BRPI0806313A2

BRPI0806313A2 - Formulação de anticorpo anti-il-13; formulação em aerossol de um anticorpo anti-il-13; formulaçãoliofilizada de um anticorpo anti-il-13; composição farmacêutica para o tratamento de um transtorno relacionado a il-13; fabricação de uma composição farmacêutica ; método de tratamento de um transtorno relacionado a il-13; seringa injetável; dispositivo para administração nasal; emplastro transdérmico; bolsa intravenosa; kit compreendendo pelo menos um recipiente; kit; e seringa injetável previamente enchida

Info

Publication number: BRPI0806313A2
Application number: BRPI0806313-3A
Authority: BR
Inventors: Anthony B Barry; Thomas J Crowley; Daniel A Dixon; Erin Christine Soley
Original assignee: Wyeth Corp
Priority date: 2007-01-09
Filing date: 2008-01-09
Publication date: 2011-09-06
Also published as: TW200837080A; US20090060906A1; JP5419709B2; EP2114451A2; WO2008086395A3; AR064826A1; CL2008000058A1; CA2674608A1; CN101600457A; JP2010515742A; MX2009007406A; WO2008086395A2; AU2008204901A1; CN101600457B; PE20081610A1

Abstract

FORMULAçãO DE ANTICORPO ANTI-IL-13; FORMULAçãO EM AEROSSOL DE UM ANTICORPO ANTI-IL-13; EORMULAçãO LIOFILIZADA DE UM ANTICORPO ANTI-IL-l3; COMPOSIçãO FARMACêUTICA PARA O TRATAMENTO DE UM TRANSTORNO RELACIONADO A IL-13; FABRICAçãO DE UMA COMPOSIçãO FARMACêUTICA; MéTODO DE TRATAMENTO DE UM TRANSTORNO RELACIONADO A IL-13; SERINGA INJETáVEL; DISPOSITIVO PARA ADMINISTRAçãO NASAL; EMPLASTRO TRANSDéRMICO; BOLSA INTRAVENOSA; KIT COMPREENDENDO PELO MENOS UM RECIPIENTE; KIT; E SERINGA INJETáVEL PREVIAMENTE ENCHIDA. Apresentam-se formulações adequadas para o tratamento de transtornos associados à expressão ou atividade indesejável de IL-13.

Description

"FORMULAÇÃO DE ANTICORPO ANTI-IL-13; FORMULAÇÃO EM AEROSSOL DE UM ANTICORPO ANTI-IL-13; FORMULAÇÃO LIOFILIZADA DE UM ANTICORPO ANTI-IL-13; COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA PARA O TRATAMENTO DE UM TRANSTORNO RELACIONADO A IL-13; FABRICAÇÃO DE UMA COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA; MÉTODO DE TRATAMENTO DE UM TRANSTORNO RELACIONADO A IL-13; SERINGA INJETÁVEL; DISPOSITIVO PARA ADMINISTRAÇÃO NASAL; EMPLASTRO TRANSDÉRMICO; BOLSA INTRAVENOSA; KIT COMPREENDENDO PELO MENOS UM RECIPIENTE; KIT; E SERINGA INJETÁVEL PREVIAMENTE ENCHIDA".

REFERÊNCIA A PEDIDOS RELACIONADOS Este pedido reivindica o beneficio do Pedido Provisório n2 U.S. 60/879.500, depositado em 09 de janeiro de 2007, cujo conteúdo é aqui incorporado integralmente por referência.

CAMPO DA TÉCNICA Este pedido refere-se ao campo de anticorpos e, mais particularmente, ao armazenamento de anticorpos.

FUNDAMENTOS

Os anticorpos e as proteínas derivadas de anticorpos têm muitas aplicações. O uso de anticorpos nessas aplicações é facilitado pelo armazenamento dos anticorpos em formulações que promovam a estabilidade dos anticorpos em várias condições usando formulações relativamente simples. Se for usada uma formulação para um uso terapêutico, é importante que a formulação permita o armazenamento sem uma perda inaceitável de atividade dos componentes ativos, minimize o acúmulo de produtos indesejáveis, como agregados inativos, acomode concentrações apropriadas de componentes ativos e não contenha componentes que sejam incompatíveis com aplicações terapêuticas. Formulações que sejam para o armazenamento de proteínas a serem usadas para processamento a jusante, por exemplo, proteínas que devam ser conjugadas a outra entidade para se fabricar um agente terapêutico, não devem conter componentes que interfiram com o processo de fabricação.

SUMÁRIO

A invenção se refere a formulações para o armazenamento de anticorpos anti-IL-13. As formulações são utilizáveis, por exemplo, como formulações farmacêuticas. Portanto, em um aspecto, a invenção se refere a uma formulação de anticorpo anti-IL-13 que inclui (a) um anticorpo anti-IL-13; (b) um crioprotetor; e (c) um tampão, de modo que o pH da formulação seja de cerca de 5,5 a 6,5. Em algumas modalidades, a formulação é uma formulação líquida, uma formulação liofilizada, uma formulação liofilizada reconstituída ou uma formulação em aerossol. Em certas modalidades, o anti-IL-13 na formulação está a uma concentração de cerca de 0,5 mg/mL a cerca de 250 mg/mL, de cerca de 0,5 mg/mL a cerca de 45 mg/mL, de cerca de 0,5 mg/mL a cerca de 100 mg/mL, de cerca de 100 mg/mL a cerca de 200 mg/mL ou de cerca de 50 mg/mL a cerca de 250 mg/mL. Em algumas modalidades da formulação, o anticorpo anti-IL-13 é um anticorpo humanizado (por exemplo, um anticorpo parcialmente humanizado ou um anticorpo completamente humanizado). Em alguns casos, o anticorpo é um anticorpo de construto de cadeia leve kapa. Em algumas modalidades, o anticorpo é um anticorpo IgGl, um anticorpo IgG2 ou um anticorpo IgG4 . Em certas modalidades, o anticorpo anti-IL- 13 na formulação é um anticorpo monoclonal. Em alguns casos, o anticorpo anti-IL-13 da formulação é um anticorpo descrito no Pedido de Patente Norte-americana n° 11/149.309 (Patente Norte-americana Publ. n° 20060073148), Pedido de Patente Norte-americana n° 11/155.843 (Patente Norte-americana Publ. n° 20060063228) ou WO 2006/085938. Em modalidades especificas, o anticorpo anti-IL-13 é IMA-638 (veja a Figura 34) ou IMA-026 (veja a Figura 35).

O crioprotetor da formulação pode ser, por exemplo, de cerca de 2,5% a cerca de 10% (peso/volume) de sacarose ou trealose. Em alguns casos, o crioprotetor da formulação não é histidina. Em algumas modalidades, o tampão na formulação é de cerca de 4 mM a cerca de 60 mM de tampão histidina, de cerca de 5 mM a cerca de 25 mM de tampão succinato ou de cerca de 5 mM a cerca de 25 mM de tampão acetato. O pH dos tampões da formulação está genericamente entre cerca de 5,0 e 7,0. Em algumas modalidades especificas, o pH do tampão da formulação é de 5,0, 5,5, 6,0 ou 6,5. Além do crioprotetor e do tampão, as formulações da invenção podem conter outros excipientes. Em algumas modalidades, a formulação inclui um surfactante a uma concentração de cerca de 0% a 0,2%. Em alguns casos, a formulação contém mais do que 0% e até cerca de 0,2% de polissorbato-20, polissorbato-40, polissorbato-60, polissorbato-65, polissorbato-80 ou polissorbato-85. Em modalidades especificas, a formulação contém 0,001%, 0,002%, 0,003%, 0,004%, 0,005%, 0,006%, 0,007%, 0,008%, 0,009%, 0,01%, 0,02%, 0,03%, 0,04%, 0,05%, 0,06%, 0,07%, 0,08%, 0,09%, 0,1%, 0,11%, 0,12%, 0,13%, 0,14%, 0,15%, 0,16%, 0,17%, 0,18%, 0,19% ou 0,2% de polissorbato-80. A formulação também pode incluir de cerca de 0,01% a cerca de 5% de arginina. Em modalidades especificas, a formulação contém 0,01%, 0,02%, 0,03%, 0,04%, 0,05%, 0,06%, 0,07%, 0,08%,. 0,09%, 0,1%, 0,11%, 0,12%, 0,13%, 0,14%, 0,15%, 0,16%, 0,17%, 0,18%, 0,19% ou 0,2%, 0,3%, 0,5%, 0,6%, 0,7%, 0,8%, 0,9%, 1,0%, 1,1%, 1,2%, 1,3%, 1,4%, 1,5%, 1,6%, 1,7%, 1,8%, 1,9%, 2%, 2,5%, 3%, 3,5%, 4,0%, 4,5% ou 5% de arginina. Em algumas modalidades, a formulação também inclui de cerca de 0,001% a cerca de 0,05% de Tween 20 ou Tween 80. Em modalidades especificas, a formulação contém 0,005%, 0,008%, 0,01%, 0,2%, 0,03%, 0,04% ou 0,05% de Tween 20 ou Tween 80. Em certas modalidades, as formulações da invenção podem conter um surfactante e arginina, arginina e Tween, ou arginina, Tween e um surfactante diferente de Tween. Em outras modalidades, a formulação também pode incluir um ou mais de: de cerca de 1% a cerca de 10% de sorbitol, de cerca de 0, 1% a cerca de 2% de glicina, de cerca de 5 mM a cerca de 150 mM de metionina, e de cerca de 5 mM a cerca de 100 mM de cloreto de sódio.

A formulação também pode incluir um segundo anticorpo ou seu fragmento de ligação a antigeno. Por exemplo, o segundo anticorpo pode ser um anticorpo anti-IL- 13 ou seu fragmento de ligação a IL-13, em que o segundo anticorpo IL-13 tem uma especificidade de epitopo diferente do primeiro anticorpo para IL-13 da formulação. Outros exemplos não limitativos de anticorpos que podem ser coformulados com anticorpo anti-IL-13 incluem anticorpo anti-IgE ou seu fragmento de ligação a IgE, anticorpo anti- IL-4 ou seu fragmento de ligação a IL-4, um anticorpo anti- TNF-a ou seu fragmento de ligação a TNF-α, um anticorpo anti-C5 ou seu fragmento de ligação a complemento e anticorpo anti-IL-9 ou seu fragmento de ligação a IL-9. A formulação também pode incluir um segundo agente terapêutica ou farmacologicamente ativo que seja utilizável no tratamento de um transtorno inflamatório.

Em certas modalidades da formulação, (a) o anticorpo é um anticorpo murideo humanizado anti-IL-13; (b) o crioprotetor é de cerca de 0,02% a cerca de 10% (peso/volume) de sacarose ou trealose; e (c) o tampão é de cerca de 4 mM a cerca de 60 mM de tampão histidina. Em alguns casos, essa formulação também contém de cerca de 0,01% a cerca de 5% de arginina. Em certos casos, essa formulação também contém de cerca de 0,001% a cerca de 0,05% de Tween. Em outros casos, essa formulação contém de cerca de 0,01% a cerca de 5% de arginina e de cerca de 0,001% a cerca de 0,05% de Tween. Em algumas modalidades, a formulação também compreende um ou mais de: de cerca de 1% a cerca de 10% de sorbitol, de cerca de 0,1% a cerca de 2% de glicina, de cerca de 5 mM a cerca de 150 mM de metionina, e de cerca de 5 mM a cerca de 100 mM de cloreto de sódio. Em alguns casos, essa formulação também contém mais do que 0% e até cerca de 0,2% de um surfactante (por exemplo, polissorbato-20, -40, -45, -60, -65, -80, -85) .

Em certas modalidades da formulação, (a) o anticorpo é IMA-638 ou IMA-026; (b) o crioprotetor é de cerca de 0,02% a cerca de 10% (peso/volume) de sacarose ou trealose; e (c) o tampão é de cerca de 10 mM de tampão succinato, pH 6,0. Em outras modalidades da formulação, (a) o anticorpo é anticorpo IMA-638 ou IMA-026; (b) o crioprotetor é de cerca de 0,02% a cerca de 10% (peso/volume) de sacarose ou trealose; e (c) o tampão é de cerca de 10 mM de tampão acetato, pH 6,0.

Em outro aspecto, apresenta-se uma formulação em aerossol que compreende: (a) um anticorpo anti-IL-13; (b) de cerca de 5% a cerca de 10% (peso/volume) de sacarose ou trealose; e (c) um tampão com um pH de cerca de 5,5 a 6,5. Em alguns casos, essa formulação também contém de cerca de 0,01% a cerca de 5% de arginina. Em certos casos, essa formulação também contém de cerca de 0,001% a cerca de 0,05% de Tween. Em outros casos, essa formulação contém de cerca de 0,01% a cerca de 5% de arginina e de cerca de 0,001% a cerca de 0,05% de Tween. Em algumas modalidades, a formulação compreende um ou mais de: de cerca de 1% a cerca de 10% de sorbitol, de cerca de 0,1% a cerca de 2% de glicina, de cerca de 5 mM a cerca de 150 mM de metionina, e de cerca de 5 mM a cerca de 100 mM de cloreto de sódio. Em alguns casos, essa formulação contém mais do que 0% e até cerca de 0,2% de um surfactante (por exemplo, polissorbato- 20, -40, -60, -65, -80, -85) . Em alguns casos, a formulação em aerossol também inclui um agente terapêutico que seja utilizável no tratamento de asma ou doença pulmonar obstrutiva crônica.

Em outro aspecto, apresenta-se uma formulação liofilizada que compreende: (a) um anticorpo anti-IL-13; (b) de cerca de 5% a cerca de 10% (peso/volume) de sacarose ou trealose; e (c) um tampão com um pH de cerca de 5,5 a 6,5. Em alguns casos, essa formulação também contém de cerca de 0,01% a cerca de 5% de arginina. Em certos casos, essa formulação também contém de cerca de 0,001% a cerca de 0,05% de Tween. Em outros casos, essa formulação contém de cerca de 0,01% a cerca de 5% de arginina e de cerca de 0,001% a cerca de 0,05% de Tween. Em algumas modalidades, a formulação compreende um ou mais de: de cerca de 1% a cerca de 10% de sorbitol, de cerca de 0, 1% a cerca de 2% de glicina, de cerca de 5 mM a cerca de 150 mM de metionina, e de cerca de 5 mM a cerca de 100 mM de cloreto de sódio. Em alguns casos, essa formulação contém mais do que 0% e até cerca de 0,2% de um surfactante (por exemplo, polissorbato- 20, -40, -60, -65, -80, -85). Em alguns casos, a formulação liofilizada também inclui um agente terapêutico que seja utilizável no tratamento de asma ou doença pulmonar obstrutiva crônica.

Em certas modalidades, a integridade do anticorpo é mantida após armazenamento na formulação durante pelo menos dezoito meses a -80°C, pelo menos vinte e quatro meses a -80°C, pelo menos dezoito meses a -20°C, pelo menos vinte e quatro meses a -20°C, pelo menos dezoito meses a 2 °C - 8°C, pelo menos vinte e quatro meses a 2°C - 8°C, pelo menos dezoito meses a 25 °C ou pelo menos vinte e quatro meses a 25 °C. Em alguns casos, a formulação inclui menos de 10% de espécies de alto peso molecular (HMW) após pelo menos dezoito meses a -80°C, pelo menos vinte e quatro meses a -80°C, pelo menos dezoito meses a -20°C, pelo menos vinte e quatro meses a -20°C, pelo menos dezoito meses a 2°C - 8 °C, pelo menos vinte e quatro meses a 2°C - 8°C, pelo menos dezoito meses a 25 °C ou pelo menos vinte e quatro meses a 25°C. A invenção inclui modalidades em que as espécies HMW são ensaiadas usando-se cromatografia liquida de alto desempenho-exclusão de tamanho (SEC-HPLC). A invenção também inclui modalidades em que a formulação compreende menos de 10% de espécies de baixo peso molecular (LMW) após pelo menos dezoito meses a -80°C, pelo menos vinte e quatro meses a -80°C, pelo menos dezoito meses a -20°C, pelo menos vinte e quatro meses a -20°C, pelo menos dezoito meses a 2 °C - 8°C, pelo menos vinte e quatro meses a 2°C - 8°C, pelo menos dezoito meses a 25 °C ou pelo menos vinte e quatro meses a 25°C. Em certos casos, as espécies LMW são ensaiadas usando- se SEC-HPLC. Em algumas modalidades da formulação, com a reconstituição da formulação de anticorpo liofilizada, a formulação retém pelo menos 90% da estrutura do anticorpo em comparação com a formulação antes da Iiofilização. A estrutura do anticorpo é determinada, por exemplo, por ensaio de ligação, ensaio de carga de superfície, bioensaio ou a razão de espécies HMW para espécies LMW. Em outro aspecto, a invenção se refere a uma composição farmacêutica para o tratamento de um transtorno relacionado a IL-13. A composição farmacêutica inclui uma formulação de anticorpo anti-IL-13 conforme aqui descrita, por exemplo, uma formulação contendo um anticorpo humanizado, e outras características conforme aqui descritas.

Em ainda outro aspecto, a invenção se refere à fabricação de uma composição farmacêutica, a composição incluindo uma formulação de anticorpo que inclui (a) um anticorpo anti-IL-13; (b) um crioprotetor; e (c) um tampão, de modo que o pH da formulação seja de cerca de 5,5 a 6,5. Em alguns casos, o anticorpo anti-IL-13 da composição farmacêutica é um anticorpo descrito no Pedido de Patente Norte-americana n° 11/149.309 (Patente Norte-americana Publ. n° 20060073148), Pedido de Patente Norte-americana n° 11/155.843 (Patente Norte-americana Publ. n° 20060063228) ou WO 2006/085938. Em modalidades específicas, o anticorpo anti-IL-13 é IMA-638 ou IMA-026. Em alguns casos, a composição farmacêutica também contém de cerca de 0,01% a cerca de 5% de arginina. Em certos casos, a composição farmacêutica também contém de cerca de 0,001% a cerca de 0,05% de Tween. Em outros casos, a composição farmacêutica contém de cerca de 0,01% a cerca de 5% de arginina e de cerca de 0,001% a cerca de 0,05% de Tween. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica compreende um ou mais de: de cerca de 1% a cerca de 10% de sorbitol, de cerca de 0,1% a cerca de 2% de glicina, de cerca de 5 mM a cerca de 150 mM de metionina e de cerca de 5 mM a cerca de 100 mM de cloreto de sódio. Em alguns casos, essa formulação contém mais do que 0% e até cerca de 0,2% de um surfactante (por exemplo, polissorbato-20, -40, -60, -65, -80, -85) .

Em outro aspecto, a invenção se refere a um método de tratamento de um transtorno relacionado a IL-13, o método compreendendo a administração de uma quantidade farmaceuticamente eficaz de uma formulação de anticorpo para IL-13. A formulação inclui (a) um anticorpo anti-IL-13; (b) um crioprotetor; e (c) um tampão, de modo que o pH da formulação seja de cerca de 5,5 a 6,5. Em alguns casos, o anticorpo anti-IL-13 da formulação é um anticorpo descrito no Pedido de Patente Norte-americana n° 11/149.309 (Patente Norte-americana Publ. n° 2 0060073148), Pedido de Patente Norte-americana n° 11/155.843 (Patente Norte-americana Publ. n° 20060063228) ou WO 2006/085938. Em modalidades especificas, o anticorpo anti-IL-13 é IMA-638 ou IMA-026. Em alguns casos, a formulação também contém de cerca de 0,01% a cerca de 5% de arginina. Em certos casos, a formulação também contém de cerca de 0,001% a cerca de 0,05% de Tween. Em outros casos, a formulação contém cerca de 0,01% a cerca de 5% de arginina e de cerca de 0,001% a cerca de 0,05% de Tween. Em algumas modalidades, a formulação compreende um ou mais de: de cerca de 1% a cerca de 10% de sorbitol, de cerca de 0,1% a cerca de 2% de glicina, de cerca de 5 mM a cerca de 150 mM de metionina e de cerca de 5 mM a cerca de 100 mM de cloreto de sódio. Em alguns casos, essa formulação contém mais do que 0% e até cerca de 0,2% de um surfactante (por exemplo, polissorbato-20, -40, -60, -65, -80, -85) . Em algumas modalidades, os métodos da invenção incluem terapia de combinação. Terapia de combinação refere-se a qualquer forma de administração em combinação dois ou mais compostos terapêuticos diferentes, de modo que o segundo composto seja administrado enquanto o composto terapêutico previamente administrado ainda seja eficaz no corpo (por exemplo, os dois compostos são simultaneamente eficazes no paciente, o que pode incluir efeitos sinérgicos dos dois compostos). A terapia de combinação pode incluir uma molécula de anticorpo anti-IL-13, coformulada com e/ou coadministrada com um ou mais agentes terapêuticos adicionais, por exemplo, um ou mais inibidores de citocina e de fator de crescimento, imunossupressores, agentes antiinflamatórios (por exemplo, agentes antiinflamatórios sistêmicos), inibidores metabólicos, inibidores de enzimas e/ou agentes citotóxicos ou citostáticos. O agente de ligação a IL-13 e o outro agente terapêutico também podem ser administrados separadamente.

Em certas modalidades do método, o transtorno relacionado a IL-13 é uma doença inflamatória. Em algumas modalidades, a doença inflamatória é selecionada do grupo que consiste em artrite, asma, doença inflamatória do intestino, transtornos inflamatórios da pele, esclerose múltipla, osteoporose, tendinite, transtornos alérgicos, inflamação em resposta a um insulto ao hospedeiro, sépsis, artrite reumatóide, osteoartrite, doença do intestino irritável, colite ulcerativa, psoriase, lúpus eritematoso sistêmico e qualquer outra doença autoimune. Em certas modalidades do método, o transtorno relacionado a IL-13 é asma alérgica, asma não alérgica, combinações de asma alérgica e não alérgica, asma induzida por exercícios, asma induzida por fármacos, asma ocupacional, asma de estágio tardio, leucemia linfocitica crônica de células B (CLL de células Β) , doença de Hodgkin, fibrose tissular em esquistossomose, doença reumática autoimune, transtorno inflamatório do intestino, artrite reumatóide, condições que envolvam inflamação das vias aéreas, eosinofilia, fibrose e produção excessiva de muco (por exemplo, fibrose cística e fibrose pulmonar); transtornos atópicos (por exemplo, rinite alérgica); condições inflamatórias e/ou autoimunes da pele (por exemplo, dermatite atópica), condições inflamatórias e/ou autoimunes dos órgãos gastrointestinais (por exemplo, doenças inflamatórias do intestino (IBD)), condições inflamatórias e/ou autoimunes do fígado (por exemplo, cirrose); infecções virais; esclerodermia e fibrose de outros órgãos, como fibrose do fígado, conjuntivite alérgica, eczema, urticária, alergias alimentares, doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD), colite ulcerativa, infecção pelo Vírus do Sarcoma de Rous, uveíte, esclerodermia ou osteoporose. Em algumas modalidades do método, a formulação de anticorpo é administrada por inalação, por nebulização ou injeção.

Em algumas modalidades, apresenta-se uma seringa injetável compreendendo uma solução previamente enchida das formulações aqui descritas. Em uma modalidade específica, a seringa previamente enchida compreende: 100 mg/mL de anticorpo anti-IL-13 (por exemplo, IMA-026, IMA-638), 10 mM de histidina, 5% de sacarose, 0,01% de Tween-80, 40 mM de NaCl, pH 6,0. Em outra modalidade especifica, a formulação na seringa previamente enchida também compreende entre cerca de 0,1% e de cerca de 2% de arginina. Em alguns casos, a seringa é equipada com um dispositivo autoinjetor. Em outras modalidades, apresenta-se um dispositivo para administração nasal das formulações aqui descritas. Em alguns casos, apresenta-se um emplastro transdérmico para administração das formulações aqui descritas. Em ainda outros casos, apresenta-se uma bolsa intravenosa para administração das formulações aqui descritas. Em modalidades especificas, a bolsa intravenosa contém salina normal ou 5% de dextrose.

Em outras modalidades, apresenta-se um kit compreendendo um recipiente das formulações aqui descritas. O kit pode opcionalmente incluir instruções de uso. Em alguns casos, o recipiente no kit é um frasco de plástico ou vidro ou uma seringa injetável.

A menos que definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos aqui usados têm o mesmo significado que o comumente entendido por aqueles versados na técnica a que esta invenção pertence. Embora se possam usar métodos e materiais similares ou equivalentes aos aqui descritos na prática ou teste da presente invenção, são descritos abaixo métodos e materiais adequados. Todas as publicações, pedidos de patentes, patentes e outras referências aqui mencionadas são incorporadas por referência em sua inteireza. Além disso, os materiais, métodos e exemplos são apenas ilustrativos e não pretendem ser limitativos.

Outras características e vantagens da invenção ficarão claras com a descrição detalhada, desenhos e reivindicações.

DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A Figura 1 é um gráfico representando os resultados de experimentos em gue a porcentagem de espécies HMW em formulações armazenadas liofilizadas de anticorpos anti-IL-13, reconstituídas em momentos apropriados, foi determinada usando-se cromatografia de exclusão de tamanho- cromatografia líquida de alto desempenho (SEC-HPLC). Porcentagem de HMW = porcentagem de proteína total em espécies HMW. As amostras foram armazenadas a 4°C, 250C e 40°C durante até vinte e quatro meses antes da reconstituição.

A Figura 2 é um gráfico representando os resultados de experimentos em que a bioatividade de uma formulação de anticorpo anti-IL-13 armazenada liofilizada, reconstituída em momentos apropriados, foi determinada como uma porcentagem de um padrão de anticorpo anti-IL-13. Os dados são expressos como atividade específica em unidades por miligrama de proteína. As amostras foram armazenadas a 4°C, 25°C e 40°C durante até vinte e quatro meses antes da reconstituição.

A Figura 3 é um gráfico representando os resultados de experimentos em que a porcentagem de espécies HMW em uma formulação liquida de anticorpo anti-IL-13 a 100 mg/mL foi determinada usando-se SEC-HPLC após armazenamento a 4°C, 15°C, 25°C e 40°C durante até vinte e quatro meses.

A Figura 4 é um gráfico representando os resultados de experimentos em que a porcentagem de espécies LMW em uma formulação liquida de anticorpo anti-IL-13 a 100 mg/mL foi determinada usando-se SEC-HPLC após armazenamento a 4°C, 15°C, 25°C, e 40°C durante até vinte e quatro meses.

A Figura 5 é um gráfico representando os resultados de experimentos em que a porcentagem de atividade de ligação de anticorpo anti-IL-13 em uma formulação liquida foi ensaiada após armazenamento a 4°C, 15°C, 25°C e 40°C durante até seis meses. A atividade de ligação é expressa como uma porcentagem com relação a um padrão.

A Figura 6 é um gráfico representando os resultados de experimentos em que a bioatividade de uma formulação de anticorpo anti-IL-13 a 100 mg/mL foi determinada como uma porcentagem de um padrão de anticorpo anti-IL-13. Os dados são expressos como atividade especifica em unidades por miligrama de proteína. As amostras foram armazenadas a 4°C, 15°C, 25°C, e 40°C durante até vinte e quatro meses.

A Figura 7 é um gráfico que representa os resultados de experimentos que ensaiam a concentração de proteína em uma formulação líquida armazenada a 4°C, 15°C, 25°C e 40°C durante até vinte e quatro meses.

A Figura 8 é um gráfico de calorimetria de varredura diferencial modulada subambiente (mDSC) para determinar a temperatura de transição de vidro da fase amorfa concentrada por congelamento.

A Figura 9A é uma reprodução de uma imagem de microscopia da liofilização de um anticorpo anti-IL-13 a - 25 ° C.

A Figura 9B é uma reprodução de uma imagem de microscopia da liofilização de um anticorpo anti-IL-13 elevado de -25°C para -15°C.

A Figura 9C é uma reprodução de uma imagem de microscopia da liofilização de um anticorpo anti-IL-13 reduzido de -15°C para -18°C.

A Figura 9D é uma reprodução de uma imagem de microscopia da liofilização de um anticorpo anti-IL-13 elevado de -18°C para -8°C.

A Figura 9E é uma reprodução de uma imagem de microscopia da liofilização de um anticorpo anti-IL-13 elevado de -80C para -4°C.

A Figura 9F é uma reprodução de uma imagem de microscopia da liofilização de um anticorpo anti-IL-13 reduzido de -4°C para -16°C.

A Figura 10 é um gráfico representando um traçado de ciclos para um ciclo de liofilização agressivo. A temperatura é mostrada para duas composições de anticorpos diferentes (designadas como MYO-029 e IMA-638), a de armazenamento (armazenamento) e o ponto de orvalho. A pressão é mostrada conforme ensaiada usando-se um manômetro de capacitância e um manômetro Pirani. A Figura 11 é um gráfico representando um traçado de ciclos para um ciclo de liofilização de controle. As amostras de temperatura e pressão são como para a Figura 10.

A Figura 12 é um gráfico representando um traçado de ciclos para um ciclo de liofilização com recozimento. As amostras de temperatura e pressão são como para a Figura 10.

A Figura 13 é um gráfico representando a temperatura do produto durante a secagem primária para o ciclo de liofilização agressivo, o ciclo de liofilização de controle e o ciclo de liofilização com recozimento correspondentes às Figuras 10-12, respectivamente.

A Figura 14 é um gráfico representando o termograma de calorimetria de varredura diferencial modulada de uma amostra de controle. Duas temperaturas de transição de vidro (medidas no fluxo térmico reverso) são observadas, uma iniciando a 51, 3°C e uma a 7 4,5°C.

A Figura 15 é um gráfico representando os resultados espectroscopia infravermelha de transformada de Fourier das três amostras (controle, agressivo e com recozimento) na região de amida I.

A Figura 16 é um gráfico representando o tempo de reconstituição de amostras como função do tempo em armazenamento. As amostras são de controle, agressivo e com recozimento, e foram armazenadas a 5°C ou 50°C.

A Figura 17 é um gráfico representando a concentração de proteína conforme ensaiada usando-se espectroscopia UV-Iuz visível (A280) · As amostras são como para a Figura 16. A Figura 18 é um gráfico representando o espalhamento de luz em solução conforme ensaiado por espectroscopia UV-Iuz visível (A42o) · As amostras são como para a Figura 16.

A Figura 19 é um gráfico representando os resultados de um ensaio de espécies HMW usando SEC-HPLC. As amostras são como para a Figura 16.

A Figura 20 é um gráfico representando a afinidade de ligação do anticorpo testado como função do tempo em armazenamento. As amostras são como para a Figura 16.

A Figura 21 é um gráfico de barras representando a porcentagem de recuperação na triagem de excipiente IMA-638 conduzida em frascos e seringas, em que a concentração do anticorpo IMA-638 foi medida por UV/Vis.

A Figura 22 é um gráfico de barras representando a porcentagem de alteração em espécies HMW na triagem de excipiente IMA-638 conduzida em frascos e seringas, de t = 0 a seis semanas a 40"C.

A Figura 23 é um gráfico de barras representando a porcentagem de alteração em espécies LMW na triagem de excipiente IMA-638 conduzida em frascos e seringas, de t = 0 a seis semanas a 40°C.

A Figura 24 é um gráfico de barras representando a concentração de IMA-638 em formulações com ou sem Tween após agitação à temperatura ambiente em um agitador de gel durante vinte e quatro horas a cerca de 200 rpm.

A Figura 25 é um gráfico de barras representando a porcentagem de espécies HMW de IMA-638 em formulações com ou sem Tween após agitação à temperatura ambiente em um agitador de gel durante vinte e quatro horas a cerca de 200 rpm.

Figura 26 é um gráfico de barras representando a concentração de IMA-638 em formulações com ou sem Tween após um (FTl), três (FT3) e cinco (FT5) ciclos de congelamento- descongelamento (ciclo de congelamento a -80°C; ciclo de descongelamento a 37°C).

A Figura 27 é um gráfico de barras representando a porcentagem de espécies HMW de IMA-638 em formulações com ou sem Tween após um (FTl), três (FT3), e cinco (FT5) ciclos de congelamento-descongelamento (ciclo de congelamento a -80°C; ciclo de descongelamento a 37°C).

A Figura 28 é um gráfico representando a porcentagem de espécies HMW em formulações líquidas de IMA- 638 em seringas armazenadas a 4°C durante até 7 meses.

A Figura 29 é um gráfico representando a porcentagem de espécies HMW em formulações líquidas de IMA- 638 em seringas armazenadas a 25°C durante até 7 meses.

A Figura 30 é um gráfico representando a porcentagem de espécies HMW em formulações líquidas de IMA- 638 em seringas armazenadas a 40°C durante até 7 meses.

A Figura 31 é um gráfico representando a porcentagem de espécies HMW em formulações líquidas de IMA- 638 que contêm 0,01% de Tween e entre 0% e 2% de arginina em seringas armazenadas a 40'C durante até vinte e oito semanas. A Figura 32 é um gráfico representando a porcentagem de espécies HMW de um anticorpo para IL-13, IMA- 026, que foi reconstituído depois de ter sido liofilizado e armazenado a 4°C, 25°C e 40°C durante até doze meses.

A Figura 33 é um gráfico representando a bioatividade de um anticorpo IMA-026 que foi reconstituído depois de ter sido liofilizado e armazenado a 4°C, 25 'C e 40°C durante até doze meses.

A Figura 34 apresenta a seqüência de aminoácidos da cadeia pesada (SEQ ID NO:l) e da cadeia leve (SEQ ID NO: 2) do anticorpo IMA-638. O último resíduo de aminoácido codificado pela seqüência de DNA da cadeia pesada, Lys44S/ é observado na forma madura secretada de IMA-638 apenas em pequenas quantidades e é presumivelmente removido da maior parte do anticorpo monoclonal durante o processamento intracelular por proteases celulares de ovário de hamster chinês (CHO). Consequentemente, a terminação carbóxi da cadeia pesada de IMA-638 é Gly447 . O processamento da lisina carbóxi terminal foi observado em anticorpos recombinantes e derivados do plasma e não parece ter impacto sobre sua função.

A Figura 35 apresenta a seqüência de aminoácidos da cadeia pesada (SEQ ID NO: 3) e da cadeia leve (SEQ ID NO:4) do anticorpo IMA-026.

DESCRIÇÃO DETALHADA

Foram identificadas formulações que incluem um anticorpo anti-IL-13 que são adequadas para armazenamento de um anticorpo anti-IL-13 (uma "formulação"). A integridade do anticorpo na formulação é geralmente mantida após armazenamento de longo prazo como um liquido ou como um produto liofilizado sob várias condições. Por exemplo, a integridade do anticorpo é adequadamente mantida após exposição a uma ampla faixa de temperaturas de armazenamento (por exemplo, -80°C a 40°C), tensões de cisalhamento (por exemplo, agitação) e estresse interfacial (ciclos de congelamento-descongelamento). Além disso, para material liofilizado, a integridade do anticorpo é adequadamente mantida durante o processo de reconstituição. Além disso, a integridade do anticorpo é suficientemente mantida para uso como um medicamento conforme demonstrado por acúmulos relativamente baixos de espécies LMW e HMW, bioatividade in vitro, atividade de ligação in vitro e estabilidade após nebulização.

Formulações

Uma formulação de anticorpo anti-IL-13 conforme aqui descrita inclui um anticorpo anti-IL-13, um composto que possa servir como um crioprotetor e um tampão. O pH da formulação é em geral pH 5,5 - 6,5. Em algumas modalidades, a formulação é armazenada como um liquido. Em outras modalidades, a formulação é preparada como um liquido e é, então, secada, por exemplo, por liofilização ou secagem por pulverização, antes do armazenamento. Uma formulação seca pode ser usada como um composto seco, por exemplo, como um aerossol ou pó, ou reconstituída a sua concentração original ou outra, por exemplo, usando água, um tampão ou outro líquido apropriado. 0 processo de purificação do anticorpo é projetado para permitir a transferência do anticorpo para uma formulação adequada para armazenamento de longo prazo como um liquido congelado e subseqüentemente para liofilização (por exemplo, usando uma formulação de histidina/sacarose). A formulação é liofilizada com a proteína a uma concentração específica. A formulação liofilizada pode ser, então, reconstituída quando necessário com um diluente adequado (por exemplo, água) para ressolubilizar os componentes de formulação originais em uma concentração desejada, geralmente a uma concentração igual ou maior em comparação com a concentração antes da liofilização. A formulação liofilizada pode ser reconstituída para produzir uma formulação que tenha uma concentração diferente da concentração original (isto é, antes da liofilização), dependendo da quantidade de água ou diluente adicionada ao liofilizado com relação ao volume de líquido que foi originalmente liofilizado (por exemplo, Exemplo 6, infra).

Formulações de anticorpos anti-IL-13 adequadas podem ser identificadas por ensaio de um ou mais parâmetros de integridade de anticorpo. Os parâmetros ensaiados são genericamente a porcentagem de espécies HMW ou a porcentagem de espécies LMW. A porcentagem de espécies HMW ou espécies LMW é determinada como uma porcentagem do teor de proteína total em uma formulação ou como uma alteração na porcentagem de aumento com o tempo (isto é, durante o armazenamento). A porcentagem total de espécies HMW em uma formulação aceitável não é maior que 10% de espécies HMW após armazenamento como um liofilizado ou liquido de 2 °C a 40 °C (por exemplo, de 2°C a 25°C, de 2°C a 15°C, de 2°C a S0C, a cerca de 2°C ou a cerca de 25°C) durante pelo menos um ano, ou não é maior que cerca de 10% de espécies LMW após armazenamento como um liofilizado ou liquido de 2 °C a 40 °C durante pelo menos um ano. "Cerca de" significa ±20% de um valor numérico citado. Assim, "cerca de 20°C" significa 16°C a 24°C. Tipicamente, o perfil de estabilidade é de menos de 10% de HMW/LMW a 2° - 8°C para um produto refrigerado, e 25°C para um produto à temperatura ambiente. Espécies HMW ou espécies LMW são ensaiadas em uma formulação armazenada como um liofilizado depois que o liofilizado é reconstituído. 40°C é uma condição acelerada que é geralmente usada para testes de estabilidade e determinação da estabilidade para exposições de curto prazo a condições de não armazenamento, por exemplo, que podem ocorrer durante a transferência de um produto durante o transporte.

Quando o parâmetro ensaiado é a porcentagem de alteração em espécies HMW ou espécies LMW, a porcentagem de proteína total em uma ou ambas as espécies após o armazenamento é comparada com a porcentagem de proteína total em uma ou ambas as espécies antes do armazenamento (por exemplo, com a preparação da formulação). Determina-se a diferença nas porcentagens. Em geral, a alteração na porcentagem de proteínas em espécies HMW ou espécies LMW em formulações líquidas não é maior que 10%, por exemplo, não maior do que 4%, ou não maior do que cerca de 3% após armazenamento a 2° - 8°C ou 25°C durante cerca de dezoito a vinte e quatro meses. "Cerca de" significa ±20% de um valor numérico citado. Assim, de cerca de 10% significa de 8% a 12%. Formulações armazenadas como produto liofilizado em geral têm menos de cerca de 5%, menos de cerca de 4%, menos de cerca de 3%, ou menos de cerca de 2% de espécies LMW após reconstituição depois de um armazenamento a 2°C - 8 °C (por exemplo, 4 °C) durante cerca de dezoito a vinte e quatro meses.

As formulações podem ser armazenadas como um liofilizado durante, por exemplo, pelo menos dois anos, pelo menos três anos, pelo menos quatro anos ou pelo menos cinco anos. Em um exemplo, uma formulação de anticorpo anti-IL-13 contém 100 mg/mL de anticorpo anti-IL-13, 10 mM de histidina, 5% de sacarose, e tem um pH de 6,0. Em outro exemplo, uma formulação de anticorpo anti-IL-13 contém 100 mg/mL de anticorpo anti-IL-13, 10 mM de histidina, 5% de sacarose, 0,01% de Tween 80, 2% de arginina, e tem um pH de 6,0. Em outro exemplo, a formulação contém 0,5 mg/mL de anticorpo anti-IL-13, 10 mM de histidina, 5% de sacarose, e tem um pH de 6,0. Em ainda outro exemplo, a formulação contém 0,5 mg/mL de anticorpo anti-IL-13, 10 mM de histidina, 5% de sacarose, 0,01% de Tween 80, 2% de arginina, e tem um pH de 6,0.

Detalhes adicionais relativos a componentes das formulações e métodos para ensaio da integridade do anticorpo anti-IL-13 em uma formulação são apresentados abaixo. Anticorpos

Um anticorpo anti-IL-13 é um componente das formulações aqui descritas. Conforme aqui usado, a menos que especificado de outra forma, o termo "anticorpo" inclui anticorpos policlonais, anticorpos monoclonais, composições de anticorpos com especificidades poliepitópicas, anticorpos bioespecificos, diacorpos, moléculas de cadeia única que façam parte de um anticorpo, anticorpos híbridos, como anticorpos completa ou parcialmente humanizados, fragmentos de anticorpos de ligação a antígeno, como fragmentos Fab, fragmentos F(ab')2 e fragmentos Fv, e modificações dos precedentes (por exemplo, anticorpos pegilados ou fragmentos de anticorpos). A molécula de anticorpo anti-IL-13 usada na formulação pode ser uma proteína efetivamente humana, humanizada, enxertada com CDR, quimérica, com mutação, maturada para afinidade, desimunizada, sintética ou de outra forma gerada in vitro. Em uma modalidade, o anticorpo para IL-13 é um anticorpo humanizado. Em uma modalidade, o anticorpo para IL-13 não é antigênico para seres humanos e não causa uma resposta HAMA.

Uma molécula de anticorpo anti-IL-13 pode ser usada para modular (por exemplo, inibir) pelo menos uma atividade associada a IL-13 in vivo. 0 anticorpo para IL-13 pode ser usado para tratar ou prevenir um transtorno associado a IL-13, ou para melhorar pelo menos um de seus sintomas. Transtornos associados a IL-13 exemplificativos incluem transtornos inflamatórios (por exemplo, inflamação do pulmão), transtornos respiratórios (por exemplo, asma, incluindo asma alérgica e não alérgica, doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD)), assim como condições gue envolvam inflamação das vias aéreas, eosinofilia, transtornos fibróticos (por exemplo, fibrose cistica, fibrose do fígado e fibrose pulmonar), esclerodermia, produção excessiva de muco; transtornos atópicos (por exemplo, dermatite atópica, urticária, eczema, rinite alérgica, e enterogastrite alérgica), um câncer associado a IL-13 (por exemplo, uma leucemia, glioblastoma ou linfoma, por exemplo, linfoma de Hodgkin), transtornos gastro- intestinais (por exemplo, doenças inflamatórias do intestino), transtornos do fígado (por exemplo, cirrose) e infecções virais.

As concentrações de anticorpos nas formulações em geral estão entre cerca de 0,1 mg/mL e cerca de 250 mg/mL, por exemplo, cerca de 0,5 mg/mL e cerca de 100 mg/mL, cerca de 0,5 mg/mL e cerca de 1.0 mg/mL, cerca de 0,5 mg/mL e cerca de 45 mg/mL, cerca de 1 mg/mL e cerca de 10 mg/mL, cerca de 10 mg/mL e cerca de 40 mg/mL, cerca de 10 mg/mL e cerca de 50 mg/mL, cerca de 50 mg/mL e cerca de 100 mg/mL, cerca de 100 mg/mL e cerca de 200 mg/mL, cerca de 200 mg/mL e cerca de 250 mg/mL de anti-IL-13. No contexto de faixas, "cerca de" significa -20% do menor valor numérico citado da faixa e +20% do maior valor numérico citado da faixa. No contexto de faixas, por exemplo, de cerca de 10 mg/mL a cerca de 100 mg/mL, isso significa entre 8 mg/mL e 120 mg/mL. Em alguns casos, as concentrações de anticorpos nas formulações podem estar, por exemplo, entre 0,1 mg/mL e 200 mg/mL, por exemplo, 0,5 mg/mL e 100 mg/mL, 0,5 mg/mL e 1,0 mg/mL, 0,5 mg/mL e 45 mg/mL, 1 mg/mL e 10 mg/mL, 10 mg/mL e 40 mg/mL, 10 mg/mL e 50 mg/mL, 50 mg/mL e 100 mg/mL, 100 mg/mL e 200 mg/mL de anti-IL-13. Essas formulações de anticorpos podem ser usadas como agentes terapêuticos. Portanto, a concentração de anticorpo em uma formulação é suficiente para fornecer essas dosagens em um volume da formulação que seja tolerado por um sujeito que esteja sendo tratado e seja apropriado para o método de administração. Em um exemplo não limitativo, para suprir uma alta dosagem por via subcutânea, em que a limitação de volume é pequena (por exemplo, de cerca de 1 mL a 1,2 mL por injeção), a concentração de anticorpo é, em geral, de pelo menos 100 mg/mL ou mais, por exemplo, 100 mg/mL a 500 mg/mL, 100 mg/mL a 250 mg/mL, ou 100 mg/mL a 150 mg/mL. Essas altas concentrações podem ser conseguidas, por exemplo, por reconstituição de uma formulação liofilizada em um volume apropriado de diluente (por exemplo, água estéril para injeção, salina tamponada). Em alguns casos, a formulação reconstituída tem uma concentração entre cerca de 100 mg/mL e 500 mg/mL (por exemplo, 100 mg/mL, 125 mg/mL, 150 mg/mL, 175 mg/mL, 200 mg/mL, 250 mg/mL, 275 mg/mL, 300 mg/mL, 350 mg/mL, 375 mg/mL, 400 mg/mL, 425 mg/mL, 450 mg/mL, 475 mg/mL e 500 mg/mL). Para distribuição mediante inalação, a formulação é, em geral, ligeiramente concentrada (por exemplo, entre cerca de 100 mg/mL e 500 mg/mL), de modo a fornecer uma dose suficiente em um volume limitado de aerossol para inspiração. Em alguns casos, usam-se baixas concentrações (por exemplo, entre cerca de 0,05 mg/mL e 1 mg/mL). Conhecem-se métodos na técnica para adaptar a dosagem distribuída ao método de distribuição, por exemplo, um nebulizador de jato ou aerossol medido.

Anticorpos que podem ser usados em uma formulação de anticorpo anti-IL-13 incluem, por exemplo, anticorpos anti-IL-13 murídeos e murídeos humanizados. Os anticorpos podem ser anticorpos de cadeia leve kapa. Os anticorpos podem ser naturais ou manipulados para serem anticorpos IgG, IgE, IgA, IgM ou fragmentos de ligação a IL-13, conforme acima descrito. Em alguns casos, os anticorpos são anticorpos IgGl, IgG2 ou IgG4. Exemplos de anticorpos anti- IL-13 para uso nesta invenção são descritos no Pedido de Patente Norte-americana n° 11/155.843, Pedido de Patente Norte-americana n° 11/149.309, e WO 2006/085938, cujos conteúdos são aqui incorporados por referência. Exemplos não limitativos de anticorpos anti-IL-13 para uso nesta invenção incluem IMA-638 (Figura 34) e IMA-026 (Figura 35). Em algumas modalidades, a cadeia pesada do anticorpo anti-IL-13 tem cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 91%, cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98%, ou cerca de 99% de identidade de seqüência com SEQ ID N0:1, e a cadeia leve cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 91%, cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98%, ou de cerca de 99% de identidade de seqüência com SEQ ID NO:2, e o anticorpo se liga a IL-13. Em algumas modalidades, a cadeia pesada do anticorpo anti-IL-13 tem cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 91%, cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98%, ou de cerca de 99% de identidade de seqüência com SEQ ID NO: 3, e a cadeia leve cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 91%, cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98%, ou de cerca de 99% de identidade de seqüência com SEQ ID NO: 4, e o anticorpo se liga a IL-13. Em certas modalidades, os anticorpos anti-IL-13 se ligam a IL-13 com uma afinidade correspondente a um K0 de menos de 5 X IO-7 Μ, 1 X 10"7 M, 5 X 10"8 Μ, 1 X 10"8 M, 5 X 10"9 Μ, 1 X 10"9 M, mais tipicamente menos de 5 X 10"10 Μ, 1 X 10"10 M, 5 X 10"11 Μ, 1 X IO"11 M, ou mais. Métodos de introdução de substituições em uma proteína são bem conhecidos na técnica. Em uma modalidade, o anticorpo para IL-13 pode se associar a IL-13 com uma cinética na faixa de IO3 a IO8 M-1S-1, tipicamente 10^4 a 10^7 M" 1S-1. Em ainda outra modalidade, o agente de ligação a IL-13 tem uma cinética de dissociação na faixa de IO"2 a IO"6 s"1, tipicamente IO"2 a IO"5 s"1. Em uma modalidade, o agente de ligação a IL-13 se liga a IL-13, por exemplo, IL-13 humano, com uma afinidade e/ou cinética similar (por exemplo, com um fator 20, 10 ou 5) ao anticorpo monoclonal HJ 2-7 ou C65 (veja a Patente Norte-americana Publ. n° 20060073148), ou suas formas modificadas, por exemplo, suas formas quiméricas ou formas humanizadas (por exemplo, uma forma humanizada aqui descrita) . A afinidade e a cinética de ligação de um agente de ligação a IL-13 podem ser testadas usando-se, por exemplo, tecnologia de biossensor (BIACORE™).

Tampões e Crioprotetores

O pH da formulação conforme aqui descrita em geral está entre cerca de pH 5,0 e cerca de 7,0, por exemplo, cerca de pH 5,5 e cerca de 6,5, cerca de pH 5,5 e cerca de 6,0, cerca de pH 6,0 e cerca de 6,5, pH 5,5, pH 6,0, ou pH 6,5. Em geral, usa-se um tampão que possa manter uma solução em pH 5,5 a 6,5 para preparar uma formulação, por exemplo, um tampão com um pKA de cerca de 6,0. Tampões adequados incluem, sem limitação, tampão histidina, ácido 2- morfolinoetanossulfônico (MES), cacodilato, fosfato, acetato, succinato e citrato. A concentração do tampão está entre cerca de 4 mM e cerca de 60 mM, por exemplo, de cerca de 5 mM a cerca de 25 mM, por exemplo, a histidina é em geral usada a uma concentração de até 60 mM. Em alguns casos, usa-se tampão histidina a uma concentração de cerca de 5 mM ou de cerca de 10 mM. Em outros casos, usa-se tampão acetato ou succinato a uma concentração de cerca de 5 mM ou de cerca de 10 mM.

Uma formulação de anticorpo anti-IL-13 inclui um crioprotetor. Crioprotetores são conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, sacarose, trealose e glicerol. Em geral, usa-se um crioprotetor que exibe baixa toxicidade em sistemas biológicos. 0 crioprotetor é incluído na formulação a uma concentração de cerca de 0,5% a 15%, de cerca de 0,5% a 2%, de cerca de 2% a 5%, de cerca de 5% a 10%, de cerca de 10% a 15%, e de cerca de 5% (peso/volume). O tampão histidina, que pode ser usado como um tampão em uma formulação de anticorpo anti-IL-13, pode ter propriedades crioprotetoras. Em algumas modalidades da invenção, usa-se um tampão histidina juntamente com um crioprotetor, como um açúcar, por exemplo, sacarose. Uma formulação da invenção pode excluir especificamente o uso de histidina em qualquer quantidade substancial, por exemplo, nem o tampão nem o componente crioprotetor da formulação é histidina.

A viscosidade da formulação em geral é uma que seja compatível com a via de administração da formulação. Em algumas modalidades, a viscosidade da formulação está entre 1 cP e 2 cP, ou similar à da água (cerca de 1 cP). Em outras modalidades, a viscosidade da formulação está entre cerca de 5 cP e cerca de 40 cP. Em modalidades específicas, a viscosidade da formulação é de 1 cP, 2 cP, 3 cP, 4 cP, 5 cP, 10 cP, 15 cP, 20 cP, 25 cP, 30 cP, 35 cP, ou 40 cP.

Surfactantes

Em certas modalidades, inclui-se um surfactante na formulação. Exemplos de surfactante incluem, sem limitação, surfactante não iônicos, como polissorbatos (por exemplo, polissorbato-20, polissorbatopolissorbato-60, polissorbato- 65to-65, polissorbato-80, ou polissorbato-85); poloxâmeros (por exemplo, loxâmero 188); Triton™; dodecil sulfato de sódio (SDS); Iauril sulfato de sódio; octil glicosida de sódio; lauril-sulfobetaína, miristil-sulfobetaína, linoleil- sulfobetaína, estearil-sulfobetaína, lauril-sarcosina, miristil-sarcosina, linoleil-sarcosina, estearil-sarcosina, linoleil-betaína, miristil-betaina, cetil-betaina, lauroamidopropil-betaina, cocoamidopropil-betaína, linole- amidopropil-betaina, miristamidopropil-betaina, palmitopro- pil-betaína, isoestearamidopropil-betaína (por exemplo, lauroamidopropil), miristamidopropil-, palmidopropil-, ou isoestearamidopropil-dimetilamina; metil cocoil- ou metil oleil-taurato de sódio ou de dissódio; e a série Monaquat™ (Mona Industries, Inc., Paterson, N.J.), polietil glicol, polipropil glicol e copolimeros de etileno e propileno glicol (por exemplo, pluronics, PF68).

A quantidade de surfactante adicionada é suficiente para reduzir a agregação da proteína reconstituída a um nível aceitável, conforme ensaiado usando-se, por exemplo, SEC-HPLC de espécies HMW ou espécies LMW, e minimizar a formação de partículas após a reconstituição de um liofilizado de uma formulação de anticorpo anti-IL-13. Também se demonstrou que a adição de surfactante reduz o tempo de reconstituição de uma formulação liofilizada de anticorpos anti-IL-13, e auxiliar na desgaseificação da solução. Por exemplo, o surfactante pode estar presente na formulação (líquida ou antes da liofilização) em uma quantidade de cerca de 0,001% a 0,5%, por exemplo, de cerca de 0,005% a 0,05%, de cerca de 0,005% a cerca de 0,2%, e de cerca de 0,01% a 0,2%.

Adições a Formulações Anti-IL-13

As formulações são armazenadas como soluções estéreis ou liofilizados estéreis. A prevenção da ação de microorganismos nas formulações também pode ser conseguida pela inclusão de pelo menos um agente antibacteriano e/ou antifúngico em uma formulação, por exemplo, parabéns, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal e outros. Em alguns casos, o liofilizado é reconstituído com água bacteriostática (por exemplo, água contendo 0,9% de álcool benzílico). Considerações para a inclusão de um preservativo em uma formulação são conhecidas na técnica, assim como métodos de identificação de preservativos que sejam compatíveis com uma formulação e um método de distribuição específicos (por exemplo, veja Gupta, et al. (2003), AAPS Pharm. Sei. 5:article 8, p. 1-9).

Em alguns casos, a formulação é isotônica. Em geral, qualquer componente conhecido na técnica que contribua para a osmolaridade/tonicidade em solução pode ser adicionado à formulação (por exemplo, sais, açúcares, poliálcoois ou uma combinação desses). A isotonicidade em geral é atingida usando-se um componente de uma formulação básica (como sacarose) em uma concentração isotônica ou adicionando-se ura componente adicional, como um açúcar, um poliálcool, como manitol ou sorbitol, ou um sal, como cloreto de sódio.

Em alguns casos, usa-se um sal em uma formulação de anticorpo anti-IL-13, por exemplo, para atingir a isotonicidade ou para aumentar a integridade do anticorpo anti-IL-13 da formulação. Sais adequados para uso são discutidos acima. A concentração do sal pode ser de 0 mM a cerca de 300 mM. Em certos casos, a formulação é preparada com Tween (por exemplo, Tween® 20, Tween® 80) para diminuir a degradação interfacial. A concentração de Tween pode ser.de cerca de 0,001% a cerca de 0,05%. Em um exemplo, Tween 80 é usado a uma concentração de 0,01% na formulação.

Em certos outros casos, a formulação é preparada com arginina. A concentração de arginina na formulação pode ser de cerca de 0,01% a cerca de 5%. Em um exemplo, a arginina é usada a uma concentração de 2% na formulação. Em alguns casos, tanto Tween, quanto arginina são adicionados às formulações de IL-13 aqui descritas.

Em ainda outros casos, a formulação pode ser preparada com pelo menos um de: sorbitol, glicina, metionina ou cloreto de sódio. Se for incluído sorbitol na formulação, pode ser adicionado a uma concentração entre cerca de 1% e cerca de 10%. Em um exemplo, sorbitol é encontrado na formulação a uma concentração de 5%. Se for incluída glicina na formulação, pode ser adicionada a uma concentração entre cerca de 0,1% e cerca de 2%. Em um exemplo, glicina é encontrada na formulação a uma concentração de 1%. Se for incluída metionina na formulação, pode ser adicionada a uma concentração entre cerca de 5 mM e cerca de 150 mM. Em um exemplo, a metionina é adicionada à formulação a uma concentração de 100 mM. Em outro exemplo, a metionina é adicionada à formulação a uma concentração de 70 mM. Se for incluído cloreto de sódio na formulação, pode ser adicionado a uma concentração entre cerca de 5 mM e cerca de 100 mM. Em um exemplo, o cloreto de sódio é adicionado à formulação a uma concentração de 55 mM.

Armazenamento e métodos de preparação

Congelamento

Em alguns casos, formulações contendo anticorpos são congeladas para armazenamento. Portanto, é desejável que a formulação seja relativamente estável sob essas condições, incluindo sob ciclos de congelamento-descongelamento. Um método para determinar se a formulação é adequada é submeter uma formulação de amostra a pelo menos dois, por exemplo, três, quatro, cinco, oito, dez ou mais ciclos de congelamento (a, por exemplo, -20°C ou -80°C) e descongelamento (por exemplo, por descongelamento rápido em um banho de água a 37 °C ou descongelamento lento a 2° 8°C), determinando-se a quantidade de espécies LMW e/ou espécies HMW que se acumula após os ciclos de congelamento- descongelamento e comparando-se à quantidade de espécies LMW ou espécies HMW presentes na amostra antes do procedimento de congelamento-descongelamento. Um aumento nas espécies HMW ou LMWindica estabilidade diminuída.

Liofilização

As formulações podem ser armazenadas após liofilização. Consequentemente, o teste de uma formulação quanto à estabilidade do componente protéico da formulação após liofilização é útil para determinar se uma formulação é adequada. 0 método é similar ao acima descrito para o congelamento, exceto que a formulação de amostra é liofilizada, em vez de congelada, reconstituída a seu volume original e testada na presença de espécies LMW e/ou espécies HMW. A formulação de amostra liofilizada é comparada a uma formulação de amostra correspondente que não tenha sido liofilizada. Um aumento em espécies HMW ou LMW na amostra liofilizada, em comparação com a amostra correspondente indica estabilidade diminuída na amostra liofilizada. Exemplos de métodos para testar protocolos de liofilização também são apresentados no Exemplo 5 abaixo.

Em geral, um protocolo de liofilização inclui o carregamento de uma amostra em um Iiofilizador, um período de pré-resfriamento, congelamento, iniciação do vácuo, elevação gradual até a temperatura de secagem primária, secagem primária, elevação gradual até a temperatura de secagem secundária, secagem secundária e fechamento da amostra. Parâmetros adicionais que podem ser selecionados para um protocolo de liofilização incluem o vácuo (por exemplo, em mícons) e temperatura do condensador. Taxas de subida adequadas para a temperatura estão entre cerca de 0,l°C/min e 2°C/min, por exemplo 0,1"C/min e l,0°C/min, 0, 1° C/min e 0,5°C/min, 0,2°C/min e 0,5°C/min, 0,1*C/min, 0,2 ° C/min, 0,3°C/min, 0,4"C/min, 0,5°C/min, 0,6°C/min, 0,7°C/min, 0,8°C/min, 0,9°C/min e l,0°C/min. As temperaturas de prateleira durante o congelamento para um ciclo de liofilização são geralmente de cerca de -55°C a -5°C, -25°C a -5 ° C, -20 °C a -5°C, -15°C a -5°C, -10°C a -5°C, -10°C, -11°C, -12 ° C, -13 ° C , -14 °C, -15°C, -16°C, -17°C, -18°C, -19 °C, -20 °C, -21° C, -22 ° C, -23°C, -24°C, ou -25°C. As temperaturas de prateleira podem ser diferentes para a secagem primária e a secagem secundária, por exemplo, a secagem primária pode ser realizada a uma temperatura menor que a secagem secundária. Em um exemplo não limitativo, a secagem primária pode ser executada a 0°C, e a secagem secundária a 25°C.

Em alguns casos, usa-se um protocolo de recozimento durante o congelamento e antes do inicio do vácuo. Nesses casos, o tempo de recozimento tem de ser selecionado, e a temperatura em geral está acima da temperatura de transição de vidro da composição. Em geral, o tempo de recozimento é de cerca de 2 a 15 horas, de cerca de 3 a 12 horas, de cerca de 2 a 10 horas, de cerca de 3 a 5 horas, de cerca de 3 a 4 horas, de cerca de 2 horas, de cerca de 3 horas, de cerca de 5 horas, de cerca de 8 horas, de cerca de 10 horas, de cerca de 12 horas, ou de cerca de 15 horas. Δ temperatura para o recozimento em geral é de cerca de -35 °C a cerca de -5 °C, por exemplo, de cerca de -25°C a cerca de -8°C, de cerca de -20°C a cerca de -10"C, de cerca de -25°C, de cerca de -20°C, de cerca de -15°C, de cerca de 0"C, ou de cerca de -5°C. Em alguns casos, a temperatura de recozimento é em geral de -35° C a 5 °C, por exemplo, de 25°C a -8°C, -20°C a -10°C, -25°C, -20°C, -15°C, 0°C, ou 5°C.

Em um exemplo, demonstrou-se que um anticorpo anti-IL-13 em uma formulação aqui descrita era robusto em vários parâmetros de liofilização incluindo: a presença ou ausência de uma etapa de tratamento térmico pré-vácuo (recozimento) acima da temperatura de transição de vidro (Tg'), das temperaturas de prateleira na secagem primária de -25°C a 30°C, e prateleira de secagem secundária de 2 horas a 9 horas a 25° - 30°C.

Em um exemplo não limitativo, formulou-se uma formulação de 10 mM de histidina, 5% de sacarose, pH 6,0, a uma concentração de proteína de 50 mg/mL de IL-13 a granel e liofilizada. Após a liofilização, o produto é reconstituído com aproximadamente metade do volume de enchimento para distribuir proteína a 100 mg/mL. Demonstrto a 50 °C durante quatro semanas era idêntico para o material que havia sido preparado usando-se vários' ciclos de congelamento-secagem (por exemplo, veja as Figuras. 16-20), alguns dos quais tinham diferenças de quase 10 °C na temperatura de produto durante a secagem primária (por exemplo, Figura 13). Em geral, um ciclo de liofilização pode ser operado de 10 horas a 100 horas, por exemplo, 20 horas a 80 horas, 30 horas a 60 horas, 40 horas a 60 horas, 45 horas a 50 horas, 50 horas a 65 horas.

Exemplos não limitativos da faixa de temperaturas para armazenamento de uma formulação de anticorpo são de cerca de -20°C a cerca de 50°C, por exemplo, de cerca de -15° a cerca de 30°C, de cerca de -15°C a cerca de 20°C, de cerca de 5°C a cerca de 25°C, de cerca de 5°C a cerca de 20°C, de cerca de 5°C a cerca de 15°C. de cerca de 2°C a cerca de 12°C, de cerca de 2°C a cerca de 10°C, de cerca de 2 °C a cerca de 8°C, de cerca de 2°C a cerca de 6°C, 2°C, 3°C, 4 °C, 5°C, 6°C, 7°C 8°C, 10°C, 15°C ou 25°C. Independentemente das temperaturas de armazenamento, em certos casos, as amostras são estáveis sob alterações de temperatura que podem ocorrer transitoriamente durante as condições de armazenamento e transporte que possam ser antecipadas para essas composições.

Secagem por pulverização

Em alguns casos, a formulação é secada por pulverização e, então, armazenada. A secagem por pulverização é conduzida usando-se métodos conhecidos na técnica e pode ser modificada para usar secagem por pulverização liquida ou congelada (por exemplo, usando-se métodos como os da Niro Inc. (Madison, WI), Upperton Particle Technologies (Nottingham, England), ou Buchi (Brinkman Instruments Inc., Westbury, NY), ou Patentes Norte-americanas Pub. n° 20030072718 e 20030082276).

Determinação da Integridade do Anticorpo

O acúmulo de espécies LMW e HMW é uma medida útil da estabilidade do anticorpo. 0 acúmulo de LMW ou HMW em uma formulação é indicativo de instabilidade de uma proteína armazenada como parte da formulação. A cromatografia de exclusão de tamanho com HPLC pode ser usada para determinar a presença de espécies LMW e HMW. Sistemas adequados para essas medições são conhecidos na técnica, por exemplo, sistemas de HPLC (Waters, Milford, MA) . Outros sistemas conhecidos na técnica podem ser usados para avaliar a integridade do anticorpo em uma formulação, por exemplo, SDS-PAGE (para monitorizar espécies HMW e LMW), bioensaios de atividade de anticorpo, ensaio imunossorvente ligado a enzima, capacidade de se ligar a proteína IL-13 purificada e HPLC de troca de cátions (CEX-HPLC; para detectar variantes e monitorizar a carga de superfície). Em um exemplo, o bioensaio é um ensaio à base de células em que a inibição da proliferação celular dependente de IL-13 é examinada na presença de diferentes concentrações de anticorpo formulado para demonstrar a atividade biológica, isto é, a capacidade de se ligar a e seqüestrar IL-13 das células.

Artigos de Fabricação O presente pedido também apresenta um artigo de fabricação que inclui uma formulação conforme aqui descrita e fornece instruções para uso da formulação. O artigo de fabricação pode incluir um recipiente adequado para conter a formulação. Um recipiente adequado pode ser, sem limitação, uma garrafa, frasco, seringa, tubo de ensaio, nebulizador (por exemplo, nebulizadores ultrassônicos ou de malha vibratória), bolsa de solução i.v. ou inalador (por exemplo, um inalador de dose medida (MDI) ou inalador de pó seco (DPI)). O recipiente pode ser formado por qualquer material adequado, como vidro, metal ou um plástico, como policarbonato, poliestireno ou polipropileno. Em geral, o recipiente é de um material que não adsorva quantidades significativas de proteína da formulação e não seja reativo com componentes da formulação. Em algumas modalidades, o recipiente é um frasco de vidro claro com uma rolha cinza siliconizada West 4432/50 1319 ou uma rolha West 4023 Durafluor. Em algumas modalidades, o recipiente é uma seringa. Em modalidades específicas, a formulação compreende 100 mg/mL de um anticorpo anti-IL-13 (por exemplo, IMA-026, ΙΜΑ-638), 10 mM de histidina, 5% de sacarose, 0,01% de Tween-80, 40 mM de NaCl, pH 6,0, em uma seringa previamente enchida. Em certas modalidades, a seringa é adequada para uso com um dispositivo autoinjetor.

Exemplos de nebulizadores incluem, em exemplos não limitativos, nebulizadores de jato, nebulizadores ultrassônicos e nebulizadores de malha vibratória. Essas classes usam diferentes métodos para criar um aerossol a partir de um liquido. Em geral, qualquer dispositivo gerador de aerossol que possa manter a integridade da proteina nessas formulações é adequado para a distribuição de formulações conforme aqui descritas.

As formulações a serem usadas para administração a um sujeito, por exemplo, como uma substância farmacêutica, têm de ser estéreis. Isso é conseguido usando-se métodos conhecidos na técnica, por exemplo, por filtração através de membranas de filtração estéril, antes ou depois da formulação de um liquido ou liofilização e reconstituição. Alternativamente, quando não danificará a estrutura, os componentes da formulação podem ser esterilizados por autoclavagem e, então, combinados com componentes esterilizador por filtro ou radiação, para produzir uma formulação.

Métodos de Tratamento

As formulações de anticorpos anti-IL-13 são utilizáveis para o tratamento de transtornos associados à expressão ou atividade indesejável de IL-13. Esses transtornos incluem transtornos inflamatórios, como artrite, asma, doença inflamatória do intestino, transtornos inflamatórios da pele, esclerose múltipla, osteoporose, tendinite, transtornos alérgicos, inflamação em resposta a um insulto ao hospedeiro, sépsis, artrite reumatóide, osteoartrite, doença do intestino irritável, colite ulcerativa, psoriase, lúpus eritematoso sistêmico e qualquer outra doença autoimune. Em certas modalidades do método, o transtorno relacionado a IL-13 é asma alérgica, asma não alérgica, leucemia linfocitica crônica de células B (CLL de células Β) , doença de Hodgkin, fibrose tissular em esquistossomose, doença reumática autoimune, transtorno inflamatório do intestino, artrite reumatóide, condições que envolvam inflamação das vias aéreas, eosinofilia, fibrose e produção excessiva de muco (por exemplo, fibrose cistica e fibrose pulmonar); transtornos atópicos (por exemplo,trinite alérgica); condições inflamatórias e/ou autoimunes da pele (por exemplo, dermatite atópic-a) , condições inf lamatórias e/ou autoimunes dos órgãos gastrointestinais (por exemplo, doenças inflamatórias do intestino (IBD)), condições inflamatórias e/ou autoimunes do figado (por exemplo, cirrose); infecções virais; esclerodermia e fibrose de outros órgãos, como fibrose do figado, conjuntivite alérgica, eczema, urticária, alergias alimentares, doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD), colite ulcerativa, infecção por virus sincicial respiratório, uveite, esclerodermia ou osteoporose. Assim, uma formulação de anticorpo anti-IL-13 pode ser usada como uma composição farmacêutica. A presente invenção apresenta tanto métodos profiláticos, quanto terapêuticos de tratamento de um sujeito como risco de (ou suscetível a) um transtorno ou com um transtorno ou uma complicação de um transtorno associado a expressão ou atividade aberrante ou indesejável de IL-13. Conforme aqui usado, o termo "tratamento" é definido como a aplicação ou administração de um agente terapêutico a um sujeito, ou aplicação ou administração de um agente terapêutico a um tecido ou linhagem celular isolada de um sujeito, que tenha uma doença, um sintoma de uma doença ou uma predisposição a uma doença, com a finalidade de curar, sanar, aliviar, atenuar, alterar, remediar, melhorar, recuperar ou afetar a doença, os sintomas da doença ou a predisposição à doença.

Uma formulação de anticorpo anti-IL-13 pode ser administrada a um sujeito necessitado de tratamento usando- se métodos conhecidos na técnica, incluindo administração oral, parenteral, subcutânea, intramuscular, intravenosa, intra-articular, intrabrônquica, intra-abdominal, intra- capsular, intracartilaginosa, intracavitária, intracelial, intracerebelar, intracerebroventricular, intracólica,

intracervical, intragástrica, intra-hepática, intramio- cárdica, intraocular, intraosteal, intrapélvica, intrape- ricárdica, intraperitoneal, intrapleural, intraprostática, intrapulmonar, intrarretal, intrarrenal, intrarretineano, intraespinhal, intrassinovial, intratorácico, intrauterino, intravesical, intralesional, de bolus, vaginal, retal, bucal, sublingual, intranasal, transdérmica (tópica) ou transmucosa. Para administração por inalação, os compostos são distribuídos na forma de um spray em aerossol por um recipiente ou distribuidor pressurizado que contenha um propelente adequado, por exemplo, um gás, como dióxido de carbono, ou um nebulizador. Em certas modalidades, a formulação é administrada como uma formulação de liberação prolongada, liberação estendida, liberação no tempo, liberação controlada ou liberação contínua. Em algumas modalidades, usam-se formulações de depósito para administrar o anticorpo ao sujeito necessitado.

Composições orais ou parenterais podem ser preparadas em forma de dosagem unitária por razões de facilidade de administração e uniformidade da dosagem. "Forma de dosagem unitária", conforme aqui usado, refere-se a unidades fisicamente distintas adequadas como dosagens unitárias para o sujeito a ser tratado; cada unidade contendo uma quantidade predeterminada de composto ativo calculada para produzir o efeito terapêutico desejado, em associação com o veículo farmacêutico selecionado. No caso de um método de inalação, como um inalador de dose medida, o dispositivo é projetado para distribuir uma quantidade apropriada da formulação.

A toxicidade e a eficácia terapêutica da formulação podem ser determinadas por procedimentos farmacêuticos conhecidos na técnica usando-se, por exemplo, culturas celulares ou animais experimentais, por exemplo, para a determinação da LD5O (a dose letal para 50% da população) e da ED50 (a dose terapeuticamente eficaz em 50% da população). A razão de dose entre os efeitos tóxicos e terapêuticos é o índice terapêutico e pode ser expressa como a razão LD50/ED50.

Os dados obtidos nos ensaios de cultura celular e estudos com animais podem ser usados na formulação de uma faixa de dosagens para uso em seres humanos. A dosagem dessas formulações em geral se encontra dentro de uma faixa de concentrações circulantes que incluam a ED50 com pouca ou nenhuma toxicidade. A dosagem pode variar dentro dessa faixa dependendo da forma de dosagem empregada e da via de administração utilizada. Para qualquer formulação usada no método da invenção, a dose terapéuticamente eficaz pode ser inicialmente estimada em ensaios de cultura celular. Pode-se formular uma dose em modelos animais para atingir uma faixa de concentrações plasmáticas circulantes que inclui a IC50 (isto é, a concentração do composto de teste que atinge metade da inibição máxima dos sintomas) conforme determinado em cultura celular. Essa informação pode ser usada para determinar com maior precisão doses utilizáveis em seres humanos. Os níveis no plasma podem ser medidos, por exemplo, por cromatografia líquida de alto desempenho ou ensaios de ligação específica (por exemplo, ELISA). Modelos animais adequados são conhecidos na técnica e incluem, sem limitação, primatas não humanos nos quais a eficácia tenha sido demonstrada em resposta a um deságio com antígeno e ovelhas sensíveis ao antígeno após um desafio com o antígeno e cobaias. Em geral, distribui-se uma formulação de modo que a dosagem seja de pelo menos cerca de 0,1 mg de anticorpo anti-IL-13/kg de peso corporal (em geral de cerca de 1 mg/kg a cerca de 10 mg/kg) . Se o anticorpo tiver de agir no 5 cérebro, uma dosagem de 50 mg/kg a 100 mg/kg pode ser apropriada. A dosagem pode ser reduzida (em comparação com uma administração parenteral) quando distribuída diretamente ao sítio de ação, por exemplo, quando administrada diretamente ao tecido pulmonar por inalação. Uma formulação aqui descrita pode ser usada para a preparação de um medicamento para uso em qualquer um dos métodos de tratamento aqui descritos.

Terapia de Combinação

Em certos aspectos da presente invenção, as formulações aqui descritas podem ser modificadas para serem administradas como parte de uma terapia de combinação com outros agentes. Terapia de combinação se refere a qualquer forma de administração em combinação com dois ou mais compostos terapêuticos diferentes, de modo que o segundo composto seja administrado enquanto o composto terapêutico previamente administrado ainda é eficaz no corpo (por exemplo, os dois compostos são simultaneamente eficazes no paciente, o que pode incluir efeitos sinérgicos dos dois compostos). Por exemplo, os diferentes compostos terapêuticos podem ser administrados na mesma formulação ou em uma formulação separada, concomitante ou seqüencialmente. Assim, um indivíduo que receba esse tratamento pode ter um efeito combinado (conjunto) de diferentes compostos terapêuticos. Exemplos de agentes terapêuticos adicionais preferidos que podem ser coadministrados e/ou coformulados com um anticorpo para IL-13 incluem: esteróides inalados; beta-agonistas, por exemplo, beta-agonistas de curta ação ou de longa ação; antagonistas de leucotrienos ou de receptores de leucotrieno; fármacos de combinação, como ADVAIR®; inibidores de IgE, por exemplo, anticorpos anti-IgE (por exemplo, XOLAIR®) ; inibidores de fosfodiesterase (por exemplo, inibidores de PDE4); xantinas; fármacos anticolinérgicos; agentes estabilizadores de mastócitos, como cromolin; inibidores de IL-4; inibidores de IL-5; inibidores de eotaxina/CCR3; e anti-histaminicos. Essas combinações podem ser usadas para tratar asma e outros transtornos respiratórios. Exemplos adicionais de agentes terapêuticos que podem ser coadministrados e/ou coformulados com um anticorpo para IL-13 incluem um ou mais de: antagonistas de TNF (por exemplo, um fragmento solúvel de um receptor de TNF, por exemplo, receptor de TNF humano p55 ou p75 ou seus derivados, por exemplo, TNFR-IgG de 75 kd (proteína de fusão receptor de TNF-IgG de 75 kD, ENBREL™)); antagonistas da enzima TNF, por exemplo, inibidores da enzima conversora de TNFa (TACE); antagonistas do receptor muscarinico; antagonistas de TGF-β; interferon gama; perfenidona; agentes quimioterápicos, por exemplo, metotrexato, leflunomida ou um sirolimus (rapamicina) ou seu análogo, por exemplo, CCI-779; inibidores de C0X2 e CPLA2; NSAIDs; imunomoduladores; inibidores de p38, inibidores de TPL-2, Mk-2 e NFkB, entre outros. Por exemplo, no caso de condições inflamatórias, as formulações de anticorpos anti-IL-13 aqui descritas podem ser administradas em combinação com um ou mais outros agentes utilizáveis no tratamento de doenças ou condições inflamatórias. Esses agentes podem ser formulados juntamente com o anticorpo anti-IL-13, ou administrados substancialmente ao mesmo tempo como formulações separadas, ou seqüencialmente. Em alguns casos, o agente pode ser um anticorpo para IL-13 que tenha um epitopo diferente do anticorpo anti-IL-13 da formulação. Outros agentes utilizáveis no tratamento de doenças ou condições inflamatórias incluem, mas não se limitam a, agentes antiinflamatórios, ou antiflogísticos. Antiflogisticos incluem, por exemplo, glicocorticóides, como cortisona, hidrocortisona, prednisona, prednisolona, fluorcortolona, triamcinolona, metilprednisolona, prednilideno,

parametasona, dexametasona, betametasona, beclometasona, fluprednilideno, desoximetasona, fluocinolona, flunetasona, diflucortolona, clocortolona, clobetasol e éster butílico de fluocortin; agentes imunossupressores, como agentes anti-TNF (por exemplo, etanercept, infliximab) e inibidores de IL-1; penicilamina; fármacos antiinflamatórios não esteróides (NSAIDs), que englobam fármacos antiinflamatórios, analgésicos e antipiréticos, como ácido salicílico, celecoxib, difunisal e de sais de ácido fenilacético substituído ou sais de ácido 2-fenilpropiônico, como alclofenac, ibutenac, ibuprofen, clindanac, fenclorac, cetoprofen, fenoprofen, indoprofen, fenclofenac, diclofenac, flurbiprofen, piprofen, naproxen, benoxaprofen, carprofen e cicloprofen; derivados de oxican, como piroxican; derivados de ácido antranilico, como ácido mefenêmico, ácido flufenâmico, ácido tolfenâmico e ácido meclofenámico, derivados de ácido nicotinico anilino-substituido, como os fenamatos de ácido miflúmico, clonixina e flunixina; ácidos heteroarilacéticos em que a heteroarila é um grupo 2-indol- 3-ila ou pirrol-2-ila, como indometacina, oxmetacina, intrazol, acemetazina, cinmetacina, zomepirac, tolmetina, colpirac e ácido tiaprofênico; ácido idenilacético do tipo sulindac; ácidos heteroariloxiacéticos analgesicamente ativos, como benzadac; fenilbutazona; etodolac; nabunetona; e fármacos antirreumáticos modificadores da doença (DMARDs), como metotrexata, sais de ouro, hidroxicloroquina, sulfasalazina, ciclosporina, azatioprina e leflunomida.

Outros agentes terapêuticos utilizáveis no tratamento de doenças ou condições inflamatórias incluem antioxidantes. Os antioxidantes podem ser naturais ou sintéticos. Os antioxidantes são, por exemplo, superóxido dismutase (SOD), 21-aninoesteróides/aminocromanos, vitamina C ou E, e outros. Muitos outros antioxidantes são bem conhecidos por aqueles versados na técnica.

As formulações de anticorpos anti-IL-13 aqui descritas podem servir como parte de um regime de tratamento para uma condição inflamatória, que pode combinar muitos agentes antiinflamatórios diferentes. Por exemplo, as formulações de anticorpos anti-IL-13 aqui descritas podem ser administradas em combinação com um ou mais de um inibidor de IL-4, um inibidor de IL-5, um inibidor de IgE, um inibidor de IL-9, um antagonista de TNF, um antagonista de eotaxina/CCR3, um NSAID, um DMARD, um imunossupressor, inibidor de fosfodiesterase ou um anti-histaminico. Em uma modalidade do pedido, as formulações de anticorpos anti-IL- aqui descritas podem ser administradas em combinação com metotrexato. Em outra modalidade, as formulações de anticorpos anti-IL-13 aqui descritas podem ser administradas em combinação com um inibidor de TNF-α. No caso de asma, as formulações de anticorpos anti-IL-13 aqui descritas podem ser administradas em combinação com um ou mais de NSAIDs, corticoesteróides, modificadores de leucotrieno, agonistas beta-adrenérgicos de longa ação, teofilina, anti- histaminicos e cromolin.

No caso de câncer, as formulações de anticorpos anti-IL-13 aqui descritas podem ser administradas em combinação com um ou mais fatores anti-angiogênicos, quimioterápicos ou como um adjuvante de radioterapia. Também se considera que a administração das formulações de anticorpos anti-IL-13 aqui descritas servirá como parte de um regime de tratamento de câncer que pode combinar muitos agentes terapêuticos de câncer diferentes. No caso de doença do intestino irritável (IBD), as formulações de anticorpos anti-IL-13 aqui descritas podem ser administradas com um ou mais agentes antiinflamatórios e também podem ser combinadas com um regime dietético modificado. EXEMPLOS

A invenção é adicionalmente ilustrada pelos seguintes exemplos. Os exemplos são apresentados apenas para fins ilustrativos. Não devem ser tomados como limitativos do âmbito ou conteúdo da invenção de forma alguma.

Exemplo 1: Estabilidade de uma formulação anti-IL-13 liofilizada

Um método para armazenar um anticorpo a ser usado para, por exemplo, aplicações terapêuticas, é como um pó seco preparado por Iiofilização. Portanto, estudou-se a estabilidade a longo prazo de uma formulação anti-IL-13 liofilizada. Resumidamente, uma formulação contendo um anticorpo anti-IL-13 humanizado (50 mg/mL), 10 mM de histidina, 5% de sacarose (peso/volume), pH 6,0, foi preparada por filtração estéril, e aproximadamente 3,2 mL foram distribuídos em um frasco de tubo de vidro sem pirógeno de 5 mL e, então, Iiof ilizados. A formulação foi armazenada a 4°C, 25°C ou 40°C durante um mês, dois meses, três meses, seis meses e doze meses, assim como dezoito meses e vinte e quatro meses a 4°C e 25°C, então, reconstituída usando-se 1,3 mL de água estéril (USP) para levar a formulação reconstituída a cerca de 1,6 mL, de modo que a formulação tivesse 100 mg/mL de anticorpo anti-IL-13, 20 mM de histidina, e 10% de sacarose, pH 6,0.

A porcentagem de espécies HMW foi ensaiada usando- se SEC-HPLC. A porcentagem de espécies HMW na formulação antes da liofilização e reconstituição estava entre 1% - 1,5% da proteína total na formulação e também estava entre cerca de 1% - 2% em todas as amostras armazenadas a 4 °C e 25°C (Figura 1). Após doze meses de armazenamento a 40°C, as formulações tinham cerca de 3,5% de espécies HMW (Figura 1).

Assim, não houve nenhum aumento substancial no nivel de espécies HMW em amostras armazenadas a 5 °C e 25°C durante vinte e quatro meses.

As formulações liofilizadas de anticorpos anti-IL- 13 também foram ensaiadas quanto a bioatividade usando-se um ensaio à base de células em que a inibição da proliferação celular dependente de IL-13 foi examinada na presença de diferentes concentrações de anticorpo formulado para demonstrar a atividade biológica, isto ê, a capacidade de se ligar a e seqüestrar IL-13 das células. Os resultados do ensaio são comparados aos resultados usando um anticorpo anti-IL-13 diferente que não tenha sido armazenado. A Figura 2 ilustra os dados desse conjunto de bioensaios. No geral, não houve nenhuma alteração substancial na quantidade de bioatividade após vinte e quatro meses de armazenamento em nenhuma das amostras. Assim, a formulação é, conforme determinado pela bioatividade, adequada para armazenamento da formulação liofilizada durante pelo menos vinte e quatro meses.

Esses dados demonstram que uma formulação anti-IL- 13 liofilizada conforme aqui descrita é adequada para armazenamento durante pelo menos vinte e quatro meses.

Exemplo 2: Estabilidade de uma formulação liquida de alta concentração Em alguns casos, é desejável armazenar uma formulação de anticorpo anti-IL-13 em um formato liquido. Portanto, estudou-se a estabilidade a longo prazo de uma formulação anti-IL-13 liquida contendo uma concentração relativamente alta de anticorpo anti-IL-13. Resumidamente, uma formulação contendo um anticorpo anti-IL-13 humanizado (100 mg/mL) , 10 mM de histidina, 5% de sacarose (peso/volume), pH 6,0 foi preparada para armazenamento por filtração estéril da formulação em frascos de vidro sem pirógeno. A formulação foi armazenada a 2° - 8 °C, 15 °C, ou 25°C, durante cerca de seis semanas, três meses, seis meses, nove meses, doze meses, dezoito meses, e vinte e quatro meses, ou a 40 °C durante cerca de seis semanas, três meses, e seis meses, e ensaiada quanto a presença de espécies HMW, espécies LMW, bioatividade e concentração em cada momento.

A porcentagem de espécies HMW foi ensaiada usando- se SEC-HPLC. A porcentagem de espécies de alto peso molecular na formulação antes do armazenamento estava entre 2% - 3% da proteína total na formulação e estava entre cerca de 2% - 4% em amostras armazenadas a 2° - 8°C, 15°C, e 25°C (Figura 3) até nove meses de armazenamento, e entre cerca de 2% - 4% até vinte e quatro meses a 2° - 8°C e 15 °C. Após seis meses de armazenamento a 400C, a formulação continha menos de 9% de espécies HMW (Figura 3) . Assim, não houve nenhum aumento substancial no nível de espécies HMW em amostras armazenadas sob condições de baixa temperatura durante vinte e quatro meses. A porcentagem de espécies LMW na formulação de anticorpo anti-IL-13 também foi ensaiada na formulação de anticorpo anti-IL-13 a 100 mg/mL. A porcentagem de espécies LMW na formulação antes do armazenamento estava entre cerca de 1% - 2% da proteína total na formulação antes do armazenamento e estava entre cerca de 1% - 3% em amostras armazenadas a 2° - 8°C, 15°C, e 25°C (Figura 4) até nove meses de tempo de armazenamento, e entre 1% - 3% até vinte e quatro meses a 2° - 8°C. Após seis meses de armazenamento a 40°C, a formulação continha menos de 11% de espécies LMW (Figura 4) . Assim, não houve nenhum aumento substancial no nível de espécies LMW em amostras armazenadas sob condições de baixa temperatura durante vinte e quatro meses.

Ainda outro parâmetro de estabilidade foi examinado usando-se a formulação de anticorpo anti-IL-13 a 100 mg/mL: o da atividade de ligação. Nesses experimentos, a porcentagem de atividade de ligação da formulação foi determinada em comparação com um controle após armazenamento a 2° - 8°C, 15°C, 25°C, e 40°C durante um mês, três meses e seis meses, e nove meses a 2° - 8°C e 25°C apenas. O ensaio monitoriza especificamente a afinidade de ligação do anti- IL-13 a um reagente de citocina IL-13 marcado.

A atividade de ligação inicial da formulação era de cerca de 120% da amostra de referência e não se alterou substancialmente para nenhuma das amostras durante o período de testes de seis meses (Figura 5) . A atividade de ligação medida chegou a cerca de 200% da referência, o que, dado o erro geralmente observado nesse ensaio, não reflete essencialmente nenhuma alteração na atividade de ligação das amostras com o tempo, e não houve nenhuma tendência relacionada à temperatura nos resultados de ligação.

Também se usou um bioensaio como parâmetro de estabilidade para a formulação de anticorpo anti-IL-13 a 100 mg/mL. O ensaio foi conduzido conforme acima descrito no Exemplo 1. As amostras foram armazenadas a 2° - 8°C, 15°C, e 25°C durante cerca de seis semanas, três meses, seis meses, nove meses, doze meses, dezoito meses, ou vinte e quatro meses ou a 40 °C durante cerca de seis semanas, três meses, ou seis meses. Os dados foram expressos como unidades de ligação por miligrama (Figura 6).

As amostras estavam a cerca de 4,5 χ 10^7 U/mg antes do armazenamento e estavam a cerca de 4,5 - 7,5 χ IO7 U/mg após a incubação. Isso não reflete essencialmente nenhuma alteração na bioatividade das amostras durante o armazenamento. A variabilidade nos valores reflete a variabilidade inerente no ensaio. Como não há nenhuma diminuição na quantidade de bioatividade nas amostras, esses dados dão apoio adicional à adequação da formulação para o armazenamento de anti-IL-13.

A concentração da formulação de anticorpo anti-IL- a 100 mg/mL armazenada a 2° - 8 °C, 15 °C, e 25 °C durante cerca de seis semanas, três meses, seis meses, nove meses, doze meses, dezoito meses, ou vinte e quatro meses, ou a 40 °C durante cerca de seis semanas, três meses, ou seis meses também foi ensaiada por UV/Vis. A concentração das formulações líquidas a todas as temperaturas estudas era substancialmente similar (Figura 7).

Exemplo 3: Armazenamento de uma formulação líquida a baixa concentração

Para examinar adicionalmente formulações da invenção e sua adequação para o armazenamento de anticorpo anti-IL-13, testou-se uma formulação contendo uma concentração relativamente baixa de anti-IL-13. A formulação era uma formulação líquida que continha 0,5 mg/mL de anticorpo anti-IL13 humanizado, 10 mM de histidina, 5% de sacarose, a pH 6,0. As amostras foram testadas após armazenamento durante seis meses e doze meses a 5°C, então, testadas quanto a vários parâmetros de estabilidade; espécies HMW, espécies LMW, concentração de proteína e atividade de ligação. Espécies HMW e espécies LMW foram ensaiadas usando-se os métodos acima descritos. A concentração de proteína foi ensaiada usando-se espectroscopia UV-Iuz visível por medição da densidade óptica da amostra a 280 nm e subtração do espalhamento a 320 nm, e calculada usando-se a absortividade molar da proteína. Os resultados são resumidos na Tabela 1.

Tabela 1

<table>table see original document page 57</column></row><table> Esses dados demonstram que não houve nenhuma alteração substancial em nenhum dos parâmetros de estabilidade ensaiados, sustentando a adequação de uma formulação de anticorpo anti-IL-13 contendo uma concentração relativamente baixa de anticorpo anti-IL-13.

Exemplo 4: Adequação de uma formulação anti-IL-13 em aerossol

Um uso de uma formulação de anticorpo anti-IL-13 é para administração diretamente ao sistema pulmonar, por exemplo, por nebulização. Para testar a adequação da nebulização da formulação, uma formulação de anticorpo anti- IL-13 humanizado a 0,5 mg/mL, 10 mM de histidina, 5% de sacarose, pH 6,0, foi transformada em um aerossol usando-se um nebulizador comercialmente disponível, o aerossol foi recuperado e testado quanto à integridade por ensaio da degradação (formação de espécies HMW), recuperação usando-se SEC-HPLC e atividade de ligação. Os resultados são resumidos na Tabela 2.

Tabela 2

<table>table see original document page 58</column></row><table> Esses dados demonstram que não houve nenhuma alteração substancial em nenhum dos parâmetros de estabilidade ensaiados, sustentando a adequação de uma formulação de anticorpo anti-IL-13 para uso como uma forma de dosagem nebulizada.

Exemplo 5: Misturação e filtração

Demonstrou-se que o anticorpo anti-IL-13 na formulação acima descrita era robusto à misturação e filtração, que são duas operações comuns em unidades de fabricação. Resumidamente, o anticorpo anti-IL-13 foi misturado a uma concentração de proteína dfe 50 mg/mL a velocidades e tempos crescentes do propulsor, comparáveis às utilizadas durante a fabricação. Cada amostra coletada não mostrou nenhuma alteração na concentração (conforme ensaiada usando-se espectroscopia UV-Iuz visível), espécies de alto peso molecular (ensaiadas usando-se SEC-HPLC) e bioatividade (ensaiada usando-se um ensaio de ligação) com relação ao material de partida.

Após o estudo de misturação, o anticorpo anti-IL- 13 foi passado através de um filtro de esterilização comum de 0,22 μηι usando-se pressurização com nitrogênio. Em geral, a pressão de nitrogênio está abaixo de cerca de 206,8 kPa (30 psig). Após a filtração, a concentração (ensaiada usando-se espectroscopia UV-Iuz visível), as espécies HMW (ensaiadas usando-se SEC-HPLC) e a bioatividade (ensaiada usando-se a ensaio de ligação) não mostraram nenhuma alteração com relação ao material de partida. Exemplo 6: Liofilização e Reconstituição Em um exemplo não limitativo de um protocolo de condições de liofilização e reconstituição para anticorpo, 3,2 mL de anticorpo a uma concentração de 50 mg/mL na formulação 10 mM de histidina, 5% (50 mg/mL) de sacarose, pH 6,0, são distribuídos em um frasco de tubo de vidro claro (com uma rolha cinza siliconizada West 4432/50 1319) e liofilizados. Com a liofilização, o conteúdo seco do frasco era o seguinte: 160 mg de anticorpo, 3,2 χ IO"5 moles de histidina e 160 mg de sacarose. Ά torta sólida que resulta da liofilização contribui com aproximadamente 0,32 mL de volume com base na densidade dos sólidos (cerca de 320 mg a uma densidade de cerca de 1 g/mL). Para reconstituir a amostra, 1,3 mL de água são adicionados ao conteúdo do frasco. 0 conteúdo do frasco é solubilizado no volume de diluente (1,3 mL), assim como no volume dos próprios sólidos (0,3 mL), para um total de cerca de 1,6 mL, e as concentrações da formulação são de cerca de 100 mg/mL de anticorpo, cerca de 20 mM de histidina e cerca de 10% de sacarose, pH 6,0.

Exemplo 7: Preparação e Liofilização das Amostras

Preparação da Amostra de Anticorpo anti-IL-13 Uma amostra congelada de um anticorpo anti-IL-13 humanizado a uma concentração de cerca de 85 mg/mL em 20 mM de histidina, 10% de sacarose pH 6,0, foi descongelada em um banho de água a 37 °C. Uma alíquota de 125 mL do material descongelado foi dialisada contra 10 mM de histidina, 5% de sacarose, pH 6,0, usando-se um tubo de diálise com corte de peso molecular de 6 kD - 8 kD Spectra/Por. A solução resultante foi diluída a um alvo de 50 mg/mL com 10 mM de histidina, 5% de sacarose, pH 6,0 (a formulação de anticorpo anti-IL-13 para uso como um fármaco).

Práticas de Liofilização

Em todas as operações, usou-se um protetor de folha de alumínio na frente da porta e uma altura de prateleira de 63 mm para minimizar a radiação dentro do liofilizador. Em todas as operações, uma bandeja foi inteiramente enchida para manter uma carga consistente no liofilizador. As rolhas foram autoclavadas e secadas para todos os frascos de proteína. Todos os frascos para amostras de proteínas foram enxaguados com água desionizada e despirogenados. Os frascos e rolhas que foram usados para encher o restante da bandeja não foram tratados.

Frascos semeados com a formulação de anticorpo anti-IL-13 foram preparados assepticamente em uma cabine de biossegurança a um alvo de 160 mg/frasco. Os frascos para estudos de estabilidade foram enchidos com 3,2 mL de formulação fresca descrita no Exemplo 6 antes de cada operação (material que não havia sido previamente liofilizado). Durante a liofilização, frascos adicionais foram enchidos com tampões adequados que fossem compatíveis com o ciclo de liofilização alvo, para manter uma carga consistente no Iiofilizador. A liofilização foi monitorizada mediante uso de termopares dentro do arranjo de proteínas.

Calorimetria de varredura diferencial modulada (mDSC) Todas as amostras para mDSC foram operadas no modo modulado com uma amplitude de 0,5°C e um período de 100 segundos. Para pós de pós-liofilização, as amostras foram aquecidas a 2°C/min a 150°C. Todas as amostras de pó foram preparadas usando-se uma caixa de luvas purgada com nitrogênio. Para amostras líquidas, todas as elevações de temperatura foram realizadas a 0,5"C/min, e as temperaturas foram correspondidas às utilizadas nos ciclos de Iiofilização. A elevação de aquecimento final foi realizada a 2°C/min para magnificar a transição de vidro. As amostras líquidas foram preparadas na bancada laboratorial.

Microscopia da Liofilização

Para realizar a microscopia da Iiofilização, uma amostra foi congelada a -40°C a 0,5°C/min, para imitar a Iiofilização. Após iniciar o vácuo, a temperatura foi gradualmente aumentada para se observarem alterações estruturais da amostra como função da temperatura durante a sublimação. 0 microscópio de liofilização não permite controle de pressão, portanto, a amostra foi secada sob vácuo completo.

Análise de Umidade

Usou-se titulação de Karl Fischer para ensaiar a umidade nas amostras Iiofilizadas. As amostras liofilizadas foram reconstituídas com 3 mL de metanol. Realizaram-se injeções em duplicata ou triplicata de 500 μΐι. Um padrão de água de 1% foi injetado após o uso como uma verificação da adequação. Espectroscopia infravermelha de transformada de Fourier (FTIR)

A FTIR mediu a estrutura secundária do anticorpo no estado de pó seco. Uma pelota contendo aproximadamente 1 mg de proteína seca formulada dispersada em 300 mg de KBr foi prensada e varrida 200 vezes. Após a coleta de dados, a análise envolveu a subtração espectral de placebo de sacarose, correção de linha basal, alisamento, segunda derivada e normalização de área.

Estabilidade

A estabilidade do anticorpo liofilizado nas formulações foi avaliada como função do tempo e temperatura de armazenamento. Amostras de anticorpo anti-IL-13 liofilizado foram ensaiadas após a Iiofilização, depois de quatro semanas de armazenamento a 2°C - 8°C e depois de duas semanas e quatro semanas de armazenamento a 50°C. As amostras refrigeradas foram armazenadas em uma sala fria refrigerada com entrada. As amostras de alta temperatura foram armazenadas em um Incubador Lab Line Imperial ajustado a 50°C. Nos momentos apropriados, as amostras foram removidas do armazenamento e deixadas aquecer ou resfriar à temperatura da sala antes do ensaio.

Reconstituição e Aparência Visual

Os frascos de formulações liofilizadas tanto da análise pós-liofilização, quanto da análise de estabilidade ao armazenamento foram visualmente inspecionados antes, durante e depois de serem reconstituídas com 1,2 mL de água estéril para injeção. Os frascos foram inspecionados em uma caixa de luz contra um fundo preto e branco quanto à cor da torta, integridade, umidade, partículas e defeitos antes da reconstituição. Após a inspeção visual, a torta liofilizada, a o lacre de pressão foi removido do frasco usando-se uma ferramenta. A rolha foi removida, e a água estéril para injeção foi lentamente introduzida no frasco usando-se uma pipeta apropriada. 0 diluente foi distribuído usando-se um movimento de remoinho para assegurar a umectação total da torta. Uma vez que o diluente fosse completamente distribuído, a cronometragem da reconstituição foi iniciada com um cronômetro laboratorial padrão, e o frasco foi novamente arrolhado. A reconstituição estava completa quando o pedaço final de sólido se dissolveu. Rolar o frasco entre as mãos facilitou a reconstituição. Enquanto a torta liofilizada estava no processo de reconstituição, foram registradas observações acerca do estado da solução em dissolução, como clareza, borbulhamento e formação de espuma. Uma vez completada a reconstituição, o tempo de reconstituição foi registrado, e os frascos foram deixados sobre a bancada durante vários minutos, de modo que a solução resultante pudesse sedimentar, e a maioria das bolhas formadas durante a reconstituição pudessem se dissipar. A solução reconstituída foi, então, inspecionada em uma caixa de. luz tanto contra um fundo preto, quanto um branco quanto à cor, clareza e partículas.

Cromatografia de exclusão de tamanho de alto desempenho (SEC-HPLC) Dois microlitros de amostras puras de formulação de anticorpo anti-IL-13 foram injetados em uma coluna G3000swxl com uma coluna de guarda (TosoHaas Partes Nos. 08541 e 08543). A fase móvel era salina tamponada com fosfato (PBS) com 250 mM de cloreto de sódio adicionados. A taxa de fluxo foi de 0,75 mL/min, e o tempo de operação foi de 30 minutos. A absorbância ultravioleta foi monitorizada a um comprimento de onda de 280 nm. O cromatograma foi integrado para separar o pico principal de anticorpo anti- IL-13 das espécies de alto e baixo peso molecular usando-se o software Waters Empower™.

Espectroscopia de absorbância ultravioleta-luz visível para determinação de concentração (A280)

Amostras da formulação tendo um anticorpo a uma concentração de 100 mg/mL foram diluídas a aproximadamente 0,5 mg/mL e 0,25 mg/mL por adição de 10 μL de amostra a 1.990 μL e 3.990 μL de 10 mM de histidina, 5% de sacarose, pH 6,0, respectivamente. Duzentos microlitros das soluções resultantes foram colocadas em poços individuais de uma microplaca de 96 poços juntamente com um branco de tampão. A placa foi lida em um leitor de placa Spectramax® Plus quanto à absorbância ultravioleta a comprimentos de onda de 280 nm e 320 nm. Subtraindo-se a absorbância a 320 nm da absorbância a 280 nm e dividindo-se pelo coeficiente de extinção (1,405 mL/mg-cm) multiplicado pelo comprimento do trajeto (1 cm), determinou-se a concentração de proteínas da solução em cada poço. Aplicou-se o fator de diluição apropriado, e se determinou uma concentração média de proteína.

Espectroscopia de absorbância ultravioleta-luz visível para espalhamento de luz (A420)

Duzentos microlitros de cada amostra de anticorpo anti-IL-13 a ser analisada foi dividida em alíquotas em poços individuais de uma microplaca de 96 poços. Um branco de tampão serviu de controle. A placa foi lida em um leitor de placa Spectramax Plus quanto à absorbância de luz visível a um comprimento de onda de 42 0 nm.

Ensaio de ligação por eletroquimioluminescência (ECL)

As amostras foram submetidas a análise de ligação utilizando o formato de ensaio de ligação de anticorpo anti- IL-13 a E. coli Flag (BioVeris, Gaithersburg, MD) . O ensaio foi realizado com amostras divididas em alíquotas em um formato de placa de 96 poços.

Bioensaio de Anticorpo anti-IL-13

As amostras foram testadas quanto à bioatividade usando-se um bioensaio de proliferação celular TF-I. O anticorpo para IL-13 bloqueia a ligação da citocina IL-13 a receptores de superfície celular in vivo, prevenindo a ativação de células portadoras envolvidas na patogênese de doenças alérgicas e asma. O modelo de bioensaio in vitro usado neste estudo consiste em uma linhagem celular (linhagem celular de eritroleucemia TFl humana; ATCC CRL- 2003) que expressa receptor de IL-13 e se prolifera na presença de citocitina IL-13. A inibição da resposta a IL-13 de células TFl pelo anticorpo para IL-13 foi ajustada usando-se uma equação logística de 4 parâmetros. A atividade biológica (potência relativa) é determinada por comparação da curva de inibição da amostra de teste de anticorpo para IL-13 com a curva de inibição do material de referência usado como um padrão de ensaio.

Estratégia de Desenvolvimento de Ciclo Usou-se uma série de etapas seqüenciais (descritas abaixo) para se desenvolver um ciclo de Iiofilização.

Identificação da Temperatura de Produto Crítica

A temperatura de produto crítica para um anticorpo anti-IL-13 foi identificada por dois métodos ortogonais - calorimetria de varredura diferencial modulada (mDSC) e Microscopia de Liofilização. Esses dois métodos são usados para identificar a temperatura de transição de vidro do produto congelado (mDSC) e o colapso resultante (Microscopia de Liofilização). O ciclo de liofilização que mantém o produto abaixo dessa temperatura durante a secagem primária deve fornecer uma estrutura de torta intacta. A menor temperatura adequada foi considerada como sendo de -25°C, e, assim, essa temperatura é geralmente incluída em procedimentos projetados para testar condições e formulações quando se desenvolve uma formulação e métodos para liofilização de um anticorpo conforme aqui descrito.

Execução do Ciclo de Liofilização

Com base nos resultados dos estudos acima descritos, foram realizados três ciclos de liofilização diferentes para examinar três parâmetros de interesse no desenvolvimento de um procedimento de liofilização adequado para a preparação de uma formulação liofilizada adequada para armazenamento ou outros procedimentos. 0 primeiro parâmetro examinado foi o ciclo de controle, que repete ciclos de estudos anteriores de estabilidade. Todos os ciclos de estabilidade de desenvolvimento prévio utilizaram esse ciclo, de modo que serviu de ponto de partida para esta análise.

O segundo parâmetro testado foi o impacto de recozimento. O tempo de reconstituição para a formulação de anticorpo anti-IL-13 liofilizada usando-se o ciclo de controle acima é razoavelmente longo, por exemplo, de cerca de 100 s a 500 s (Figura 16) . Δ inclusão do recozimento acima da temperatura de transição de vidro da solução congelada como uma etapa adicional durante o tratamento térmico congelado serve para aumentar o tamanho do cristal de gelo antes do inicio do vácuo. Esse tamanho de cristal de gelo aumentado leva a um tamanho de poro aumentado da torta seca ao término da liofilização. Poros maiores podem permitir uma melhor penetração de água na torta liofilizada e melhorar a reconstituição.

O terceiro parâmetro testado foi um ciclo agressivo. O aumento da temperatura de secagem primária significativamente acima do ponto do ciclo de controle pode aumentar significativamente a temperatura do produto de formulação de anticorpo anti-IL-13 durante a secagem primária. Esse ciclo de liofilização serve como uma avaliação da sensibilidade de uma formulação de anticorpo anti-IL-13 à temperatura do produto durante a liofilização e pode ser usado na avaliação de desvios de fabricação durante lotes clínicos iniciais antes da execução de estudos formais de robustez de liofilização.

Avaliação de Ciclos de Liofilização A avaliação de ciclos de liofilização selecionados em formulações de anticorpos anti-IL-13 foi dividida em dois aspectos: comparação imediata com base em testes realizados pós-liofilização e potencial de impacto a prazo mais longo causado após incubação sob condições aceleradas.

Identificação da temperatura de produto crítica O produto de formulação de anticorpo anti-IL-13 continha quase 50% de proteína. Assim, antecipou-se que a proteína dominava as propriedades físicas dos estados congelado e liofilizado. Antes da liofilização, a calorimetria de varredura diferencial modulada subambiente (mDSC) buscou a temperatura de transição de vidro da fase amorfa concentrada por congelamento da formulação. Neste experimento, o anticorpo anti-IL-13 estava a uma concentração de 50 mg/mL em 5% de sacarose, 10 mM de histidina, pH 6,0. Sob essas condições, a menor transição identificada estava a -Il0C (Figura 8). A temperatura crítica foi confirmada por ensaio da progressão de temperatura da microscopia de liofilização (Figuras 9A-9F). Nesses experimentos, a estrutura foi perdida por aquecimento de -25°C a -15°C e foi recuperada por resfriamento a -18°C. A estrutura foi novamente perdida por aquecimento de -IO0C ao início de fusão a -4'C. Todas as alterações eram reversíveis, conforme indicado pela estrutura comparável observada com o resfriamento da amostra a -16°C. Assim, uma transição reversível foi observada a cerca de -15°C, e outra transição entre -10°C e -6°C. A redução da temperatura abaixo de -16°C leva a uma estrutura seca comparável à estrutura original. Com base nessa informação, uma temperatura de produto de -15°C foi selecionada como a temperatura crítica para se permanecer abaixo durante a liofilização. Esse método ilustra um método para a seleção da temperatura crítica para a Iiofilização.

Três ciclos de liofilização foram executados consecutivamente. Os traçados dos ciclos são mostrados nas Figuras 10-12. Todos os ciclos mantiveram uma pressão de câmara de 100 mT durante a secagem primária e a secundária. As taxas de elevação de temperatura foram de 0,5°C/min para todas as elevações, exceto entre a secagem primária e a secundária nas Figuras 11 e 12, que foi de 0,2°C/min para esses ciclos. Os parâmetros variados estão resumidos na Tabela 3.

Tabela 3. Comparação dos parâmetros de liofilização (tempo de secagem primária para que o último termopar atinja a temperatura da prateleira)

<table>table see original document page 70</column></row><table> Avaliação de Ciclos de Liofilização: Pós- Liofilização

O perfil de temperatura do produto (anticorpo anti-IL-13) durante a secagem primária para cada um dos três ciclos (controle, agressivo e com recozimento) é mostrado na Figura 13. Os termopares do produto de recozimento e controle foram similares, ao passo que a temperatura de prateleira elevada do ciclo agressivo levou a um aumento de quase 10°C durante a secagem primária.

Após a liofilização, frascos de formulação de anticorpo anti-IL-13 de cada um dos três ciclos de liofilização foram testados quanto à integridade bioquímica, tanto como um sólido, quanto como um liquido reconstituído. O estado sólido foi avaliado usando-se os seguintes métodos: mDSC (medir a temperatura de transição de vidro), medição da área de superfície BET, titulação de umidade de Karl Fischer, Espectroscopia Infravermelha de Transformada de Fourier (medir a estrutura secundária da proteína) e aparência da torta. Os líquidos reconstituídos foram avaliados pelo tempo de reconstituição, aparência visual, absorbância ultravioleta a 280 nm para a concentração de proteína, absorbância visível a 420 nm para espalhamento de luz, SEC-HPLC para quantificação de alto peso molecular, CEX-HPLC para heterogeneidade de carga de superfície e ligação IGEN, e bioensaio TF-I para a atividade biológica.

Todos os três ciclos produziram tortas sólidas brancas sem nenhum defeito aparente, incluindo partículas ou umidade. 0 termograma mDSC para o ciclo de controle é mostrado na Figura 14. A Tabela 5 resume os resultados para de ciclo para a transição térmica primária. A transição a 53° C não foi tão grande em magnitude, mas ainda detectável, nos outros dois ciclos de Iiofilização. Essa transição não pareceu ter impacto sobre a estabilidade da proteína com o armazenamento acelerado a 500C.

A comparação da estrutura secundária das formulações pós-liofilização revelou que a estrutura secundária da proteína é comparável entre as três amostras (Tabela 4, Figura 15) . Na Figura 15, que mostra a segunda derivada da espectroscopia infravermelha de transformada de Fourier (FTIR) no pó na região de amida I do anticorpo de amostra, a área cumulativa de cada varredura foi normalizada em 1. A informação incluída na Tabela 4 representa a fração da área total na banda de folha β (1624-1657 cm-1) como uma base para comparação entre as amostras. Quando se compara a estrutura secundária no estado seco contra a formulação no estado líquido, a diferença de área de folha β relativa era notável (0,37 como um líquido versus 0,25 - 0,27 com um pó liofilizado). Essa diferença é mais provavelmente devida à ausência de água no estado liofilizado e à correspondente alteração na conformação da proteína.

Tabela 4. Temperatura de transição de vidro (Tg) medida, área de superfície BET, umidade residual e estrutura secundária pós-liofilização <table>table see original document page 73</column></row><table>

Um frasco de cada ciclo foi reconstituído com 1,2 mL de água estéril para injeção. A aparência durante a reconstituição, o tempo de reconstituição e a aparência 60 min após a reconstituição foram registrados para cada ciclo e estão resumidos na Tabela 6. Todos os três ciclos requereram agitação física (rolar entre as mãos) para solubilizar a torta. As tortas para o ciclo agressivo (ciclo 1) e o ciclo de controle (ciclo 2) começaram a se romper e dissolver em um espaço de tempo útil para produção: o tempo de reconstituição foi de 140 s e 73 s, respectivamente. Muito do tempo de reconstituição foi gasto dissolvendo-se pedaços menores e mais renitentes de torta. A amostra do ciclo de recozimento (ciclo 3) levou o maior tempo para reconstituir. O resultado refuta a teoria de que uma etapa de recozimento resultaria em um tempo de reconstituição mais curto, presumivelmente devido à formação de uma torta mais porosa. A torta permaneceu intacta com a reconstituição e dissolveu lentamente em 373 s, de maneira semelhante à dissolução de um Lifesaver™. Todos os três ciclos produziram quantidades variáveis de espuma durante a reconstituição. O ciclo de controle produziu a maior quantidade de espuma, seguido pelo ciclo de recozimento, então, pelo ciclo agressivo, conforme visto pelo espalhamento em solução por UV/Vis a 420 nm (veja a Tabela 5). Uma vez reconstituídas, as amostras foram deixadas sedimentar durante 60 minutos. Nesse momento, muito da espuma havia se dissipado, e todas as três soluções tinham aparência similar quando inspecionadas usando-se uma caixa de luz tanto contra um fundo preto, quanto um branco. Todos os três ciclos tinham uma tonalidade amarelo e eram levemente opalescentes, com a amostra de recozimento sendo ligeiramente mais opalescente.

Todas as três amostras foram ensaiadas quanto à integridade bioquímica usando-se os ensaios aqui descritos. Esses dados demonstraram que não havia diferenças aparentes na integridade de uma formulação de anticorpo anti-IL-13, após a reconstituição, como função do ciclo de Iiofilização. A quantidade de proteína recuperada conforme demonstrado por medição da concentração de anticorpo nas formulações era essencialmente igual para todos os três ciclos. A quantidade de compostos de alto peso molecular em uma formulação, conforme medida por cromatografia de exclusão de tamanho, e a quantidade de heterogeneidade de carga de superfície, conforme medida por cromatografia de troca de cátions, foram essencialmente iguais para todos os três ciclos. Não houve alterações identificadas na funcionalidade das moléculas, conforme medido pelo ensaio de ligação IGEN e o bioensaio TF-I como função do ciclo de Iiofilização. Tabela 5. Dados Pós-Reconstituição

<table>table see original document page 75</column></row><table>

Estabilidade

Embora não parecesse haver um impacto pós- liofilização imediato sobre a integridade de um anticorpo anti-IL-13 na formulação aqui descrita como função dos ciclos de liofilização investigados, é importante avaliar se a estabilidade ao armazenamento varia em função do ciclo de liofilização. Para testar isso, executou-se um estudo de estabilidade acelerada de curto prazo conforme delineado na seção acima "Estabilidade". As amostras foram monitorizadas quanto ao tempo de reconstituição, alterações na concentração de proteína por UV/Vis a 280 nm, alterações no espalhamento de luz em solução por UV/Vis a 420 nm, alterações no agregado de alto peso molecular por SEC-HPLC alterações na atividade de ligação pelo ensaio de ligação IGEN.

A Figura 16 é traçada para mostras o tempo de reconstituição como função do tempo de armazenamento e temperatura de armazenamento. Embora haja variabilidade nos números absolutos de tempo de reconstituição, a tendência, com exceção do ciclo agressivo e do ciclo de recozimento armazenado a 5°C, é similar à observada na análise pós- liofilização. As amostras de ciclo de controle se reconstituíram mais rapidamente, seguidas pelas amostras do ciclo agressivo. As amostras do ciclo de recozimento foram as mais lentas para reconstituir. A variabilidade de momento a momento e o desvio da tendência pós-liofilização pelas amostras agressiva e recozida armazenadas a 5°C poderia ser devida a uma ou mais variáveis mal controladas. Essas incluíam a taxa em que a torna é umectada durante a reconstituição, quanto e que parte da torta é umectada quando a água para injeção é introduzida no frasco e quão agressivamente o frasco é agitado durante a reconstituição. Todas essas variáveis são subjetivas e dependentes do operador e podem ter impacto sobre o tempo de reconstituição e espalhamento de luz. A concentração de proteína, mostrada na Figura 17, não variou significativamente entre os três ciclos testados no decorrer do armazenamento (zero a quatro semanas) ou como função da temperatura (5°C e 50°C). 0 aumento de concentração do momento inicial até duas semanas pode ter sido devido a diferenças na precisão da medição do volume de reconstituição de um momento para o seguinte.

O espalhamento em solução, mostrado na Figura 18, não variou significativamente entre os três ciclos no decorrer do armazenamento ou como função da temperatura. 0 resultado elevado no momento inicial para o ciclo de controle foi devido a um aprisionamento de bolhas adicionais devido à manipulação da amostra, em vez de um resultado de diferenças de ciclo.

As amostras também foram ensaiadas quanto à porcentagem de espécies HMW presentes durante o armazenamento. Os ensaios foram realizados com SEC-HPLC. Os dados, conforme mostrado na Figura 19, demonstram que a porcentagem de agregados de alto peso molecular não variou significativamente durante o armazenamento entre os três diferentes ciclos de Iiofilização.

As amostras também foram ensaiadas quanto à ligação usando-se um ensaio em placa em um formato de 96 poços (IGEN) . A Figura 20 mostra que a ligação do anticorpo anti-IL-13 na formulação não se alterou significativamente em função do ciclo de liofilização no decorrer de quatro semanas a 2° - 8°C ou 50°C. Esses dados demonstram que o anticorpo anti-IL-13 na formulação tem um perfil de estabilidade comparável como função dos três ciclos de liofilização investigados. A adição de uma etapa de recozimento parece piorar a reconstituição, em vez de melhorá-la. 0 ciclo agressivo age como uma avaliação de robustez devido ao aumento observado na temperatura do produto de quase 10°C durante a secagem primária.

Conclusão

Demonstrou-se que o anticorpo anti-IL-13 na formulação é robusto durante a liofilização a extremos de temperatura do produto. O perfil de estabilidade com o armazenamento a 50°C durante quatro semanas foi quase idêntico ao do material que tinha quase 10°C de diferença na temperatura de produto durante a secagem primária.

Exemplo 8: Formulação de Anticorpo Para IL-13

Para se fazer uma triagem de possíveis excipientes para uma formulação líquida de anticorpo para IL-13, conduziu-se um estudo de estabilidade acelerado de curto prazo usando-se 0,5 mL de um anticorpo IMA-638 a 100 mg/mL em frascos de vidro West de 13 mm com rolhas West 4432/50 ou seringas BD Hypak™ previamente enchidas a uma temperatura de armazenamento de 40 0C durante seis semanas. A estabilidade do anticorpo foi, então, testada por medição da concentração usando-se a absorbância a 280 nm e por SEC-HPLC.

As formulações testadas incluíram a variação do pH de 5,0 para 5,5 a 6,0; diferentes tampões, como histidina, succinato e acetato de sódio; diferentes concentrações de sacarose (0%, 2,5%, 5,0% e 10%); e outros aditivos, como sorbitol, glicina, arginina e metionina. A Tabela 6 abaixo apresenta as formulações que foram testadas nessa triagem.

Tabela 6. Formulações Liquidas

<table>table see original document page 79</column></row><table>

A porcentagem de recuperação durante seis semanas de armazenamento a 40°C foi avaliada por determinação da concentração do anticorpo por UV/Vis e é mostrada na Figura 21. A recuperação foi substancialmente similar entre as formulações, mas a maior recuperação foi obtida para as formulações 4 e 8.

A porcentagem de aumento de espécies de alto peso molecular durante seis semanas de armazenamento a 40°C é mostrada na Figura 22. As seringas previamente enchidas tinham menos agregados de alto peso molecular em comparação com os frascos (veja a Figura 22, Formulação 4). As formulações 6, 8, 14 e 15 mostraram o menor aumento de espécies de alto peso molecular (entre 0,5% e 1,25%).

A porcentagem de aumento de espécies de baixo peso molecular durante seis semanas de armazenamento a 40°C é mostrada na Figura 23. Em contraste com HMW, as seringas previamente enchidas em geral tinha um pequeno aumento nas espécies LMW em comparação com os frascos de vidro. As formulações 1-13 tinham uma alteração de % de LMW de cerca de 3% - 4%.

Em conclusão, a maioria das formulações demonstrou perfis de estabilidade aceitáveis, confirmando um pH ótimo de 5-6,5, e garantindo a inclusão de diferentes excipientes adequados - pois nenhum dos excipientes foi prejudicial para a estabilidade da proteína.

Exemplo 9: Avaliação da necessidade de Tween nas formulações

Para se determinar se Tween era necessário nas principais formulações candidatas do Exemplo 8 no contexto de degradação interfacial, conduziram-se um estudo de agitação e um estudo de congelamento-descongelamento usando- se os oito candidatos principais que estão relacionados na

Tabela 7.

Tabela 7. Candidatos Principais

<table>table see original document page 80</column></row><table> <table>table see original document page 81</column></row><table>

O estudo de agitação foi conduzido usando-se 0,25 mL de formulações líquidas de IMA-638 a 100 mg/mL em frascos de vidro e agitando-se os frascos de vidro à temperatura ambiente em um agitador de gel a aproximadamente 200 rpm durante vinte e quatro horas. A concentração das amostras que foram agitadas foi comparada com a de amostras que não foram agitadas (Controle). A concentração de IMA-638 após a agitação das diferentes formulações de anticorpos é mostrado na Figura 24. As concentrações foram substancialmente similares entre as formulações. A Figura 25 apresenta a % de espécies HMW após a agitação das formulações de IMA-638. As espécies HMW entre as formulações variaram entre cerca de 1,2% e cerca de 1,5%.

O estudo de congelamento-descongelamento foi conduzido usando-se 0,25 mL de formulações líquidas de IMA- 638 a 100 mg/mL em tubos de polipropileno, em que o ciclo de congelamento foi realizado a -80°C, e o ciclo de descongelamento a 37°C. Os ciclos de congelamento- descongelamento foram conduzidos uma vez (FTl) , três vezes (FT3) ou cinco vezes (FT5). A concentração das amostras após os ciclos de congelamento-descongelamento em comparação com os controles que não foram submetidos a ciclos de congelamento-descongelamento é mostrada na Figura 26. A % de espécies HMW após o congelamento-descongelamento também foi determinada e é mostrada na Figura 27. A porcentagem de espécies HMW entre as formulações após o congelamento- descongelamento variou entre cerca de 1,2% a cerca de 1,5%.

A presença de Tween não demonstrou um efeito claro sobre a proteção contra a sensibilidade ao cisalhamento com essas condições.

Exemplo 10: Avaliação da Formulação Liquida de Anticorpo Para IL-13 em Seringas Previamente Enchidas

A estabilidade de formulações de anticorpos IMA- 638 a 100 mg/mL relacionadas na Tabela 8 abaixo, acondicionadas como formulações de 1 mL em seringas previamente enchidas BD Hypak™ com rolhas West 4432/50 foi avaliada por determinação da % de espécies HMW a 4°C, 25 °C e 40 °C durante sete meses. Os resultados desses estudos são mostrados nas Figuras 28, 29 e 30.

Tabela 8. Formulações em Seringas Previamente Enchidas Hypak™

<table>table see original document page 82</column></row><table>

A 4 °C, houve entre 0,70% e 0,90% de espécies HMW de t = 0 meses a t = sete meses. A 25 °C, houve entre cerca de 0,75% e cerca de 2,00% de espécies HMW, com os agregados aumentando com o tempo. A 40°C, os agregados aumentaram em todas as formulações com o tempo para entre 4,5% e 6,5% em sete meses para as Formulações 1 - 3 e 5. 0 menor aumento de agregados foi observado para a formulação 4 (cerca de 3% em sete meses).

A adição de arginina e Tween a uma formulação consistindo em 10 mM de histidina e 5% de sacarose parece melhorar a estabilidade do anticorpo para IL-13 no contexto de seringas previamente enchidas em todas as temperaturas estudadas.

Assim, um ou ambos esses excipientes poderiam proporcionar benefícios de estabilidade adicionais a uma formulação anti-IL-13.

Exemplo 11: Efeito de Arginina Sobre Formulações Líquidas de IMA-638 em Seringas Previamente Enchidas

O efeito da adição de baixas concentrações de arginina (0,1% - 2%) sobre a estabilidade de formulações de anticorpos IMA-638 a 100 mg/mL formuladas em 10 mM de histidina, 5% de sacarose, e 0,01% de Tween 80 foi estudado seguindo-se a porcentagem de alteração em espécies HMW após quatro semanas, oito semanas, doze semanas e vinte e oito semanas de armazenamento de seringas BD Hypak™ SCF de 1 mL previamente enchidas com rolhas West W4023 Durafluor a 40°C. Os resultados desse estudo são mostrados na Figura 31.

Os dados indicam que a adição de arginina diminui a quantidade de agregação de HMW formada com o tempo.

Exemplo 12: Caracterização de Aerossol de IMA-638 de um Nebulizador PARI LC Plus As formulações de anticorpo para IL-13 da invenção podem ser administradas a um sujeito por vários meios, inclusive como um aerossol. Um aerossol é uma suspensão de partículas líquidas ou sólidas no ar. Em algumas modalidades da invenção, as formulações de anticorpo para IL-13 são usadas para distribuição pulmonar. As partículas de fármaco para distribuição pulmonar são tipicamente caracterizadas pelo diâmetro aerodinâmico, em vez do diâmetro geométrico. O diâmetro aerodinâmico é o diâmetro de uma esfera de densidade unitária (1 g/mL) que tem a mesma velocidade de sedimentação gravitacional que a partícula em questão. O diâmetro aerodinâmico leva em consideração propriedades físicas que afetam o comportamento de uma partícula no ar, como densidade e formato. A velocidade em que uma partícula sedimenta é proporcional ao diâmetro aerodinâmico. A mediana da distribuição de massa da partícula transportada pelo ar com relação ao diâmetro aerodinâmico é chamada de diâmetro aerodinâmico mediano de massa (MMAD). O desvio padrão geométrico (GSD) é uma medida da dispersão em torno do MMAD. Finalmente, a fração de partículas finas (FPF) é a fração de partículas que estão abaixo de um diâmetro aerodinâmico especificado (menos de 4,7 pm). O MMAD, GSD e FPF são medidos por um Impactador em Cascata Anderson (ACI). O ACI mede a distribuição de tamanho das gotícuias/partículas geradas por um nebulizador, um inalador de dose medida, um inalador de pó seco, o ambiente e outros.

Neste experimento, foram determinados o MMAD, GSD e FPF de aerossóis produzidos com uma formulação de IMA-638 a 50 mg/mL e 0,5 mg/mL (10 mM de histidina, 5% de sacarose, pH 6,0) por um Nebulizador PARI LC Plus. A Tabela 9 apresenta os resultados deste estudo.

Tabela 9

<table>table see original document page 85</column></row><table>

As formulações de IMA-638 avaliadas apresentam características de aerossol (incluindo tamanho de partícula e integridade da proteína) que são bem adequadas para distribuição pulmonar de anticorpos anti-IL-13 por nebulização.

Exemplo 13: Estabilidade do Anticorpo Para IL-13 Liofilizado, IMA-026 Estou-se a estabilidade a longo prazo de uma formulação liofilizada de anticorpo anti-IL-13. Resumidamente, uma formulação contendo o anticorpo anti-IL-13, IMA-026 (50 mg/mL), 10 mM de histidina, 5% de sacarose (peso/volume), pH 6,0, foi preparada por filtração estéril, e aproximadamente 3,2 mL foram introduzidos em um frasco de tubo de vidro sem pirógenos de 5 mL com uma rolha cinza siliconizada West 4432/50 1319 e, então, Iiofilizados. A formulação foi armazenada a 4°C, 25 °C ou 40 °C durante um mês, dois meses, três meses, seis meses e doze meses a 4°C, 25°C e 40°C, então, o liofilizado foi reconstituído usando-se 1,3 mL de água estéril (USP) para levar a formulação reconstituída a cerca de 1,6 mL, de modo que a formulação tivesse 100 mg/mL de anticorpo anti-IL-13, 20 mM de histidina e 10% de sacarose, pH 6,0.

A porcentagem de espécies HMW foi ensaiada usando- se SEC-HPLC. A porcentagem de espécies HMW na formulação antes da liofilização e reconstituição era de cerca de 1% da proteína total na formulação e também estava a cerca de 1% em todas as amostras armazenadas a 4°C e 25°C (Figura 32). Após doze meses de armazenamento a 40°C, as formulações tinham cerca de 3.0% de espécies HMW (Figura 32). Assim, não houve nenhum aumento substancial no nível de espécies HMW em amostras armazenadas a 5°C e 25°C durante doze meses.

As formulações liofilizadas de anticorpos anti-IL- 13 também foram ensaiadas quanto a bioatividade usando-se um ensaio à base de células em que a inibição da proliferação celular dependente de IL-13 foi examinada na presença de diferentes concentrações de anticorpo formulado para demonstrar a atividade biológica, isto é, a capacidade de se ligar a e seqüestrar IL-13 das células. Os resultados do ensaio são comparados aos resultados usando um anticorpo anti-IL-13 que não foi armazenado. A Figura 33 ilustra os dados desse conjunto de bioensaios. No geral, não houve nenhuma alteração substancial na quantidade de bioatividade após doze meses de armazenamento em nenhuma das amostras. Assim, a formulação é, conforme determinado pela bioatividade, adequada para armazenamento da formulação liofilizada durante pelo menos doze meses. Esses dados demonstram que uma formulação anti-IL- 13 liofilizada conforme aqui descrita é adequada para armazenamento durante pelo menos doze meses.

Exemplo 14: Estabilidade do Anticorpo Para IL-13

Liofilizado, IMA-026

Este experimento foi conduzido conforme descrito no Exemplo 1, exceto que o anticorpo usado foi IMA-026. A formulação de IMA-02 6 usada era: 50 mg/mL de IMA-02 6, 10 mM de histidina, 5% de sacarose, 0,01% de Tween-80, pH 6,0. Os resultados foram substancialmente similares aos obtidos no Exemplo 1. Assim, IMA-026 liofilizado, como o IMA-638 liofilizado, é uma formulação estável.

Exemplo 15: Aerossolização de IMA-026 Com e Sem Tween

Neste experimento, estudou-se o efeito da aerossolização de IMA-026 sobre a % de HMW, porcentagem de recuperação e bioatividade. Os dados deste experimento são mostrados na Tabela 10 abaixo.

Tabela 10

<table>table see original document page 87</column></row><table>

* = por SEC-HPLC

Conforme se pode ver na Tabela 10, as propriedades pré- e pós-nebulização de IMA-026 com ou sem Tween são substancialmente similares. Assim, IMA-026 é adequado como uma formulação de aerossol. OUTRAS MODALIDADES Deve-se entender que, embora a invenção tenha sido descrito em conjunto com sua descrição detalhada, a descrição precedente pretende ilustrar, e não limitar, o âmbito da invenção, que é definido pelo âmbito das reivindicações anexas. Outros aspectos, vantagens e modificações estão dentro do âmbito das reivindicações a seguir. LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA

<110> BARRY, ANTHONY B.

CROWLEY, THOMAS J. DIXON, DANIEL A. SOLEY, ERIN CHRISTINE

<120> FORMULAÇÕES DE ANTICORPO ANTI-IL-13 E SEUS USOS

<130> 36119.354US2

<140> 12/008, 129 <141> 2008-01-09

<150> 60/879,500 <151> 2007-01-09

<160> 16

<170> PatentIn Ver. 3.3

<210> 1

<211> 448

<212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Polipeptidio sintético

<400> 1

Glu Val Gln Leu Val 1 5

Ser Leu Arg Leu Ser 20

Ala Met Ser Trp Val 35

Ala Ser Ile Ser Ser 50

Gly Arg Phe Thr Ile 65

Gln Met Asn Ser Leu 85

Arg Leu Asp Gly Tyr 100

Leu Val Thr Val Ser 115

Leu Ala Pro Ser Ser 130

Cys Leu Val Lys Asp 145

Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 10 15

Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ile Ser Tyr 25 30

Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 40 45

Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys 55 60

Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu 70 75 80

Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 90 95

Tyr Phe Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 105 110

Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 120 125

Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 135 140

Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175

Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190

Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 195 200 205

Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr 210 215 220

His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Leu Gly Ala Pro Ser 225 230 235 240

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 245 250 255

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 260 265 270

Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 275 280 285

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 290 295 300

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 305 310 315 320

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr 325 330 335

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 340 345 350

Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys 355 360 365

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 370 375 380

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 385 390 395 400

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 405 410 415

Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

420 425 430

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<210> 2 <211> 218 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<220> <223> Descrição da Seqüência Artificial: Polipeptidio sintético <400> 2

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr 20 25 30

Gly Lys Ser Leu Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro 35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser 50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 65 70 75 80

Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn 85 90 95

Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 110

Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln 115 120 125

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 130 135 140

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser 145 150 155 160

Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 165 170 175

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 180 185 190

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro 195 200 205

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215

<210> 3 <211> 450 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Polipeptidio sintético

<400> 3

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 15 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30

Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45

Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Asp Asn Ile Lys Tyr Asp Pro Lys Phe 50 55 60

Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Asn Ala Lys Asn Ser Ala Tyr 65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Ser Glu Glu Asn Trp Tyr Asp Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Leu Gly Ala 225 230 235 240

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile

Thr Leu Pro 355

Thr Cys Leu 370

Glu Ser Asn 385

Ser Lys Ala Lys Gly Gln 340 345

Pro Ser Arg Glu Glu Met 360

Val Lys Gly Phe Tyr Pro 375

Gly Gln Pro Glu Asn Asn 390

Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 350

Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 365

Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 380

Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 395 400

Leu Asp Ser Lys Ser Arg

Asp Gly 405

Trp Gln 420

Ser Phe Phe Leu

Gln Gly Asn Val 425

Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 410 415

Phe Ser Cys Ser Val Met His 430

Glu Ala Leu 435

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 440

Leu Ser Leu Ser Pro 445

Gly Lys 450

<210> 4 <211> 219 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Polipeptidio sintético <400> 4

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

15 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser 20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala 35 40 45

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60

Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 65 70 75 80

Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly 85 90 95

Ser His Ile Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 115 120 125

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 130 135 140 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 145 150 155 160

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 165 170 175

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 180 185 190

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 195 200 205

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215

<210> 5 <211> 5 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Polipeptidio sintético

<400> 5

Asp Thr Tyr Ile His 1 5

<210> 6 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptidio sintético <400> 6

Arg Ile Asp Pro Ala Asn Asp Asn Ile Lys Tyr Asp Pro Lys Phe Gln 1 5 10 15

Gly

<210> 7 <211> 11 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptidio sintético

<400> 7

Ser Glu Glu Asn Trp Tyr Asp Phe Phe Asp Tyr 1 5 10

<210> 8 <211> 8 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptidio sintético

<400> 8

Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr 1 5

<210> 9 <211> 8 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptidio sintético <400> 9

Ile Asp Pro Ala Asn Asp Asn Ile 1 5

<210> 10 <211> 11 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptidio sintético <4 00> 10

Ser Glu Glu Asn Trp Tyr Asp Phe Phe Asp Tyr 15 10

<210> 11 <211> 16 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptidio sintético <400> 11

Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu 15 10 15

<210> 12 <211> 7 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptidio sintético <400> 12

Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser 1 5

<210> 13 <211> 9 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Sequênciáf^Artificial: Peptidio sintético

<400> 13

Phe Gln Gly Ser His Ile Pro Tyr Thr 1 5

<210> 14 <211> 11 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptidio sintético <400> 14

Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr 1 5 10

<210> 15 <211> 3 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptidio sintético

<400> 15 Lys Val Ser 1

<210> 16 <211> 9 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptidio sintético <400> 16

Phe Gln Gly Ser His Ile Pro Tyr Thr 1 5

Claims

1. Formulação de anticorpo anti-IL-13, caracterizado pelo fato de compreender: (a) um anticorpo anti-IL-13; (b) um crioprotetor; e (c) um tampão, em que o pH da formulação é de cerca de 5,5 a cerca de 6,5.

2. Formulação, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a formulação é uma formulação liquida, uma formulação liofilizada, uma formulação liofilizada que é reconstituída como um liquido, ou uma formulação em aerossol.

3. Formulação, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-IL-13 na formulação está a uma concentração de: cerca de 0,5 mg/mL a cerca de 250 mg/mL, de cerca de 0,5 mg/mL a cerca de 45 mg/mL, de cerca de 0,5 mg/mL a cerca de 100 mg/mL, de cerca de 100 mg/mL a cerca de 200 mg/mL, ou de cerca de 50 mg/mL a cerca de 250 mg/mL.

4. Formulação, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-IL-13 é um anticorpo humanizado.

5. Formulação, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo de construto de cadeia leve kapa.

6. Formulação, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é selecionado do grupo que consiste em um anticorpo IgGl, um anticorpo IgG2 e um anticorpo IgG4.

7. Formulação, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-IL-13 é um anticorpo monoclonal.

8. Formulação, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-IL-13 é IMA- -638 ou IMA-026.

9. Formulação, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o crioprotetor é de cerca de -2,5% a cerca de 10% (peso/volume) de sacarose ou trealose.

10. Formulação, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o tampão é de cerca de 4 mM a cerca de 60 mM de tampão histidina, de cerca de 5 mM a cerca de 25 mM de tampão succinato, ou de cerca de 5 mM a 25 mM de tampão acetato.

11. Formulação, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a formulação também compreende um surfactante a uma concentração de cerca de 0% a cerca de 0,2%.

12. Formulação, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o surfactante é selecionado do grupo que consiste em polissorbato-20, polissorbato-40, polissorbato-60, polissorbato-65, polissorbato-80, polissorbato-85 e suas combinações.

13. Formulação, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a formulação também compreende de cerca de 0,01% a cerca de 5% de arginina.

14. Formulação, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a formulação também compreende de cerca de 0,001% a cerca de 0,05% de Tween.

15. Formulação, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a formulação também compreende pelo menos um dos seguintes: de cerca de 1% a cerca de 10% de sorbitol, de cerca de 0,1% a cerca de 2% de glicina, de cerca de 5 mM a cerca de 150 mM de metionina, e de cerca de 5 mM a cerca de 100 mM de cloreto de sódio.

16. Formulação, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a formulação também compreende um segundo anticorpo ou seu fragmento de ligação a antigeno, em que o segundo anticorpo é selecionado do grupo que consiste em: um anticorpo anti-IL-13 com uma especificidade de epitopo diferente da do anticorpo para IL-13 da formulação, um anticorpo anti-IgE, um anticorpo anti- C5, um anticorpo anti-IL-4, um anticorpo anti-TNF-α e um anticorpo anti-IL-9.

17. Formulação, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a formulação também compreende um segundo agente terapêutica ou farmacologicamente ativo que seja utilizável no tratamento de um transtorno inflamatório selecionado do grupo que consiste em um anti-histaminico, um agente anti- inflamatório, um broncodilatador de longa ação (LABA) , um corticosteróide inalado (ICS), e um inibidor de leucotrieno.

18. Formulação, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que: (a) o anticorpo é um anticorpo murideo humanizado anti-IL-13; (b) o crioprotetor é de cerca de 0,02% a cerca de 10% (peso/volume) de sacarose ou trealose; e (c) o tampão é de cerca de 4 mM a cerca de 60 mM de tampão histidina, pH 6,0.

19. Formulação, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que a formulação também compreende de cerca de 0,01% ã cerca de 5% de arginina.

20. Formulação, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que a formulação também compreende de cerca de 0,001% a cerca de 0,05% de Tween.

21. Formulação, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que a formulação também compreende pelo menos um dos seguintes: de cerca de 1% a cerca de 10% de sorbitol, de cerca de 0,1% a cerca de 2% de glicina, de cerca de 5 mM a cerca de 150 mM de metionina, e de cerca de 5 mM a cerca de 100 mM de cloreto de sódio.

22. Formulação, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de compreender adicionalmente mais do que 0% e até cerca de 0,2% de polissorbato 80.

23. Formulação, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que: (a) o anticorpo é IMA-638 ou IMA-026; (b) o crioprotetor é de cerca de 0,02% a cerca de -10% (peso/volume) de sacarose ou trealose; e (c) o tampão é 10 mM de tampão succinato, pH 6,0.

24. Formulação, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que: (a) o anticorpo é IMA-638 ou IMA-026; (b) o crioprotetor é de cerca de 0,02% a cerca de 10% (peso/volume) de sacarose ou trealose; e (c) o tampão é 10 mM de tampão acetato, pH 6,0.

25. Formulação em aerossol de um anticorpo anti- IL-13, caracterizado pelo fato de compreender: (a) um anticorpo anti-IL-13; (b) de cerca de 5% a cerca de 10% (peso/volume) de sacarose ou trealose; e (c) um tampão com um pH de cerca de 5,5 a 6,5.

26. Formulação, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a formulação também compreende de cerca de 0,01% a cerca de 5% de arginina.

27. Formulação, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a formulação também compreende de cerca de 0,001% a cerca de 0,05% de Tween.

28. Formulação, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a formulação também compreende pelo menos um dos seguintes: de cerca de 1% a cerca de 10% de sorbitol, de cerca de 0,1% a cerca de 2% de glicina, de cerca de 5 mM a cerca de 150 mM de metionina, e de cerca de 5 mM a cerca de 100 mM de cloreto de sódio.

29. Formulação em aerossol, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de compreender adicionalmente um agente terapêutico que seja utilizável no tratamento de asma ou doença pulmonar obstrutiva crônica.

30. Formulação liofilizada de um anticorpo anti- IL-13, caracterizado pelo fato de compreender: (a) um anticorpo anti-IL-13; (b) de cerca de 5% a cerca de 10% (peso/volume) de sacarose ou trealose; e (c) um tampão com um pH de cerca de 5,5 a 6,5.

31. Formulação, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a porcentagem de aumento de espécies de alto peso molecular (HMW) e de espécies de baixo peso molecular (LMW) em comparação com a formulação original é de menos de 5% após: pelo menos dezoito meses a -80°C, pelo menos vinte e quatro meses a -80°C, pelo menos dezoito meses a -20°C, pelo menos vinte e quatro meses a -20°C, pelo menos dezoito meses a 2°C - 8 °C, pelo menos vinte e quatro meses a 2°C - 8°C, pelo menos dezoito meses a 25°C, ou pelo menos vinte e quatro meses a 25°C.

32. Formulação, de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que espécies HMW e LMW são ensaiadas usando-se cromatografia liquida de alto desempenho-exclusão de tamanho (SEC-HPLC).

33. Formulação, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que pelo menos 90% do anticorpo para IL-13 são anticorpo monomérico após armazenamento do anticorpo durante pelo menos dezoito meses a 2 °C - 8°C, ou pelo menos vinte e quatro meses a 2°C - 8°C.

34. Formulação, de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelo fato de que a natureza monomérica do anticorpo é determinada por um ensaio de ligação, um ensaio de carga de superfície, um bioensaio ou pela razão de espécies HMW para espécies LMW.

35. Composição farmacêutica para o tratamento de um transtorno relacionado a IL-13, a composição farmacêutica caracterizada pelo fato de compreender uma formulação de anticorpo anti-IL-13 de acordo com a reivindicação 1.

36. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 35, caracterizada pelo fato de que a composição também compreende de cerca de 0,01% a cerca de 5% de arginina.

37. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 35, caracterizada pelo fato de que a composição também compreende de cerca de 0,001% a cerca de 0,05% de Tween.

38. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 35, caracterizada pelo fato de que a composição também compreende pelo menos um dos seguintes: de cerca de 1% a cerca de 10% de sorbitol, de cerca de 0,1% a cerca de 2% de glicina, de cerca de 5 mM a cerca de 150 mM de metionina, de cerca de 5 mM a cerca de 100 mM de cloreto de sódio, e mais de 0% e até cerca de 0,2% de um surfactante.

39. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 35, caracterizada pelo fato de que a composição compreende um anticorpo para IL-13 humanizado.

40. Fabricação de uma composição farmacêutica, a composição caracterizada pelo fato de compreender uma formulação de anticorpo que compreende: (a) um anticorpo anti-IL-13; (b) um crioprotetor; e (c) um tampão, em que o pH da formulação é de cerca de 5,5 a 6,5.

41. Método de tratamento de um transtorno relacionado a IL-13, o método caracterizado pelo fato de compreender a administração de uma quantidade farmaceuticamente eficaz de uma formulação de anticorpo que compreende: (a) um anticorpo anti-IL-13; (b) um crioprotetor; e (c) um tampão, em que o pH da formulação é de cerca de 5,5 a 6,5.

42. Método, de acordo com a reivindicação 41, caracterizado pelo fato de que o transtorno relacionado a IL-13 é selecionado do grupo que consiste em: asma alérgica, asma não alérgica, combinações de asma alérgica e não alérgica, asma induzida por exercícios, asma induzida por fármacos, asma ocupacional, asma de estágio tardio, doença pulmonar obstrutiva crônica, artrite, doença inflamatória do intestino, um transtorno inflamatório da pele, esclerose múltipla, osteoporose, tendinite, transtornos alérgicos, inflamação em resposta a um insulto ao hospedeiro, sépsis, artrite reumatóide, osteoartrite, doença do intestino irritável, colite ulcerativa, psoríase, lúpus eritematoso sistêmico, uma doença autoimune, leucemia linfocitica crônica de células B (CLL de células Β), doença de Hodgkin e fibrose tissular em esquistossomose.

43. Método, de acordo com a reivindicação 41, caracterizado pelo fato de que a formulação de anticorpo é administrada por um método selecionado do grupo que consiste em: administração oral, nasal, por depósito, parenteral, subcutânea, intramuscular, intravenosa, intrarticular, intrabrônquica, intra-abdominal, intracapsular, intracarti- laginosa, intracavitária, intracelial, intracerebelar, intracerebroventricular, intracólica, intracervical, intra- gástrica, intra-hepática, intramiocárdica, intraocular, intraosteal, intrapélvica, intrapericárdica, intraperito- neal, intrapleural, intraprostática, intrapulmonar, intrarretal, intrarrenal, intrarretineano, intraespinhal, intrassinovial, intra-torácica, intrauterina, intravesical, intralesional, de bolus, vaginal, retal, bucal, sublingual, transdérmica (tópica), transmucosa ou por liberação prolongada.

44. Seringa injetável, caracterizada pelo fato de conter uma solução previamente enchida da formulação, de acordo com a reivindicação 1.

45. Dispositivo para administração nasal, caracterizado pelo fato de compreender uma formulação de acordo com a reivindicação 1 e um dispersante farmaceuticamente aceitável.

46. Emplastro transdérmico, caracterizado pelo fato de compreender uma formulação de acordo com a reivindicação 1 e, opcionalmente, um veiculo farmaceuticamente aceitável.

47. Bolsa intravenosa, caracterizada pelo fato de compreender uma formulação de acordo com a reivindicação 1 e, opcionalmente, salina normal ou 5% de dextrose.

48. Kit compreendendo pelo menos um recipiente, caracterizado pelo fato de compreender uma formulação de acordo com a reivindicação 1 e instruções de uso.

49. Kit, de acordo com a reivindicação 48, caracterizado pelo fato de que o recipiente é um frasco de vidro ou uma seringa injetável.

50. Seringa injetável previamente enchida, caracterizada pelo fato de compreender a formulação: (a) 100 mg/mL de um anticorpo anti-IL-13; (b) 10 mM de histidina; (c) 5% de sacarose; (d) 0,01% de Tween-80; (e) 40 mM de NaCl, em que o pH da formulação é de 6,0.