CN101646458A - 使用血管发生抑制剂的联合疗法 - Google Patents
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Abstract
本文中公开了使用联合疗法治疗肿瘤的方法,其中以足以治疗或预防受试者中的肿瘤的时间和量施用VEGF拮抗剂和至少能够抑制PDGF受体酪氨酸激酶的蛋白激酶抑制剂。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2007年2月1日提交的美国临时专利申请No.60/887,688的权益,通过述及将其公开内容完整收入本文。
发明背景
血管系统的发育是许多生理性和病理性过程的基本要求。活跃生长中的组织诸如胚胎和肿瘤要求充足的血液供应。它们通过生成促血管发生因子来满足这一需要,所述促血管发生因子经由称为血管发生(angiogenesis)的过程促进新血管形成。血管形成是复杂但有序的生物学事件,涉及所有或许多以下步骤:a)自已有的内皮细胞(EC)增殖出EC或自祖细胞分化出EC;b)EC迁移并接合以形成索样结构;c)血管索然后发生管发生(tubulogenesis)以形成具有中央内腔的血管;d)已有的索或血管伸出芽以形成次生血管;e)初级血管丛发生进一步重塑(remodeling)和整形(reshaping);及f)内皮周细胞(peri-endothelial cell)被募集来包围内皮管,为血管提供维持和调节功能,此类细胞包括用于小毛细血管的周细胞、用于大血管的平滑肌细胞、和心脏中的心肌细胞。Hanahan,D.Science 277:48-50(1997);Hogan,B.L.&Kolodziej,P.A.Nature Reviews Genetics.3:513-23(2002);Lubarsky,B.&Krasnow,M.A.Cell.112:19-28(2003)。
现在完全确立了血管发生涉及多种病症的发病机理。这些包括实体瘤和转移、动脉粥样硬化、晶状体后纤维组织增生、血管瘤、慢性炎症、眼内新血管疾病诸如增殖性视网膜病变例如糖尿病性视网膜病、年龄相关黄斑变性(AMD)、新生血管性青光眼、移植角膜组织和其它组织的免疫排斥、类风湿性关节炎、和银屑病。Folkman等,J.Biol.Chem.,267:10931-10934(1992);Klagsbrun等,Annu.Rev.Physiol.53:217-239(1991);Garner A.,″Vasculardiseases″,在Garner A和Klintworth GK编的《Pathobiology of Ocular Disease.ADynamic Approach》第2版(Marcel Dekker,NY,1994)中,pp 1625-1710。
在肿瘤生长的情况中,血管发生对于自增生至瘤形成的转换,及为肿瘤的生长和转移提供营养似乎是至关重要的。Folkman等,Nature 339:58(1989)。新血管形成(neovascularization)让肿瘤细胞获得了与正常细胞相比的生长优势和增殖自治。肿瘤通常开始于单个异常细胞,由于与可利用毛细管床的距离,该细胞只能增殖至几立方毫米的尺寸,而且它能在较长的一段时间里保持“休眠”状态而不进一步生长和传播。有些肿瘤细胞然后转向血管发生表型以激活内皮细胞,所述内皮细胞增殖并成熟成新的毛细血管。这些新形成的血管不仅让原发性肿瘤继续生长,而且让转移性肿瘤细胞传播并再建群(recolonization)。因而,在肿瘤切片中的微血管密度与乳腺癌及数种其它肿瘤的患者存活之间观察到了相关性。Weidner等,N.Engl.J.Med 324:1-6(1991);Horak等,Lancet 340:1120-1124(1992);Macchiarini等,Lancet340:145-146(1992)。尚未完全了解控制血管发生转换的精确机制,但是认为肿瘤块的新血管形成源自众多血管发生刺激物与抑制物的净平衡(Folkman,Nat Med 1(1):27-31(1995))。
血管发育的过程受到精密调节。迄今为止,多种分子,多为由周围细胞生成的分泌性因子,已显示出调节EC分化、增殖、迁移和接合成索样结构。例如,血管内皮生长因子(VEGF)已鉴定为涉及刺激血管发生和诱导血管通透性的关键因子。Ferrara等,Endocr.Rev.18:4-25(1997)。甚至单个VEGF等位基因的遗失导致胚胎致死的发现指向此因子在血管系统的发育和分化中所发挥的不可代替的作用。此外,VEGF已显示为与肿瘤和眼内病症有关的新血管形成的关键介导物。Ferrara等,Endocr.Rev.见上文。VEGF mRNA在多数所检查的人肿瘤中过表达。Berkman等,J.Clin.Invest.91:153-159(1993);Brown等,Human Pathol.26:86-91(1995);Brown等,Cancer Res.53:4727-4735(1993);Mattern等,Brit.J.Cancer 73:931-934(1996);Dvorak等,Am.J.Pathol.146:1029-1039(1995)。
抗VEGF中和性抗体在裸鼠中遏制多种人肿瘤细胞系的生长(Kim等,Nature 362:841-844(1993);Warren等,J.Clin.Invest.95:1789-1797(1995);等,Cancer Res.56:4032-4039(1996);Melnyk等,Cancer Res.56:921-924(1996)),而且在缺血性视网膜病症模型中还抑制眼内血管发生。Adamis等,Arch.Ophthalmol.114:66-71(1996)。因此,抗VEGF单克隆抗体或其它VEGF作用抑制剂是有希望用于治疗肿瘤和多种眼内新血管病症的候选物。此类抗体记载于例如1998年1月14日公开的EP 817,648和1998年10月15日公开的WO98/45331和WO98/45332。
尽管通过血管发生抑制剂诸如抗VEGF抗体在癌症治疗中实现了重大进步,但人们仍然在寻求改良的疗法,尤其是寻求那些进一步增强整体功效的疗法。
发明概述
本发明提供了用于治疗肿瘤的联合疗法,其中将VEGF拮抗剂与至少具有阻断PDGFR活性的蛋白激酶抑制剂组合,由此产生抗肿瘤活性。在某些实施方案中,VEGF拮抗剂是干扰VEGF对细胞受体的结合的化合物。此类VEGF阻断性拮抗剂的例子包括但不限于对VEGF特异性的可溶性VEGF受体、适体(aptamer)或肽体(peptibody)、和抗VEGF抗体。在一个实施方案中,抗VEGF抗体是贝伐单抗(bevacizumab)。
在一方面,蛋白激酶抑制剂是对PDGFR特异性的。在其它方面,蛋白激酶抑制剂靶向多种RTK,包括PDGFR和VEGFR-2,由此阻断PDGF和VEGF二者途径。在一个实施方案中,蛋白激酶抑制剂是sunitinib()。
本发明的方法可用于治疗不同的癌症,实体瘤和软组织肿瘤类肿瘤二者。本发明的治疗可改善的癌症的非限制性例子包括乳腺癌(breast cancer)、结肠直肠癌(colorectal cancer)、直肠癌(rectal cancer)、非小细胞肺癌(non-smallcell lung cancer)、非何杰金氏淋巴瘤(non-Hodgkin’s lymphoma,NHL)、肾细胞癌(renal cell cancer)、前列腺癌(prostate cancer)、肝癌(liver cancer)、胰腺癌(pancreatic cancer)、软组织肉瘤(soft-tissue sarcoma)、卡波西氏肉瘤(Kaposi’ssarcoma)、类癌癌瘤(carcinoid carcinoma)、头颈癌(head and neck cancer)、黑素瘤(melanoma)、卵巢癌(ovarian cancer)、间皮瘤(mesothelioma)、和多发性骨髓瘤(multiple myeloma)。在某些方面,癌症是转移的。在其它方面,癌症是非转移的。
在某些实施方案中,在癌症诸如肾细胞癌瘤(renal cell carcinoma)、非小细胞肺癌瘤(non-small cell lung carcinoma)、结肠直肠癌瘤(colorectalcarcinoma)、乳腺癌瘤(breast carcinoma)或胰腺癌瘤(pancreatic carcinoma)的联合疗法中使用贝伐单抗和sunitinib。在某些实施方案中,在组合使用时,以大约0.05mg/kg至大约15mg/kg的范围施用贝伐单抗。在一个实施方案中,可以给受试者施用一剂或多剂的大约0.5mg/kg、1.0mg/kg、2.0mg/kg、3.0mg/kg、4.0mg/kg、5.0mg/kg、6.0mg/kg、7.0mg/kg、7.5mg/kg、8.0mg/kg、9.0mg/kg、10mg/kg或15mg/kg(或其任意组合)。此类剂量可以间歇施用,例如每天、每三天、每周或每两至三周。在另一个实施方案中,在组合使用时,给受试者隔周以10mg/kg或每三周以15mg/kg静脉内施用贝伐单抗,且给受试者以日剂量大约25mg至大约50mg口服施用sunitinib一至四周接着停用一至两周。在又一个实施方案中,以25mg/天施用sunitinib两周接着停用一周。
取决于要治疗的具体癌症适应症,本发明的联合疗法可以与别的治疗剂诸如化疗剂或别的疗法诸如放疗或手术组合。可以在本发明的联合疗法中使用许多已知的化疗剂。在某些实施方案中,本发明的联合疗法可以与超过一种的化疗剂组合。在一个实施方案中,本发明的联合疗法与化疗剂帕利他塞(paclitaxel)组合。在另一个实施方案中,本发明的联合疗法与化疗剂卡铂(carboplatin)和帕利他塞组合。在某些实施方案中,会使用那些对于特定适应症的治疗而言是标准的化疗剂。在另一个实施方案中,要在组合中使用的每一种治疗剂的剂量和频率与相应药剂在没有其它药剂的情况中使用时的剂量和频率相同,或比相应药剂在没有其它药剂的情况中使用时的剂量和频率低。
附图简述
图1A和1B描绘了无胸腺裸鼠中已建立的LS174T人结肠癌瘤异种移植物的生长抑制(n=10只每组)。sunitinib和抗VEGF(MAb B20-4.1)的施用日程分别以箭头和箭标示。服药详情见实施例1。图1B是指明存活的Kaplan-Meier图。
图2A和2B描绘了无胸腺裸鼠中已建立的H1299人非小细胞肺癌瘤(NSCLC)异种移植物的生长抑制(n=10只每组)。图2B是指明存活的Kaplan-Meier图。
图3显示了另一项H1299异种移植物生长抑制研究的结果(n=10只每组)。为单一疗法和联合疗法二者使用两种不同sunitinib剂量。服药详情见实施例1。
图4描绘了无胸腺裸鼠中已建立的786-O肾细胞癌瘤(RCC)异种移植物的生长抑制(n=10只每组)。
图5A和5B描绘了无胸腺裸鼠中已建立的Bx-PC3人胰腺癌瘤异种移植物的生长抑制(n=10只每组)。为单一疗法和联合疗法二者使用两种不同sunitinib剂量。服药详情见实施例1。图5B是指明存活的Kaplan-Meier图。
图6描绘了SCID小鼠中已建立的Caki-2肾细胞癌瘤(RCC)异种移植物的生长抑制(n=10只每组)。为单一疗法和联合疗法二者使用两种不同sunitinib剂量。服药详情见实施例1。
图7A和7B总结和比较了Caki-2 RCC异种移植物(7A)和H1299 NSCLC异种移植物(7B)的生长抑制。在每幅图中,只显示了低sunitinib剂量。服药详情见实施例1。
图8A-C图示了所处理的H1299 NSCLC异种移植物中肿瘤的形态学变化。8A显示了不同处理下肿瘤坏死的程度(坏死百分比是通过H&E染色测量的);8B呈现了不同处理下血管密度的变化(是通过PECAM IHC测定的);而8C显示了用抗VEGF(B20-4.1)和sunitinib组合处理的H1299异种移植物中的肿瘤和肿瘤血管系统。
发明详述
I.定义
为了解释本说明书的目的,应用以下定义,而且在任何适宜的时候,以单数使用的术语也会包括复数,反之亦然。在下文所列任何定义与通过述及收入本文的任何文件抵触的情况中,应当以下文所列定义为准。
术语“VEGF”或“VEGF-A”用于指165个氨基酸的人血管内皮细胞生长因子及相关的121个、189个和206个氨基酸的人血管内皮细胞生长因子,如Leung et al.Science,246:1306(1989);及Houck et al.Mol.Endocrin.,5:1806(1991)所述,及其天然存在的等位基因形式和加工形式。VEGF-A是包括VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E、VEGF-F和PlGF在内的基因家族的一部分。VEGF-A主要结合两种高亲和力受体酪氨酸激酶,即VEGFR-1(Flt-1)和VEGFR-2(Flk-1/KDR),后者是VEGF-A血管内皮细胞有丝分裂信号的主要递质。另外,神经毡蛋白-1(neuropilin-1)已经被鉴定为肝素结合VEGF-A同种型(isoform)的受体,而且可在血管发育中发挥作用。术语“VEGF”或“VEGF-A”还指来自非人物种诸如小鼠、大鼠或灵长类动物的VEGF。有时,来自特定物种的VEGF表示如下,hVEGF表示人VEGF,mVEGF表示鼠VEGF。术语“VEGF”还用于指包含165个氨基酸的人血管内皮细胞生长因子的氨基酸第8-109位或第1-109位的截短形式多肽。本申请中可能通过例如“VEGF(8-109)”、“VEGF(1-109)”或“VEGF165”来鉴别任何此类形式VEGF。“截短的”天然VEGF的氨基酸位置如天然VEGF序列中所示编号。例如,截短的天然VEGF中的第17位氨基酸(甲硫氨酸)也是天然VEGF中的第17位(甲硫氨酸)。截短的天然VEGF具有与天然VEGF相当的对KDR和Flt-1受体的结合亲和力。
术语“VEGF变体”如本文中所使用的指在天然VEGF序列中包括一处或多处氨基酸突变的VEGF多肽。任选的是,所述一处或多处氨基酸突变包括氨基酸替代。为了本文中所描述的VEGF变体的速记名称的目的,应注意数字指沿推定天然VEGF氨基酸序列的氨基酸残基位置(在Leung et al.,见上文和Houck et al.,见上文中提供)。
“天然序列”多肽包括与衍生自自然界的多肽具有相同氨基酸序列的多肽。如此,天然序列多肽可以具有来自任何哺乳动物的天然存在多肽的氨基酸序列。此类天然序列多肽可以从自然界分离,或者可以通过重组或合成手段来生产。术语“天然序列”多肽明确涵盖该多肽的天然存在的截短或分泌形式(例如胞外结构域序列)、天然存在的变体形式(例如可变剪接形式)、及天然存在的等位变体。
多肽“变体”意指与天然序列多肽具有至少约80%氨基酸序列同一性的生物学活性多肽。此类变体包括例如在多肽的N-末端或C-末端添加或删除一个或多个氨基酸残基的多肽。通常,变体与天然序列多肽将具有至少约80%的氨基酸序列同一性,更优选的是,至少约90%的氨基酸序列同一性,和甚至更优选的是,至少约95%的氨基酸序列同一性。
“VEGF生物学活性”包括对任何VEGF受体的结合或任何VEGF信号传导活性,诸如调节正常的和异常的血管发生(angiogenesis)和脉管发生(vasculogenesis)(Ferrara和Davis-Smyth(1997)Endocrine Rev.18:4-25;Ferrara(1999)J.Mol.Med.77:527-543);促进胚胎脉管发生和血管发生(Carmeliet etal.(1996)Nature 380:435-439;Ferrara et al.(1996)Nature 380:439-442);及调控雌性生殖道中的和为了骨生长和软骨形成的周期性血管增殖(Ferrara et al.(1998)Nature Med.4:336-340;Gerber et al.(1999)Nature Med.5:623-628)。在作为血管发生和脉管发生中的血管发生因子之外,VEGF,作为多效生长因子,在生理过程诸如内皮细胞存活、血管通透性和血管舒张、单核细胞趋化性和钙流入中展现出多种生物学效应(Ferrara和Davis-Smyth(1997),见上文;及Cebe-Suarez et al.Cell.Mol.Life Sci.63:601-615(2006))。此外,最近的研究报道了VEGF对少数非内皮细胞类型诸如视网膜色素上皮细胞、胰导管细胞、和许旺(Schwann)细胞的促有丝分裂效应(Guerrin et al.(1995)J.CellPhysiol.164:385-394;Oberg-Welsh et al.(1997)Mol.Cell.Endocrinol.126:125-132;Sondell et al.(1999)J.Neurosci.19:5731-5740)。
“血管发生抑制剂”或“抗血管发生剂”指或直接或间接抑制血管发生(angiogenesis)、血管生成(vasculogenesis)、或不想要的血管通透性的小分子量物质、多核苷酸、多肽、分离的蛋白质、重组蛋白、抗体、或其偶联物或融合蛋白。应当理解,抗血管发生剂包括那些结合并阻断血管发生因子或其受体的血管发生活性的药剂。例如,抗血管发生剂是上文定义的血管发生剂的抗体或其它拮抗剂,例如VEGF-A的抗体、VEGF-A受体(例如KDR受体或Flt-1受体)的抗体、抗PDGFR抑制剂诸如(Imatinib Mesylate)。抗血管发生剂还包括天然血管发生抑制剂,例如血管他丁(angiostatin)、内皮他丁(endostatin)等。参见例如Klagsbrun and D’Amore,Annu.Rev.Physiol.53:217-39(1991);Streit and Detmar,Oncogene 22:3172-3179(2003)(例如列举恶性黑素瘤中抗血管发生疗法的表3);Ferrara&Alitalo,Nature Medicine5(12):1359-1364(1999);Tonini等,Oncogene 22:6549-6556(2003)(例如列举已知抗血管发生因子的表2);Sato,Int.J.Clin.Oncol.8:200-206(2003)(例如列举临床试验中所使用的抗血管发生剂的表1)。
“VEGF拮抗剂”指能够中和、阻断、抑制、消除、降低或干扰VEGF活性(包括其与一种或多种VEGF受体的结合)的分子(肽基或非肽基分子)。在某些实施方案中,VEGF拮抗剂将VEGF的表达水平或生物学活性降低或抑制了至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或更多。在一个实施方案中,受到VEGF拮抗剂抑制的VEGF是VEGF(8-109)、VEGF(1-109)、或VEGF165。在本发明的方法中有用的VEGF拮抗剂包括特异性结合VEGF的肽基或非肽基化合物,诸如抗VEGF抗体及其抗原结合片段、特异性结合VEGF的多肽或其片段、和特异性结合VEGF由此使其隔绝与一种或多种受体(例如可溶性VEGF受体蛋白质或其VEGF结合片段,或嵌合VEGF受体蛋白质)结合的受体分子及衍生物、至少与编码VEGF多肽的核酸分子的片段互补的反义核酸寡聚物;至少与编码VEGF多肽的核酸分子的片段互补的小RNA;靶向VEGF的核酶;针对VEGF的肽体;及VEGF适体。
“抗VEGF抗体”指以足够亲和力和特异性结合VEGF的抗体。所选择的抗体通常会具有足够强的对VEGF的结合亲和力,例如,该抗体可以以介于100nM-1pM之间的Kd值结合hVEGF。抗体亲和力可通过例如基于表面等离振子共振的测定法(诸如PCT申请公开文本No.WO2005/012359中所记载的BIAcore测定法);酶联免疫吸附测定法(ELISA);和竞争测定法(例如RIA)来测定。在某些实施方案中,本发明的抗VEGF抗体可用作治疗剂,用于靶向和干扰其中涉及VEGF活性的疾病或疾患。还有,可对该抗体进行其它生物学活性测定法,例如为了评估其作为治疗剂的效力所进行的生物学活性测定法。此类测定法是本领域已知的,而且取决于抗体的靶抗原和预定用途。例子包括HUVEC抑制测定法(如下文实施例中所描述的);肿瘤细胞生长抑制测定法(如例如WO 89/06692中所记载的);抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)和补体介导的细胞毒性(CDC)测定法(美国专利5,500,362);及激动活性或造血测定法(参见WO 95/27062)。抗VEGF抗体通常不会结合其它VEGF同系物,诸如VEGF-B或VEGF-C,也不会结合其它生长因子,诸如PlGF、PDGF或bFGF。
在某些实施方案中,抗VEGF抗体包括与杂交瘤ATCC HB 10709所生成的单克隆抗VEGF抗体A4.6.1;依照Presta et al.Cancer Res.57:4593-4599(1997)生成的重组人源化抗VEGF单克隆抗体结合相同表位的单克隆抗体。在一个实施方案中,抗VEGF抗体是“贝伐单抗”(Bevacizumab,BV),也称作“rhuMAb VEGF”或它包含突变的人IgG1框架区和来自鼠抗hVEGF单克隆抗体A.4.6.1(其阻断人VEGF对其受体的结合)的抗原结合互补决定区。贝伐单抗大约93%的氨基酸序列,包括大部分框架区,衍生自人IgG1,而大约7%的序列衍生自鼠抗体A4.6.1。贝伐单抗具有约149,000道尔顿的分子量,而且是糖基化的。贝伐单抗已经被FDA批准与化疗方案联合用于治疗转移性结肠直肠癌(CRC)和非小细胞肺癌(NSCLC)(Hurwitz et al.,N.Engl.J.Med.350:2335-42(2004);Sandler et al.,N.Engl.J.Med.355:2542-50(2006))。当前,许多正在进行的用于治疗各种癌症适应症的临床试验中正在研究贝伐单抗(Kerbel,J.Clin.Oncol.19:45S-51S(2001);De Vore et al.,Proc.Am.Soc.Clin.Oncol.19:485a.(2000);Hurwitz et al.,Clin.Colorectal Cancer6:66-69(2006);Johnson et al.,Proc.Am.Soc.Clin.Oncol.20:315a(2001);Kabbinavar et al.,J.Clin.Oncol.21:60-65(2003);Miller et al.,Breast Can.Res.Treat.94:Suppl 1:S6(2005))。
贝伐单抗和其它人源化抗VEGF抗体进一步记载于2005年2月26日公告的美国专利No.6,884,879。别的抗体包括G6或B20系列抗体(例如,G6-31、B20-4.1),如PCT公开文本No.WO2005/012359、PCT公开文本No.WO2005/044853、和US专利申请60/991,302中所记载的,通过述及将这些专利申请的内容明确收入本文。关于别的抗体,参见美国专利No.7,060,269;6,582,959;6,703,020;6,054,297;WO98/45332;WO 96/30046;WO94/10202;EP 0666868B1;美国专利申请公开文本No.2006009360,20050186208,20030206899,20030190317,20030203409,和20050112126;及Popkov et al.,Journal of Immunological Methods 288:149-164(2004)。其它抗体包括那些结合人VEGF上功能性表位的抗体,所述功能性表位包含残基F17、M18、D19、Y21、Y25、Q89、I91、K101、E103、和C104或者包含残基F17、Y21、Q22、Y25、D63、I83和Q89。
依照本发明的“G6系列抗体”指自G6抗体的序列衍生的抗VEGF抗体或依照PCT公开文本No.WO2005/012359的图7、24-26、和34-35之任一的G6衍生抗体,通过述及将其整个公开内容收入本文。还可参见PCT公开文本No.WO2005/044853,通过述及将这些专利申请的内容明确收入本文。在一个实施方案中,G6系列抗体结合人VEGF上的功能性表位,该表位包含残基F17、Y21、Q22、Y25、D63、I83和Q89。
依照本发明的“B20系列抗体”指自B20抗体的序列衍生的抗VEGF抗体或依照PCT公开文本No.WO2005/012359的图27-29之任一的B20衍生抗体,通过述及将其整个公开内容收入本文。还可参见PCT公开文本No.WO2005/044853和美国专利申请60/991,302,通过述及将这些专利申请的内容明确收入本文。在一个实施方案中,B20系列抗体结合人VEGF上的功能性表位,其包含残基F17、M18、D19、Y21、Y25、Q89、I91、K101、E103、和C104。
依照本发明的“功能性表位”指抗原中有力地促进抗体结合的氨基酸残基。有力促进抗原中残基任一个的突变(例如,通过丙氨酸或同系物突变对野生型VEGF进行的突变)会破坏抗体的结合,使得抗体的相对亲和力比值(IC50突变型VEGF/IC50野生型VEGF)会大于5(参见WO2005/012359的实施例2)。在一个实施方案中,相对亲和力比是通过溶液结合噬菌体展示ELISA测定的。简言之,将96孔Maxisorp免疫板(NUNC)用Fab形式的待测试抗体以PBS中2ug/ml的浓度于4℃包被过夜,并用PBS、0.5%BSA、和0.05%Tween20(PBT)于室温封闭2小时。首先将展示hVEGF丙氨酸点突变体(残基8-109形式)或野生型hVEGF(8-109)的噬菌体在PBT中的连续稀释液在Fab包被的板上于室温温育15分钟,并用PBS、0.05%Tween20(PBST)清洗板。用在PBT中1∶5000稀释的抗M13单克隆抗体辣根过氧化物酶(AmershamPharmacia)偶联物检测所结合的噬菌体,用3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB,Kirkegaard&Perry Labs,Gaithersburg,MD)底物显色大约5分钟,用1.0MH3PO4淬灭,并以分光光度法于450nm读数。IC50值的比(IC50,ala/IC50,wt)代表了结合亲和力的降低倍数(相对结合亲和力)。
贯穿本说明书和权利要求书,本文中免疫球蛋白重链残基的编号方式是如Kabat等,《Sequences of Proteins of Immunological Interest》,第5版,PublicHealth Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991)中的EU索引的编号方式,明确收入本文作为参考。“如Kabat中的EU索引”指人IgG1 EU抗体的残基编号方式。
术语“抗体”在本文中以最广义使用,明确覆盖单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、及抗体片段,只要它们展现出期望的生物学活性。
在一个实施方案中,依照本发明的“Kd”或“Kd值”是通过如下测定法所述使用Fab型式的抗体和VEGF分子进行的放射性标记VEGF结合测定法(RIA)来测量的:通过在存在未标记VEGF的滴定系列的条件下,用最小浓度的125I标记VEGF(109)平衡Fab,然后用抗Fab抗体包被的平板捕捉结合的VEGF来测量Fab对VEGF的溶液结合亲和力(Chen,et al.,J Mol Biol 293:865-881(1999))。为了确定测定条件,用50mM碳酸钠(pH 9.6)中的5μg/ml捕捉用抗Fab抗体(Cappel Labs)包被微量滴定板(Dynex)过夜,随后用PBS中的2%(w/v)牛血清清蛋白在室温(约23℃)封闭2-5小时。在非吸附平板(Nunc#269620)中,将100pM或26pM[125I]-VEGF(109)与连续稀释的目的Fab(例如如Presta etal.,Cancer Res.57:4593-4599(1997)中的Fab-12)混合。然后将目的Fab保温过夜;不过,保温可持续65个小时以保证达到平衡。此后,将混合物转移至捕捉板以进行室温保温1小时。然后除去溶液,并用含0.1%20的PBS洗板8次。平板干燥后,加入150μl/孔闪烁液(MicroScint-20;Packard),然后在Topcount伽马计数器(Packard)上对平板计数10分钟。选择各Fab给出小于或等于最大结合之20%的浓度用于竞争性结合测定法。依照另一实施方案,Kd或Kd值是通过表面等离振子共振测定法使用BIAcoreTM-2000或BIAcoreTM-3000(BIAcore,Inc.,Piscataway,NJ)在25℃使用固定化hVEGF(8-109)CM5芯片在约10个响应单位(RU)测量的。简而言之,依照供应商的说明书用盐酸N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)-碳化二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化羧甲基化右旋糖苷生物传感器芯片(CM5,BIAcore Inc.)。用10mM乙酸钠pH 4.8将人VEGF稀释至5μ/ml(约0.2μM),然后以5μl/分钟的流速注入至获得约10个响应单位(RU)的偶联蛋白质。注入人VEGF后,注入1M乙醇胺以封闭未反应基团。为了进行动力学测量,在25℃以约25μl/分钟的流速注入在含0.05%20的PBS(PBST)中两倍连续稀释的Fab(0.78nM至500nM)。使用简单一对一朗格缪尔(Langmuir)结合模型(BIAcore Evaluation Software version 3.2)通过同时拟合结合和解离传感图计算结合速率(kon)和解离速率(koff)。平衡解离常数(Kd)以比率koff/kon计算。参见例如Chen,Y.,et al.,J Mol Biol 293:865-881(1999)。如果根据上文表面等离振子共振测定法,结合速率超过106M-1S-1,那么结合速率可使用荧光淬灭技术来测定,即根据分光计诸如配备了断流装置的分光光度计(a stop-flowequipped spectrophometer)(Aviv Instruments)或8000系列SLM-AmincoTM分光光度计(ThermoSpectronic)中用搅拌比色杯的测量,在存在浓度渐增的人VEGF短形式(8-109)或小鼠VEGF的条件下,测量PBS,pH 7.2中的20nM抗VEGF抗体(Fab形式)在25℃的荧光发射强度(激发=295nm;发射=340nm,16nm带通(band pass))的升高或降低。
“阻断性”抗体或抗体“拮抗剂”指抑制或降低其所结合的抗原的生物学活性的抗体。例如,VEGF特异性拮抗性抗体结合VEGF并抑制VEGF诱导血管内皮细胞增殖的能力。在某些实施方案中,阻断性抗体或拮抗性抗体完全抑制抗原的生物学活性。
除非另有说明,表述“多价抗体”贯穿本说明书用于指包含三个或更多抗原结合位点的抗体。多价抗体优选改造成具有三个或更多个抗原结合位点,而且一般不是天然序列IgM或IgA抗体。
“Fv”片段是包含完整抗原识别和结合位点的抗体片段。该区域由紧密结合(该结合的本质可以是共价的,例如在scFv中)的一个重链可变域(区)和一个轻链可变域(区)的二聚体组成。正是在这种构造中,每个可变域(区)的三个CDR相互作用而在VH-VL二聚体表面上限定了一个抗原结合位点。六个CDR或其子集一起赋予抗体以抗原结合特异性。然而,即使是单个可变域(区)(或是只包含对抗原特异性的三个CDR的半个Fv)也具有识别和结合抗原的能力,只是通常亲和力低于完整结合位点。
在用于本文时,“抗体可变域(区)”指抗体分子的轻链和重链中包含互补决定区(CDR;即CDR1、CDR2、和CDR3)和框架区(FR)氨基酸序列的那部分。VH指重链可变域(区)。VL指轻链可变域(区)。依照本发明所使用的方法,归为CDR和FR的氨基酸位置可以依照Kabat(Sequences of Proteins ofImmunological Interest(National Institutes of Health,Bethesda,Md.,1987和1991))来限定。抗体或抗原结合片段的氨基酸编号方式也依照Kabat的氨基酸编号。
在用于本文时,术语“互补决定区(CDR;即CDR1、CDR2、和CDR3)指抗体可变域(区)中其存在是抗原结合所必需的氨基酸残基。每个可变域通常具有三个CDR,鉴定为CDR1、CDR2和CDR3。每个互补决定区可以包含来自如Kabat定义的“互补决定区”的氨基酸残基(即大约是轻链可变域的残基24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)及重链可变域的残基31-35(H1)、50-65(H2)和95-102(H3);Kabat等,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5thEd.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD.(1991))和/或来自“高变环”的残基(即大约是轻链可变域的残基26-32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)及重链可变域的残基26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3);Chothia and Lesk,J.Mol.Biol.196:901-917(1987))。在有些情况中,互补决定区可以包含来自Kabat定义的CDR和高变环二者的氨基酸。例如,抗体4D5重链的CDRH1包含氨基酸26-35。
“框架区”(以下的FR)指可变域中CDR残基以外的残基。每个可变域通常具有四个FR,鉴定为FR1、FR2、FR3和FR4。如果CDR是依照Kabat定义的,那么轻链FR残基位于大约轻链残基1-23(LCFR1)、35-49(LCFR2)、57-88(LCFR3)、和98-107(LCFR4),而重链FR残基位于大约重链残基1-30(HCFR1)、36-49(HCFR2)、66-94(HCFR3)、和103-113(HCFR4)。如果CDR包含来自高变环的氨基酸残基,那么轻链FR残基位于大约轻链残基1-25(LCFR1)、33-49(LCFR2)、53-90(LCFR3)、和97-107(LCFR4),而重链FR残基位于大约重链残基1-25(HCFR1)、33-52(HCFR2)、56-95(HCFR3)、和102-113(HCFR4)。在有些情况中,在CDR包含来自Kabat定义的CDR和高变环二者的氨基酸时,FR残基将做相应的调整。例如,当CDRH1包含氨基酸H26-H35时,重链FR1残基位于1-25位,而FR2残基位于36-49位。
“Fab”片段包含轻链的可变域和恒定域及重链的可变域和第一恒定域(CH1)。F(ab′)2抗体片段包含一对Fab片段,它们一般在它们羧基末端附近通过它们之间的铰链半胱氨酸共价连接。本领域还知道抗体片段的其它化学偶联形式。
“单链Fv”或“scFv”抗体片段包含抗体的VH和VL结构域,其中这些结构域存在于一条多肽链上。一般而言,Fv多肽在VH与VL结构域之间进一步包含多肽接头,其使得scFv能够形成结合抗原的期望结构。关于scFv的综述参见Pluckthun,于《The Pharmacology of Monoclonal Antibodies》,第113卷,Rosenburg和Moore编,Springer-Verlag,New York,第269-315页,1994。
术语“双抗体(diabody)”指具有两个抗原结合位点的小型抗体片段,该片段在同一条多肽链(VH及VL)中包含相连的重链可变域(VH)和轻链可变域(VL)。通过使用过短的接头使得同一条链上的两个结构域之间不能配对,迫使这些结构域与另一条链的互补结构域配对,从而产生两个抗原结合位点。双抗体更完整的记载于例如EP 404,097;WO 93/11161;Hollinger等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448(1993)。
表述“线性抗体”指Zapata等,Protein Eng,8(10):1057-1062(1995)中所描述的抗体。简言之,这些抗体包含一对串联的Fd区段(VH-CH1-VH-CH1),该区段与互补的轻链多肽一起形成抗原结合区对。线性抗体可以是双特异性的,或者是单特异性的。
术语“单克隆抗体”在用于本文时指从一群基本上同质的抗体获得的抗体,即构成群体的各抗体个体是相同的,除了可以以极小量存在的可能的天然存在突变形式外。单克隆抗体是高度特异性的,针对单一抗原性位点。此外,与典型的包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的常规(多克隆)抗体制备物不同,每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。修饰语“单克隆”指示抗体从基本上同质的抗体群获得的特征,不应解释为要求通过任何特定方法来生成抗体。例如,将依照本发明使用的单克隆抗体可通过最初由Kohler等Nature 256:495,(1975)记载的杂交瘤方法来制备,或者可通过重组DNA方法来制备(参见例如美国专利No.4,816,567)。“单克隆抗体”还可使用例如Clackson等Nature 352:624-628,(1991)和Marks等J.Mol.Biol.222:581-597,(1991)中记载的技术从噬菌体抗体库分离。
单克隆抗体在本文中明确包括“嵌合”抗体(免疫球蛋白),其中重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源,而链的剩余部分与衍生自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源,以及此类抗体的片段,只要它们展现出期望的生物学活性(美国专利No.4,816,567;Morrison等Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6851-6855),(1984)。
非人(例如鼠)抗体的“人源化”形式指最低限度包含衍生自非人免疫球蛋白的序列的嵌合抗体。在极大程度上,人源化抗体指人免疫球蛋白(受体抗体)中的高变区残基用具有期望特异性、亲和力和能力的非人物种(供体抗体)诸如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类的高变区残基替换的免疫球蛋白。在有些情况中,将人免疫球蛋白的Fv框架区(FR)残基用相应的非人残基替换。此外,人源化抗体可包含在受体抗体或供体抗体中没有发现的残基。进行这些修饰是为了进一步改进抗体的性能。通常,人源化抗体包含至少一个、通常两个基本上整个如下可变区,其中所有或基本上所有高变环对应于非人免疫球蛋白的高变环,且所有或基本上所有FR区是人免疫球蛋白序列的FR。人源化抗体任选还包含至少部分免疫球蛋白恒定区(Fc),通常是人免疫球蛋白的恒定区。更多细节参见Jones et al.,Nature 321:522-525(1986);Riechmannet al.,Nature 332:323-329(1988);Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992)。
“人抗体”指拥有与由人生成的抗体的氨基酸序列对应的氨基酸序列和/或使用本文所公开的用于生成人抗体的任何技术生成的抗体。人抗体的这种定义明确排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。人抗体可使用本领域已知的多种技术来生成。在一个实施方案中,人抗体是从噬菌体文库选择的,该噬菌体文库表达人抗体(Vaughan et al.,Nature Biotechnology 14:309-314(1996);Sheets et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.95:6157-6162(1998);Hoogenboomand Winter,J.Mol.Biol.227:381(1991);Marks et al.,J.Mol.Biol.222:581(1991))。人抗体还可通过将人免疫球蛋白基因座导入内源免疫球蛋白基因已经部分或完全灭活的转基因动物(例如小鼠)来生成。在受到攻击时,观察到人抗体生成,它在所有方面与在人体中看到的极其相似,包括基因重排、装配和抗体全集。这种方法记载于例如美国专利No.5,545,807;5,545,806;5,569,825;5,625,126;5,633,425;5,661,016,及以下科学出版物:Marks et al.,Bio/Technology 10:779-783(1992);Lonberg et al.,Nature 368:856-859(1994);Morrison,Nature 368:812-13(1994);Fishwild et al.,Nature Biotechnology14:845-51(1996);Neuberger,Nature Biotechnology 14:826(1996);Lonberg andHuszar,Intern.Rev.Immunol.13:65-93(1995)。或者,人抗体可通过生成针对靶抗原的抗体的人B淋巴细胞的永生化来制备(此类B淋巴细胞可从个体回收,或者可在体外免疫)。参见例如Cole et al.,Monoclonal Antibodies andCancer Therapy,Alan R.Liss,p.77(1985);Boerner et al.,J.Immunol.147(1):86-95(1991);及美国专利No.5,750,373。
“亲和力成熟的”抗体指在抗体的一个或多个CDR中具有一处或多处改变、导致该抗体对抗原的亲和力与没有这些改变的亲本抗体相比有所改进的抗体。优选的亲和力成熟的抗体具有纳摩尔或甚至皮摩尔量级的对靶抗原的亲和力。亲和力成熟的抗体可通过本领域已知规程来生成。Marks et al.,Bio/Technology 10:779-783(1992)记载了通过VH和VL结构域改组进行的亲和力成熟。以下文献记载了CDR和/或框架残基的随机诱变:Barbas et al.,Proc.Nat.Acad Sci.USA 91:3809-3813(1994);Schier et al.,Gene 169:147-155(1995);Yelton et al.,J.Immunol.155:1994-2004(1995);Jackson et al.,J.Immunol.154(7):3310-9(1995);Hawkins et al.,J.Mol.Biol.226:889-896(1992)。
抗体的“功能性抗原结合位点”指能够结合靶抗原的位点。抗原结合位点的抗原结合亲和力不必像衍生该抗原结合位点的亲本抗体那样强,但是结合抗原的能力必须是使用已知用于评估抗体对抗原结合的多种方法之任一可测量到的。此外,本文中多价抗体的每个抗原结合位点的抗原结合亲和力不必在量上相同。对于本文中的多聚体抗体,功能性抗原结合位点的数目可以使用超速离心分析来评估,如美国专利申请公开文本No.20050186208中所记载的。依照这种分析方法,将靶抗原与多聚体抗体以不同比例混合,并计算复合物的平均分子量,其中假设不同数目的功能性结合位点。将这些理论值与得到的实际实验值进行比较以评估功能性结合位点的数目。
具有指定抗体的“生物学特征”的抗体指拥有该指定抗体区别于其它结合相同抗原的抗体的一项或多项生物学特征的抗体。
为了筛选结合抗原上感兴趣抗体所结合的表位的抗体,可以实施常规交叉阻断测定法,诸如Antibodies,A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory,Ed Harlow and David Lane(1988)中所记载的。
“物种依赖性抗体”指这样一种抗体,其对来自第一哺乳动物物种的抗原具有强于对来自第二哺乳动物物种的该抗原同系物的结合亲和力。通常,物种依赖性抗体“特异性结合”人类抗原(即具有不超过约1x10-7M,优选不超过约1x10-8M,最优选不超过约1x10-9M的结合亲和力(Kd)),但对来自第二非人哺乳动物物种的该抗原同系物具有比其对人类抗原的结合亲和力弱至少约50倍,或至少约500倍,或至少约1000倍的结合亲和力。物种依赖性抗体可以是如上定义的各种类型的抗体。在一个实施方案中,物种依赖性抗体是人源化抗体或人抗体。
在用于本文时,“抗体突变体”或“抗体变体”指物种依赖性抗体的氨基酸序列变体,其中物种依赖性抗体的一个或多个氨基酸残基发生了修饰。此类突变体与物种依赖性抗体必然具有小于100%的序列同一性或相似性。在一个的实施方案中,抗体突变体所具有的氨基酸序列与物种依赖性抗体的重链或轻链可变域的氨基酸序列具有至少75%、更优选至少80%、更优选至少85%、更优选至少90%、最优选至少95%的氨基酸序列同一性或相似性。关于此序列的同一性或相似性在本文中定义为在比对序列并在必要时引入缺口以实现最大百分比序列同一性后,候选序列中与物种依赖性抗体残基相同(即相同残基)或相似(即根据共同侧链特性来自同一组的氨基酸残基,见下文)的氨基酸残基的百分比。N-末端、C-末端、或内部的延伸、删除、或插入可变域(区)以外的抗体序列都不应视为影响序列同一性或相似性。
为了延长包含本发明氨基酸序列的抗体或多肽的半衰期,可如例如美国专利No.5,739,277中所记载的将补救受体结合表位附着于抗体(尤其是抗体片段)。例如,可以将编码补救受体结合表位的核酸分子与编码本发明多肽序列的核酸在同一读码框内相连接,使得由改造后的核酸分子编码的融合蛋白包含补救受体结合表位和本发明的多肽序列。在用于本文时,术语“补救受体结合表位”指IgG分子(例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)的Fc区中负责延长IgG分子体内血清半衰期的表位(例如Ghetie et al.,Ann.Rev.Immunol.18:739-766(2000),表1)。其Fc区中有替代且血清半衰期延长的抗体还记载于WO00/42072;WO 02/060919;Shields et al.,J.Biol.Chem.276:6591-6604(2001);Hinton,J.Biol.Chem.279:6213-6216(2004))。在另一个实施方案中,还可以通过例如附着其它多肽序列来延长血清半衰期。例如,可以将在本发明的方法中有用的抗体或其它多肽附着于血清清蛋白或血清清蛋白中结合FcRn受体或血清清蛋白结合肽的那部分,使得血清清蛋白结合该抗体或多肽,例如此类多肽序列披露于WO01/45746。在一个优选的实施方案中,待附着的血清清蛋白肽包含氨基酸序列DICLPRWGCLW。在另一个实施方案中,Fab的半衰期通过这些方法得到了延长。血清清蛋白结合肽序列还可参见Dennis et al.,J.Biol.Chem.277:35035-35043(2002)。
“嵌合VEGF受体蛋白”指具有衍生自至少两种不同蛋白质(其中至少一种是VEGF受体蛋白)的氨基酸序列的VEGF受体分子。在某些实施方案中,嵌合VEGF受体蛋白能够结合VEGF并抑制VEGF的生物学活性。
“分离的”多肽或“分离的”抗体指已经鉴定且自其天然环境的一种成分分开和/或回收的多肽或抗体。其天然环境的污染性成分指将会干扰该多肽或抗体的诊断或治疗用途的物质,可包括酶、激素、和其它蛋白质性质或非蛋白质性质的溶质。在一个实施方案中,将多肽或抗体纯化至(1)根据Lowry法的测定,多肽或抗体重量超过95%,最优选重量超过99%,(2)足以通过使用转杯式测序仪获得至少15个残基的N-末端或内部氨基酸序列的程度,或(3)根据还原性或非还原性条件下的SDS-PAGE及使用考马斯蓝或优选银染色,达到同质。既然多肽或抗体天然环境的至少一种成分不会存在,那么分离的多肽或抗体包括重组细胞内的原位多肽或抗体。然而,分离的多肽或抗体通常将通过至少一个纯化步骤来制备。
“片段”指多肽和核酸分子的一部分,其含有参比核酸分子或多肽全长的至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、或更多。所述片段可含有10、20、30、40、50、60、70、80、90、或100、200、300、400、500、600、或更多个核苷酸,或者10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、190、200或更多个氨基酸。
“处理”和“治疗”(treatment)指治疗性处理和预防性措施二者。需要治疗的受试者包括那些早就患有良性、癌前、或非转移性肿瘤的受试者以及要预防肿瘤发生或复发的受试者。
术语“治疗有效量”指在哺乳动物中治疗或预防疾病或病症的治疗剂量。在癌症的情况中,治疗有效量的治疗剂可减少癌细胞的数目;缩小原发性肿瘤的大小;抑制(即一定程度的减缓,优选阻止)癌细胞浸润入周围器官;抑制(即一定程度的减缓,优选阻止)肿瘤转移;一定程度的抑制肿瘤生长;和/或一定程度的减轻一种或多种与病症有关的症状。根据药物可阻止现有癌细胞生长和/或杀死现有癌细胞的程度,它可以是细胞抑制性的和/或细胞毒性的。对于癌症疗法,体内功效可以通过例如评估存活持续时间、距疾病进展的时间(time to disease progression,TTP)、响应率(RR)、响应持续时间、和/或生活质量来测量。
术语“癌(症)”和“癌(性)的”指向或描述哺乳动物中典型的以不受调节的细胞生长为特征的生理疾患。此定义中包括良性和恶性癌症。“早期癌症”或“早期肿瘤”指非侵入性的或非转移性的,或者归为0期、I期、或II期癌症的癌症。
术语“癌前”指典型地在癌之前或发展成癌的疾患或生长。“癌前”生长会具有以异常细胞周期调节、增殖、或分化为特征的细胞,这些可通过细胞周期调节、细胞增殖、或分化的标志物来测定。
“发育异常”指组织、器官、或细胞的任何异常生长或发育。优选的是,发育异常是高级的或癌前的。
“转移”指癌自其原发部位传播至身体中的其它位置。癌细胞能脱离原发性肿瘤,渗透入淋巴和血管,经由血流而循环,和在身体中其它地方的正常组织中的远端病灶(转移)中生长。转移可以是当地的或远端的。转移是一个连续过程,视肿瘤细胞自原发性肿瘤脱落、经由血流而传播、并在远端部位停止而定。在新的部位,该细胞建立血供且能生长至形成危及生命的团块。
肿瘤细胞内的刺激性和抑制性分子途径调节这种行为,而且肿瘤细胞与远端部位中的宿主细胞之间的相互作用也是重要的。
“非转移的”指良性的或保留在原发部位且尚未渗透入淋巴或血管系统或渗透至原发部位以外的组织的癌症。一般而言,非转移性癌症指作为0期、I期、或II期癌症和偶尔的III期癌症的任何癌症。
“原发性肿瘤”或“原发性癌”指初始的癌症,而不是位于受试者身体中另一组织、器官、或位置中的转移病灶。
“良性肿瘤”或“良性癌”指仍然局限于起源部位且没有能力渗透、侵入、或转移至远端部位的肿瘤。
“肿瘤载荷”指身体中癌细胞的数目、肿瘤的大小、或癌的量。肿瘤载荷也称作肿瘤负荷。
“肿瘤数目”指肿瘤的数目。
“受试者”指哺乳动物,包括但不限于人或非人哺乳动物,诸如牛、马、犬、绵羊、或猫。在一个实施方案中,受试者指人。
术语“抗癌疗法”指在治疗癌症中有用的疗法。抗癌治疗剂的例子包括但不限于例如化疗剂、生长抑制剂、细胞毒剂、放射疗法中所使用的药剂、抗血管发生剂、凋亡剂、抗微管蛋白剂、和其它治疗癌症的药剂,诸如抗HER-2抗体、抗CD20抗体、表皮生长因子受体(EGFR)拮抗剂(例如酪氨酸激酶抑制剂)、HER1/EGFR抑制剂(例如erlotinib(TarcevaTM))、血小板衍生生长因子抑制剂(例如GleevecTM(Imatinib Mesylate))、COX-2抑制剂(例如celecoxib)、干扰素、细胞因子、结合一种或多种以下靶物的拮抗剂(例如中和性抗体)(ErbB2、ErbB3、ErbB4、PDGFR-β、BlyS、APRIL、BCMA或VEGF受体、TRAIL/Apo2)、和其它生物活性和有机化学剂,等。本发明还包括它们的组合。
术语“细胞毒剂”在用于本文时指抑制或阻止细胞功能和/或引起细胞破坏的物质。该术语意图包括放射性同位素(例如I131、I125、Y90和Re186)、化疗剂、和毒素诸如细菌、真菌、植物或动物起源的酶活毒素或其片段。
“化疗剂”指可用于治疗癌症的化学化合物。化疗剂的例子包括可用于治疗癌症的化学化合物。化疗剂的例子包括烷化剂类(alkylating agents),诸如塞替派(thiotepa)和环磷酰胺(cyclophosphamide);磺酸烷基酯类(alkyl sulfonates),诸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan);氮丙啶类(aziridines),诸如苯佐替派(benzodepa)、卡波醌(carboquone)、美妥替派(meturedepa)和乌瑞替派(uredepa);乙撑亚胺类(ethylenimines)和甲基蜜胺类(methylamelamines),包括六甲蜜胺(altretamine)、三乙撑蜜胺(triethylenemelamine)、三乙撑磷酰胺(triethylenephosphoramide)、三乙撑硫代磷酰胺(triethylenethiophosphoramide)和三羟甲蜜胺(trimethylolomelamine);番荔枝内酯类(acetogenins)(尤其是布拉他辛(bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone));喜树碱(camptothecin)(包括合成类似物托泊替康(topotecan));苔藓抑素(bryostatin);callystatin;CC-1065(包括其阿多来新(adozelesin)、卡折来新(carzelesin)和比折来新(bizelesin)合成类似物);隐藻素类(cryptophycins)(特别是隐藻素1和隐藻素8);多拉司他汀(dolastatin);duocarmycin(包括合成类似物,KW-2189和CB1-TM1);艾榴塞洛素(eleutherobin);pancratistatin;sarcodictyin;海绵抑素(spongistatin);氮芥类(nitrogen mustards),诸如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、胆磷酰胺(cholophosphamide)、雌莫司汀(estramustine)、异环磷酰胺(ifosfamide)、双氯乙基甲胺(mechlorethamine)、盐酸氧氮芥(mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法仑(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯芥胆甾醇(phenesterine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥(uracil mustard);亚硝脲类(nitrosoureas),诸如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimustine);抗生素类,诸如烯二炔类抗生素(enediyne)(例如加利车霉素(calicheamicin),尤其是加利车霉素γ1I和加利车霉素ωI1(参见例如Agnew(1994)Chem.Intl.Ed.Engl.33:183-186);蒽环类抗生素(dynemicin),包括dynemicin A;二膦酸盐类(bisphosphonates),诸如氯膦酸盐(clodronate);埃斯波霉素(esperamicin);以及新制癌素(neocarzinostatin)发色团和相关色蛋白烯二炔类抗生素发色团)、阿克拉霉素(aclacinomycin)、放线菌素(actinomycin)、氨茴霉素(anthramycin)、偶氮丝氨酸(azaserine)、博来霉素(bleomycin)、放线菌素C(cactinomycin)、carabicin、洋红霉素(carminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycin)、放线菌素D(dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-二氮-5-氧-L-正亮氨酸、多柔比星(doxorubicin)(包括吗啉代多柔比星、氰基吗啉代多柔比星、2-吡咯代多柔比星和脱氧多柔比星)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊达比星(idarubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素类(mitomycins)诸如丝裂霉素C、霉酚酸(mycophenolic acid)、诺拉霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycin)、培洛霉素(peplomycin)、泊非霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑菌素(streptonigrin)、链佐星(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin);抗代谢物类,诸如甲氨蝶呤(methotrexate)和5-氟尿嘧啶(5-FU);叶酸类似物,诸如二甲叶酸(denopterin)、甲氨蝶呤(methotrexate)、蝶罗呤(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate);嘌呤类似物,诸如氟达拉滨(fludarabine)、6-巯基嘌呤(mercaptopurine)、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鸟嘌呤(thioguanine);嘧啶类似物,诸如安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷(azauridine)、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、双脱氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine);雄激素类,诸如卡鲁睾酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)、表硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾内酯(testolactone);抗肾上腺类,诸如氨鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane);叶酸补充剂,诸如亚叶酸(folinic acid);醋葡醛内酯(aceglatone);醛磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside);氨基乙酰丙酸(aminolevulinic acid);恩尿嘧啶(eniluracil);安吖啶(amsacrine);bestrabucil;比生群(bisantrene);依达曲沙(edatraxate);地磷酰胺(defosfamide);地美可辛(demecolcine);地吖醌(diaziquone);elfornithine;依利醋铵(elliptinium acetate);埃坡霉素(epothilone);依托格鲁(etoglucid);硝酸镓;羟脲(hydroxyurea);香菇多糖(lentinan);氯尼达明(lonidamine);美登木素生物碱类(maytansinoids),诸如美登素(maytansine)和安丝菌素(ansamitocin);米托胍腙(mitoguazone);米托蒽醌(mitoxantrone);莫哌达醇(mopidamol);二胺硝吖啶(nitracrine);喷司他丁(pentostatin);蛋氨氮芥(phenamet);吡柔比星(pirarubicin);洛索蒽醌(losoxantrone);鬼臼酸(podophyllinic acid);2-乙基酰肼(ethylhydrazide);丙卡巴肼(procarbazine);多糖复合物(JHS Natural Products,Eugene,OR);雷佐生(razoxane);根霉素(rhizoxin);西佐喃(sizofiran);螺旋锗(spirogermanium);细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid);三亚胺醌(triaziquone);2,2′,2″-三氯三乙胺;单端孢菌素类(trichothecenes)(尤其是T-2毒素、疣孢菌素(verrucarin)A、杆孢菌素(roridin)A和蛇行菌素(anguidin));乌拉坦(urethan);长春地辛(vindesine);达卡巴嗪(dacarbazine);甘露莫司汀(mannomustine);二溴甘露醇(mitobronitol);二溴卫矛醇(mitolactol);哌泊溴烷(pipobroman);gacytosine;阿糖胞苷(arabinoside)(“Ara-C”);环磷酰胺(cyclophosphamide);塞替派(thiotepa);类紫杉醇类(taxoids),例如帕利他塞(paclitaxel)(Bristol-Myers Squibb Oncology,Princeton,N.J.)、ABRAXANETM不含克列莫佛(Cremophor)、清蛋白改造纳米颗粒剂型帕利他塞(American Pharmaceutical Partners,Schaumberg,Illinois)和多西他塞(doxetaxel)(-Poulenc Rorer,Antony,France);苯丁酸氮芥(chlorambucil);吉西他滨(gemcitabine);6-硫鸟嘌呤(thioguanine);巯基嘌呤(mercaptopurine);甲氨蝶呤(methotrexate);铂类似物,诸如顺铂(cisplatin)和卡铂(carboplatin);长春碱(vinblastine);铂(platinum);依托泊苷(etoposide)(VP-16);异环磷酰胺(ifosfamide);米托蒽醌(mitoxantrone);长春新碱(vincristine);长春瑞滨(vinorelbine);能灭瘤(novantrone);替尼泊苷(teniposide);依达曲沙(edatrexate);道诺霉素(daunomycin);氨基蝶呤(aminopterin);希罗达(xeloda);伊本膦酸盐(ibandronate);伊立替康(irinotecan)(Camptosar,CPT-11)(包括伊立替康及5-FU和亚叶酸的治疗方案);拓扑异构酶抑制剂RFS 2000;二氟甲基鸟氨酸(DMFO);类视黄酸类(retinoids),诸如视黄酸(retinoic acid);卡培他滨(capecitabine);考布他汀(combretastatin);亚叶酸(leucovorin)(LV);奥沙利铂(oxaliplatin),包括奥沙利铂治疗方案(FOLFOX);PKC-α、Raf、H-Ras、EGFR(例如erlotinib(TarcevaTM))和VEGF-A的、降低细胞增殖的抑制剂;及任何上述物质的药剂学可接受的盐、酸或衍生物。
该定义还包括作用于调节或抑制激素对肿瘤作用的抗激素剂诸如抗雌激素类和选择性雌激素受体调控物类(SERM),包括例如他莫昔芬(tamoxifen)(包括他莫昔芬)、雷洛昔芬(raloxifene)、屈洛昔芬(droloxifene)、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬(trioxifene)、那洛昔芬(keoxifene)、LY117018、奥那司酮(onapristone)和托瑞米芬(toremifene);抑制在肾上腺中调节雌激素生成的芳香酶的芳香酶抑制剂,诸如例如4(5)-咪唑、氨鲁米特(aminoglutethimide)、醋酸甲地孕酮(megestrolacetate)、依西美坦(exemestane)、福美坦(formestane)、法倔唑(fadrozole)、伏罗唑(vorozole)、来曲唑(letrozole)和阿那曲唑(anastrozole);抗雄激素类,诸如氟他米特(flutamide)、尼鲁米特(nilutamide)、比卡米特(bicalutamide)、亮丙瑞林(leuprolide)、和戈舍瑞林(goserelin);以及曲沙他滨(troxacitabine)(1,3-二氧戊环核苷胞嘧啶类似物);反义寡核苷酸,特别是抑制涉及异常(abherant)细胞增殖的信号途经中的基因表达的反义寡核苷酸,诸如例如PKC-α、Raf和H-Ras;核酶,诸如VEGF表达抑制剂(例如核酸)和HER2表达抑制剂;疫苗,诸如基因疗法疫苗,例如疫苗、疫苗和疫苗;rIL-2;拓扑异构酶1抑制剂;rmRH;长春瑞滨(Vinorelbine)和埃斯波霉素(Esperamicins)(见美国专利No.4,675,187);及任何上述物质的药剂学可接受的盐、酸或衍生物。
“蛋白激酶”指催化γ-磷酸根自ATE转移至蛋白质或肽中Ser/Thr或Tyr侧链上的羟基且密切涉及对多种重要细胞功能(最值得注意的是信号转导、分化、和增殖)的控制的一大类酶。虽然这些蛋白激酶中的每一种磷酸化特定的蛋白质/肽底物,但是它们都在高度保守的口袋中结合相同的第二底物ATP。许多疾病(值得注意的是包括癌症)与蛋白激酶介导的细胞信号传导途径的扰动有联系。
“蛋白激酶抑制剂”指能够阻断一种或多种蛋白激酶活性的大或小分子量化合物。在某些实施方案中,蛋白激酶抑制剂是靶向一种或多种涉及肿瘤生长、病理性血管发生和癌的转移性进展的受体酪氨酸激酶的小分子酪氨酸激酶抑制剂(TKI)。TKI靶向受体的胞内激酶结构域,由此降低或关闭信号转导。在抑制VEGFR之外,许多当前开发的小分子TKI靶向其它受体,尤其是受体酪氨酸激酶的分裂激酶结构域(split kinase domain)家族中的那些。受体酪氨酸激酶的例子包括表皮生长因子受体(EGFR)、血管内皮生长因子受体(VEGFR)、血小板衍生生长因子受体(PDGFR)和成纤维细胞生长因子受体(FGFR)。血小板衍生生长因子(PDGF)是肿瘤相关血管发生的另一种关键介导物。它由许多肿瘤以旁分泌方式分泌,而且认为它促进内皮细胞增殖和基质形成。与VEGF类似,PDGF的生成在低氧条件下上调,诸如那些在血管化不良的肿瘤组织中所看到的。PDGF经多种过程促进肿瘤生长,包括癌细胞的自分泌刺激和基质细胞的旁分泌刺激(Heldin et al.,Physiol Rev79-1283-1316(1999);Sundberg et al.,Am J Pathol 151:479-492(1997))。本领域知道许多治疗性小分子TKI,包括但不限于:vatalanib(PTK787)、erlotinib()、OSI-7904、ZD6474()、ZD6126(ANG453)、ZD1839、sunitinib()、semaxanib(SU5416)、AMG706、AG013736、Imatinib()、MLN-518、CEP-701、PKC-412、Lapatinib(GSK572016)、AZD2171、sorafenib()、XL880、和CHIR-265。
术语“药学可接受盐形式”指那些保留活性化合物诸如sunitinib的生物学效力和特性的盐形式。此类盐包括:(1)酸加成盐,其是通过亲本化合物的游离碱与无机酸(诸如氢氯酸、氢溴酸、硝酸、5磷酸、硫酸、和高氯酸等等)或与有机酸(诸如乙酸、草酸、(D)或(L)苹果酸、马来酸、甲磺酸、乙磺酸、对甲苯磺酸、水杨酸、酒石酸、柠檬酸、琥珀酸或丙二酸等等)的反应而获得的,优选用氢氯酸或(L)-苹果酸,诸如sunitinib的苹果酸盐;或(2)当亲本化合物中存在的酸性质子被金属离子(例如碱金属离子、碱土离子)替换或用有机碱配位时所形成的盐。例示性的离子包括处于其通常化合价的铝、钙、锂、镁、钾、钠和锌。优选的有机碱包括质子化的叔15胺和季铵阳离子,部分包括三甲胺、二乙胺、N,N′-二苄基乙二胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、甲葡胺(N-甲基葡糖胺)和普鲁卡因。
术语“前体药物”在用于本申请时指与母药(parent drug)相比对肿瘤细胞的细胞毒性较小并能够酶促活化或转变为更具活性母药形式的药用活性物质的前体或衍生物形式。参见例如Wilman,“Prodrugs in CancerChemotherapy”,Biochemical Society Transactions,14,pp.375-382,615thMeeting Belfast(1986)和Stella等,“Prodrugs:A Chemical Approach to TargetedDrug Delivery”,Directed Drug Delivery,Borchardt等,编,pp.247-267,HumanaPress(1985)。本发明的前体药物包括但不限于含磷酸盐/酯前体药物、含硫代磷酸盐/酯前体药物、含硫酸盐/酯前体药物、含肽前体药物、D-氨基酸修饰前体药物、糖基化前体药物、含β-内酰胺前体药物、含任选取代苯氧基乙酰胺的前体药物或含任选取代苯乙酰胺的前体药物、可转化为更具活性而无细胞毒性的药物的5-氟胞嘧啶和其它5-氟尿苷前体药物。可衍生为本发明使用的前体药物形式的细胞毒性药物的例子包括但不限于上文描述的那些化疗剂。
“放射疗法”或“放疗”指使用定向伽马射线或贝塔射线来诱发对细胞的足够损伤,以限制细胞正常发挥功能的能力或全然破坏细胞。应当领会,本领域知道许多方式来确定治疗的剂量和持续时间。典型的治疗作为一次施用来给予,而典型的剂量范围为每天10-200个单位(戈瑞(Gray))。
“降低或抑制”指引起20%、30%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、或更多的总体降低的能力。降低或抑制可以指所治疗的病症的症状、转移的存在或大小、原发性肿瘤的大小、或血管发生性病症中血管的大小或数目。
治疗剂
本发明的特色在于在联合疗法中使用VEGF拮抗剂和蛋白激酶抑制剂来治疗受试者中的肿瘤。VEGF拮抗剂指能够结合VEGF,降低VEGF表达水平,或中和、阻断、抑制、消除、降低、或干扰VEGF生物学活性(包括VEGF结合一种或多种VEGF受体和VEGF介导的血管发生和内皮细胞存活或增殖)的分子。作为在本发明的方法中有用的VEGF拮抗剂包括特异性结合VEGF的抗体、抗VEGF抗体及其抗原结合片段、特异性结合VEGF由此使其隔绝与一种或多种受体结合的受体分子及衍生物、融合蛋白(例如VEGF-Trap(Regeneron))、和VEGF121-白树毒素(Peregrine)。VEGF拮抗剂还包括VEGF多肽的拮抗性变体、针对VEGF的RNA适体和肽体。下文描述了这些每一种的例子。
在本发明的方法中有用的抗VEGF抗体包括任何以足够亲和力和特异性结合VEGF且能降低或抑制VEGF生物学活性的抗体或其抗原结合片段。抗VEGF抗体通常不会结合其它VEGF同系物,诸如VEGF-B或VEGF-C,也不会结合其它生长因子,诸如PlGF、PDGF、或bFGF。此类抗VEGF抗体的例子包括但不限于本文中“定义”下所提供的那些。
两种表征最全面的VEGF受体是VEGFR1(也称作Flt-1)和VEGFR2(鼠同系物也称作KDR和FLK-1)。每一种受体对每一种VEGF家族成员的特异性有所不同,但是VEGF-A结合Flt-1和KDR二者。全长Flt-1受体包括具有七个Ig结构域的胞外结构域、跨膜结构域、和具有酪氨酸激酶活性的胞内结构域。胞外结构域涉及VEGF结合,而胞内结构域涉及信号转导。
特异性结合VEGF的VEGF受体分子或其片段可以在本发明的方法中用于结合和隔绝VEGF蛋白,由此阻止它发信号。在某些实施方案中,VEGF受体分子或其VEGF结合片段是可溶性形式,诸如sFlt-1。受体的可溶性形式发挥对VEGF蛋白生物学活性的抑制效应,其通过结合VEGF,由此阻止它结合其在靶细胞表面上存在的天然受体来实现。还包括VEGF受体融合蛋白,下文描述了它们的例子。
嵌合VEGF受体蛋白指具有自至少两种不同蛋白质(其中至少一种是VEGF受体蛋白,例如flt-1或KDR受体)衍生的氨基酸序列且能够结合并抑制VEGF生物学活性的受体分子。在某些实施方案中,本发明的嵌合VEGF受体蛋白由自只有两种不同VEGF受体分子衍生的氨基酸序列组成;然而,可以将包含一个、两个、三个、四个、五个、六个、或所有七个来自flt-1和/或KDR受体胞外配体结合区的Ig样结构域的氨基酸序列连接至来自其它无关蛋白质的氨基酸序列,例如免疫球蛋白序列。与Ig样结构域组合的其它氨基酸序列对于本领域普通技术人员会是显而易见的。嵌合VEGF受体蛋白的例子包括可溶性Flt-1/Fc、KDR/Fc、或FLt 1/KDR/Fc(也称作VEGF Trap)(参见例如PCT申请公开文本No.WO97/44453)。
本发明的可溶性VEGF受体蛋白或嵌合VEGF受体蛋白包括没有经跨膜结构域而固定至细胞表面的VEGF受体蛋白。因此,VEGF受体(包括嵌合受体蛋白)的可溶性形式,虽然能够结合并灭活VEGF,但是不包含跨膜结构域,并如此一般不会变成与该分子在其中表达的细胞的细胞膜相结合。
适体指形成特异性结合靶分子(诸如VEGF多肽)的三级结构的核酸分子。本领域完善建立了适体的生成和治疗性用途。参见例如美国专利No.5,475,096。VEGF适体是PEG化的经修饰寡核苷酸,其采取使之能够结合胞外VEGF的三维构象。靶向VEGF、用于治疗与年龄有关的黄斑变性的在治疗上有效的适体的一个例子是pegaptanib(MacugenTM,OSI)。关于适体的别的信息可见于美国专利申请公开文本No.20060148748。
肽体(peptibody)指连接至编码免疫球蛋白分子的片段或部分的氨基酸序列的肽序列。多肽可以衍生自通过任何用于特异性结合的方法(包括但不限于噬菌体展示技术)选择出的随机化序列。在一个实施方案中,可以将所选择的多肽连接至编码免疫球蛋白的Fc部分的氨基酸序列。特异性结合并拮抗VEGF的肽体在本发明的方法中也是有用的。
在本发明中有用的蛋白激酶抑制剂是那些至少有能力通过靶向PDGFR酪氨酸激酶而阻断PDGF信号传导途径的那些蛋白激酶抑制剂。在某些实施方案中,抑制剂是小分子、非肽化合物。在一个实施方案中,本发明的蛋白激酶抑制剂靶向PDGFR和VEGFR-2酪氨酸激酶二者。PDGFR/VEGFR-2双重抑制剂的例子是sunitinib。
sunitinib(SU11248,Pfizer Inc)是靶向数种相关蛋白质酪氨酸激酶受体(包括PDGFR-β、KIT、和FLT-3)以及三种VEGF受体的口服抑制剂。是sunitinib的苹果酸盐。苹果酸sunitinib在化学上描述为(2S)-羟基-丁二酸,与N-[2-(二乙氨基)乙基]-5-[(Z)-(5-氟-1,2-二氢-2-氧代-3H-吲哚-3-内鎓盐(ylidine))甲基]-2,4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酰胺(N-[2-(diethylamino)ethyl]-5-[(Z)-(5-fluoro-1,2-dihydro-2-oxo-3H-indol-3-ylidine)methyl]-2,4-dimethyl-1H-pyrrole-3-carboxamide)(1∶1)化合。分子式为C22H27FN4O2-C4H6O5(Sun et al.,J Med Chem 41:2588-2603(1998))。临床前研究显示了sunitinib具有经由VEGFR和PDGFR-β介导的抗血管发生效应和多种肿瘤细胞系中经由KIT的直接抗肿瘤活性(Abrams et al.,Mol Cancer Ther2:1011-21(2003);O’Farrell et al.,Blood 101:3597-605(2003))。一项最近在Lewis肺癌瘤肿瘤中进行的研究证明了sunitinib减缓肿瘤生长的进展并削弱转移的发展,尽管它没有引起原发性肿瘤的消退(Osusky et al.,Angiogenesis7:225-33(2004))。基于临床前/临床证据,认为sunitinib在RCC中的活性机制是经由对内皮细胞中的VEGF途径和在支持性周细胞上表达的PDGFR-β的双重抑制(Motzer et al.,JAMA 295:2516-24(2006))。sunitinib最近在美国获得了批准用于晚期肾细胞癌瘤和胃肠基质肿瘤(GIST)。
联合疗法
本发明的特色在于VEGF拮抗剂和蛋白激酶抑制剂的组合使用,作为旨在自这些治疗剂的组合活性提供有益效应的特定治疗方案的一部分。组合的有益效应包括但不限于源自治疗剂组合的药动学或药效学共同作用(co-action)。本发明在治疗各种阶段的、各种类型的癌症中特别有用。
术语癌症涵盖增殖性病症的集合,包括但不限于癌前生长、良性肿瘤、和恶性肿瘤。良性肿瘤仍然局限于起源部位且没有能力渗透、侵入、或转移至远端部位。恶性肿瘤会侵入并损害它们周围的其它组织。它们还能获得脱离起源部位并传播至身体其它部分(转移)(通常经由血流或在淋巴结所处位置经由淋巴系统)的能力。原发性肿瘤以发生它们的组织类型来分类;转移性肿瘤以衍生癌细胞的组织类型来分类。随着时间消逝,恶性肿瘤的细胞变得越来越异常,而且表现出更不像正常细胞。癌细胞外观的这种变化称作肿瘤等级(tumor grade),而且将癌细胞描述为完全分化的(well-differentiated)(低级)、中度分化的(moderately-differentiated)、不良分化的(poorly-differentiated)、或未分化的(undifferentiated)(高级)。完全分化的细胞相当正常,表现为和类似它们起源的正常细胞。未分化的细胞指已经变得如此异常以致于不再可能确定其起源的细胞。
癌症分期系统描述癌症在解剖学上已经传播了多远,而且试图将具有相似预后和处理的患者置于相同分期组中。可实施数项测试来帮助癌症分期,包括活检和某些影像检测诸如胸部x-射线、乳房x射线照片、骨扫描、CT扫描、和MRI扫描。验血和临床评估也用于评估患者的整体健康和检测癌症是否已经传播至某些器官。
为了对癌症分期,美国癌症联合委员会(American Joint Committee onCancer)首先使用TNM分类系统将癌症(特别是实体瘤)置于字母分类中。给癌症指派字母T(肿瘤大小)、N(可触知的结节)、和/或M(转移)。T1、T2、T3、和T4描述渐增的原发性病灶尺寸;N0、N1、N2、N3指示渐进发展中的结节涉及;而M0和M1反映远端转移的存在与否。
在第二种分期方法中,也称作整体阶段分组(Overall Stage Grouping)或罗马数字分期(Roman Numeral Staging),将癌症分成0期至IV期,掺入了原发性病症的尺寸以及结节传播和远端转移的存在。在这种系统中,将癌症分组成四期,以罗马数字I至IV表示,或者归类为“复发”。对于有些癌症,0期称作“原位”或“Tis”,诸如乳腺癌的原位导管癌或原位小叶癌。高级腺瘤也可归类为0期。一般而言,I期癌症是小的局限性癌症,其通常是可治愈的,而IV期通常代表不能手术治疗的或转移性的癌症。II期和III期癌症通常是局部高级的和/或展现出涉及局部淋巴结。一般而言,较高期数指示更严重的(extensive)疾病,包括更大的肿瘤尺寸和/或癌症传播至邻近原发性肿瘤的附近淋巴结和/或器官。这些阶段有精确定义,但是定义对每一种癌症是不同的,而且是熟练技术人员已知的。
许多癌症登记诸如NCI的“监视流行病学和最终结果程序”(Surveillance,Epidemiology,and End Results Program)(SEER)使用概括分期(summarystaging)。这种系统用于所有类型的癌症。它将癌症病历分成五大类:
“原位”指只存在于它开始的细胞层中的早期癌症。
“局限性的”指癌症限于它开始的器官,没有传播的证据。
“区域性的”指癌症已经传播超出起源(原发性)部位至附近的淋巴结或器官和组织。
“远端的”指癌症自原发性部位传播至远端器官或远端淋巴结。
“未知的”用于描述没有足够信息来指明阶段的情况。
另外,癌症在原发性肿瘤被清除后几个月或几年复现是常见的。在所有可见的肿瘤都被根除后复现的癌症称作复发性疾病。在原发性肿瘤的区域中复现的疾病是局部复发的,而作为转移复现的疾病称作远端复发。
肿瘤可以是实体瘤或者是非实体瘤或软组织肿瘤。软组织肿瘤的例子包括白血病(例如慢性髓细胞性白血病(chronic myelogenous leukemia)、急性髓细胞性白血病(acute myelogenous leukemia)、成人急性成淋巴细胞性白血病(adult acute lymphoblastic leukemia)、急性髓细胞性白血病(acute myelogenousleukemia)、成熟B细胞急性成淋巴细胞性白血病(mature B-cell acutelymphoblastic leukemia)、慢性淋巴细胞性白血病(chronic lymphocyticleukemia)、多形核细胞性白血病(polymphocytic leukemia)、或毛细胞性白血病(hairy cell leukemia))或淋巴瘤(例如非何杰金氏淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、或何杰金氏病(Hodgkin’s disease))。实体瘤包括血液、骨髓、或淋巴系统以外的身体组织的任何癌症。实体瘤可进一步分成上皮细胞起源的那些和非上皮细胞起源的那些。上皮细胞实体瘤的例子包括胃肠道、结肠、乳腺、前列腺、肺、肾、肝、胰腺、卵巢、头和颈、口腔、胃、十二指肠、小肠、大肠、肛门、胆囊、唇(labium)、鼻咽、皮肤、子宫、男性生殖器官、泌尿器官、膀胱、和皮肤的肿瘤。非上皮起源的实体瘤包括肉瘤、脑瘤、和骨瘤。
化疗剂
本发明的联合疗法可进一步包含一种或多种化疗剂。组合施用包括使用分开的配制剂或单一药物配制剂的共施用或同时施用,和任一次序的序贯施用,其中有一段时间所有活性剂同时发挥它们的生物学活性。
如果施用的话,由于药物的组合作用或可归于抗代谢物化疗剂施用的消极副作用,通常以关于它们已知的或任选降低的剂量施用化疗剂。可依照制造商的说明书或根据从业人员凭经验确定的那样使用此类化疗剂的制备和剂量给药日程。在一个其中化疗剂是帕利他塞的实施方案中,每周(例如以大约60-90mg/m2)或每3周(例如以大约135-200mg/m2)施用它。合适的多西他塞剂量包括60mg/m2、70mg/m2、75mg/m2、100mg/m2(每3周)、或35mg/m2或40mg/m2(每周)。
上文公开了可组合的多种化疗剂。在某些实施方案中,要组合的化疗剂选自下组:类紫杉醇(taxoid)(包括多西他塞(docetaxel)和帕利他塞(paclitaxel))、长春药(vinca)(诸如长春瑞滨(vinorelbine)或长春碱(vinblastine))、铂化合物(诸如卡铂(carboplatin)或顺铂(cisplatin))、芳香酶抑制剂(诸如来曲唑(letrozole)、阿那曲唑(anastrazole)、或依西美坦(exemestane))、抗雌激素(例如氟维司群(fulvestrant)或他莫昔芬(tamoxifen))、依托泊苷(etoposide)、塞替哌(thiotepa)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、甲氨蝶呤(methotrexate)、脂质体多柔比星(liposomal doxorubicin)、PEG化脂质体多柔比星(pegylated liposomal doxorubicin)、卡培他滨(capecitabine)、吉西他滨(gemcitabine)、COX-2抑制剂(例如塞来考昔(celecoxib))、或蛋白体抑制剂(例如PS342)。在一个实施方案中,本发明的联合疗法与帕利他塞组合。在另一个实施方案中,本发明的联合疗法与卡铂和帕利他塞组合。
配制、剂量和施用
会以与优良医学实践一致的方式配制、剂量给药和施用本发明中所使用的治疗剂。在此内容中考虑的因素包括所治疗的具体病症、所治疗的具体受试者、患者个体的临床状况、病症的起因、投递药剂的部位、施药的方法、施药的日程安排、要组合的药剂的药物-药物相互作用、和医学从业人员知道的其它因素。
使用本领域已知的标准方法通过将具有期望纯度的活性成分与任选的生理学可接受载体、赋形剂或稳定剂混合来制备治疗用配制剂(Remington’sPharmaceutical Sciences(第20版),A.Gennaro编,2000,Lippincott,Williams&Wilkins,Philadelphia,PA)。可接受的载体包括盐水,或缓冲剂,诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸;抗氧化剂,包括抗坏血酸;低分子量(少于约10个残基)多肽;蛋白质,诸如血清清蛋白、明胶或免疫球蛋白;亲水性聚合物,诸如聚乙烯吡咯烷酮;氨基酸,诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸;单糖、二糖和其它碳水化合物,包括葡萄糖、甘露糖或糊精;螯合剂,诸如EDTA;糖醇,诸如甘露醇或山梨醇;成盐相反离子,诸如钠;和/或非离子表面活性剂,诸如TWEENTM、PLURONICSTM或PEG。
任选的是,在一个实施方案中,配制剂含有药学可接受盐,诸如氯化钠,其大约为生理浓度。任选的是,在另一个实施方案中,本发明的配制剂可含有药学可接受防腐剂。在某些实施方案中,防腐剂的浓度范围为0.1-2.0%,典型的是v/v。合适的防腐剂包括药学领域已知的那些。苯甲醇、酚、间甲酚、对羟基苯甲酸甲酯、和对羟基苯甲酸丙酯是优选的防腐剂。任选的是,在又一个实施方案中,本发明的配制剂可包括药学可接受表面活性剂,其浓度为0.005-0.02%。
本文中的配制剂还可含有超过一种所治疗具体适应症所必需的活性化合物,优选活性互补且彼此没有不利影响的那些。合适的是,此类分子以对于预定目的有效的量组合。
活性成分还可包载于例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊中(例如分别是羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)、在胶状药物传递系统中(例如脂质体、清蛋白微球体、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊)、或在粗滴乳状液中。此类技术公开于Remington’s PharmaceuticalSciences,见上文。
可制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适例子包括含有本发明抗体的固体疏水性聚合物半透性基质,该基质以定型产品的形式存在,例如薄膜或微胶囊。持续释放基质的例子包括聚酯、水凝胶(例如聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯(美国专利No.3,773,919)、L-谷氨酸和L-谷氨酸γ-乙酯的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物诸如LUPRON DEPOTTM(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林构成的可注射微球体)及聚-D-(-)-3-羟基丁酸。虽然诸如乙烯-乙酸乙烯和乳酸-乙醇酸等聚合物能够持续释放分子100天以上,但是某些水凝胶释放蛋白质的时间较短。当胶囊化抗体在体内长时间保持时,它们可能由于暴露于37℃的潮湿环境而变性或聚集,导致生物学活性损失和免疫原性可能改变。可根据相关机制来设计稳定化理性策略。例如,如果发现聚集机制是经由硫醇-二硫化物互换而形成分子间S-S键,那么可通过修饰巯基残基、自酸性溶液冻干、控制湿度、采用适宜添加剂、和开发特定的聚合物基质组合物来实现稳定。
依照已知方法给人类患者施用本发明的治疗剂,诸如静脉内施用(像推注或通过一段时间里的连续输注),通过肌肉内、腹膜内、脑脊髓内、皮下、关节内、滑膜内、鞘内、口服、表面、或吸入路径。在VEGF拮抗剂的情况中,如果VEGF拮抗作用与广泛的副作用或毒性有关,那么局部施用是特别想要的。回体(ex vivo)策略也可用于治疗性应用。回体策略涉及用编码VEGF拮抗剂的多核苷酸转染或转导自受试者获得的细胞。然后将经过转染或转导的细胞返回受试者。细胞可以是极其多种类型之任一,包括但不限于造血细胞(例如,骨髓细胞、巨噬细胞、单核细胞、树突细胞、T细胞、或B细胞)、成纤维细胞、上皮细胞、内皮细胞、角质形成细胞、或肌肉细胞。
例如,如果VEGF拮抗剂是抗体,那么通过任何合适手段施用抗体,包括胃肠外、皮下、腹膜内、肺内、和鼻内,及(如果想要局部免疫抑制治疗的话)病灶内施用。胃肠外输注包括肌肉内、静脉内、动脉内、腹膜内、或皮下施用。另外,合适的是,通过脉冲输注来施用抗体,特别是使用递减剂量的抗体。在一个实施方案中,通过注射给予剂量给药。在另一个实施方案中,通过静脉内或皮下注射给予剂量给药,这部分取决于施药是短期的还是长期的。
在另一个例子中,在病症或肿瘤位置允许时,局部施用VEGF拮抗性化合物,例如通过直接注射,而且可以周期性重复注射。也可以在手术切除肿瘤后系统地/全身地将VEGF拮抗剂投递至受试者或直接投递至肿瘤细胞,例如肿瘤或肿瘤床,用以预防或降低局部复发或转移。
组合中的治疗剂的施用通常在规定的时间段里进行(通常是数分钟、数小时、数天或数周,这取决于所选择的组合)。联合疗法旨在涵盖这些治疗剂以序贯方式的施用(也就是说,其中在不同时间施用每一种治疗剂),以及这些治疗剂或治疗剂中至少两种以基本上同时的方式的施用。
可以通过相同路径或不同路径来施用治疗剂。例如,可以通过静脉内注射来施用组合中的VEGF拮抗剂,同时可以口服施用所述组合中的蛋白激酶抑制剂。或者,例如,可以口服施用这两种治疗剂,或者可以通过静脉内注射来施用这两种治疗剂,这取决于具体的治疗剂。治疗剂的施用次序也随着具体药剂而变化。
根据疾病的类型和严重程度,施用于患者的初始候选剂量是约1μg/kg至100mg/kg(例如0.1-20mg/kg)每种治疗剂,例如或是通过一次或多次分开施药或是通过连续输注。根据上文所述因素,典型日剂量的范围可以是约1μg/kg至100mg/kg或更多。对于持续数天或更长的重复施药,根据状况,持续治疗直至根据上文所述方法的测量,癌症得到治疗。然而,其它剂量方案也可能是有用的。在一个例子中,如果VEGF拮抗剂是抗体,那么以范围为大约5mg/kg至大约15mg/kg的剂量每两至三周施用本发明的抗体。如果蛋白激酶抑制剂是口服小分子化合物,那么以范围为大约25mg/天至大约50mg/天的剂量每天施用药物。此外,本发明的口服化合物可以在传统的高剂量间歇方案下施用,或者使用没有安排中断的更低且更频繁的剂量(称作“节拍疗法”(metronomic therapy))来施用。在使用间歇方案时,例如,可以每天给予药物,持续2-3周,接着中断1周;或者,可以每天给予药物,持续4周,接着中断2周,这取决于日剂量和具体适应症。本发明疗法的进展易于通过常规技术和测定法来监测。
以下实施例仅仅意图例示本发明的实施,而非作为限制提供的。本文中所引用的所有专利和科学文献的公开内容完整收录作为参考。
实施例
实施例1:抗VEGF和Sunitinib的组合用于在体内抑制人肿瘤生长
此实验对作为单一疗法和与小分子酪氨酸激酶抑制剂sunitinib组合的抗VEGF单克隆抗体B20-4.1评估针对裸鼠中各种人癌瘤异种移植物的活性。
方法和材料
在异种移植物研究中使用了以下人肿瘤细胞:
LS174T人结肠癌瘤
H1299人非小细胞肺癌瘤
786-O人肾细胞癌瘤
Caki-2人肾细胞癌瘤
Bx-PC3人胰腺癌瘤
使用了雌性无胸腺裸鼠(在研究的第1天为10-11周龄)或C.B-17 SCID小鼠(在研究的第1天为15-16周龄)。自培养的人癌瘤细胞(在H1299细胞的情况中)或自在异种移植小鼠中维持的现有人肿瘤启动异种移植物。每只测试小鼠接受在右侧腹中皮下植入的肿瘤细胞或肿瘤碎片,并监测肿瘤的生长。肿瘤生长一段时间后,时间长度取决于所测试的具体人肿瘤,将小鼠分入不同的组,每组由10只小鼠组成。使用如下公式计算体积:
肿瘤体积(mm3)=(w2x1)/2
其中w=人肿瘤的宽度,而1=人肿瘤的长度,以mm计。假设1mg相当于1mm3肿瘤体积,由此可估算肿瘤重量。
在研究中使用对照IgG抗体和测试MAb B20-4.1以及sunitinib。对照和B20-4.1抗体均以一种剂量水平施用(5mg/kg,i.p.,两周一次(biweekly),至结束)。sunitinib以两种剂量水平施用(25或50mg/kg,p.o.,每天一次,至结束)。
对于在同一天给予一组的联合治疗,在sunitinib剂之前30分钟施用抗体剂。每剂PBS、对照IgG、或B20-4.1以0.2mL每20g体重(10mL/kg)体积施用,而每剂sunitinib或媒介以0.1mL每20g体重(5mL/kg)体积施用。所有剂量依动物的体重缩放。
每周两次使用测径器测量肿瘤。当动物的肿瘤达到终点尺寸2,000mm3时或者在研究结束时,以先发生者为准,将每只动物安乐死。处理结局基于肿瘤生长抑制(TGI)。TGI评估来自一组中所有动物的数据,排除由于处理相关的(TR)或非处理相关的(NTR)原因而死亡的动物,而且定义为处理组与对照组之间最终肿瘤体积中值的差异,表述为对照组的肿瘤体积中值的百分比。在此测定法中产生至少60%TGI的药剂归为有治疗活性的。
处理可引起动物中肿瘤的部分消退(PR)或完全消退(CR)。在PR响应中,对于研究过程期间的三次连续测量,肿瘤体积为其第1天体积的50%或更小,而且这三次测量中的一次或多次等于或大于13.5mm3。在CR响应中,对于研究过程期间的三次连续测量,肿瘤体积小于13.5mm3。对动物监测消退响应。
当动物的肿瘤达到2000mm3体积时或者在研究结束时,将动物安乐死。收集血清、肿瘤、和肾样品供进一步检测使用,所述检测包括肿瘤和肿瘤血管系统的的组织学评估。
在研究的头5天每天对动物称体重,然后每周两次。频繁地对小鼠观察任何不良的处理相关副作用的明显征候,并在观察到时记录毒性的临床征候。可接受的毒性定义为研究期间组均值体重损失小于20%且10只接受处理的动物中不超过1例发生处理相关(TR)死亡。任何导致更大毒性的剂量给药方案被认为是超过最大耐受剂量(MID)。如果根据临床征候和/或尸检的证据,死亡可归于治疗副作用,或者,如果死亡是由于剂量给药期期间或最后一剂10天内的未知原因,那么将该死亡归为TR。如果没有证据证明死亡与治疗副作用有关,那么将该死亡归为NTR。
使用Mann-Whitney U检验分析对照组和处理组之间肿瘤载荷中值的差异的统计分析。以显著性水平P=0.05进行双尾统计分析。在0.01≤P≤0.05,认为结果是统计学显著的,而在P<0.01,是高度显著的。
结果
对LS174T结肠癌瘤生长的抑制
图1A显示了LS174T结肠癌瘤研究的每组小鼠的肿瘤生长(以体积随时间变化来显示)。第2组(标有菱形的曲线)给予对照抗体,第4组(标有正方形的曲线)仅给予4剂B20-4.1;第7组(平坦曲线)给予sunitinib,50mg/kg,po,每天一次,14天;而第11组(标有三角形的曲线)给予B20-4.1和sunitinib二者,剂量给药方案与单一疗法组相同。图1B是相同研究结果的Kaplan-Meier图。正如这两张图中所显示的,B20-4.1和sunitinib的组合产生了比任一单一药剂处理显著增加的对结肠肿瘤生长的抑制。
在一项分开的25天研究中,在单一疗法组和联合疗法组中都使用高剂量sunitinib(每天50mg/kg)低剂量sunitinib(每天25mg/kg)。在第18天测量不同处理组的MTV和TGI。B20-4.1单一疗法产生了微弱的48%TGI。sunitinib单一疗法产生了剂量依赖性响应,在低剂量没有TGI,而在高剂量有不显著的43%TGI。B20-4.1与低剂量sunitinib的组合产生了50%TGI,与B20-4.1单一疗法相当。B20-4.1与更高剂量sunitinib的组合导致75%TGI。基于体重测量或临床症状发现,所有治疗表现出可被很好地耐受,没有证据证明毒性。
对H1299 NSCLC生长的抑制
对H1299非小细胞肺癌瘤(NSCLC)异种移植物进行了两项研究。图2A和2B呈现了来自与如上所述LS174T研究类似的短期处理研究的结果。第2组(标有菱形的曲线)给予对照抗体;第4组(标有正方形的曲线)仅给予4剂B20-4.1;第7组(平坦曲线)给予sunitinib,每天50mg/kg,po,14天;而第11组(标有三角形的曲线)给予B20-4.1和sunitinib二者,剂量给药方案与相同疗法组相同。图2B是同一研究结果的Kaplan-Meier图。正如这两张图中所显示的,B20-4.1和sunitinib的组合产生了比任一单一药剂处理显著增加的对NSCLC肿瘤生长的抑制。
图3呈现了来自H1299 NSCLC肿瘤的更长期处理研究的结果。该研究还比较了两种sunitinib剂量(低剂量,每天25mg/kg和高剂量,每天50mg/kg)之间的效果。使用来自第19天(此时所有小鼠仍然在研究中)的测量数据计算TGI。B20-4.1单一疗法产生了64%TGI,对应于有治疗活性,没有消退响应(regression response)。使用25或50mg/kg sunitinib的处理产生了剂量依赖性的TGI,分别为32和62%。50mg/kg sunitinib处理组具有1例部分消退。使用B20-4.1和25或50mg/kg sunitinib的组合的处理分别产生了74和82%的TGI,每个组中有2例部分消退。如此,低剂量sunitinib或高剂量sunitinib提供了比相应的B20-4.1单一药剂处理和sunitinib单一药剂处理显著改善的抑制活性。尤其重要的是,在低剂量,作为单一药剂的sunitinib在此研究中未能发挥出治疗活性,而sunitinib剂量相同时,与B20-4.1组合,提供了对NSCLC肿瘤生长的显著抑制。基于体重测量或临床症状发现,所有处理表现出可被很好地耐受,没有证据证明毒性。
在TGI测量之外,在组织学分析中使用肿瘤样品来比较肿瘤在单一疗法和联合疗法下的形态学变化。在研究结束时测量肿瘤坏死和血管密度。正如图8A-8C中所显示的,B20-4.1/sunitinib组合导致显著增加的肿瘤坏死和降低的微血管密度。
对肾癌瘤生长的抑制
在人肾细胞癌瘤的肿瘤生长研究中使用了两种异种移植物系。图4显示了来自使用786-O肾细胞癌瘤异种移植物的研究的结果。虽然在该研究中使用了sunitinib的高和低两种剂量,但是在单一药剂组和与B20-4.1的组合的图中只显示了高剂量sunitinib(每天50mg/kg)。在此项研究中,B20-4.1单一疗法导致67%TGI,sunitinib单一疗法导致80%TGI,而联合疗法显示出92%TGI。联合疗法的活性显著好于单一药剂sunitinib或B20-4.1(分别为p=0.0002和p<0.0001)。即使在将更低剂量sunitinib(25mg/kg,qd)与抗VEGF疗法组合时,该组合还显示出卓越的功效(TGI=77%)(p=0.0029)。
图6显示了来自使用SCID小鼠中Caki-2人肾细胞癌瘤异种移植物的研究的结果。显示了sunitinib的高和低两种剂量。在第29天(研究的最后一天)计算TGI。注意,B20-4.1单一疗法和低剂量(25mg/kg)sunitinib单一疗法都导致第29天均值肿瘤体积(MTV)为446和352mm3,这在研究的定义下不能解释为治疗性TGI。比较而言,B20-4.1/sunitinib组合处理产生了65%的治疗性TGI,这是超过单独给予任一药剂的显著的且有意义的改善(P<0.001)。高剂量(50mg/kg)sunitinib单一疗法确实产生了62%TGI,而B20-4.1/sunitinib组合处理在相同的剂量产生了升高的TGI,即73%。在任何组中都没有记录到消退响应。B20-4.1与50mg/kg 0-025694的组合显著好于B20-4.1单一疗法,但是50mg/kg sunitinib单一疗法不然。然而,均值和中值肿瘤生长曲线提示朝向组合活性的趋势。基于体重测量或临床症状,所有处理表现出可被很好地耐受,没有证据证明毒性。
对胰腺癌瘤生长的抑制
使用与如上所述其它研究类似的药剂和方法进行了Bx-PC3人胰腺癌瘤异种移植物中的肿瘤生长研究。图5A和5B显示了结果。与Caki-2肾细胞癌瘤异种移植物中的研究类似,在使用低剂量sunitinib时,B20-4.1和sunitinib的组合表现出产生比单一药剂更显著的改善。将第5组与第3组或第2组进行比较。虽然不希望受限于理论,来自此项研究和Caki-2研究的结果可提示,虽然sunitinib在两种剂量都展现出对PDGFR的强阻断活性,但是它只在高剂量展现出对VEGFR活性的有效阻断;使得在低剂量与B20-4.1的组合提供了比单一药剂更显著的抑制作用。此类发现为在治疗对临床剂量的任一单一疗法响应不良的肿瘤中或在更加期望更低剂量的sunitinib时组合抗VEGF药剂和sunitinib提供了强有力的基本原理。
图7A和7B进一步图示了在Caki-2RCC(图7A)和H1299NSCLC(图7B)模型中使用低剂量sunitinib(每天25mg/kg)时的组合效果。
综上所述,这些异种移植物小鼠研究为联合疗法提供了强有力的证据,其中VEGF和PDGF两种途径都得到有效靶向,导致叠加的或甚至协同的抗肿瘤活性,及因此显著改善的临床结局。
实施例2:抗VEGF和sunitinib的组合用于治疗乳腺癌
乳腺癌占美国女性中所有新癌症诊断的几乎三分之一,在2006年诊断了超过214,000例。估计每年有超过41,000名女性会死于她们的疾病(Jernal et al.,CA Cancer J.Clin 56:106-30(2006))。尽管在早期疾病的辅助治疗中获得了许多进展,高达30-40%的女性会形成系统性复发。小比例的患有转移性乳腺癌(MTC)的女性会活5年,同时只有2-3%成为长期存活者(Greenburg et al.,J.Clin.Oncol.14:2197-205(1996))。
此实施例提供了用抗VEGF、化疗和sunitinib的组合来治疗乳腺癌的方法,通过给受试者施用有效剂量的贝伐单抗(bevacizumab)、sunitinib、和帕利他塞,这能导致延长的存活和改善的生命质量。例如,在某些实施方案中,给受试者施用:(1)贝伐单抗,10mg/kg(例如基于受试者在第1天的体重),IV输注,在28天周期的第1天和第15天;(2)帕利他塞,剂量为65mg/m2-90mg/m2(典型的是90mg/m2),每周IV输注,持续3周,接着停药1周;和(3)sunitinib,典型的是口服施用,剂量为20-50mg/天,例如25mg/天或37.5mg/天,每天服用,持续3周,接着是1周停药期。在某些实施方案中,治疗周期定义为4周。或者,可以以50mg/天的剂量给受试者施用sunitinib,依照4周服药、2周停药的日程来给予(Farve et al.,J.Clin.Oncol.24(1):25-35(2006))。典型的是,贝伐单抗装在400-mg玻璃管形瓶中,其中装有16ml贝伐单抗(25mg/ml)及由磷酸钠、海藻糖、聚山梨酯20和无菌注射用水组成的媒介。帕利他塞可作为5、16.7、和50mL管形瓶中聚氧乙烯化蓖麻油(Cremophor EL)50%和无水乙醇50%中的6mg/mL浓缩液来获得。苹果酸sunitinib在化学上描述为(2S)-羟基-丁二酸,与N-[2-(二乙氨基)乙基]-5-[(Z)-(5-氟-1,2-二氢-2-氧代-3H-吲哚-3-内鎓盐(ylidine))甲基]-2,4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酰胺(1∶1)化合。分子式为C22H27FN4O2.·C4H6O5。sunitinib胶囊含有相当于12.5mg或25mgsunitinib的苹果酸sunitinib及作为无活性成分的甘露醇、交联羧甲基纤维素钠、聚维酮(K-25)、和硬脂酸镁。
结局判定为基于肿瘤响应分析(例如通过独立考查机构(IndependentReview Facility,IRF)评估进行的)的无进展存活(progression free survival,PFS),这可以通过实体瘤响应评估标准(Response Evaluation Criteria in SolidTumors,RECIST)和/或IRF(放射照片)来评估(Therasse et al.,J.Natl CancerInst.92:205-16(2000))。整体存活(Overall survival)、12个月存活、客观响应(objective response)、客观响应持续时间(duration of objective response)和12个月PFS也可用作结局判定。还可评估可溶性蛋白质的血浆水平,例如sVEGFR2、sVEGFR3和VEGF-C及PDGF途径。
治疗方法的受试者是具有乳腺腺癌的受试者(例如通过组织学或细胞学研究确定的)。典型的是,受试者具有可测量的或不可测量的局部复发性或转移性疾病。在某些实施方案中,局部复发性疾病应当不是治愈目的的切除术可治疗的。在某些实施方案中,受试者先前可以接受过激素疗法,例如在辅助或转移情况下(例如,如果在第1天之前中断≥2周)。在某些实施方案中,受试者可以接受过辅助性非紫杉烷化疗(例如,如果在启动所述方案之前中断≥6个月)。在某些实施方案中,受试者可以接受过辅助性紫杉烷化疗(例如,如果在第1天之前中断了≥12个月)。任选的是,受试者还可以接受同时的二膦酸盐疗法(例如,如果在加入研究之前或在加入研究的头30天内启动)。任选的是,受试者也可以在启动治疗时先前接受过放疗,前提是受试者在第1天之前已经自任何重大(≥3级)急性毒性恢复。
在某些实施方案中,被排除的受试者是具有未知的HER2或已知的HER2阳性状态的受试者。一般而言,HER2阳性状态可通过荧光原位杂交(FISH)测定法或通过本领域已知方法得出的3+免疫组织化学结果来鉴定。其它被排除的受试者包括先前为局部复发的或转移性的疾病接受过化疗的受试者,在第1天之前2周内先前接受过激素疗法的受试者,在第1天之前12个月内先前接受过辅助性或新近接受过辅助性紫杉烷化疗的受试者,在第1天之前6个月内先前接受过辅助性或新近接受过辅助性非紫杉烷化疗的受试者、或接受过最近的放疗、正在发生≥3级急性毒性的受试者。被排除的受试者还包括器官功能不足(例如证据为嗜中性细胞计数降低、血小板计数降低、或总胆红素大于1.5mg/dl),具有不受控制的严重医学精神病学疾患,具有没有得到充分控制的的高血压(例如定义为在接受抗高血压药疗法时收缩压大于150mmHg和/或舒张压大于100mmHg),先前具有高血压危象或高血压脑病的历史,在第1天之前的12个月内具有心肌梗死或不稳定心绞痛的历史,在第1天之前的12个月内具有中风或短暂性脑缺血发作的历史,具有出血素质或严重凝血病的证据,或具有严重的非愈合的伤口、活动性溃疡或未处理的骨折的受试者。还可参见贝伐单抗和sunitinib的标签上的别的排除。
实施例3:抗VEGF和sunitinib的组合用于治疗晚期非小细胞肺癌
肺癌是美国癌症死亡的主因,2006年估计发生174,470例新发病病例和162,460例死亡。大约55%-75%的非小细胞肺癌(NSCLC)患者呈现晚期(advanced)疾病(不能切除的或转移性疾病)。美国肺癌患者的整体5年存活率为14%,在过去的20年里只有略微改善(DeVita et al.,Cancer:principles andpractice of oncology,第6版Philadelphia(PA):Lippincott Williams和Wilkins;2001)。呈现IIIb期和IV期疾病的患者分别具有6%和8%的5年存活率(Mountain,Chest 111:1710-7(1997))。在成熟的(definitive)初始治疗(由手术切除、放疗、化疗、或这些方式的组合组成)后,大约50%的早期患者和80%的局部晚期疾病患者会复发并接受第一线(first-line)或后续线(later-line)治疗方法。
此实施例提供了用抗VEGF、化疗和sunitinib的组合来治疗非小细胞肺癌的方法,通过给受试者施用有效剂量的贝伐单抗、sunitinib、帕利他塞和卡铂,这能导致延长的存活和改善的生命质量。例如,在某些实施方案中,给受试者施用:(1)贝伐单抗,15mg/kg(例如基于受试者在第1天的体重),IV输注,在21天周期的第1天;(2)卡铂,通过基于Calvert方程(下文详细讨论)的曲线下面积(AUC=6)来确定剂量给药;(3)帕利他塞,剂量为200mg/m2(例如基于受试者在第1天的体重),IV输注,在每个21天周期的第1天,总共四个周期;和(4)sunitinib,典型的是口服施用,剂量为20-50mg/天,例如25mg/天或37.5mg/天,每天服用,持续2周,接着是1周停药期。在某些实施方案中,治疗周期定义为3周。或者,可以以50mg/天的剂量给受试者施用sunitinib,依照4周服药、2周停药的日程来给予。
如上文所讨论的,卡铂是通过基于如下Calvert方程的曲线下面积(AUC=6)来确定剂量给药的:
总剂量(mg)=(靶AUC)x(GFR+25),
其中GFR是以毫升每分(mL/min)计的肾小球滤过率,而靶曲线下面积(AUC)为6mg/mLxmin。作为肌酸酐清除率的GFR可以经由24小时尿液收集来测量(优选地),或者可以使用Cockcroft-Gault公式(Cockcroft和Gault,1976)基于血清肌酸酐来计算。对于男性,如下估算:
GFR=(140-年龄)x体重/[72x(血清肌酸酐)]。
对于女性,GFR=0.85乘以此公式。年龄以岁计,体重以千克计,而血清肌酸酐以毫克每分升计。
典型的是,贝伐单抗装在400-mg玻璃管形瓶中,其中装有16ml贝伐单抗(25mg/ml)及由磷酸钠、海藻糖、聚山梨酯20和无菌注射用水组成的媒介。
卡铂可作为现成用于稀释和胃肠外施用的10mg/mL预混合的无菌水溶液来获得。可获得50、150、450、和600mg大小的管形瓶。
帕利他塞可作为5、16.7、和50mL管形瓶中聚氧乙烯化蓖麻油(Cremophor EL)50%和无水乙醇50%中的6mg/mL浓缩液来获得。
苹果酸sunitinib在化学上描述为(2S)-羟基-丁二酸,与N-[2-(二乙氨基)乙基]-5-[(Z)-(5-氟-1,2-二氢-2-氧代-3H-吲哚-3-内鎓盐(ylidine))甲基]-2,4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酰胺(1∶1)化合。分子式为C22H27FN4O2.·C4H6O5。sunitinib胶囊含有相当于12.5mg或25mg sunitinib的苹果酸sunitinib及作为无活性成分的甘露醇、交联羧甲基纤维素钠、聚维酮(K-25)、和硬脂酸镁。
结局判定为基于肿瘤响应分析(例如通过独立考查机构(IRF)评估进行的)的无进展存活(PFS),这可以通过实体瘤响应评估标准(RECIST)和/或IRF(放射照片)来评估。整体存活、客观响应、客观响应持续时间也可用作结局判定。在治疗过程期间,可以自患者采集血浆样品用于测量预后性和预测性生物标志物(诸如参与血管发生途径的分子,包括但不限于VEGF、可溶性VEGFR、PDGF和可溶性PDGFR)的血浆水平。
治疗方法的受试者是患有局部晚期的、复发的、或转移性鳞状NSCLC(例如通过组织学或细胞学研究而确定的)的受试者。在一个实施方案中,被排除的受试者是先前为转移性疾病接受过系统性化疗的受试者。其它被排除的受试者包括患有肺癌以外的活动性恶性肿瘤的受试者,患有当前的、最近的(在进行研究第1天前的4周内)、或计划参与另一项实验性药物研究的受试者,和先前用抗VEGF或与sunitinib靶向类似途径的药剂治疗过的受试者。也可使用其它排除标准,包括一般医学排除或那些对于贝伐单抗和sunitinib疗法是典型的受试者。
实施例4:抗VEGF和sunitinib的组合用于治疗肾细胞癌
肾细胞癌(RCC)占所有恶性肿瘤的大约2%,估计在美国每年发病39,000例且每年死亡大约13,000例。直到最近,转移性疾病的治疗效力都是堪忧的。此类治疗包括细胞因子(干扰素α[IFNα]和白介素-2[IL-2]),其提供很少的好处和极大程度的毒性。后一种是直到2005年后期唯一批准用于此疾病的药剂。对于患有转移性RCC的患者,已经出现了新的治疗方法,其使用两种最近批准的药剂,即sunitinib()和sorafenib()。
此实施例提供了用抗VEGF和sunitinib的组合来治疗肾细胞癌的方法,通过给受试者施用有效剂量的贝伐单抗和sunitinib,这能导致延长的存活和改善的生命质量。
例如,在某些实施方案中,给受试者施用:(1)贝伐单抗,10mg/kg(例如基于受试者在第1天的体重),每2周IV输注,即在每个42天(6周)周期的第1、15和29天进行;和(2)sunitinib,典型的是口服施用,剂量为50mg/天,持续4周,接着是2周停药期。在某些实施方案中,治疗周期定义为4周sunitinib和2周停药(6周)。
典型的是,贝伐单抗装在400-mg玻璃管形瓶中,其中装有16ml贝伐单抗(25mg/ml)及由磷酸钠、海藻糖、聚山梨酯20和无菌注射用水组成的媒介。
苹果酸sunitinib在化学上描述为(2S)-羟基-丁二酸,与N-[2-(二乙氨基)乙基]-5-[(Z)-(5-氟-1,2-二氢-2-氧代-3H-吲哚-3-内鎓盐(ylidine))甲基]-2,4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酰胺(1∶1)化合。分子式为C22H27FN4O2.·C4H6O5。sunitinib胶囊含有相当于12.5mg或25mg sunitinib的苹果酸sunitinib及作为无活性成分的甘露醇、交联羧甲基纤维素钠(croscarmellose sodium)、聚维酮(povidone)(K-25)、和硬脂酸镁。
结局判定(outcome measue)为基于肿瘤响应分析(例如通过独立考查机构(IRF)评估进行的)的无进展存活(PFS),这可以通过实体瘤响应评估标准(RECIST)(Therasse et al.,New guidelines to evaluate the response to treatmentin solid tumors,J.Natl Cancer Inst.2000:92:205-16)和/或IRF(放射照片)来评估。整体存活、客观响应和客观响应持续时间也可用作结局判定。在治疗过程期间,可以自患者采集血浆样品用于测量预后性和预测性生物标志物(诸如参与血管发生途径的分子,包括但不限于VEGF、可溶性VEGFR、PDGF和可溶性PDGFR)的血浆水平。
在一个实施方案中,治疗方法的受试者是患有组织学上证实的以透明细胞(clear cell)为主(>50%)的转移性RCC的受试者。在另一个实施方案中,受试者包括根据RECIST的定义具有可测量(在至少一个维度(要记录的最长直径)上能精确测量的病灶,使用常规技术时为20mm或使用螺旋CT扫描时为10mm)的疾病的受试者。在又一个实施方案中,所述受试者包括先前接受过肾切除术的受试者。
在一个实施方案中,被排除的受试者是患有肉瘤样(sarcomatoid)特征为主的RCC的受试者。其它要排除的受试者包括先前为RCC接受过系统性或辅助性疗法的受试者。在又一个实施方案中,被排除的受试者是在第1天之前的2天内为RCC进行了放疗的受试者,为了疼痛控制的适应症而给予的单级分放疗(single-fraction radiotherapy)除外。在又一个实施方案中,被排除的受试者可以包括那些当前需要透析的和那些已经经历过使用贝伐单抗、sunitinib、sorafenib、axitinib、沙利度胺(thalidomide)、或其它药剂的治疗的受试者,所述其它药剂或是处在研究阶段的或是已上市销售的,其通过VEGF抑制或抗血管发生机制来起作用。也可使用其它排除标准,包括一般医学排除或那些对于贝伐单抗和sunitinib疗法是典型的受试者。
Claims (21)
1.一种治疗受试者中的肿瘤的方法,包括给所述受试者施用VEGF拮抗剂和蛋白激酶抑制剂,
其中所述VEGF拮抗剂干扰VEGF对细胞受体的结合,
其中所述蛋白激酶抑制剂至少能够抑制PDGF受体酪氨酸激酶,且
其中所述施用的时间和量足以治疗或预防所述受试者中的所述肿瘤。
2.权利要求1的方法,其中所述VEGF拮抗剂是能够特异性结合VEGF的适体。
3.权利要求1的方法,其中所述VEGF拮抗剂是可溶性VEGF受体蛋白、或其VEGF结合片段、或嵌合VEGF受体蛋白。
4.权利要求3的方法,其中所述嵌合VEGF受体蛋白至少包含来自Flt-1或KDR的胞外结构域2。
5.权利要求1的方法,其中所述VEGF拮抗剂是抗VEGF抗体。
6.权利要求5的方法,其中所述抗VEGF抗体是单克隆抗体。
7.权利要求6的方法,其中所述单克隆抗体是嵌合的、完全人的、或人源化的抗体。
8.权利要求7的方法,其中所述抗VEGF抗体是贝伐单抗、G6系列抗体、B20系列抗体、或其VEGF结合片段。
9.权利要求8的方法,其中所述抗VEGF抗体是贝伐单抗。
10.权利要求1的方法,其中所述蛋白激酶抑制剂能够抑制PDGF受体酪氨酸激酶和VEGF受体酪氨酸激酶二者。
11.权利要求10的方法,其中所述蛋白激酶抑制剂是sunitinib或其药学可接受盐形式。
12.权利要求1的方法,其中所述肿瘤选自下组:乳腺癌、结肠直肠癌、直肠癌、非小细胞肺癌、非何杰金氏淋巴瘤(NHL)、肾细胞癌、前列腺癌、肝癌、胰腺癌、软组织肉瘤、卡波西氏肉瘤、类癌癌瘤、头颈癌、黑素瘤、卵巢癌、间皮瘤、和多发性骨髓瘤。
13.权利要求12的方法,其中所述肿瘤是非小细胞肺癌。
14.权利要求12的方法,其中所述癌症是转移的。
15.权利要求12的方法,其中所述患者先前未接受过治疗。
16.权利要求1的方法,其中所述VEGF拮抗剂是贝伐单抗且所述蛋白激酶抑制剂是sunitinib。
17.权利要求16的方法,其中给所述受试者隔周以10mg/kg或每三周以15mg/kg静脉内施用贝伐单抗,且其中给所述受试者以日剂量25mg口服施用sunitinib两周、三周或四周接着停用一周或两周。
18.权利要求17的方法,其中给所述受试者每三周以15mg/kg静脉内施用贝伐单抗,且其中给所述受试者以25mg日剂量口服施用sunitinib两周接着停用一周。
19.权利要求1或16的方法,进一步包括给所述受试者施用一种或多种化疗剂。
20.权利要求19的方法,其中所施用的化疗剂是帕利他塞。
21.权利要求19的方法,其中所施用的化疗剂是卡铂和帕利他塞。
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