequada (em que, por exemplo, o local, tempo, grau ou início da angiogênese é indesejado do ponto de vista médico) em um estado doente, de forma que cause um estado doente. Em alguns casos, angiogênese excessiva, inadequada ou descontrolada ocorre quando houver crescimento de vasos sanguíneos novos que contribui para a piora do estado doentio ou causa um estado doentio, tal como em câncer, especialmente tumores sólidos vascularizados e tumores metastáticos (que incluem câncer de cólon, câncer de pulmão (especialmente câncer de pulmão de células pequenas) ou câncer de próstata), doenças causadas por neovascularização ocular, especialmente cegueira diabética, retinopatias, principalmente retinopatia diabética ou degeneração macular relacionada à idade, neovascularização coroidal (CNV), edema macular diabético, miopia patológica, mal de Von Hippel-Lindau, histoplasmose do olho, Oclusão da Veia da Retina Central (CRVO), neovascularização da córnea, neovascularização da retina e rubeose; psoríase, artrite psoriática, hemangioblastoma tal como hemangioma; doenças renais inflamatórias, tais como glomerulonefrite, especialmente glomerulonefrite mesangioproliferativa, síndrome urêmica hemolítica, nefropatia diabética ou nefroesclerose hipertensiva; várias doenças inflamatórias, tais como artrite, especialmente artrite reumatoide, doença intestinal inflamatória, psoríase, sarcoidose, arteriosclerose arterial e doenças que ocorrem após transplantes, endometriose ou asma crônica e mais de setenta outras condições. Os novos vasos sanguíneos podem alimentar os tecidos doentes, destruir tecidos normais e, no caso de câncer, os novos vasos podem permitir que células de tumores escapem para a circulação e abriguem-se em outros órgãos (metástases de tumores). A presente invenção contempla o tratamento dos pacientes que estão em risco de desenvolver as doenças mencionadas acima.
[050] “Permeabilidade vascular anormal” ocorre quando o fluxo de fluidos, moléculas (tais como íons e nutrientes) e células (tais como linfócitos) entre os compartimentos vascular e extravascular for excessivo ou inadequado de outra forma (em que, por exemplo, o local, tempo ou início da permeabilidade vascular são indesejados do ponto de vista médico) em um estado doente ou de tal forma que cause um estado doente. A permeabilidade vascular anormal pode gerar “vazamento” excessivo ou inadequado de outra forma de íons, água, nutrientes ou células através da vasculatura. Em alguns casos, permeabilidade vascular excessiva, descontrolada ou de outra forma inadequada ou vazamento vascular exacerba ou induz estados de doença que incluem, por exemplo, edema associado a tumores que incluem, por exemplo, tumores do cérebro; ascite associada a malignidades; síndrome de Meigs; inflamação pulmonar; síndrome nefrótica; efusão pericardial; efusão pleural; permeabilidade associada a doenças cardiovasculares tal como a condição após enfartes do miocárdio, apoplexias e similares. A presente invenção contempla o tratamento dos pacientes que desenvolveram ou encontram-se em risco de desenvolver as doenças e distúrbios associados ao vazamento ou permeabilidade vascular anormal.
[051] Outros pacientes que são candidatos para receber os anticorpos ou polipeptídeos de acordo com a presente invenção possuem, ou encontram-se em risco de desenvolver proliferação anormal de tecido fibrovascular, acne rosácea, síndrome da imunodeficiência adquirida, oclusão arterial, queratite atópica, úlceras bacterianas, mal de Bechets, tumores no sangue, mal de obstrução da carótida, neovascularização coroidal, inflamação crônica, deslocamento da retina crônico, uveíte crônica, vitrite crônica, desgaste excessivo de lentes de contato, rejeição de enxerto da córnea, neovascularização da córnea, neovascularização de enxerto da córnea, mal de Crohn, mal de Eales, ceratoconjuntivite epidérmica, úlceras fúngicas, infecções por simplex da Herpes, infecções por Herpes-zóster, síndromes de hiperviscosidade, sarcoma de Kaposi, leucemia, degeneração de lipídios, mal de Lyme, queratólise marginal, úlcera de Mooren, infecções por micobactérias diferentes de hanseníase, miopia, doença neovascular ocular, caroços óticos, síndrome de Osler-Weber (Osler-Weber-Rendu, osteoartrite, mal de Pagets, pars planitis, penfigoide, filectenulose, poliartrite, complicações pós-laser, infecções por protozoários, pseudoxantoma elástico, queratite seca de pterígio, queratotomia radial, neovascularização da retina, retinopatia do prematuro, fibroplasias retrolentas, sarcoide, esclerite, anemia de células falciformes, síndrome de Sogrens, tumores sólidos, mal de Stargarts, mal de Stevens Johnson, queratite límbica superior, sífilis, lúpus sistêmico, degeneração marginal de Terrien, toxoplasmose, trauma, tumores de sarcoma de Ewing, tumores de neuroblastoma, tumores de osteossarcoma, tumores de retinoblastoma, tumores de rabdomiossarcoma, colite ulcerativa, obstrução das veias, sarcoidose de Wegeners e deficiência de Vitamina A, angiogênese indesejada associada à diabete, doenças parasíticas, cura anormal de feridas, hipertrofia após cirurgia, lesão ou trauma, inibição do crescimento capilar, inibição da ovulação e formação de corpus luteum, inibição de implantes e inibição do desenvolvimento de embriões no útero.
[052] Terapias antiangiogênese são úteis no tratamento geral de rejeição de enxertos, inflamações do pulmão, síndrome nefrótica, pré-eclâmpsia, efusão do pericárdio, tal como a associada à pericardite, e efusão pleural, doenças e distúrbios caracterizados por vazamento ou permeabilidade vascular indesejável, tal como edema associado a tumores que incluem, por exemplo, tumores do cérebro, ascite associada a malignidades, síndrome de Meigs, inflamação dos pulmões, síndrome nefrótica, efusão do pericárdio, efusão pleural, permeabilidade associada a doenças cardiovasculares tais como a condição após enfartes do miocárdio, apoplexias e similares. Outras doenças dependentes de angiogênese de acordo com a presente invenção incluem angiofibroma (sangue anormal de vasos que são propensos a sangramento), glaucoma neovascular (crescimento de vasos sanguíneos no olho), más formações arteriovenosas (comunicação anormal entre artérias e veias), fraturas sem união (fraturas que não curam), placas arterioscleróticas (endurecimento das artérias), granuloma piogênico (lesão comum da pele composta de vasos sanguíneos), escleroderma (uma forma de doença de tecido conectivo), hemangioma (tumor composto de vasos sanguíneos), tracoma (principal causa de cegueira no terceiro mundo), juntas hemofílicas, adesões vasculares e cicatrizes hipertróficas (formação anormal de cicatrizes).
[053] Da forma utilizada, “tratamento” (e suas variações gramaticais, tais como “tratar” ou “tratando”) designa a administração de um composto ou composição farmacêutica para fins profiláticos e/ou terapêuticos. Para “tratar doença” ou uso para “tratamento terapêutico” designa tratamento de administração a pacientes que já sofrem de uma doença para melhorar a condição do paciente. Os efeitos desejáveis de tratamento incluem, mas sem limitações, a prevenção da reincidência da doença, alívio dos sintomas, redução de quaisquer consequências patológicas diretas ou indiretas da doença, prevenção de metástase, redução da velocidade de progresso da doença, melhoria ou redução do estado doentio e remissão ou melhor prognóstico. Em algumas realizações, os anticorpos de acordo com a presente invenção são utilizados para retardar o desenvolvimento de uma doença ou reduzir a velocidade do progresso de uma doença. Preferencialmente, o paciente é diagnosticado como sofrendo de uma doença que possui angiogênese anormal, com base na identificação de qualquer um dos sintomas característicos descritos abaixo ou no uso dos métodos de diagnóstico descritos no presente. “Evitar doença” designa tratamento profilático de um paciente que ainda não está doente, mas que é susceptível a desenvolver uma doença específica, ou encontra-se em risco, de outra forma, de desenvolvê-la. Preferencialmente, determina-se que um paciente encontra-se em risco de desenvolver uma doença que possui angiogênese anormal utilizando os métodos de diagnóstico descritos no presente.
[054] “Tratamento ou melhoria” indica a melhoria de uma condição ou sintomas da condição antes ou depois do seu início. Em comparação com controle não tratado equivalente, essa melhoria ou grau de tratamento é de pelo menos 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ou 100%, conforme medido por meio de qualquer método padrão.
[055] Os termos “recorrência”, “reincidência” ou “reincidente” designam o retorno de um câncer ou doença após a determinação clínica do desaparecimento da doença. Um diagnóstico de metástase distante ou recorrência local pode ser considerado reincidência.
[056] “Refratário” indica a resistência ou falta de reação de uma doença ou condição a um tratamento (o número de células de plasma neoplásticas, por exemplo, aumenta apesar do fornecimento de tratamento). Em certas realizações, o termo “refratário” designa resistência ou falta de reação a qualquer tratamento anterior, incluindo, mas sem limitações, antagonista de VEGF, agentes antiangiogênicos e tratamentos quimioterápicos. Em certas realizações, o termo “refratário” designa falta de reação intrínseca de uma doença ou condição a qualquer tratamento anterior que compreenda um antagonista de VEGF, agentes antiangiogênicos e/ou tratamentos quimioterápicos. Em certas realizações, o antagonista de VEGF é um anticorpo anti-VEGF.
[057] “Reincidente” indica a regressão da doença do paciente para o seu estado doente anterior, especialmente o retorno de sintomas após uma recuperação aparente ou parcial. Em certas realizações, estado reincidente designa o processo de retorno à doença antes do tratamento anterior, que inclui, mas sem limitações, antagonista de VEGF, agentes antiangiogênicos e/ou tratamentos quimioterápicos. Em certas realizações, estado reincidente indica o processo de retorno à doença após uma forte reação inicial a uma terapia de câncer que compreende um antagonista de VEGF, agentes antiangiogênicos e/ou tratamentos quimioterápicos. Em certas realizações, o antagonista de VEGF é um anticorpo anti-VEGF.
[058] A expressão “terapia adjuvante” designa o tratamento fornecido após a terapia primária, normalmente cirurgia. Terapia adjuvante para câncer ou doença pode incluir terapia imune, quimioterapia, terapia de radiação ou terapia hormonal.
[059] A expressão “terapia de manutenção” designa novo tratamento programado que é fornecido para ajudar a manter os efeitos de um tratamento anterior. Terapia de manutenção é frequentemente administrada para ajudar a manter o câncer em remissão ou prolongar uma reação a uma terapia específica, independentemente do progresso da doença.
[060] A expressão “câncer invasivo” designa um câncer que se espalhou além da camada de tecido na qual começou para os tecidos vizinhos normais. Cânceres invasivos podem ou não ser metastáticos.
[061] A expressão “câncer não invasivo” designa um câncer muito precoce ou um câncer que não se espalhou além do tecido de origem.
[062] A expressão “sobrevivência livre de progresso” em oncologia designa o período de tempo durante e após o tratamento em que um câncer não cresce. Sobrevivência livre de progresso inclui o período de tempo em que os pacientes experimentaram reação completa ou reação parcial, bem como o período de tempo em que os pacientes experimentaram doença estável.
[063] A expressão “doença progressiva” em oncologia pode designar um crescimento de tumor de mais de 20% desde o início do tratamento, seja devido a um aumento de massa ou a uma difusão do tumor.
[064] “Distúrbio” é qualquer condição que se beneficiaria do tratamento com o anticorpo. Por exemplo, mamíferos que sofrem ou necessitam de profilaxia contra angiogênese anormal (angiogênese excessiva, inadequada ou descontrolada) ou permeabilidade vascular anormal ou vazamento. Isso inclui doenças ou distúrbios agudos e crônicos que incluem as condições patológicas que predispõem o mamífero ao distúrbio em questão. Exemplos não limitadores de distúrbios a serem tratados no presente incluem tumores benignos e malignos; não leucemias e malignidades linfoides; distúrbios neuronais, gliais, astrocitais, hipotalâmicos e outros glandulares, macrofagais, epiteliais, estromais e blastocoélicos; e distúrbios inflamatórios, angiogênicos e imunológicos.
[065] Os termos “câncer” e “canceroso” designam ou descrevem a condição fisiológica em mamíferos que é tipicamente caracterizada pelo crescimento celular desregulado. Exemplos de câncer incluem, mas sem limitações, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma e leucemia. Exemplos mais específicos desses cânceres incluem câncer de células escamosas, glioblastoma, câncer cervical, câncer de ovário, câncer de fígado, câncer de bexiga, hepatoma, câncer de mama, câncer de cólon, câncer colorretal, carcinoma de endométrio, carcinoma de glândulas salivares, câncer de fígado, câncer renal, câncer de próstata, câncer de vulva, câncer de tireoide, carcinoma hepático, câncer de cabeça e pescoço, câncer retal, câncer colorretal, câncer de pulmão incluindo câncer de pulmão de células pequenas, câncer de pulmão de células não pequenas, adenocarcinoma de pulmão e carcinoma escamoso de pulmão, câncer de células escamosas (tal como câncer de células escamosas epitelial), câncer de próstata, câncer de peritônio, câncer hepatocelular, câncer gástrico ou estomacal incluindo câncer gastrointestinal, câncer pancreático, glioblastoma, retinoblastoma, astrocitoma, tecomas, arrenoblastomas, hepatoma, malignidades hematológicas que incluem linfoma não de Hodgkins (NHL), mieloma múltiplo e malignidades hematológicas agudas, carcinoma endometrial ou uterino, endometriose, fibrossarcomas, coriocarcinoma, carcinoma de glândulas salivares, câncer de vulva, câncer de tireoide, carcinomas de esôfago, carcinoma hepático, carcinoma anal, carcinoma peniano, carcinoma nasofaríngeo, carcinomas de laringe, sarcoma de Kaposi, melanoma, carcinomas de pele, Schwannoma, oligodendroglioma, neuroblastomas, rabdomiossarcoma, sarcoma osteogênico, leiomiossarcomas, carcinomas de trato urinário, carcinomas de tireoide, tumor de Wilm, bem como linfoma de células B (incluindo linfoma não de Hodgkin (NHL) folicular/de baixo grau; NHL linfocítico pequeno (SL); NHL folicular/de grau intermediário; NHL difuso de grau intermediário; NHL imunoblástico de alto grau; NHL linfoblástico de alto grau; NHL de células não divididas pequenas de alto grau; NHL de doença volumosa; linfoma de células manto; linfoma relativo à AIDS; e Macroglobulinemia de Waldenstrom); leucemia linfocítica crônica (CLL); leucemia linfoblástica aguda (ALL); leucemia de células cabeludas; leucemia mieloblástica crônica; e distúrbio linfoproliferativo pós-transplante (PTLD), bem como proliferação vascular anormal associada a facomatoses e síndrome de Meigs.
[066] “Tumor”, da forma utilizada no presente, indica toda proliferação e crescimento de células neoplásticas, sejam elas malignas ou benignas, e todas as células e tecidos pré-cancerosos e cancerosos.
[067] A expressão “composição antineoplásica” ou “agente antineoplásico” designa uma composição útil no tratamento de câncer que compreende pelo menos um agente terapêutico ativo, tal como “agente anticancerígeno”. Exemplos de agentes terapêuticos (agentes anticancerígenos) incluem, mas sem limitações, por exemplo, agentes quimioterápicos, agentes inibidores de crescimento, agentes citotóxicos, agentes utilizados em terapia de radiação, agentes antiangiogênese, agentes apoptóticos, agentes antitubulina e outros agentes para o tratamento de câncer, tais como anticorpos anti-HER-2, anticorpos anti-CD20, um antagonista receptor de fator de crescimento epidérmico (EGFR) (tal como um inibidor de tirosina quinase), inibidor de HER1/EGFR (tal como erlotinib (Tarceva®), inibidores de fator de crescimento derivado de plaquetas (tais como Gleevec® (Mesilato de Imatinib)), um inibidor de COX-2 (tal como celecoxib), interferons, citocinas, antagonistas (tais como anticorpos neutralizantes) que se ligam a um ou mais dos receptores de ErbB2, ErbB3, ErbB4, PDGFR-beta, BAFF, BR3, APRIL, BCMA ou VEGF alvo, TRAIL/Apo2, outros agentes químicos orgânicos e bioativos, etc. Suas combinações também são contempladas na presente invenção.
[068] “Agente inibidor de crescimento”, da forma utilizada no presente, designa um composto ou composição que inibe o crescimento ou proliferação de uma célula in vitro e/ou in vivo. Desta forma, o agente inibidor de crescimento pode ser aquele que reduz significativamente o percentual de células em fase S. Exemplos de agentes inibidores do crescimento incluem agentes que bloqueiam o progresso do ciclo celular (em local diferente da fase S), tais como agentes que induzem a suspensão de G1 e a suspensão da fase M. Os bloqueadores clássicos da fase M incluem as vincas (vincristina e vimblastina), TAXOL® e inibidores topo II, tais como doxorrubicina, epirrubicina, daunorrubicina, etoposida e bleomicina. Os agentes que suspendem G1 também invadem a suspensão da fase S, tais como agentes alquilantes de DNA, como tamoxifen, prednisona, dacarbazina, mecloretamina, cisplatina, metotrexato, 5- fluorouracil e ara-C. Informações adicionais podem ser encontradas em The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn e Israel, eds., Capítulo 1, intitulado Cell Cycle Regulation, Oncogenes and Antineoplastic Drugs de Murakami et al. (WB Saunders: Filadélfia, 1995), especialmente pág. 13.
[069] A expressão “agente citotóxico”, da forma utilizada no presente, indica uma substância que inibe ou evita o funcionamento das células e/ou causa destruição das células. A expressão destina-se a incluir isótopos radioativos (tais como I131, I125, Y90 e Re186), agentes inibidores do crescimento, agentes quimioterápicos e toxinas, tais como toxinas enzimaticamente ativas de origem animal, vegetal, fúngica ou bacteriana, ou seus fragmentos.
[070] “Agente quimioterápico” é um composto químico útil no tratamento de câncer. Exemplos de agentes quimioterápicos são compostos químicos úteis no tratamento de câncer. Exemplos de agentes quimioterápicos incluem agentes alquilantes, tais como tiotepa e ciclofosfamida CYTOXAN®; sulfonatos de alquila, tais como busulfan, improsulfan e piposulfan; aziridinas, tais como benzodopa, carboquona, meturedopa e uredopa; etilenoiminas e metilamelaminas, incluindo altretamina, trietilenomelamina, trietilenofosforamida, trietilenotiofosforamida e trimetilolomelamina; acetogeninas (especialmente bulatacina e bulatacinona); camptotecina (incluindo o análogo sintético topotecan); briostatina; calistatina; CC-1065 (incluindo seus análogos sintéticos de adozelesina, carzelesina e bizelesina); criptoficinas (particularmente criptoficina 1 e criptoficina 8); dolastatina; duocarmicina (incluindo os análogos sintéticos, KW-2189 e CB1-TM1); eleuterobina; pancratistatina; sarcodictiina; espongistatina; mostardas de nitrogênio, tais como clorambucil, clornafazina, colofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, cloridrato óxido de mecloretamina, melfalan, novembichina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostarda de uracil; nitrosureias, tais como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina e ranimustina; antibióticos, tais como os antibióticos de enediina (por exemplo, caliqueamicina, especialmente caliqueamicina gama 1I e caliqueamicina ômega I1 (vide, por exemplo, Agnew, Chem. Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994); dinemicina, incluindo dinemicina A; bisfosfonatos, tais como clodronato; esperamicina; bem como neocarzinostatin cromoforo e cromoforos antibióticos de enediina cromoproteína relacionados), aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorubicina, detorrubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorubicina ADRIAMYCIN® (incluindo morfolino-doxorrubicina, cianomorfolino- doxorrubicina, 2-pirrolin-doxorrubicina e desoxidoxorubicina), epirrubicina, esorrubicina, idarrubicina, marcelomicina, mitomicinas tais como mitomicina C, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorrubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorrubicina; antimetabólitos, tais como metotrexato e 5-fluorouracil (5-FU); análogos de ácido fólico, tais como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos de purina, tais como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina, tais como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, dideoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina; andrógenos, tais como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; antiadrenais, tais como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; reabastecedor de ácido fólico, tal como ácido frolínico; aceglatona; aldofosfamido glicosídeo; ácido aminolevulínico; eniluracil; amsacrina; bestrabucil; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diaziquona; elfornitina; acetato de eliptínio; epotilona; etoglucídeo; nitrato de gálio; hidroxiureia; lentinan; lonidainina; maitansinoides, tais como maitansina e ansamitocinas; mitoguazona; mitoxantrona; mopidamol; nitraerina; pentostatina; fenamet; pirarrubicina; losoxantrona; ácido podofilínico; 2-etil hidrazida; procarbazina; complexo de polissacarídeos PSK® (JHS Natural Products, Eugene OR); razoxano; rizoxina; sizofiran; espirogermânio; ácido tenuazônico; triaziquona; 2,2’,2”-triclorotrietilamina; tricotecenos (especialmente toxina T-2, verracurina A, roridina A e anguidina); uretano; vindesina; dacarbazina; manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobroman; gacitosina; arabinosida (“Ara-C”); ciclofosfamida; tiotepa; taxoides, tais como paclitaxel TAXOL® (Bristol- Myers Squibb Oncology, Princeton NJ), ABRAXANE® livre de Cremophor, formulação de nanopartículas de paclitaxel elaborada com albumina (American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Illinois) e doxetaxel TAXOTERE® (Rhône-Poulenc Rorer, Antony, França); clorambucil; gemcitabina GEMZAR®; 6- tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; análogos de platina tais como cisplatina e carboplatina; vinblastina; platina; etoposida (VP-16); ifosfamida; mitoxantrona; vincristina; vinorelbina NAVELBINE®; novantrona; teniposida; edatrexato; daunomicina; aminopterina; xeloda; ibandronato; irinotecan (Camptosar, CPT-11) (incluindo o regime de tratamento de irinotecan com 5-FU e leucovorina); inibidor de topoisomerase RFS 2000; difluorometilornitina (DMFO); retinoides, tais como ácido retinoico; capecitabina; combrestatina; leucovorina (LV); oxaliplatina, incluindo o regime de tratamento de oxaliplatina (FOLFOX); inibidores de PKC-alfa, Raf, H-Ras e EGFR (tais como erlotinib (Tarceva®)) que reduzem a proliferação celular e sais, ácidos ou derivados farmaceuticamente aceitáveis de quaisquer dos acima.
[071] Agentes quimioterápicos também incluem agentes anti- hormonais que agem para regular ou inibir a ação hormonal sobre tumores tais como antiestrógenos e moduladores receptores de estrógenos seletivos (SERMs), que incluem, por exemplo, tamoxifeno (incluindo tamoxifeno NOLVADEX®), raloxifeno, droloxifeno, 4-hidroxitamoxifeno, trioxifeno, queoxifeno, LY117018, onapristona e toremifeno FARESTON; inibidores da aromatase que inibem a enzima aromatase, que regula a produção de estrógenos nas glândulas adrenais, tais como 4 (5)-imidazóis, aminoglutetimida, acetato de megestrol MEGASE®, exemestano AROMASIN®, formestanie, fadrozol, vorozol RIVISOR®, letrozol FEMARA® e anastrozol ARIMIDEX®; e antiandrógenos, tais como flutamida, nilutamida, bicalutamida, leuprolida e goserelin; bem como troxacitabina (análogo de citosina nucleosídeo de 1,3- dioxolano); oligonucleotídeos sem sentido, particularmente os que inibem a expressão de genes em processos de sinalização relacionados à proliferação celular aberrante, tais como PKC-alfa, Ralf e H-Ras; ribozimas, tais como inibidor da expressão de VEGF (por exemplo, ribozima ANGIOZYME®) e inibidor da expressão de HER2; vacinas, tais como vacinas de terapia genética, por exemplo vacina ALLOVECTIN®, vacina LEUVECTIN® e vacina VAXID®; rIL-2 PROLEUKIN®; inibidor da topoisomerase 1 LURTOTECAN®; rmRH ABARELIX®; Vinorelbina e Esperamicinas (vide a Patente Norte-Americana n° 4.675.187) e sais, ácidos ou derivados farmaceuticamente aceitáveis de quaisquer dos acima.
[072] O termo “pró-droga”, da forma utilizada no presente pedido, designa uma forma precursora ou derivada de uma substância farmaceuticamente ativa (tal como molécula pequena) que é menos citotóxica para células doentes em comparação com a droga parental e é capaz de ser ativada de forma enzimática ou convertida na forma parental mais ativa. Vide, por exemplo, Wilman, Prodrugs in Cancer Chemotherapy, Biochemical Society Transactions, 14, págs. 375-382, 615a Reunião de Belfast (1986) e Stella et al., Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery, Directed Drug Delivery, Borchardt et al., (ed.), págs. 247-267, Humana Press (1985). As pró- drogas de acordo com a presente invenção incluem, mas sem limitações, pró- drogas que contêm fosfato, pró-drogas que contêm tiofosfato, pró-drogas que contêm sulfato, pró-drogas que contêm peptídeos, pró-drogas modificadas com D-aminoácidos, pró-drogas glicosiladas, pró-drogas que contêm β-lactama, pró- drogas que contêm fenoxiacetamida opcionalmente substituída ou pró-drogas que contêm fenilacetamida opcionalmente substituída, 5-fluorocitosina e outras pró-drogas de 5-fluorouridina que podem ser convertidas na droga livre citotóxica mais ativa. Exemplos de drogas citotóxicas que podem ser derivadas em forma de pró-droga para uso na presente invenção incluem, mas sem limitações, os agentes quimioterápicos descritos acima.
[073] “Isolado”, quando utilizado para descrever os vários polipeptídeos descritos no presente, indica polipeptídeo que foi identificado e separado e/ou recuperado a partir de uma célula ou cultivo celular do qual foi expresso. Os componentes contaminantes do seu ambiente natural são materiais que tipicamente interfeririam com utilizações diagnósticas ou terapêuticas para o polipeptídeo e podem incluir enzimas, hormônios e outros solutos proteináceos ou não proteináceos. Em realizações, o polipeptídeo será purificado (1) até um grau suficiente para a obtenção de pelo menos quinze resíduos de sequência de aminoácidos interna ou N-terminal, utilizando um sequenciador de xícaras de centrifugação; ou (3) até a homogeneidade, por meio de SDS-PAGE, sob condições redutoras ou não redutoras, utilizando azul de Coomassie ou, preferencialmente, manchas de prata. O polipeptídeo isolado inclui o polipeptídeo in situ em células recombinantes, já que pelo menos um componente do ambiente natural do polipeptídeo não estará presente. Normalmente, entretanto, o polipeptídeo isolado será preparado por meio de pelo menos uma etapa de purificação.
[074] Ácido nucleico codificador de polipeptídeo “isolado” ou outro ácido nucleico codificador de polipeptídeo é uma molécula de ácido nucleico que é identificada e separada de pelo menos uma molécula de ácido nucleico contaminante com a qual normalmente é associada na fonte natural do ácido nucleico codificador de polipeptídeo. Uma molécula de ácido nucleico codificadora de polipeptídeo isolada é diferente na forma ou ambiente em que é encontrada na natureza. As moléculas de ácido nucleico codificadoras de polipeptídeos isoladas são diferenciadas, portanto, da molécula de ácido nucleico codificadora de polipeptídeo específica que existe em células naturais. Uma molécula de ácido nucleico codificadora de polipeptídeo isolada inclui, entretanto, moléculas de ácido nucleico codificadoras de polipeptídeo contidas em células que normalmente expressam o polipeptídeo no qual, por exemplo, a molécula de ácido nucleico encontra-se em um local cromossômico diferente de células naturais.
[075] A expressão “sequências de controle” designa sequências de DNA necessárias para a expressão de uma sequência de codificação ligada operativamente em um organismo hospedeiro específico. As sequências de controle que são apropriadas para procariontes, por exemplo, incluem um promotor, opcionalmente uma sequência operadora e um local de ligação de ribossomos. As células eucarióticas são conhecidas por utilizarem promotores, sinais de poliadenilação e enhancers.
[076] Ácido nucleico é “ligado operativamente” quando é colocado em relação funcional com uma outra sequência de ácido nucleico. DNA para uma sequência prévia ou líder de secreção, por exemplo, é ligado operativamente a DNA para um polipeptídeo caso seja expresso na forma de proteína prévia que participa da secreção do polipeptídeo; um promotor ou enhancer é ligado operativamente a uma sequência de codificação caso afete a transcrição da sequência; ou um local de ligação de ribossomos é ligado operativamente a uma sequência de codificação caso seja posicionado de forma a possibilitar a tradução. Geralmente, “ligado operativamente” indica que as sequências de DNA que são ligadas são contíguas e, no caso de líder de secreção, contíguas e em fase de leitura. Os enhancers, entretanto, não necessitam ser contíguos. A ligação é obtida por meio de ligação em locais de restrição convenientes. Caso esses locais não existam, os adaptadores de oligonucleotídeos sintéticos ou ligantes são utilizados de acordo com a prática convencional.
[077] “Condições estringentes” ou “condições de alta estringência”, da forma definida no presente, podem ser identificadas por aquelas que: (1) empregam baixa resistência iônica e alta temperatura para lavagem, tal como 0,015 M de cloreto de sódio/0,0015 M de citrato de sódio/0,1% de dodecil sulfato de sódio a 50 °C; (2) empregam durante a hibridização um agente desnaturante, tal como formamida, por exemplo 50% (v/v) formamida com albumina de soro bovino a 0,1%/0,1% Ficoll/0,1% polivinilpirrolidona/50 mM de tampão fosfato de sódio sob pH 6,5 com 750 mM de cloreto de sódio, 75 mM de citrato de sódio a 42 °C; ou (3) hibridização por uma noite em uma solução que emprega 50% de formamida, 5 x SSC (0,75 M de NaCl, 0,075 M de citrato de sódio), 50 mM de fosfato de sódio (pH 6,8), 0,1% pirofosfato de sódio, 5 x solução de Denhardt, DNA de esperma de salmão sonicado (50 μg/mL), 0,1% SDS e 10% sulfato de dextran a 42 °C, com lavagem por dez minutos a 42 °C em 0,2 x SSC (cloreto de sódio/citrato de sódio), seguidos por lavagem em alta estringência por dez minutos que consiste em 0,1 x SSC contendo EDTA a 55 °C.
[078] As sequências de aminoácidos descritas no presente são sequências de aminoácidos contíguas, a menos que especificado em contrário. Da forma utilizada no presente, o termo “imunoadesina” designa moléculas similares a anticorpos que combinam a especificidade de ligação de uma proteína heteróloga (“uma adesina”) com as funções efetoras de domínios constantes de imunoglobulina. Estruturalmente, as imunoadesinas compreendem uma fusão de uma sequência de aminoácidos com a especificidade de ligação desejada, que é diferente do local de ligação e reconhecimento de antígenos de um anticorpo (ou seja, é “heteróloga”) e uma sequência de domínio constante de imunoglobulina. A parte de adesina de uma molécula de imunoadesina é tipicamente uma sequência de aminoácidos contígua que compreende pelo menos o local de ligação de um receptor ou ligante, tal como VEGFR ou um ligante de fibronectina. A sequência de domínio constante de imunoglobulina na imunoadesina pode ser obtida a partir de qualquer imunoglobulina, tal como os subtipos IgG-1, IgG-2, IgG-3 ou IgG-4, IgA (incluindo IgA-1 e IgA-2), IgE, IgD ou IgM. Corpos de peptídeos, que frequentemente compreendem uma sequência derivada da seleção de disposição de fagos de sequências que ligam especificamente um alvo fundido a uma porção Fc de uma imunoglobulina, podem ser considerados imunoadesinas no presente.
[079] O termo “anticorpo” é utilizado no sentido mais amplo e cobre especificamente, por exemplo, anticorpos monoclonais isolados (incluindo anticorpos agonistas, antagonistas e neutralizantes), composições de anticorpos com especificidade poliepitópica, anticorpos policlonais, anticorpos de fita única e fragmentos de anticorpos (vide abaixo), desde que liguem especificamente um polipeptídeo nativo e/ou exibam uma atividade biológica ou atividade imunológica de acordo com a presente invenção. Segundo uma realização, o anticorpo liga-se a uma forma oligomérica de uma proteína alvo, tal como uma forma trimérica. Segundo uma outra realização, o anticorpo liga-se especificamente a uma proteína, ligação esta que pode ser inibida por um anticorpo monoclonal de acordo com a presente invenção (tal como um anticorpo depositado de acordo com a presente invenção etc.). A expressão “fragmento funcional ou análogo” de um anticorpo é um composto que possui uma atividade biológica qualitativa em comum com um anticorpo ao qual se está referindo. Um análogo ou fragmento funcional de um anticorpo de acordo com a presente invenção pode ser, por exemplo, um que possa ligar-se especificamente a VEGF ou α5β1. Em uma realização, o anticorpo pode evitar ou reduzir substancialmente a capacidade de indução da proliferação celular de um VEGF.
[080] “Anticorpo isolado” é aquele que tenha sido identificado, separado e/ou recuperado a partir de um componente do seu ambiente natural. Os componentes contaminantes do seu ambiente natural são materiais que interfeririam com utilizações em diagnóstico ou terapêuticas para o anticorpo e podem incluir enzimas, hormônios e outros solutos proteináceos ou não proteináceos. Em realizações, o anticorpo será purificado (1) até mais de 95% em peso de anticorpo, conforme determinado por meio do método de Lowry, e, de maior preferência, mais de 99% em peso; (2) até grau suficiente para a obtenção de pelo menos quinze resíduos de sequência de aminoácidos interna ou N-terminal, utilizando um sequenciador de xícara de centrifugação; ou (3) até a homogeneidade, por meio de SDS-PAGE, sob condições redutoras ou não redutoras, utilizando azul de Coomassie ou, preferencialmente, manchas de prata. Anticorpo isolado inclui o anticorpo in situ em células recombinantes, desde que pelo menos um componente do ambiente natural do anticorpo não esteja presente. Normalmente, entretanto, o anticorpo isolado será preparado por meio de pelo menos uma etapa de purificação.
[081] A unidade básica de anticorpo de quatro cadeias é uma glicoproteína heterotetramérica composta de duas cadeias leves (L) idênticas e duas cadeias pesadas (H) idênticas (um anticorpo IgM consiste em cinco das unidades heterotetraméricas básicas, juntamente com um polipeptídeo adicional denominado cadeia J, contendo, portanto, dez locais de ligação de antígenos, enquanto os anticorpos IgA secretados podem polimerizar-se para formar conjuntos polivalentes que compreendem duas a cinco das unidades de quatro cadeias básicas junto com a cadeia J). No caso de IgGs, a unidade de quatro cadeias é geralmente de cerca de 150.000 daltons. Cada cadeia L é ligada a uma cadeia H por uma ligação de dissulfeto covalente, enquanto as duas cadeias H são ligadas entre si por uma ou mais ligações de dissulfeto, dependendo do isotipo de cadeia H. Cada cadeia H e L também contém pontes de dissulfeto intracadeias em espaços regulares. Cada cadeia H contém, no terminal N, um domínio variável (VH) seguido por três domínios constantes (CH) para cada uma das cadeias α e Y e quatro domínios CH para os isotipos μ e ε. Cada cadeia L contém, no terminal N, um domínio variável (VL) seguido por um domínio constante (CL) na sua outra extremidade. O VL é alinhado ao VH e o CL é alinhado ao primeiro domínio constante da cadeia pesada (CH1). Acredita-se que resíduos de aminoácidos específicos formem uma superfície intermediária entre os domínios variáveis de cadeia leve e de cadeia pesada. O emparelhamento de VH e VL entre si forma um local de ligação de antígenos isolado. Para a estrutura e propriedades das diferentes classes de anticorpos, vide, por exemplo, Basic and Clinical Immunology, oitava edição, Daniel P. Stites, Abba I. Terr e Tristram G. Parslow (eds.), Appleton & Lange, Norwalk CT, 1994, pág. 71 e Capítulo 6.
[082] A cadeia L de qualquer espécie de vertebrado pode ser classificada em um dentre dois tipos claramente distintos, denominados capa e lambda, com base nas sequências de aminoácidos dos seus domínios constantes. Dependendo da sequência de aminoácidos do domínio constante das suas cadeias pesadas (CH), as imunoglobulinas podem ser atribuídas a diferentes classes ou isotipos. Existem cinco classes de imunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, que contêm cadeias pesadas denominadas α, δ, Y, ε, e μ, respectivamente. As classes Y e α são adicionalmente divididas em subclasses com base em diferenças relativamente menores de função e sequência CH; seres humanos, por exemplo, expressam as subclasses a seguir: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2.
[083] O termo “variável” designa o fato de que certos segmentos dos domínios variáveis diferem extensamente de sequência entre os anticorpos. O domínio V media a ligação de antígenos e define a especificidade de um anticorpo específico para o seu antígeno específico. A variabilidade não é distribuída regularmente, entretanto, ao longo da série de 110 aminoácidos dos domínios variáveis. Ao contrário, as regiões V consistem de estiramentos relativamente invariáveis denominados regiões de estrutura (FRs) de quinze a trinta aminoácidos separados por regiões mais curtas de extrema variabilidade, denominadas “regiões hipervariáveis”, que contêm de nove a doze aminoácidos de comprimento cada uma. Cada um dos domínios variáveis de cadeia leve e pesada compreende quatro FRs, que adotam em grande parte configuração de folha beta, conectadas por três regiões hipervariáveis, que formam circuitos que conectam e, em alguns casos, fazem parte da estrutura de folha beta. As regiões hipervariáveis de cada cadeia são mantidas juntas em boa proximidade pelas FRs e, com as regiões hipervariáveis da outra cadeia, contribuem para a formação do local de ligação de antígenos de anticorpos (vide Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edição, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda MD (1991)). Os domínios constantes não estão diretamente envolvidos na ligação de um anticorpo a um antígeno, mas exibem diversas funções efetoras, tais como a participação do anticorpo em citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC).
[084] A expressão “região hipervariável”, quando utilizada no presente, designa os resíduos de aminoácidos de um anticorpo que são responsáveis pela ligação aos antígenos. A região hipervariável compreende, geralmente, resíduos de aminoácidos de uma “região determinante de complementaridade” ou “CDR” (tal como resíduos 24 a 34 (L1), 50 a 56 (L2) e 89 a 97 (L3) no VL, e cerca de 31 a 35B (H1), 50 a 65 (H2) e 95 a 102 (H3) no VH (em uma realização, H1 é de cerca de 31 a 35); Kabat et al., acima e/ou os resíduos de um “circuito hipervariável” (tais como os resíduos 26 a 32 (L1), 50 a 52 (L2) e 91 a 96 (L3) no VL, e 26 a 32 (H1), 53 a 55 (H2) e 96 a 101 (H3) no VH; Chothia e Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)).
[085] Ao longo de todo o presente relatório descritivo e reivindicações, o sistema de numeração de Kabat é geralmente utilizado com referência a um resíduo no domínio variável (aproximadamente, resíduos 1 a 107 da cadeia leve e resíduos 1 a 113 da cadeia pesada) (por exemplo, Kabat et al. (1991)). O “sistema de numeração EU” ou “índice EU” geralmente é utilizado com referência a um resíduo em uma região constante de cadeia pesada de imunoglobulina (tal como o índice EU relatado em Kabat et al., acima (1991), expressamente incorporado ao presente como referência). A menos que indicado em contrário no presente, referências a números de resíduos no domínio variável de anticorpos indicam numeração de resíduos por meio do sistema de numeração de Kabat. A menos que indicado em contrário no presente, referências a números de resíduos no domínio constante de anticorpos indicam numeração de resíduos por meio do sistema de numeração EU.
[086] A expressão “anticorpo monoclonal”, da forma utilizada no presente, designa um anticorpo obtido a partir de uma população de anticorpos substancialmente homogêneos, ou seja, os anticorpos individuais que compreendem a população são idênticos, exceto por possíveis mutações de ocorrência natural que podem estar presentes em quantidades menores. Os anticorpos monoclonais são altamente específicos, sendo dirigidos para um único local antigênico. Além disso, ao contrário das preparações de anticorpos policlonais que incluem diferentes anticorpos dirigidos a diferentes determinantes (epítopos), cada anticorpo monoclonal é direcionado a um único determinante sobre o antígeno. Além da sua especificidade, os anticorpos monoclonais são vantajosos por poderem ser sintetizados de forma não contaminada por outros anticorpos. O adjetivo “monoclonal” não deve ser considerado exigindo a produção do anticorpo por meio de nenhum método específico. Os anticorpos monoclonais úteis na presente invenção podem ser preparados, por exemplo, por meio da metodologia de hibridoma descrita em primeiro lugar por Kohler et al., Nature, 256: 495 (1975), ou podem ser fabricados utilizando métodos de DNA recombinante em células vegetais, animais, eucarióticas ou bacterianas (vide, por exemplo, a Patente Norte-Americana n° 4.816.567). Os “anticorpos monoclonais” podem também ser isolados a partir de bibliotecas de anticorpos de fagos, utilizando as técnicas descritas, por exemplo, em Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991) e Marks et al., J. Mol. Biol. , 222: 581-597 (1991) ou utilizando os métodos descritos nos Exemplos abaixo.
[087] Os anticorpos monoclonais do presente incluem anticorpos “quiméricos”, nos quais uma porção da cadeia leve e/ou pesada é idêntica ou homóloga a sequências correspondentes em anticorpos derivados de uma espécie específica ou pertencentes a uma classe ou subclasse específica de anticorpos, enquanto o restante da(s) cadeia(s) é idêntico ou homólogo a sequências correspondentes de anticorpos derivados de outras espécies ou pertencentes a outra classe ou subclasse de anticorpos, bem como fragmentos desses anticorpos, desde que exibam a atividade biológica de acordo com a presente invenção (vide a Patente Norte-Americana n° 4.816.567; e Morrison et al., PNAS USA, 81: 6851-6855 (1984)). Os anticorpos quiméricos de interesse no presente incluem anticorpos “primatizados”, que compreendem sequências de ligação de antígenos de domínio variável derivadas de primatas não humanos (por exemplo, Macaco do Velho Mundo, Chimpanzé etc.) e sequências de regiões constantes humanas.
[088] Anticorpo “maturado por afinidade” é aquele com uma ou mais alterações em uma ou mais de suas CDRs, o que resulta em aumento da afinidade do anticorpo para o antígeno, em comparação com anticorpo parental que não possui essa(s) alteração(ões). Os anticorpos maturados por afinidade preferidos possuirão afinidades nanomolares ou até picomolares para o antígeno alvo. Os anticorpos maturados por afinidade são produzidos por meio de procedimentos conhecidos na técnica. Marks et al., Bio/Technology, 10: 779-783 (1992) descrevem maturação por afinidade por meio de troca de domínios VH e VL. A mutagênese aleatória de resíduos de cadeia principal e/ou CDR é descrita por: Barbas et al., PNAS USA 91: 3809-3813 (1994); Schier et al., Gene 169: 147-155 (1995); Yelton et al., J. Immunol. 155: 1994-2004 (1995); Jackson et al., J. Immunol. 154 (7): 3310-9 (1995); e Hawkins et al., J. Mol. Biol. 226: 889-896 (1992).
[089] Anticorpo “bloqueador” ou anticorpo “antagonista” é aquele que inibe ou reduz a atividade biológica do antígeno que liga. Anticorpos anti- α5β1 antagonistas ou de bloqueios, por exemplo, inibem completa ou parcialmente a angiogênese por meio da ligação de α5β1.
[090] Um anticorpo “agonista” é aquele que aumenta ou amplia a atividade biológica do antígeno que liga. Anticorpos anti-α5β1 agonistas, por exemplo, aumentam a angiogênese por meio da ligação de α5β1.
[091] Um anticorpo “intacto” é aquele que compreende um local de ligação de antígenos, bem como um CL e pelo menos domínios constantes de cadeia pesada, CH1, CH2 e CH3. Os domínios constantes podem ser domínios constantes de sequência nativa (por exemplo, domínios constantes de sequências nativas humanas) ou suas variantes de sequências de aminoácidos. Preferencialmente, o anticorpo intacto possui uma ou mais funções efetoras.
[092] “Fragmentos de anticorpos” compreendem uma porção de um anticorpo intacto, preferencialmente a região variável ou de ligação de antígenos do anticorpo intacto. Exemplos de fragmentos de anticorpos incluem fragmentos de Fab, Fab’, F(ab’)2 e Fv; diacorpos, anticorpos lineares (vide a Patente Norte-Americana n° 5.641.870, Exemplo 2; Zapata etal., Protein Eng. 8 (10): 1057-1062 (1995)); moléculas de anticorpos de fita única; e anticorpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticorpos.
[093] A expressão “anticorpos lineares” geralmente designa os anticorpos descritos em Zapata et al., Protein Eng., 8 (10): 1057-1062 (1995). Resumidamente, estes anticorpos compreendem um par de segmentos Fd em conjunto (VH-CH1-VH-CH1) que, junto com os polipeptídeos de cadeia leve complementares, formam um par de regiões de ligação de antígenos. Os anticorpos lineares podem ser biespecíficos ou monoespecíficos.
[094] A digestão de papaína de anticorpos produz dois fragmentos de ligação de antígenos idênticos, denominados fragmentos de “Fab”, e um fragmento de “Fc” residual, cuja designação reflete a capacidade de cristalização rápida. O fragmento de Fab consiste em uma cadeia L inteira, juntamente com o domínio de região variável da cadeia H (VH) e o primeiro domínio constante de uma cadeia pesada (CH1). Cada fragmento de Fab é monovalente com relação à ligação de antígenos, ou seja, contém um único local de ligação de antígenos. O tratamento com pepsina de um anticorpo gera um único fragmento F(ab’)2 grande, que corresponde aproximadamente a dois fragmentos de Fab ligados por dissulfeto que possuem atividade de ligação de antígenos divalentes e ainda são capazes de reticular antígenos. Os fragmentos de Fab’ diferem dos fragmentos de Fab por conterem alguns resíduos adicionais no terminal carbóxi do domínio CH1, incluindo uma ou mais cisteínas da região de articulação do anticorpo. Fab’-SH é a designação do presente para Fab’ em que o(s) resíduo(s) de cisteína dos domínios constantes apresenta(m) um grupo tiol livre. Os fragmentos de anticorpos F(ab’)2 foram originalmente produzidos na forma de pares de fragmentos de Fab’ que contêm cisteínas de articulação entre eles. Outros acoplamentos químicos de fragmentos de anticorpos também são conhecidos.
[095] O fragmento de Fc compreende as porções carbóxi- terminais das duas cadeias H mantidas juntas por dissulfetos. As funções efetoras de anticorpos são determinadas por sequências na região Fc, que também é a parte reconhecida por receptores de Fc (FcR) encontrados em certos tipos de células.
[096] Uma “região Fc variante” compreende uma sequência de aminoácidos que difere daquela de uma região Fc de sequência nativa em virtude de pelo menos uma “modificação de aminoácido”, conforme definido no presente. Preferencialmente, a região Fc variante contém pelo menos uma substituição de aminoácido em comparação com uma região Fc de sequência nativa ou com a região Fc de um polipeptídeo parental, tal como cerca de uma a cerca de dez substituições de aminoácidos e, preferencialmente, cerca de uma a cerca de cinco substituições de aminoácidos em uma região Fc de sequência nativa ou na região Fc do polipeptídeo parental. Em uma realização, a região Fc variante do presente possuirá pelo menos cerca de 80% de homologia, pelo menos cerca de 85% de homologia, pelo menos cerca de 90% de homologia, pelo menos cerca de 95% de homologia ou pelo menos cerca de 99% de homologia com uma região Fc de sequência nativa. Segundo uma outra realização, a região Fc variante do presente possuirá pelo menos cerca de 80% de homologia, pelo menos cerca de 85% de homologia, pelo menos cerca de 90% de homologia, pelo menos cerca de 95% de homologia ou pelo menos cerca de 99% de homologia com uma região Fc de um polipeptídeo parental.
[097] A expressão “polipeptídeo que compreende uma região Fc” designa um polipeptídeo, tal como um anticorpo ou imunoadesina (vide definições abaixo), que compreende uma região Fc. A lisina C-terminal (resíduo 447 de acordo com o sistema de numeração EU) da região Fc pode ser removida, por exemplo, durante a purificação do polipeptídeo ou por meio de elaboração recombinante do ácido nucleico que codifica o polipeptídeo. Consequentemente, uma composição que compreende polipeptídeos, incluindo anticorpos, que possuem uma região Fc de acordo com a presente invenção pode compreender populações de polipeptídeos com todos os resíduos K447 removidos, populações de polipeptídeos sem resíduos K447 removidos ou populações de polipeptídeos que possuem uma mistura de polipeptídeos com e sem o resíduo K447.
[098] “Fv” é o fragmento de anticorpo mínimo que contém um local de reconhecimento e de ligação de antígenos completo. Este fragmento consiste em um dímero de um domínio de região variável de cadeia leve e um de cadeia pesada em associação firme e não covalente. Da dobra desses dois domínios, emanam seis laços hipervariáveis (três laços da cadeia H e L cada) que contribuem com os resíduos de aminoácidos para ligação de antígenos e conferem especificidade de ligação de antígenos ao anticorpo. Entretanto, mesmo um domínio variável isolado (ou metade de um Fv que compreende apenas três CDRs específicas para um antígeno) possui a capacidade de reconhecer e ligar antígeno, embora em afinidade menor que o local de ligação completo.
[099] “Fv de cadeia isolada”, também abreviado como “sFv” ou “scFv”, são fragmentos de anticorpos que compreendem os domínios de anticorpos VH e VL conectados a uma única cadeia de polipeptídeo. Preferencialmente, o polipeptídeo de sFv compreende adicionalmente um ligante de polipeptídeo entre os domínios VH e VL, o que permite que o sFv forme a estrutura desejada para ligação de antígenos. Para uma análise de sFv, vide Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg e Moore eds., Springer-Verlag, Nova Iorque, págs. 269-315 (1994); Borrebaeck 1995, abaixo.
[100] O termo “diacorpos” designa fragmentos de anticorpos pequenos preparados por meio da construção de fragmentos de sFv (vide parágrafo anterior) com ligantes curtos (cerca de cinco a dez resíduos) entre os domínios VH e VL, de forma a atingir-se o emparelhamento intercadeias mas não intracadeias dos domínios V, resultando em um fragmento bivalente, ou seja, um fragmento que contém dois locais de ligação de antígenos. Os diacorpos biespecíficos são heterodímeros de dois fragmentos de sFv “cruzados”, em que os domínios VH e VL dos dois anticorpos estão presentes sobre diferentes cadeias de polipeptídeos. Os diacorpos são descritos mais completamente, por exemplo, em EP 404.097, WO 93/11161 e Hollinger et al., PNAS USA, 90: 64446448 (1993).
[101] Anticorpos “humanizados” são formas de anticorpos não humanos (tais como de roedores) que são anticorpos quiméricos que contêm sequência mínima derivada do anticorpo não humano. Em sua maioria, os anticorpos humanizados são imunoglobulinas humanas (anticorpo receptor), em que resíduos de uma região hipervariável do receptor são substituídos por resíduos de uma região hipervariável de uma espécie não humana (anticorpo doador), tal como camundongo, rato, coelho ou primata não humano que apresente a capacidade, afinidade e especificidade de anticorpo desejada. Em alguns casos, os resíduos de região de estrutura (FR) da imunoglobulina humana são substituídos por resíduos não humanos correspondentes. Além disso, os anticorpos humanizados podem compreender resíduos que não são encontrados no anticorpo receptor nem no anticorpo doador. Essas modificações são feitas para refinar ainda mais o desempenho do anticorpo. Geralmente, o anticorpo humanizado compreenderá substancialmente todos dentre pelo menos um, tipicamente dois domínios variáveis, em que todos ou substancialmente todos os laços hipervariáveis correspondem aos de uma imunoglobulina não humana e todas ou substancialmente todas as FRs são as de uma sequência de imunoglobulina humana. O anticorpo humanizado também compreenderá opcionalmente pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina (Fc), tipicamente a de uma imunoglobulina humana. Para detalhes adicionais, vide Jones et al., Nature 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332: 323-329 (1988); e Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2: 593-596 (1992).
[102] “Anticorpo dependente de espécie” é um anticorpo que possui afinidade de ligação mais forte para um antígeno de uma primeira espécie de mamífero que para um homólogo daquele antígeno de uma segunda espécie de mamífero. Normalmente, o anticorpo dependente de espécie "liga-se especificamente" a um antígeno humano (ou seja, possui um valor de afinidade de união (Kd) de não mais de cerca de 1 x 10-7 M, preferencialmente não mais de cerca de 1 x 10-8 ou não mais de cerca de 1 x 10-9 M), mas possui afinidade de ligação para um homólogo do antígeno de uma segunda espécie de mamífero não humano que é pelo menos cerca de cinquenta vezes, pelo menos cerca de quinhentas vezes ou pelo menos cerca de mil vezes mais fraca que a sua afinidade de ligação para o antígeno humano. O anticorpo dependente de espécie pode ser de qualquer um dos diversos tipos de anticorpos definidos acima, mas é preferencialmente um anticorpo humano ou humanizado.
[103] Nessas realizações, a extensão da ligação do polipeptídeo, anticorpo, antagonista ou composição a uma proteína “não alvo” será de menos de cerca de 10% da ligação do polipeptídeo, anticorpo, antagonista ou composição à sua proteína alvo específica, conforme determinado por meio de análise de ordenamento de células ativadas por fluorescência (FACS) ou radioimunoprecipitação (RIA). Com relação à ligação de um polipeptídeo, anticorpo, antagonista ou composição a uma molécula alvo, a expressão "ligação específica", "liga-se especificamente a" ou "é específica para" um polipeptídeo específico ou um epítopo sobre um polipeptídeo alvo específico indica ligação que é mensuravelmente diferente de uma interação não específica. A ligação específica pode ser medida, por exemplo, por meio da determinação da ligação de uma molécula em comparação com a ligação de uma molécula controle, que geralmente é uma molécula com estrutura similar que não possui atividade de ligação. A ligação específica pode ser determinada, por exemplo, por meio de competição com uma molécula controle que é similar ao alvo, tal como excesso de alvo não marcado. Neste caso, indica-se ligação específica caso a ligação do alvo marcado a uma sonda seja competitivamente inibida por alvo não marcado em excesso. A expressão “ligação específica”, “liga-se especificamente a” ou “é específico para” um polipeptídeo específico ou um epítopo sobre um polipeptídeo alvo específico, da forma utilizada no presente, pode ser exibida, por exemplo, por uma molécula que possui Kd para o alvo de pelo menos cerca de 10-4 M, pelo menos cerca de 10-5 M, pelo menos cerca de 10-6 M, pelo menos cerca de 10-7 M, pelo menos cerca de 10-8 M, pelo menos cerca de 109 M, pelo menos cerca de 10-10 M, pelo menos cerca de 10-11 M, pelo menos cerca de 10-12 M ou mais. Em uma realização, a expressão “ligação específica” indica ligação em que uma molécula liga-se a um polipeptídeo específico ou epítopo sobre um polipeptídeo específico sem ligação substancial a nenhum outro polipeptídeo ou epítopo de polipeptídeo.
[104] As “funções efetoras” de anticorpos designam as atividades biológicas atribuíveis à região Fc (uma região Fc de sequência nativa ou região Fc com variação de sequência de aminoácidos) de um anticorpo e variam de acordo com o isotipo do anticorpo. Exemplos de funções efetoras de anticorpos incluem: citotoxicidade dependente de complemento e ligação de C1q; ligação de receptor Fc; citotoxicidade mediada por células dependentes de anticorpos (ADCC); fagocitose; regulagem para baixo de receptores da superfície celular; e ativação de células B. Uma “região Fc de sequência nativa” compreende uma sequência de aminoácidos idêntica à sequência de aminoácidos de uma região Fc encontrada na natureza. Exemplos de sequências de Fc são descritos, por exemplo, mas sem limitações, em Kabat et al., acima (1991)).
[105] “Percentual (%) de identidade de sequência de aminoácidos” ou “homologia”, com relação às sequências de polipeptídeos e de anticorpos identificadas no presente, é definido como o percentual de resíduos de aminoácidos em uma possível sequência que são idênticos aos resíduos de aminoácidos no polipeptídeo sendo comparado, após o alinhamento das sequências, considerando qualquer substituição conservativa como parte da identidade de sequência. O alinhamento para propósitos de determinação do percentual de identidade de sequências de aminoácidos pode ser atingido de várias formas que se encontram dentro do conhecimento da técnica, utilizando, por exemplo, software de computador disponível ao público, tal como software BLAST, BLAST-2, ALIGN ou Megalign (DNASTAR). Os técnicos no assunto podem determinar parâmetros apropriados para medir o alinhamento, incluindo quaisquer algoritmos necessários para atingir o alinhamento máximo ao longo do comprimento total das sequências sendo comparadas. Para os propósitos do presente, entretanto, valores percentuais de identidade de sequência de aminoácidos são gerados utilizando o programa de computador de comparação de sequências ALIGN-2. O programa de computador de comparação de sequências ALIGN-2 foi elaborado pela Genentech, Inc. e o código fonte foi depositado com documentação de usuário no Escritório Norte-Americano de Direitos Autorais, Washington DC 20559, onde foi registrado com o n° de Registro de Direitos Autorais Norte-Americano TXU510087. O programa ALIGN- 2 é disponível ao público por meio da Genentech, Inc., South San Francisco, Califórnia. O programa ALIGN-2 deverá ser compilado para uso em um sistema operativo UNIX, preferencialmente UNIX digital V4.0D. Todos os parâmetros de comparação de sequências são estabelecidos pelo programa ALIGN-2 e não variam.
[106] As expressões “receptor de Fc” ou “FcR” são utilizadas para descrever um receptor que se liga à região Fc de um anticorpo. Em uma realização, um FcR de acordo com a presente invenção é aquele que liga um anticorpo IgG (um receptor gama) e inclui receptores das subclasses FCYRI, FCYRII e FCYRIII, incluindo variantes alélicas e, alternativamente, formas divididas desses receptores. Os receptores FCYRII incluem FCYRIIA (um “receptor de ativação”) e FCYRIIB (um “receptor de inibição”), que possuem sequências de aminoácidos similares que diferem principalmente nos seus domínios citoplasmáticos. O receptor de ativação FcyRIIA contém um motivo de ativação com base em tirosina imunorreceptora (ITAM) no seu domínio citoplasmático. O receptor de inibição FcyRIIB contém um motivo de inibição com base em tirosina imunorreceptora (ITIM) no seu domínio citoplasmático (vide análise M. em Daêron, Annu. Rev. Immunol. 15: 203-234 (1997)). O termo inclui alótipos, tais como alótipos de FcyRIIIA: FcyRIIIA-Phe158, FcyRIIIA-Val158, FcyRIIA-R131 e/ou FcyRIIA-H131. FcRs são analisados em Ravetch e Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9: 457-92 (1991); Capel et al., Immunomethods 4: 25-34 (1994); e de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126: 330-41 (1995). Outros FcRs, incluindo aqueles a serem identificados no futuro, são englobados pelo termo “FcR” no presente. O termo também inclui o receptor neonatal, FcRn, que é responsável pela transferência de IgGs maternos para o feto (Guyer et al., J. Immunol. 117: 587 (1976) e Kim et al., J. Immunol. 24: 249 (1994)).
[107] O termo “FcRn” indica o receptor de Fc neonatal (FcRn). FcRn possui estrutura similar ao complexo principal de histocompatibilidade (MHC) e consiste em uma cadeia V ligada de forma não covalente a 32- microglobulina. As diversas funções do receptor de Fc neonatal FcRn são analisadas em Ghetie e Ward (2000), Annu. Rev. Immunol. 18, 739-766. FcRn desempenha um papel no fornecimento passivo de IgGs de imunoglobulina de mãe para filho e na regulagem dos níveis de IgG em soro. FcRn pode agir como um receptor de salvados, ligando e transportando IgGs pinocitosados em forma intacta no interior e através das células, resgatando-os de um processo degradativo padrão.
[108] WO 00/42072 (Presta) e Shields et al., J. Biol. Chem. 9 (2): 6591-6604 (2001), por exemplo, descrevem variantes de anticorpos com maior ou menor ligação a FcRs. O teor dessas publicações é incorporado especificamente ao presente como referência.
[109] O “domínio CH1” de uma região Fc de IgG humana (também denominado domínio “C1” de “H1”) normalmente estende-se de cerca do aminoácido 118 até cerca do aminoácido 215 (sistema de numeração EU).
[110] “Região de articulação” é geralmente definida como estendendo-se de Glu216 a Pro230 de IgG1 humano (Burton, Molec. Immunol. 22: 161-206 (1985)). As regiões de articulação de outros isotipos de IgG podem ser alinhadas com a sequência de IgG1 por meio da colocação dos primeiro e último resíduos de cisteína, formando ligações S-S intercadeias pesadas nas mesmas posições.
[111] A “região de articulação inferior” de uma região Fc é normalmente definida como o estiramento de resíduos imediatamente C- terminais até a região de articulação, ou seja, os resíduos 233 a 239 da região Fc. Em relatórios anteriores, a ligação de FcR geralmente foi atribuída a resíduos de aminoácidos na região de articulação inferior de uma região Fc de IgG.
[112] O “domínio CH2” de uma região Fc de IgG humana (também denominado domínio “C2” de “H2”) normalmente estende-se de cerca do aminoácido 231 até cerca do aminoácido 340. O domínio CH2 é exclusivo pelo fato de que não é emparelhado de perto com outro domínio. Por outro lado, duas cadeias de carboidrato ramificadas N-ligadas são interpostas entre os dois domínios CH2 de uma molécula IgG nativa intacta. Especulou-se que o carboidrato pode fornecer um substituto para o emparelhamento entre domínios e ajudar a estabilizar o domínio CH2. Burton, Molec. Immunol. 22: 161-206 (1985).
[113] O “domínio CH3” (também denominado domínio “C2” ou “H3”) compreende o estiramento de resíduos C-terminais até um domínio CH2 em uma região Fc (ou seja, de cerca do resíduo de aminoácido 341 até a extremidade C-terminal de uma sequência de anticorpo, tipicamente no resíduo de aminoácido 446 ou 447 de um IgG).
[114] Uma “região Fc funcional” possui uma “função efetora” de uma região Fc de sequência nativa. Exemplos de “funções efetoras” incluem ligação de C1q, citotoxicidade dependente de complemento, ligação de receptor Fc; citotoxicidade mediada por células dependentes de anticorpos (ADCC); fagocitose; regulagem para baixo de receptores da superfície celular (tais como receptor de células B; BCR) etc. Essas funções efetoras geralmente necessitam que a região Fc seja combinada com um domínio de ligação (tal como um domínio variável de anticorpo) e podem ser determinadas utilizando vários testes conforme descrito no presente, por exemplo.
[115] “C1q” é um polipeptídeo que inclui um local de ligação para a região Fc de uma imunoglobulina. C1q, juntamente com duas serino proteases, C1r e C1s, formam o complexo C1, o primeiro componente do processo de citotoxicidade dependente de complemento (CDC). C1q humano pode ser adquirido comercialmente, por exemplo, por meio da Quidel, San Diego CA.
[116] A expressão “domínio de ligação” designa a região de um polipeptídeo que se liga a outra molécula. No caso de um FcR, o domínio de ligação pode compreender uma porção de uma de suas cadeias de polipeptídeo (tal como a sua cadeia alfa) que é responsável pela ligação de uma região Fc. Um domínio de ligação útil é o domínio extracelular de uma cadeia alfa de FcR.
[117] Um anticorpo ou corpo de peptídeo com um Fc de IgG variante com afinidade de ligação de FcR “alterada” ou atividade de ADCC é aquele que possui atividade de ligação de FcR (tal como FCYR ou FcRn) e/ou atividade de ADCC aumentada ou reduzida em comparação com um polipeptídeo parental ou um polipeptídeo que compreende uma região Fc de sequência nativa. O Fc variante que “exibe maior ligação” a um FcR liga elo menos um FcR com afinidade mais alta (tal como valor IC50 ou Kd aparente mais baixo) que o polipeptídeo parental ou um Fc de IgG de sequência nativa. Segundo algumas realizações, o aumento da ligação em comparação com um polipeptídeo parental é de cerca de três vezes, preferencialmente cerca de 5, 10, 25, 50, 60, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450 ou 500 vezes, ou cerca de 25% a 1000% de melhoria da ligação. A variante de polipeptídeo que “exibe ligação reduzida" a um FcR liga pelo menos um FcR com afinidade mais baixa (tal como Kd aparente mais alto ou valor IC50 mais alto) que um polipeptídeo parental. A redução da ligação em comparação com um polipeptídeo parental pode ser de cerca de 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60% ou mais de redução da ligação.
[118] “Citotoxicidade mediada por células dependentes de anticorpos” ou “ADCC” designa uma forma de citotoxicidade, em que Ig secretado e ligado a receptores de Fc (FcRs) presentes sobre certas células citotóxicas (por exemplo, Células Matadoras Naturais (NK), neutrófilos e macrófagos) permitem que essas células efetoras citotóxicas liguem-se especificamente a uma célula alvo que contenha antígenos e matem em seguida a célula alvo com citotoxinas. Os anticorpos “armam” as células citotóxicas e são absolutamente necessários para essa matança. As células primárias para a mediação de ADCC, células NK, expressam unicamente FCYRIII, enquanto monócitos expressam FCYRI, FCYRII e FcyRIII. A expressão de FcR sobre células hematopoiéticas é resumida na Tabela 3 da página 464 de Ravetch e Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9: 457-92 (1991); Para determinar a atividade de ADCC de uma molécula de interesse, pode ser realizado um teste de ADCC in vitro, tal como o descrito na Patente Norte-Americana n° 5.500.362 ou 5.821.337 ou nos Exemplos abaixo. Células efetoras úteis para esses testes incluem células mononucleares sanguíneas periféricas (PBMC) e células Matadoras Naturais (NK). Alternativa ou adicionalmente, a atividade de ADCC da molécula de interesse pode ser determinada in vivo, tal como em um modelo animal como o descrito em Clynes et al., PNAS (U. S. A.) 95: 652-656 (1998).
[119] O polipeptídeo que compreende uma região Fc variante que “exibe aumento de ADCC” ou media citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpo (ADCC) na presença de células efetoras humanas mais eficientemente que um polipeptídeo que contém Fc de IgG do tipo selvagem ou um polipeptídeo parental é aquele que, in vitro ou in vivo, é substancialmente mais eficaz na mediação de ADCC, quando as quantidades de polipeptídeo com região Fc variante e o polipeptídeo com região Fc do tipo selvagem (ou o polipeptídeo parental) no teste são essencialmente as mesmas. Geralmente, essas variantes serão identificadas utilizando o ensaio de ADCC in vitro, conforme descrito no presente, mas são contemplados outros testes ou métodos de determinação da atividade de ADCC, por exemplo em um modelo animal etc. Em uma realização, a variante preferida é de cerca de cinco vezes a cerca de cem vezes, tal como cerca de 25 a cerca de 50 vezes, mais eficaz na mediação de ADCC que o Fc do tipo selvagem (ou polipeptídeo parental).
[120] “Citotoxicidade dependente de complemento” ou “CDC” designa a lise de uma célula alvo na presença de complemento. A ativação do processo clássico de complemento é iniciada pela ligação do primeiro componente do sistema de complemento (C1q) a anticorpos (da subclasse apropriada) que são ligados ao seu antígeno cognato. Para determinar a ativação do complemento, pode ser realizado teste de CDC, conforme descrito, por exemplo, em Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202: 163 (1996).
[121] Variantes de polipeptídeos com sequências de aminoácidos com região Fc alterada e maior ou menor capacidade de ligação de C1q são descritas na Patente Norte-Americana n° 6.194.551 e WO 99/51642. O teor dessas publicações é incorporado especificamente ao presente como referência. Vide também Idusogie et al., J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000).
[122] “Células efetoras humanas” são leucócitos que expressam um ou mais FcRs e realizam funções efetoras. Segundo uma realização, as células expressam pelo menos FCYRIII e realizam função efetora de ADCC. Exemplos de leucócitos humanos que mediam ADCC incluem células mononucleares sanguíneas periféricas (PBMC), células matadoras naturais (NK), monócitos, células T citotóxicas e neutrófilos; em que PBMCs e células NK são preferidas. As células efetoras podem ser isoladas a partir de uma fonte nativa, tal como sangue ou PBMCs, conforme descrito no presente.
[123] Métodos de medição da ligação a FcRn são conhecidos (vide, por exemplo, Ghetie 1997, Hinton 2004). A ligação a FcRn humano in vivo e a meia vida em soro de polipeptídeos de ligação com alta afinidade para FcRn humano podem ser testadas, por exemplo, em camundongos transgênicos ou linhagens de células humanas transfectadas que expressam FcRn humano, ou em primatas que recebem administração de polipeptídeos variantes de Fc. Em uma realização, especificamente os anticorpos anti-α5β1 de acordo com a presente invenção que contêm um Fc de IgG variante exibem aumento da afinidade de ligação para FcRn humano sobre um polipeptídeo que contém Fc de IgG do tipo selvagem em pelo menos 2 vezes, pelo menos 5 vezes, pelo menos 10 vezes, pelo menos 50 vezes, pelo menos 60 vezes, pelo menos 70 vezes, pelo menos 80 vezes, pelo menos 100 vezes, pelo menos 125 vezes, pelo menos 150 vezes. Em uma realização específica, a afinidade de ligação para FcRn humano é aumentada em cerca de 170 vezes.
[124] Para afinidade de ligação a FcRn, em uma realização, o EC50 ou Kd aparente (sob pH 6,0) do polipeptídeo é de menos de 1 μM, de maior preferência menor ou igual a 100 nM, de maior preferência menor ou igual a 10 nM. Em uma realização, para aumento da afinidade de ligação a FCYRIII (F158; ou seja, isotipo de baixa afinidade), o EC50 ou Kd aparente é menor ou igual a 10 nM e, para FCYRIII (V158; isotipo de alta afinidade), o EC50 ou Kd aparente é menor ou igual a 3 nM. Segundo uma outra realização, uma redução da ligação de um anticorpo a um receptor Fc com relação a um anticorpo controle (tal como o anticorpo Herceptin®) pode ser considerada significativa com relação ao anticorpo controle se a razão entre os valores das absorções nos pontos intermediários do anticorpo de teste e as curvas de ligação do anticorpo controle (tal como A450 nm (anticorpo)/A450 nm (Ab controle)) for menor ou igual a 40%. Segundo uma outra realização, um aumento da ligação de um anticorpo A um receptor Fc com relação a um anticorpo controle (tal como o anticorpo Herceptin®) pode ser considerada significativa com relação ao anticorpo controle se a razão entre os valores das absorções nos pontos intermediários do anticorpo de teste e as curvas de ligação do anticorpo controle (tal como A450 nm (anticorpo)/A450 nm (Ab controle)) for maior ou igual a 125%.
[125] Um “polipeptídeo parental” ou “anticorpo parental” é um polipeptídeo ou anticorpo que compreende uma sequência de aminoácidos da qual surgiu o polipeptídeo ou anticorpo variante e com o qual o polipeptídeo ou anticorpo variante está sendo comparado. Tipicamente, o polipeptídeo parental ou anticorpo parental não possui uma ou mais das modificações de regiões Fc descritas no presente e difere de função efetora em comparação com uma variante de polipeptídeo conforme descrito no presente. O polipeptídeo parental pode compreender uma região Fc de sequência nativa ou uma região Fc com modificações de sequência de aminoácidos previamente existentes (tais como adições, exclusões e/ou substituições).
[126] Os anticorpos de acordo com a presente invenção podem ser derivados de biblioteca de fagos. Da forma utilizada no presente, “biblioteca” designa uma série de sequências de anticorpos ou fragmentos de anticorpos, ou os ácidos nucleicos que codificam essas sequências, em que as sequências são diferentes na combinação de aminoácidos variantes que são introduzidos nessas sequências segundo os métodos de acordo com a presente invenção.
[127] “Disposição de fagos” (phage display) é um método por meio do qual polipeptídeos variantes são dispostos como proteínas de fusão para pelo menos uma porção de proteína de revestimento sobre a superfície de partículas de fago, tal como fago filamentoso. Uma utilidade da disposição de fagos reside no fato de que grandes bibliotecas de variantes de proteínas aleatorizadas seletivamente podem ser ordenadas rápida e eficientemente para as sequências que se ligam a um antígeno alvo com alta afinidade. A disposição de bibliotecas de proteínas e peptídeos sobre fago vem sendo utilizada para selecionar milhões de polipeptídeos em busca dos que possuem propriedades de ligação específicas. Métodos de disposição de fagos polivalentes vêm sendo utilizados para dispor pequenos peptídeos aleatórios e proteínas pequenas por meio de fusões ao gene III ou gene VIII de fago filamentoso. Wells e Lowman, Curr. Opin. Struct. Biol., 3: 355-362 (1992) e referências ali mencionadas. Em uma disposição de fagos monovalentes, uma biblioteca de peptídeos ou proteínas é fundida a um gene III ou uma de suas porções e expressa em baixos níveis na presença de proteína de gene III do tipo selvagem, de forma que as partículas de fagos disponham uma ou nenhuma cópia das proteínas de fusão. Os efeitos da avidez são reduzidos com relação a fago polivalente, de tal forma que a seleção seja realizada com base na afinidade de ligantes intrínsecos e são utilizados vetores de fagomídeos, que simplificam manipulações de DNA. Lowman e Wells, Methods: A Companion to Methods in Enzymology, 3: 205-0216 (1991).
[128] Um “fagomídeo” é um vetor de plasmídeo que possui uma origem de reprodução bacteriana, tal como Co1E1, e uma cópia de uma região intergênica de um bacteriófago. O fagomídeo pode ser utilizado sobre qualquer bacteriófago conhecido, incluindo bacteriófago filamentoso e bacteriófago lambdoide. O plasmídeo também conterá geralmente um marcador selecionável para resistência a antibióticos. Segmentos de DNA clonados nesses vetores podem ser propagados na forma de plasmídeos. Quando células que abrigam estes vetores possuírem todos os genes necessários para a produção de partículas de fagos, o modo de reprodução do plasmídeo altera-se para reprodução de círculo rolante para gerar cópias de uma fita do DNA de plastídeo e partículas de fagos de pacotes. O fagomídeo pode formar partículas de fagos infecciosas ou não infecciosas. Este termo inclui fagomídeos que contêm um gene de proteína de revestimento de fago ou seu fragmento ligado a um gene de polipeptídeo heterólogo como uma fusão de gene, de tal forma que o polipeptídeo heterólogo seja exibido sobre a superfície da partícula de fago.
[129] A expressão “vetor de fago” indica uma forma reprodutiva de fita dupla de um bacteriófago que contém um gene heterólogo e capaz de reprodução. O vetor de fago possui uma origem de reprodução de fago que permite a reprodução de fagos e a formação de partículas de fago. O fago é preferencialmente um bacteriófago filamentoso, tal como um fago M13, f1, fd, Pf3 ou um de seus derivados, ou um fago lambdoide, tal como lambda, 21, phi80, phi81, 82, 424, 434 etc. ou um de seus derivados.
[130] Modificações covalentes de polipeptídeos tais como corpos de peptídeos, imunoadesinas, anticorpos e peptídeos curtos são incluídas no escopo da presente invenção. Um tipo de modificação covalente inclui a reação de resíduos de aminoácidos desejados de um polipeptídeo com um agente derivante orgânico que é capaz de reagir com cadeias laterais selecionadas ou os resíduos N ou C-terminais do polipeptídeo. A derivação com agentes bifuncionais é útil, por exemplo, para reticular o polipeptídeo em uma superfície ou matriz de suporte insolúvel em água para uso no método de purificação de anticorpos e vice versa. Os agentes reticulantes comumente utilizados incluem, por exemplo, 1,1-bis(diazoacetil)-2-feniletano, glutaraldeído, N- hidroxissuccinimido ésteres, tais como ésteres com ácido 4-azidossalicílico, imidoésteres homobifuncionais, incluindo dissuccinimidil ésteres tais como 3,3’- ditiobis(succinimidilpropionato), maleimidas bifuncionais, tais como bis-N- maleimido-1,8-octano, e agentes tais como 3- [(p-azidofenil)ditio]propioimidato de metila.
[131] Outras modificações incluem a desamidação de resíduos glutaminila e asparaginila nos resíduos de glutamila e aspartila correspondentes, respectivamente, hidroxilação de prolina e lisina, fosforilação de grupos hidroxila de resíduos serila ou treonila, metilação dos grupos α-amino de cadeias laterais de lisina, arginina e histidina (T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman & Co., São Francisco, págs. 79-86 (1983)), acetilação da amina N-terminal e amidação de qualquer grupo carboxila C-terminal.
[132] Outras modificações incluem a conjugação de toxinas aos antagonistas tais como maitansina e maitansinoides, caliqueamicina e outros agentes citotóxicos.
[133] Outro tipo de modificação covalente do polipeptídeo compreende a ligação do polipeptídeo a um dentre uma série de polímeros não proteináceos, tais como polietileno glicol (PEG), polipropileno glicol ou polioxialquilenos, da forma descrita nas Patentes Norte-Americanas n° 4.640.835, 4.496.689, 4.301.144, 4.670.417, 4.791.192 ou 4.179.337.
[134] O polipeptídeo de acordo com a presente invenção pode também ser modificado de maneira a formar uma molécula quimérica que compreende o polipeptídeo fundido a uma outra sequência de aminoácidos ou polipeptídeos heteróloga (tais como imunoadesinas ou corpos de peptídeos).
[135] Em uma realização, essa molécula quimérica compreende uma fusão do polipeptídeo com um domínio de transdução de proteína que dirige o polipeptídeo para fornecimento a vários tecidos e, mais particularmente, através da barreira de sangue do cérebro, utilizando, por exemplo, o domínio de transdução de proteína de proteína TAT do vírus da imunodeficiência humana (Schwarze et al., 1999, Science 285: 1569-72).
[136] Em uma outra realização, essa molécula quimérica compreende uma fusão do polipeptídeo com um polipeptídeo de marca que fornece um epítopo ao qual pode ligar-se seletivamente um anticorpo antimarca. A marca de epítopo geralmente é colocada no terminal amino ou carboxila do polipeptídeo. A presença dessas formas marcadas com epítopo do polipeptídeo pode ser detectada utilizando um anticorpo contra o polipeptídeo de marca. Além disso, o fornecimento da marca de epítopo permite que o polipeptídeo seja facilmente purificado por meio de purificação de afinidade utilizando um anticorpo antimarca ou outro tipo de matriz de afinidade que se ligue à marca de epítopo. Diversos polipeptídeos de marca e seus anticorpos correspondentes são conhecidos na técnica. Exemplos incluem marcas poli-histidina (poli-his) ou poli-histidina-glicina (poli-His-gly); o polipeptídeo de marca flu HA e seu anticorpo 12CA5 (Field et al., Mol. Cell. Biol., 8: 2159-2165 (1988)); a marca c-myc e seus anticorpos 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 e 9E10 (Evan et al., Molecular and Cellular Biology, 5: 3610-3616 (1985)) e a marca glicoproteína D (gD) do vírus simplex da herpes e seu anticorpo (Paborsky et al., Protein Engineering, 3 (6): 547-553 (1990)). Outros peptídeos de marca incluem o peptídeo de marca (Hopp et al., Bio Technology, 6: 1204-1210 (1988)); o peptídeo de epítopo KT3 (Martin et al., Science, 255: 192-194 (1992)); um peptídeo de epítopo de α-tubulina (Skinner et al., J. Biol. Chem., 266: 15163-15166 (1991)); e a marca de peptídeo de proteína 10 de gene T7 (Lutz-Freyermuth et al., PNAS USA, 87: 6393-6397 (1990)).
[137] Em uma realização alternativa, a molécula quimérica pode compreender uma fusão do polipeptídeo com uma imunoglobulina ou uma região específica de uma imunoglobulina. Para uma forma bivalente da molécula quimérica (tal como uma “imunoadesina”), essa fusão poderá ser para a região Fc de uma molécula IgG. Fusões de Ig de acordo com a presente invenção incluem polipeptídeos que compreendem aproximadamente ou apenas os resíduos 94 a 243, resíduos 33 a 53 ou os resíduos 33 a 52 de seres humanos no lugar de pelo menos uma região variável em uma molécula de Ig. Em uma realização específica, a fusão de imunoglobulina inclui as regiões de articulação, CH2 e CH3 ou de articulação, CH1, CH2 e CH3 de uma molécula IgG1. Para a produção de fusões de imunoglobulina, vide também a Patente Norte-Americana n° 5.428.130.
[138] A presente invenção fornece métodos e composições para inibição ou prevenção de reincidência do crescimento de tumores ou reincidência do crescimento de células cancerosas. Em várias realizações, câncer é reincidência do crescimento de tumor ou reincidência do crescimento de células cancerosas em que a quantidade de células cancerosas não foi significativamente reduzida ou aumentou, ou o tamanho do tumor não foi significativamente reduzido, aumentou, ou não apresenta nenhuma redução adicional de tamanho ou de quantidade de células cancerosas. A determinação de se as células cancerosas são reincidência do crescimento de tumor ou reincidência do crescimento de células cancerosas pode ser realizada in vivo ou in vitro por meio de qualquer método conhecido na técnica para determinar a eficácia do tratamento sobre células cancerosas. Um tumor resistente a tratamento anti-VEGF é um exemplo de reincidência do crescimento de tumor.
[139] Uma “quantidade eficaz” de um polipeptídeo, anticorpo, antagonista ou composição, da forma descrita no presente, é uma quantidade suficiente para conduzir um propósito especificamente indicado. Uma “quantidade eficaz” pode ser determinada empiricamente e por meio de métodos conhecidos com relação ao propósito indicado.
[140] A expressão “quantidade terapeuticamente eficaz” designa a quantidade de um anticorpo, polipeptídeo ou antagonista de acordo com a presente invenção eficaz para “tratar” uma doença ou distúrbio em um mamífero (também denominado paciente). No caso de câncer, a quantidade terapeuticamente eficaz da droga pode reduzir o número de células cancerosas, reduzir o tamanho do tumor, inibir (ou seja, reduzir a velocidade até certo ponto e, preferencialmente, suspender) a infiltração de células cancerosas em órgãos periféricos; inibir (ou seja, reduzir até certo ponto e, preferencialmente, suspender) a metástase tumoral; inibir, até certo ponto, o crescimento de tumores; e/ou melhorar, até certo ponto, um ou mais dos sintomas associados ao câncer. Desde que possa evitar o crescimento de células cancerosas existentes e/ou matá-las, a droga pode ser citoestática e/ou citotóxica. Em uma realização, a quantidade terapeuticamente eficaz é uma quantidade inibidora do crescimento. Em outra realização, a quantidade terapeuticamente eficaz é uma quantidade que estende a sobrevivência de um paciente. Em outra realização, a quantidade terapeuticamente eficaz é uma quantidade que aumenta a sobrevivência livre de progresso de um paciente.
[141] No caso de cura de feridas, a expressão “quantidade eficaz” ou “quantidade terapeuticamente eficaz” designa uma quantidade de uma droga eficaz para acelerar ou melhorar a cura de feridas em um paciente. Uma dose terapêutica é uma dose que exibe um efeito terapêutico sobre o paciente e uma dose subterapêutica é uma dose que não exibe efeito terapêutico sobre o paciente tratado.
[142] Uma “ferida crônica” designa uma ferida que não cura. Vide, por exemplo, Lazarus et al., Definitions and Guidelines for Assessment of Wounds and Evaluation of Healing, Arch. Dermatol. 130: 489-93 (1994). Feridas crônicas incluem, mas sem limitações, por exemplo, úlceras arteriais, úlceras diabéticas, úlceras de pressão, úlceras venosas etc. Uma ferida aguda pode desenvolver-se em uma ferida crônica. Feridas agudas incluem, mas sem limitações, feridas causadas, por exemplo, por lesões térmicas, trauma, cirurgia, extirpação de câncer de pele extenso, infecções fúngicas e bacterianas profundas, vasculite, escleroderma, pênfigo, necrólise epidérmica tóxica etc. Vide, por exemplo, Buford, Wound Healing and Pressure Sores, HealingWell.com, publicado em: 24 de outubro de 2001. Uma “ferida normal” indica uma ferida que sofre reparo de cura de ferida normal.
[143] “Quantidade inibidora do crescimento” de um polipeptídeo, anticorpo, antagonista ou composição de acordo com a presente invenção é uma quantidade capaz de inibir o crescimento de células, especialmente tumorais, tais como células de câncer, in vitro ou in vivo. Uma “quantidade inibidora do crescimento” de um polipeptídeo, anticorpo, antagonista ou composição de acordo com a presente invenção para fins de inibição do crescimento de células neoplásticas pode ser determinada empiricamente e por meio de métodos conhecidos ou de exemplos fornecidos no presente.
[144] “Quantidade citotóxica” de um polipeptídeo, anticorpo, antagonista ou composição de acordo com a presente invenção é uma quantidade capaz de causar a destruição de células, especialmente tumorais, tais como células de câncer, in vitro ou in vivo. Uma “quantidade citotóxica” de um polipeptídeo, anticorpo, antagonista ou composição de acordo com a presente invenção para fins de inibição do crescimento de células neoplásticas pode ser determinada empiricamente e por meio de métodos conhecidos na técnica.
[145] “Doença autoimune” no presente é uma doença ou distúrbio que surge dos próprios tecidos do indivíduo e é dirigido contra eles, sua manifestação, cossegregado ou condição resultante.
[146] Exemplos de doenças ou distúrbios autoimunes incluem, mas sem limitação, artrite (artrite reumatoide tal como artrite aguda, artrite reumatoide crônica, artrite da gota, artrite da gota aguda, artrite inflamatória crônica, artrite degenerativa, artrite infecciosa, artrite de Lyme, artrite proliferativa, artrite psoriática, artrite vertebral e artrite reumatoide juvenil, osteoartrite, artrite crônica progressiva, artrite deformante, poliartrite crônica primária, artrite reativa e espondilite anquilosante), doenças da pele hiperproliferativas inflamatórias, psoríase tal como psoríase de placas, psoríase da gota, psoríase pustular e psoríase das unhas, dermatite, incluindo dermatite de contato, dermatite de contato crônica, dermatite alérgica, dermatite de contato alérgica, dermatite herpetiforme e dermatite atópica, síndrome de hiper IgM ligada a x, urticária tal como urticária idiopática crônica, incluindo urticária autoimune crônica, polimiosite/dermatomiosite, dermatomiosite juvenil, necrólise epidérmica tóxica, escleroderma (incluindo escleroderma sistêmico), esclerose tal como esclerose sistêmica, esclerose múltipla (MS) tal como MS espinho-ótica, MS progressiva primária e MS remetente retardada, esclerose sistêmica progressiva, aterosclerose, arteriosclerose, esclerose disseminada e esclerose atáxica, doença intestinal inflamatória (IBD) (tal como mal de Crohn, colite tal como colite ulcerativa, colite ulcerosa, colite microscópica, colite colagenosa, colite poliposa, enterocolite necrotizante, colite transmural e doença intestinal inflamatória autoimune), pioderma gangrenosa, eritema nodoso, colangite esclerosante primária, episclerite), síndrome de tensão respiratória, incluindo síndrome de tensão respiratória aguda ou em adultos (ARDS), meningite, inflamação total ou parcial da úvea, irite, coroidite, distúrbio hematológico autoimune, espondilite reumatoide, perda súbita da audição, doenças mediadas por IgE tais como anafilaxia e rinite alérgica e atópica, encefalite tal como encefalite de Rasmussen e encefalite do limbo e/ou haste cerebral, uveíte, tal como uveíte anterior, uveíte anterior aguda, uveíte granulomatosa, uveíte não granulomatosa, uveíte facoantigênica, uveíte posterior ou uveíte autoimune, glomerulonefrite (GN) com e sem síndrome nefrótica tal como glomerulonefrite aguda ou crônica como GN primária, GN mediada imune, GN membranosa (nefropatia membranosa), GN membranosa idiopática, GN proliferativa membranosa (MPGN), incluindo Tipo I e Tipo II, e GN em rápida progressão, condições alérgicas, reações alérgicas, eczema, incluindo eczema alérgico ou atópico, asma tal como asma dos brônquios, asma brônquica e asma autoimune, condições que envolvem a infiltração de células T e reações inflamatórias crônicas, doença inflamatória pulmonar crônica, miocardite autoimune, deficiência de adesão de leucócitos, lúpus eritematoso sistêmico (SLE) ou lúpus eritematodes sistêmico tais como SLE cutânea, lúpus eritematoso cutâneo subagudo, síndrome do lúpus neonatal (NLE), lúpus eritematoso disseminado, lúpus (que inclui nefrite, cerebrite, pediátrico, não renal, discoide e alopecia), diabetes mellitus de início juvenil (Tipo I), incluindo diabetes mellitus dependente de insulina pediátrica (IDDM), diabetes mellitus com início em adultos (diabete Tipo II), diabete autoimune, diabetes insipidus idiopática, reações imunológicas associadas à hipersensibilidade aguda e retardada mediada por citocinas e linfócitos T, tuberculose, sarcoidose, granulomatose, incluindo granulomatose linfomatoide, granulomatose de Wegener, agranulocitose, vasculitide, incluindo vasculite (incluindo vasculite de vasos grandes (incluindo polimialgia reumática e artrite de células gigantes (de Takayasu)), vasculite de vasos médios (incluindo mal de Kawasaki e poliartrite nodosa), poliartrite microscópica, vasculite do SNC, vasculite necrotizante, cutânea ou de hipersensibilidade, vasculite necrotizante sistêmica e vasculite associada a ANCA, tal como síndrome ou vasculite de Churg-Strauss (CSS)), artrite temporal, anemia aplástica, anemia aplástica autoimune, anemia positiva de Coombs, anemia Diamond Blackfan, anemia hemolítica ou anemia hemolítica imune incluindo anemia hemolítica autoimune (AIHA), anemia perniciosa, mal de Addison, anemia pura dos glóbulos vermelhos ou aplasia (PRCA), deficiência de Fator VIII, hemofilia A, neutropenia autoimune, pancitopenia, leucopenia, doenças que envolvem diapedese de leucócitos, distúrbios inflamatórios do SNC, síndrome de lesões a diversos órgãos tais como os secundários a septicemia, trauma ou hemorragia, doenças mediadas por complexo de antígeno e anticorpo, doença da membrana basal antiglomerular, síndrome de anticorpos antifosfolipídios, neurite alérgica, mal de Bechet ou de Behcet, síndrome de Castleman, síndrome de Goodpasture, síndrome de Reynaud, síndrome de Sjogren, síndrome de Stevens-Johnson, penfigoide tal como penfigoide bolhosa e penfigoide da pele, pênfigo (incluindo pênfigo vulgar, pênfigo foliar, pênfigo de muco-membrana penfigoide e pênfigo eritematoso), poliendocrinopatias autoimunes, mal ou síndrome de Reiter, nefrite complexa imune, nefrite mediada por anticorpos, neuropatia crônica tal como polineuropatias IgM ou neuropatia mediada por IgM, trombocitopenia (conforme desenvolvido, por exemplo, por pacientes com enfarte do miocárdio), incluindo púrpura trombocitopênica trombótica (TTP) e trombocitopenia mediada imune ou autoimune tal como púrpura trombocitopênica idiopática (ITP) incluindo ITP crônica ou aguda, doença autoimune dos testículos e ovários, incluindo ooforite e orquite autoimune, hipotireoidismo primário, hipoparatireoidismo, doenças endócrinas autoimunes incluindo tireoidite tal como tireoidite autoimune, mal de Hashimoto, tireoidite crônica (tireoidite de Hashimoto) ou tireoidite subaguda, mal da tireoide autoimune, hipotireoidismo idiopático, mal de Grave, síndromes poliglandulares tais como síndromes poliglandulares autoimunes (ou síndromes de endocrinopatia poliglandular), síndromes paraneoplásicas, incluindo síndromes paraneoplásicas neurológicas tais como síndrome miastênica de Lambert-Eaton ou síndrome de Eaton-Lambert, síndrome de homem rígido ou pessoa rígida, encefalomielite tal como encefalomielite alérgica e encefalomielite alérgica experimental (EAE), miastenia grave, degeneração do cerebelo, neuromiotonia, síndrome de opsoclonus ou opsoclonus mioclonus (OMS), neuropatia sensorial, síndrome de Sheehan, hepatite autoimune, hepatite crônica, hepatite lupoide, hepatite de células gigantes, hepatite ativa crônica ou hepatite ativa crônica autoimune, pneumonite intersticial linfoide, bronquiolite obliterans (não de transplante) x NSIP, síndrome de Guillain-Barré, mal de Berger (nefropatia de IgA), nefropatia de IgA idiopática, dermatose de IgA linear, cirrose biliar primária, pneumonocirrose, síndrome de enteropatia autoimune, doença celíaca, doença celíaca, psilose celíaca (enteropatia do glúten), psilose refratária, psilose idiopática, crioglobulinemia, esclerose lateral amilotrófica (ALS; mal de Lou Gehrig), mal de artéria coronariana, doença do ouvido interno autoimune (AIED) ou perda da audição autoimune, síndrome de opsoclonus mioclonus (OMS), policondrite tal como policondrite refratária ou retardada, proteinose alveolar pulmonar, amiloidose, esclerite, linfocitose não cancerosa, linfocitose primária, que inclui linfocitose de células B monoclonais (tal como gamopatia monoclonal benigna e gamopatia monoclonal com significado não determinado, MGUS), neuropatia periférica, síndrome paraneoplásica, canalopatias tais como epilepsia, enxaqueca, arritmia, distúrbios musculares, surdez, cegueira, paralisia periódica e canalopatias do SNC, autismo, miopatia inflamatória, glomerulosclerose segmental focal (FSGS), oftalmopatia endócrina, uveorretinite, coriorretinite, distúrbio hepatológico autoimune, fibromialgia, falhas endócrinas múltiplas, síndrome de Schmidt, adrenalite, atrofia gástrica, demência pré-senil, doenças desmielinizantes tais como doenças desmielinizantes autoimunes, nefropatia diabética, síndrome de Dressler, alopecia areata, síndrome de CREST (calcinose, fenômeno de Raynaud, falta de mobilidade do esôfago, esclerodactilia e telangiectasia), infertilidade autoimune masculina e feminina, doença de tecidos conectivos misturados, doença de Chagas, febre reumática, aborto recorrente, pulmão de fazendeiro, eritema multiforme, síndrome pós-cardiotomia, síndrome de Cushing, pulmão de ornitófilo, angite granulomatosa alérgica, angite linfocítica benigna, síndrome de Alport, alveolite tal como alveolite alérgica e alveolite fibrosante, doença pulmonar intersticial, reação à transfusão, hanseníase, malária, leishmaniose, quipanossomíase, esquistossomíase, ascaríase, aspergilose, síndrome de Sampter, síndrome de Caplan, dengue, endocardite, fibrose do endomiocárdio, fibrose pulmonar intersticial difusa, fibrose pulmonar intersticial, fibrose pulmonar idiopática, fibrose cística, endoftalmite, eritema elevatum diutinum, eritroblastose fetal, facite eosinofílica, síndrome de Shulman, síndrome de Felty, flaríase, ciclite tal como ciclite crônica, ciclite heterocrônica, iridociclite ou ciclite de Fuch, púrpura de Henoch-Schonlein, infecção por vírus da imunodeficiência humana (HIV), infecção por ecovírus, cardiomiopatia, mal de Alzheimer, infecção por parvovírus, infecção por vírus da rubéola, síndromes pós-vacinação, infecção por rubéola congênita, infecção por vírus Epstein-Barr, sarampo, síndrome de Evan, falha gonadal autoimune, coreia de Sydenham, nefrite pós-estreptocóccica, tromboangite ubiterans, tirotoxicose, tabe dorsal, coriodite, polimialgia de células gigantes, oftamopatia endócrina, pneumonite por hipersensibilidade crônica, ceratoconjuntivite seca, ceratoconjuntivite epidêmica, síndrome nefrítica idiopática, nefropatia de alteração mínima, lesões por reperfusão isquêmica e familiar benigna, autoimunicidade da retina, inflamação das juntas, bronquite, doença de obstrução das vias aéreas, silicose, aftas, estomatite aftosa, distúrbios arterioscleróticos, aspermiogênese, hemólise autoimune, mal de Boeck, crioglobulinemia, contratura de Dupuytren, endoftalmia facoanafilática, enterite alérgica, eritema nodosum leprosum, paralisia facial idiopática, síndrome de fadiga crônica, febre reumática, mal de Hamman Rich, perda da audição sensoneural, hemoglobinúria paroxística, hipogonadismo, ileíte regional, leucopenia, mononucleose infecciosa, mielite transversal, mixedema idiopático primário, nefrose, oftalmia simpática, orquite granulomatosa, pancreatite, polirradiculite aguda, pioderma gangrenoso, tireoidite de Quervain, atrofia esplênica adquirida, infertilidade devido a anticorpos antiespermatozoides, timoma não maligno, vitiligo, doenças associadas ao vírus Epstein-Barr e SCID, síndrome da imunodeficiência adquirida (AIDS), doenças parasíticas tais como leishmaniose, síndrome de choque tóxico, envenenamento alimentar, condições que envolvem a infiltração de células T, deficiência de adesão de leucócitos, reações imunológicas associadas à hipersensibilidade aguda e retardada mediada por citocinas e linfócitos T, doenças que envolvem a diapedese de leucócitos, síndrome de lesão a múltiplos órgãos, doenças mediadas por complexos de antígeno e anticorpos, doença da membrana base antiglomerular, neurite alérgica, poliendocrinopatias autoimunes, ooforite, mixedema primário, gastrite atrófica autoimune, oftalmia simpática, doenças reumáticas, doença de tecido conectivo misturado, síndrome nefrótica, insulite, falhas poliendócrinas, neuropatia periférica, síndrome poliglandular autoimune do tipo I, hipoparatireoidismo idiopático com início em adultos (AOIH), alopecia total, cardiomiopatia dilatada, epidermólise bolhosa adquirida (EBA), hemocromatose, miocardite, síndrome nefrótica, colangite esclerosante primária, sinusite purulenta ou não purulenta, sinusite aguda ou crônica, sinusite etmoide, frontal, maxilar ou esfenoide, distúrbio relativo a eosinófilos tal como eosinofilia, eosinofilia por infiltração pulmonar, síndrome de eosinofilia e mialgia, síndrome de Loffler, pneumonia eosinofílica crônica, eosinofilia pulmonar tropical, aspergilose broncopneumônica, aspergiloma ou granulomas que contêm eosinófilos, anafilaxia, espondiloartrites soronegativas, doença autoimune poliendócrina, colangite esclerosante, esclera, episclera, candidíase mucocutânea crônica, síndrome de Bruton, hipogamaglobulinemia infantil transitória, síndrome de Wiskott-Aldrich, ataxia telangiectasia, distúrbios autoimunes associados a doenças do colágeno, reumatismo, doença neurológica, distúrbio por reperfusão isquêmica, redução da reação da pressão sanguínea, distúrbios vasculares, angiectasia, lesões dos tecidos, isquemia cardiovascular, hiperalgesia, isquemia cerebral e doenças que acompanham a vascularização, distúrbios por hipersensibilidade alérgica, glomerulonefrite, lesões por reperfusão, lesões por reperfusão de tecidos do miocárdio ou outros, dermatoses com componentes inflamatórios agudos, meningite purulenta aguda ou outros distúrbios inflamatórios do sistema nervoso central, síndromes associadas à transfusão de granulócitos, toxicidade induzida por citocinas, inflamações agudas sérias, inflamações intratáveis crônicas, pielite, pneumonocirrose, retinopatia diabética, distúrbios de artérias grandes diabéticas, hiperplasia endoarterial, úlcera péptica, valvulite e endometriose.
[147] O termo “detecção” destina-se a incluir a determinação da presença ou ausência de uma substância ou a quantificação de uma substância. O termo refere-se, portanto, ao uso dos materiais, composições e métodos de acordo com a presente invenção para determinações qualitativas e quantitativas. De forma geral, o método específico utilizado para detecção não é crítico para a prática da presente invenção.
[148] “Detecção”, por exemplo, pode incluir, de acordo com a presente invenção: observação da presença ou ausência de produto genético α5, produto genético β1 (tais como moléculas de mRNA) ou um polipeptídeo α5 ou α5β1; alteração dos níveis de um polipeptídeo α5 ou α5β1 ou quantidade ligada a um alvo; alteração da função/atividade biológica de um polipeptídeo α5 ou α5β1. Em algumas realizações, “detecção” pode incluir a detecção dos níveis de α5 ou α5β1 do tipo selvagem (tais como níveis de mRNA ou de polipeptídeos). A detecção pode incluir a quantificação de uma alteração (tal como um aumento ou redução) de qualquer valor em pelo menos 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100% ou mais em comparação com um controle. A detecção pode incluir a quantificação de uma mudança de qualquer valor em pelo menos duas vezes, três vezes, quatro vezes, cinco vezes, seis vezes, sete vezes, oito vezes, nove vezes, dez vezes ou mais, tal como vinte vezes, trinta vezes, quarenta vezes, cinquenta vezes, sessenta vezes, setenta vezes, oitenta vezes, noventa vezes, cem vezes ou mais.
[149] “Marca”, da forma utilizada no presente, designa um composto ou composição detectável que é conjugado direta ou indiretamente ao anticorpo. A marca pode ser detectável por si própria (tais como marcas de radioisótopos ou marcas fluorescentes) ou, no caso de marca enzimática, pode catalisar a alteração química de um composto ou composição de substrato que seja detectável.
III. ANTICORPOS ANTI-A5B1
[150] São fornecidos no presente anticorpos que podem ligar α5β1 e inibir competitivamente a ligação do anticorpo anti-α5β1 18C12 a α5β1 humano. Consequentemente, uma realização da presente invenção fornece anticorpos que compreendem uma sequência leve variável (VL) descrita em qualquer dos SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8 e uma sequência pesada variável (VH) descrita em qualquer um dentre SEQ ID NO: 9, 10, 11, 12, 13 ou 14. Também são contempladas formas humanas ou quiméricas (incluindo, por exemplo, humanizadas) dos anticorpos anti-α5β1 descritos no presente.
[151] Segundo uma realização, o anticorpo liga um α5β1 humano com Kd de 500 nM a 1 pM. Em certas realizações, um anticorpo fornecido no presente possui uma constante de dissociação (Kd) de < 1 μM, < 100 nM, < 10 nM, < 1 nM, < 0,1 nM, < 0,01 nM ou < 0,001 nM (por exemplo, 10-8 M ou menos, por exemplo de 10-8 M a 10-13 M, por exemplo de 10-9 M a 10-13 M). Segundo uma outra realização, o anticorpo não liga αVβ3, αVβ5 ou αVβ1. Segundo uma outra realização, o anticorpo compreende uma sequência Fc de um IgG humano, tal como IgG1 humano ou IgG4 humano. Em uma outra realização, uma sequência Fc foi alterada ou modificada de outra forma, de maneira que não possui função efetora de citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC), frequentemente relacionada à sua ligação a receptores de Fc (FcRs). Existem muitos exemplos de alterações ou mutações de sequências Fc que podem alterar a função efetora. WO 00/42072 e Shields et al., J. Biol. Chem. 9 (2): 65916604 (2001), por exemplo, descrevem variantes de anticorpos com maior ou menor ligação a FcRs. O teor dessas publicações é incorporado especificamente ao presente como referência. O anticorpo pode apresentar-se na forma de um fragmento de Fab, Fab', F(ab)'2, Fv de fita única (scFv) ou Fv; um diacorpo e um anticorpo linear. Além disso, o anticorpo pode ser um anticorpo multiespecífico que se liga a α5β1 e é um antagonista de α5β1, mas também liga um ou mais alvos diferentes e inibe a sua função (tal como VEGF) ou um anticorpo multiespecífico que se liga a dois ou mais locais diferentes sobre α5β1. O anticorpo pode ser conjugado a um agente terapêutico (tal como um agente citotóxico, um radioisótopo e um agente quimioterápico) ou uma marca para detectar α5β1 em amostras de pacientes ou in vivo por meio de formação de imagens (tal como radioisótopo, tintura fluorescente e enzima).
[152] Moléculas de ácido nucleico que codificam os anticorpos anti-α5β1, vetores de expressão que compreendem moléculas de ácido nucleico que codificam um ou ambos os domínios variáveis e células que compreendem as moléculas de ácido nucleico também são contempladas. Estes anticorpos podem ser utilizados nas terapias descritas no presente e para detectar proteína α5β1 em amostras de pacientes (utilizando, por exemplo, FACS, imuno- histoquímica (IHC), testes ELISA) ou em pacientes.
A. ANTICORPOS MONOCLONAIS
[153] Os anticorpos monoclonais podem ser preparados, por exemplo, utilizando métodos de hibridoma, tais como os descritos por Kohler e Milstein, Nature 256: 495 (1975) ou podem ser elaborados por meio de métodos de DNA recombinante (Patente Norte-Americana n° 4.816.567) ou podem ser produzidos por meio dos métodos descritos no presente nos Exemplos abaixo. Em um método de hibridoma, um camundongo, hamster ou outro animal hospedeiro apropriado é tipicamente imunizado com um agente imunizante (tal como um polipeptídeo α5, β1 ou α5β1 isoladamente ou em combinação com uma portadora apropriada) para gerar linfócitos que produzem ou são capazes de produzir anticorpos que se ligarão especificamente ao agente imunizante. Alternativamente, os linfócitos podem ser imunizados in vitro.
[154] O agente imunizante incluirá tipicamente um polipeptídeo ou uma proteína de fusão da proteína de interesse ou uma composição que compreende a proteína. Geralmente, linfócitos sanguíneos periféricos (“PBLs”) são utilizados caso sejam desejadas células de origem humana ou são utilizadas células do baço ou células dos nódulos linfáticos caso sejam desejadas fontes de mamíferos não humanos. Os linfócitos são fundidos em seguida a uma linhagem celular imortalizada, utilizando um agente de fusão apropriado, tal como polietileno glicol, para formar uma célula de hibridoma. Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (Nova Iorque: Academic Press, 1986), págs. 59-103. As linhagens celulares imortalizadas são normalmente células de mamíferos transformadas, particularmente células de mieloma de origem humana, bovina e de roedores. Normalmente, são empregadas linhagens celulares de mieloma de rato ou camundongo. As células de hibridoma podem ser cultivadas em um meio de cultivo apropriado que contém preferencialmente uma ou mais substâncias que inibem o crescimento ou a sobrevivência das células imortalizadas não fundidas. Caso as células parentais não contenham a enzima hipoxantino guanina fosforribosil transferase (HGPRT ou HPRT), por exemplo, o meio de cultivo para os hibridomas incluirá tipicamente hipoxantina, aminopterina e timidina (“meio HAT”), substâncias que evitam o crescimento de células com deficiência de HGPRT.
[155] Linhagens celulares imortalizadas preferidas são aquelas que se fundem eficientemente, apoiam a expressão estável em alto nível de anticorpos pelas células produtoras de anticorpos selecionadas e são sensíveis a um meio tal como meio HAT. As linhagens celulares imortalizadas de maior preferência são linhagens de mieloma murino, que podem ser obtidas, por exemplo, por meio do Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Califórnia, e da Coleção Norte-Americana de Cultivos de Tipos, Manassas, Virgínia. Linhagens celulares de mieloma humano e heteromieloma humano/de camundongos também foram descritas para a produção de anticorpos monoclonais humanos. Kozbor, J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications (Marcel Dekker Inc., Nova Iorque, 1987), págs. 51-63.
[156] O meio de cultivo no qual são cultivadas células de hibridoma pode ser testado em seguida para determinar a presença de anticorpos monoclonais dirigidos ao polipeptídeo. A especificidade de ligação de anticorpos monoclonais produzidos pelas células de hibridoma pode ser determinada por meio de imunoprecipitação ou de um teste de ligação in vitro, tal como radioimunoensaio (RIA) ou ensaio imunoabsorvente ligado por enzimas (ELISA). Esses métodos e testes são conhecidos na técnica. A afinidade de ligação do anticorpo monoclonal pode ser determinada, por exemplo, por meio da análise Scatchard de Munson e Pollard, Anal. Biochem., 107: 220 (1980).
[157] Após a identificação das células de hibridoma desejadas, os clones podem ser subclonados por meio da limitação de procedimentos de diluição e cultivados por meio de métodos padrão. Goding, acima. Meios de cultivo apropriados para este propósito incluem, por exemplo, Meio Eagle’s Modificado da Dulbecco ou meio RPMI-1640. Alternativamente, as células de hibridoma podem ser cultivadas in vivo na forma de ascite em mamíferos.
[158] Os anticorpos monoclonais secretados pelos subclones podem ser isolados ou purificados do meio de cultivo ou fluido de ascite por meio de procedimentos convencionais de purificação de imunoglobulina, tais como proteína A Sepharose, cromatografia de hidroxiapatita, eletroforese em gel, diálise ou cromatografia de afinidade.
[159] Os anticorpos monoclonais podem também ser fabricados por meio de métodos de DNA recombinante, tais como os descritos na Patente Norte-Americana n° 4.816.567. O DNA codificador dos anticorpos monoclonais de acordo com a presente invenção pode ser facilmente isolado e sequenciado utilizando procedimentos convencionais (empregando, por exemplo, sondas de oligonucleotídeos que sejam capazes de ligar-se especificamente a genes codificadores das cadeias pesada e leve de anticorpos murinos). As células de hibridoma de acordo com a presente invenção servem de fonte preferida desse DNA. Uma vez isolado, o DNA pode ser colocado em vetores de expressão, que são transfectados em seguida para células hospedeiras, tais como células COS de símios, células de Ovário de Hamster Chinês (CHO) ou células de mieloma que, de outra forma, não produzem proteína de imunoglobulina, para obter a síntese de anticorpos monoclonais nas células hospedeiras recombinantes. O DNA pode também ser modificado, por exemplo, por meio de substituição da sequência de codificação por domínios constantes de cadeia leve e pesada humana no lugar das sequências murinas homólogas (Patente Norte-Americana n° 4.816.567; Morrison et al., acima), ou por meio de ligação covalente da sequência de codificação de imunoglobulina com a sequência de codificação para um polipeptídeo não de imunoglobulina, no todo ou em parte. Esse polipeptídeo não de imunoglobulina pode ser substituído pelos domínios constantes de um anticorpo de acordo com a presente invenção, ou pode ser substituído pelos domínios variáveis de um local de combinação de antígenos de um anticorpo de acordo com a presente invenção para criar um anticorpo bivalente quimérico.
[160] Os anticorpos podem ser anticorpos monovalentes. Métodos de preparação de anticorpos monovalentes são conhecidos na técnica. Um método envolve, por exemplo, a expressão recombinante de cadeia leve de imunoglobulina e cadeia pesada modificada. A cadeia pesada geralmente é truncada em qualquer ponto da região Fc, de forma a evitar a retícula de cadeia pesada. Alternativamente, os resíduos de cisteína relevantes são substituídos por um outro resíduo de aminoácido ou são excluídos, de forma a evitar a retícula.
[161] Métodos in vitro também são apropriados para a preparação de anticorpos monovalentes. A digestão de anticorpos para produzir seus fragmentos, particularmente fragmentos de Fab, pode ser realizada utilizando métodos rotineiros conhecidos na técnica, mas sem limitações.
ANTICORPOS HUMANOS
[162] Em certas realizações, um anticorpo fornecido no presente é um anticorpo humano. Anticorpos humanos podem ser produzidos utilizando diversos métodos conhecidos na técnica. Anticorpos humanos são descritos de forma geral em van Dijk e van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001) e Lonberg, Curr. Opin. Immunol. 20: 450-459 (2008).
[163] Podem ser preparados anticorpos humanos por meio da administração de imunógenos a um animal transgênico que tenha sido modificado para produzir anticorpos humanos intactos ou anticorpos intactos com regiões variáveis humanas em resposta a desafio antigênico. Esses animais contêm tipicamente, no todo ou em parte, os locais de imunoglobulina humana, que substituem os locais de imunoglobulina endógena ou que estão presentes de forma extracromossômica ou integrados aleatoriamente aos cromossomos do animal. Nesses camundongos transgênicos, os locais de imunoglobulina endógena foram, de forma geral, desativados. Para análise de métodos de obtenção de anticorpos humanos de animais transgênicos, vide Lonberg, Nat. Biotech. 23: 1117-1125 (2005). Vide também, por exemplo, as Patentes Norte- Americanas n° 6.075.181 e 6.150.584, que descrevem tecnologia XENOMOUSE®; Patente Norte-Americana n° 5.770.429, que descreve a tecnologia HuMab®; Patente Norte-Americana n° 7.041.870, que descreve tecnologia K-M MOUSE®; e o Pedido de Patente Norte-Americano publicado n° US 2007/0061900, que descreve a tecnologia VelociMouse®). Regiões variáveis humanas de anticorpos intactos gerados por esses animais podem ser adicionalmente modificadas, por exemplo, por meio de combinação com uma região constante humana diferente.
[164] Podem também ser elaborados anticorpos humanos por meio de métodos com base em hibridoma. Linhagens celulares de mieloma humano e heteromieloma humano/de camundongos também foram descritas para a produção de anticorpos monoclonais humanos (vide, por exemplo Kozbor, J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, págs. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., Nova Iorque, 1987); e Boerner et al., J. Immunol., 147: 86 (1991)). Os anticorpos humanos gerados por meio da tecnologia de hibridoma de células B humanas também são descritos em Li et al., PNAS U. S. A., 103: 3557-3562 (2006). Métodos adicionais incluem os descritos, por exemplo, na Patente Norte-Americana n° 7.189.826 (que descreve a produção de anticorpos IgM humanos monoclonais de linhagens de células de hibridoma) e Ni, Xiandai Mianyixue, 26 (4): 265-268 (2006) (que descreve hibridomas humanos). Tecnologia de hibridomas humanos (tecnologia Trioma) também é descrita em Vollmers e Brandlein, Histology and Histopathology, 20 (3): 927-937 (2005) e Vollmers e Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27 (3): 185-91 (2005).
[165] Anticorpos humanos podem também ser gerados por meio do isolamento de sequências de domínio variável de clone de Fv selecionadas a partir de bibliotecas de disposição de fagos derivadas de seres humanos. Essas sequências de domínios variáveis podem ser combinadas em seguida com um domínio constante humano desejado. Métodos de seleção de anticorpos humanos a partir de bibliotecas de anticorpos são descritos abaixo.
ANTICORPOS DERIVADOS DE BIBLIOTECAS:
[166] Os anticorpos de acordo com a presente invenção podem ser isolados por meio da seleção de bibliotecas combinatórias em busca de anticorpos com a(s) atividade(s) desejada(s). Diversos métodos são conhecidos na técnica, por exemplo, para gerar bibliotecas de disposição de fagos e seleção dessas bibliotecas em busca de bibliotecas que possuem as características de ligação desejadas. Esses métodos são analisados, por exemplo, em Hoogenboom et al. em Methods in Molecular Biology 178: 1-37 (O’Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001) e adicionalmente descritos, por exemplo, em McCafferty et al., Nature 348: 552-554; Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992); Marks e Bradbury em Methods in Molecular Biology 248: 161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338 (2): 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol. 340 (5): 1073-1093 (2004); Fellouse, PNAS USA 101 (34): 12467-12472 (2004); e Lee et al., J. Immunol. Methods 284 (1-2): 119-132 (2004).
[167] Em certos métodos de disposição de fagos, repertórios de genes VH e VL são clonados separadamente por meio de reação em cadeia de polimerase (PCR) e novamente combinados aleatoriamente em bibliotecas de fagos, que podem ser pesquisadas em seguida em busca de fago de ligação de antígenos conforme descrito em Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994). Fago tipicamente dispõe fragmentos de anticorpos, seja na forma de fragmentos de Fv de fita única (scFv) ou de fragmentos de Fab. Bibliotecas de fontes imunizadas fornecem anticorpos com alta afinidade para o imunógeno sem a necessidade de construção de hibridomas. Alternativamente, o repertório nativo pode ser clonado (por exemplo, de seres humanos) para fornecer uma única fonte de anticorpos humanos para ampla variedade de antígenos próprios e não próprios sem nenhuma imunização, conforme descrito por Griffiths et al., EMBO J., 12: 725-734 (1993). Por fim, bibliotecas nativas podem também ser elaboradas sinteticamente por meio de clonagem dos segmentos de genes V não redispostos de células haste, utilizando primers de PCR que contêm sequência aleatória para codificar as regiões de CDR3 altamente variáveis e realizar redisposição in vitro conforme descrito por Hoogenboom e Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992). Publicações de patentes que descrevem bibliotecas de fagos de anticorpos humanos incluem, por exemplo: Patente Norte- Americana n° 5.750.373 e Pedidos de Patente Norte-Americanos publicados n° 2005/0079574, 2005/0119455, 2005/0266000, 2007/0117126, 2007/0160598, 2007/0237764, 2007/0292936 e 2009/0002360.
[168] Anticorpos ou fragmentos de anticorpos isolados de bibliotecas de anticorpos humanos são considerados anticorpos humanos ou fragmentos de anticorpos humanos no presente.
ANTICORPOS QUIMÉRICOS E HUMANIZADOS
[169] Em certas realizações, um anticorpo fornecido no presente é um anticorpo quimérico. Certos anticorpos quiméricos são descritos, por exemplo, na Patente Norte-Americana n° 4.816.567; e Morrison et al., PNAS USA, 81: 6851-6855 (1984)). Em um exemplo, um anticorpo quimérico compreende uma região variável não humana (tal como uma região variável derivada de camundongo, rato, hamster, coelho ou primata não humano, tal como macaco) e uma região constante humana. Em um exemplo adicional, um anticorpo quimérico é um anticorpo com “classe trocada” no qual a classe ou subclasse foi alterada com relação ao anticorpo parental. Anticorpos quiméricos incluem seus fragmentos de ligação de antígenos.
[170] Em certas realizações, um anticorpo quimérico é um anticorpo humanizado. Tipicamente, um anticorpo não humano é humanizado para reduzir a imunogenicidade para seres humanos, mantendo ao mesmo tempo a especificidade e afinidade do anticorpo não humano parental. Geralmente, um anticorpo humanizado compreende um ou mais domínios variáveis nos quais HVRs, tais como CDRs (ou suas porções), são derivadas de um anticorpo não humano e FRs (ou suas porções) são derivadas de sequências de anticorpos humanos. Um anticorpo humanizado também compreenderá opcionalmente pelo menos uma porção de uma região constante humana. Em algumas realizações, alguns resíduos de FR em um anticorpo humanizado são substituídos por resíduos correspondentes de um anticorpo não humano (tal como o anticorpo do qual são derivados os resíduos de HVR), por exemplo, para restaurar ou aumentar a especificidade ou afinidade de anticorpos.
[171] Anticorpos humanizados e os métodos de sua elaboração são analisados, por exemplo, em Almagro e Fransson, Front. Biosci. 13: 16191633 (2008) e são adicionalmente descritos, por exemplo, em Riechmann et al., Nature 332: 323-329 (1988); Queen et al., PNAS USA 86: 10029-10033 (1989); Patentes Norte-Americanas n° 5.821.337, 7.527.791, 6.982.321 e 7.087.409; Kashmiri et al., Methods 36: 25-34 (2005) (que descreve enxerto de SDR (a- CDR)); Padlan, Mol. Immunol. 28: 489-498 (1991) (que descreve “nova formação de superfície); Dall’Acqua et al., Methods 36: 43-60 (2005) (que descreve “mudança de FR”); e Osbourn et al., Methods 36: 61-68 (2005) e Klimka et al., Br. J. Cancer, 83: 252-260 (2000) (que descreve a abordagem de “seleção orientada” para troca de FR).
[172] As regiões de estrutura humana que podem ser utilizadas para humanização incluem, mas sem limitações: regiões de estrutura selecionadas utilizando o método de "melhor adequação" (vide, por exemplo, Sims et al., J. Immunol. 151: 2296 (1993)); regiões de estrutura derivadas da sequência de consenso de anticorpos humanos de um subgrupo específico de regiões variáveis de cadeia leve ou pesada (vide, por exemplo, Carter et al., PNAS U. S. A., 89: 4285 (1992); e Presta et al., J. Immunol., 151: 2623 (1993)); regiões de cadeia principal maduras humanas (que sofreram mutação somática) ou regiões de cadeia principal de linhagem de germens humanos (vide, por exemplo, Almagro e Fransson, Front. Biosci. 13: 1619-1633 (2008)); e regiões de estrutura derivadas de bibliotecas de FR de seleção (vide, por exemplo, Baca et al., J. Biol. Chem. 272: 10678-10684 (1997); e Rosok et al., J. Biol. Chem. 271: 2261122618 (1996)).
E. ANTICORPOS MULTIESPECÍFICOS
[173] Em certas realizações, um anticorpo fornecido no presente é um anticorpo multiespecífico, tal como um anticorpo biespecífico. Os anticorpos multiespecíficos são anticorpos monoclonais que possuem especificidades de ligação para pelo menos dois locais diferentes. Em certas realizações, uma das especificidades de ligação é para α5β1 e a outra é para qualquer outro antígeno (tal como VEGF). Em certas realizações, anticorpos biespecíficos podem ligar-se a dois epítopos diferentes de α5β1. Podem também ser utilizados anticorpos biespecíficos para localizar agentes citotóxicos para células que expressem α5β1. Anticorpos biespecíficos podem ser preparados na forma de anticorpos de comprimento total ou fragmentos de anticorpos.
[174] Os métodos de elaboração de anticorpos multiespecíficos incluem, mas sem limitações, coexpressão recombinante de dois pares de cadeia leve e cadeia pesada de imunoglobulina que possuem especificidades diferentes (vide Milstein e Cuello, Nature 305: 537 (1983)), WO 93/08829 e Traunecker et al., EMBO J. 10: 3655 (1991)) e engenharia “botão no orifício” (vide, por exemplo, Patente Norte-Americana n° 5.731.168). Anticorpos multiespecíficos podem também ser elaborados por meio da realização de efeitos de direcionamento eletrostático para elaborar moléculas heterodiméricas de Fc de anticorpos (WO 2009/089004A1); retícula de dois ou mais anticorpos ou fragmentos (vide, por exemplo, Patente Norte- Americana n° 4.676.980 e Brennan et al., Science, 229: 81 (1985)); utilizando fechos de leucina para produzir anticorpos biespecíficos (vide, por exemplo, Kostelny et al., J. Immunol., 148 (5): 1547-1553 (1992)); utilizando tecnologia de “diacorpos” para elaborar fragmentos de anticorpos biespecíficos (vide, por exemplo, Hollinger et al., PNAS USA, 90: 6444-6448 (1993)); e utilizando dímeros Fv de fita única (sFv) (vide, por exemplo, Gruber et al., J. Immunol., 152: 5368 (1994)); e preparação de anticorpos triespecíficos conforme descrito, por exemplo, em Tutt et al., J. Immunol. 147: 60 (1991).
[175] Os anticorpos elaborados com três ou mais locais de ligação de antígenos funcionais, incluindo “anticorpos de Octopus”, também são incluídos no presente (vide, por exemplo, US 2006/0025576A1).
[176] O anticorpo ou fragmento do presente também inclui um “FAb de Ação Dupla" ou "DAF" que compreende um local de ligação de antígenos que se liga a α5β1, bem como um outro antígeno diferente (vide, por exemplo, US 2008/0069820).
F. VARIANTES DE ANTICORPOS
[177] Em certas realizações, são contempladas variantes de sequências de aminoácidos dos anticorpos fornecidos no presente. Pode ser desejável, por exemplo, aprimorar a afinidade de ligação e/ou outras propriedades biológicas do anticorpo. Variantes de sequências de aminoácidos de um anticorpo podem ser preparadas por meio da introdução de modificações apropriadas na sequência de nucleotídeos que codifica o anticorpo, ou por meio da síntese de peptídeos. Essas modificações incluem, por exemplo, exclusões e/ou inserções e/ou substituições de resíduos nas sequências de aminoácidos do anticorpo. Qualquer combinação de deleção, inserção e substituição pode ser feita para chegar à construção final, desde que a construção final possua as características desejadas, tais como ligação de antígenos. 1. VARIANTES SUBSTITUCIONAIS, INSERÇÃO E DELEÇÃO.
[178] Em certas realizações, são fornecidas variantes de anticorpos que contêm uma ou mais substituições de aminoácidos. Sítios de interesse para mutagênese substitucional incluem os HVRs e FRs. Substituições conservativas são exibidas na Tabela 1 sob o título “substituições conservativas”. Alterações mais substanciais são fornecidas na Tabela 1 sob o título “exemplos de substituições” e conforme descrito adicionalmente abaixo com referência a classes de cadeias laterais de aminoácidos. Substituições de aminoácidos podem ser introduzidas em um anticorpo de interesse e os produtos são selecionados para determinar uma atividade desejada, tal como ligação de antígenos retida/aprimorada, redução da imunogenicidade ou aumento de ADCC ou CDC.
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[179] Os aminoácidos podem ser agrupados de acordo com as propriedades de cadeia lateral comuns: (1) hidrofóbicos: Norleucina, Met, Ala, Val, Leu, Ile; (2) hidrofílicos neutros: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln; (3) ácidos: Asp, Glu; (4) básicos: His, Lys, Arg; (5) resíduos que influenciam a orientação da cadeia: Gly, Pro; (6) aromáticos: Trp, Tyr, Phe.
[180] Substituições não conservativas causarão a substituição de um membro de uma dessas classes por outra classe.
[181] Um tipo de variante substitucional envolve a substituição de um ou mais resíduos da região hipervariável de um anticorpo parental (por exemplo, anticorpo humano ou humanizado). Geralmente, a(s) variante(s) resultante(s) selecionada(s) conterá(ão) modificações (tal como melhorias) em certas propriedades biológicas (tal como aumento da afinidade e redução da imunogenicidade) com relação ao anticorpo parental e/ou possuirão certas propriedades biológicas substancialmente retidas com relação ao anticorpo parental. Um exemplo de variante substitucional é um anticorpo maturado por afinidade, que pode ser gerado convenientemente, gerado, por exemplo, por técnicas de maturação por afinidade com base em disposição de fagos, tais como as descritas no presente. Resumidamente, um ou mais resíduos de HVR são mutados e os anticorpos variantes são dispostos sobre fagos e selecionados por uma atividade biológica específica (tal como afinidade de ligação).
[182] Podem ser realizadas alterações (tais como substituições) em HVRs, por exemplo, para aumentar a afinidade de anticorpo. Essas alterações podem ser feitas em hotspots de HVR, ou seja, resíduos codificados por códons que sofrem alta frequência de mutação durante o processo de maturação somática (vide, por exemplo, Chowdhury, Methods Mol. Biol. 207:179196 (2008)) e/ou SDRs (a-CDRs), em que a variante resultante VH ou VL é testada para determinar a afinidade de ligação. A maturação da afinidade, por meio da construção e nova seleção de bibliotecas secundárias foi descrita, por exemplo, em Hoogenboom et al. em Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O’Brien et al., Ed., Human Press, Totowa NJ (2001)). Em algumas realizações de maturação da afinidade, a diversidade é introduzida nos genes variáveis selecionados para determinar a maturação por qualquer um dentre uma série de métodos (tais como PCR à prova de erros, alteração de cadeias ou mutagênese dirigida a oligonucleotídeos). É criada em seguida uma biblioteca secundária. A biblioteca é triada em seguida para identificar quaisquer variantes de anticorpos com a afinidade desejada. Um outro método de introdução da diversidade envolve abordagens dirigidas a HVR, em que diversos resíduos de HVR (tais como 4 a 6 resíduos de cada vez) são aleatorizados. Resíduos de HVR envolvidos na ligação de antígenos podem ser especificamente identificados, tais como utilizando modelagem ou mutagênese de varredura de alanina. CDR- H3 e CDR-L3 são particularmente alvos.
[183] Em certas realizações, substituições, inserções ou deleções podem ocorrer em até um ou mais HVRs, desde que essas alterações não reduzam substancialmente a capacidade do anticorpo de ligar ao antígeno. Alterações conservativas, por exemplo, (tais como substituições conservativas conforme fornecido no presente) que não reduzem substancialmente a afinidade de ligação podem ser realizadas em HVRs. Essas alterações podem estar fora de hotspots de HVR ou SDRs. Em certas realizações das sequências de VH e VL variantes fornecidas acima, cada HVR é inalterado ou contém não mais de uma, duas ou três substituições de aminoácidos.
[184] Um método útil de identificação de resíduos ou regiões de um anticorpo que podem ser dirigidas para mutagênese é denominado “mutagênese de varredura de alanina”, conforme descrito por Cunningham e Wells (1989), Science, 244: 1081-1085. Nesse método, um resíduo ou grupo de resíduos alvo (tais como resíduos carregados como arg, asp, his, lys e glu) é identificado e substituído por um aminoácido com carga neutra ou negativa (tal como alanina ou polialanina) para determinar se a interação do anticorpo com antígeno é afetada. Substituições adicionais podem ser introduzidas nos locais de aminoácidos que demonstram sensibilidade funcional às substituições iniciais. Alternativa ou adicionalmente, uma estrutura de cristal do complexo de antígeno e anticorpo para identificar pontos de contato entre o anticorpo e o antígeno. Esses resíduos de contato e resíduos vizinhos podem ser dirigidos ou eliminados para possível substituição. Variantes podem ser selecionadas para determinar se elas contêm as propriedades desejadas.
[185] As inserções de sequências de aminoácidos incluem fusões de terminais carboxila e/ou amino que variam de comprimento de um resíduo até polipeptídeos que contêm cem ou mais resíduos, bem como inserções intrassequenciais de resíduos de aminoácidos isolados ou múltiplos. Exemplos de inserções terminais incluem um anticorpo com resíduo de metionila N-terminal. Outras variantes de inserção da molécula de anticorpo incluem a fusão ao terminal N ou C do anticorpo a uma enzima (por exemplo, para ADEPT) ou polipeptídeo que aumente a meia vida do anticorpo em soro.
2. VARIANTES DE GLICOSILAÇÃO
[186] Em certas realizações, um anticorpo fornecido no presente é alterado para aumentar ou reduzir a extensão de glicosilação do anticorpo. A adição ou deleção de locais de glicosilação para um anticorpo pode ser convenientemente realizada por meio da alteração da sequência de aminoácidos, de tal forma que seja criado ou removido um ou mais locais de glicosilação.
[187] Quando o anticorpo compreender uma região Fc, o carboidrato a ele ligado pode ser alterado. Os anticorpos nativos produzidos por células de mamíferos compreendem tipicamente um oligossacarídeo biantenário ramificado que geralmente é ligado por uma ligação N a Asn297 do domínio CH2 da região Fc. Vide, por exemplo, Wright et al., TIBTECH 15: 26-32 (1997). O oligossacarídeo pode incluir vários carboidratos, tais como manose, N-acetil glucosamina (GlcNAc), galactose e ácido siálico, bem como uma fucose ligada a um GlcNAc na “haste” da estrutura de oligossacarídeo biantenária. Em algumas realizações, podem ser elaboradas modificações do oligossacarídeo em um anticorpo de acordo com a presente invenção, a fim de criar variantes de anticorpos com certas propriedades aprimoradas.
[188] Em uma realização, são fornecidas variantes de anticorpos que possuem uma estrutura de carboidrato que não contém fucose ligada (direta ou indiretamente) a uma região Fc. A quantidade de fucose nesse anticorpo pode ser de 1% a 80%, de 1% a 65%, de 5% a 65% ou de 20% a 40%. A quantidade de fucose é determinada por meio do cálculo da quantidade média de fucose na cadeia de açúcar em Asn297, com relação à soma de todas as glicoestruturas ligadas a Asn 297 (tais como estruturas com alto teor de manose híbridas e complexas) conforme medido por meio de espectrometria de massa MALDI-TOF, conforme descrito, por exemplo, em WO 2008/077546. Asn297 designa o resíduo de asparagina localizado próximo da posição 297 na região Fc (numeração Eu de resíduos de região Fc); Asn297 pode também estar localizado, por exemplo, a cerca de três aminoácidos acima ou abaixo no fluxo da posição 297, ou seja, entre as posições 294 e 300, devido a variações menores de sequências de anticorpos. Essas variantes de fucosilação podem possuir função ADCC aprimorada. Vide, por exemplo as Patentes Norte-Americanas publicadas n° US 2003/0157108 (Presta, L.); US 2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd). Exemplos de publicações relativas a variantes de anticorpos “desfucosilados” ou “com deficiência de fucose” incluem: US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO 2005/053742; WO 2002/031140; Okazaki et al., J. Mol. Biol. 336: 1239-1249 (2004); e Yamane-Ohnuki et al., Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004). Exemplos de linhagens celulares capazes de produzir anticorpos defucosilados incluem células CHO Lec13 com deficiência na fucosilação de proteínas (Ripka et al., Arch. Biochem. Biophys. 249: 533-545 (1986); Pedido de Patente Norte- Americano n° US 2003/0157108 A1, Presta, L.; e WO 2004/056312 A1, Adams et al., especialmente no Exemplo 11) e linhagens de células knockout, tais como gene alfa-1,6-fucosiltransferase, FUT8, células CHO knockout (vide, por exemplo, Yamane-Ohnuki et al., Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004); Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng., 94 (4): 680-688 (2006); e WO 2003/085107).
[189] Variantes de anticorpos possuem adicionalmente oligossacarídeos bisseccionados, tais como em que um oligossacarídeo biantenário ligado à região Fc do anticorpo é bisseccionado por GlcNAc. Essas variantes de anticorpos podem possuir fucosilação reduzida e/ou função de ADCC aprimorada. Exemplos dessas variantes de anticorpos são descritos, por exemplo, em WO 2003/011878 (Jean-Mairet et al.); Patente Norte-Americana n° 6.602.684 (Umana et al.); e US 2005/0123546 (Umana et al.). Também são fornecidas variantes de anticorpos com pelo menos um resíduo de galactose no oligossacarídeo ligado à região Fc. Essas variantes de anticorpos podem possuir função CDC aprimorada. Essas variantes de anticorpos são descritas, por exemplo, em WO 1997/30087 (Patel et al.); WO 1998/58964 (Raju, S.); e WO 1999/22764 (Raju, S.).
3. VARIANTES DE REGIÃO FC:
[190] Em certas realizações, uma ou mais modificações de aminoácidos podem ser introduzidas na região Fc de um anticorpo fornecido no presente, de forma a gerar um variante da região Fc e assim aumentar, por exemplo, a eficácia do anticorpo no tratamento de uma doença ou distúrbio que envolve angiogênese anormal e/ou permeabilidade ou vazamento vascular. A variante de região Fc pode compreender uma sequência de região Fc humana (tal como região Fc de IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4 humana) que compreende uma modificação de aminoácidos (tal como substituição) em uma ou mais posições de aminoácidos.
[191] Em certas realizações, a presente invenção contempla uma variante de anticorpo que possui algumas mas não todas as funções efetoras, o que o torna candidato desejável para aplicações nas quais a meia vida do anticorpo in vivo é importante, mas certas funções efetoras (tais como complemento e ADCC) são desnecessárias ou prejudiciais. Testes de citotoxicidade in vitro e/ou in vivo podem ser conduzidos para confirmar a redução/esgotamento das atividades de CDC e/ou ADCC. Testes de ligação de receptores Fc (FcR), por exemplo, podem ser conduzidos para garantir que o anticorpo não apresente ligação de FcyR (portanto, propenso a não apresentar atividade de ADCC), mas retenha a capacidade de ligação de FcRn. As células primárias para a mediação de ADCC, células NK, expressam unicamente FCYRIII, enquanto monócitos expressam FCYRI, FCYRII e FCYRIII. A expressão de FcR sobre células hematopoiéticas é resumida na Tabela 3 da página 464 de Ravetch e Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9: 457-492 (1991). Exemplos sem limitação de testes in vitro para determinar a atividade de ADCC de uma molécula de interesse são descritos na Patente Norte-Americana n° 5.500.362 (vide também Hellstrom, I. et al., PNAS USA 83: 7059-7063 (1986)) e Hellstrom, I. et al., PNAS USA 82: 1499-1502 (1985); 5.821.337 (vide Bruggemann, M. et al., J. Exp. Med. 166: 1351-1361 (1987)). Alternativamente, podem ser empregados métodos de teste não radioativos (vide, por exemplo, teste de citotoxicidade não radioativo para citometria de fluxo (Cell Technology, Inc. Mountain View, CA; e teste de citotoxicidade não radioativo CytoTox 96® (Promega, Madison, WI). Células efetoras úteis para esses testes incluem células mononucleares sanguíneas periféricas (PBMC) e células Matadoras Naturais (NK). Alternativa ou adicionalmente, a atividade de ADCC da molécula de interesse pode ser determinada in vivo, tal como em modelo animal como o descrito em Clynes et al., PNAS U. S. A. 95: 652-656 (1998). Testes de ligação de C1q podem também ser conduzidos para confirmar que o anticorpo é incapaz de ligar e, desta forma, não apresenta atividade de CDC. Vide, por exemplo, ELISA de ligação de C1q e C3c em WO 2006/029879 e WO 2005/100402. Para determinar a ativação do complemento, pode ser realizado teste de CDC (vide, por exemplo, Gazzano- Santoro et al., J. Immunol. Methods 202: 163 (1996); Cragg, M. S. et al., Blood 101: 1045-1052 (2003); e Cragg, M. S. e M. J. Glennie, Blood 103: 2738-2743 (2004)). Determinações de meia vida/liberação in vivo e ligação de FcRn podem também ser realizadas utilizando métodos conhecidos na técnica (vide, por exemplo, Petkova, S. B. et al., Int’l Immunol. 18 (12): 1759-1769 (2006)).
[192] Anticorpos com função efetora reduzida incluem aqueles com substituição de um ou mais dos resíduos da região Fc 238, 265, 269, 270, 297, 327 e 329 (Patente Norte-Americana n° 6.737.056). Esses mutantes de Fc incluem mutantes de Fc com substituições em duas ou mais das posições de aminoácidos 265, 269, 270, 297 e 327, incluindo a chamada mutante Fc “DANA” com substituição dos resíduos 265 e 297 por alanina (Patente Norte-Americana n° 7,332,581).
[193] São descritas certas variantes de anticorpos com maior ou menor ligação a FcRs (vide, por exemplo, a Patente Norte-Americana n° 6.737.056; WO 2004/056312 e Shields et al., J. Biol. Chem. 9 (2): 6591-6604 (2001)).
[194] Em certas realizações, uma variante de anticorpo compreende uma região Fc com uma ou mais substituições de aminoácidos que aumentam ADCC, tais como substituições nas posições 298, 333 e/ou 334 da região Fc (numeração de resíduos EU).
[195] Em algumas realizações, são realizadas alterações na região Fc que resultam em ligação de C1q e/ou Citotoxicidade Dependente de Complemento (CDC) alterada (ou seja, aumentada ou reduzida) , conforme descrito, por exemplo, na Patente Norte-Americana n° 6.194.551, WO 99/51642 e Idusogie et al., J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000).
[196] Mutações ou alterações nas sequências de região Fc podem ser elaboradas para aumentar a ligação de FcR (tal como FcgamaR, FcRn). Segundo uma realização, um anticorpo de acordo com a presente invenção possui pelo menos uma função efetora alterada selecionada a partir do grupo que consiste em ADCC, CDC e ligação de FcRn aprimorada em comparação com um IgG nativo ou um anticorpo parental. Exemplos de várias mutações específicas úteis são descritos, por exemplo, em Shields, R. L. et al. (2001), JBC 276 (6) 6591-6604; Presta, L. G. (2002), Biochemical Society Transactions 30 (4): 487-490; e WO 00/42072. Anticorpos com maiores meias vidas e ligação aprimorada ao receptor Fc neonatal (FcRn), que é responsável pela transferência de IgGs maternos para o feto (Guyer et al., J. Immunol. 117: 587 (1976) e Kim et al., J. Immunol. 24: 249 (1994)), são descritos em US 2005/0014934A1 (Hinton et al.). Estes anticorpos compreendem uma região Fc com uma ou mais substituições que aumentam a ligação da região Fc a FcRn. Essas variantes de Fc incluem aquelas com substituições em um ou mais dos resíduos da região Fc: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 ou 434, tal como substituição do resíduo da região Fc 434 (Patente Norte-Americana n° 7.371.826).
[197] Vide também Duncan & Winter, Nature 322: 738-40 (1988); Patente Norte-Americana n° 5.648.260; Patente Norte-Americana n° 5.624.821; e WO 94/29351 com referência a outros exemplos de variantes de região Fc.
4. VARIANTES DE ANTICORPOS ELABORADOS COM CISTEÍNAS
[198] Em certas realizações, pode ser desejável criar anticorpos elaborados com cisteínas, tais como “tioMAbs”, em que um ou mais resíduos de um anticorpo são substituídos por resíduos de cisteína. Em realizações específicas, os resíduos substituídos ocorrem em locais acessíveis do anticorpo. Substituindo esses resíduos por cisteína, grupos tiol reativos são posicionados, portanto, em locais acessíveis do anticorpo e podem ser utilizados para conjugar o anticorpo a outras porções, tais como porções de drogas ou porções de droga e ligante, para criar um imunoconjugado, conforme descrito adicionalmente no presente. Em certas realizações, qualquer um ou mais dos resíduos a seguir podem ser substituídos por cisteína: V205 (numeração de Kabat) da cadeia leve; A118 (numeração EU) da cadeia pesada; e S400 (numeração EU) da região Fc de cadeia pesada. Anticorpos elaborados com cisteína podem ser gerados conforme descrito, por exemplo, na Patente Norte-Americana n° 7.521.541.
[199] Em algumas realizações, resíduo(s) de cisteína pode(m) ser introduzido(s) na região Fc, de forma a permitir a formação de ligações de dissulfeto intercadeias nessa região. O anticorpo homodimérico gerado desta forma pode possuir capacidade de internalização aprimorada e/ou morte celular mediada por complemento aprimorada e citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC). Vide Caron et al., J. Exp. Med., 176: 1191-1195 (1992) e Shopes, J. Immunol., 148: 2918-2922 (1992). Anticorpos homodiméricos com atividade antitumoral aprimorada podem também ser preparados utilizando reticulantes heterobifuncionais, conforme descrito em Wolff et al., Cancer Research, 53: 2560-2565 (1993). Alternativamente, pode ser construído um anticorpo que possui regiões Fc duplas e pode, portanto, apresentar capacidades de ADCC e lise de complemento aprimoradas. Vide Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design 3: 219-230 (1989).
5. DERIVADOS DE ANTICORPOS
[200] Em certas realizações, um anticorpo fornecido no presente pode ser adicionalmente modificado para que contenha porções não proteináceas adicionais que são conhecidas na técnica e facilmente disponíveis. As porções apropriadas para derivação do anticorpo incluem, mas sem limitações, polímeros hidrossolúveis. Exemplos não limitadores de polímeros hidrossolúveis incluem, mas sem limitações, polietileno glicol (PEG), copolímeros de etileno glicol e propileno glicol, carboximetilcelulose, dextran, álcool polivinílico, polivinil pirrolidona, poli-1,3-dioxolano, poli-1,3,6-trioxano, copolímero de etileno e anidrido maleico, poliaminoácidos (homopolímeros ou copolímeros aleatórios) e dextran ou poli(n-vinil pirrolidona) polietileno glicol, homopolímeros de propropileno glicol, copolímeros de óxido de polipropileno e óxido de etileno, polióis polioxietilados (tais como glicerol), álcool polivinílico e suas misturas. Propionaldeído de polietileno glicol pode apresentar vantagens de fabricação devido à sua estabilidade em água. O polímero pode ser de qualquer peso molecular e pode ser ramificado ou não ramificado. A quantidade de polímeros ligados ao anticorpo pode variar e, caso mais de um polímero seja ligado, eles podem ser moléculas idênticas ou diferentes. Geralmente, a quantidade e/ou o tipo de polímeros utilizados para derivação podem ser determinados com base em considerações que incluem, mas sem limitações, as propriedades ou funções específicas do anticorpo a ser aprimorado, se o derivado de anticorpo será utilizado em terapia sob condições definidas, etc.
[201] Em uma outra realização, são fornecidos conjugados de um anticorpo e porção não proteinácea que podem ser seletivamente aquecidos por meio de exposição à radiação. Em uma realização, a porção não proteinácea é um nanotubo de carbono (Kam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102: 1160011605 (2005)). A radiação pode ser de qualquer comprimento de onda e inclui, mas sem limitações, comprimentos de onda que não prejudicam células comuns, mas que aquecem a porção não proteinácea até uma temperatura na qual células próximas à porção não proteinácea de anticorpos são mortas.
G. IMUNOCONJUGADOS
[202] A presente invenção também fornece imunoconjugados que compreendem um anticorpo anti-α5β1 do presente conjugado a um ou mais agentes citotóxicos, tais como agentes quimioterápicos ou drogas, agentes inibidores do crescimento, toxinas (tais como toxinas de proteínas, toxinas enzimaticamente ativas de origem bacteriana, fúngica, vegetal ou animal, ou seus fragmentos) ou isótopos radioativos.
[203] Em uma realização, um imunoconjugado é um conjugado de droga e anticorpo (ADC) no qual um anticorpo é conjugado a uma ou mais drogas, que incluem, mas sem limitações, um maitansinoide (vide as Patentes Norte- Americanas n° 5.208.020, 5.416.064 e Patente Europeia n° EP 0.425.235 B1); uma auristatina tal como as porções de droga monometilauristatina DE e DF (MMAE e MMAF) (vide as Patentes Norte-Americanas n° 5.635.483, 5.780.588 e 7.498.298); dolastatina; uma caliqueamicina ou seu derivado (vide as Patentes Norte-Americanas n° 5.712.374, 5.714.586, 5.739.116, 5.767.285, 5.770.701, 5.770.710, 5.773.001 e 5.877.296; Hinman et al., Cancer Res. 53: 3336-3342 (1993); e Lode et al., Cancer Res. 58: 2925-2928 (1998)); uma antraciclina tal como daunomicina ou doxorubicina (vide Kratz et al., Current Med. Chem. 13: 477-523 (2006); Jeffrey et al., Bioorganic & Med. Chem. Letters 16: 358-362 (2006); Torgov et al., Bioconj. Chem. 16: 717-721 (2005); Nagy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97: 829-834 (2000); Dubowchik et al., Bioorg. & Med. Chem. Letters 12: 1529-1532 (2002); King et al., J. Med. Chem. 45: 4336-4343 (2002); e Patente Norte-Americana n° 6.630.579); metotrexato; vindesina; um taxano tal como docetaxel, paclitaxel, larotaxel, tesetaxel e ortataxel; tricoteceno; e CC1065.
[204] Em uma realização, um imunoconjugado compreende um anticorpo conforme descrito no presente conjugado a uma toxina enzimaticamente ativa ou seu fragmento, incluindo, mas sem limitações, cadeia de difteria A, fragmentos ativos não de ligação de toxina de difteria, cadeia de exotoxina A (de Pseudomonas aeruginosa), cadeia ricina A, cadeia de abrina A, cadeia modeccina A, alfassarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII e PAP-S), inibidor de Momordica charantia, curcina, crotina, inibidor de Sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina e os tricotecenos.
[205] Em uma outra realização, um imunoconjugado compreende um anticorpo conforme descrito no presente, conjugado a um átomo radioativo para formar um radioconjugado. Uma série de isótopos radioativos é disponível para a produção de radioconjugados. Exemplos incluem At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 e isótopos radioativos de Lu. Quando o conjugado for utilizado para detecção, ele pode compreender um átomo radioativo para estudos cintilográficos, tal como tc99m ou I123, ou marca de centrifugação para formação de imagens por meio de ressonância magnética nuclear (NMR) (também conhecida como formação de imagens por ressonância magnética, MRI), tal como novamente iodo-123, iodo-131, índio-111, flúor-19, carbono-13, nitrogênio-15, oxigênio-17, gadolínio, manganês ou ferro.
[206] Os conjugados de um anticorpo e agente citotóxico podem ser fabricados utilizando uma série de agentes acopladores de proteínas bifuncionais, tais como propionato de N-succinimidil-3-(2-piridilditiol) (SPDP), ciclo-hexano-1-carboxilato de succinimidil-4-(N-maleimidometila) (SMCC), iminotiolano (IT), derivados bifuncionais de imidoésteres (tais como adipimidato de dimetila HCl), ésteres ativos (tais como suberato de dissuccinimidila), aldeídos (tais como glutaraldeído), compostos bisazido (tais como bis(p- azidobenzoil) hexanodiamina), derivados de bisdiazônio (tais como bis-(p- diazoniobenzoil)-etilenodiamina), di-isocianatos (tais como 2,6-di-isocianato de tolueno) e compostos de flúor bisativo (tais como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzeno). Pode-se preparar, por exemplo, imunotoxina ricina, conforme descrito em Vitetta et al., Science, 238: 1098 (1987). Ácido 1-isotiocianatobenzil-3-metildietileno triaminopenta-acético marcado com carbono 14 (MX-DTPA) é um exemplo de agente quelante para conjugação de radionucleto ao anticorpo. Vide WO 94/11026. O ligante pode ser uma “ligação divisível” que possibilita a liberação de uma droga citotóxica na célula. Pode-se utilizar, por exemplo, um ligante instável ácido, ligante sensível à peptidase, ligante fotoinstável, ligante de dimetila ou ligante contendo dissulfeto (Chari et al., Cancer Res. 52: 127-131 (1992); Patente Norte-Americana n° 5.208.020).
[207] Os imunoconjugados ou ADCs contemplam expressamente no presente, mas sem limitações, os conjugados preparados com reagentes reticulantes, que incluem, mas sem limitações, BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, sulfo-EMCS, sulfo-GMBS, sulfo-KMUS, sulfo-MBS, sulfo-SIAB, sulfo-SMCC, sulfo-SMPB e SVSB (benzoato de succinimidil-(4-vinilsulfona)) que são disponíveis comercialmente (tal como por meio da Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL, E. U. A.).
H. IMUNOLIPOSSOMOS
[208] Os anticorpos descritos no presente podem também ser formulados como imunolipossomos. Os lipossomos que contêm o anticorpo são preparados por meio de métodos conhecidos na técnica, conforme descrito em Epstein et al., PNAS USA, 82: 3688 (1985); Hwang et al., PNAS USA, 77: 4030 (1980); e Patentes Norte-Americanas n° 4.485.045 e 4.544.545. Lipossomos com maior tempo de circulação são descritos na Patente Norte-Americana n° 5.013.556.
[209] Lipossomos particularmente úteis podem ser gerados por meio do método de evaporação de fase reversa com uma composição de lipídios que compreende fosfatidilcolina, colesterol e fosfatidiletanolamina derivada de PEG (PEG-PE). Os lipossomos são extrudados por meio de filtros com tamanho de poro definido para gerar lipossomos com o diâmetro desejado. Os fragmentos de Fab’ do anticorpo de acordo com a presente invenção podem ser conjugados aos lipossomos descritos em Martin et al., J. Biol. Chem., 257: 286-288 (1982) por meio de uma reação de intercâmbio de dissulfetos. Um agente antineoplásico, um agente inibidor de crescimento ou um agente quimioterápico (tal como doxorubicina) também está opcionalmente contido no lipossomo. Vide Gabizon et al., J. National Cancer Inst. 81 (19): 1484 (1989). IV. MÉTODOS TERAPÊUTICOS UTILIZANDO ANTICORPOS ANTI-A5B1
[210] Qualquer um dos anticorpos anti-α5β1 fornecidos no presente pode ser utilizado em métodos terapêuticos. Compreende-se que qualquer uma das formulações ou métodos terapêuticos descritos no presente pode utilizar um imunoconjugado de acordo com a presente invenção no lugar ou além de um anticorpo anti-α5β1.
[211] Em um aspecto, é fornecido um anticorpo anti-α5β1 para uso como medicamento. Em aspectos adicionais, é fornecido um anticorpo anti- α5β1 para uso no tratamento de doenças e distúrbios que envolvam angiogênese anormal e/ou permeabilidade ou vazamento vascular, incluindo, por exemplo, câncer, doenças oculares e distúrbios imunológicos (tais como distúrbios autoimunes). Em certas realizações, é fornecido um anticorpo anti- α5β1 para uso em um método de tratamento. Em certas realizações, a presente invenção fornece um anticorpo anti-α5β1 para uso em um método de tratamento de indivíduos portadores de uma doença ou distúrbio que envolva a angiogênese anormal e/ou permeabilidade ou vazamento vascular, que compreende a administração ao indivíduo de uma quantidade eficaz do anticorpo anti-α5β1. Em uma dessas realizações, o método compreende adicionalmente a administração ao indivíduo de uma quantidade eficaz de pelo menos um, dois, três, quatro ou mais agentes terapêuticos adicionais, incluindo, por exemplo, um agente antiangiogênico, um agente antineoplásico, um agente inibidor de crescimento ou um agente quimioterápico conforme descrito no presente. Em realizações adicionais, a presente invenção fornece um anticorpo anti-α5β1 para uso na inibição da angiogênese anormal e/ou permeabilidade ou vazamento vascular. Em certas realizações, a presente invenção fornece um anticorpo anti-α5β1 para uso em um método de inibição da angiogênese anormal e/ou permeabilidade ou vazamento vascular em um indivíduo que compreende a administração ao indivíduo de uma quantidade eficaz do anticorpo anti-α5β1 para inibir a angiogênese anormal e/ou permeabilidade ou vazamento vascular. Um “indivíduo” de acordo com qualquer das realizações acima é preferencialmente um ser humano.
[212] Em um aspecto adicional, a presente invenção fornece o uso de um anticorpo anti-α5β1 na produção ou preparação de um medicamento. Em uma realização, o medicamento destina-se ao tratamento de uma doença ou distúrbio que envolve a angiogênese anormal e/ou permeabilidade ou vazamento vascular. Em uma realização adicional, o medicamento destina-se a uso em um método de tratamento de uma doença ou distúrbio que envolve a angiogênese anormal e/ou permeabilidade ou vazamento vascular que compreende a administração a um indivíduo portador de uma doença ou distúrbio que envolve a angiogênese anormal e/ou permeabilidade ou vazamento vascular de uma quantidade eficaz do medicamento. Em uma dessas realizações, o método compreende adicionalmente a administração ao indivíduo de uma quantidade eficaz de pelo menos um, dois, três, quatro ou mais agentes terapêuticos adicionais, incluindo, por exemplo, um agente antiangiogênico, um agente antineoplásico, um agente inibidor de crescimento ou um agente quimioterápico conforme descrito no presente. Em uma realização adicional, o medicamento destina-se à inibição da angiogênese anormal e/ou permeabilidade ou vazamento vascular. Em uma realização adicional, o medicamento destina-se a uso em um método de inibição da angiogênese anormal e/ou permeabilidade ou vazamento vascular em um indivíduo que compreende a administração ao indivíduo de uma quantidade eficaz do medicamento para inibir a angiogênese anormal e/ou permeabilidade ou vazamento vascular. Um “indivíduo” de acordo com qualquer das realizações acima pode ser um ser humano.
[213] Em um aspecto adicional, a presente invenção fornece métodos de tratamento de uma doença ou distúrbio que envolve angiogênese anormal e/ou permeabilidade ou vazamento vascular. Em uma realização, o método compreende a administração a um indivíduo portador dessa doença ou distúrbio que envolve a angiogênese anormal e/ou permeabilidade ou vazamento vascular de uma quantidade eficaz de um anticorpo anti-α5β1. Em uma dessas realizações, o método compreende adicionalmente a administração ao indivíduo de uma quantidade eficaz de pelo menos um agente terapêutico adicional, conforme descrito abaixo. Um “indivíduo” de acordo com qualquer das realizações acima pode ser um ser humano.
[214] Em um aspecto adicional, a presente invenção fornece um método de inibição da angiogênese anormal e/ou permeabilidade ou vazamento vascular em um indivíduo. Em uma realização, o método compreende a administração ao indivíduo de uma quantidade eficaz de um anticorpo anti-α5β1 para inibir a angiogênese anormal e/ou permeabilidade ou vazamento vascular. Em uma realização, o “indivíduo” é um ser humano.
[215] Em um aspecto adicional, a presente invenção fornece formulações farmacêuticas que compreendem qualquer um dos anticorpos anti- α5β1 fornecidos no presente, por exemplo, para uso em qualquer um dos métodos terapêuticos acima. Em uma realização, uma formulação farmacêutica compreende qualquer um dos anticorpos anti-α5β1 fornecidos no presente e um veículo farmaceuticamente aceitável. Em uma outra realização, uma formulação farmacêutica compreende qualquer um dos anticorpos anti-α5β1 fornecidos no presente e pelo menos um agente terapêutico adicional, tal como conforme descrito no presente.
[216] As terapias de combinação descritas no presente incluem administração combinada (em que dois, três, quatro ou mais agentes terapêuticos são incluídos na mesma formulação ou em formulações separadas) e administração separada, caso em que a administração do agente pode ocorrer antes, simultaneamente e/ou depois da administração do agente terapêutico e/ou adjuvante adicional. Os anticorpos de acordo com a presente invenção podem também ser utilizados em combinação com terapia de radiação.
[217] Em certas realizações, um agente terapêutico adicional é um antagonista de VEGF (tal como um anticorpo anti-VEGF, como bevacizumab). Em algumas realizações, os anticorpos anti-α5β1 são administrados em combinação com um antagonista de VEGF. O anticorpo anti-α5β1 e agente adicional (tal como um antagonista de VEGF) podem ser adicionados simultânea ou sequencialmente. Alternativamente, o paciente pode ser tratado com o antagonista de VEGF e receber em seguida administração do antagonista de α5β1, tal como tratamento com o antagonista de VEGF até que o paciente não mais reaja a tratamento com antagonista VEGF e, em seguida, o paciente é tratado com um antagonista de α5β1. Segundo uma realização, o paciente é tratado com o antagonista de VEGF quando o câncer é não invasivo e é tratado em seguida com o antagonista de α5β1 quando o câncer é invasivo. Alguns pacientes que experimentam níveis elevados de α5β1 naturalmente ou em resposta a terapia com antagonista de VEGF, em comparação com pacientes não doentes ou controle, podem reagir especialmente a esse tratamento de combinação. São contempladas combinações que compreendem adicionalmente um agente terapêutico (tal como um agente antineoplásico, um agente quimioterápico, um agente inibidor de crescimento e um agente citotóxico). Pacientes que estão por serem tratados com quimioterapia (tal como irinotecan) e antagonistas de α5β1, ou que tenham sido tratados com quimioterapia e antagonistas de α5β1, por exemplo, podem beneficiar-se da terapia com antagonista de VEGF. Alternativamente, pacientes que tenham sido tratados com quimioterapia e antagonistas de VEGF podem beneficiar-se da terapia com antagonista de α5β1. Em uma realização, o anticorpo anti-VEGF é bevacizumab. Em outra realização, o anticorpo anti-α5β1 é um anticorpo anti- α5β1 descrito no presente.
[218] Um anticorpo de acordo com a presente invenção (e qualquer agente terapêutico adicional) pode ser administrado por qualquer meio apropriado, que inclui parenteral, intrapulmonar e intranasal e, se desejado para tratamento local, administração intralesional. As infusões parenterais incluem administração intramuscular, intravenosa, intra-arterial, intraperitoneal ou subcutânea. A dosagem pode ser fornecida por qualquer via apropriada, tal como por meio de injeções, tais como injeções intravenosas ou subcutâneas, dependendo, em parte, de se a administração é rápida ou crônica. São contemplados no presente diversos cronogramas de dosagem, que incluem, mas sem limitações, administrações isoladas ou múltiplas ao longo de diversos momentos, administração de mistura e infusão de pulso.
[219] Os anticorpos de acordo com a presente invenção serão formulados, dosados e administrados de forma consistente com a boa prática médica. Fatores para consideração neste contexto incluem o distúrbio específico sendo tratado, o mamífero específico sendo tratado, a condição clínica do paciente individual, a causa do distúrbio, o local de fornecimento do agente, o método de administração, o cronograma de administração e outros fatores conhecidos dos praticantes da medicina. O anticorpo não necessita ser, mas é opcionalmente formulado com um ou mais agentes atualmente utilizados para evitar ou tratar o distúrbio em questão. A quantidade eficaz desses outros agentes depende da quantidade de anticorpo presente na formulação, do tipo de distúrbio ou tratamento e de outros fatores discutidos acima. Estes são geralmente utilizados nas mesmas dosagens e com vias de administração conforme descrito no presente ou cerca de 1 a 99% das dosagens descritas no presente ou em qualquer dosagem e por meio de qualquer processo que seja determinado empírica ou clinicamente como sendo apropriado.
[220] Para a prevenção ou tratamento de doença, a dosagem apropriada de um anticorpo de acordo com a presente invenção (quando utilizado isoladamente ou em combinação com um ou mais agentes tais como agentes quimioterápico) dependerá do tipo de doença a ser tratado, do tipo de anticorpo, da severidade e do curso da doença, se o anticorpo é administrado para propósitos preventivos ou terapêuticos, terapia anterior, histórico clínico do paciente e reação ao anticorpo e do critério do médico atendente. O anticorpo é administrado adequadamente ao paciente em uma vez ou ao longo de uma série de tratamentos. Dependendo do tipo e da severidade da doença, cerca de 1 μg/kg a 15 mg/kg (tal como 0,1 mg/kg a 10 mg/kg) de anticorpo pode ser uma possível dose inicial para administração ao paciente, seja, por exemplo, por meio de uma ou mais administrações separadas ou por meio de infusão contínua. Dosagem diária típica poderá variar de cerca de 1 μg/kg a 100 mg/kg ou mais, dependendo dos fatores mencionados acima. Para administrações repetidas ao longo de vários dias ou mais, dependendo da condição, o tratamento seria geralmente mantido até que ocorra uma supressão desejada de sintomas da doença. Um exemplo de dosagem do anticorpo estaria na faixa de cerca de 0,05 mg/kg a cerca de 10 mg/kg. Desta forma, uma ou mais doses de cerca de 0,5 mg/kg, 2,0 mg/kg, 4,0 mg/kg ou 10 mg/kg (ou qualquer de suas combinações) podem ser administradas ao paciente. Essas doses podem ser administradas intermitentemente, tal como semanalmente ou a cada três semanas (por exemplo, de tal forma que o paciente receba cerca de duas a cerca de vinte, tal como cerca de seis doses do anticorpo). Pode-se administrar uma dose de carregamento mais alta inicial, seguida por uma ou mais doses mais baixas. Entretanto, outros regimes de dosagem podem ser úteis. O progresso desta terapia é facilmente monitorado por meio de técnicas e testes convencionais.
[221] Dependendo da indicação a ser tratada e dos fatores relevantes à dosagem com que os médicos com conhecimento no campo estariam familiares, os anticorpos de acordo com a presente invenção serão administrados em uma dosagem que seja eficaz para o tratamento daquela indicação, ao mesmo em tempo que minimizam a toxicidade e os efeitos colaterais.
[222] Os tratamentos de câncer podem ser avaliados, por exemplo, mas sem limitações, regressão de tumores, peso do tumor ou contração de tamanho, tempo para o progresso, duração de sobrevivência, sobrevivência livre de progresso, velocidade de reação geral, duração da reação, qualidade de vida, expressão de proteína e/ou atividade. Como os agentes antiangiogênicos descritos no presente dirigem-se à vasculatura do tumor e, não necessariamente, às próprias células neoplásticas, eles representam uma classe exclusiva de drogas anticancerígenas e, portanto, podem necessitar de medidas exclusivas e definições de reações clínicas a drogas. Contração de tumor de mais de 50% em uma análise bidimensional, por exemplo, é a linha de corte padrão para a declaração de uma reação. Os antagonistas de α5β1 e antagonistas de VEGF de acordo com a presente invenção, entretanto, podem causar inibição da difusão metastática sem a contração do tumor primário, ou podem simplesmente exercer um efeito tumoristático. Consequentemente, podem ser empregadas abordagens de determinação da eficácia da terapia, que incluem, por exemplo, medição de plasma ou marcadores urinários de angiogênese e medição de reação por meio de formação de imagens radiológicas.
[223] A avaliação de tratamentos para degeneração macular relacionada à idade (AMD) inclui, mas sem limitações, redução da velocidade de perda de visão adicional ou prevenção de perda de visão adicional. Para terapia de AMD, a eficácia in vivo pode ser medida, por exemplo, por meio de um ou mais dos seguintes: determinação da alteração média da melhor acuidade visual corrigida (BCVA) com relação à linha base até um tempo desejado, determinação da proporção de pacientes que perdem menos de quinze letras de acuidade visual em um tempo desejado em comparação com a linha base, determinação da proporção de pacientes que ganham acuidade visual maior ou igual a quinze letras em um tempo desejado em comparação com a linha base, determinação da proporção de pacientes com equivalente Snellen de acuidade visual de 20/2000 ou pior em um tempo desejado, determinação do Questionário de Funcionamento Visual NEI, determinação do tamanho de CNV e quantidade de vazamento de CNV em um tempo desejado, conforme determinado por meio de angiografia de fluoresceína etc.
V. FORMULAÇÕES FARMACÊUTICAS
[224] Os anticorpos anti-α5β1 podem ser formulados com veículos ou excipientes apropriados, de forma que sejam adequados para administração. Formulações apropriadas dos anticorpos são obtidas por meio de mistura de um anticorpo que apresente o grau desejado de pureza com veículos, excipientes ou estabilizantes farmaceuticamente aceitáveis opcionais (Remington's Pharmaceutical Sciences, 16a edição, Osol, A. Ed. (1980)), na forma de formulações liofilizadas ou soluções aquosas. Veículos, excipientes ou estabilizantes aceitáveis são atóxicos para pacientes nas dosagens e concentrações empregadas e incluem tampões tais como fosfato, citrato e outros ácidos orgânicos; antioxidantes, incluindo ácido ascórbico e metionina; conservantes (tais como cloreto de octadecildimetilbenzil amônio; cloreto de hexametônio; cloreto de benzalcônio, cloreto de benzetônio; fenol; álcool butílico ou benzílico; alquil parabenos, tais como metil ou propil parabeno; catecol; resorcinol; ciclo-hexanol; 3-pentanol; e m-cresol); polipeptídeos com baixo peso molecular (menos de cerca de dez resíduos); proteínas, tais como albumina de soro, gelatina ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos tais como polivinilpirrolidona; aminoácidos tais como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina ou lisina; monossacarídeos, dissacarídeos e outros carboidratos que incluem glicose, manose ou dextrinas; agentes quelantes tais como EDTA; açúcares, tais como sacarose, manitol, tre-halose ou sorbitol; contraíons formadores de sais tais como sódio; complexos metálicos (tais como complexos de Zn e proteína); e/ou tensoativos não iônicos, tais como TWEEN®, PLURONICS® ou polietileno glicol (PEG). Exemplos de formulações de anticorpos são descritos em WO 98/56418, expressamente incorporada ao presente como referência. Exemplos de veículos farmaceuticamente aceitáveis no presente incluem ainda agentes de dispersão de drogas intersticiais tais como glicoproteínas de hialuronidase ativas neutras (sHASEGP), tais como glicoproteínas de hialuronidase PH-20 solúveis humanas, como rHuPH20 (HYLENEX®, Bayer International, Inc.). Certos exemplos de sHASEGPs e métodos de uso, incluindo rHuPH20, são descritos nas Patentes Norte- Americanas publicadas n° 2005/0260186 e 2006/0104968. Em um aspecto, um sHASEGP é combinado com uma ou mais glicosaminoglicanases adicionais, tais como condroitinases. Formulações liofilizadas adaptadas para administração subcutânea são descritas em WO 97/04801. Essas formulações liofilizadas podem ser reconstituídas com um diluente apropriado até alta concentração de proteína e a formulação reconstituída pode ser administrada por via subcutânea ao mamífero a ser tratado no presente.
[225] A formulação do presente pode também conter mais de um composto ativo conforme o necessário para a indicação específica sendo tratada, preferencialmente aqueles com atividades complementares que não se prejudiquem entre si. Pode ser desejável, por exemplo, fornecer adicionalmente um agente antineoplásico, um agente inibidor de crescimento, um agente citotóxico e/ou um agente quimioterápico. Essas moléculas encontram-se adequadamente presentes em combinação, em quantidades que são eficazes para o propósito pretendido. A quantidade eficaz desses outros agentes depende da quantidade de anticorpo presente na formulação, do tipo de doença ou distúrbio ou tratamento e de outros fatores discutidos acima. Estes são geralmente utilizados nas mesmas dosagens e com vias de administração conforme descrito no presente ou cerca de 1 a 99% das dosagens empregadas até aqui.
[226] Os ingredientes ativos podem também ser capturados em microcápsulas preparadas, por exemplo, por métodos de aglutinação ou por polimerização interfacial, tais como microcápsulas de hidroximetilcelulose ou gelatina e microcápsulas de poli(metilmetacrilato), respectivamente, em sistemas de fornecimento de drogas coloidais (tais como lipossomos, microesferas de albumina, microemulsões, nanopartículas e nanocápsulas) ou em macroemulsões. Estas técnicas são descritas em Remington's Pharmaceutical Sciences, 16a edição, Osol, A. Ed. (1980).
[227] Podem ser fabricadas preparações de liberação prolongada. Exemplos apropriados de preparações de liberação prolongada incluem matrizes semipermeáveis de polímeros hidrofóbicos sólidos que contêm o antagonista, matrizes estas que se encontram na forma de artigos moldados, tais como filmes ou microcápsulas. Exemplos de matrizes com liberação prolongada incluem poliésteres, hidrogéis (tais como poli(2-hidroxietilmetacrilato) ou álcool (poli)vinílico, polilactidas (Patente Norte-Americana n° 3.773.919), copolímeros de ácido L-glutâmico e L-glutamato de Y—etila, etileno-vinil acetato não degradável, copolímeros de ácido láctico e ácido glicólico degradáveis tais como LUPRON DEPOT® (microesferas injetáveis compostas de copolímero de ácido láctico e ácido glicólico e acetato de leuprolida) e ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico.
[228] Lipofectinas ou lipossomos podem ser utilizados para fornecer os polipeptídeos e anticorpos ou composições de acordo com a presente invenção para células. Ao utilizar-se fragmentos de anticorpos, prefere- se o menor fragmento inibidor que se liga especificamente ao domínio de ligação da proteína alvo. Com base nas sequências de região variável de um anticorpo, por exemplo, podem ser projetadas moléculas de peptídeos que retenham a capacidade de ligação da sequência de proteínas alvo. Esses peptídeos podem ser sintetizados quimicamente e/ou produzidos por meio de tecnologia de DNA recombinante. Vide, por exemplo, Marasco et al., PNAS USA, 90: 7889-7893 (1993).
[229] Os ingredientes ativos podem também ser capturados em microcápsulas preparadas, por exemplo, por meio de técnicas de acumulação ou polimerização interfacial (por exemplo, microcápsulas de hidroximetilcelulose ou gelatina e microcápsulas de poli(metilmetacrilato), respectivamente) em sistemas de fornecimento de drogas coloidais (por exemplo, lipossomos, microesferas de albumina, microemulsões, nanopartículas e nanocápsulas), ou em macroemulsões. Estas técnicas são descritas em Remington’s Pharmaceutical Sciences, acima.
[230] Podem ser fabricadas preparações de liberação prolongada. Exemplos apropriados de preparações de liberação prolongada incluem matrizes semipermeáveis de polímeros hidrofóbicos sólidos que contenham o anticorpo, que se encontram na forma de artigos moldados, tais como filmes ou microcápsulas. Exemplos de matrizes com liberação prolongada incluem poliésteres, hidrogéis (tais como poli(2-hidroxietilmetacrilato) ou álcool (poli)vinílico, polilactidas (Patente Norte-Americana n° 3.773.919), copolímeros de ácido L-glutâmico e L-glutamato de Y-etila, etileno vinil acetato não degradável, copolímeros degradáveis de ácido láctico e ácido glicólico, tais como LUPRON DEPOT® (microesferas injetáveis compostas de copolímero de ácido láctico e ácido glicólico e acetato de leuprolida) e ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico. Embora polímeros tais como etileno-vinil acetato e ácido láctico-ácido glicólico permitam a liberação de moléculas por mais de cem dias, certos hidrogéis liberam proteínas por períodos de tempo mais curtos. Quando anticorpos encapsulados permanecerem no corpo por um longo período, eles podem desnaturar-se ou agregar-se como resultado da exposição à umidade a 37 °C, o que resulta em perda da atividade biológica e possíveis alterações da imunogenicidade. Estratégias racionais podem ser idealizadas para estabilização, dependendo do mecanismo envolvido. Caso se descubra, por exemplo, que o mecanismo de agregação é a formação de ligação S-S intermolecular por meio de intercâmbio de tiodissulfeto, pode-se atingir a estabilização por meio da modificação de resíduos sulfidrila, liofilização a partir de soluções ácidas, controle do teor de umidade, uso de aditivos apropriados e desenvolvimento de composições de matriz de polímeros específicas.
[231] As formulações a serem utilizadas para administração in vivo devem ser estéreis. Isso é facilmente obtido por meio de filtragem através de membranas de filtragem estéreis.
VI. MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO E FORMAÇÃO DE IMAGENS UTILIZANDO ANTICORPOS ANTI-A5B1
[232] Anticorpos anti-α5β1 marcados, seus derivados e análogos que se ligam especificamente a um polipeptídeo α5β1 podem ser utilizados para fins de diagnóstico para detectar, diagnosticar ou monitorar doenças e/ou distúrbios associados à expressão, expressão aberrante e/ou atividade de α5β1. Os anticorpos anti-α5β1 de acordo com a presente invenção podem ser utilizados, por exemplo, em testes de formação de imagens ou testes de diagnóstico in situ, in vivo, ex vivo e in vitro.
[233] Métodos de detecção de expressão aberrante de um polipeptídeo α5β1, que compreendem (a) teste da expressão do polipeptídeo em células (tais como tecido) ou fluido do corpo de um indivíduo utilizando um ou mais anticorpos de acordo com a presente invenção e (b) comparação do nível de expressão genética com um nível de expressão genética padrão, por meio do quê um aumento ou redução do nível de expressão genética testado em comparação com o nível de expressão padrão indica expressão aberrante.
[234] Realizações adicionais da presente invenção incluem métodos de diagnóstico de uma doença ou distúrbio associado à expressão ou expressão aberrante de α5β1 em animais (tais como mamíferos, como seres humanos). Os métodos compreendem a detecção de moléculas α5β1 no mamífero. Em uma realização, após a administração de um antagonista de VEGF, o diagnóstico compreende: (a) administração de uma quantidade eficaz de um anticorpo anti-α5β1 a um mamífero; (b) espera por um intervalo de tempo após a administração para permitir a concentração preferencial do anticorpo α5β1 marcado em locais no paciente nos quais a molécula α5β1 é expressa (e para liberação da molécula marcada não ligada até um nível de fundo); (c) determinação do nível de fundo; e (d) detecção da molécula marcada no paciente, de tal forma que a detecção de molécula marcada acima do nível de fundo indica que o paciente possui uma doença ou distúrbio específico associado à expressão ou expressão aberrante de α5β1. O nível de fundo pode ser determinado por meio de vários métodos que incluem a comparação da quantidade de molécula marcada detectada com um valor padrão determinado anteriormente para um sistema específico.
[235] Os anticorpos α5β1 de acordo com a presente invenção podem ser utilizados para testar níveis de proteína em uma amostra biológica utilizando métodos imuno-histológicos clássicos conhecidos dos técnicos no assunto (vide, por exemplo, Jalkanen et al., J. Cell. Biol. 101: 976-985 (1985); Jackson et al., J. Cell. Biol. 105: 3087-3096 (1987)). Outros métodos com base em anticorpos úteis para a detecção da expressão de genes de proteínas incluem imunoensaios, tais como o ensaio imunoabsorvente ligado por enzimas (ELISA) e o radioimunoensaio (RIA). Marcas de testes de anticorpos apropriados são conhecidas na técnica e incluem marcas de enzimas, tais como glicose oxidase; radioisótopos, tais como iodo (131 I, 125 I, 123 I, 121 I), carbono (14 C), enxofre (35 S), trítio (3 H), índio (115m In, 113m In, 112 In, 111 In) e tecnécio (99 Tc, 99m Tc), tálio (201 Ti), gálio (68 Ga, 67 Ga), paládio (103 Pd), molibdênio (99 Mo), xenônio (133 Xe), flúor (18 F), 153 Sm, 177 Lu, 159 Gd, 149 Pm, 140 La, 175 Yb, 166 Ho, 90 Y, 47 Sc, 186 Re, 188 Re, 142 Pr, 105 Rh, 97 Ru; luminol; e marcas fluorescentes, tais como fluoresceína e rodamina, e biotina.
[236] Métodos conhecidos na técnica podem ser aplicados a anticorpos marcados de acordo com a presente invenção. Esses métodos incluem, mas sem limitações, o uso de agentes de conjugação bifuncionais (vide, por exemplo, as Patentes Norte-Americanas n° 5.756.065, 5.714.631, 5.696.239, 5.652.361, 5.505.931, 5.489.425, 5.435.990, 5.428.139, 5.342.604, 5.274.119, 4.994.560 e 5.808.003).
[237] Segundo uma realização específica, a expressão ou sobre-expressão de polipeptídeo α5β1 é determinada em um teste de diagnóstico ou prognóstico após a administração de um agente terapêutico antagonista de VEGF por meio da avaliação de níveis de α5β1 presente sobre a superfície de uma célula (tal como por meio de um teste imuno- histoquímico utilizando anticorpos anti-α5β1). Alternativa, ou adicionalmente, pode-se medir os níveis de ácido nucleico codificador de polipeptídeo α5β1 ou mRNA na célula, por meio, por exemplo, de hibridização in situ fluorescente utilizando uma sonda com base em ácido nucleico correspondente a um ácido nucleico que codifica α5β1 ou seu complemento (FISH; vide WO 98/45479 publicada em outubro de 1998), Southern Blot, Northern Blot ou técnicas de reação em cadeia de polimerase (PCR), tais como PCR quantitativa em tempo real (RT-PCR). Pode-se também estudar a sobre-expressão de α5β1 medindo-se o antígeno retirado em um fluido biológico tal como soro, utilizando, por exemplo, testes com base em anticorpos (vide também, por exemplo, a Patente Norte-Americana n° 4.933.294 emitida em doze de junho de 1990; WO 91/05264 publicada em 18 de abril de 1991; Patente Norte-Americana n° 5.401.638 emitida em 28 de março de 1995; e Sias et al., J. Immunol. Methods, 132: 73-80 (1990)). Além dos testes acima, diversos testes in vivo e ex vivo são disponíveis para os técnicos no assunto. Pode-se, por exemplo, expor as células no corpo do mamífero a um anticorpo que seja opcionalmente marcado com uma marca detectável, tal como um isótopo radioativo, e pode-se avaliar a ligação do anticorpo, por exemplo, por meio de varredura externa para avaliação da radioatividade ou de análise de uma amostra (tal como uma biópsia ou outra amostra biológica) retirada de um mamífero exposto anteriormente ao anticorpo.
VII. ARTIGOS INDUSTRIALIZADOS E KITS
[238] Outra realização da presente invenção é um artigo industrializado que contém materiais úteis para o tratamento de câncer (tais como tumores), doenças oculares (tais como AMD úmida) ou doenças autoimunes e condições relacionadas. O artigo industrializado pode compreender um recipiente e um rótulo ou bula sobre o recipiente ou a ele associado. Os recipientes apropriados incluem, por exemplo, garrafas, ampolas, seringas etc. Os recipientes podem ser formados a partir de uma série de materiais tais como vidro ou plástico. Geralmente, o recipiente contém uma composição que é eficaz para o tratamento da condição e pode ter uma porta de acesso estéril (o recipiente pode ser, por exemplo, um saco de solução intravenosa ou uma ampola que contém uma tampa perfurável por uma agulha de injeção hipodérmica). Pelo menos um agente ativo na composição é um antagonista de VEGF ou um antagonista de α5β1 ou um agonista de VEGF ou um agonista de α5β1 de acordo com a presente invenção. O rótulo ou bula indica que a composição é utilizada para o tratamento da condição específica. O rótulo ou bula compreenderá adicionalmente instruções de administração da composição de anticorpo ao paciente. Também são contemplados artigos industrializados e kits que compreendem terapias combinatórias descritos no presente.
[239] A bula indica instruções costumeiramente incluídas em embalagens comerciais de produtos terapêuticos, que contêm informações sobre as indicações, uso, dosagem, administração, contraindicações e/ou advertências referentes ao uso desses produtos terapêuticos.
[240] Além disso, o artigo industrializado pode compreender adicionalmente um segundo recipiente que compreende um tampão farmaceuticamente aceitável, tal como água bacteriostática para injeção (BWFI), solução salina tamponada com fosfato, solução de Ringer e solução de dextrose. Ele pode ainda incluir outros materiais desejáveis do ponto de vista comercial e do usuário, que incluem outros tampões, diluentes, filtros, agulhas e seringas.
[241] Também são fornecidos kits que são úteis para vários propósitos, tais como para isolamento ou detecção de α5β1 e/ou VEGF em pacientes, opcionalmente em combinação com os artigos industrializados. Para isolamento e purificação de α5β1, o kit pode conter um anticorpo anti-α5β1 acoplado a esferas (por exemplo, esferas de sefarose). Podem ser fornecidos kits que contêm os anticorpos para detecção e quantificação de α5β1 in vitro, por exemplo em ELISA ou Western Blot. Da mesma forma que com o artigo industrializado, o kit compreende um recipiente e um rótulo ou bula sobre o recipiente ou a ele associado. O recipiente contém, por exemplo, uma composição que compreende pelo menos um anticorpo anti-α5β1 de acordo com a presente invenção. Podem ser incluídos recipientes adicionais que contenham, por exemplo, diluentes, tampões e anticorpos controle. O rótulo ou bula pode fornecer uma descrição da composição, bem como instruções de uso in vitro ou em diagnóstico desejado.
[242] Os reagentes disponíveis comercialmente indicados nos Exemplos foram utilizados de acordo com as instruções do fabricante, a menos que indicado em contrário. A fonte dessas células identificadas nos exemplos a seguir e em todo o relatório descritivo por números de acesso ATCC é a Coleção Norte-Americana de Cultivos de Tipos, Manassas VA. A menos que indicado em contrário, a presente invenção utiliza procedimentos padrão de tecnologia de DNA recombinante, tais como os descritos acima e nos livros-texto a seguir: Sambrook et al., acima; Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (Green Publishing Associates e Wiley Interscience, N.Y., 1989); Innis et al., PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, Inc.: Nova Iorque, 1990); Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, 1988); Gait, Oligonucleotide Synthesis (IRL Press: Oxford, 1984); Freshney, Animal Cell Culture, 1987; Coligan et al., Current Protocols in Immunology, 1991.
EXEMPLOS
[243] Os exemplos a seguir são oferecidos para ilustrar, mas não para limitar a presente reivindicação. Os técnicos no assunto reconhecerão facilmente uma série de parâmetros não críticos que podem ser alterados ou modificados para gerar essencialmente os mesmos resultados.
EXEMPLO 1 MATERIAIS E MÉTODOS A. ANÁLISE BIACORE
[244] Para determinar a cinética de ligação e afinidades dos anticorpos descritos no presente, utilizou-se medição de Ressonância de Plasma de Superfície (SRP) com um instrumento BIAcore® 3000. O anticorpo foi capturado em primeiro lugar por chip biossensor CM5 anti-Fc humano de coelho previamente imobilizado sobre a célula de fluxo diferente para atingir cerca de 150 RU (Unidades de Resposta). Para medições de cinética, diluições em série em duas vezes de integrina humana α5β1 (300 nM a 1,2 nM) foram injetadas em tampão PBT (PBS com Tween 20 a 0,05%) a 25 °C com velocidade de fluxo de 30 μL/min. Taxas de associação (kon) e taxas de dissociação (koff) foram calculadas utilizando um modelo de ligação Langmuir um a um simples (Software de Avaliação BIAcore versão 3.2). A constante de dissociação de equilíbrio (KD) foi calculada como razão koff/kon.
B. TESTE DE LIGAÇÃO DE FIBRONECTINA COM CÉLULAS U937
[245] 100 μL de 10 μg/mL de fibronectina (R & D Systems) diluídos em PBS com pH 7,4 foram adicionados às cavidades de placas com 96 cavidades (Nunc MaxiSorp) e incubados por uma noite a 2-8 °C. As placas foram lavadas por três vezes com 200 μL de PBS, pH 7,4. 200 μL de PBS, pH 7,4/1% BSA foram adicionados a todas as cavidades e as placas foram incubadas por pelo menos sessenta minutos à temperatura ambiente com suave agitação. As placas foram lavadas por três vezes com 200 μL de PBS, pH 7,4.
[246] 50 μL de anticorpo anti-α5β1 diluído foram adicionados a cada cavidade (10 μg/mL diluídos em série a 1:3 por dez vezes), seguidos imediatamente por 50 μL de células U937 (ATCC, Cat. n° CRL-1593.2) em uma concentração de 1 x 106 células/mL em Meio de Teste (RPMI 1640 (Media Prep A0806), 5 mg/mL de BSA, 1 mM de L-glutamina, 1 mM de MgCl2).
[247] As placas foram incubadas por trinta minutos a 37 °C, as células não ligadas foram descartadas e as placas foram lavadas com duas vezes com 150 μL de Meio de Teste. Foram adicionados 100 μL de Meio de Teste e 100 μL de Brilho de Título de Célula (Promega Cat. n° G7573) a cada cavidade. As placas foram incubadas por dez a quinze minutos à temperatura ambiente e cobertas. A luminescência foi detectada em um leitor de placas VICTOR 2V (Perkin-Elmer) e as unidades de luminescência foram analisadas com relação à concentração dos anticorpos utilizados no teste, utilizando adequação de mínimos quadrados não lineares de quatro parâmetros para obter os valores IC50.
C. TESTE DE LIGAÇÃO DE FIBRONECTINA COM A5B1:
[248] 25 μL de 1 μg/mL de fibronectina (R & D Systems) diluídos em PBS, foram adicionados às cavidades de placas com 384 cavidades (Nunc MaxiSorp) e incubados por uma noite a 2-8 °C. As placas foram lavadas por três vezes com 80 μL de tampão PBS. 50 μL de PBS/1% BSA foram adicionados a todas as cavidades e as placas foram incubadas por pelo menos sessenta minutos à temperatura ambiente com suave agitação e lavados por três vezes em seguida com 80 μL de tampão PBT.
[249] Anticorpo anti-α5β1 (30 μg/mL) foi diluído em série 1:3 por onze vezes. 50 μL do anticorpo anti-α5β1 diluído em série foram adicionados a 0,65 mL de microtubos e previamente misturados (1:1) com 50 μL de 200 ng/mL de α5β1 (R & D Systems) em tampão ELISA (150 mM de NaCl, 10 mM de Tris, pH 7,5, 5 mg/mL de BSA, 1 mM de MnCl2) por sessenta minutos à temperatura ambiente com suave agitação. 25 μL do α5β1 e anticorpo anti-α5β1 previamente misturados foram adicionados às cavidades revestidas com fibronectina e as placas foram incubadas à temperatura ambiente por sessenta minutos com suave agitação. As placas foram lavadas por seis vezes com tampão de PBT, 100 ng/mL de antibiotina β1 em tampão ELISA foram adicionados a cada cavidade e as placas foram incubadas por sessenta minutos à temperatura ambiente com suave agitação. As placas foram lavadas por seis vezes com 80 μL de tampão de PBT, 25 μL de estreptoavidina-HRP (1:50.000 em tampão ELISA, GE Healthcare) foram adicionados a cada cavidade e as placas foram incubadas por sessenta minutos à temperatura ambiente com suave agitação. As placas foram lavadas por seis vezes com 80 μL de tampão PBT, 25 μL de substrato TMB (Kirkgaard e Perry Laboratories) foram adicionados a cada cavidade, as placas foram incubadas por cerca de seis minutos à temperatura ambiente e a reação foi suspensa com 25 μL de 1 M ácido fosfórico. A absorção foi lida a 450 nm e os valores IC50 foram analisados conforme descrito no capítulo B acima.
D. TESTE DE MIGRAÇÃO DE HUVEC
[250] As células HUVEC foram cultivadas em meios padrão até 80% de confluência. As células foram tripsinizadas, contadas e novamente suspensas em meio EBM-2 com BSA a 0,1% sob concentração de 5 x 105 células/mL. Para o teste, 100 μL de células (5 x 104 células/cavidade) foram colocadas em placas por cavidade em um sistema de múltiplas cavidades BD Falcon HTS com 24 cavidades (BD Ref. 351185, tamanho de poro de 8 μm). As placas de HTS foram previamente revestidas com fibronectina (1 a 2 μg/mL) por uma noite. As placas foram lavadas com PBS e foram adicionados 500 μL de solução (EBM com 0,1% de BSA) à câmara inferior. Para cada amostra, foram utilizadas de três a seis cavidades. Nenhum estímulo de migração (tal como VEGF) foi adicionado à cavidade controle negativo.
[251] Para iniciar o teste, foram adicionados 100 μL de células (5 x 104 células por cavidade) à câmara superior. A câmara inferior continha 500 μL de meios (EBM com 0,1% de BSA). Anticorpos anti-integrina α5β1 e controles de isotipos são geralmente adicionados à câmara superior com as células em uma concentração final de 0 μg/mL e incubados por quinze minutos antes da adição do estímulo de migração (VEGF) à câmara inferior.
[252] Adicionou-se estímulo à câmara inferior (10 ng/mL de VEGF-A) e as placas foram incubadas por quatro a seis horas ou por uma noite. As células foram raspadas da câmara superior utilizando um esfregão de esponja, adicionou-se PBS e, em seguida, as células da câmara superior foram novamente raspadas. Os meios foram drenados da câmara inferior e as células foram fixadas com 500 μL de metanol a 100% por cinco minutos.
[253] As células foram manchadas em seguida com 500 μL de manchas de ácido nucleico verde SYTOX® (diluição 1:5000 ou 1:10000 em PBS) (Molecular Probes S7020) por pelo menos dez minutos (no escuro). Em seguida, foi utilizado um microscópio para tomar fotografias individuais de cada cavidade. Foram tomadas fotografias utilizando um programa Axio Vision AC e uma objetiva de 5x. ImageJ foi utilizado para analisar os resultados (mínimo de 5 pixels, cesto 5). O número de células por cavidade foi registrado e analisado utilizando Microsoft Excel.
EXEMPLO 2 GERAÇÃO DE ANTICORPOS ANTI-A5B1
[254] Os anticorpos anti-α5β1 foram gerados por meio da imunização de hamsters com polipeptídeos de domínio extracelular α5β1 humano recombinante. Foi selecionado clone 18C12 de anticorpo monoclonal de hamster que compreende as sequências VH e VL descritas nas Figuras 1 e 2.
[255] Duas versões de hamster quimérico 18C12, h18C12.v1.1 e h18C12.v2.1 foram geradas por meio de clonagem da cadeia leve do hamster 18C12 em dois conjuntos de VLcapa1/VHIII de consenso: h18C12.v1.1 e h18C12.v2.1 que diferem apenas na região de contato de CDR-H3. Especificamente, a região de contato de CDR-H3 de h18C12.v1.1 compreende os resíduos a seguir: C92A93R94 e a região de contato de CDR-H3 de h18C12.v2.1 compreendem os resíduos a seguir: C92T93S94. Foram dispostos com sucesso h18C12.v1.1 e h18C12.v2.1 sobre fago em formato de Fab e observou-se ligação por meio de ELISA de competição de fagos. Não foi observada diferença significativa de ligação entre h18C12.v1.1 e h18C12.v2.1. Selecionou-se h18C12.v1.1 para humanização adicional. 18C12.v3 humanizado foi gerado alterando-se a maior parte da cadeia principal de cadeia leve de h18C12.v1.1 na estrutura lambda IV de consenso humano, com exceção dos resíduos a seguir na cadeia leve: Y36, A43 e Y49. Além disso, foram retidos os resíduos a seguir na cadeia principal VHIII humana: G49 e D73.
[256] h18C12.v3 foi maturado por afinidade e foram gerados os clones a seguir: h18C12.v6; h18C12.v7; h18C12.v9; h18C12.v15; h18C12.v16; h18C12.v28; h18C12.v30; h18C12.v51; h18C12.v54; h18C12.v70; h18C12.v78. Sequências de CDR para cada um dos clones são descritas na Figura 3. Sequências de CDR para o clone h18C12.v6 foram modificadas conforme segue: CDR-L2: D50cS e D56S; CDR-H1: N31A; e CDR-H2: N53A. As sequências de CDR modificadas foram inseridas em seguida em uma cadeia principal ÀIII//VHIII humana modificada para gerar h18C12.v6.1Lam3 (h18C12.v6.1) e h18C12.v6.2Lam3 (h18C12.v6.2). A cadeia principal ÀIII humana modificada para h18C12.v6.1 continha as modificações a seguir: L46Y; V47L; I48M; N69A; A71R; e G77N. A cadeia principal ÀIII humana modificada para h18C12.v6.2 continha as modificações a seguir: N69A, A71R e G77N. A cadeia principal VHIII modificada continha as modificações a seguir: S49G e N73D.
[257] O clone h18C12.v6.1 foi adicionalmente modificado para remover Asparagina (N) em CDR-L2 (N50aS50bS50cG50d). Foram gerados os clones a seguir: h18C12.v6.1.1, h18C12.v6.1.2, h18C12.v6.1.3, h18C12.v6.1.4 e h18C12.v6.1.5. A sequência de CDR-L2 nas posições 50a, 50b, 50c e 50d para cada um dos clones h18C12.v6.1 é descrita na Figura 7.
EXEMPLO 3 ELISA DE COMPETIÇÃO DE FAGOS
[258] Placas de microtítulos MAXISORP® foram revestidas com integrina α5β1 humana recombinante (R&D) a 5 μg/mL em PBS por uma noite e bloqueadas em seguida com tampão PBST (0,5% de BSA e 0,05% Tween 20 em PBS) por uma hora à temperatura ambiente. Fago de sobrenadantes de cultivo foi incubado com integrina α5β1 humana diluída em série em tampão PBST em uma placa com microtítulos de cultivo de tecidos por uma hora, após o quê 80 μL da mistura foram transferidos para as cavidades revestidas alvo por quinze minutos para capturar fago não ligado. A placa foi lavada com tampão PBT (0,05% Tween 20 em PBS) e adicionou-se anti-M13 conjugado a HRP (Amersham Pharmacia Biotech) (1:5000 em tampão PBST) por quarenta minutos. A placa foi lavada com tampão PBT e desenvolvida por meio da adição de substrato tetrametilbenzidina (Kirkegaard e Perry Laboratories, Gaithersburg MD). A absorção a 450 nm foi plotada em função da concentração alvo em solução para determinar IC50 de fago. Isso foi utilizado como estimativa de afinidade para o clone de Fab disposto sobre a superfície do fago. A Figura 4 ilustra os resultados de um teste de competição de fagos que demonstra a ligação de variantes de 18C12 maturadas por afinidade h18C12.v3; h18C12.v6; h18C12.v7; h18C12.v9; h18C12.v15; h18C12.v16; h18C12.v28; h18C12.v30; h18C12.v51; h18C12.v54; h18C12.v70 e h18C12.v78 em integrina α5β1 humana.
EXEMPLO 4 DETERMINAÇÕES DA AFINIDADE DE ANTICORPOS POR MEIO DE BIACORE
[259] Para determinar a ligação de cinética e afinidades de IgGs de 18C12, h18C12.v6.1, h18C12.v6.1.1, h18C12.v6.1.2, h18C12.v6.1.3, h18C12.v6.1.4 e h18C12.v6.1.5, utilizou-se medição de Ressonância de Plasma de Superfície (SRP) com um instrumento BIAcore® 3000 conforme descrito no Exemplo 1.
[260] A Figura 5 ilustra os resultados de uma análise de BIAcore da ligação de variantes de 18C12 maturadas por afinidade a integrina α5β1 humana. A Figura 6 ilustra os resultados da análise de BIACore da ligação de 18C12 quimérico (18C12 que compreende as sequências de VL e VH de hamster descritas na Figura 1 e a porção Fc de IgG1) e h18C12.v6.1 para integrina α5β1 humana. Os dados demonstram que h18C12.v6.1 possui afinidade de ligação para integrina α5β1 humana que é cerca de duas vezes mais alta que a afinidade de ligação de 18C12 de hamster a integrina α5β1 humana. A Figura 7 ilustra resultados de análise de BIAcore para cada um dos clones h18C12.v6.1.
EXEMPLO 5 ANTICORPOS 18C12 INIBEM A LIGAÇÃO A FIBRONECTINA
[261] Para comparar os efeitos de 18C12 quimérico e IgGs h18C12.v6.1 ou h18C12.v6.1.5 sobre a ligação a fibronectina, foram utilizados os testes de ligação de fibronectina descritos no Exemplo 1 acima.
[262] A Figura 8 ilustra os resultados de um teste de ligação de fibronectina que compara a capacidade de 18C12 quimérico e h18C12.v6.1 de interferir com a ligação de células U937 a fibronectina. A Figura 9 ilustra os resultados de um teste de ligação de fibronectina que compara a capacidade de 18C12 de hamster e h18C12.v6.1.5 de interferir com a ligação de células U937 a fibronectina. A Figura 10 ilustra os resultados de um teste de ligação de fibronectina que compara a capacidade de 18C12 de hamster e h18C12.v6.1.5 de interferir com a ligação de domínio extracelular de α5β1 recombinante a fibronectina. Os dados demonstram que 18C12 de hamster, 18C12 quimérico, h18C12.v6.1 e h18C12.v6.1.5 inibem a ligação de células U937 ou domínio extracelular de α5β1 recombinante a fibronectina.
EXEMPLO 6 ANTICORPOS 18C12 INIBEM A MIGRAÇÃO DE HUVEC
[263] Para comparar os efeitos de IgGs 18C12 quimérico e h18C12.v6.1 sobre a migração de células HUVEC, foi utilizado o teste de migração de HUVEC descrito no Exemplo 1 acima.
[264] A Figura 11 ilustra os resultados de um teste de migração de HUVEC que compara a capacidade de 18C12 quimérico e h18C12.v6.1 de interferir com a migração de células HUVEC sobre fibronectina. Os dados demonstram que 18C12 quimérico e h18C12.v6.1 inibem a migração de células HUVEC sobre fibronectina.
EXEMPLO 7 TESTES DE DESENVOLVIMENTO EMBRIÔNICO
[265] Camundongos transgênicos α5 que expressam uma integrina α5β1 quimérica (α5 humano e β1 murino) foram utilizados em testes de desenvolvimento embriônico para demonstrar a eficácia dos anticorpos 18C12 descritos no presente. Camundongos transgênicos machos que expressam α5 humano e não expressam α5 murino foram acasalados com fêmeas de camundongos que não expressam α5 humano e são heterozigóticas para α5 murino. Fêmeas de camundongos prenhas receberam injeção intraperitoneal de 10 mg/kg de anticorpo anti-α5β1 (h18C12.v6.1.5) ou de um anticorpo controle negativo duas vezes por semana a partir de 9,5 dias após o coito. No dia 14,5 após o coito, os embriões foram recolhidos, genotipados e foi avaliada a vasculatura embriônica. Os resultados encontram-se resumidos na tabela abaixo.
Figure img0002
[266] Estes resultados demonstram que h18C12.v6.1.5 prejudica a função de integrina α5β1 in vivo durante o desenvolvimento vascular.
EXEMPLO 8 TESTES DE ALOENXERTO DE TUMORES
[267] Modelos de tumores de aloenxerto C57/B16 são utilizados em estudos para demonstrar a eficácia dos anticorpos 18C12 descritos no presente. Células de tumores C57/B16 são implantadas em camundongos transgênicos α5 humanos::knockout α5 murinos e os camundongos são tratados com anticorpos anti-α5β1.
[268] Camundongos que possuem tumores estabelecidos são aleatorizados em quatro grupos, de tal forma que todos os grupos possuam volumes de tumores iniciais similares. O regime de dosagem é o seguinte: (1) Anticorpo controle negativo (13,5 mg/kg, 2 x/semana); (2) Anticorpo anti-VEGF (3,5 mg/kg, 2x/semana) + anticorpo controle negativo (10 mg/kg, 2x/semana); (3) Anticorpo controle negativo (3,5 mg/kg, 2x/semana) + anticorpo anti-α5β1 (18C12) (10 mg/kg, 2x/semana); (4) Anticorpo anti-VEGF (3,5 mg/kg, 2x/semana) + anticorpo anti-α5β1 (18C12) (10 mg/kg, 2x/semana).
[269] O comprimento e a largura de tumores são medidos duas vezes por semana usando compassos e os volumes de tumores são calculados utilizando a fórmula a seguir: Volume de tumor (mm3) = (w2 x 1)/2, em que w = largura e l = comprimento em mm. Volumes de tumores são plotados contra o tempo para refletir as velocidades de crescimento de tumor.
EXEMPLO 9 TESTES DE XENOENXERTOS DE TUMORES
[270] Modelos de xenoenxertos de tumores foram utilizados em estudos para demonstrar a eficácia dos anticorpos 18C12 descritos no presente. Células de glioma U87 humano que abrigam um gene repórter de luciferase são implementadas nos cérebros de camundongos nude e os camundongos são tratados com anticorpos anti-α5β1.
[271] Foi elaborada a imagem de camundongos que contêm tumores estabelecidos utilizando formação de imagens por bioluminescência e eles foram aleatorizados em três grupos, de tal forma que todos os grupos possuíssem um encargo de tumor inicial similar. O regime de dosagem é o seguinte: (1) Anticorpos controle negativos (erva de Santiago) (5 mg/kg, 2x/semana) + anti-gD (10 mg/kg, 2x/semana); (2) Anticorpo anti-VEGF (B20-4.1) (5 mg/kg, 2x/semana) + anticorpo controle negativo (10 mg/kg, 2x/semana); (3) Anticorpo anti-VEGF (B20-4.1) (5 mg/kg, 2x/semana) + anticorpo anti-α5β1 (h18C12.v6.1.5) (10 mg/kg, 2x/semana).
[272] A sobrevivência desses camundongos foi monitorada diariamente após o implante cirúrgico de células de tumores. Tratamento com o anticorpo anti-α5β1 ht18C12.v6.1.5 em combinação com anti-VEGF aumentou significativamente a sobrevivência de camundongos com relação a anti-VEGF isoladamente. Os resultados são exibidos na Figura 12. Os encargos de tumor também foram medidos nas semanas 1, 3, 4 e 5 após o implante, utilizando formação de imagens por bioluminescência. Os camundongos tratados com o anticorpo anti-α5β1 h18C12.v6.1.5 em combinação com anti-VEGF apresentaram encargo de tumor reduzido com relação a camundongos tratados apenas com anti-VEGF. Os resultados são exibidos na Figura 13.
[273] Todas as publicações (incluindo, por exemplo, patentes, pedidos de patentes publicados e números de acesso ao Genbank) mencionadas no presente são integralmente incorporadas como referência para todos os fins, como se cada referência fosse incorporada específica e individualmente como referência.

Claims (35)

1. ANTICORPO ANTI-α5β1, caracterizado por compreender: - um domínio VL que compreende uma CDR-L1 que compreende os resíduos 23 a 34 da SEQ ID NO:8; uma CDR-L2 que compreende os resíduos 49 a 60 da SEQ ID NO: 8; uma CDR-L3 que compreende os resíduos 93 a 101 da SEQ ID NO: 8; e - um domínio VH que compreende uma CDR-H1 que compreende os resíduos 31 a 35 da SEQ ID NO: 14; uma CDR-H2 que compreende os resíduos 50 a 68 da SEQ ID NO: 14; e uma CDR-H3 que compreende os resíduos 101 a 109 da SEQ ID NO: 14.
2. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por: - o domínio VL compreender SEQ ID NO: 8; e - o domínio VH compreender SEQ ID NO: 14.
3. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizado por ser um anticorpo humano, humanizado, quimérico, biespecífico ou multiespecífico.
4. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado por ser um fragmento de anticorpo que liga α5β1.
5. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizado por ser um anticorpo IgG1 de comprimento total.
6. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por compreender uma porção Fc que compreende uma substituição N297A.
7. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado por compreender adicionalmente uma marca detectável.
8. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pela marca detectável ser um membro selecionado a partir do grupo que consiste em: um radioisótopo, uma tintura fluorescente e uma enzima.
9. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado por ser para uso como medicamento.
10. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado por ser para uso no tratamento de uma doença ou distúrbio que envolve angiogênese anormal e/ou permeabilidade ou vazamento vascular.
11. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pela doença ser um membro selecionado a partir do grupo que consiste em: câncer, doença ocular e doença autoimune.
12. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado por ser para uso na inibição da angiogênese.
13. IMUNOCONJUGADO, caracterizado por compreender o anticorpo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, e um agente citotóxico.
14. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, caracterizada por compreender o anticorpo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, e um veículo farmaceuticamente aceitável.
15. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 14, caracterizada por compreender adicionalmente um antagonista de VEGF.
16. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 15, caracterizada pelo antagonista de VEGF ser um anticorpo anti-VEGF.
17. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 16, caracterizada pelo anticorpo anti-VEGF ser bevacizumab.
18. MÉTODO IN VITRO OU EX VIVO PARA DETECTAR A PROTEÍNA α5β1, em uma amostra suspeita de conter a proteína α5β1, caracterizado por compreender: (a) colocar em contato o anticorpo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 7 a 8, com a amostra; e (b) detectar a formação de um complexo entre o anticorpo anti- α5β1 e a proteína α5β1.
19. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pela amostra ser de um paciente diagnosticado com uma doença que envolve angiogênese anormal, permeabilidade vascular anormal e/ou vazamento vascular.
20. USO DE UM ANTICORPO, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado por ser na preparação de um medicamento para tratar uma doença ou distúrbio em um indivíduo, que envolve a angiogênese anormal e/ou permeabilidade ou vazamento vascular.
21. USO, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pela doença ou distúrbio ser um membro selecionado a partir do grupo que consiste em: câncer, doença ocular e doença autoimune.
22. USO, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo câncer ser selecionado a partir do grupo que consiste em: câncer colorretal, câncer de pulmão, câncer de mama, câncer de células renais e glioblastoma.
23. USO, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pela doença ou distúrbio ser um membro selecionado a partir do grupo que consiste em: retinopatia, degeneração macular relacionada à idade, neovascularização da córnea, neovascularização de enxerto da córnea, neovascularização da retina e glaucoma neovascular.
24. USO, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo medicamento ser administrado em combinação com um antagonista de VEGF.
25. USO, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo antagonista de VEGF ser um anticorpo anti-VEGF.
26. USO, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo anticorpo anti-VEGF ser bevacizumab.
27. USO, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo antagonista de VEGF ser administrado antes do medicamento.
28. USO, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo antagonista de VEGF e o medicamento serem administrados simultaneamente.
29. USO, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo medicamento ser administrado ao indivíduo que foi primeiro tratado com o antagonista de VEGF até que o indivíduo tornou-se não responsivo ao tratamento com antagonista de VEGF.
30. USO, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo medicamento ser administrado em combinação com o agente terapêutico selecionado a partir do grupo que consiste em: um agente antineoplásico, um agente quimioterápico, um agente inibidor de crescimento e um agente citotóxico.
31. USO, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo medicamento compreender adicionalmente um antagonista de VEGF.
32. USO, de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo antagonista de VEGF ser anticorpo anti-VEGF.
33. USO, de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo anticorpo anti-VEGF ser bevacizumab.
34. USO, de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelo medicamento compreender adicionalmente um agente terapêutico selecionado a partir do grupo que consiste em: um agente antineoplásico, um agente quimioterápico, um agente inibidor de crescimento e um agente citotóxico.
35. KIT PARA DETECTAR A PROTEÍNA α5β1, em um indivíduo que tenha sido tratado com um antagonista de VEGF, caracterizado por compreender: (a) um anticorpo anti-α5β1, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6; e (b) instruções de uso.
BRPI1006270-0A 2009-03-25 2010-03-23 Anticorpo anti-a5ss1, imunoconjugado, composição farmacêutica, método in vitro ou ex vivo para detectar a proteína a5ss1, uso de um anticorpo e kit para detectar a proteína a5ss1 BRPI1006270B1 (pt)

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KR (1) KR101523127B1 (pt)
CN (2) CN102365297B (pt)
AR (1) AR075925A1 (pt)
AU (1) AU2010229479B2 (pt)
BR (1) BRPI1006270B1 (pt)
CA (1) CA2753988C (pt)
CL (1) CL2011002360A1 (pt)
CO (1) CO6410315A2 (pt)
CR (1) CR20110497A (pt)
DK (1) DK2411411T3 (pt)
EC (1) ECSP11011344A (pt)
HK (2) HK1162538A1 (pt)
IL (1) IL215291A (pt)
MA (1) MA33210B1 (pt)
MX (1) MX2011010012A (pt)
MY (1) MY173526A (pt)
NZ (1) NZ594343A (pt)
PE (1) PE20120770A1 (pt)
RU (1) RU2011142974A (pt)
SG (2) SG10201609416XA (pt)
TW (1) TWI504409B (pt)
UA (1) UA108199C2 (pt)
WO (1) WO2010111254A1 (pt)
ZA (1) ZA201105573B (pt)

Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP3788479B2 (ja) * 2003-05-21 2006-06-21 株式会社ジェイ・エム・エス 血清調製用容器及びそれを用いた血清調製方法
TWI504409B (zh) 2009-03-25 2015-10-21 Genentech Inc 新穎抗－α５β１抗體及其用途
EP2688585B1 (en) * 2011-03-23 2018-09-05 The Regents of The University of California Methods and compositions for improving antiangiogenic therapy with anti-integrins
EP3309555A3 (en) * 2011-12-12 2018-05-30 Pieris Pharmaceuticals GmbH Methods for preventing or treating disorders by increasing bioavailability of iron and related pharmaceutical formulation
US9840553B2 (en) 2014-06-28 2017-12-12 Kodiak Sciences Inc. Dual PDGF/VEGF antagonists
US9616114B1 (en) 2014-09-18 2017-04-11 David Gordon Bermudes Modified bacteria having improved pharmacokinetics and tumor colonization enhancing antitumor activity
DK3268391T3 (da) * 2015-03-09 2021-09-13 Argenx Bvba Fremgangsmåder til reduktion af serumniveauer af Fc-indeholdende midler ved anvendelse af FcRn-antagonister
AU2016381964B2 (en) 2015-12-30 2024-02-15 Kodiak Sciences Inc. Antibodies and conjugates thereof
US11180535B1 (en) 2016-12-07 2021-11-23 David Gordon Bermudes Saccharide binding, tumor penetration, and cytotoxic antitumor chimeric peptides from therapeutic bacteria
US11129906B1 (en) 2016-12-07 2021-09-28 David Gordon Bermudes Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria
US11597774B2 (en) 2017-05-04 2023-03-07 City Of Hope Antibody variable domains and antibody constructs
WO2020141608A1 (ja) * 2019-01-04 2020-07-09 国立大学法人京都大学 潰瘍性大腸炎及び原発性硬化性胆管炎の検査方法
WO2021072265A1 (en) 2019-10-10 2021-04-15 Kodiak Sciences Inc. Methods of treating an eye disorder
WO2023220733A1 (en) 2022-05-12 2023-11-16 Morphic Therapeutic, Inc. USE OF INTEGRIN a5b1 INHIBITORS IN THE TREATMENT OF PULMONARY HYPERTENSION AND HEART FAILURE

Family Cites Families (160)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
US4179337A (en) 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
JPS6023084B2 (ja) 1979-07-11 1985-06-05 味の素株式会社 代用血液
US4485045A (en) 1981-07-06 1984-11-27 Research Corporation Synthetic phosphatidyl cholines useful in forming liposomes
US4640835A (en) 1981-10-30 1987-02-03 Nippon Chemiphar Company, Ltd. Plasminogen activator derivatives
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4675187A (en) 1983-05-16 1987-06-23 Bristol-Myers Company BBM-1675, a new antibiotic complex
US4544545A (en) 1983-06-20 1985-10-01 Trustees University Of Massachusetts Liposomes containing modified cholesterol for organ targeting
US4496689A (en) 1983-12-27 1985-01-29 Miles Laboratories, Inc. Covalently attached complex of alpha-1-proteinase inhibitor with a water soluble polymer
ATE97498T1 (de) 1984-01-30 1993-12-15 Imp Cancer Res Tech Verbesserungen an wachstumsfaktoren.
US5540933A (en) 1985-05-31 1996-07-30 La Jolla Cancer Research Foundation Isolation and use of fibronectin receptor
DE3675588D1 (de) 1985-06-19 1990-12-20 Ajinomoto Kk Haemoglobin, das an ein poly(alkenylenoxid) gebunden ist.
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
US6548640B1 (en) 1986-03-27 2003-04-15 Btg International Limited Altered antibodies
US5401638A (en) 1986-06-04 1995-03-28 Oncogene Science, Inc. Detection and quantification of neu related proteins in the biological fluids of humans
US4791192A (en) 1986-06-26 1988-12-13 Takeda Chemical Industries, Ltd. Chemically modified protein with polyethyleneglycol
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
DE3883899T3 (de) 1987-03-18 1999-04-22 Sb2 Inc Geänderte antikörper.
US5489425A (en) 1987-06-24 1996-02-06 The Dow Chemical Company Functionalized polyamine chelants
US4994560A (en) 1987-06-24 1991-02-19 The Dow Chemical Company Functionalized polyamine chelants and radioactive rhodium complexes thereof for conjugation to antibodies
US5606040A (en) 1987-10-30 1997-02-25 American Cyanamid Company Antitumor and antibacterial substituted disulfide derivatives prepared from compounds possessing a methyl-trithio group
US5770701A (en) 1987-10-30 1998-06-23 American Cyanamid Company Process for preparing targeted forms of methyltrithio antitumor agents
EP0330506A3 (en) 1988-02-26 1990-06-20 Dana Farber Cancer Institute Vla proteins
US5756065A (en) 1988-06-24 1998-05-26 The Dow Chemical Company Macrocyclic tetraazacyclododecane conjugates and their use as diagnostic and therapeutic agents
ZA894792B (en) 1988-06-24 1991-04-24 Dow Chemical Co Macrocyclic bifunctional chelants,complexes thereof and their antibody conjugates
ATE120457T1 (de) 1988-06-24 1995-04-15 Dow Chemical Co Macrocyclische bifunktionelle chelatbildner, komplexe davon und ihre konjugierten antikörper.
US5274119A (en) 1988-07-01 1993-12-28 The Dow Chemical Company Vicinal diols
US5342604A (en) 1988-10-31 1994-08-30 The Dow Chemical Company Complexes possessing ortho ligating functionality
US5696239A (en) 1988-10-31 1997-12-09 The Dow Chemical Company Conjugates possessing ortho ligating functionality and complexes thereof
US5225538A (en) 1989-02-23 1993-07-06 Genentech, Inc. Lymphocyte homing receptor/immunoglobulin fusion proteins
US5808003A (en) 1989-05-26 1998-09-15 Perimmune Holdings, Inc. Polyaminocarboxylate chelators
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
WO1991005264A1 (en) 1989-09-29 1991-04-18 Oncogenetics Partners Detection and quantification of neu related proteins in the biological fluids of humans
US5013556A (en) 1989-10-20 1991-05-07 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
CA2026147C (en) 1989-10-25 2006-02-07 Ravi J. Chari Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
US5208020A (en) 1989-10-25 1993-05-04 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
ATE164395T1 (de) 1990-12-03 1998-04-15 Genentech Inc Verfahren zur anreicherung von proteinvarianten mit geänderten bindungseigenschaften
DK0590058T3 (da) 1991-06-14 2004-03-29 Genentech Inc Humaniseret heregulin-antistof
WO1993008829A1 (en) 1991-11-04 1993-05-13 The Regents Of The University Of California Compositions that mediate killing of hiv-infected cells
JPH07501451A (ja) 1991-11-25 1995-02-16 エンゾン・インコーポレイテッド 多価抗原結合タンパク質
US5428139A (en) 1991-12-10 1995-06-27 The Dow Chemical Company Bicyclopolyazamacrocyclophosphonic acid complexes for use as radiopharmaceuticals
US5505931A (en) 1993-03-04 1996-04-09 The Dow Chemical Company Acid cleavable compounds, their preparation and use as bifunctional acid-labile crosslinking agents
WO1994011026A2 (en) 1992-11-13 1994-05-26 Idec Pharmaceuticals Corporation Therapeutic application of chimeric and radiolabeled antibodies to human b lymphocyte restricted differentiation antigen for treatment of b cell lymphoma
US5635483A (en) 1992-12-03 1997-06-03 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Tumor inhibiting tetrapeptide bearing modified phenethyl amides
US5780588A (en) 1993-01-26 1998-07-14 Arizona Board Of Regents Elucidation and synthesis of selected pentapeptides
CA2163345A1 (en) 1993-06-16 1994-12-22 Susan Adrienne Morgan Antibodies
US5627263A (en) 1993-11-24 1997-05-06 La Jolla Cancer Research Foundation Integrin-binding peptides
US5981478A (en) 1993-11-24 1999-11-09 La Jolla Cancer Research Foundation Integrin-binding peptides
US5773001A (en) 1994-06-03 1998-06-30 American Cyanamid Company Conjugates of methyltrithio antitumor agents and intermediates for their synthesis
DE69531187T2 (de) 1994-12-20 2004-04-22 Merck Patent Gmbh Monoklonaler Antikörper gegen das Alpha-V-Integrin
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US5641870A (en) 1995-04-20 1997-06-24 Genentech, Inc. Low pH hydrophobic interaction chromatography for antibody purification
US5712374A (en) 1995-06-07 1998-01-27 American Cyanamid Company Method for the preparation of substantiallly monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates
US5714586A (en) 1995-06-07 1998-02-03 American Cyanamid Company Methods for the preparation of monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates
ES2434840T3 (es) 1995-07-27 2013-12-17 Genentech, Inc. Formulación de proteína liofilizada isotónica estable
GB9603256D0 (en) 1996-02-16 1996-04-17 Wellcome Found Antibodies
US5994071A (en) 1997-04-04 1999-11-30 Albany Medical College Assessment of prostate cancer
US6884879B1 (en) 1997-04-07 2005-04-26 Genentech, Inc. Anti-VEGF antibodies
US20020032315A1 (en) 1997-08-06 2002-03-14 Manuel Baca Anti-vegf antibodies
ES2273415T3 (es) 1997-04-07 2007-05-01 Genentech, Inc. Anticuerpos anti-vegf.
ES2190087T3 (es) 1997-06-13 2003-07-16 Genentech Inc Formulacion estabilizada de un anticuerpo.
WO1998058964A1 (en) 1997-06-24 1998-12-30 Genentech, Inc. Methods and compositions for galactosylated glycoproteins
WO1999022764A1 (en) 1997-10-31 1999-05-14 Genentech, Inc. Methods and compositions comprising glycoprotein glycoforms
US6610833B1 (en) 1997-11-24 2003-08-26 The Institute For Human Genetics And Biochemistry Monoclonal human natural antibodies
ES2375931T3 (es) 1997-12-05 2012-03-07 The Scripps Research Institute Humanización de anticuerpo murino.
CA2319160A1 (en) 1998-01-23 1999-07-29 Merck Patent Gesellschaft Mit Beschraenkter Haftung Monoclonal antibody anti .alpha.v-integrin and its use to inhibit .alpha.v.beta.6-integrin attachment to fibronectin
JP2002510481A (ja) 1998-04-02 2002-04-09 ジェネンテック・インコーポレーテッド 抗体変異体及びその断片
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
EP2261229A3 (en) 1998-04-20 2011-03-23 GlycArt Biotechnology AG Glycosylation engineering of antibodies for improving antibody-dependent cellular cytotoxicity
DE69940465D1 (de) 1998-05-08 2009-04-09 Univ California Verfahren zum nachweis und hemmung der angiogenese
US6852318B1 (en) 1998-05-08 2005-02-08 The Regents Of The University Of California Methods for detecting and inhibiting angiogenesis
UA60365C2 (uk) 1998-06-04 2003-10-15 Пфайзер Продактс Інк. Похідні ізотіазолу, спосіб їх одержання, фармацевтична композиція та спосіб лікування гіперпроліферативного захворювання у ссавця
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
JP2003512019A (ja) 1999-01-15 2003-04-02 ジェネンテック・インコーポレーテッド 変化したエフェクター機能を有するポリペプチド変異体
ES2420835T3 (es) 1999-04-09 2013-08-27 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Procedimiento para controlar la actividad de las moléculas inmunofuncionales
GB9909392D0 (en) 1999-04-24 1999-06-23 Imp Cancer Res Tech Treatment, imaging and diagnosis of disease
TWI262914B (en) 1999-07-02 2006-10-01 Agouron Pharma Compounds and pharmaceutical compositions for inhibiting protein kinases
US20020019330A1 (en) 1999-08-11 2002-02-14 Richard Murray Novel methods of diagnosis of angiogenesis, compositions, and methods of screening for angiogenesis modulators
CA2381699A1 (en) 1999-08-11 2001-02-15 Eos Biotechnology, Inc. Novel methods of diagnosis of angiogenesis compostions and methods of screening for angiogenesis modulators
US20030152926A1 (en) 1999-08-11 2003-08-14 Eos Biotechnology, Inc. Novel methods of diagnosis of angiogenesis, compositions and methods of screening for angiogenesis modulators
US20040009494A1 (en) 1999-08-11 2004-01-15 Richard Murray Novel methods of diagnosis of angiogenesis and other conditions, compositions, and the methods of screening for modulators
US20020015970A1 (en) 1999-08-11 2002-02-07 Richard Murray Novel methods of diagnosis of angiogenesis, compositions, and methods of screening for angiogenesis modulators
JP4668498B2 (ja) 1999-10-19 2011-04-13 協和発酵キリン株式会社 ポリペプチドの製造方法
WO2001044463A1 (en) 1999-12-15 2001-06-21 Genentech, Inc. Shotgun scanning, a combinatorial method for mapping functional protein epitopes
AU767394C (en) 1999-12-29 2005-04-21 Immunogen, Inc. Cytotoxic agents comprising modified doxorubicins and daunorubicins and their therapeutic use
US20040259152A1 (en) 2000-02-22 2004-12-23 Richard Murray Novel methods of diagnosing and screening for modulators of tissue remodeling and treating related diseases
JP2003531588A (ja) 2000-04-11 2003-10-28 ジェネンテック・インコーポレーテッド 多価抗体とその用途
US7064191B2 (en) 2000-10-06 2006-06-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Process for purifying antibody
US6946292B2 (en) 2000-10-06 2005-09-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cells producing antibody compositions with increased antibody dependent cytotoxic activity
CA2953239A1 (en) 2000-10-06 2002-04-18 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Antibody composition-producing cell
US6596541B2 (en) 2000-10-31 2003-07-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
CN101940189A (zh) 2000-11-30 2011-01-12 米德列斯公司 用于生产人类抗体的转基因转染色体啮齿动物
CA2438030A1 (en) 2001-02-14 2002-10-10 Protein Design Labs Methods of diagnosis of angiogenesis, compositions and methods of screening for angiogenesis modulators
WO2002086443A2 (en) 2001-04-18 2002-10-31 Protein Design Labs, Inc Methods of diagnosis of lung cancer, compositions and methods of screening for modulators of lung cancer
WO2002098358A2 (en) 2001-06-04 2002-12-12 Eos Biotechnology, Inc. Methods of diagnosis and treatment of androgen-dependent prostate cancer, prostate cancer undergoing androgen-withdrawal, and androgen-independent prostate cancer
EP1517998A2 (en) 2001-06-18 2005-03-30 EOS Biotechnology, Inc. Methods of diagnosis of ovarian cancer, compositions and methods of screening for modulators of ovarian cancer
US7189507B2 (en) 2001-06-18 2007-03-13 Pdl Biopharma, Inc. Methods of diagnosis of ovarian cancer, compositions and methods of screening for modulators of ovarian cancer
US20040076955A1 (en) 2001-07-03 2004-04-22 Eos Biotechnology, Inc. Methods of diagnosis of bladder cancer, compositions and methods of screening for modulators of bladder cancer
EP1423510A4 (en) 2001-08-03 2005-06-01 Glycart Biotechnology Ag ANTIBODY GLYCOSYLATION VARIANTS WITH INCREASED CELL CYTOTOXICITY DEPENDENT OF ANTIBODIES
US20040033495A1 (en) 2001-08-03 2004-02-19 Eos Biotechnology, Inc. Methods of diagnosis of angiogenesis, compositions and methods of screening for angiogenesis modulators
US20030124579A1 (en) 2001-09-05 2003-07-03 Eos Biotechnology, Inc. Methods of diagnosis of ovarian cancer, compositions and methods of screening for modulators of ovarian cancer
JP2005518782A (ja) 2001-09-17 2005-06-30 プロテイン デザイン ラブス， インコーポレイテッド ガンの診断方法、ガンのモジュレータのスクリーニング組成物及び方法
US20070042360A1 (en) 2001-09-17 2007-02-22 Eos Biotechnology, Inc. Methods of diagnosis of cancer, compositions and methods of screening for modulators of cancer
ES2326964T3 (es) 2001-10-25 2009-10-22 Genentech, Inc. Composiciones de glicoproteina.
US20030232350A1 (en) 2001-11-13 2003-12-18 Eos Biotechnology, Inc. Methods of diagnosis of cancer, compositions and methods of screening for modulators of cancer
WO2003042661A2 (en) 2001-11-13 2003-05-22 Protein Design Labs, Inc. Methods of diagnosis of cancer, compositions and methods of screening for modulators of cancer
US20040093621A1 (en) 2001-12-25 2004-05-13 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd Antibody composition which specifically binds to CD20
WO2003085119A1 (fr) 2002-04-09 2003-10-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Procede d'amelioration de l'activite d'une composition d'anticorps de liaison avec le recepteur fc$g(g) iiia
CA2481920A1 (en) 2002-04-09 2003-10-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Antibody composition-containing medicament
BR0309145A (pt) 2002-04-09 2005-02-01 Kyowa Hakko Kogyo Kk Células das quais o genoma é modificado
CA2481837A1 (en) 2002-04-09 2003-10-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Production process for antibody composition
ATE503829T1 (de) 2002-04-09 2011-04-15 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd Zelle mit erniedrigter oder deletierter aktivität eines am gdp-fucosetransport beteiligten proteins
AU2003236019A1 (en) 2002-04-09 2003-10-20 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Drug containing antibody composition appropriate for patient suffering from Fc Gamma RIIIa polymorphism
AU2003239966B9 (en) 2002-06-03 2010-08-26 Genentech, Inc. Synthetic antibody phage libraries
US20060241067A1 (en) 2002-06-25 2006-10-26 Varner Judith A Methods For inhibiting angiogenesis, cell migration, cell adhesion, and cell survival
US7361740B2 (en) 2002-10-15 2008-04-22 Pdl Biopharma, Inc. Alteration of FcRn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis
US7285268B2 (en) 2002-11-26 2007-10-23 Pdl Biopharma, Inc. Chimeric and humanized antibodies to α5β1 integrin that modulate angiogenesis
EP1575516B1 (en) * 2002-11-26 2012-05-30 Abbott Biotherapeutics Corp. Chimeric and humanized antibodies to alpha5 beta1 integrin that modulate angiogenesis
WO2004048938A2 (en) 2002-11-26 2004-06-10 Protein Design Labs, Inc. Methods of detecting soft tissue sarcoma, compositions and methods of screening for soft tissue sarcoma modulators
US7276589B2 (en) 2002-11-26 2007-10-02 Pdl Biopharma, Inc. Chimeric and humanized antibodies to α5β1 integrin that modulate angiogenesis
PL212899B1 (pl) 2002-12-16 2012-12-31 Genentech Inc Humanizowane przeciwcialo, kompozycja zawierajaca to przeciwcialo, wyrób fabryczny, przeciwcialo lub jego fragment do zastosowania w sposobie indukowania apoptozy, izolowany kwas nukleinowy, wektor ekspresji, komórka gospodarza, sposób wytwarzania przeciwciala lub jego fragmentu, plynny preparat i zastosowanie przeciwciala do wytwarzania leku
EP1585767A2 (en) 2003-01-16 2005-10-19 Genentech, Inc. Synthetic antibody phage libraries
US7871607B2 (en) 2003-03-05 2011-01-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminoglycanases
US20060104968A1 (en) 2003-03-05 2006-05-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminogly ycanases
WO2004089988A2 (en) * 2003-04-03 2004-10-21 Protein Design Labs, Inc Inhibitors of integrin alpha5beta1 and their use for the control of tissue granulation
SI1638941T1 (sl) 2003-05-22 2010-11-30 Abbott Lab Inhibitorji indazol benzizoksazol in benzizotiazol kinaze
US20050106667A1 (en) 2003-08-01 2005-05-19 Genentech, Inc Binding polypeptides with restricted diversity sequences
WO2005044853A2 (en) 2003-11-01 2005-05-19 Genentech, Inc. Anti-vegf antibodies
CA2542046A1 (en) 2003-10-08 2005-04-21 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Fused protein composition
CA2542125A1 (en) 2003-10-09 2005-04-21 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Process for producing antibody composition by using rna inhibiting the function of .alpha.1,6-fucosyltransferase
HUE031632T2 (en) 2003-11-05 2017-07-28 Roche Glycart Ag Antigen binding molecules with enhanced Fc receptor binding affinity and effector function
BR122018071808B8 (pt) 2003-11-06 2020-06-30 Seattle Genetics Inc conjugado
JPWO2005053742A1 (ja) 2003-12-04 2007-06-28 協和醗酵工業株式会社 抗体組成物を含有する医薬
ES2376556T3 (es) * 2004-03-24 2012-03-14 Abbott Biotherapeutics Corp. Utilización de la anticuerpos anti-alfa5beta1 para inhibir la proliferación de las células cancerosas.
JP5128935B2 (ja) 2004-03-31 2013-01-23 ジェネンテック， インコーポレイテッド ヒト化抗ＴＧＦ−β抗体
US7785903B2 (en) 2004-04-09 2010-08-31 Genentech, Inc. Variable domain library and uses
EP2360186B1 (en) 2004-04-13 2017-08-30 F. Hoffmann-La Roche AG Anti-P-selectin antibodies
US20060008415A1 (en) 2004-06-25 2006-01-12 Protein Design Labs, Inc. Stable liquid and lyophilized formulation of proteins
TWI309240B (en) 2004-09-17 2009-05-01 Hoffmann La Roche Anti-ox40l antibodies
NZ580115A (en) 2004-09-23 2010-10-29 Genentech Inc Cysteine engineered antibody light chains and conjugates
BRPI0515745A (pt) 2004-12-09 2008-08-05 Centocor Inc imunoconjugados de antiintegrina, métodos e usos
EP1957531B1 (en) 2005-11-07 2016-04-13 Genentech, Inc. Binding polypeptides with diversified and consensus vh/vl hypervariable sequences
CN101360736A (zh) 2005-11-23 2009-02-04 阿斯利康(瑞典)有限公司 L-丙氨酸衍生物
EP2091916A2 (en) 2005-11-23 2009-08-26 AstraZeneca AB L-phenylalanine derivatives and their use as integrin antagonists
EP1973951A2 (en) 2005-12-02 2008-10-01 Genentech, Inc. Binding polypeptides with restricted diversity sequences
EP1984330A1 (en) 2006-02-09 2008-10-29 AstraZeneca AB Chemical compounds
SI1989231T1 (sl) * 2006-03-21 2015-10-30 Genentech, Inc., Kombinacijska terapija, ki vključuje alfa5beta 1 antagoniste
JP5298007B2 (ja) 2006-03-21 2013-09-25 ジェネンテック， インコーポレイテッド アルファ５ベータ１アンタゴニストを含むコンビナトリアル療法
TW200812616A (en) 2006-05-09 2008-03-16 Genentech Inc Binding polypeptides with optimized scaffolds
CA2652886A1 (en) 2006-05-24 2007-11-29 Bayer Schering Pharma Aktiengesellschaft High affinity human and humanized anti-.alpha.5.beta.1 integrin function blocking antibodies with reduced immunogenicity
PL2059533T3 (pl) 2006-08-30 2013-04-30 Genentech Inc Przeciwciała wieloswoiste
US20080226635A1 (en) 2006-12-22 2008-09-18 Hans Koll Antibodies against insulin-like growth factor I receptor and uses thereof
CN100592373C (zh) 2007-05-25 2010-02-24 群康科技(深圳)有限公司 液晶显示面板驱动装置及其驱动方法
CN101888878B (zh) 2007-09-26 2014-05-21 健泰科生物技术公司 新型抗体
US8592562B2 (en) 2008-01-07 2013-11-26 Amgen Inc. Method for making antibody Fc-heterodimeric molecules using electrostatic steering effects
CN101970006B (zh) * 2008-02-05 2014-08-06 百时美施贵宝公司 α5-β1抗体和它们的用途
TWI504409B (zh) 2009-03-25 2015-10-21 Genentech Inc 新穎抗－α５β１抗體及其用途

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