BR112019022695A2 - Formulações estáveis de anticorpos anti-ctla4 isolados e em combinação com anticorpos do receptor de morte programada 1 (pd-1) e métodos de uso das mesmas

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Abstract

Description

Claims

BR112019022695A2

Publication number: BR112019022695A2
Application number: BR112019022695-8A
Authority: BR
Inventors: Bhattacharya Soumendu; De Arnab; Nachu Narasimhan Chakravarthy; K. Sharma Manoj; Yang Xiaoyu; Burlage Rubi; K. Cheung Jason
Original assignee: Merck Sharp & Dohme Corp.
Priority date: 2017-05-02
Filing date: 2018-05-01
Publication date: 2020-05-26
Also published as: SG11201910134SA; CN110678199A; JP2023109942A; CO2019012143A2; EA201992526A1; EP3618866A4; KR20190142393A; CA3060695A1; MX2019013034A; US20200262922A1; CL2019003143A1; TN2019000294A1; KR102624564B1; EP3618866A1; JP2020518598A; MA50501A; AU2018263837A1; WO2018204343A1

a invenção refere-se a formulações estáveis compreendendo anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos que se ligam ao antígeno 4 associado a linfócito t citotóxico (ctla4), opcionalmente contendo ainda um anticorpo de anti-receptor de morte programada 1 (pd-1) humano ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo. também são fornecidos métodos para tratar vários canceres e infecções crônicas com as formulações da invenção.

FORMULAÇÕES ESTÁVEIS DE ANTICORPOS ANTI-CTLA4 ISOLADOS E EM COMBINAÇÃO COM ANTICORPOS DO RECEPTOR DE MORTE PROGRAMADA 1 (PD-1) E MÉTODOS DE USO DAS MESMAS

CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A invenção refere-se a formulações de anticorpos terapêuticos e seu uso no tratamento de vários transtornos. Em um aspecto, a invenção refere-se a formulações compreendendo anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos que se ligam ao antígeno 4 associado a linfócito T citotóxico (CTLA4). Em um outro aspecto, tal formulação compreende ainda um anticorpo anti-receptor de morte programada 1 (PD-1) humano ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo. Também são fornecidos métodos de tratar vários canceres e infecções crônicas com as formulações descritas na presente invenção.

REFERÊNCIA CRUZADA AOS PEDIDOS RELACIONADOS

[002] Este pedido reivindica o benefício de U.S.S.N. 62/500,268, depositado em 2 de maio de 2017, os conteúdos do qual são aqui incorporados por referência em sua totalidade.

REFERÊNCIA À LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS APRESENTADA ELETRONICAMENTE

[003] A listagem de sequências do presente pedido é apresentada eletronicamente por intermédio da EFS-Web como uma listagem de sequências em formato ASCII com um nome de arquivo 24449WOPCT-SEQTXT30APR2018.TXT, data de criação de 30 de abril de 2018 e um tamanho de 96 Kb. Esta listagem de sequências apresentada por intermédio da EFS-Web é parte do relatório descritivo e é aqui incorporada por referência em sua totalidade.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[004] Fármacos de anticorpo para o uso em humanos podem diferir de

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2/132 certa forma na sequência de aminoácidos de seus domínios constantes ou em suas sequências estruturais dentro dos domínios variáveis, mas eles tipicamente diferem o mais dramaticamente nas sequências de CDR. Mesmo os anticorpos que se ligam à mesma proteína, ao mesmo polipeptídeo ou ainda potencialmente ao mesmo epítopo podem compreender sequências de CDR inteiramente diferentes. Anticorpos terapêuticos para o uso em seres humanos também podem ser obtidos a partir de sequência de anticorpo de linhagem germinativa humana ou de sequências de anticorpo de linhagem germinativa não humana (por exemplo, de roedor), tal como em anticorpos humanizados, levando ainda a mais diversidade em sequências de CDR potenciais. Estas diferenças de sequência resultam em diferentes estabilidades em solução e diferente responsividade a parâmetros de solução. Além disso, pequenas mudanças no arranjo de aminoácidos ou mudanças em um ou alguns resíduos de aminoácido podem resultar em estabilidade de anticorpo dramaticamente diferente e suscetibilidade às vias de degradação específicas de sequência. Como uma consequência, não é possível no momento prognosticar as condições de solução necessárias para otimizar a estabilidade de anticorpo. Cada anticorpo deve ser estudado individualmente para determinar a formulação de solução ideal. Bhambhani etal. (2012) J. Pharm. Sei. 101:1120.

[005] Anticorpos também são proteínas de peso molecular relativamente alto (~150.000 Da), por exemplo quando comparadas com outras proteínas terapêuticas tais como hormônios e citocinas. Como uma consequência, é frequentemente necessário dosar com quantidades em peso relativamente altas de fármacos de anticorpo para obter as concentrações molares desejadas de fármaco. Além disso, é frequentemente desejável administrar fármacos de anticorpo subeutaneamente, visto que isto permite a autoadministração. A autoadministração evita o tempo e despesa associados com visitas a uma

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3/132 instalação médica para administração, por exemplo, intravenosamente. A liberação subcutânea é limitada pelo volume de solução que pode ser praticamente liberado em um local de injeção em uma única injeção, que é geralmente cerca de 1 a 1,5 mL. A autoadministração subcutânea é tipicamente realizada usando uma seringa pré-cheia ou autoinjetor cheio com uma formulação de solução líquida do fármaco, ao invés de uma forma liofilizada, para evitar a necessidade do paciente de ressuspender o fármaco antes da injeção. Fármacos de anticorpo devem ser estáveis durante o armazenamento para garantir eficácia e a consistência na dosagem, de modo que seja crítico que qualquer formulação escolhida suporte as propriedades desejáveis, tais como concentração alta, limpidez e viscosidade aceitável e que também mantenha estas propriedades e eficácia do fármaco durante um tempo de prateleira aceitavelmente longo sob condições de armazenamento típicas.

[006] CTLA4 tem relação muito íntima com a molécula de CD28 em estrutura de gene, localização do cromossomo, homologia de sequência e expressão de gene. Ambos são receptores para a molécula co-estimulante B7, principalmente expressa na superfície de células T ativadas. Depois de se ligar a B7, CTLA4 pode inibir a ativação de células T de camundongo e humanas, desempenhando um papel regulador negativo na ativação de células T.

[007] mAbs de CTLA4 ou ligantes de CTLA4 podem impedir CTLA4 de se ligar aos seus ligantes nativos, bloqueando desse modo a transdução do sinal regulador negativo de célula T por CTLA4 e melhorando a responsividade de células T a vários antígenos. Neste aspecto, resultados de estudo in vivo e in vitro estão substancialmente de acordo. No momento, existem alguns mAbs de CTLA4 sendo testados em ensaios clínicos para tratar câncer de próstata, câncer de bexiga, câncer colorretal, câncer do trato gastrointestinal, câncer de fígado, melanoma maligno, etc. (Grosso et al., CTLA-4 blockade in tumor models: an

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4/132 overview of preclinical and translational research. Cancer Immun. 13:5 (2013)).

[008] Como fatores importantes que afetam a função de células T, CTLA4 e mAbs de CTLA4 podem produzir efeito terapêutico específico sobre doenças interferindo-se com o microambiente imune no corpo. Eles têm eficácia alta e remediam a deficiência da medicação tradicional, abrindo um novo caminho da terapia genética. CTLA4 e mAbs de CTLA4 estão sendo testados em experimentos e vários estágios de ensaios clínicos. Por exemplo, em doenças autoimunes, eles eficazmente inibiram a hiperresponsividade das vias aéreas em um modelo animal de asma, impediram o desenvolvimento de doenças reumáticas, tolerância imune mediada a um aloenxerto no corpo e semelhantes. Por outro lado, embora a terapia genética biológica não mostrou qualquer efeito adverso em ensaios clínicos de curto prazo, atenção deve ser dada ao efeito potencial depois da aplicação a longo prazo. Por exemplo, a obstrução excessiva da sinalização de CTLA4-B7 por mAbs de CTLA4 pode resultar no desenvolvimento de doenças autoimunes. Visto que anticorpos podem se ligar especificamente aos seus antígenos e induzir a lise de células alvos ou bloquear o progresso da patologia, desenvolvimento e utilização de fármacos com base em anticorpos, especialmente anticorpos humanizados têm importante significância no tratamento clínico de tumores malignos e outras doenças imunes em seres humanos.

[009] PD-1 é reconhecido como um importante participante na regulação imune e na manutenção da tolerância periférica. PD-1 é moderadamente expresso em células T naive, B e NKT e suprarregulados por sinalização do receptor de célula T/B em linfócitos, monócitos e mielócitos (Sharpe et al., The function of programmed cell death 1 and its ligands in regulating autoimunnity and infection. Nature Immunology (2007); 8:239 - 245). Foi proposto que a eficácia de anticorpos anti-PD-1 poderia ser melhorada se administrados em

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5/132 combinação com outras terapias para câncer aprovadas ou experimentais, por exemplo, radiação, cirurgia, agentes quimioterápicos, terapias alvo, agentes que inibem outras vias de sinalização que são desregulados em tumores e outros agentes de melhoramento imune. Um tal agente que foi testado em combinação com antagonistas de PD-1 é o antígeno 4 associado a linfócito T citotóxico (abreviado CTLA4).

[010] A necessidade existe para formulações estáveis de anticorpos antiCTLA4 para uso farmacêutico, por exemplo, para tratar vários canceres e doenças infecciosas, assim como para formulações estáveis de anticorpos antiCTLA4 co-formulados com anticorpos anti-PD-1 humano. Preferivelmente, tais formulações exibirão um tempo de prateleira longo, serão estáveis quando armazenadas e transportadas e preferivelmente exibirão estabilidade durante meses a anos sob condições típicas para o armazenamento de fármacos para autoadministração, isto é, em temperatura de refrigerador em uma seringa, resultando em um tempo de prateleira longo para o produto medicamentoso correspondente.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[011] Em um aspecto, a invenção inclui uma formulação de um anticorpo anti-CTLA4 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, compreendendo (i) um anticorpo anti-CTLA4 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo; (ii) um tampão, (iii) um açúcar não-redutor; (iv) um tensoativo não-iônico; e um antioxidante. Em uma outra modalidade, a formulação compreende ainda um anticorpo anti-PD-1, por exemplo, pembrolizumabe ou nivolumabe. Em uma modalidade, a formulação compreende ainda um quelante.

[012] Em uma modalidade, a formulação compreende (i) cerca de 10 mg/mL a cerca de 200 mg/mL de um anticorpo anti-CTLA4 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo; (ii) cerca de 5 mM a cerca de 20 mM de tampão;

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6/132 (iii) cerca de 6 % a cerca de 8 % em peso/volume (p/v) de açúcar não-redutor;

(iv) cerca de 0,01 % a cerca de 0,10 % de tensoativo não-iônico; e (v) cerca de 1 mM a cerca de 20 mM de antioxidante. Em uma outra modalidade, a formulação compreende ainda um anticorpo anti-PD-1, por exemplo, pembrolizumabe ou nivolumabe. Em uma outra modalidade, a formulação compreende ainda um quelante. Em uma modalidade, o quelante está presente em quantidade de cerca de 1 μΜ a cerca de 50 μΜ. O quelante é DTPA. Em uma modalidade, a formulação tem um pH entre 4,5 e 6,5. Em modalidades particulares, o pH da formulação é de cerca de pH 5,0 a cerca de pH 6,0. Em uma outra modalidade, o pH da formulação é de cerca de pH 5,3 a cerca de pH 5,8. Em uma outra modalidade, o pH é 5,3. Em uma outra modalidade, o pH é 5,4. Em uma modalidade, o pH é 5,5. Em uma modalidade, o pH é 5,6. Em uma outra modalidade, o pH é 5,7. Em uma modalidade, o pH é 5,8.

[013] Em uma modalidade da formulação, o tampão é tampão L-histidina ou tampão acetato de sódio, o açúcar não-redutor é sacarose, o tensoativo nãoiônico é polisorbato 80 e o antioxidante é metionina ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo. Em uma modalidade, o antioxidante é L-metionina. Em uma outra modalidade, o antioxidante é um sal farmaceuticamente aceitável de L-metionina, tal como, por exemplo, HCI de metionina.

[014] Em uma outra modalidade, a formulação compreende (i) cerca de 10 mg/mL a cerca de 200 mg/mL de um anticorpo anti-CTLA4 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo; (ii) cerca de 5 mM a cerca de 20 mM de Lhistidina ou cerca de 5 mM a cerca de 20 mM de tampão acetato de sódio; (iii) cerca de 6 % a cerca de 8 % p/v de sacarose; (iv) cerca de 0,01 % a cerca de 0,10 % p/v de polisorbato 80; e (v) cerca de 1 mM a cerca de 20 mM de L-metionina. Em uma outra modalidade, a formulação compreende ainda um anticorpo anti

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PD-1, por exemplo, pembrolizumabe ou nivolumabe. Em uma modalidade, a formulação compreende ainda um quelante. Em uma modalidade, o quelante está presente em uma quantidade de cerca de 1 μΜ a cerca de 50 μΜ. Em uma modalidade, o quelante é DTPA. Em uma modalidade, o tampão é um tampão Lhistidina. Em uma modalidade, a formulação compreende cerca de 8 mM a cerca de 12 mM de L-histidina. Em uma outra modalidade, a formulação compreende cerca de 5 mM a cerca de 10 mM de L-metionina. Em uma outra modalidade, a formulação compreende polisorbato 80 em uma razão em peso de aproximadamente 0,02 % p/v. Em uma modalidade, a formulação anti-CTLA4 compreende sacarose em uma razão em peso de cerca de 7 % (p/v).

[015] Em modalidades da formulação, a concentração do anticorpo antiCTLA4 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é de cerca de 10 mg/mL a cerca de 100 mg/mL. Em uma outra modalidade, a concentração do anticorpo anti-CTLA4 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é cerca de 10 mg/mL, 12,5 mg/mL, 15 mg/mL, 20 mg/mL, 25 mg/mL, 50 mg/mL, 75 mg/mL ou 100 mg/mL. Em uma modalidade, a concentração do anticorpo anti-CTI_A4 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é 25 mg/mL. Em uma modalidade adicional, a concentração do anticorpo anti-CTLA4 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é cerca de 50 mg/mL. Em uma outra modalidade, a concentração do anticorpo anti-CTLA ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é cerca de 75 mg/mL. Em uma outra modalidade, a concentração do anticorpo anti-CTLA4 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é 100 mg/mL.

[016] Em um aspecto, é fornecida uma formulação compreendendo cerca de 25 mg/mL de um anticorpo anti-CTLA4 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, 10 mM de tampão L-histidina, cerca de 7 % p/v de sacarose, cerca de 0,02 % p/v de polisorbato 80 e cerca de 10 mM de L-metionina.

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[017] Em um aspecto, é fornecida uma formulação compreendendo cerca de 50 mg/mL de um anticorpo anti-CTLA4 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, 10 mM de tampão L-histidina, cerca de 7 % p/v de sacarose, cerca de 0,02 % p/v de polisorbato 80 e cerca de 10 mM de L-metionina.

[018] Em um aspecto, é fornecida uma formulação compreendendo cerca de 75 mg/mL de um anticorpo anti-CTLA4 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, 10 mM de tampão L-histidina, cerca de 7 % p/v de sacarose, cerca de 0,02 % p/v de polisorbato 80 e cerca de 10 mM de L-metionina.

[019] Em um aspecto, é fornecida uma formulação compreendendo cerca de 100 mg/mL de um anticorpo anti-CTLA4 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, 10 mM de tampão L-histidina, cerca de 7 % p/v de sacarose, cerca de 0,02 % p/v de polisorbato 80 e cerca de 10 mM de L-metionina.

[020] Em um aspecto de qualquer uma das formulações acima, a formulação tem um pH de cerca de 5,3 a 5,8. Em um outro aspecto, a formulação tem um pH de cerca de 5,5 a cerca de 5,6. Em um outro aspecto, a formulação tem um pH de cerca de 5,5. Em um outro aspecto, a formulação tem um pH de cerca de 5,6.

[021] Em um aspecto de qualquer uma das formulações acima, a formulação compreende um anticorpo anti-PDl ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo. Em um aspecto, o anticorpo anti-PDl é pembrolizumabe. Em um outro aspecto, o anticorpo anti-PDl é nivolumabe.

[022] Em um outro aspecto, a formulação pode compreender ainda um quelante. Em uma modalidade, o quelante é DTPA. Em uma modalidade, o quelante é EDTA. Em um aspecto, o quelante está presente em uma quantidade de cerca de 1 μΜ a cerca de 50 μΜ. Em uma modalidade, a formulação compreende cerca de 5 μΜ do quelante. Em uma modalidade, a formulação compreende cerca de 10 μΜ do quelante. Em uma modalidade, a formulação

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9/132 compreende cerca de 15 μΜ do quelante. Em uma modalidade, a formulação compreende cerca de 20 μΜ do quelante. Em uma modalidade, a formulação compreende cerca de 25 μΜ do quelante. Em uma modalidade, formulação compreende cerca de 30 μΜ do quelante. Em uma modalidade, formulação compreende cerca de 35 μΜ do quelante. Em uma modalidade, formulação compreende cerca de 40 μΜ do quelante. Em uma modalidade, formulação compreende cerca de 45 μΜ do quelante. Em uma modalidade, formulação compreende cerca de 50 μΜ do quelante. Em uma modalidade, o agente quelante é DTPA, que está presente em qualquer uma das quantidades estabelecidas acima. Em uma outra modalidade, o agente quelante é EDTA que está presente em qualquer uma das quantidades estabelecidas acima.

[023] Em uma modalidade, a formulação está contida em um frasco de vidro. Em uma outra modalidade, a formulação está contida em um dispositivo de injeção. Em uma outra modalidade, a formulação é uma formulação líquida. Em um aspecto, a formulação é congelada até pelo menos abaixo de -70 °C. Em uma outra modalidade, a formulação é uma solução reconstituída a partir de uma formulação liofilizada.

[024] Em certas modalidades, a formulação é estável em temperatura refrigerada (2 a 8 °C) por pelo menos 3 meses, preferivelmente 6 meses e mais preferivelmente 1 ano e ainda mais preferivelmente até 2 anos. Em uma modalidade da formulação, depois de 12 meses a 5 °C a % de monómero do anticorpo anti-CTLA4 é > 90 % como determinado por cromatografia de exclusão por tamanho. Em uma outra modalidade da formulação, depois de 12 meses a 5 °C a % de monómero do anticorpo anti-CTLA4 é > 95 % como determinado por cromatografia de exclusão por tamanho. Em uma outra modalidade da formulação, depois de 12 meses a 5 °C a % de cadeia pesada e cadeia leve do anticorpo anti-CTLA4 é > 90 % como determinado por CE-SDS redutor. Em uma

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10/132 outra modalidade da formulação, depois de 12 meses a 5 °C a % de cadeia pesada e cadeia leve do anticorpo anti-CTLA4 é > 95 % como determinado por CE-SDS redutor. Em uma outra modalidade da formulação, depois de 12 meses a 5 °C, a % de IgG intacta do anticorpo anti-CTLA4 é > 90 % como determinado por CESDS não redutor. Em uma outra modalidade da formulação, depois de 12 meses a 5 °C a % de IgG intacta do anticorpo anti-CTLA4 é > 95 % como determinado por CE-SDS não redutor.

[025] Em um aspecto de qualquer uma das formulações descritas acima, a formulação compreende um anticorpo anti-CTLA4 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreendendo três CDRs de cadeia leve e três CDRs de cadeia pesada, em que as CDRs de cadeia leve compreendem CDRL1 da SEQ ID NO: 38, CDRL2 da SEQ ID NO: 39, CDRL3 da SEQ ID NO: 40 e as CDRs de cadeia pesada compreendem CDRH1 da SEQ ID NO: 35, CDRH2 da SEQ ID NO: 36 e CDHR3 da SEQ ID NO: 37. Em um outro aspecto, a formulação compreende um anticorpo anti-CTLA4 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 88 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a SEQ ID NO: 48. Em um outro aspecto, a formulação compreende um anticorpo anti-CTLA4 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreendendo uma cadeia pesada compreendendo a SEQ ID NO: 99 e uma cadeia leve compreendendo a SEQ ID NO: 100.

[026] Em um aspecto, a presente invenção fornece uma co-formulação de um anticorpo anti-CTLA4 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo e um anticorpo anti-PD-1 humano ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, compreendendo (i) um anticorpo anti-CTLA4 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo; (ii) um anticorpo anti-PD-1 humano ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, (ii) um tampão, (iii) um açúcar não-redutor; (iv)

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11/132 um tensoativo não-iônico; e um antioxidante. Em uma modalidade, a coformulação compreende ainda um quelante. Em uma modalidade o quelante é EDTA. Em uma outra modalidade, o quelante é DTPA. Em uma modalidade da co-formulação, a razão do anticorpo anti-PD-1 humano para o anticorpo antiCTLA4 é 1:2. Em uma outra modalidade da co-formulação, a razão do anticorpo anti-PD-1 humano para o anticorpo anti-CTLA4 é 1:1. Em uma outra modalidade da co-formulação, a razão do anticorpo anti-PD-1 humano para o anticorpo antiCTLA4 é 2:1. Em uma outra modalidade da co-formulação, a razão do anticorpo anti-PD-1 humano para o anticorpo anti-CTLA4 é 10:1. Em uma outra modalidade da co-formulação, a razão do anticorpo anti-PD-1 humano para o anticorpo anti-CTLA4 é 1:10. Em uma outra modalidade, a razão do anticorpo anti-PD-1 humano para o anticorpo anti-CTLA4 é 8:1. Em uma outra modalidade, a razão do anticorpo anti-PD-1 humano para o anticorpo anti-CTLA4 é 8:3.

[027] Em uma modalidade da invenção, a co-formulação compreende (i) cerca de 1 mg/mL a cerca de 100 mg/mL de um anticorpo anti-CTLA4 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo; (ii) cerca de 1 mg/mL a cerca de 100 mg/mL de um anticorpo anti-PD-1 humano (ii) cerca de 5 mM a cerca de 20 mM de tampão; (iii) cerca de 6 % a cerca de 8 % em peso/volume (p/v) de açúcar não-redutor; (iv) cerca de 0,01 % a cerca de 0,10 % de tensoativo não-iônico; e (v) cerca de 1 mM a cerca de 20 mM de antioxidante. Em uma modalidade, a coformulação compreende ainda um quelante. Em uma modalidade, o quelante é DTPA. Em uma modalidade da co-formulação, a razão do anticorpo anti-PD-1 humano para o anticorpo anti-CTLA4 é 1:2. Em uma outra modalidade da coformulação, a razão do anticorpo anti-PD-1 humano para o anticorpo anti-CTLA4 é 1:1. Em uma outra modalidade da co-formulação, a razão do anticorpo antiPD-1 humano para o anticorpo anti-CTLA4 é 2:1. Em uma outra modalidade da co-formulação, a razão do anticorpo anti-PD-1 humano para o anticorpo anti

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CTLA4 é 10:1. Em uma outra modalidade da co-formulação, a razão do anticorpo anti-PD-1 humano para o anticorpo anti-CTLA4 é 1:10. Em uma outra modalidade, a razão do anticorpo anti-PD-1 humano para o anticorpo anti-CTLA4 é 8:1. Em uma outra modalidade, a razão do anticorpo anti-PD-1 humano para o anticorpo anti-CTLA4 é 8:3. Em uma modalidade, a co-formulação tem um pH entre 4,5 e 6,5. Em outras modalidades, o pH da formulação é de cerca de pH 5,0 a cerca de pH 6,0. Em uma outra modalidade, o pH da formulação é de cerca de pH 5,3 a cerca de pH 5,8.

[028] Em uma modalidade da co-formulação, o tampão é um tampão histidina ou tampão acetato de sódio, o açúcar não-redutor é sacarose, o tensoativo não-iônico é polisorbato 80 e o antioxidante é metionina ou um sal farmaceuticamente aceitável deste. Em uma modalidade, o antioxidante é Lmetionina. Em uma outra modalidade, antioxidante é um sal farmaceuticamente aceitável de L-metionina, tal como, por exemplo, HCI de metionina.

[029] Em um outro aspecto, a co-formulação compreende (i) cerca de 1 mg/mL a cerca de 100 mg/mL de um anticorpo anti-CTLA4 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo; (ii) cerca de 1 mg/mL a cerca de 100 mg/mL de um anticorpo anti-PD-1 humano ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo; (iii) cerca de 5 mM a cerca de 20 mM de tampão L-histidina ou cerca de 5 mM a cerca de 20 mM de tampão acetato de sódio; (iv) cerca de 6 % a cerca de 8 % p/v de sacarose; (v) cerca de 0,01 % a cerca de 0,10 % p/v de polisorbato 80; e (vi) cerca de 1 mM a cerca de 20 mM de L-metionina. Em uma modalidade, a co-formulação compreende ainda um quelante. Em uma modalidade, o quelante é DTPA. Em uma modalidade, o tampão é tampão L-histidina. Em uma modalidade, a co-formulação compreende cerca de 8 mM a cerca de 12 mM de tampão L-histidina. Em uma outra modalidade, a co-formulação compreende cerca de 5 mM a cerca de 10 mM de L-metionina. Em uma outra modalidade, a

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13/132 co-formulação compreende polisorbato 80 em uma razão em peso de aproximadamente 0,02 % p/v. Em uma modalidade, co-formulação compreende sacarose em uma razão em peso de cerca de 7 % (p/v).

[030] Em modalidades da co-formulação, a concentração do anticorpo antiCTLA4 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é de cerca de 1 mg/mL a cerca de 100 mg/mL. Em uma outra modalidade, a concentração do anticorpo anti-CTLA4 é de cerca de 10 mg/mL a cerca de 100 mg/mL. Em uma outra modalidade, a concentração do anticorpo anti-CTLA4 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é cerca de 10 mg/mL. Em uma outra modalidade, a concentração do anticorpo anti-CTLA4 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é 1,25 mg/mL. Em uma outra modalidade, a concentração do anticorpo anti-CTLA4 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é 2,5 mg/mL. Em uma outra modalidade, a concentração do anticorpo anti-CTLA4 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é 5 mg/mL. Em uma outra modalidade, a concentração do anticorpo anti-CTLA4 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é 12,5 mg/mL. Em uma outra modalidade, a concentração do anticorpo anti-CTLA4 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é 25 mg/mL. Em uma outra modalidade, a concentração do anticorpo anti-CTLA4 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é 50 mg/mL. Em uma outra modalidade, o anticorpo anti-CTLA4 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é 75 mg/mL. Em uma outra modalidade, a concentração do anticorpo anti-CTLA4 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é 100 mg/mL. Em uma modalidade adicional, a concentração do anticorpo anti-CTLA4 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é cerca de 50 mg/mL. Em uma outra modalidade, a concentração do anticorpo anti-CTLA4 é 2,9 mg/mL. Em uma outra modalidade, a concentração do anticorpo anti-CTLA4 é 7,9 mg/mL.

[031] Em modalidades da co-formulação, a concentração do anticorpo anti

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PD-1 humano é de cerca de 1 mg/mL a cerca de 100 mg/mL. Em uma outra modalidade, a concentração do anticorpo anti-PD-1 humano é cerca de 10 mg/mL a cerca de 100 mg/mL. Em uma outra modalidade, a concentração do anticorpo anti-PD-1 humano é cerca de 25 mg/mL. Em uma outra modalidade, a concentração do anticorpo anti-PD-1 humano é cerca de 22,7 mg/mL. Em uma outra modalidade, a concentração do anticorpo anti-PD-1 humano é cerca de 2,27 mg/mL. Em uma outra modalidade, a concentração do anticorpo anti-PD-1 humano é cerca de 21,1 mg/mL. Em uma outra modalidade, a concentração do anticorpo anti-PD-1 humano é cerca de 23,5 mg/mL.

[032] Em uma modalidade, a co-formulação compreende cerca de 25 mg/mL do anticorpo anti-PDl, cerca de 12,5 mg/mL do anticorpo anti-CTLA4,10 mM de tampão L-histidina, cerca de 7 % p/v de sacarose, cerca de 0,02 % p/v de polisorbato 80 e cerca de 10 mM de L-metionina.

[033] Em uma modalidade, a co-formulação compreende cerca de 25 mg/mL do anticorpo anti-PDl, cerca de 25 mg/mL do anticorpo anti-CTLA4, 10 mM de tampão L-histidina, cerca de 7 % p/v de sacarose, cerca de 0,02 % p/v de polisorbato 80 e cerca de 10 mM de L-metionina.

[034] Em uma modalidade, a co-formulação compreende cerca de 25 mg/mL do anticorpo anti-PDl, cerca de 50 mg/mL do anticorpo anti-CTLA4, 10 mM de tampão L-histidina, cerca de 7 % p/v de sacarose, cerca de 0,02 % p/v de polisorbato 80 e cerca de 10 mM de L-metionina.

[035] Em uma modalidade, a co-formulação compreende cerca de 22,72 mg/mL do anticorpo anti-PDl, cerca de 2,3 mg/mL do anticorpo anti-CTLA4, 10 mM de tampão L-histidina, cerca de 7 % p/v de sacarose, cerca de 0,02 % p/v de polisorbato 80 e cerca de 10 mM de L-metionina.

[036] Em uma modalidade, a co-formulação compreende cerca de 2,27 mg/mL do anticorpo anti-PDl, cerca de 22,7 mg/mL do anticorpo anti-CTLA4,10

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15/132 mM de tampão L-histidina, cerca de 7 % p/v de sacarose, cerca de 0,02 % p/v de polisorbato 80 e cerca de 10 mM de L-metionina.

[037] Em uma modalidade, a co-formulação compreende cerca de 23,5 mg/mL do anticorpo anti-PDl, cerca de 2,9 mg/mL do anticorpo anti-CTLA4, 10 mM de tampão L-histidina, cerca de 7 % p/v de sacarose, cerca de 0,02 % p/v de polisorbato 80 e cerca de 10 mM de L-metionina.

[038] Em uma modalidade, a co-formulação compreende cerca de 21,1 mg/mL do anticorpo anti-PDl, cerca de 7,9 mg/mL do anticorpo anti-CTLA4, 10 mM de tampão L-histidina, cerca de 7 % p/v de sacarose, cerca de 0,02 % p/v de polisorbato 80 e cerca de 10 mM de L-metionina.

[039] Em um aspecto de qualquer uma das formulações descritas acima, a formulação compreende um anticorpo anti-CTLA4 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreendendo três CDRs de cadeia leve e três CDRs de cadeia pesada, em que as CDRs de cadeia leve compreendem CDRL1 da SEQ ID NO: 38, CDRL2 da SEQ ID NO: 39, CDRL3 da SEQ ID NO: 40 e as CDRs de cadeia pesada compreendem CDRH1 da SEQ ID NO: 35, CDRH2 da SEQ ID NO: 36 e CDHR3 da SEQ ID NO: 37. Em um outro aspecto, a formulação compreende um anticorpo anti-CTLA4 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo a SEQ ID NO: 88 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a SEQ ID NO: 48. Em um outro aspecto, a formulação compreende um anticorpo anti-CTLA4 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreendendo uma cadeia pesada compreendendo a SEQ ID NO: 99 e uma cadeia leve compreendendo a SEQ ID NO: 100. Em um aspecto de qualquer uma das formulações descritas acima, o anticorpo anti-PD-1 humano ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende três CDRs de cadeia leve e três CDRs de cadeia pesada, em que as CDRs de cadeia leve compreendem CDRL1 da SEQ ID NO: 1, CDRL2 da SEQ

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ID NO: 2, CDRL3 da SEQ ID NO: 3 e as CDRs de cadeia pesada compreendem CDRH1 da SEQ ID NO: 6, CDRH2 da SEQ ID NO: 7 e CDHR3 da SEQ ID NO: 8. Em um outro aspecto, as formulações compreendem um anticorpo anti-PDl humano ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreendendo uma região variável de cadeia leve compreendendo a SEQ ID NO: 4 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a SEQ ID NO: 9. Em um outro aspecto, as formulações compreendem um anticorpo anti-PDl humano ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreendendo uma cadeia leve compreendendo a SEQ ID NO: 5 e uma cadeia pesada compreendendo a SEQ ID NO: 10. Em um aspecto de qualquer uma das formulações descritas acima, o anticorpo anti-PD-1 humano ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é pembrolizumabe. Em um outro aspecto, o anticorpo anti-PD-1 humano ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é nivolumabe.

[040] Em um aspecto de qualquer uma das co-formulações descritas acima, a formulação compreende (i) um anticorpo anti-CTLA4 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreendendo três CDRs de cadeia leve e três CDRs de cadeia pesada, em que as CDRs de cadeia leve compreendem CDRL1 da SEQ ID NO: 38, CDRL2 da SEQ ID NO: 39, CDRL3 da SEQ ID NO: 40 e as CDRs de cadeia pesada compreendem CDRH1 da SEQ ID NO: 35, CDRH2 da SEQ ID NO: 36 e CDHR3 da SEQ ID NO: 37 e (ii) um anticorpo anti-PD-1 humano ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreendendo três CDRs de cadeia leve e três CDRs de cadeia pesada, em que as CDRs de cadeia leve compreendem CDRL1 da SEQ ID NO: 1, CDRL2 da SEQ ID NO: 2, CDRL3 da SEQ ID NO: 3 e as CDRs de cadeia pesada compreendem CDRH1 da SEQ ID NO: 6, CDRH2 da SEQ ID NO: 7 e CDHR3 da SEQ ID NO: 8.

[041] Em um aspecto de qualquer uma das co-formulações descritas acima, a formulação compreende (i) um anticorpo anti-CTLA4 ou fragmento de ligação

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17/132 ao antígeno do mesmo compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo a SEQ ID NO: 88 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a SEQ ID NO: 48 e (ii) um anticorpo anti-PDl humano ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreendendo uma região variável de cadeia leve compreendendo a SEQ ID NO: 4 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a SEQ ID NO: 9.

[042] Em um outro aspecto de qualquer uma das co-formulações descritas acima, a formulação compreende (i) um anticorpo anti-CTLA4 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreendendo uma cadeia pesada compreendendo a SEQ ID NO: 99 e uma cadeia leve compreendendo a SEQ ID NO: 100 e (ii) um anticorpo anti-PDl humano ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreendendo uma cadeia leve compreendendo a SEQ ID NO: 5 e uma cadeia pesada compreendendo a SEQ ID NO: 10.

[043] Em uma modalidade, a formulação é contida em um frasco de vidro. Em uma outra modalidade, a formulação é contida em um dispositivo de injeção. Em uma outra modalidade, a formulação é uma formulação líquida. Em um aspecto, a formulação é congelada até pelo menos abaixo de -70 °C. Em uma outra modalidade, a formulação é uma solução reconstituída a partir de uma formulação liofilizada.

[044] Em um aspecto, são fornecidos métodos de tratar infecção crônica ou câncer em um indivíduo mamífero (por exemplo, um humano) em necessidade dos mesmos compreendendo: administrar uma quantidade eficaz da formulação anti-CTLA4 ou da co-formulação apresentada na presente invenção.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[045] A FIGURA IA mostra a absorbância de UV A350 da formulação Al a 5^o, 25° e 40 °C durante 8 semanas. A FIGURA IB mostra a absorbância de UV A350 da formulação A2 a 5^o, 25° e 40 °C durante 8 semanas.

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[046] A FIGURA 2 mostra a absorbância de UV A350 das formulações Al e A2 para estudos de congelamento/descongelamento, agitação e estresse de luz.

[047] A FIGURA 3A e 3B mostram a % de HMW, como determinado por dados de UP-SEC, vs. Tempo em condições de armazenamento a 5^o, 25° e 40 °C para as Formulações Al e A2, respectivamente.

[048] A FIGURA 4A e 4B mostram a % de monômero, como determinado por dados de UP-SEC, vs. Tempo em condições de armazenamento a 5^o, 25° e 40 °C para as Formulações Al e A2, respectivamente.

[049] A FIGURA 5 mostra a % de HMW, como determinado por UP-SEC, para as Formulações Al e A2 para estudos de congelamento/descongelamento, agitação e estresse de luz.

[050] A FIGURA 6 mostra a % de monômero, como determinado por UPSEC, para as Formulações Al e A2 para estudos de congelamento/descongelamento, agitação e estresse de luz.

[051] A FIGURA 7A e 7B mostra a % ácida, como determinado por dados de HP-IEX, vs. Tempo em condições de armazenamento a 5^o, 25° e 40 °C para as Formulações Al e A2, respectivamente.

[052] A FIGURA 8A e 8B mostra a % básica, como determinado por dados de HP-IEX, vs. Tempo em condições de armazenamento a 5^o, 25° e 40 °C para as Formulações Al e A2, respectivamente.

[053] FIGURA 9A e 9B mostra a % Principal, como determinado por dados de HP-IEX, vs. Tempo em condições de armazenamento a 5^o, 25° e 40 °C para as Formulações Al e A2, respectivamente.

[054] A FIGURA 10 mostra a % ácida, como determinado por HP-IEX, para as Formulações Al e A2 para estudos de congelamento/descongelamento, agitação e estresse de luz.

[055] A FIGURA 11 mostra a % básica, como determinado por HP-IEX, para

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19/132 as Formulações Al e A2 para estudos de congelamento/descongelamento, agitação e estresse de luz.

[056] A FIGURA 12 mostra a % Principal, como determinado por ΗΡ-ΙΕΧ, para as Formulações Al e A2 para estudos de congelamento/descongelamento, agitação e estresse de luz.

[057] A FIGURA 13 mostra a porcentagem de oxidação de LC-M4 (oxidação de metionina) como determinado por mapeamento de peptídeo para as formulações Al e A2.

[058] A FIGURA 14 mostra a porcentagem de oxidação de HC-M34 (oxidação de metionina) como determinado por mapeamento de peptídeo para as formulações Al e A2.

[059] A FIGURA 15 mostra a porcentagem de oxidação de HC-M250 (oxidação de metionina) como determinado por mapeamento de peptídeo para as formulações Al e A2.

[060] A FIGURA 16 mostra a porcentagem de oxidação de HC-M426 (oxidação de metionina) como determinado por mapeamento de peptídeo para as formulações Al e A2.

[061] A FIGURA 17A mostra a absorbância de UV A350 da formulação Bl a 5°, 25° e 40 °C durante 8 semanas. A FIGURA 17B mostra a absorbância de UV A350 da formulação B2 a 5°, 25° e 40 °C durante 8 semanas.

[062] A FIGURA 18 mostra a absorbância de UV A350 das formulações Bl e B2 para estudos de congelamento/descongelamento, agitação e estresse de luz.

[063] A FIGURA 19A e 19B mostram a % de HMW, como determinado por dados de UP-SEC, vs. Tempo em condições de armazenamento a 5°, 25° e 40 °C para as Formulações Bl e B2, respectivamente.

[064] A FIGURA 20A e 20B mostram a % de monômero, como determinado por dados de UP-SEC, vs. Tempo em condições de armazenamento a 5^o, 25° e 40

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20/132 °C para as Formulações Bl e B2, respectivamente.

[065] A FIGURA 21 mostra a % de HMW, como determinado por UP-SEC, para as Formulações Bl e B2 para estudos de congelamento/descongelamento, agitação e estresse de luz.

[066] A FIGURA 22 mostra a % de monómero, como determinado por UPSEC, para as Formulações Bl e B2 para estudos de congelamento/descongelamento, agitação e estresse de luz.

[067] A FIGURA 23A e 23B mostram a % ácida, como determinado por dados de HP-IEX, vs. Tempo em condições de armazenamento a 5°, 25° e 40 °C para as Formulações Bl e B2, respectivamente.

[068] A FIGURA 24A e 24B mostram a % básica, como determinado por dados de HP-IEX, vs. Tempo em condições de armazenamento a 5°, 25° e 40 °C para as Formulações Bl e B2, respectivamente.

[069] A FIGURA 25A e 25B mostram a % principal, como determinado por dados de HP-IEX, vs. Tempo em condições de armazenamento a 5°, 25° e 40 °C para as Formulações Bl e B2, respectivamente.

[070] A FIGURA 26 mostra a % ácida, como determinado por HP-IEX, para as Formulações Bl e B2 para estudos de congelamento/descongelamento, agitação e estresse de luz.

[071] A FIGURA 27 mostra a % básica, como determinado por HP-IEX, para as Formulações Bl e B2 para estudos de congelamento/descongelamento, agitação e estresse de luz.

[072] A FIGURA 28 mostra a % principal, como determinado por HP-IEX, para as Formulações Bl e B2 para estudos de congelamento/descongelamento, agitação e estresse de luz.

[073] A FIGURA 29 mostra a porcentagem de oxidação de LC-M4 (oxidação de metionina) como determinado por mapeamento de peptídeo para as

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21/132 formulações Bl e B2.

[074] A FIGURA 30 mostra a porcentagem de oxidação de HC-M34 (oxidação de metionina) como determinado por mapeamento de peptídeo para as formulações Bl e B2.

[075] A FIGURA 31 mostra a porcentagem de oxidação de HC-M250 (oxidação de metionina) como determinado por mapeamento de peptídeo para as formulações Bl e B2.

[076] A FIGURA 32 mostra a porcentagem de oxidação de HC-M426 (oxidação de metionina) como determinado por mapeamento de peptídeo para as formulações Bl e B2.

[077] A FIGURA 33 mostra os dados de KD para as co-formulações, indicando que as formulações são estáveis em três valores de pH diferentes (5,0, 5,5 e 6,0).

[078] A FIGURA 34 mostra as sequências de aminoácidos das cadeias pesadas e leves para ipilimumabe (SEQ ID NOs: 84 e 85, respectivamente).

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[079] Em um aspecto, a invenção fornece formulações compreendendo anticorpos anti-CTLA4 e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos compreendendo metionina. Também são fornecidas co-formulações de um anticorpo anti-CTLA4 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo e um anticorpo anti-PD-1 humano ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreendendo metionina. Em cada caso, a formulação e a co-formulação opcionalmente compreendem um agente quelante.

I. Definições e Abreviações

[080] Como usado por todo o relatório descritivo e reivindicações anexas, as abreviações seguintes aplicam-se:

API ingrediente farmacêutico ativo

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CDR	região determinante de complementaridade nas regiões variáveis de imunoglobulina, definida usando o sistema de numeração de Kabat, a menos que de outro modo indicado
CHO	ovário de hamster chinês
Cl	intervalo de confiança
CTLA4	antígeno 4 associado a linfócito T citotóxico
DTPA	ácido dietilenotriaminapentaacético
EC50	concentração resultante em 50 % de eficácia ou ligação
ELISA	ensaio imunossorvente ligado à enzima
FFPE	fixado em formalina, embebido em parafina
FR	região de estrutura
HRP	peroxidase de raiz forte
HNSCC	carcinoma de células escamosas da cabeça e pescoço
IC50	concentração resultante em 50 % de inibição
IgG	imunoglobulina G
ICH	International Conference of Harmonization
IHC	imuno-histoquímica ou imuno-histoquímico
mAb	anticorpo monoclonal
MES	ácido 2-(N-morfolino)etanossulfônico
NCBI	National Center for Biotechnology Information
NSCLC	câncer pulmonar de células não pequenas
PCR	reação em cadeia de polimerase

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PD-1	morte programada 1 (também conhecida como morte celular programada-1 e receptor de morte programada 1)
PD-L1	ligante 1 de morte celular programada 1
PD-L2	ligante 2 de morte celular programada 1
PS80	polisorbato 80
TNBC	câncer de mama triplo negativo
V_H	região variável de cadeia pesada de imunoglobulina
VK	região variável de cadeia leve capa de imunoglobulina
V_L	região variável de cadeia leve de imunoglobulina
v/v	volume por volume
WFI	água para injeção
p/v	peso por volume

[081] De modo que a invenção possa ser mais facilmente entendida, certos termos técnicos e científicos são especificamente definidos abaixo. A menos que especificamente definido em outra parte neste documento, todos os outros termos técnicos e científicos usados na presente invenção têm o significado comumente entendido por um técnico no assunto ao qual a presente invenção pertence.

[082] Como usado por todo o relatório descritivo e nas reivindicações anexas, as formas no singular um, uma e o, a incluem a referência no plural a menos que o contexto claramente dite de outro modo.

[083] Referência a ou indica uma ou ambas as possibilidades a menos que o contexto claramente dite uma das possibilidades indicadas. Em alguns casos, e/ou foi utilizado para realçar uma ou ambas as possibilidades.

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[084] Tratar um câncer como usado na presente invenção significa administrar uma formulação da invenção a um indivíduo tendo uma condição imune ou condição cancerosa ou diagnosticado com um câncer ou infecção patogênica (por exemplo, viral, bacteriana, fúngica), para obter pelo menos um efeito terapêutico positivo, tal como, por exemplo, número reduzido de células cancerígenas, tamanho reduzido do tumor, taxa reduzida de infiltração de célula cancerígena em órgãos periféricos ou taxa reduzida de metástase tumoral ou crescimento tumoral. Tratamento pode incluir um ou mais do seguinte: induzir/aumentar uma resposta imune antitumoral, estimular uma resposta imune a um patógeno, toxina, e/ou auto-antígeno, estimular uma resposta imune a uma infecção viral, diminuir o número de um ou mais marcadores tumorais, inibir o crescimento ou sobrevivência de células tumorais, eliminar ou reduzir o tamanho de uma ou mais lesões ou tumores cancerosos, diminuir o nível de um ou mais marcadores tumorais, melhorar, reduzir a severidade ou duração do câncer, prolongar a sobrevivência de um paciente em relação à sobrevivência esperada em um paciente não tratado similar.

[085] Condição imune ou transtorno imune abrange, por exemplo, inflamação patológica, um transtorno inflamatório e um transtorno ou doença autoimune. Condição imune também refere-se a infecções, infecções persistentes e condições proliferativas, tais como câncer, tumores e angiogênese, incluindo infecções, tumores e canceres que resistem à erradicação pelo sistema imune. Condição cancerosa inclui, por exemplo, câncer, células cancerígenas, tumores, angiogênese e condições pré-cancerosas tais como displasia.

[086] Efeitos terapêuticos positivos no câncer podem ser medidos de vários modos (Ver, W. A. Weber, J. Nucl. Med. 50:15-105 (2009)). Por exemplo, a respeito da inibição do crescimento tumoral, de acordo com padrões NCI, um

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T/C 42 % é o nível mínimo de atividade antitumoral. Um T/C < 10 % é considerado um nível alto de atividade antitumoral, com T/C (%) = Volume de tumor médio do tratado/Volume de tumor médio do controle x 100. Em algumas modalidades, o tratamento obtido por administração de uma formulação da invenção é qualquer um de sobrevivência isenta de progressão (PFS), sobrevivência isenta de doença (DFS) ou sobrevivência global (OS). PFS, também referido como Tempo para Progressão Tumoral indica a duração de tempo durante e depois do tratamento que o câncer não cresce e inclui a quantidade de tempo que os pacientes experimentaram uma resposta completa ou uma resposta parcial, assim como a quantidade de tempo que os pacientes experimentaram doença estável. DFS refere-se à duração de tempo durante e depois do tratamento que o paciente permanece livre da doença. OS refere-se a um prolongamento na expectativa de vida quando comparado aos indivíduos ou pacientes ingênuos ou não tratados. Embora uma modalidade das formulações, métodos de tratamento e usos da presente invenção possam não ser eficazes em obter um efeito terapêutico positivo em cada paciente, isto deve ser feito em um número estatisticamente significativo de indivíduos como determinado por qualquer teste estatístico conhecido na técnica tal como o teste t de Student, o teste chi², o teste U de acordo com Mann e Whitney, o teste Kruskal-Wallis (teste H), teste Jonckheere-Terpstra e o teste Wilcoxon.

[087] O termo paciente (alternativamente referido como indivíduo na presente invenção) refere-se a um mamífero (por exemplo, rato, camundongo, cão, gato, coelho) capaz de ser tratado com as formulações da invenção, o mais preferivelmente um ser humano. Em algumas modalidades, o paciente é um paciente adulto. Em outras modalidades, o paciente é um paciente pediátrico.

[088] O termo anticorpo refere-se a qualquer forma de anticorpo que exibe a atividade biológica desejada. Assim, ele é usado no sentido mais amplo

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26/132 e especificamente abrange, mas não é limitado a, anticorpos monoclonais (incluindo anticorpos monoclonais inteiro), anticorpos policlonais, anticorpos humanizados, anticorpos completamente humanos e anticorpos quiméricos. Anticorpos parentais são anticorpos obtidos por exposição de um sistema imune a um antígeno antes da modificação dos anticorpos para um uso intencionado, tal como humanização de um anticorpo para o uso como um anticorpo terapêutico humano.

[089] Em geral, a unidade estrutural básica de anticorpo compreende um tetrâmero. Cada tetrâmero inclui dois pares idênticos de cadeias de polipeptídeo, cada par tendo uma cadeia leve (cerca de 25 kDa) e uma cadeia pesada (cerca de 50 a 70 kDa). A porção amino-terminal de cada cadeia inclui uma região variável de cerca de 100 a 110 ou mais aminoácidos principalmente responsáveis por reconhecimento de antígeno. As regiões variáveis de cada par de cadeia leve/pesada formam o sítio de ligação a anticorpo. Assim, em geral, um anticorpo intacto tem dois sítios de ligação. A porção carbóxi-terminal da cadeia pesada pode definir uma região constante principalmente responsável pela função efetora. Tipicamente, cadeias leves humanas são classificadas como cadeias leves kappa e lambda. Além disso, cadeias pesadas humanas são tipicamente classificadas como mi, delta, gama, alfa ou epsilon e definem o isótipo de anticorpo como IgM, IgD, IgG, IgA e IgE, respectivamente. Dentro das cadeias leves e pesadas, as regiões variáveis e constantes são unidas por uma região J de cerca de 12 ou mais aminoácidos, com a cadeia pesada também incluindo uma região D de cerca de 10 mais aminoácidos. Ver geralmente, Fundamental Immunology Ch. 7 (Paul, W., ed., 2^âed. Raven Press, N.Y. (1989).

[090] Tipicamente, os domínios variáveis tanto das cadeias pesadas quanto leves compreendem três regiões hipervariáveis, também chamadas regiões determinantes de complementaridade (CDRs), que são localizadas dentro de

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27/132 regiões de estrutura (FR) relativamente conservadas. As CDRs são usualmente alinhadas pelas regiões de estrutura, permitindo que se liguem a um epítopo específico. Em geral, do N-terminal ao C-terminal, ambos os domínios variáveis de cadeias leves e pesadas compreendem FR1, CDR1, FR2 , CDR2, FR3, CDR3 e FR4. A designação de aminoácidos a cada domínio está, geralmente, de acordo com as definições de Sequences of Proteins of Immunological Interest, Kabat, et al.; National Institutes of Health, Bethesda, Md.; 5^â ed.; NIH Publ. N- 91-3242 (1991); Kabat (1978) Adv. Prot. Chem. 32:1-75; Kabat, etal., (1977)7. Biol. Chem. 252:6609 - 6616; Chothia, et al., (1987) J Mol. Biol. 196:901 - 917 ou Chothia, et al., (1989) Nature 342:878 - 883.

[091] Um anticorpo que especificamente se liga a uma proteína alvo específica é um anticorpo que exibe ligação preferencial àquele alvo quando comparado a outras proteínas, mas esta especificidade não requer especificidade de ligação absoluta. Um anticorpo é considerado específico para seu alvo intencionado se sua ligação é determinante da presença da proteína alvo em uma amostra, por exemplo, sem produzir resultados indesejados tais como falso positivos. Anticorpos ou fragmentos de ligação dos mesmos, úteis na presente invenção se ligarão à proteína alvo com uma afinidade que é pelo menos duas vezes maior, preferivelmente pelo menos dez vezes maior, mais preferivelmente pelo menos 20 vezes maior e o mais preferivelmente pelo menos 100 vezes maior do que a afinidade com proteínas não-alvos. Como usado na presente invenção, um anticorpo é dito se ligar especificamente a um polipeptídeo compreendendo uma dada sequência de aminoácidos, por exemplo, a sequência de aminoácidos de uma molécula de CTLA4 humano ou PD-1 humano madura, se ela se liga a polipeptídeos compreendendo esta sequência mas não se liga a proteínas que carecem desta sequência.

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[092] Anticorpo quimérico refere-se a um anticorpo em que uma porção da cadeia pesada e/ou leve é idêntica ou homóloga a sequências correspondentes em um anticorpo derivado de uma espécie particular (por exemplo, ser humano) ou pertencente a uma classe ou subclasse de anticorpo particular, enquanto o restante da(s) cadeia(s) é idêntico ou homólogo a sequências correspondentes em um anticorpo derivado de uma outra espécie (por exemplo, camundongo) ou pertencente a uma outra classe ou subclasse de anticorpo, assim como fragmentos de tais anticorpos, contanto que eles exibam a atividade biológica desejada.

[093] Co-formulado ou co-formulação ou coformulação ou coformulado como usado na presente invenção refere-se a pelo menos dois anticorpos diferentes ou fragmentos de ligação ao antígeno do mesmos que são formulados juntos e armazenados como um produto combinado em um único frasco ou recipiente (por exemplo um dispositivo de injeção) ao invés de ser formulado e armazenado individualmente e depois misturado antes da administração ou separadamente administrado. Em uma modalidade, a coformulação contém dois anticorpos diferentes ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos.

[094] O termo quantidade farmaceuticamente eficaz ou quantidade eficaz significa uma quantidade por meio da qual composição ou formulação terapêutica suficiente é introduzida a um paciente para tratar uma doença ou condição. Um técnico no assunto reconhece que este nível pode variar de acordo com as características do paciente tais como idade, peso, etc.

[095] O termo cerca de, quando modificando a quantidade (por exemplo, mM ou M) de uma substância ou composição, a porcentagem (v/v ou p/v) de um componente da formulação, o pH de uma solução/formulação ou o valor de um parâmetro caracterizando uma etapa em um método ou semelhantes refere-se

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29/132 à variação na quantidade numérica que pode ocorrer, por exemplo, através de procedimentos de medição, manejo e amostragem típicos envolvidos na preparação, caracterização e/ou uso da substância ou composição; através de erro instrumental nestes procedimentos; através de diferenças na fabricação, fonte ou pureza dos ingredientes utilizados para fabricar ou usar as composições ou realizar os procedimentos; e semelhantes. Em certas modalidades, cerca de pode significar uma variação de ± 0,1 %, 0,5 %, 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 % ou 10 %.

[096] Como usado na presente invenção, x % (p/v) é equivalente a x g/100 mL (por exemplo, 5 % p/v equivale a 50 mg/mL).

[097] Formulações da presente invenção incluem anticorpos e fragmentos dos mesmos que são biologicamente ativos quando reconstituídos ou na forma líquida.

[098] Os termos câncer, canceroso ou maligno referem-se à ou descrevem a condição fisiológica em mamíferos que é tipicamente caracterizada por crescimento celular desregulado. Exemplos de câncer incluem, mas não são limitados a, carcinoma, linfoma, leucemia, blastoma e sarcoma. Exemplos mais particulares de tais canceres incluem carcinoma de células escamosas, mieloma, câncer pulmonar de células pequenas, câncer pulmonar de células não pequenas, glioma, linfoma de Hodgkin, linfoma não-Hodgkin, câncer gastrointestinal (trato), câncer renal, câncer de ovário, câncer de fígado, leucemia linfoblástica, leucemia linfocítica, câncer colorretal, câncer do endométrio, câncer do rim, câncer de próstata, câncer da tireoide, melanoma, condrossarcoma, neuroblastoma, câncer pancreático, glioblastoma multiforme, câncer cervical, câncer cerebral, câncer de estômago, câncer de bexiga, hepatoma, câncer de mama, carcinoma de cólon e câncer de cabeça e pescoço.

[099] Chothia significa um sistema de numeração de anticorpo descrito em Al-Lazikani et al., JMB 273:927 - 948 (1997).

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[0100] Kabat como usado na presente invenção significa um sistema de alinhamento e numeração de imunoglobulina desenvolvido por Elvin A. Kabat ((1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5^â Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md.).

[0101] Um agente inibidor de crescimento quando usado na presente invenção refere-se a um composto ou composição que inibe o crescimento de uma célula, especialmente célula cancerígena que superexpressa qualquer um dos genes identificados na presente invenção, in vitro ou in vivo. Assim, o agente inibidor de crescimento é um que reduz significativamente a porcentagem de células que superexpressam tais genes na fase S. Exemplos de agentes inibidores de crescimento incluem agentes que bloqueiam a progressão do ciclo celular (em um local exceto a fase S), tais como agentes que induzem o bloqueio em G1 e bloqueio na fase M. Bloqueadores clássicos da fase M incluem os taxanos da vinca (vincristina e vimblastina) e inibidores de topo II tais como doxorrubicina, epirrubicina, daunorrubicina e etoposido. Aqueles agentes que bloqueiam G1 também propagam em bloqueio da fase S, por exemplo, agentes alquilantes de DNA tais como dacarbazina, mecloretamina e cisplatina. Outra informação pode ser encontrada em The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn e Israel, eds., Capítulo 1, intitulada Cell cycle regulation, oncogens and antineoplastic drugs de Murakami et al. (WB Saunders: Philadelphia, 1995).

[0102] Os termos fragmento de ligação a CTLA4, fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, fragmento de ligação do mesmo ou fragmento do mesmo abrange um fragmento ou um derivado de um anticorpo que ainda substancialmente mantém sua atividade biológica de se ligar ao antígeno (CTLA4 humano) e inibir sua atividade (por exemplo, bloquear a ligação do CTLA4 humano aos seus ligantes nativos). Portanto, o termo fragmento de anticorpo ou fragmento de ligação a CTLA4 refere-se a uma porção de um anticorpo

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31/132 inteiro, geralmente a região de ligação ao antígeno ou variável do mesmo. Exemplos de fragmentos de anticorpo de CTLA4 incluem os fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 e Fv. Tipicamente, um fragmento de ligação ou derivado mantém pelo menos 10 % de sua atividade inibitória de CTLA4. Em algumas modalidades, um fragmento de ligação ou derivado mantém pelo menos 25 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 99 % ou 100 % (ou mais) de sua atividade inibitória de CTLA4, embora qualquer fragmento de ligação com afinidade suficiente para exercer o efeito biológico desejado seja útil. Em algumas modalidades, um fragmento de ligação ao antígeno se liga ao seu antígeno com uma afinidade que é pelo menos duas vezes maior, preferivelmente pelo menos dez vezes maior, mais preferivelmente pelo menos 20 vezes maior e o mais preferivelmente pelo menos 100 vezes maior do que a afinidade com antígenos não relacionados. Em uma modalidade, o anticorpo tem uma afinidade que é maior do que cerca de 10⁹ litros/mol, como determinado, por exemplo, por análise de Scatchard. Munsen et al. (1980) Analyt. Biochem. 107:220 - 239. Também é intencionado que um fragmento de ligação a CTLA4 possa incluir variantes tendo substituições de aminoácido conservativas que não alteram substancialmente sua atividade biológica.

[0103] Os termos fragmento de ligação a PD-1, fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, fragmento de ligação do mesmo ou fragmento do mesmo abrange um fragmento ou um derivado de um anticorpo que ainda substancialmente mantém sua atividade biológica de se ligar ao antígeno (PD-1 humano) e inibir sua atividade (por exemplo, bloquear a ligação de PD-1 a PDL1 e PDL2). Portanto, o termo fragmento de anticorpo ou fragmento de ligação a PD-1 refere-se a uma porção de um anticorpo inteiro, geralmente a região de ligação a antígeno ou variável deste. Exemplos de fragmentos de anticorpo incluem fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 e Fv. Tipicamente, um fragmento de

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32/132 ligação ou derivado mantém pelo menos 10 % de sua atividade inibitória de PD1. Em algumas modalidades, um fragmento de ligação ou derivado mantém pelo menos 25 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 99 % ou 100 % (ou mais) de sua atividade inibitória de PD-1, embora qualquer fragmento de ligação com afinidade suficiente para exercer o efeito biológico desejado seja útil. Em algumas modalidades, um fragmento de ligação ao antígeno se liga ao seu antígeno com uma afinidade que é pelo menos duas vezes maior, preferivelmente pelo menos dez vezes maior, mais preferivelmente pelo menos 20 vezes maior e o mais preferivelmente pelo menos 100 vezes maior do que a afinidade com antígenos não relacionados. Em uma modalidade o anticorpo tem uma afinidade que é maior do que cerca de 10⁹ litros/mol, como determinado, por exemplo, por análise de Scatchard. Munsen et al. (1980) Analyt. Biochem. 107:220 - 239. Também é intencionado que um fragmento de ligação a PD-1 possa incluir variantes tendo substituições de aminoácido conservativas que não alteram substancialmente sua atividade biológica.

[0104] Anticorpo humano refere-se a um anticorpo que compreende sequências proteicas de imunoglobulina humana apenas. Um anticorpo humano pode conter cadeias de carboidrato de murino se produzido em um camundongo, em uma célula de camundongo ou em um hibridoma derivado de uma célula de camundongo. Similarmente, anticorpo de camundongo ou anticorpo de rato refere-se a um anticorpo que compreende apenas sequências de imunoglobulina de camundongo ou rato, respectivamente.

[0105] Anticorpo humanizado refere-se a formas de anticorpos que contêm sequências de anticorpos não humanos (por exemplo, murino) assim como anticorpos humanos. Tais anticorpos contêm sequência mínima derivada de imunoglobulina não humana. Em geral, o anticorpo humanizado compreenderá substancialmente todos de pelo menos um e tipicamente dois,

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33/132 domínios variáveis, em que todos ou substancialmente todas as alças hipervariáveis correspondem àquelas de uma imunoglobulina não humana e todas ou substancialmente todas as regiões FR são aquelas de uma sequência de imunoglobulina humana. O anticorpo humanizado opcionalmente também compreenderá pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina (Fc), tipicamente aquela de uma imunoglobulina humana. As formas humanizadas de anticorpos de roedor geralmente compreenderão as mesmas sequências de CDR dos anticorpos de roedor parentais, embora certas substituições de aminoácido possam ser incluídas para aumentar a afinidade, aumentar a estabilidade do anticorpo humanizado ou por outras razões.

[0106] Os anticorpos da presente invenção também incluem anticorpos com regiões Fc modificadas (ou bloqueadas) para fornecer funções efetoras alteradas. Ver, por exemplo, Pat. dos EUA N- 5.624.821; W02003/086310; W02005/120571; W02006/0057702; Presta (2006) Adv. Drug Delivery Rev. 58:640 - 656. Tal modificação pode ser usada para realçar ou suprimir várias reações do sistema imune, com efeitos benéficos possíveis em diagnose e terapia. Alterações da região Fc incluem mudanças de aminoácido (substituições, supressões e inserções), glicosilação ou desglicolização e adicionam Fc múltiplas. Mudanças à Fc também podem alterar a meia-vida de anticorpos em anticorpos terapêuticos e uma meia-vida mais longa resultaria em dosagem menos frequente, com a conveniência aumentada e uso diminuído concomitantes de material. Ver Presta (2005) J. Allergy Clin. Immunol, 116:731 at 734-35.

[0107] Anticorpo completamente humano refere-se a um anticorpo que compreende sequências proteicas de imunoglobulina humana apenas. Um anticorpo completamente humano pode conter cadeias de carboidrato de murino se produzido em um camundongo, em uma célula de camundongo ou

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34/132 em um hibridoma derivado de uma célula de camundongo. Similarmente, anticorpo de camundongo refere-se a um anticorpo que compreende sequências de imunoglobulina de camundongo apenas. Um anticorpo completamente humano pode ser gerado em um ser humano, em um animal transgênico tendo sequências de linhagem germinativa de imunoglobulina humana, por exibição de fago ou outros métodos biológicos moleculares.

[0108] Região hipervariável refere-se aos resíduos de aminoácido de um anticorpo que são responsáveis pela ligação ao antígeno. A região hipervariável compreende resíduos de aminoácido de uma região determinante de complementaridade ou CDR (por exemplo, resíduos 24 a 34 (CDRL1), 50 a 56 (CDRL2) e 89 a 97 (CDRL3) no domínio variável de cadeia leve e resíduos 31 a 35 (CDRH1), 50 a 65 (CDRH2) e 95 a 102 (CDRH3) no domínio variável de cadeia pesada como medido pelo sistema de numeração de Kabat (Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5^â Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md.) e/ou aqueles resíduos de uma alça hipervariável (isto é, resíduos 26 a 32 (Ll), 50 a 52 (L2) e 91 a 96 (L3) no domínio variável de cadeia leve e 26 a 32 (Hl), 53 a 55 (H2) e 96 a 101 (H3) no domínio variável de cadeia pesada (Chothia e Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196: 901 - 917). Como usado na presente invenção, o termo resíduos de estrutura ou FR refere-se àqueles resíduos de domínio variável exceto os resíduos de região hipervariável definidos na presente invenção como resíduos de CDR. Resíduos de CDR e FR são determinados de acordo com a definição de sequência padrão de Kabat. Kabat et al. (1987) Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda Md.

[0109] Variantes conservativamente modificadas ou substituição conservative refere-se a substituições de aminoácidos são conhecidas dos técnicos no assunto e podem ser feitas geralmente sem alterar a atividade

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35/132 biológica da molécula resultante, mesmo em regiões essenciais do polipeptídeo. Tais substituições exemplares são preferivelmente feitas de acordo com aquelas apresentadas na tabela 1 como segue:

Tabela 1. Substituições de aminoácido conservatives exemplares

Resíduo original	Substituição conservative
Ala (A)	Gly; Ser
Arg (R)	Lys, His
Asn (N)	Gin; His
Asp (D)	Glu; Asn
Cys (C)	Ser; Ala
Gin (Q)	Asn
Glu (E)	Asp; Gin
Gly (G)	Ala
His (H)	Asn; Gin
e (1)	Leu; Vai
Leu (L)	He; Vai
Lys (K)	Arg; His
Met (M)	Leu; He; Tyr
Phe (F)	Tyr; Met; Leu
Pro (P)	Ala
Ser (S)	Thr
Thr (T)	Ser
Trp (W)	Tyr; Phe
Tyr (Y)	Trp; Phe
Vai (V)	He; Leu

[0110] Além disso, técnicos no assunto reconhecem que, em geral, substituições de aminoácido únicas em regiões não essenciais de um

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36/132 polipeptídeo não alteram substancialmente a atividade biológica. Ver, por exemplo, Watson et al. (1987) Molecular Biology of the Gene, The Benjamin/Cummings Pub. Co., p. 224 (4^â Edição).

[0111] A frase consiste essencialmente em ou variações tais como consistem essencialmente em ou consistindo essencialmente em, como usado por todo o relatório descritivo e reivindicações, indicam a inclusão de quaisquer elementos relatados ou grupo de elementos e a inclusão opcional de outros elementos, de natureza similar ou diferente do que os elementos relatados, que não mudam materialmente as propriedades básicas ou novas do regime de dosagem, método ou composição específicos. Como um exemplo não limitante, um composto de ligação que consiste essencialmente de uma sequência de aminoácidos relatada também pode incluir um ou mais aminoácidos, incluindo substituições de um ou mais resíduos de aminoácido, que não afetam materialmente as propriedades do composto de ligação.

[0112] Compreendendo ou variações tal como compreendem, compreende ou compreendido de são usados por todo o relatório descritivo e reivindicações em um sentido inclusivo, isto é, para especificar a presença das características estabelecidas mas não para excluir a presença ou adição de outras características que possam realçar materialmente a operação ou utilidade de qualquer uma das modalidades da invenção, a menos que o contexto requeira de outro modo devido à linguagem de expressão ou implicação necessária.

[0113] Anticorpo isolado e fragmento de anticorpo isolado refere-se ao estado de purificação e em tal contexto significa que a molécula mencionada é substancialmente livre de outras moléculas biológicas tais como ácidos nucleicos, proteínas, lipídeos, carboidratos ou outros materiais tais como resíduos celulares e meios de crescimento. Geralmente, o termo isolado não é intencionado a referir-se a uma ausência completa de tal material ou a uma

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37/132 ausência de água, tampões ou sais, a menos que eles estejam presentes em quantidades que substancialmente interferem com o uso experimental ou terapêutico do composto de ligação como descrito na presente invenção.

[0114] Anticorpo monoclonal ou mAb ou Mab, como usado na presente invenção, refere-se a uma população de anticorpos substancialmente homogêneos, isto é, as moléculas de anticorpo compreendendo a população são idênticas em sequência de aminoácidos exceto mutações possíveis que ocorrem naturalmente que podem estar presentes em quantidades menores. Ao contrário, preparações de anticorpo (policlonal) convencionais tipicamente incluem uma grande quantidade de diferentes anticorpos tendo diferentes sequências de aminoácidos em seus domínios variáveis, particularmente suas CDRs, que são frequentemente específicos para diferentes epítopos. O modificador monoclonal indica o caráter do anticorpo como sendo obtido de uma população substancialmente homogênea de anticorpos e não deve ser interpretado como requerendo a produção do anticorpo por qualquer método particular. Por exemplo, os anticorpos monoclonais a serem usados de acordo com a presente invenção podem ser fabricados pelo método do hibridoma primeiro descrito por Kohler et al. (1975) Nature 256: 495 ou pode ser fabricado por métodos de DNA recombinante (ver, por exemplo, Pat. dos EUA N4.816.567). Os anticorpos monoclonais também podem ser isolados de bibliotecas de fago de anticorpo usando as técnicas descritas em Clackson et al. (1991) Nature 352: 624 - 628 e Marks et al. (1991) J. Mol. Biol. 222: 581 - 597, por exemplo. Ver também Presta (2005) J. Allergy Clin. Immunol. 116:731.

[0115] Tumor conforme o mesmo aplica-se a um indivíduo diagnosticado com, ou suspeito de ter um câncer, refere-se a um neoplasma maligno ou potencialmente maligno ou massa tecidual de qualquer tamanho e inclui tumores primários e neoplasmas secundários. Um tumor sólido é um

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38/132 crescimento anormal ou massa de tecido que usualmente não contém cistos ou áreas líquidas. Diferentes tipos de tumores sólidos são denominados para o tipo de células que os formam. Exemplos de tumores sólidos são sarcomas, carcinomas e linfomas. Leucemias (canceres do sangue) geralmente não formam tumores sólidos (National Cancer Institute, Dictionary of Cancer Terms).

[0116] O termo tamanho do tumor refere-se ao tamanho total do tumor que pode ser medido como o comprimento e largura de um tumor. O tamanho do tumor pode ser determinado por uma variedade de métodos conhecidos na técnica, tais como, por exemplo, medindo-se as dimensões de tumor(es) após a remoção do indivíduo, por exemplo, usando paquímetros ou enquanto no corpo usando técnicas de imagem, por exemplo, cintilografia óssea, ultrassom, varreduras de CT ou MRI.

[0117] Regiões variáveis ou região V como usado na presente invenção significa o segmento de cadeias de IgG que é variável em sequência entre diferentes anticorpos. Ele estende até o resíduo de Kabat 109 na cadeia leve e 113 na cadeia pesada.

[0118] O termo tampão abrange aqueles agentes que mantêm o pH da solução das formulações da invenção em uma faixa aceitável, ou, para formulações liofilizadas da invenção, fornecem um pH de solução aceitável antes da liofilização.

[0119] Os termos liofilização, liofilizado e seco por congelamento referem-se a um processo pelo qual o material a ser seco é primeiro congelado e depois o solvente gelado ou congelado é removido por sublimação em um ambiente a vácuo. Um excipiente pode ser incluído em formulações préliofilizadas para realçar a estabilidade do liofilizado produto durante o armazenamento.

[0120] O termo formulação farmacêutica refere-se a preparações que

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39/132 estão em tal forma como para permitir que os ingredientes ativos sejam eficazes e que não contenham nenhum componente adicional que seja tóxico aos indivíduos aos quais a formulação seria administrada. O termo formulação e formulação farmacêutica são usados permutavelmente o tempo todo.

[0121] Farmaceuticamente aceitável refere-se a excipientes (veículos, aditivos) e composições que podem ser razoavelmente administradas a um indivíduo para fornecer uma dose eficaz do ingrediente ativo utilizado e que são geralmente considerados como seguros por exemplo, que são fisiologicamente toleráveis e não produzem tipicamente uma reação alérgica ou desagradável similar, tal como indisposição gástrica e semelhantes, quando administrados a um ser humano. Em uma outra modalidade, este termo referese a entidades e composições moleculares aprovadas por uma agência reguladora do governo federal ou um estado governamental ou listadas na Farmacopeia dos EUA ou uma outra farmacopeia geralmente reconhecida para o uso em animais e mais particularmente em seres humanos.

[0122] Uma formulação reconstituída é uma que foi preparada dissolvendo-se uma formulação de proteína liofilizada em um diluente tal que a proteína é dispersa na formulação reconstituída. A formulação reconstituída é adequada para administração, por exemplo, administração parenteral) e pode ser opcionalmente adequada para administração subcutânea.

[0123] Tempo de reconstituição é o tempo que é necessário para reidratar uma formulação liofilizada com uma solução a uma solução clarificada isenta de partícula.

[0124] Uma formulação estável é uma em que a proteína na mesma essencialmente mantém sua estabilidade física e/ou estabilidade química e/ou atividade biológica durante o armazenamento. Várias técnicas analíticas para medir a estabilidade proteica estão disponíveis na técnica e são revisadas em

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Peptide and Protein Drug Delivery, 247 - 301, Vincent Lee Ed., Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Pubs. (1991) e Jones, A. Adv. Drug Delivery Rev. 10:29 - 90 (1993). A estabilidade pode ser medida em uma temperatura selecionada por um período de tempo selecionado. Por exemplo, em uma modalidade, uma formulação estável é uma formulação sem nenhuma mudança significativa observada em uma temperatura refrigerada (2 a 8 °C) por pelo menos 12 meses. Em uma outra modalidade, uma formulação estável é uma formulação sem nenhuma mudança significativa observada em uma temperatura refrigerada (2 a 8 °C) por pelo menos 18 meses. Em uma outra modalidade, formulação estável é uma formulação sem nenhuma mudança significativa observada na temperatura ambiente (23 a 27 °C) por pelo menos 3 meses. Em uma outra modalidade, formulação estável é uma formulação sem nenhuma mudança significativa observada na temperatura ambiente (23 a 27 °C) por pelo menos 6 meses. Em uma outra modalidade, formulação estável é uma formulação sem nenhuma mudança significativa observada na temperatura ambiente (23 a 27 °C) por pelo menos 12 meses. Em uma outra modalidade, formulação estável é uma formulação sem nenhuma mudança significativa observada na temperatura ambiente (23 a 27 °C) por pelo menos 18 meses. Os critérios para estabilidade para uma formulação de anticorpo são como segue. Tipicamente, não mais do que 10 %, preferivelmente 5 %, de monômero de anticorpo é degradado como medido por SEC-HPLC. Tipicamente, a formulação é incolor ou clara a levemente opalescente por análise visual. Tipicamente, a concentração, pH e osmolalidade da formulação têm não mais do que +/Ί0 % de mudança. A potência é tipicamente dentro de 60 e 140 %, preferivelmente 80 e 120 % do controle ou referência. Tipicamente, não mais do que 10 %, preferivelmente 5 % de clipagem do anticorpo é observado, isto é, % de espécies de peso molecular baixo como determinado, por exemplo, por HP-SEC. Tipicamente, não mais do que 10 %,

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41/132 preferivelmente não mais do que 5 % de agregação do anticorpo é observada, isto é % de espécies de peso molecular alto como determinado, por exemplo, por HP-SEC.

[0125] Um anticorpo mantém sua estabilidade física em uma formulação farmacêutica se ela não mostra nenhum aumento significativo de agregação, precipitação e/ou desnaturação durante exame visual de cor e/ou clareza ou como medido por dispersão de luz UV, cromatografia de exclusão por tamanho (SEC) e dispersão de luz dinâmica. As mudanças da conformação proteica podem ser avaliadas por espectroscopia de fluorescência, que determina a estrutura terciária da proteína e por espectroscopia de FTIR, que determina a estrutura secundária da proteína.

[0126] Um anticorpo mantém sua estabilidade química em uma formulação farmacêutica, se ele não mostra nenhuma alteração química significativa. A estabilidade química pode ser avaliada detectando-se e quantificando-se formas quimicamente alteradas da proteína. Processos de degradação que frequentemente alteram a estrutura química da proteína incluem hidrólise ou clipagem (avaliada por métodos tais como cromatografia de exclusão por tamanho e SDS-PAGE), oxidação (avaliada por métodos tais como por mapeamento de peptídeo em combinação com espectroscopia de massa ou MALDI/TOF/MS), desamidação (avaliada por métodos tais como cromatografia de troca iônica, focalização isoelétrica capilar, mapeamento de peptídeo, medição de ácido isoaspártico) e isomerização (avaliada medindo-se o teor de ácido isoaspártico, mapeamento de peptídeo, etc.).

[0127] Um anticorpo mantém sua atividade biológica em uma formulação farmacêutica, se a atividade biológica do anticorpo em um dado tempo estiver dentro de uma faixa predeterminada da atividade biológica exibida no momento que a formulação farmacêutica foi preparada. A atividade

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42/132 biológica de um anticorpo pode ser determinada, por exemplo, por um ensaio de ligação ao antígeno.

[0128] O termo isotônica significa que a formulação de interesse tem essencialmente a mesma pressão osmótica que o sangue humano. Formulações isotônicas geralmente terão uma pressão osmótica de cerca de 270 a 328 mOsm. A pressão levemente hipotônica é 250 a 269 e a pressão levemente hipertônica é 328 a 350 mOsm. A pressão osmótica pode ser medida, por exemplo, usando um osmômetro do tipo pressão de vapor ou congelamento.

II. Formulações e Co-formulações da Invenção.

[0129] Em um aspecto, a invenção fornece formulações biológicas estáveis compreendendo anticorpos anti-CTLA4 ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos que especificamente se ligam ao CTLA4 humano como o ingrediente farmacêutico ativo. A inclusão de metionina em tais formulações reduz a oxidação de resíduos de metionina presentes na região Fc do anticorpo anti-CTLA4.

[0130] Em um aspecto, a invenção também fornece uma co-formulação de um anticorpo anti-CTLA4 com um anticorpo anti-PD-1. As principais vias de degradação de pembrolizumabe incluíram oxidação de metionina 105 (Metl05) na CDR3 de cadeia pesada (por exemplo, M105 da SEQ ID NO: 10) durante o estresse de peróxido e oxidação de Metl05 e resíduos Fc de metionina quando expostas à luz. Pembrolizumabe manteve sua bioatividade sob a maioria das condições de estresse para os níveis de degradação testados. Entretanto, a redução na afinidade para PD-1 foi observada para amostras estressadas de peróxido por Ressonância Plasmônica Superficial (SPR). Um resíduo de metionina exposto ou um resíduo de metionina na CDR de um anticorpo tem o potencial de impactar a atividade biológica do anticorpo através da oxidação. A adição de metionina é capaz de reduzir a oxidação de Metl05 dentro da CDR de

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43/132 cadeia pesada de pembrolizumabe.

Anticorpos anti-PD-1 e Fragmentos de Ligação ao antígeno dos mesmos

[0131] Em um aspecto, a invenção fornece formulações biológicas estáveis compreendendo anticorpos anti-CTLA4 ou fragmentos de ligação ao antígeno do mesmos, co-formulados com um anticorpo anti-PD-1 humano ou fragmentos de ligação ao antígeno do mesmos que especificamente se ligam a PD-1 humano (por exemplo, um anticorpo anti-PD-1 humano ou humanizado) como o ingrediente farmacêutico ativo (API de PD-1), assim como métodos para usar as formulações da invenção. Qualquer anticorpo anti-PD-1 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo pode ser usado nas co-formulações e métodos da invenção. Em modalidades particulares, o API de PD-1 é um anticorpo anti-PD-1, que é selecionado de pembrolizumabe e nivolumabe. Em modalidades específicas, o anticorpo anti-PD-1 é pembrolizumabe. Em modalidades alternativas, o anticorpo anti-PD-1 é nivolumabe. A Tabela 2 fornece sequências de aminoácidos para os anticorpos anti-PD-1 humano exemplares pembrolizumabe e nivolumabe. Anticorpos de PD-1 alternativos e fragmentos de ligação ao antígeno que são úteis nas co-formulações e métodos da invenção são mostrados na tabela 3.

[0132] Como usado na presente invenção, Pembrolizumabe (anteriormente conhecido como MK-3475, SCH 900475 e lambrolizumabe) alternativamente referido na presente invenção como pembro, é um mAb de lgG4 humanizado com a estrutura descrita em WHO Drug Information, Vol. 27, N- 2, páginas 161 -162 (2013) e que compreende as sequências de aminoácidos e CDRs de cadeia pesada e leve descritas na tabela 2. Pembrolizumabe foi aprovado pelo U.S. FDA para o tratamento de pacientes com melanoma inoperável ou metastático e para o tratamento de certos pacientes com câncer de células escamosas da cabeça e pescoço (HNSCC) recorrente ou metastático,

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44/132 linfoma de Hodgkin clássico (cHL), carcinoma urotelial, câncer gástrico, câncer de alta instabilidade de microssatélites (MSI-H) e câncer pulmonar de células não pequenas, como descrito na Informação de Prescrição para KEYTRUDA™ (Merck & Co., Inc., Whitehouse Station, NJ USA; aprovação dos EUA inicial em 2014, atualizado em setembro de 2017).

[0133] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-PD-1 humano ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo para o uso nas co-formulações da invenção compreende três CDRs de cadeia leve de CDRL1, CDRL2 e CDRL3 e/ou três CDRs de cadeia pesada de CDRH1, CDRH2 e CDRH3.

[0134] Em uma modalidade da invenção, CDRL1 é a SEQ ID NO: 1 ou uma variante da SEQ ID NO: 1, CDRL2 é a SEQ ID NO: 2 ou uma variante da SEQ ID NO: 2 e CDRL3 é a SEQ ID NO: 3 ou uma variante da SEQ ID NO: 3.

[0135] Em uma modalidade, CDRH1 é a SEQ ID NO: 6 ou uma variante da SEQ ID NO: 6, CDRH2 é a SEQ ID NO: 7 ou uma variante da SEQ ID NO: 7 e CDRH3 é a SEQ ID NO: 8 ou uma variante da SEQ ID NO: 8.

[0136] Em uma modalidade, as três CDRs de cadeia leve são SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 3 e as três CDRs de cadeia pesada são SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 8.

[0137] Em uma modalidade alternativa da invenção, CDRL1 é a SEQ ID NO: 11 ou uma variante da SEQ ID NO: 11, CDRL2 é a SEQ ID NO: 12 ou uma variante da SEQ ID NO: 12 e CDRL3 é a SEQ ID NO: 13 ou uma variante da SEQ ID NO: 13.

[0138] Em uma modalidade, CDRH1 é a SEQ ID NO: 16 ou uma variante da SEQ ID NO: 16, CDRH2 é a SEQ ID NO: 17 ou uma variante da SEQ ID NO: 17 e CDRH3 é a SEQ ID NO: 18 ou uma variante da SEQ ID NO: 18.

[0139] Em uma modalidade, as três CDRs de cadeia leve são SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 3 e as três CDRs de cadeia pesada são SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 8.

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[0140] Em uma modalidade alternativa, as três CDRs de cadeia leve são SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 e SEQ ID NO: 13 e as três CDRs de cadeia pesada são SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17 e SEQ ID NO: 18.

[0141] Em uma outra modalidade da invenção, CDRL1 é a SEQ ID NO: 21 ou uma variante da SEQ ID NO: 21, CDRL2 é a SEQ ID NO: 22 ou uma variante da SEQ ID NO: 22 e CDRL3 é a SEQ ID NO: 23 ou uma variante da SEQ ID NO: 23.

[0142] Ainda em uma outra modalidade, CDRH1 é a SEQ ID NO: 24 ou uma variante da SEQ ID NO: 24, CDRH2 é a SEQ ID NO: 25 ou uma variante da SEQ ID NO: 25 e CDRH3 é a SEQ ID NO: 26 ou uma variante da SEQ ID NO: 26.

[0143] Em uma outra modalidade, as três CDRs de cadeia leve são SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22 e SEQ ID NO: 23 e as três CDRs de cadeia pesada são SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25 e SEQ ID NO: 26.

[0144] Alguns anticorpos anti-PD-1 humano e fragmentos de ligação ao antígeno da invenção compreendem uma região variável de cadeia leve e uma região variável de cadeia pesada. Em algumas modalidades, a região variável de cadeia leve compreende a SEQ ID NO: 4 ou uma variante da SEQ ID NO: 4 e a região variável de cadeia pesada compreende a SEQ ID NO: 9 ou uma variante da SEQ ID NO: 9. Em outras modalidades, a região variável de cadeia leve compreende a SEQ ID NO: 14 ou uma variante da SEQ ID NO: 14 e a região variável de cadeia pesada compreende a SEQ ID NO: 19 ou uma variante da SEQ ID NO: 19. Em outras modalidades, a região variável de cadeia pesada compreende a SEQ ID NO: 27 ou uma variante da SEQ ID NO: 27 e a região variável de cadeia leve compreende a SEQ ID NO: 28 ou uma variante da SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29 ou uma variante da SEQ ID NO: 29 ou SEQ ID NO: 30 ou uma variante da SEQ ID NO: 30. Em tais modalidades, uma sequência de região variável de cadeia pesada ou de cadeia leve variante é idêntica à sequência de referência exceto tendo uma, duas, três, quatro ou cinco substituições de

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46/132 aminoácido. Em algumas modalidades, as substituições estão na região de estrutura (isto é, fora das CDRs). Em algumas modalidades, uma, duas, três, quatro ou cinco das substituições de aminoácido são substituições conservativas.

[0145] Em uma modalidade das co-formulações da invenção, o anticorpo anti-PD-1 humano ou fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia leve compreendendo ou consistindo na SEQ ID NO: 4 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo ou consistindo na SEQ ID NO: 9. Em uma outra modalidade, o anticorpo anti-PD-1 humano ou fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia leve compreendendo ou consistindo na SEQ ID NO: 14 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo ou consistindo na SEQ ID NO: 19. Em uma modalidade das formulações da invenção, o anticorpo anti-PD-1 humano ou fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia leve compreendendo ou consistindo na SEQ ID NO: 28 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo ou consistindo na SEQ ID NO: 27. Em uma outra modalidade, o anticorpo anti-PD-1 humano ou fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia leve compreendendo ou consistindo na SEQ ID NO: 29 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo ou consistindo na SEQ ID NO: 27. Em uma outra modalidade, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia leve compreendendo ou consistindo na SEQ ID NO: 30 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo ou consistindo na SEQ ID NO: 27.

[0146] Em uma outra modalidade, as co-formulações da invenção compreendem um anticorpo anti-PD-1 humano ou proteína de ligação a antígeno que tem um domínio Vie/ou um domínio Vh com pelo menos 95 %, 90 %, 85 %, 80 %, 75 % ou 50 % de homologia de sequência a um dos domínios Vl

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47/132 ou domínios Vh descritos acima e exibe ligação específica a PD-1. Em uma outra modalidade, o anticorpo anti-PD-1 humano ou proteína de ligação a antígeno das co-formulações da invenção compreende domínios Vl e Vh tendo até 1, 2, 3, 4 ou 5 ou mais substituições de aminoácido e exibe ligação específica a PD-1.

[0147] Em qualquer uma das modalidades acima, o API de PD-1 pode ser um anticorpo anti-PD-1 inteiro ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que especificamente se liga a PD-1 humano. Em certas modalidades, o API de PD-1 é um anticorpo anti-PD-1 inteiro selecionado de qualquer classe de imunoglobulinas, incluindo IgM, IgG, IgD, IgA e IgE. Preferivelmente, o anticorpo é um anticorpo de IgG. Qualquer isótipo de IgG pode ser usado, incluindo IgGi, IgGz, lgG₃ e IgGzi. Domínios constantes diferentes podem ser anexados às regiões Vl e Vh fornecidas na presente invenção. Por exemplo, se um uso intencionado particular de um anticorpo (ou fragmento) da presente invenção exigir funções efetoras alteradas, um domínio constante de cadeia pesada exceto IgGl pode ser usado. Embora anticorpos de IgGl levem em consideração a meia-vida longa e funções efetoras, tais como ativação do complemento e citotoxicidade celular dependente de anticorpo, tais atividades podem não ser desejáveis para todos os usos do anticorpo. Em tais exemplos, um domínio constante de lgG4, por exemplo, pode ser usado.

[0148] Em modalidades da invenção, o API de PD-1 é um anticorpo anti-PD1 compreendendo uma cadeia leve compreendendo ou consistindo em uma sequência de resíduos de aminoácido como apresentado na SEQ ID NO: 5 e uma cadeia pesada compreendendo ou consistindo em uma sequência de resíduos de aminoácido como apresentado na SEQ ID NO: 10. Em modalidades alternativas, o API de PD-1 é um anticorpo anti-PD-1 compreendendo uma cadeia leve compreendendo ou consistindo em uma sequência de resíduos de aminoácido como apresentado na SEQ ID NO: 15 e uma cadeia pesada

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48/132 compreendendo ou consistindo em uma sequência de resíduos de aminoácido como apresentado na SEQ ID NO: 20. Em outras modalidades, o API de PD-1 é um anticorpo anti-PD-1 compreendendo uma cadeia leve compreendendo ou consistindo em uma sequência de resíduos de aminoácido como apresentado na SEQ ID NO: 32 e uma cadeia pesada compreendendo ou consistindo em uma sequência de resíduos de aminoácido como apresentado na SEQ ID NO: 31. Em modalidades adicionais, o API de PD-1 é um anticorpo anti-PD-1 compreendendo uma cadeia leve compreendendo ou consistindo em uma sequência de resíduos de aminoácido como apresentado na SEQ ID NO: 33 e uma cadeia pesada compreendendo ou consistindo em uma sequência de resíduos de aminoácido como apresentado na SEQ ID NO: 31. Ainda em modalidades adicionais, o API de PD-1 é um anticorpo anti-PD-1 compreendendo uma cadeia leve compreendendo ou consistindo em uma sequência de resíduos de aminoácido como apresentado na SEQ ID NO: 34 e uma cadeia pesada compreendendo ou consistindo em uma sequência de resíduos de aminoácido como apresentado na SEQ ID NO: 31. Em algumas co-formulações da invenção, o API de PD-1 é pembrolizumabe ou um biossimilar de pembrolizumabe. Em algumas coformulações da invenção, o API de PD-1 é nivolumabe ou um biossimilar de nivolumabe.

[0149] Comumente, variantes de sequência de aminoácidos dos anticorpos anti-PD-1 e fragmentos de ligação ao antígeno da invenção ou dos anticorpos anti-CTLA4 e fragmentos de ligação ao antígeno da invenção terão uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 75 % de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos de um anticorpo de referência ou fragmento de ligação ao antígeno (por exemplo, cadeia pesada, cadeia leve, Vh, Vl ou sequência humanizada), mais preferivelmente pelo menos 80 %, mais preferivelmente pelo menos 85 %, mais preferivelmente pelo menos 90 % e o

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49/132 mais preferivelmente pelo menos 95, 98 ou 99 %. Identidade ou homologia a respeito de uma sequência é definida na presente invenção como a porcentagem de resíduos de aminoácido na sequência candidata que são idênticos aos resíduos anti-PD-1, depois de alinhar as sequências e introduzir intervalos, se necessário, para obter a porcentagem máxima de identidade de sequência e sem considerar quaisquer substituições conservativas como parte da identidade de sequência. Nenhuma das extensões, supressões ou inserções N-terminais, C-terminais ou internas na sequência de anticorpo deve ser interpretada como afetando a identidade de sequência ou homologia.

[0150] Identidade de sequência refere-se ao grau ao qual os aminoácidos de dois polipeptídeos são os mesmos em posições equivalentes quando as duas sequências são idealmente alinhadas. A identidade de sequência pode ser determinada usando um algoritmo BLAST em que os parâmetros do algoritmo são selecionados para fornecer a maior combinação entre as respectivas sequências sobre o comprimento inteiro das respectivas sequências de referência. As referências seguintes referem-se aos algoritmos BLAST frequentemente usados para análise de sequência: BLAST ALGORITHMS: Altschul, S.F., et al., (1990) J. Mol. Biol. 215:403 - 410; Gish, W., et al., (1993) Nature Genet. 3:266 - 272; Madden, T.L., et al., (1996) Meth. Enzymol. 266:131 -141; Altschul, S.F., et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389 - 3402; Zhang, J., et al., (1997) Genome Res. 7:649 - 656; Wootton, J.C., et al., (1993) Comput. Chem. 17:149 - 163; Hancock, J.M. et al., (1994) Comput. Appl. Biosci. 10:67 - 70; ALIGNMENT SCORING SYSTEMS: Dayhoff, M.O., et al., A model of evolutionary change in proteins. em Atlas of Protein Sequence and Structure, (1978) vol. 5, suppl. 3. M.O. Dayhoff (ed.), páginas 345 - 352, Natl. Biomed. Res. Found., Washington, DC; Schwartz, R.M., et al., Matrices for detecting distant relationships. em Atlas of Protein Sequence and Structure, (1978) vol. 5, suppl.

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3. Μ.O. Dayhoff (ed.), páginas 353 - 358, Natl. Biomed. Res. Found., Washington, DC; Altschul, S.F., (1991) J. Mol. Biol. 219:555 - 565; States, D.J., et al., (1991) Methods 3:66 - 70; Henikoff, S., etal., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 - 10919; Altschul, S.F., et al., (1993) J. Mol. Evol. 36:290 - 300; ALIGNMENT STATISTICS: Karlin, S., et al., (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264 - 2268; Karlin, S., et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873 - 5877; Dembo, A., et al., (1994) Ann. Prob. 22:2022 - 2039; e Altschul, S.F. Evaluating the statistical significance of multiple distinct local alignments. em Theoretical and Computational Methods in Genome Research (S. Suhai, ed.), (1997) páginas 1 -14, Plenum, New York.

[0151] Do mesmo modo, qualquer classe de cadeia leve pode ser usada nas composições e métodos da presente invenção. Especificamente, kappa, lambda ou variantes das mesmas são úteis nas presentes composições e métodos.

Tabela 2. Sequências de Anticorpo de PD-1 Exemplares

Caracterís- tica do anticorpo	Sequência de aminoácidos	SEQ ID NO.
Cadeia leve de Pembrolizumabe
CDR1	RASKGVSTSGYSYLH	1
CDR2	LASYLES	2
CDR3	QHSRDLPLT	3
Região variável	EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASKGVSTSGYSYLHWYQQKP GQAPRLLIYLASYLESGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAV YYCQHSRDLPLTFGGGTKVEIK	4
Cadeia leve	EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASKGVSTSGYSYLHWYQQKP GQAPRLLIYLASYLESGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAV YYCQHSRDLPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGT	5

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	ASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSK DSTYSLSSTLTLSKADYEKH KVYACEVTHQG LSSPVTKSFN RG E C
Cadeia pesada de Pembrolizumabe
CDR1	NYYMY	6
CDR2	GINPSNGGTNFNEKFKN	7
CDR3	RDYRFDMGFDY	8
Região variável	QVQLVQSGVEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYMYWVRQA PGQGLEWMGGINPSNGGTNFNEKFKNRVTLTTDSSTTTAY M E LKS LQF D DTAVYYCA RRDYRFDMGF D YWG QGTTVTVSS	9
Cadeia pesada	QVQLVQSGVEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYMYWVRQA PGQGLEWMGGINPSNGGTNFNEKFKNRVTLTTDSSTTTAY Μ E LKS LQF D DTAVYYCA RRDYRFDMGF D YWG QGTTVTVSS ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNS GALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDH KPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDT LMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTK PREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSI EKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPS DIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRW QEG N VFSCSVM H EALH N H YTQKSLSLSLG K	10
Cadeia leve de Nivolumabe
CDR1	RASQSVSSYLA	11
CDR2	DAS NR AT	12
CDR3	QQSSNWPRT	13
Região variável	EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQA PRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYC	14

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	QQSSNWPRTFGQGTKVEIK
Cadeia leve	EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQ APRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYY CQQSSNWPRTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGT ASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSK DSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRG EC	15
Cadeia pesada de Nivolumabe
CDR1	NSGMH	16
CDR2	VIWYDGSKRYYADSVKG	17
CDR3	NDDY	18
Região variável	QVQLVESGGG VVQPG RSLRLDCKASGITFSNSG Μ H WVRQA PGKGLEWVAVIWYDGSKRYYADSVKGRFTISRDNSKNTLFLQ Μ N S LR AE DTAVYYCATN D DYWG QGTLVTVSS	19
Cadeia pesada	QVQLVESGGGVVQPGRSLRLDCKASGITFSNSGMHWVRQA PGKGLEWVAVIWYDGSKRYYADSVKGRFTISRDNSKNTLFL QM NSLRAE DTAVYYCATN D DYWGQGTLVTVSSASTKG PSV FPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGV HTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTK VDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRT PEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQF NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKA KGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE WESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEG N VFSCSVM H EALH N H YTQKSLSLSLG K	20

Tabela 3. Anticorpos de PD-1 Adicionais e Fragmentos de ligação ao antígeno Úteis nas Co-formulações, Métodos e Usos da Invenção.

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A. Anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno compreendendo CDRs de cadeia leve e pesada de hPD-1.08A no WO2008/156712
CDRL1	SEQ ID NO: 21
CDRL2	SEQ ID NO: 22
CDRL3	SEQ ID NO: 23
CDRH1	SEQ ID NO: 24
CDRH2	SEQ ID NO: 25
CDRH3	SEQ ID NO: 26
C. Anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno compreendendo a região variável de cadeia pesada de hlO9A maduro e uma das regiões variáveis de cadeia leve de K09A maduro no WO 2008/156712
VR de cadeia pesada	SEQ ID NO: 27
VR de cadeia leve	SEQ ID NO: 28 ou SEQ ID NO: 29 ou SEQ ID NO: 30
D. Anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno compreendendo a cadeia pesada de 409 maduro e uma das cadeias leves de K09A maduro no WO 2008/156712
Cadeia pesada	SEQ ID NO: 31
Cadeia leve	SEQ ID NO: 32 ou SEQ ID NO: 33 ou SEQ ID NO: 34

[0152] Em algumas modalidades da co-formulação da invenção, o API de PD-1 (isto é o anticorpo anti-PD-1 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo) está presente em uma concentração de cerca de 25 mg/mL a cerca de 100 mg/mL. Em modalidades alternativas, o API está presente em uma concentração de cerca de 10 mg/mL, cerca de 25 mg/mL, cerca de 50 mg/mL, cerca de 75 mg/mL ou cerca de 100 mg/mL.

Anticorpos anti-CTLA4 e Fragmento de Ligação ao antígeno dos mesmos

[0153] A invenção fornece formulações biológicas estáveis compreendendo anticorpos anti-CTLA4 ou fragmentos de ligação ao antígeno

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54/132 dos mesmos que especificamente se ligam ao CTLA4 humano (por exemplo, um anticorpo anti-CTLA4 humano ou humanizado) como o ingrediente farmacêutico ativo (API de CTLA4), assim como métodos para usar as formulações da invenção.

[0154] A invenção também fornece co-formulações biológicas estáveis compreendendo (i) anticorpo anti-CTLA4 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que especificamente se liga ao CTLA4 humano (por exemplo, um anticorpo anti-CTLA4 humano ou humanizado) e (ii) um anticorpo anti-PD-1 humano ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que especificamente se liga a PD-1 humano. Qualquer anticorpo anti-CTLA4 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo pode ser usado na formulação, incluindo a co-formulação e métodos da invenção. As Tabelas 4 a 8 e Figura 34 fornecem sequências de aminoácidos para anticorpos anti-CTLA4 exemplares e fragmentos de ligação ao antígeno que são úteis nas formulações, incluindo co-formulações e métodos da invenção.

[0155] Em uma modalidade das formulações, incluindo a co-formulação, o anticorpo anti-CTLA-4 é o anticorpo monoclonal humano 10D1, agora conhecido como ipilimumabe e comercializado como Yervoy™, que é divulgado na Patente US N- 6,984,720 e WHO Drug Information 19(4): 61 (2005). Em uma outra modalidade, o anticorpo anti-CTLA-4 é tremelimumabe, também conhecido como CP-675.206) que é um anticorpo monoclonal de lgG2 que é descrito na Publicação do Pedido de Patente US N² 2012/263677 ou Publicações do Pedido Internacional PCT N— WO 2012/122444 ou 2007/113648 A2.

[0156] Em uma da formulação, incluindo a co-formulação, anticorpo antiCTLA-4 é um anticorpo monoclonal que compreende uma cadeia pesada tendo a sequência de aminoácidos revelada na SEQ ID NO: 84 e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos revelada na SEQ ID NO: 85. Em algumas modalidades, o anticorpo de CTLA4 é um fragmento de ligação ao

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55/132 antígeno da SEQ ID NO: 84 e/ou SEQ ID NO: 85, em que o fragmento de ligação ao antígeno especificamente se liga a CTLA4.

[0157] Em uma modalidade das formulações, incluindo a co-formulação, da invenção o anticorpo anti-CTLA-4 é qualquer um dos anticorpos anti-CTLA-4 ou fragmentos de ligação ao antígeno do mesmos, divulgados na Publicação do Pedido Internacional N² WO 2016/015675 Al. Em uma modalidade, o anticorpo anti-CTLA4 é um anticorpo monoclonal que compreende as seguintes CDR's:

HCDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos GFTFSDNW (SEQ ID NO: 35)

HCDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos IRNKPYNYET (SEQ ID NO: 36)

HCDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos TAQFAY (SEQ ID NO:

37) e/ou

LCDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos ENIYGG (SEQ ID NO:

38)

LCDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos GAT (SEQ ID NO: 39)

LCDR3 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada de: QNVLRSPFT (SEQ ID NO: 40); QNVLSRHPG (SEQ ID NO: 41); OU QNVLSSRPG (SEQ ID NO: 42)

[0158] Em uma modalidade das formulações, incluindo a co-formulação, da invenção, o anticorpo anti-CTLA4 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma cadeia pesada variável e uma cadeia leve variável. Em uma modalidade, a cadeia pesada variável e leve variável compreende as sequências VH e VL de 8D2/8D2 (RE) ou uma variante do mesmo. Em uma outra modalidade, a cadeia pesada variável e leve variável compreende as sequências VH e VL de 8D2H1L1 ou uma variante do mesmo. Em uma outra modalidade, a

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56/132 cadeia pesada variável e a cadeia leve variável compreendem as sequências VH e VL de 8D2H2L2 ou uma variante do mesmo. Em uma outra modalidade, a cadeia pesada variável e a cadeia leve variável compreendem as sequências VH e VL de 8D3H3L3 ou uma variante do mesmo. Em uma outra modalidade, a cadeia pesada variável e a cadeia leve variável compreendem as sequências VH e VL de 8D2H2I17 ou uma variante do mesmo. Em uma modalidade, a metionina na posição 18 da variante de qualquer um de 8D2/8D2 (RE), 8D2H1L1, 8D2H2L2, 8D2H2L15 ou 8D2H2L17 é independentemente substituída com um aminoácido selecionado de: leucina, valina, isoleucina e alanina. Em uma outra modalidade da variante, a metionina na posição 18 da variante de qualquer um de 8D2/8D2 (RE), 8D2H1L1, 8D2H2L2, 8D2H2L15 ou 8D2H2L17 é substituída com leucina.

[0159] Em uma modalidade da formulação, incluindo a co-formulação, o anticorpo anti-CTLA4 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é 8D2H2L2 ou uma variante deste, em que a metionina na posição 18 na sequência de aminoácidos de cadeia pesada variável (VH) da variante de 8D2H2L2 é independentemente substituída com um aminoácido selecionado de: leucina, valina, isoleucina e alanina.

TABELA 4: Sequências exemplares de anticorpos anti-CTLA4

Anticorpo	V_H	V_L
8D2/8D2 (RE)	EVKLDETGGGLVQPGRPMKLSC VASGFTFSDNWMNWVRQSPE KG LE WLAQI RN KPYN YETYYSDS VKGRFTISRDDSKSSVYLQMNNL RG E DM G1YYCTAQFAYWG QGT LVTVSA (SEQ ID NO: 43)	DIQMTQSPASLSASVGETVTITCGT SENIYGGLNWYQRKQGKSPQLLIF GATNLADGMSSRFSGSGSGRQYS LKISSLHPDDVATYYCQNVLRSPFT FGSGTKLEI (SEQ ID NO: 44)
8D2/8D2 RE	EVKLDETGGGLVQPGRPIKLSCV ASGFTFSDNWMNWVRQSPEK	DIQMTQSPASLSASVGETVTITCGT SENIYGGLNWYQRKQGKSPQLLIF

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VARIANTE 1	GLEWLAQIRNKPYNYETYYSDSV KGRFTISRDDSKSSVYLQMNNLR GEDMGIYYCTAQFAYWGQGTL VTVSA (SEQ ID NO: 86)	GATNLADGMSSRFSGSGSGRQYS LKISSLHPDDVATYYCQNVLRSPFT FGSGTKLEI (SEQ ID NO: 44)
8D2H1L1	EVQLVESGGGLVQPGGSMRLSC AASGFTFSDNWMNWVRQAPG KG LE WLAQI RN KPYN YETYYSDS VKGRFTISRDDSKNSVYLQMNSL KTE DTG VYYCTAQFAYWG QGTL VTVSS (SEQ ID NO: 45)	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRT SENIYGGLNWYQRKQGKSPKLLIY GATNLASGMSSRFSGSGSGTDYTL KISSLHPDDVATYYCQNVLRSPFTF GSGTKLEIK (SEQ ID NO: 46)
8D2H1L1 VARIANTE 1	EVQLVESGGGLVQPGGSIRLSCA ASGFTFSDNWMNWVRQAPGK GLEWLAQIRNKPYNYETYYSDSV KGRFTISRDDSKNSVYLQMNSLK TE DTG VYYCTAQFAYWG QGTLV TVSS (SEQ ID NO: 87)	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRT SENIYGGLNWYQRKQGKSPKLLIY GATNLASGMSSRFSGSGSGTDYTL KISSLHPDDVATYYCQNVLRSPFTF GSGTKLEIK (SEQ ID NO: 46)
8D2H2L2	EVQLVESGGGLVQPGGSMRLSC AASGFTFSDNWMNWVRQAPG KG LE WLAQI RN KPYN YETYYSAS VKGRFTISRDDSKNSVYLQMNSL KTE DTG VYYCTAQFAYWG QGTL VTVSS (SEQ ID NO: 47)	D1QMTQS PSS LSASVG D R VTITC RT SENIYGGLNWYQRKPGKSPKLLIYG ATNLASGVSSRFSGSGSGTDYTLTI SSLQPEDVATYYCQNVLRSPFTFGS GTKLEIK (SEQ ID NO: 48)
8D2H2L2 VARIANTE 1	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSC AASGFTFSDNWMNWVRQAPG KG LE WLAQI RN KPYN YETYYSAS VKGRFTISRDDSKNSVYLQMNSL KTE DTG VYYCTAQFAYWG QGTL	D1 QMTQS PSS LSASVG D R VTITC RT SENIYGGLNWYQRKPGKSPKLLIYG ATNLASGVSSRFSGSGSGTDYTLTI SSLQPEDVATYYCQNVLRSPFTFGS GTKLEIK (SEQ ID NO: 48)

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	VTVSS (SEQ ID NO: 88)
8D3H3L3	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSC AASGFTFSDNWMNWVRQAPG KG LE WVAQI RN KPYNYETEYAA SVKGRFTISRDDSKNSAYLQMNS LKTE DTAVYYCTAQF AYWG QGT LVTVSS (SEQ ID NO: 49)	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCR ASENIYGGLNWYQQKPGKAPKLLI YGATSLASGVPSRFSGSGSGTDYTL TISSLQPEDFATYYCQNVLRSPFTF GSGTKLEIK (SEQ ID NO: 50)
8D2H2L15	EVQLVESGGGLVQPGGSMRLSC AASGFTFSDNWMNWVRQAPG KG LE WLAQI RN KPYN YETYYSAS VKGRFTISRDDSKNSVYLQMNSL KTE DTG VYYCTAQFAYWG QGTL VTVSS (SEQ ID NO: 51)	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRT SENIYGGLNWYQRKPGKSPKLLIYG ATNLASGVSSRFSGSGSGTDYTLTI SSLQPEDVATYYCQNVLSRHPGFG SGTKLEIK (SEQ ID NO: 52)
8D2H2L15 VARIANTE 1	EVQLVESGGGLVQPGGSIRLSCA ASGFTFSDNWMNWVRQAPGK G LE WLAQI RN KPYN YETYYSASV KGRFTISRDDSKNSVYLQMNSLK TE DTG VYYCTAQFAYWG QGTLV TVSS (SEQ ID NO: 89)	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRT SENIYGGLNWYQRKPGKSPKLLIYG ATNLASGVSSRFSGSGSGTDYTLTI SSLQPEDVATYYCQNVLSRHPGFG SGTKLEIK (SEQ ID NO: 52)
8D2H2L17	EVQLVESGGGLVQPGGSMRLSC AASGFTFSDNWMNWVRQAPG KG LE WLAQI RN KPYN YETYYSAS VKGRFTISRDDSKNSVYLQMNSL KTE DTG VYYCTAQFAYWG QGTL VTVSS (SEQ ID NO: 53)	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRT SENIYGGLNWYQRKPGKSPKLLIYG ATNLASGVSSRFSGSGSGTDYTLTI SSLQPEDVATYYCQNVLSSRPGFG SGTKLEIK (SEQ ID NO: 54)
8D2H2L17 VARIANTE	EVQLVESGGGLVQPGGSIRLSCA ASGFTFSDNWMNWVRQAPGK	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRT SENIYGGLNWYQRKPGKSPKLLIYG

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1	G LE WLAQI RN KPYN YETYYSASV KGRFTISRDDSKNSVYLQMNSLK TEDTGVYYCTAQFAYWGQGTLV TVSS (SEQ ID NO: 90)	ATNLASGVSSRFSGSGSGTDYTLTI SSLQPEDVATYYCQNVLSSRPGFG SGTKLEIK (SEQ ID NO: 54)
Anticorpo	Cadeia pesada completa	Cadeia leve completa
8D2H2L2 VARIANTE 1	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSC AASGFTFSDNWMNWVRQAPG KG LE WLAQI RN KPYN YETYYSAS VKGRFTISRDDSKNSVYLQMNSL KTE DTG VYYCTAQFAYWG QGTL VTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTS GGTAALGCLVKDYFPEPVTVSW NSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYS LSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNH KPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCP PCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTL MISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVK FNWYVDGVEVHNAKTKPREEQ YNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGK EYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKG QPREPQVYTLPPSRDELTKNQVS LTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQP ENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLT VDKSRWQQG N VFSCSVM H EAL HNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 99)	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRT SENIYGGLNWYQRKPGKSPKLLIYG ATNLASGVSSRFSGSGSGTDYTLTI SSLQPEDVATYYCQNVLRSPFTFGS GTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLK SGTASVVCLLNNFYPREAKVQWK VDNALQSGNSQESVTEQDSKDST YSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVT HQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 100)

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[0160] Em uma outra modalidade das formulações, incluindo a coformulação da invenção, o único anticorpo anti-CTLA4 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende as sequências de cadeia VH e VL de variante 1 de 8D2/8D2 (RE). Em uma outra modalidade, o anticorpo anti-CTLA4 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende as sequências de cadeia VH e VLde variante 1 de 8D2H1L1. Em uma outra modalidade, o anticorpo anti-CTLA4 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende as sequências de cadeia VH e VL de variante 1 de 8D2H2L2. Em uma outra modalidade, o anticorpo anti-CTLA4 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende as sequências de cadeia VH e VL de variante de 8D2H2L15. Em uma outra modalidade, o anticorpo anti-CTLA4 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende as sequências de cadeia VH e VL ou uma variante de 8D2H2I17.

[0161] Em uma modalidade das formulações, incluindo a co-formulação, da invenção o anticorpo anti-CTLA4 é qualquer um dos anticorpos anti-CTLA4 ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, descritos no Pedido Internacional PCT N² PCT/CN2016/096357, depositado em 23 de agosto de 2016. Em uma modalidade, o anticorpo anti-CTLA4 é anticorpo de camundongo 4G10, compreendendo as seguintes sequências de amino de cadeia VH e cadeia VL e versões humanizadas deste anticorpo.

TABELA 5: Anticorpo anti-CTLA4 de murino

Anticorpo	V_H	V_L
4G 10 murino	QVKLQESGPELVKPGASMKISCK ASGYSFTG YTM N WVKQSHG KN LEWIGLINPYNNITNYNQKFMG KATFTVDKSSSTAYMELLRLTSED SGVYFCARLDYRSYWGQGTLVT	QAVVTQESALTTSPG ETVTLTCRS STGAVTTSNFANWVQEKPDHLFT SLIGGTNNRAPGVPARFSGSLIGD KAALTITGAQTEDEAIYFCALWYS NHWVFGGGTKLTVLGQPKSSPSV

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VSA (SEQ ID NO: 55)

TLFQGQFC (SEQ ID NO: 56)

[0162] Em uma modalidade das formulações, incluindo a co-formulação, da invenção, o anticorpo anti-CTLA4 é um anticorpo monoclonal que compreende as seguintes CDR's:

HCDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos selecionada de GYSFTGYT (SEQ. ID NO: 57) ou GYTXiN (SEQ ID NO: 58), em que Xi é M,V,L,I,G,A,S,T.

HCDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos selecionada de INPYNX1IX2, (SEQ ID NO: 59) em que Xi é N, D ou E e X₂ é T, D, E, G ou A; ou LINPYNX1IX2NYX3QKFX4G (SEQ ID NO: 60), em que Xi é N, D; X₂ é T, D, E, G ou A; X3 é A ou N; e X4 é Q ou M.

HCDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos selecionada de LDYRSY (SEQ ID NO: 61) ou ARLDYRSY (SEQ ID NO: 62) e/ou

LCDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos selecionada de TGAVTTSNF (SEQ ID NO: 63) ou GSSTGAVTTSNFXiN (SEQ ID NO: 64), em que Xi é P ou A;

LCDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos selecionada de GTN ou GTNNX1AX2 (SEQ ID NO: 65), em que Xi é K, R ou qualquer aminoácido exceto M ou C; e X2 é S ou P;

LCDR3 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada de ALX1YSNHX2 (SEQ ID NO: 66), em que Xi é W ou qualquer aminoácido exceto M ou C e X₂é W ou qualquer aminoácido exceto M ou C; ou ALX1YSNHX2V (SEQ ID NO: 67) em que Xi é W ou qualquer aminoácido exceto M ou C e X2 é W ou qualquer aminoácido exceto M ou C.

[0163] Em uma outra modalidade, as sequências VH humanizadas do anticorpo 4G10 compreende qualquer uma das sequências VH seguintes:

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TABELA 6: Sequências do anticorpo anti-CTLA4 exemplares

Anticorpo	V_H
4G10H1	QVQLVESGAELVKPGASMKISCKASGYSFTGYTMNWVKQAPGQGLE
Humani-	WIGLINPYNNITNYNQKFMGKATFTVDKSISTAYMELSRLTSDDSGVYF
zado	CARLDYRSYWGQGTLVTVSA (SEQ ID NO: 68)
4G10H3	QVQLVESGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYTMNWVRQAPGQGLE
Humani-	WIG LI N PYN NITN YAQKFQG RVTFTVDTSISTAYM ELSRLRSDDTG VYF
zado	CARLDYRSYWGQGTLVTVSA (SEQ ID NO: 69)
4G10H4	QVQLVESGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYTMNWVRQAPGQGLE
Humani-	WIGLINPYNDITNYAQKFQGRVTFTVDTSISTAYMELSRLRSDDTGVYF
zado	CARLDYRSYWGQGTLVTVSA (SEQ ID NO: 70)
4G10H5	QVQLVESGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYTMNWVRQAPGQGLE
Humani-	WIG LI N PYN N1DN YAQKFQG RVTFTVDTSISTAYM E LSRLRSDDTG VYF
zado	CARLDYRSYWGQGTLVTVSA (SEQ ID NO: 71)
4G10H	QVQLVESGAEX1KKPGASX2KX3SCKASGYSFTGYTX4NWVX5QAPGQG
consenso	LEWIGLINPYNX6IX7NYX8QKFX9GX10X11TFTVDX12SISTAYMELSRLX13
Humani-	SDDX14GVYFCARLDYRSYWGQGTLVTVSA (SEQ ID NO: 72)
zado	Xi = V ou L X2 = V ou M X₃ = V ou 1 X₄= Μ, V, L, 1, G, A, S, T X₅ = R ou K Xô = N ou D ou E X7 = T ou D ou E ou G ou A X₈ = A ou N X9 = Q ou M X10 = R ou K

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Xu = V ou A X12 = T ou K Xi3 = R ou T X14 = T ou S

[0164] Em outras modalidades das formulações, incluindo a co-formulação, da invenção, as sequências VL humanizadas do anticorpo 4G10 compreendem qualquer uma das sequências VL seguintes:

TABELA 7: Sequências do anticorpo anti-CTLA4 exemplares

Anticorpo	V_L
4G10L1 humanizado	QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTTSNFANWVQEKPGQ AFRSLIGGTNNRASWVPARFSGSLLGGKAALTISGAQPEDEAEYFC ALWYSNHWVFGGGTKLTVL (SEQ ID NO: 73)
4G10L3 humanizado	QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTTSNFPNWVQQKPGQ APRSLIGGTNNKASWTPARFSGSLLGGKAALTISGAQPEDEAEYYC ALWYSNHWVFGGGTKLTVL (SEQ ID NO: 74)
4G10L consenso humanizado	QAV VTQE PS LTVS P G GTVTLTCG SSTG AVTTS N FXi N WVQ X2KPGQAX3RSLIGGTNNX4AX5WX6PARFSGSLLGGKAALTISGAQ PEDEAEYX7CALX8YSNHX9VFGGGTKLTVL (SEQ ID NO: 75) Xi = P ou A X₂ = Qou E X₃ = P ou F X4 = K ou R ou qualquer outro aminoácido exceto M ou C X₅=S ou P X₆ = Tou V X₇ = Y ou F Xs = W ou qualquer aminoácido exceto M ou C X9 = W ou qualquer aminoácido exceto M ou C

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[0165] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CTLA4 compreende uma sequência de cadeia pesada variável e uma sequência de cadeia leve variável correspondendo à sequência VH e VL de 4G10H1L1. Em uma outra modalidade, o anticorpo anti-CTLA4 compreende uma sequência de cadeia pesada variável e uma sequência de cadeia leve variável correspondendo à sequência VH e VL de 4G10H3L3. Em uma modalidade, o anticorpo anti-CTLA4 compreende uma sequência de cadeia pesada variável e uma sequência de cadeia leve variável correspondendo à sequência VH e VL de 4G10H3L3. Em uma outra modalidade, o anticorpo anti-CTLA4 compreende uma sequência de cadeia pesada variável e uma sequência de cadeia leve variável correspondendo à sequência VH e VL de 4G10H5L3.

TABELA 8: Sequências do anticorpo anti-CTLA4 exemplares

Anticorpo	V_H	V_L
4G10H1L1	QVQLVESGAELVKPGASMKISCK ASGYSFTGYTM NWVKQAPGQG L EWIGLINPYNNITNYNQKFMGKA TFTVDKSISTAYMELSRLTSDDSG VYFCARLDYRSYWGQGTLVTVSA (SEQ ID NO: 76)	QAVVTQE PS LTVSP G GTVTLTC GSSTGAVTTSNFANWVQEKPG QAFRSLIGGTNNRASWVPARFS GSLLGGKAALTISGAQPEDEAEY FCALWYSNHWVFGGGTKLTVL (SEQ ID NO: 77)
4G10H3L3	QVQLVESGAEVKKPGASVKVSCK ASGYSFTGYTM NWVRQAPGQG L EWIGLINPYNNITNYAQKFQGRV TFTVDTSISTAYMELSRLRSDDTG VYFCARLDYRSYWGQGTLVTVSA (SEQ ID NO: 78)	QAVVTQE PS LTVSP G GTVTLTC GSSTGAVTTSNFPNWVQQKPG QAPRSLIGGTNNKASWTPARFS GSLLGGKAALTISGAQPEDEAEY YCALWYSNHWVFGGGTKLTVL (SEQ ID NO: 79)
4G10H4L3	QVQLVESGAEVKKPGASVKVSCK ASGYSFTGYTM NWVRQAPGQG L	QAVVTQE PS LTVSP G GTVTLTC GSSTGAVTTSNFPNWVQQKPG

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	EWIG LI N PYN DITN YAQKFQG RV TFTVDTSISTAYMELSRLRSDDTG VYFCARLDYRSYWGQGTLVTVSA (SEQ ID NO: 80)	QAPRSLIGGTNNKASWTPARFS GSLLGGKAALTISGAQPEDEAEY YCALWYSNHWVFGGGTKLTVL (SEQ ID NO: 81)
4G10H5L3	QVQLVESGAEVKKPGASVKVSCK ASGYSFTG YTM N WVRQAPGQG L EWIGLINPYNNIDNYAQKFQGRV TFTVDTSISTAYMELSRLRSDDTG VYFCARLDYRSYWGQGTLVTVSA (SEQ ID NO: 82)	QAVVTQE PS LTVSP G GTVTLTC GSSTGAVTTSNFPNWVQQKPG QAPRSLIGGTNNKASWTPARFS GSLLGGKAALTISGAQPEDEAEY YCALWYSNHWVFGGGTKLTVL (SEQ ID NO: 83)

Tabela 9. Anticorpos anti-CTLA4 humano adicionais
A. Compreende CDRs de cadeia leve e pesada de Ipilimumabe
CDRL1	RASQSVGSSYLA (SEQ ID NO: 91)
CDRL2	GAFSRAT (SEQ ID NO: 92)
CDRL3	QQYGSSPWT (SEQ ID NO: 93)
CDRH1	SYTMH (SEQ ID NO: 94)
CDRH2	FISYDGNNKYYADSVKG (SEQ ID NO: 95)
CDRH3	TGWLGPFDY (SEQ ID NO: 96)
C. Compreende a região variável de cadeia pesada madura e a região variável de cadeia leve madura de Ipilimumabe
VR de cadeia pesada	QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYTMHWVRQA PGKGLEWVTFISYDGNNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLY LQMNSLRAEDTAIYYCARTGWLGPFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 97)
VR de cadeia	EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVGSSYLAWYQQK PGQAPRLLIYGAFSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLE

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leve	PEDFAVYYCQQYGSSPWTFGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 98)
D. Compreende a cadeia pesada madura e a cadeia leve madura de Ipilimumabe
Cadeia pesada	SEQ ID NO: 84
Cadeia leve	SEQ ID NO: 85

[0166] Em uma outra modalidade das formulações, incluindo a coformulação, da invenção, o anticorpo anti-CTLA-4 é um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que compete cruzado pela ligação a CTLA-4 humano com ou se liga à mesma região de epítopo de CTLA-4 humano como o ipilimumabe, tremelimumabe ou qualquer um dos anticorpos descritos acima, incluindo 8D2/8D2 (RE) ou variante 1 de 8D2/8D2 (RE), 8D2H1L1 ou variante 1 de 8D2H1L1, 8D2H2L2 ou variante 1 de 8D2H2L2, 8D3H3L3, 8D2H2L15 ou variante 1 de 8D2H2L15 deste, 8D2H2L17 ou variante 1 de 8D2H2L17,4G10H1L1 ou variante do mesmo, 4G10H3L3 ou variante do mesmo, 4G10H3L3 ou variante do mesmo e 4G10H5L3 ou variante do mesmo.

Formulações

[0167] Em alguns aspectos da invenção, as formulações descritas na presente invenção minimizam a formação de agregados de anticorpo (espécies de peso molecular alto) e particulados, espécies de peso molecular alto e baixo, minimizam a oxidação de resíduos de metionina e garantem que o anticorpo mantenha a atividade biológica com o passar do tempo.

[0168] Em um aspecto, a invenção inclui várias formulações de um anticorpo anti-CTLA4 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo. Por exemplo, a presente invenção inclui formulações compreendendo (i) um anticorpo anti-CTLA4 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, (ii) um

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67/132 tampão (por exemplo, L-histidina ou acetato), (iii) um açúcar não-redutor (por exemplo, sacarose); (iv) um tensoativo não-iônico (por exemplo, polisorbato 80); e (v) um antioxidante (por exemplo, L-metionina). Em um aspecto, a formulação compreende ainda um anticorpo anti-PD-1. Em um aspecto, a formulação pode compreender ainda um quelante. Em uma modalidade, o quelante é ácido dietilenotriaminapentaacético (DTPA).

[0169] Em um aspecto, a invenção também inclui várias co-formulações de um anticorpo anti-CTLA4 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo e um anticorpo anti-PD-1 humano ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo. Em uma modalidade, a presente invenção inclui formulações compreendendo (i) um anticorpo anti-CTLA4 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, (ii) um anticorpo anti-PD-1 humano ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, (iii) um tampão (por exemplo, L-histidina ou acetato), (iv) um açúcar não-redutor (por exemplo, sacarose), (v) um tensoativo não-iônico (por exemplo, polisorbato 80) e (vi) um antioxidante (por exemplo, L-metionina). Em uma modalidade, a formulação pode compreender ainda um quelante (por exemplo, DTPA).

[0170] Formulações farmacêuticas descritas na presente invenção podem incluir tampões. O termo tampão abrange aqueles agentes que mantêm o pH da solução das formulações líquidas descritas aqui em uma faixa aceitável, ou, para as formulações liofilizadas descritas na presente invenção, fornece um pH aceitável da solução antes da liofilização e/ou depois da reconstituição.

[0171] Tampões que são úteis nas formulações farmacêuticas e métodos da invenção incluem succinato (sódio ou potássio), L-histidina, fosfato (sódio ou potássio), Tris (tris (hidroximetil) aminometano), dietanolamina, citrato (sódio), acetato (sódio) e semelhantes. Em uma modalidade da invenção, o tampão está presente na formulação em uma concentração de cerca de 1 a 20 mM (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 e 20 mM). Em modalidades

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68/132 específicas da invenção, o tampão é tampão histidina. Em uma outra modalidade, o tampão é tampão L-histidina.

[0172] Em uma modalidade, o tampão tem um pH na faixa de cerca de 4,5 a cerca de 6,5. Em uma outra modalidade, o pH está na faixa de cerca de 5,0 a 6,0. Em uma outra modalidade, a faixa de pH é de cerca de 5,3 a 5,8. Em uma outra modalidade, o pH é cerca de 5,5. Chegando na formulação exemplar, tampões de histidina e acetato na faixa de pH de 5,0 a 6,0 foram explorados quanto à adequabilidade. Quando uma faixa de valores de pH é relatada, tal como um pH entre pH 5,5 e 6,0, a faixa é intencionada a ser inclusiva dos valores relatados. Por exemplo, uma faixa de cerca de 5,0 a cerca de 6,0 inclui 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9 e 6,0. Para formulações liofilizadas, a menos que de outro modo indicado, o pH refere-se ao pH depois da reconstituição. O pH é tipicamente medido a 25 °C usando medidor de pH em bulbo de vidro padrão. Como usado na presente invenção, uma solução compreendendo tampão histidina em pH X refere-se a uma solução em pH X e compreendendo o tampão histidina, isto é, o pH é intencionado a referir-se ao pH da solução. Em algumas modalidades da co-formulação em que a coformulação contém uma concentração mais alta de anticorpo anti-PD-1 humano quando comparado ao anticorpo anti-CTLA4, o pH da co-formulação é cerca de 5,0.

[0173] Em uma modalidade da invenção, a formulação anti-CTLA4 e a coformulação de anti-CTLA4 e anti-PD-1 humano compreende um açúcar nãoredutor. Como usado na presente invenção, açúcar não-redutor é um açúcar não capaz de agir como um agente redutor porque ele não contém ou não pode ser convertido para conter um grupo aldeído livre ou um grupo cetona livre. Exemplos de açúcares que não de redução incluem, mas não são limitados a dissacarídeos tais como sacarose e trealose. Em uma modalidade, o açúcar não

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69/132 redutor está presente em uma quantidade de cerca de 1 a 10 % (p/v) (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 %). Em uma outra modalidade, o açúcar não-redutor está presente em uma quantidade de cerca de 6 % a cerca de 8 % (p/v) (6, 7 ou 8 %). Em uma outra modalidade, o açúcar não-redutor está presente em uma quantidade de cerca de 6 % (p/v). Em uma outra modalidade, o açúcar nãoredutor está presente em uma quantidade de cerca de 7 % (p/v). Em uma outra modalidade, o açúcar não-redutor está presente em uma quantidade de cerca de 8 % (p/v). Em uma modalidade, o açúcar não-redutor é sacarose, trealose ou rafinose. Em uma outra modalidade, o açúcar não-redutor é sacarose. Em uma outra modalidade, a sacarose está presente em 6 a 8 % p/v. Em uma modalidade, a sacarose está presente em 6 % (p/v). Em uma modalidade, a sacarose está presente em 7 % (p/v). Em uma modalidade, a sacarose está presente em 8 % (P/v).

[0174] As formulações descritas aqui também compreendem um tensoativo. Como usado na presente invenção, um tensoativo é um agente ativo de superfície que é anfipático em natureza. Tensoativos podem ser adicionados às formulações aqui para fornecer estabilidade, reduzir e/ou impedir a agregação ou para impedir e/ou inibir o dano proteico durante as condições de processamento tais como purificação, filtração, liofilização, transporte, armazenamento e liberação. Em um aspecto da invenção, um tensoativo pode ser útil para fornecer estabilidade adicional ao(s) ingrediente(s) ativo(s).

[0175] Tensoativos não-iônicos que podem ser úteis nas formulações e coformulações descritas na presente invenção incluem, mas não são limitados a, ésteres de ácido graxo de polioxietileno sorbitano (Polisorbatos, vendidos sob o nome comercial Tween® (Uniquema Americas LLC, Wilmington, DE)) incluindo Polisorbato-20 (monolaurato de polioxietileno sorbitano), Polisorbato-40 (monopalmitato de polioxietileno sorbitano), Polisorbato-60 (monoestearato de

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70/132 polioxietileno sorbitano) e Polisorbato-80 (monooleato de polioxietileno sorbitano); éteres alquilicos de polioxietileno tais como Brij® 58 (Uniquema Americas LLC, Wilmington, DE) e Brij® 35; poloxâmeros (por exemplo, poloxâmero 188); Triton® X-100 (Union Carbide Corp., Houston, TX) e Triton® X114; NP40; Span 20, Span 40, Span 60, Span 65, Span 80 e Span 85; copolimeros de etileno e propileno glicol (por exemplo, a série pluronic® de tensoativos nãoiônicos tais como pluronic® F68, pluronic® 10R5, pluronic® F108, pluronic® F127, pluronic® F38, pluronic® L44, pluronic® L62 (BASF Corp., Ludwigshafen, Germany); e dodecil sulfato de sódio (SDS). Em uma modalidade, o tensoativo não-iônico é polisorbato 80 ou polisorbato 20. Em uma modalidade, o tensoativo não-iônico é polisorbato 20. Em uma outra modalidade, o tensoativo não-iônico é polisorbato 80.

[0176] A quantidade de tensoativo não-iônico a ser incluído nas formulações da invenção é uma quantidade suficiente para realizar a função desejada, isto é, uma quantidade mínima necessária para estabilizar o ingrediente farmacêutico ativo (isto é, o anticorpo anti-CTLA4 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo ou tanto o anticorpo anti-CTLA4 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo quanto o anticorpo anti-PD-1 humano ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo) na formulação. Todas as porcentagens listadas para polisorbato 80 são em % p/v. Tipicamente, o tensoativo está presente em uma concentração de cerca de 0,008 % a cerca de 0,1 % p/v. Em algumas modalidades deste aspecto da invenção, o tensoativo está presente na formulação em uma quantidade de cerca de 0,01 % a cerca de 0,1 %; de cerca de 0,01 % a cerca de 0,09 %; de cerca de 0,01 % a cerca de 0,08 %; de cerca de 0,01 % a cerca de 0,07 %; de cerca de 0,01 % a cerca de 0,06 %; de cerca de 0,01 % a cerca de 0,05 %; de cerca de 0,01 % a cerca de 0,04 %; de cerca de 0,01 % a cerca de 0,03 %, de cerca de 0,01 % a cerca de 0,02 %, de cerca de

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0,015 % a cerca de 0,04 %; de cerca de 0,015 % a cerca de 0,03 %, de cerca de 0,015 % a cerca de 0,02 %, de cerca de 0,02 % a cerca de 0,04 %, de cerca de 0,02 % a cerca de 0,035 % ou de cerca de 0,02 % a cerca de 0,03 %. Em modalidades específicas, o tensoativo está presente em uma quantidade de cerca de 0,02 %. Em modalidades alternativas, o tensoativo está presente em uma quantidade de cerca de 0,01 %, cerca de 0,015 %, cerca de 0,025 %, cerca de 0,03 %, cerca de 0,035 % ou cerca de 0,04 %.

[0177] Em modalidades exemplares da invenção, o tensoativo é um tensoativo não-iônico selecionado a partir do grupo consistindo em: Polisorbato 20 e Polisorbato 80. Em modalidades preferidas, o tensoativo é Polisorbato 80.

[0178] Em modalidades específicas, as formulações, incluindo as coformulações, da invenção compreendem cerca de 0,01 % a cerca de 0,04 % p/v de polisorbato 80. Em outras modalidades, as formulações descritas na presente invenção compreendem polisorbato 80 em uma quantidade de cerca de 0,008 % p/v, cerca de 0,01 % p/v. Em uma modalidade, a quantidade de polisorbato 80 é cerca de 0,015 % p/v. Em uma outra modalidade, a quantidade de polisorbato 80 é cerca de 0,02 % p/v. Em uma outra modalidade, a quantidade de polisorbato 80 é cerca de 0,025 % p/v. Em uma outra modalidade, a quantidade de polisorbato 80 é cerca de 0,03 % p/v. Em uma outra modalidade, a quantidade de polisorbato 80 é cerca de 0,035 % p/v. Em uma outra modalidade, a quantidade de polisorbato 80 é cerca de 0,04 % p/v. Em uma outra modalidade, a quantidade de polisorbato 80 é cerca de 0,045 % p/v. Em modalidades particulares, as formulações da invenção compreendem cerca de 0,02 % p/v de polisorbato 80.

[0179] As formulações, incluindo as co-formulações, da presente invenção também compreendem metionina ou um sal farmaceuticamente aceitável deste. Em uma modalidade, a metionina é L-metionina. Em uma outra

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72/132 modalidade, a metionina é um sal farmaceuticamente aceitável de L-metionina, tal como, por exemplo, HCI de metionina. Em uma modalidade, metionina está presente na formulação em uma concentração de cerca de 1 a 20 mM (1, 2, 3, 4,

5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 e 20 mM). Em uma outra modalidade, a metionina está presente de cerca de 5mM a cerca de 10 mM (5,

6, 7, 8, 9 e 10 mM). Em uma outra modalidade, a metionina está presente em cerca de 10 mM.

[0180] As formulações e co-formulações descritas na presente invenção podem compreender ainda um agente quelante. Em uma modalidade da invenção, o agente quelante está presente na formulação em uma concentração de cerca de 1 a 50 μΜ (por exemplo, 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ou 50 μΜ). Em uma modalidade, o agente quelante é DTPA. Em uma outra modalidade, o agente quelante é EDTA. Em alguma modalidade adicional, o DTPA é o antioxidante que pode estar presente em qualquer uma das seguintes quantidades de 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ou 50 μΜ em qualquer uma das formulações descritas na presente invenção.

Composições liofilizadas

[0181] As formulações liofilizadas de proteínas terapêuticas fornecem várias vantagens. Formulações liofilizadas em geral oferecem melhor estabilidade química do que formulações de solução e assim meia-vida aumentada. Uma formulação liofilizada também pode ser reconstituída em diferentes concentrações dependendo dos fatores clínicos, tais como via de administração ou dosagem. Por exemplo, uma formulação liofilizada pode ser reconstituída em uma concentração alta (isto é, em um pequeno volume) se necessário para a administração subcutânea ou em uma concentração mais baixa se administrada intravenosamente. Concentrações altas também podem ser necessárias se dosagem alta for necessária para um indivíduo particular,

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73/132 particularmente se administradas subcutaneamente onde o volume de injeção deve ser minimizado. Uma tal formulação de anticorpo liofilizada é divulgada na Pat. US N- 6.267.958, que é por meio desta incorporada por referência em sua totalidade. Formulações liofilizadas de uma outra proteína terapêutica são divulgadas na Pat. US N² 7.247.707, que é por meio desta incorporada por referência em sua totalidade.

[0182] Tipicamente, a formulação liofilizada é preparada em antecipação à reconstituição em concentração alta de produto medicamentoso (DP, em uma modalidade exemplar, o anticorpo anti-PD-1 humanizado pembrolizumabe ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo), isto é, em antecipação à reconstituição em um baixo volume de água. A diluição subsequente com água ou tampão isotônico depois pode ser facilmente usada para diluir o DP a uma concentração mais baixa. Tipicamente, excipientes são incluídos em uma formulação liofilizada da presente invenção em níveis que resultarão em uma formulação aproximadamente isotônica quando reconstituídos em concentração de DP alta, por exemplo, para administração subcutânea. A reconstituição em um volume maior de água para fornecer uma concentração de DP mais baixa necessariamente reduzirá a tonicidade da solução reconstituída, mas tal redução pode ser de pouca significância em administração não subcutânea, por exemplo, intravenosa. Se a isotonicidade for desejada em concentração de DP mais baixa, o pó liofilizado pode ser reconstituído no volume baixo padrão de água e depois diluído ainda com diluente isotônico, tal como cloreto de sódio a 0,9 %.

[0183] As formulações liofilizadas da presente invenção são formadas por liofilização (secagem por congelamento) de uma solução pré-liofilização. A secagem por congelamento é realizada congelando-se a formulação e subsequentemente sublimando-se água em uma temperatura adequada para a

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74/132 secagem primária. Sob esta condição, a temperatura do produto é abaixo do ponto eutético ou da temperatura de colapso da formulação. Tipicamente, a temperatura de prateleira para a secagem primária variará de cerca de -30 a 25 °C (contanto que o produto permaneça congelado durante a secagem primária) em uma pressão adequada, variando tipicamente de cerca de 50 a 250 mTorr. A formulação, tamanho e tipo do recipiente retendo a amostra (por exemplo, frasco de vidro) e o volume de líquido ditarão o tempo necessário para a secagem, que pode variar de algumas horas a vários dias (por exemplo, 40 a 60 h). Um estágio de secagem secundário pode ser realizado a cerca de 0 a 40 °C, dependendo principalmente do tipo e tamanho de recipiente e do tipo de proteína utilizada. O tempo de secagem secundário é ditado pelo nível de umidade residual desejado no produto e tipicamente dura pelo menos cerca de 5 horas. Tipicamente, o teor de umidade de uma formulação liofilizada é menos do que cerca de 5 % e preferivelmente menos do que cerca de 3 %. A pressão pode ser a mesma como aquela utilizada durante a etapa de secagem primária. Condições de secagem por congelamento podem ser variadas dependendo da formulação e tamanho do frasco.

[0184] Em alguns exemplos, pode ser desejável liofilizar a formulação de proteína no recipiente em que a reconstituição da proteína deve ser realizada de modo a evitar uma etapa de transferência. O recipiente neste exemplo pode, por exemplo, ser um frasco de 3, 5, 10, 20, 50 ou 100 cc.

[0185] As formulações liofilizadas da presente invenção são reconstituídas antes da administração. A proteína pode ser reconstituída em uma concentração de cerca de 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 75, 80, 90 ou 100 mg/mL ou concentrações mais altas tais como 150 mg/mL, 200 mg/mL, 250 mg/mL ou 300 mg/mL até cerca de 500 mg/mL. Em uma modalidade, a concentração de proteína depois da reconstituição é cerca de 10 a 300 mg/mL. Em uma

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75/132 modalidade, a concentração de proteína depois da reconstituição é cerca de 20 a 250 mg/mL. Em uma modalidade, a concentração de proteína depois da reconstituição é cerca de 150 a 250 mg/mL. Em uma modalidade, a concentração de proteína depois da reconstituição é cerca de 180 a 220 mg/mL. Em uma modalidade, a concentração de proteína depois da reconstituição é cerca de 50 a 150 mg/mL. Em uma modalidade, a concentração de proteína depois da reconstituição é cerca de 100 mg/mL. Em uma modalidade, a concentração de proteína depois da reconstituição é cerca de 75 mg/mL. Em uma modalidade, a concentração de proteína depois da reconstituição é cerca de 50 mg/mL. Em uma modalidade, a concentração de proteína depois da reconstituição é cerca de 25 mg/mL. Concentrações com alto teor de proteína são particularmente úteis onde a liberação subcutânea da formulação reconstituída é intencionada. Entretanto, para outras vias de administração, tais como administração intravenosa, concentrações mais baixas da proteína podem ser desejadas (por exemplo, de cerca de 5 a 50 mg/mL).

[0186] A reconstituição geralmente ocorre em uma temperatura de cerca de 25 °C para garantir hidratação completa, embora outras temperaturas possam ser utilizadas conforme desejado. O tempo necessário para a reconstituição dependerá, por exemplo, do tipo de diluente, quantidade de excipiente(s) e proteína. Diluentes exemplares incluem água estéril, água bacteriostática para injeção (BWFI), uma solução tamponada de pH (por exemplo, solução salina tamponada com fosfato), solução salina estéril, solução de Ringer ou solução de dextrose.

Composições Líquidas

[0187] Uma formulação de anticorpo líquida pode ser fabricada tomandose o fármaco (por exemplo, anti-PD-1 humanizado) que está na forma líquida (por exemplo, pembrolizumabe em uma formulação aquosa) e tampão

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76/132 trocando-o no tampão desejado como a última etapa do processo de purificação. Não existe nenhuma etapa de liofilização nesta modalidade. O fármaco no tampão final é concentrado a uma concentração desejada. Excipientes tais como sacarose e polisorbato 80 são adicionados ao fármaco e ele é diluído usando o tampão apropriado à concentração de proteína final. O fármaco formulado final é filtrado usando filtros de 0,22 pm e preenchido em um recipiente final (por exemplo, frascos de vidro).

III. Métodos de uso

[0188] A invenção também refere-se a um método de tratar câncer em um indivíduo, o método compreendendo administrar uma quantidade eficaz de qualquer uma das formulações da invenção; isto é, qualquer formulação descrita na presente invenção, ao indivíduo. Em algumas modalidades específicas deste método, a formulação é administrada ao indivíduo por intermédio de administração intravenosa. Em outras modalidades, a formulação é administrada ao indivíduo por administração subcutânea. Em uma modalidade, a invenção compreende um método de tratar câncer em um paciente humano compreendendo administrar qualquer formulação da invenção ao paciente.

[0189] Em qualquer um dos métodos da invenção, o câncer pode ser selecionado a partir do grupo consistindo em: melanoma, câncer pulmonar, câncer de cabeça e pescoço, câncer de bexiga, câncer de mama, câncer gastrointestinal, mieloma múltiplo, câncer hepatocelular, linfoma, câncer renal, mesotelioma, câncer de ovário, câncer esofágico, câncer anal, câncer do trato biliar, câncer colorretal, câncer cervical, câncer da tireoide, câncer salivar, câncer de próstata (por exemplo, adenocarcinoma de próstata refratário a hormônio), câncer pancreático, câncer de cólon, câncer esofágico, câncer de fígado, câncer da tireoide, glioblastoma, glioma e outras malignidades neoplásicas.

[0190] Em algumas modalidades o câncer pulmonar em câncer pulmonar

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77/132 de células não pequenas.

[0191] Em modalidades alternadas, o câncer pulmonar é câncer pulmonar de células pequenas.

[0192] Em algumas modalidades, o linfoma é linfoma de Hodgkin.

[0193] Em outras modalidades, o linfoma é linfoma não-Hodgkin. Em modalidades particulares, o linfoma é linfoma mediastinal de grandes células B.

[0194] Em algumas modalidades, o câncer de mama é câncer de mama triplo negativo.

[0195] Em outras modalidades, o câncer de mama é câncer de mama ER+/HER2-.

[0196] Em algumas modalidades, o câncer de bexiga é câncer urotelial.

[0197] Em algumas modalidades, o câncer de cabeça e pescoço é câncer de nasofaringe. Em algumas modalidades, o câncer é câncer da tireoide. Em outras modalidades, o câncer é câncer salivar. Em outras modalidades, o câncer é carcinoma de células escamosas da cabeça e pescoço.

[0198] Em uma modalidade, a invenção compreende um método de tratar câncer pulmonar de células não pequenas (NSCLC) metastático em um paciente humano compreendendo administrar uma formulação da invenção ao paciente. Em modalidades específicas, o paciente tem um tumor com alta expressão de PD-L1 [(Contagem de Proporção do Tumor (TPS) > 50 %)] e não foi previamente tratado com quimioterapia contendo platina. Em outras modalidades, o paciente tem um tumor com expressão de PD-L1 (TPS > 1 %) e foi previamente tratado com quimioterapia contendo platina. Ainda em outras modalidades, o paciente tem um tumor com expressão de PD-L1 (TPS > 1 %) e não foi previamente tratado com quimioterapia contendo platina. Em modalidades específicas, o paciente teve progressão da doença durante ou depois de receber quimioterapia contendo platina. Em certas modalidades, o TPS de PD-L1 é determinado por um

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78/132 teste aprovado pelo FDA. Em certas modalidades, o tumor do paciente não tem nenhuma aberração genômica de EGFR ou ALK. Em certas modalidades, o tumor do paciente tem uma aberração genômica de EGFR ou ALK e teve progressão da doença durante ou depois de receber tratamento para a(s) aberração(ões) de EGFR ou ALK antes de receber o anticorpo anti-PD-1 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.

[0199] Em algumas modalidades, o câncer é câncer colorretal metastático com altos níveis de instabilidade de microssatélites (MSI-H).

[0200] Em algumas modalidades, o câncer é câncer colorretal metastático com altos níveis de instabilidade de microssatélites (MSI-H).

[0201] Em algumas modalidades, o câncer é um tumor sólido com um alto nível de instabilidade de microssatélites (MSI-H).

[0202] Em algumas modalidades, o câncer é um tumor sólido com uma alta carga mutacional.

[0203] Em algumas modalidades, o câncer é selecionado a partir do grupo consistindo em: melanoma, câncer pulmonar de células não pequenas, linfoma de Hodgkin clássico reincidente ou refratário, carcinoma de células escamosas da cabeça e pescoço, câncer urotelial, câncer esofágico, câncer gástrico e câncer hepatocelular.

[0204] Em outras modalidades dos métodos de tratamento acima, o câncer é uma malignidade de Heme. Em certas modalidades, a malignidade de Heme é leucemia linfoblástica aguda (ALL), leucemia mieloide aguda (AML), leucemia linfocítica crônica (CLL), leucemia mieloide crônica (CML), linfoma difuso de grandes células B (DLBCL), DLBCL positivo para EBV, linfoma mediastinal de grandes células B primário, linfoma de grandes células B rico em célula T/histiócito, linfoma folicular, linfoma de Hodgkin (HL), linfoma da célula do manto (MCL), mieloma múltiplo (MM), proteína de leucemia-1 mieloide (Mcl-1),

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79/132 síndrome mielodisplásica (MDS), linfoma não-Hodgkin (NHL) ou linfoma linfocítico pequeno (SLL).

[0205] Malignidades que demonstram sobrevivência isenta de doença e global melhorada em relação à presença de linfócitos infiltrantes no tumor em material de biópsia ou cirúrgico, por exemplo, melanoma, câncer colorretal, hepático, renal, estomacal/esofágico, mamário, pancreático e de ovário são abrangidas nos métodos e tratamentos descritos na presente invenção. Tais subtipos de câncer são conhecidos como sendo suscetíveis ao controle imune por linfócitos T. Adicionalmente, são incluídas malignidades refratárias ou recorrentes cujo crescimento pode ser inibido usando os anticorpos descritos na presente invenção.

[0206] Cânceres adicionais que podem beneficiar-se de tratamento com as formulações descritas na presente invenção incluem aqueles associados com infecção persistente com vírus tais como vírus da imunodeficiência humana, vírus da hepatite classe A, B e C, vírus Epstein Barr, papilomavírus humanos que são conhecidos como sendo casualmente relacionados a, por exemplo, sarcoma de Kaposi, câncer de fígado, câncer de nasofaringe, linfoma, cânceres cervicais, vulvares, anais, penianos e orais.

[0207] As formulações também podem ser usadas para prevenir ou tratar infecções e doença infecciosa. Assim, a invenção fornece um método para tratar infecção crônica em um indivíduo mamífero compreendendo administrar uma quantidade eficaz de uma formulação da invenção ao indivíduo. Em algumas modalidades específicas deste método, a formulação é administrada ao indivíduo por intermédio de administração intravenosa. Em outras modalidades, a formulação é administrada ao indivíduo por administração subcutânea.

[0208] Estes agentes podem ser usados isolados ou em combinação com vacinas, para estimular a resposta imune a patógenos, toxinas e auto-antígenos.

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Os anticorpos ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmos podem ser usados para estimular a resposta imune a vírus infecciosos aos seres humanos, incluindo mas não limitados a: vírus da imunodeficiência humana, vírus da hepatite classe A, B e C, vírus Epstein Barr, citomegalovírus humano, papilomavírus humanos e vírus da herpes. Anticorpos anti-PD-1 antagonistas ou fragmentos de anticorpo podem ser usados para estimular a resposta imune à infecção com parasitas bacterianos ou fúngicos e outros patógenos. Infecções virais com hepatite B e C e HIV são, dentre aquelas, consideradas como sendo infecções virais crônicas.

[0209] As formulações da invenção podem ser administradas a um paciente em combinação com um ou mais agentes terapêuticos adicionais. O agente terapêutico adicional pode ser um agente bioterapêutico (incluindo, mas não limitado a anticorpos para VEGF, EGFR, Her2/neu, receptores de VEGF, outros receptores de fator de crescimento, CD20, CD40, CD-40L, OX-40, 4-1BB e ICOS), um agente imunogênico (por exemplo, células cancerosas atenuadas, antígenos tumorais, células apresentadoras de antígeno tais como células dendríticas pulsadas com antígeno ou ácidos nucleicos derivados de tumor, citocinas imunoestimulantes (por exemplo, IL-2, IFNct2, GM-CSF) e células transfectadas com genes que codificam citocinas imunoestimulantes tais como mas não limitadas a GM-CSF).

[0210] Como observado acima, em algumas modalidades dos métodos da invenção, o método compreende ainda administrar um agente terapêutico adicional. Em modalidades particulares, o agente terapêutico adicional é um anticorpo anti-LAG3 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo,um anticorpo anti-GITR ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo,um anticorpo anti-TIGIT ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo,um anticorpo anti-CD27 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo. Em uma

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81/132 modalidade, o agente terapêutico adicional é um vetor viral de doença de Newcastle que expressa IL-12. Em uma outra modalidade, o agente terapêutico adicional é dinaciclibe. Ainda em outras modalidades, o agente terapêutico adicional é um agonista de STING.

[0211] Vias de administração adequadas podem, por exemplo, incluir liberação parenteral, incluindo intramuscular, subcutânea, assim como intratecal, intraventricular direta, intravenosa, intraperitoneal. Fármacos podem ser administrados em uma variedade de vias convencionais, tais como injeção intraperitoneal, parenteral, intra-arterial ou intravenosa. Modos de administração em que o volume de solução deve ser limitado (por exemplo, administração subcutânea) requerem uma formulação liofilizada para permitir a reconstituição em concentração alta.

[0212] Selecionar uma dosagem do agente terapêutico adicional depende de vários fatores, incluindo a taxa de rotação sérica ou tecidual da entidade, o nível dos sintomas, a imunogenicidade da entidade e a acessibilidade das células alvos, tecido ou órgão no indivíduo sendo tratado. A dosagem do agente terapêutico adicional deve ser uma quantidade que forneça um nível aceitável de efeitos colaterais. Consequentemente, a quantidade de dose e frequência de dosagem de cada agente terapêutico adicional (por exemplo, agente bioterapêutico ou quimioterapêutico) dependerá em parte do agente terapêutico particular, da severidade do câncer sendo tratado e características do paciente. Orientação em selecionar as doses apropriadas de anticorpos, citocinas e moléculas pequenas está disponível. Ver, por exemplo, Wawrzynczak (1996) Antibody Therapy, Bios Scientific Pub. Ltd, Oxfordshire, UK; Kresina (ed.) (1991) Monoclonal Antibodies, Cytokines and Arthritis, Marcel Dekker, New York, NY; Bach (ed.) (1993) Monoclonal Antibodies and Peptide Therapy in Autoimmune Diseases, Marcel Dekker, New York, NY; Baert et al. (2003) New

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Engl. J. Med. 348:601 - 608; Milgrom et al. (1999) New Engl. J. Med. 341:1966 1973; Slamon et al. (2001) New Engl. J. Med. 344:783-792; Beniaminovitz et al. (2000) New Engl. J. Med. 342:613 - 619; Ghosh et al. (2003) New Engl. J. Med. 348:24 - 32; Lipsky et al. (2000) New Engl. J. Med. 343:1594 - 1602; Physicians' Desk Reference 2003 (Physicians' Desk Reference, 57- Ed); Medical Economics Company; ISBN: 1563634457; 57- edição (novembro de 2002). A determinação do regime de dosagem apropriado pode ser feita pelo clínico, por exemplo, usando parâmetros ou fatores conhecidos ou suspeitos na técnica para afetar o tratamento ou prognosticados para afetar o tratamento e dependerá, por exemplo, do histórico clínico do paciente (por exemplo, terapia prévia), do tipo e estágio do câncer a ser tratado e biomarcadores de resposta a um ou mais dos agentes terapêuticos na terapia de combinação.

[0213] Várias referências na literatura estão disponíveis para facilitar a seleção de portadores ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis para o agente terapêutico adicional. Ver, por exemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences and U.S. Pharmacopeia: National Formulary, Mack Publishing Company, Easton, PA (1984); Hardman et al. (2001) Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, McGraw-Hill, New York, NY; Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott, Williams, and Wilkins, New York, NY; Avis et al. (eds.) (1993) Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications, Marcel Dekker, NY; Lieberman, et al. (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets, Marcel Dekker, NY; Lieberman et al. (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems, Marcel Dekker, NY; Weiner and Kotkoskie (2000) Excipient Toxicity and Safety, Marcel Dekker, Inc., New York, NY.

[0214] Uma formulação farmacêutica de anticorpo pode ser administrada por infusão contínua ou por doses em intervalos de, por exemplo, um dia, 1 a 7

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83/132 vezes por semana, uma semana, duas semanas, três semanas, mensalmente, bimensalmente, etc. Um protocolo de dose preferido é um envolvendo a dose ou frequência de dose máxima que evita efeitos colaterais indesejáveis significativos. Uma dose semanal total é geralmente pelo menos 0,05 pg/kg, 0,2 úg/kg, 0,5 pg/kg, 1 μg/kg, 10 μg/kg, 100 μg/kg, 0,2 mg/kg, 1,0 mg/kg, 2,0 mg/kg, 10 mg/kg, 25 mg/kg, 50 mg/kg de peso corpóreo ou mais. Ver, por exemplo, Yang et al. (2003) New Engl. J. Med. 349:427 - 434; Herold et al. (2002) New Engl. J. Med. 346:1692 -1698; Liu etal. (1999)7. Neurol. Neurosurg. Psych. 67:451-456; Portielji et al. (20003) Cancer Immunol. Immunother. 52:133 - 144. A dose desejada de um produto terapêutico de molécula pequena, por exemplo, um mimético de peptídeo, produto natural ou produto químico orgânico, é cerca da mesma como para um anticorpo ou polipeptídeo, em uma base de mol/kg.

[0215] As modalidades da invenção também incluem uma ou mais das formulações biológicas descritas na presente invenção (i) para o uso em, (ii) para o uso como um medicamento ou composição para, ou (iii) para o uso na preparação de um medicamento para: (a) terapia (por exemplo, do corpo humano); (b) medicina; (c) indução de ou aumento de uma resposta imune antitumoral (d) diminuição do número de um ou mais marcadores tumorais em um paciente; (e) parada ou retardo do crescimento de um tumor ou um câncer sanguíneo; (f) parada ou retardo da progressão de e doença relacionada ao CTLA4 ou PD-1; (g) parada ou retardo da progressão do câncer; (h) estabilização de doença relacionada a CTLA4 ou PD-1; (i) inibição do crescimento ou sobrevivência de células tumorais; (j) eliminação ou redução do tamanho de uma ou mais lesões ou tumores cancerosos; (k) redução da progressão, início ou severidade de doença relacionada a CTLA4 ou PD-1; (I) redução da severidade ou duração dos sintomas clínicos de doença relacionada a CTLA4 ou PD-1 tal como câncer (m) prolongamento da sobrevivência de um paciente em relação à

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84/132 sobrevivência esperada em um paciente similar não tratado n) indução da remissão completa ou parcial de uma condição cancerosa ou outra doença relacionada a CTLA4 ou PD-1, o) tratamento de câncer; ou p) tratamento de infecções crônicas.

MÉTODOS GERAIS

[0216] Métodos padrão em biologia molecular são descritos em Sambrook, Fritsch e Maniatis (1982 & 1989 2- Edição, 2001 3^â Edição) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Sambrook and Russell (2001) Molecular Cloning, 3- ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Wu (1993) Recombinant DNA, Vol. 217, Academic Press, San Diego, CA). Métodos padrão também aparecem em Ausbel, et al. (2001) Current Protocols in Molecular Biology, Vols. 1-4, John Wiley and Sons, Inc. New York, NY, que descreve a clonagem em células bacterianas e mutagênese de DNA (Vol. 1), clonagem em células mamíferas e levedura (Vol. 2), glicoconjugados e expressão de proteína (Vol. 3) e bioinformática (Vol. 4).

[0217] São descritos métodos para a purificação de proteína incluindo imunoprecipitação, cromatografia, eletroforese, centrifugação e cristalização (Coligan, et al. (2000) Current Protocols in Protein Science, Vol. 1, John Wiley and Sons, Inc., New York). Análise química, modificação química, modificação póstraducional, produção de proteínas de fusão, glicosilação de proteínas são descritas (ver, por exemplo, Coligan, et al. (2000) Current Protocols in Protein Science, Vol. 2, John Wiley and Sons, Inc., New York; Ausubel, et al. (2001) Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 3, John Wiley and Sons, Inc., NY, NY, páginas 16.0.5 - 16.22.17; Sigma-Aldrich, Co. (2001) Products for Life Science Research, St. Louis, MO; páginas 45 - 89; Amersham Pharmacia Biotech (2001) BioDirectory, Piscataway, N.J., páginas 384 - 391). A produção, purificação e

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85/132 fragmentação de anticorpos policlonais e monoclonais são descritas (Coligan, et al. (2001) Current Protocols in Immunology, Vol. 1, John Wiley and Sons, Inc., New York; Harlow e Lane (1999) Using Antibodies, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Harlow e Lane, supra). Técnicas padrão para caracterizar interações de ligante/receptor estão disponíveis (ver, por exemplo, Coligan, et al. (2001) Current Protocols in Immunology, Vol. 4, John Wiley, Inc., New York).

[0218] Anticorpos monoclonais, policlonais e humanizados podem ser preparados (ver, por exemplo, Sheperd e Dean (eds.) (2000) Monoclonal Antibodies, Oxford Univ. Press, New York, NY; Kontermann e Dubel (eds.) (2001) Antibody Engineering, Springer-Verlag, New York; Harlow e Lane (1988) Antibodies A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, páginas 139 - 243; Carpenter, et al. (2000) J. Immunol. 165:6205; He, etal. (1998)1 Immunol. 160:1029; Tang etal. (1999) J. Biol. Chem. 274:27371 - 27378; Baca etal. (1997)1 Biol. Chem. 272:10678 - 10684; Chothia et al. (1989) Nature 342:877 - 883; Foote e Winter (1992) 1 Mol. Biol. 224:487 499; Pat. dos EUA N^a 6.329.511).

[0219] Uma alternativa para a humanização é usar bibliotecas de anticorpo humano exibidas em bibliotecas de fago ou anticorpo humano em camundongos transgênicos (Vaughan et al. (1996) Nature Biotechnol. 14:309 - 314; Barbas (1995) Nature Medicine 1:837 - 839; Mendez et al. (1997) Nature Genetics 15:146 - 156; Hoogenboom e Chames (2000) Immunol. Today 21:371 - 377; Barbas et al. (2001) Phage Display: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York; Kay et al. (1996) Phage Display of Peptides and Proteins: A Laboratory Manual, Academic Press, San Diego, CA; de Bruin etal. (1999) Nature Biotechnol. 17:397 - 399).

[0220] Purificação de antígeno não é necessária para a geração de

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86/132 anticorpos. Animais podem ser imunizados com células portando o antígeno de interesse. Esplenócitos depois podem ser isolados dos animais imunizados e os esplenócitos podem fundir com uma linhagem de célula de mieloma para produzir um hibridoma (ver, por exemplo, Meyaard et al. (1997) Immunity 7:283 - 290; Wright et al. (2000) Immunity 13:233 - 242; Preston et al., supra; Kaithamana et al. (1999) J. Immunol. 163:5157 - 5164).

[0221] Anticorpos podem ser conjugados, por exemplo, a moléculas de fármacos pequenas, enzimas, lipossomos, polietilenoglicol (PEG). Anticorpos são úteis para terapia, diagnóstico, kit ou outros propósitos e incluem anticorpos ligados, por exemplo, a corantes, radioisótopos, enzimas ou metais, por exemplo, ouro coloidal (ver, por exemplo, Le Doussal et al. (1991) J. Immunol. 146:169 -175; Gibellini et al. (1998) J. Immunol. 160:3891 - 3898; Hsing e Bishop (1999) J. Immunol. 162:2804 - 2811; Everts et al. (2002) J. Immunol. 168:883 889).

[0222] Métodos para citometria de fluxo, incluindo classificação de células ativadas por fluorescência (FACS), estão disponíveis (ver, por exemplo, Owens, et al. (1994) Flow Citometry Principles for Clinical Laboratory Practice, John Wiley and Sons, Hoboken, NJ;Givan (2001) Flow Citometry, 2-ed.; Wiley-Liss, Hoboken, NJ; Shapiro (2003) Practical Flow Citometry, John Wiley and Sons, Hoboken, NJ). Reagentes fluorescentes adequados para modificar ácidos nucleicos, incluindo iniciadores e sondas de ácido nucleico, polipeptídeos e anticorpos, para o uso, por exemplo, como reagentes de diagnóstico, estão disponíveis (Molecular Probesy (2003) Catalogue, Molecular Probes, Inc., Eugene, OR; Sigma-Aldrich (2003) Catalogue, St. Louis, MO).

[0223] São descritos métodos padrão de histologia do sistema imune (ver, por exemplo, Muller-Harmelink (ed.) (1986) Human Timo: Histopathology and Pathology, Springer Verlag, New York, NY; Hiatt, et al. (2000) Color Atlas of

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Histology, Lippincott, Williams e Wilkins, Phila, PA; Louis, et al. (2002) Basic Histology: Text and Atlas, McGraw-Hill, New York, NY). Pacotes de software e bases de dados para determinar, por exemplo, fragmentos antigênicos, sequências líderes, enovelamento proteico, domínios funcionais, sítios de glicosilação e alinhamentos de sequência, estão disponíveis (ver, por exemplo, GenBank, Vector NTI® Suite (Informax, Inc, Bethesda, MD); GCG Wisconsin Package (Accelrys, Inc., San Diego, CA); DeCypher® (TimeLogic Corp., Cristal Bay, Nevada); Menne, etal. (2000) Bioinformatics 16: 741 - 742; Menne, etal. (2000) Bioinformatics Applications Note 16:741 - 742; Wren, et al. (2002) Comput. Methods Programs Biomed. 68:177 - 181; von Heijne (1983) Eur. J. Biochem. 133:17 - 21; von Heijne (1986) Nucleic Acids Res. 14:4683 - 4690).

Métodos Analíticos

[0224] Os métodos analíticos adequados para avaliar a estabilidade do produto incluem cromatografia de exclusão por tamanho (SEC), teste de dispersão de luz dinâmica (DLS), calorimetria diferencial de varredura (DSC), quantificação de iso-asp, potência, UV em 340 nm, espectroscopia UV e FTIR. SEC (J. Pharm. Scien., 83:1645 - 1650, (1994); Pharm. Res., 11:485 (1994); J. Pharm. Bio. Anal., 15:1928 (1997); J. Pharm. Bio. Anal., 14:1133 - 1140 (1986)) mede a porcentagem de monômero no produto e fornece informação da quantidade de agregados solúveis. DSC (Pharm. Res., 15:200 (1998); Pharm. Res., 9:109 (1982)) fornece informação de temperatura de desnaturação de proteína e temperatura de transição vítrea. DLS (American Lab., novembro (1991)) mede o coeficiente de difusão médio e fornece informação da quantidade de agregados solúveis e insolúveis. UV em 340 nm mede a intensidade de luz dispersa em 340 nm e fornece informação sobre as quantidades de agregados solúveis e insolúveis. Espectroscopia UV mede a absorbância em 278 nm e fornece informação da concentração de proteína. FTIR (Eur. J. Pharm. Biopharm.,

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45:231 (1998); Pharm. Res., 12:1250 (1995); J. Pharm. Scien., 85:1290 (1996); J. Pharm. Scien., 87:1069 (1998)) mede o espectro no IR na região única de amida e fornece informação da estrutura secundária da proteína.

[0225] O teor de iso-asp nas amostras é medido usando o Sistema de Detecção de Isoaspartato Isoquant (Promega). O kit usa a enzima Proteína Isoaspartil Metiltransferase (PIMT) para detectar especificamente a presença de resíduos de ácido isoaspártico em uma proteína alvo. PIMT catalisa a transferência de um grupo metila de S-adenosil-L-metionina a ácido isoaspártico na posição alfa-carboxila, gerando S-adenosil-L-homocisteína (SAH) no processo. Esta é uma molécula relativamente pequena e pode usualmente ser isolada e quantificada por HPLC de fase reversa usando os padrões de HPLC SAH fornecidos no kit.

[0226] A potência ou bioidentidade de um anticorpo pode ser medida por sua capacidade de se ligar ao seu antígeno. A ligação específica de um anticorpo ao seu antígeno pode ser quantificada por qualquer método conhecido por um técnico no assunto, por exemplo, um imunoensaio, tal como ELISA (ensaio imunossorvente ligado à enzima).

[0227] Todas as publicações mencionadas na presente invenção são incorporadas por referência para o propósito de descrever e divulgar metodologias e materiais que poderiam ser usados em relação à presente invenção.

[0228] Tendo descritas as modalidades diferentes da invenção aqui com referência aos desenhos anexos, deve ser entendido que a invenção não é limitada àquelas modalidades precisas e que várias mudanças e modificações podem ser efetuadas nesta por uma pessoa habilitada na técnica sem divergir do escopo ou espírito da invenção como definido nas reivindicações anexas.

EXEMPLOS

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EXEMPLO 1

Estabilidade da formulação do anticorpo anti-CTLA4 com ou sem metionina [0229] Este estudo foi conduzido para estudar o efeito de 10 mM de LMetionina sobre a estabilidade de uma formulação do anticorpo anti-CTLA4. Os efeitos dos estresses seguintes foram avaliados em formulações anti-CTLA4 com e sem L-Metionina:

(1) Estresse térmico a 5±3 °C (umidade ambiente), 25 °C (60 % de umidade relativa), 40 °C (75 % de umidade relativa) - até 3 meses.

(2) Estresse de agitação em uma posição horizontal (300 rpm por 3 dias) (3) Estresse de congelamento-descongelamento (ciclos de congelamentodescongelamento clínico a -80 °C a 18 a 22 °C (temperatura ambiente para um descongelamento de 4 horas)).

(4) Estresse de luz (condições de ICH sob 0,2x ICH, 0,5x ICH, lx ICH).

[0230] Com base nos dados, uma formulação contendo L-metionina é mais estável do que uma formulação correspondente sem L-metionina.

Materiais e Métodos

[0231] As seguintes formulações líquidas foram preparadas usando um anticorpo anti-CTLA4 tendo as seguintes CDRs: CDRH1 da SEQ ID NO: 35, CDRH2 da SEQ ID NO: 36, CDRH3 da SEQ ID NO: 37, CDRL1 da SEQ ID NO: 38, CDRL2 da SEQ ID NO: 39 e CDRL3 da SEQ ID NO: 40 em uma cadeia principal de IgGl. As sequências de cadeia pesada variável e cadeia leve variável para o anticorpo antiCTLA4 são apresentadas na SEQ ID NO: 88 e 48, respectivamente. Cada formulação foi preenchida a 1 mL em frascos de vidro do Tipo 1 de 2 mL. Um total de 36 frascos para a formulação Al e 19 frascos para as formulações A2 foram preenchidos. O pH alvo para cada formulação foi 5,5.

Tabela 10: Formulações do anticorpo anti-CTLA4

Formulação

Descrição

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Número
Al	Anticorpo anti-CTLA4 (50 mg/mL)	10 mM de tampão Lhistidina	7 % de sacarose (p/v)	0,02 % de PS80 (P/v)	10 mM de L- Met
A2	Anticorpo anti-CTLA4 (50 mg/mL)	10 mM de tampão L- histidina	7 % de sacarose (P/v)	0,02 % de PS80 (P/v)	NA

[0232] Os frascos depois foram incubados em três condições de armazenamento diferentes: 5 °C (umidade ambiente), 25 °C (60 % de umidade relativa) e 40 °C (75 % de umidade relativa). Os dados foram coletados como segue:

[0233] Estudos de fotoestabilidade foram conduzidos usando formulações líquidas de 1 mL de Al e A2 em frascos de vidro na temperatura ambiente sob 0,2X ICH; 0,5X ICH; e IX ICH.

[0234] As concentrações de proteína foram medidas usando-se absorbância de UV em 280 nm.

[0235] As amostras foram equilibradas até a temperatura ambiente e estudos de turvação (A350) foram conduzidos nas amostras em absorbância espectrofotométrica em 350 nm.

[0236] Amostras foram avaliadas por cromatografia de exclusão por tamanho (SEC) quanto à pureza em que a porcentagem de monómero foi determinada, assim como as porcentagens de espécies de peso molecular alto (HMW) e picos de eluição tardios (espécies de LMW). Cromatografia de exclusão por tamanho de ultra desempenho (UP-SEC) foi realizada diluindo-se as amostras a 5,0 mg/mL em fase móvel (50 mM de fosfato de sódio, 450 mM de monocloridreto de arginina, pH 7,0). As amostras diluídas foram injetadas (6 μί)

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91/132 em um UPLC equipada com uma coluna Waters BEH200 e um detector de UV. Proteínas na amostra foram separadas por tamanho e detectadas por absorção de UV em 280 nm.

[0237] Cromatografia de troca iônica foi realizada para avaliar a estabilidade química e para monitorar a mudança no perfil variante de carga com o passar do tempo. Um método de HPLC de troca iônica foi realizado usando uma coluna Dionex ProPac WCX-10 e um detector de UV em 280 nm. Amostras foram diluídas em água purificada e 80 pg foram injetados para análise. A fase móvel usada para a análise de IEX das amostras de estabilidade térmica foi um gradiente das seguintes fases móveis (fase móvel A: 20 mM de MOPS, pH 7,2; fase móvel B: 50 mM de fosfato de sódio, 60 mM de cloreto de sódio, pH 8,0). O ensaio é realizado usando um gradiente de fase móvel de 20 mM de MOPS, pH 7,2 a 50 mM de fosfato de sódio, 60 mM de NaCI, pH 8,0. A detecção de UV é realizada em 280 nm. Estes métodos são considerados equivalentes e os resultados são apresentados como porcentagens relativas com base na área total do cromatograma.

[0238] O mapeamento de peptídeo foi realizado por digestão de Lys-C. Amostras foram injetadas em Q Exactive em 30 uL/amostra. A análise de dados foi feita pelo software PinPoint.

[0239] Os resultados dos estudos são apresentados nas tabelas abaixo:

TABELA 11

Condição de armazenamento	5 °C
Formulações	Formulação Al (com L-Metionina)
Tempo (semanas)	0	4	8	12
pH	5,7	5,7	5,7	NT
Concentração (mg/mL) (Azso nm)	54,8	54,1	53,7	NT
Turvação (A350 nm)	0,135	0,135	0,133	NT

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UPSEC
Espécies de peso molecular alto (%)	1,07	1,11	1,13	1,16
Picos de peso molecular baixo (%)	0,06	0,10	0,07	0,01
Monômero (%)	98,9	98,8	98,8	98,8
HP-IEX
Variantes ácidas (%)	21,79	21,85	23,08	22,88
Variantes básicas (%)	10,79	9,89	9,94	10,60
Principal (%)	67,4	68,3	67,0	66,5
Mapeamento de peptídeo
% de oxidação de LC-M4	0,1	NT	NT	NT
% de oxidação de HC-M34	0,3	NT	NT	NT
% de oxidação de HC-M250	2,3	NT	NT	NT
% de oxidação de HC-M426	0,8	NT	NT	NT

Tabela 12

Condição de armazenamento	5 °C
Formulações	Formulação A2 Sem L-metionina
Tempo (semanas)	0	4	8	12
pH	5,7	5,7	5,7	NT¹
Concentração (mg/mL) (A280 nm)	53,6	54,3	54,0	NT
Turvação (A350 nm)	0,132	0,135	0,132	NT
UPSEC
Espécies de peso molecular alto (%)	1,06	1,13	1,8	NT
Picos de peso molecular baixo (%)	0,05	0,06	0,07	NT
Monômero (%)	98,9	98,8	98,8	NT
HP-IEX

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Condição de armazenamento	5 °C
Formulações	Formulação A2 Sem L-metionina
Tempo (semanas)	0	4	8	12
Variantes ácidas (%)	21,94	23,20	22,97	NT
Variantes básicas (%)	8,67	8,94	11,95	NT
Principal (%)	69,4	67,8	65,1	NT
Mapeamento de peptídeo
% de oxidação de LC-M4	0,1	NT	NT	NT
% de oxidação de HC-M34	0,3	NT	NT	NT
% de oxidação de HC-M250	2,3	NT	NT	NT
% de oxidação de HC-M426	1,1	NT	NT	NT

Tabela 13:

Condição de armazenamento	25 °C
Formulações	Formulação 1 Com L-Metionina
Tempo (semanas)	0	4	8	12
pH	5,7	5,7	5,7	NT
Concentração (mg/mL) (A280 nm)	54,8	54,6	53,8	NT
Turvação (A350 nm)	0,135	0,139	0,143	NT
UPSEC
Espécies de peso molecular alto (%)	1,07	1,20	1,24	1,22
Picos de peso molecular baixo (%)	0,06	0,14	0,23	0,18
Monômero (%)	98,9	98,7	98,5	98,6
HP-IEX
Variantes ácidas (%)	21,79	23,48	26,53	28,85

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Condição de armazenamento	25 °C
Formulações	Formulação 1 Com L-Metionina
Tempo (semanas)	0	4	8	12
Variantes básicas (%)	10,79	8,95	11,94	11,79
Principal (%)	67,4	67,6	61,5	59,4
Mapeamento de peptídeo
% de oxidação de LC-M4	0,1	NT	NT	NT
% de oxidação de HC-M34	0,3	NT	NT	NT
% de oxidação de HC-M250	2,3	NT	NT	NT
% de oxidação de HC-M426	0,8	NT	NT	NT

Tabela 14

Condição de armazenamento	25 °C
Formulações	Formulação A2 Sem L-Metionina
Tempo (semanas)	0	4	8	12
pH	5,7	5,8	5,8	NT
Concentração (mg/mL) (Azso nm)	53,6	54,8	54,2	NT
Turvação (A350 nm)	0,132	0,142	0,142	NT
UPSEC
Espécies de peso molecular alto (%)	1,06	1,24	1,33	1,30
Picos de peso molecular baixo (%)	0,05	0,14	0,25	0,17
Monômero (%)	98,9	98,6	98,4	98,5
ΗΡ-ΙΕΧ
Variantes ácidas (%)	21,94	25,28	26,91	29,69
Variantes básicas (%)	8,67	10,97	11,91	12,01

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Condição de armazenamento	25 °C
Formulações	Formulação A2 Sem L-Metionina
Tempo (semanas)	0	4	8	12
Principal (%)	69,4	63,8	61,2	58,3
Mapeamento de peptídeo
% de oxidação de LC-M4	0,1	NT	NT	NT
% de oxidação de HC-M34	0,3	NT	NT	NT
% de oxidação de HC-M250	2,3	NT	NT	NT
% de oxidação de HC-M426	1,1	NT	NT	NT

Tabela 15

Condição de armazenamento	40 °C
Formulações	Formulação Al Com L-Metionina
Tempo (semanas)	0	4	8	12
pH	5,7	5,7	5,7	NT
Concentração (mg/mL) (A280 nm)	54,8	54,8	54,2	NT
Turvação (A350 nm)	0,135	0,156	0,183	NT
UPSEC
Espécies de peso molecular alto (%)	1,07	1,22	1,29	1,64
Picos de peso molecular baixo (%)	0,06	0,53	0,96	2,32
Monômero (%)	98,9	98,2	97,7	96,0
ΗΡ-ΙΕΧ
Variantes ácidas (%)	21,79	36,96	49,35	61,09
Variantes básicas (%)	10,79	11,74	13,82	12,51
Principal (%)	67,4	51,3	36,8	26,4

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96/132

Condição de armazenamento	40 °C
Formulações	Formulação Al Com L-Metionina
Tempo (semanas)	0	4	8	12
Mapeamento de peptídeo
% de oxidação de LC-M4	0,1	NT	0,2	NT
% de oxidação de HC-M34	0,3	NT	0,4	NT
% de oxidação de HC-M250	2,3	NT	2,6	NT
% de oxidação de HC-M426	0,8	NT	1,0	NT

Tabela 16

Condição de armazenamento	40 °C
Formulações	Formulação A2 Sem L-Metionina
Tempo (semanas)	0	4	8	12
pH	5,7	5,8	5,8	NT
Concentração (mg/mL) (A280 nm)	53,6	54,9	54,2	NT
Turvação (A350 nm)	0,132	0,168	0,212	NT
UPSEC
Espécies de peso molecular alto (%)	1,06	1,37	1,54	1,62
Picos de peso molecular baixo (%)	0,05	0,58	1,04	2,27
Monômero (%)	98,9	98,1	97,5	96,1
ΗΡ-ΙΕΧ
Variantes ácidas (%)	21,94	38,15	51,39	62,84
Variantes básicas (%)	8,67	14,43	12,87	12,44
Principal (%)	69,4	47,4	35,7	24,7
Mapeamento de peptídeo

Petição 870190110273, de 29/10/2019, pág. 517/597

97/132

Condição de armazenamento	40 °C
Formulações	Formulação A2 Sem L-Metionina
Tempo (semanas)	0	4	8	12
% de oxidação de LC-M4	0,1	NT	0,2	NT
% de oxidação de HC-M34	0,3	NT	0,3	NT
% de oxidação de HC-M250	2,3	NT	5,0	NT
% de oxidação de HC-M426	1,1	NT	2,0	NT

Tabela 17

Formulação	Formulação Al Com L-Metionina
Estresse	T0	Congelamento- Descongelamento	Agitação¹	Fotoestabilidade (ICH)
ld	3d	0,2X	0,5X	IX
pH	5,7	5,8	5,8	5,8	5,7	5,7	5,7
Concentração (mg/mL) (A280 nm)	54,8	54,8	54,3	53,2	54,5	55,2	53,8
Turvação (A350 nm)	0,135	0,133	0,132	0,133	0,181	0,248	0,412
UPSEC
Espécies de peso molecular alto (%)	1,07	1,10	1,08	1,11	1,58	2,13	3,06
Picos de peso molecular baixo (%)	0,06	0,06	0,05	0,06	0,16	0,26	0,45
Monômero (%)	98,9	98,8	98,9	98,8	98,3	97,6	96,5
ΗΡ-ΙΕΧ
Variantes ácidas (%)	21,7	22,65	23,0	22,7	26,1	25,8	37,2

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98/132

	9		8	3	9	9	6
Variantes básicas (%)	10,79	11,50	10,84	11,15	20,75	20,48	30,92
Principal (%)	67,4	65,9	66,1	66,1	53,1	53,6	31,8
Mapeamento de peptídeo
% de oxidação de LC-M4	0,1	NT	NT	NT	0,3	0,4	0,8
% de oxidação de HC- M34	0,3	NT	NT	NT	0,4	0,4	0,4
% de oxidação de HC- M250	2,3	NT	NT	NT	10,7	18,8	31,6
% de oxidação de HC- M426	0,8	NT	NT	NT	7,2	13,7	25,8

Tabela 18

Formulação	Formulação Al Com L-Metionina
Estresse	TO	Congelamento- Descongelamento	Agitação¹	Fotoestabilidade (ICH)
Id	3d	0,2X	0,5X	IX
pH	5,7	NT	NT	NT	5,7	5,7	5,6
Concentração (mg/mL) (A280 nm)	53,6	NT	NT	NT	53,9	53,8	54,3
Turvação (A350 nm)	0,132	NT	NT	NT	0,187	0,272	0,466
UPSEC
Espécies de peso molecular alto (%)	1,06	NT	NT	NT	1,77	2,48	3,72
Picos de peso molecular	0,05	NT	NT	NT	0,16	0,28	0,61

Petição 870190110273, de 29/10/2019, pág. 519/597

99/132

baixo (%)
Monômero (%)	98,9	NT	NT	NT	98,1	97,3	95,9
HP-IEX
Variantes ácidas (%)	21,94	NT	NT	NT	27,81	32,36	38,17
Variantes básicas (%)	8,67	NT	NT	NT	22,05	29,06	34,19
Principal (%)	69,4	NT	NT	NT	50,1	38,6	27,6
Mapeamento de peptídeo
% de oxidação de LC-M4	0,1	NT	NT	NT	0,3	0,4	0,7
% de oxidação de HC- M34	0,3	NT	NT	NT	0,3	0,3	0,4
% de oxidação de HC- M250	2,3	NT	NT	NT	13,3	24,9	43,2
% de oxidação de HC- M426	1,1	NT	NT	NT	9,0	18,9	33,7

Resultados

[0240] Não houve nenhuma mudança mensurável na concentração de proteína entre as formulações para as condições e duração do estudo, como medido por absorbância de UV em 280 nm.

[0241] Não houve nenhuma mudança mensurável no pH entre as formulações para as condições testadas e a duração do estudo.

[0242] Dados de turvação (A350) são mostrados na Figura IA e Figura 1B. A 40 °C, ambas as formulações mostraram uma tendência de aumentar em turvação para o ponto no tempo de até 8 semanas. Para ambas as formulações, não houve nenhuma mudança substancial na turvação para o ponto no tempo de até 8 semanas a 25 °C e 5 °C. Como mostrado na Figura 2, a Formulação A2 exibiu um aumento levemente maior (mas compatível) na turvação para todas

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100/132 as condições de estresse de luz quando comparada à Formulação Al. O tratamento das amostras de Formulação Al para estresses de congelamentodescongelamento (até 5X) ou agitação (300 rpm, por até 3 dias) não mudou a turvação da amostra comparado às amostras de controle (TO). A Formulação A2 não foi submetida a estresses de congelamento-descongelamento ou agitação. Assim, a Formulação Al, contendo L-metionina é levemente preferível com base nos dados de turvação.

[0243] Como mostrado nas Figuras 3A, 3B, 4A e 4B, a análise de UP-SEC das amostras para determinar a porcentagem de HMW e a porcentagem de monômero indicaram que a 40 °C, ambas as formulações mostraram uma tendência de aumento em % de pico de HMW e % de pico de LMW (e uma diminuição consequente em % de pico de monômero) para o ponto no tempo de até 12 semanas. A 25 °C, ambas as formulações mostraram tendências similares, mas mudanças menores, quando comparadas a 40 °C. A 5 °C, nenhuma mudança substancial foi observada. Como mostrado na Figura 5, a formulação A2 mostra um aumento levemente maior, mas compatível em % de HMW (e diminuição levemente maior, mas compatível correspondente em % de monômero) para todas as condições de estresse de luz estudadas quando comparada à Formulação Al. O tratamento de amostras de Formulação Al para estresses de congelamento-descongelamento (até 5X) ou agitação (300 rpm, por até 3 dias) não mudou a % de HMW ou a % de monômero comparado às amostras de controle (T0) (ver Figura 5 e Figura 6). A Formulação A2 não foi submetida a estresses de congelamento-descongelamento ou agitação. Assim, a Formulação Al, contendo L-metionina, é levemente preferível com base nos dados de UP-SEC.

[0244] Como mostrado nas Figuras 7A, 7B, 8A, 8B, 9A e 9B, os dados de HPIEX indicam que a 40 °C, ambas as formulações mostraram uma tendência de

Petição 870190110273, de 29/10/2019, pág. 521/597

101/132 aumento em % de pico ácido e % de pico básico até o ponto no tempo de 12 semanas, junto com uma tendência correspondente de diminuição na % de pico principal. A 25 °C, ambas as formulações mostraram tendências similares, mas mudanças menores, quando comparadas a 40 °C. A 5 °C, nenhuma mudança substancial foi observada para a Formulação 1 ou Formulação 2, exceto para ponto no tempo de 8 semanas para a Formulação A2, onde um pequeno aumento na % de pico básico e pequena diminuição correspondente na % de pico principal foi observada. Esta tendência pode não ser confirmada no ponto no tempo de 12 semanas/5 °C visto que as amostras de Formulação A2 não foram testadas. Como mostrado nas Figuras 10 a 12, a Formulação A2 mostra um aumento levemente maior, mas compatível em % de picos ácidos e % de picos básicos (e diminuição levemente maior, mas compatível correspondente na % de pico principal) para todas as condições de estresse de luz, junto com uma diminuição correspondente na % de pico principal (quando comparado à Formulação Al). Também mostrado nas Figuras 10 a 12, o tratamento de amostras de Formulação Al para estresses de congelamento-descongelamento (até 5X) ou agitação (300 rpm, por até 3 dias) não mudou a % de pico ácido, % de pico básico ou % de pico principal comparadas às amostras de controle (T0) (Formulação 2 não foi submetida a estresses de congelamentodescongelamento ou agitação). Assim, a Formulação Al, contendo L-metionina, é levemente preferível com base nos dados de HP-IEX.

[0245] Anticorpos monoclonais frequentemente têm resíduos de metionina na região CDR e na região Fc que podem ser responsáveis pela oxidação sob estresse de luz. Para o anticorpo anti-CTLA4, LC-M4, HC-M34, HCM250 e HC-M426 podem ser responsáveis pela oxidação sob estresse de luz. Estudos de mapeamento de peptídeo foram realizados para determinar as mudanças no nível de oxidação destes resíduos durante exposição de 8 semanas

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102/132 a 40 °C ou tratamento com estresse de luz de ,2X/O,5X/1X ICH.

[0246] Os resultados dos estudos de mapeamento de peptídeo que mostram a porcentagem de oxidação em resíduos LC-M4, HC-M34, HC-M250 e HC-M426 são representados na Figura 13, Figura 14, Figura 15 e Figura 16 respectivamente.

[0247] Como mostrado nas Figuras 13 a 16, sob condições de estresse de luz existe uma oxidação aumentada de certos resíduos de metionina. Notavelmente, os resíduos HC-M250 e HC-M426 mostraram aumento significativo em níveis de oxidação durante o tratamento com estresse de luz de 0,5X e IX ICH em ambas as formulações. Entretanto, a presença de 10 mM de Lmetionina na Formulação Al resultou em menor aumento em níveis de oxidação de M250 e M426 quando comparada à Formulação A2 que não continha Lmetionina. Assim, a Formulação 1 (com L-Met) parecería levemente preferível com base nos dados de mapeamento de peptídeo.

[0248] Com base em uma comparação dos dados analíticos dos estudos acima, a formulação Al quando comparada à formulação Al exibiu (i) um aumento na turvação para todas as condições de estresse de luz, (ii) aumento mais baixo em níveis de agregado (% de HMW) para todas as condições de estresse de luz, (iii) diminuição levemente menor, mas compatível na % de pico principal para todas as condições de estresse de luz e (iv) aumento mais baixo em níveis de oxidação de resíduos HC M250 e HC M426 a seguir do estresse de luz.

EXEMPLO 2

Triagem do tampão da formulação do anticorpo anti-CTLA4

[0249] Este estudo compara a estabilidade de um anticorpo anti-CLTA4 compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo a SEQ ID NO: 88 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a SEQ ID NO: 48

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103/132 em dois tampões de formulação viáveis diferentes (L-histidina e acetato) na presença de sacarose, polisorbato 80 e L-metionina. Interações proteínaproteína (indicativo de estabilidade coloidal e térmica) das duas formulações foram medidas (em tampões de L-histidina e acetato como mostrado abaixo). Uma interação proteína-proteína repulsiva, como indicado por um parâmetro de interação de difusão positivo (Kd) valores (Kd>0), indica uma formulação estável com propensão baixa para agregação. A Kd para ambas as formulações em três pHs diferentes (pH 5, 5,5 e 6) foi medida pelo menos três vezes cada (N=3) para obter um desvio padrão. Com base nas interações proteína-proteína (dados não mostrados ou Fig Y), o anticorpo anti-CTLA4 é estável tanto no tampão Lhistidina quanto no de acetato através de uma faixa de pH de 5,0 a 6,0. Consequentemente, as duas formulações foram colocadas em estabilidade térmica adicional a 5 °C, 25 °C e 40 °C no pH 5,5.

[0250] Para avaliar a estabilidade das formulações, os efeitos dos estresses seguintes foram avaliados nas duas formulações anti-CTLA4 (tampão L-histidina e tampão de acetato):

(4) Estresse de luz (condições de ICH sob 0,2x ICH, 0,5x ICH, lx ICH).

[0251] Com base nos dados, o anticorpo anti-CTLA4 é estável tanto no tampão L-histidina quanto no tampão de acetato.

Materiais e Métodos

[0252] As formulações líquidas seguintes foram preparadas usando um

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104/132 anticorpo anti-CTLA4 tendo as seguintes CDRs: HCDR1 da SEQ ID NO: 35, HCDR2 da SEQ ID NO: 36, HCDR3 da SEQ ID NO: 37, LCDR1 da SEQ ID NO: 38, LCDR2 da SEQ ID NO: 39 e LCDR3 da SEQ ID NO: 40 em uma cadeia principal de IgGl. Cada formulação foi preenchida em 1 mL em frascos de vidro do Tipo 1 de 2 mL. Um total de 72 lotes cada para as duas formulações foi fabricado. A tabela abaixo lista as composições das duas formulações. Sacarose a 7 % (p/v) é adicionada como um estabilizante; PS-80 é um tensoativo que comunica estabilidade contra estresse induzido por agitação; e L-metionina é um antioxidante visto que ela reduziu a oxidação de metionina sob condições de estresse de luz (ver Exemplo 1 acima).

Tabela 19: Formulação

Número da formulação	Descrição
BI	Anticorpo anti-CTLA4 (50 mg/mL)	10 mM de tampão Lhistidina	7 % (p/v) Sacarose	0,02 % (p/v) polisorbato 80	10 mM de L-Met
B2	Anticorpo anti-CTLA4 (50 mg/mL)	10 mM de Acetato	7 % (p/v) Sacarose	0,02 % (p/v) polisorbato 80	10 mM de L-Met

[0253] Os frascos depois foram incubados em três condições de armazenamento diferentes: 5 °C (umidade ambiente), 25 °C (60 % de umidade relativa) e 40 °C (75 % de umidade relativa). Os dados foram coletados como segue:

Tabela 20: Cronograma para a Formulação BI

	Inicial	2 semanas	4 semanas	6 semanas	8 semanas	Congelamento Descongelamento	Agit. (300 RPM	ação )	Luz (ICH)
5C	X		X		X	X	X	X	X (0,2)	X (0,5)	X (D

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105/132

25C			X		X
40C		X	X	X	X

Tabela 21: Cronograma para a Formulação B2

	Inicial	2 semanas	4 semanas	6 semanas	8 semanas	Congelamento Descongelamento	Agitaç. (300 R	ão PM)	Luz (ICH)
5C	X		X		X				X (0,2)	X (0,5)	X (1)
25C			X		X
40C			X	X	X

[0254] Estudos de fotoestabilidade foram conduzidos usando formulações líquidas de 1 mL de Bl e B2 em frascos de vidro na temperatura ambiente sob 0,2X ICH; 0,5X ICH; e IX ICH.

[0255] Concentrações de proteína foram medidas usando-se absorbância de UV em 280 nm.

[0256] Amostras foram equilibradas até a temperatura ambiente e estudos de turvação (A350) foram conduzidos nas amostras em absorbância espectrofotométrica em 350 nm

[0257] Amostras foram avaliadas por cromatografia de exclusão por tamanho (SEC) quanto à pureza em que a porcentagem de monômero foi determinada, assim como as porcentagens de espécies de peso molecular alto (HMW) e picos de eluição tardios (espécies de LMW). Cromatografia de exclusão por tamanho de ultra desempenho (UP-SEC) foi realizada diluindo-se as amostras a 5,0 mg/mL em fase móvel (50 mM de fosfato de sódio, 450 mM de monocloridreto de arginina, pH 7,0). As amostras diluídas foram injetadas (6 pL) em uma UPLC equipada com uma coluna Waters BEH200 e um detector de UV. Proteínas na amostra foram separadas por tamanho e detectadas por absorção de UV em 280 nm.

[0258] Cromatografia de troca iônica foi realizada para avaliar a estabilidade química e para monitorar a mudança no perfil variante de carga com

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106/132 o passar do tempo. Um método de HPLC de troca iônica foi realizado usando uma coluna Dionex ProPac WCX-10 e um detector de UV em 280 nm. Amostras foram diluídas em água purificada e 80 pg foram injetados para análise. A fase móvel usada para a análise de IEX das amostras de estabilidade térmica foi um gradiente das seguintes fases móveis (fase móvel A: 20 mM de MOPS, pH 7,2; fase móvel B: 50 mM de fosfato de sódio, 60 mM de cloreto de sódio, pH 8,0). O ensaio é realizado usando um gradiente de fase móvel de 20 mM de MOPS, pH 7,2 a 50 mM de fosfato de sódio, 60 mM de NaCI, pH 8,0. A detecção de UV é realizada em 280 nm. Estes métodos são considerados equivalentes e os resultados são apresentados como porcentagens relativas com base na área total do cromatograma.

[0259] O mapeamento de peptídeo foi realizado por digestão de Lys-C. Amostras foram injetadas em Q Exactive em 30 uL/amostra. A análise de dados foi feita pelo software PinPoint.

[0260] Os resultados dos estudos são apresentados nas tabelas abaixo:

Tabela 22

Condição de armazenamento	5 °C
Formulações	Formulação BI (Tampão L-histidina)	Formulação B2 (Tampão de acetato)
Tempo (semanas)	0	4	8	0	4	8
pH	5,6	5,6	5,6	5,6	5,6	5,6
Concentração (mg/mL) (A280 nm)	48,5	48,9	49,5	49,2	48,9	49,5
Turvação (A350 nm)	0,071	0,069	0,068	0,068	0,071	0,067
HPSEC
Espécies de peso molecular alto (%)	1,17	1,20	1,24	1,15	1,19	1,17

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107/132

Picos de peso molecular baixo (%)	ND	ND	0,01	ND	ND	ND
Monômero (%)	98,8	98,8	98,8	98,8	98,8	98,8
HP-IEX
Variantes ácidas (%)	13,15	13,11	13,25	13,05	13,07	13,12
Variantes básicas (%)	12,65	12,75	12,71	12,74	12,81	12,79
Principal (%)	74,2	74,1	74,0	74,2	74,1	74,1
Mapeamento de peptídeo
% de oxidação de LC-M4	0,1	NT	NT	0,1	NT	NT
% de oxidação de HC-M34	0,2	NT	NT	0,2	NT	NT
% de oxidação de HC-M250	1,2	NT	NT	1,3	NT	NT
% de oxidação de HC-M426	0,6	NT	NT	0,6	NT	NT

Tabela 23

Condição de armazenamento	25 °C
Formulações	Formulação Bl (Tampão L-histidina)	Formulação B2 (Tampão de acetato)
Tempo (semanas)	0	4	8	0	4	8
pH	5,6	5,6	5,6	5,6	5,6	5,6
Concentração (mg/mL) (A280 nm)	48,5	49,1	49,2	49,2	49,0	49,5
Turvação (A350 nm)	0,071	0,071	0,074	0,068	0,069	0,073
HPSEC
Espécies de peso molecular alto (%)	1,17	1,28	1,34	1,15	1,29	1,33
Picos de peso molecular baixo (%)	ND	0,06	0,12	ND	0,06	0,11

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108/132

Monômero (%)	98,8	98,7	98,6	98,8	98,7	98,6
HP-IEX
Variantes ácidas (%)	13,15	15,10	17,50	13,05	15,73	18,77
Variantes básicas (%)	12,65	13,39	13,87	12,74	13,41	13,96
Principal (%)	74,2	71,5	68,6	74,2	70,9	67,3
Mapeamento de peptídeo
% de oxidação de LC-M4	0,1	NT	NT	0,1	NT	NT
% de oxidação de HC-M34	0,2	NT	NT	0,2	NT	NT
% de oxidação de HC-M250	1,2	NT	NT	1,3	NT	NT
% de oxidação de HC-M426	0,6	NT	NT	0,6	NT	NT

Tabela 24

Condição de armazenamento	40 °C
Formulações	Formulação Bl (Tampão L-histidina)	Formulação B2 (Tampão de acetato)
Tempo (semanas)	0	4	8	0	4	8
pH	5,6	5,6	5,6	5,6	5,6	5,6
Concentração (mg/mL) (A280 nm)	48,5	48,7	49,3	49,2	48,8	49,4
Turvação (A350 nm)	0,071	0,081	0,101	0,068	0,085	0,094
HPSEC
Espécies de peso molecular alto (%)	1,17	1,34	1,47	1,15	1,42	1,60
Picos de peso molecular baixo (%)	ND	0,65	1,47	ND	0,58	1,38
Monômero (%)	98,8	98,0	97,0	98,8	98,0	97,0
HP-IEX

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109/132

Variantes ácidas (%)	13,15	29,60	44,85	13,05	32,83	49,48
Variantes básicas (%)	12,65	15,77	15,55	12,74	15,03	14,74
Principal (%)	74,2	54,6	39,6	74,2	52,1	35,8
Mapeamento de peptídeo
% de oxidação de LC-M4	0,1	NT	0,1	0,1	NT	0,1
% de oxidação de HC-M34	0,2	NT	0,2	0,2	NT	0,2
% de oxidação de HC-M250	1,2	NT	1,4	1,3	NT	1,7
% de oxidação de HC-M426	0,6	NT	0,7	0,6	NT	0,7

Tabela 25

Formulações	Formulação Bl (Tampão L-histidina)
Estresse	TO	Congelam -entoDescongel a-mento	Agitação	Fotoestabilidade (ICH)
Id	3d	0,2X	0,5X	IX
pH	5,6	5,6	5,6	5,6	5,6	5,6	5,5
Concentração (mg/mL) (A280 nm)	48,5	49,6	49,0	49,4	49,2	49,2	49,6
Turvação (A350 nm)	0,07 1	0,069	0,06 7	0,07	0,08 1	0,13 7	0,19 3
HPSEC
Espécies de peso molecular alto (%)	1,17	1,19	1,20	1,20	1,62	2,00	3,01
Picos de peso molecular baixo (%)	ND	ND	ND	0,01	0,02	0,07	0,16
Monómero (%)	98,8	98,8	98,8	98,8	98,4	97,9	96,8

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HP-IEX
Variantes ácidas (%)	13,1 5	13,29	13,1 9	13,3 0	15,5 3	18,3 6	23,6 6
Variantes básicas (%)	12,6 5	12,91	12,7 5	12,8 9	19,7 0	25,8 5	34,2 2
Principal (%)	74,2	73,8	74,1	73,8	64,8	55,8	42,1
Mapeamento de peptídeo
% de oxidação de LC-M4	0,1	NT	NT	NT	0,2	0,3	0,6
% de oxidação de HC-M34	0,2	NT	NT	NT	0,3	0,3	0,4
% de oxidação de HC-M250	1,2	NT	NT	NT	6,2	11,5	22,7
% de oxidação de HC-M426	0,6	NT	NT	NT	4,6	8,8	18,8

Tabela 26

Formulações	Formulação B2 (Tampão de acetato)
Estresse	T0	Congelamento Descongelam ento	Agitação	Fotoestabilidad e (ICH)
ld	3d	0,2X	0,5X	IX
pH	5,6	5,6	5,6	5,6	5,6	5,6	5,6
Concentração (mg/mL) (A280 nm)	49,1 8	49,4	49,1	48,8	49,0	49,1	49,6
Turvação (A350 nm)	0,06 8	0,066	0,06 6	0,06 9	0,07 5	0,09 5	0,11 0
HPSEC
Espécies de peso molecular alto (%)	1,15	1,18	1,16	1,16	2,00	3,12	4,69

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111/132

Picos de peso molecular baixo (%)	ND	ND	ND	ND	0,02	0,09	0,17
Monômero (%)	98,8	98,8	98,8	98,8	98,0	96,8	95,1
HP-IEX
Variantes ácidas (%)	13,0 5	13,17	13,1 6	13,1 5	14,3 0	16,3 9	18,3 3
Variantes básicas (%)	12,7 4	13,12	12,8 9	12,7 0	22,0 7	30,8 7	39,9 3
Principal (%)	74,2	73,7	74,0	74,1	63,6	52,7	41,7
Mapeamento de peptídeo
% de oxidação de LC-M4	0,1	NT	NT	NT	0,3	0,5	0,8
% de oxidação de HC-M34	0,2	NT	NT	NT	0,3	0,4	0,5
% de oxidação de HC-M250	1,3	NT	NT	NT	7,9	16,0	29,1
% de oxidação de HC-M426	0,6	NT	NT	NT	6,2	12,5	26,1

[0261] Não houve nenhuma mudança mensurável na concentração de proteína entre as formulações para as condições e duração do estudo, como medido por absorbância de UV em 280 nm.

[0262] Não houve nenhuma mudança mensurável no pH entre as formulações para as condições testadas e a duração do estudo.

[0263] Dados de turvação (A350) são mostrados na Figura 17A, Figura 17B e Figura 18. Durante a comparação dos dados, foi descoberto que a 40 °C, ambas as formulações mostraram uma tendência de aumento na turvação para o ponto no tempo de até 8 semanas. A 25 °C e 5 °C, ambas as formulações não mostraram nenhuma mudança substancial na turvação para o ponto no tempo de até 8 semanas. Como mostrado na Figura 14 também foi observado que a formulação BI mostrou um aumento levemente maior, mas compatível na turvação a seguir das condições de estresse de luz (0,5X ICH e IX ICH) quando comparada à

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Formulação B2. O tratamento de amostras para estresses de congelamentodescongelamento (até 5X) ou agitação (300 rpm, por até 3 dias) não mudou a turvação da amostra comparadas às amostras de controle (TO).

[0264] Como mostrado nas Figuras 19A, 19B, 20A e 20B, a análise de UPSEC das amostras para determinar a porcentagem de HMW e a porcentagem de monômero indicou que a 40 °C ambas as formulações mostraram uma tendência de aumento em % de pico de HMW e % de pico de LMW (e uma diminuição consequente em % de pico de monômero) para o ponto no tempo de até 8 semanas. A 25 °C, ambas as formulações mostraram tendências similares, mas mudanças menores, quando comparadas a 40 °C. A 5 °C, nenhuma mudança substancial foi observada. Como mostrado nas Figuras 21 e 22, a Formulação B2 mostra um aumento levemente maior (mas compatível) em % de HMW (e diminuição levemente maior, mas compatível correspondente em % de monômero) para todas as condições de estresse de luz estudadas quando comparada à Formulação Bl. O tratamento de amostras para estresses de congelamento-descongelamento (até 5X) ou agitação (300 rpm, por até 3 dias) não mudou a % de HMW ou a % de monômero comparadas às amostras de controle (T0) (Figuras 21 e 22)

[0265] Como mostrado nas Figuras 23A, 23B, 24A, 24B, 25A e 25B, os dados de HP-IEX indicam que a 40 °C, ambas as formulações mostraram uma tendência de aumento em % de pico ácido e % de pico básico no ponto no tempo de até 8 semanas, junto com uma tendência correspondente de diminuição na % de pico principal. Entretanto, a Formulação B2 mostrou uma diminuição levemente maior, mas compatível de % de pico principal quando comparada à Formulação Bl. A 25 °C, ambas as formulações mostraram tendências similares, mas mudanças menores, quando comparadas a 40 °C. Como mostrado nas Figuras 26, 27 e 28, a seguir das condições de estresse de luz (0,5X ICH e IX ICH), a

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Formulação Bl mostra um aumento levemente maior, mas compatível em % de picos ácidos, enquanto a Formulação B2 mostra um aumento levemente maior (mas compatível) em % de picos básicos. Entretanto, a diminuição correspondente em % de pico principal foi comparável para as duas formulações. 0 tratamento de amostras para estresses de congelamento-descongelamento (até 5X) ou agitação (300 rpm, por até 3 dias) não mudou a % de pico ácido, % de pico básico ou % de pico principal comparado às amostras de controle (TO) (Figuras 26 a 28).

[0266] Estudos de mapeamento de peptídeo foram realizados para determinar as mudanças no nível de oxidação destes resíduos durante a exposição de 8 semanas a 40 °C ou tratamento de estresse de luz ,2X/O,5X/1X ICH.

[0267] Os resultados dos estudos de mapeamento de peptídeo mostrando a porcentagem de oxidação em resíduos LC-M4, HC-M34, HC-M250 e HC-M426 são representados na Figura 29, Figura 30, Figura 31 e Figura 32 respectivamente.

[0268] Como mostrado nas Figuras 29 a 32, sob condições de estresse de luz houve oxidação aumentada de certos resíduos de metionina. Notavelmente, resíduos HC-M250 e HC-M426 mostraram aumento significativo em níveis de oxidação durante o tratamento com estresse de luz de 0,5X e IX ICH em ambas as formulações. Entretanto, a Formulação Bl resultou em menor aumento em níveis de oxidação de M250 e M426 quando comparada à Formulação B2.

[0269] Com base em uma comparação dos dados analíticos dos estudos acima, a formulação Bl (tampão L-histidina) quando comparada à formulação B2 (tampão de acetato) exibiu (i) aumento mais baixo em níveis de agregado (% de HMW) para todas as condições de estresse de luz, (ii) diminuição levemente menor, mas compatível na % de pico principal a 40 C e (iii) aumento mais baixo

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114/132 em níveis de oxidação de resíduos HC M250 e HC M426 a seguir do estresse de luz. Consequentemente, com base nos dados de interação proteína-proteína e nos dados de estabilidade, é mostrado que o anticorpo anti-CTLA4 é estável tanto no tampão L-histidina quanto no tampão de acetato.

EXEMPLO 3

Co-Formulação de um anticorpo anti-CTLA4 e um anticorpo anti-PD-1.

[0270] A co-formulação de dois anticorpos em uma única formulação é mais conveniente para pacientes e aumenta a complacência do paciente. Com base nas interações proteína-proteína (mostradas abaixo), todas as coformulações (mostradas abaixo) foram descobertas ser estáveis através do pH 5,0 a 6,0. Consequentemente, três co-formulações (P1C1, P1C2 e P2C1) em pH 5,5 foram escolhidas e colocadas em estabilidade térmica adicional a 5 °C, 25 °C e 40 °C junto com os dois controles (anti-PDl e anti-CTLA4).

[0271] Este estudo avalia a estabilidade de um anticorpo anti-CLTA4 tendo as seguintes CDRs: HCDR1 da SEQ ID NO: 35, HCDR2 da SEQ ID NO: 36, HCDR3 da SEQ ID NO: 37, LCDR1 da SEQ ID NO: 38, LCDR2 da SEQ ID NO: 39 e LCDR3 da SEQ ID NO: 40 em uma cadeia principal de IgGl co-formulada com pembrolizumabe em várias concentrações como segue:

TABELA 27

Coformulações	Razão de	Pembro	Anticorpo	Concentração
Pembrolizumabe/		anti-CTLA4	total
Anti-CTLA4 (p/p)
P2C1	2:1	25 mg/mL	12,5 mg/mL	37,5 mg/mL
P1C1	1:1	25 mg/mL	25 mg/mL	50 mg/mL
P1C2	1:2	25 mg/mL	50 mg/mL	75 mg/mL
P1C10	1:10	22,72 mg/mL	2,3 mg/mL	25 mg/mL

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115/132

P10C1	1:10	2,27 mg/mL	22,7 mg/mL	25 mg/mL
PI (Controle)	1:0	25 mg/mL	Nenhum	25 mg/mL
Cl (Controle)	0:1	Nenhum	50 mg/mL	50 mg/mL
25/200	8:1	23,5 mg/mL	2,9 mg/mL	26,4 mg/mL
75/200	8:3	21,1 mg/mL	7,9 mg/mL	29,0 mg/mL

[0272] As formulações foram preparadas como formulações líquidas como segue:

Tabela 28

Formulação	Tampão	\|\|\|\|\|	Crioprotetor/Modificador de tonicidade	Tensoativo	Antioxidante
P2C1	L-Histidina (10 mM)	5, 5,5, 6	Sacarose (7 %)	PS-80 (0,02 %)	10 mM de L- Met
P1C1	L-Histidina (10 mM)	5, 5,5, 6	Sacarose (7 %)	PS-80 (0,02 %)	10 mM de L- Met
P1C2	L-Histidina (10 mM)	5, 5,5, 6	Sacarose (7 %)	PS-80 (0,02 %)	10 mM de L- Met
P1C10	L-Histidina (10 mM)	5, 5,5, 6	Sacarose (7 %)	PS-80 (0,02 %)	10 mM de L- Met
P10C1	L-Histidina (10 mM)	5, 5,5, 6	Sacarose (7 %)	PS-80 (0,02 %)	10 mM de L- Met
PI (Controle)	L-Histidina (10 mM)	5, 5,5, 6	Sacarose (7 %)	PS-80 (0,02 %)	10 mM de L- Met
Cl (Controle)	L-Histidina (10 mM)	5, 5,5, 6	Sacarose (7 %)	PS-80 (0,02 %)	10 mM de L- Met

[0273] Cada formulação foi preenchida em 1 mL em frascos 2R. A estabilidade foi medida por inspeção visual, turvação por PD350, concentração de proteína, Imagiologia de Microfluxo (MFI) (avaliação de particulados), cromatografia de exclusão por tamanho de modo misto (SEC) (avaliação da agregação), clEF (avaliação de variantes de carga), IEX (avaliação de variantes de

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116/132 carga) e UP-SEC (avaliação de agregação). Porque anti-CTLA4 e anti-PDl são coeluídos em UP-SEC, para a co-formulação, anti-PDl e anti-CTLA4 foram separados por SEC de modo misto para avaliar a estabilidade da co-formulação. A co-formulação em pH 5,5 foi usada nos estudos de estabilidade térmica. O protocolo de estabilidade térmica é como segue:

Tabela 29

	T0	1 mês	3 meses	6 meses	9 meses	12 meses	Extra
5 °C (umidade ambiente)	3 combo+ 2 mono	3 combo+ 2 mono	3 combo+ 2 mono	3 combo+ 2 mono	3 combo	3 combo+ 2 mono	9 combo+ 9 mono
25 °C (60 % de umidade relativa)	3 combo+ 2 mono	3 combo+ 2 mono	3 combo+ 2 mono	3 combo	3 combo+ 2 mono	N/A
40 °C (75 % de umidade relativa)	3 combo+ 2 mono	3 combo+ 2 mono	3 combo+ 2 mono	N/A	N/A	N/A

[0274] Interações proteína-proteína, que são indicativas de estabilidade coloidal e térmica, das diferentes co-formulações foram medidas (3 coformulações e 2 controles). Uma interação proteína-proteína repulsiva, como indicado por um parâmetro de interação de difusão positivo (Kd) valor de Kd >0 indica uma formulação estável com propensão baixa para agregação. A Kd para todas as formulações aqui em valores de pH diferentes (pH 5,0, 5,5 e 6,0) foi medida pelo menos três vezes para obter um desvio padrão. Como mostrado na

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Figura 33, as combinações P1C1, P2C2 e P1C2 são estáveis em cada um dos três valores de pH visto que todas as co-formulações têm valores de Kd positivos. Pembrolizumabe (PD1) e combinações ricas em pembrolizumabe (P2C1) são mais estáveis em pH de 5,0 quando comparadas a combinações ricas em CTLA4 (P1C2). As combinações ricas em CTLA4 (P1C2) são igualmente estáveis em pH 5,0 e pH 5,5. Isto é, co-formulações com uma maior fração de pembrolizumabe são mais estáveis em um pH de 5,0 quando comparadas a co-formulações com uma maior fração de CTLA4, que são igualmente estáveis em pH 5,0 e 5,5.

Resultados de estabilidade de 12 meses

[0275] Em doze meses, não foi observada muita mudança na concentração total de proteína (determinada por UV 280) em qualquer condição (dados não mostrados).

[0276] Mudanças de turvação: Mudanças de turvação foram observadas por até 12 meses na ordem seguinte: 5 °C < 25 °C < 40 °C para cada formulação. A taxa de mudança de turvação a 40 °C para dados de até 6 meses pareceu diretamente proporcional à concentração total de proteína em cada formulação, (dados não mostrados).

[0277] O número de particulados (medido por MFI) em toda a formulação em todas as condições parece bastante baixo (dados não mostrados). Imagiologia de Microfluxo (MFI) foi usada para caracterizar as amostras coformuladas. Um mililitro de amostra é removido em uma ponta de pipeta e suavemente bombeado (0,17 mL/min) através de uma célula de fluxo (150 micron de profundidade de campo) de um sistema microscópico para garantir a contagem de partículas e captura de imagem de partículas por uma câmera digital. Conforme as amostras passam através da célula de fluxo, imagens de campo luminoso são capturadas em tempo real em sucessão contínua. A produtividade no final da análise, é a contagem de partículas e dados de

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118/132 concentração de partículas. Imagens MFI também podem ser processadas usando o software do sistema para diferentes parâmetros morfológicos, tais como tamanho, intensidade, transparência e forma.

[0278] Para cada um dos anticorpos anti-PD-1 e anti-CTLA4, um aumento em % de variantes de carga ácida, indicativo de desamidação, para cada anticorpo foi observado em temperaturas mais altas (25° e 40 °C). Um método de HPLC de troca iônica foi realizado usando uma coluna Dionex ProPac WCX-10 e um detector de UV em 280 nm. Amostras foram diluídas em água purificada e 80 pg foram injetados para análise. A fase móvel usada para a análise de IEX das amostras de estabilidade térmica foi um gradiente das seguintes fases móveis (fase móvel A: 24 mM de MÊS, pH 6, 4 % de acetonitrila; fase móvel B: 20 mM de NaPO4, 95 mM de NaCI, pH 8, 4 % de acetonitrila). Um sumário dos dados de clEF normalizados (inicial, 3 e 6 meses) é listado abaixo:

Tabela 30

Amostra	aPDl ácido	aPDl Principal	aPDl básico	aCTLA ácido	aCTLA principal	aCTLA básico
P2C1	inicial	20,83	66,99	12,18	19,84	75,13	5,03
P1C1	inicial	20,24	66,38	13,38	19,59	75,26	5,15
P1C2	inicial	18,10	67,84	14,06	18,86	75,77	5,37
PI	inicial	23,70	63,24	13,07
C1H	inicial				20,12	73,70	6,18
P2C1	3M5C	21,18	65,94	12,88	16,07	78,16	5,77
P1C1	3M5C	20,22	66,79	12,98	24,71	68,71	6,59
P1C2	3M5C	18,51	68,83	12,66	17,06	77,63	5,30
PI	3M5C	24,12	63,15	12,73
C1H	3M5C				28,13	65,33	6,54

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119/132

P2C1	3M25C	25,44	62,77	11,79	24,03	69,51	6,46
P1C1	3M25C	24,15	64,99	10,86	24,35	69,31	6,34
P1C2	3M25C	24,63	65,60	9,77	29,18	64,52	6,30
Pl	3M25C	28,97	60,41	10,62
C1H	3M25C				27,23	65,63	7,14
P2C1	3M40C	59,56	36,14	4,30	23,94	39,68	36,38
P1C1	3M40C	59,24	36,22	4,54	62,92	31,53	5,55
P1C2	3M40C	56,68	39,25	4,07	63,29	31,17	5,55
Pl	3M40C	43,81	50,20	5,99
C1H	3M40C				60,31	34,14	5,55
P2C1	6M5C	21,57	35,69	7,08	7,29	25,82	2,55
P1C1	6M5C	15,98	38,73	9,64	10,69	22,35	2,6
P1C2	6M5C	16,62	26,47	7,65	14,02	31,67	3,59
Pl	6M5C	36,84	49,21	13,94
C1H	6M5C				27,56	67,01	5,45
P2C1	6M25C	20,09	29,69	6,34	13,71	27,5	2,67
P1C1	6M25C	28,35	29,98	8,46	13,17	18,09	1,95
P1C2	6M25C	21,9	21,66	5,41	21	26,15	3,87
Pl	6M25C	45,43	46,07	8,52
C1H	6M25C				35,46	57,47	7,05
P2C1	6M40C	56,37	7,93	2,3	27,97	5,44	0
P1C1	6M40C	38,81	16,47	9,93	9,039	10,94	9,37
P1C2	6M40C	28,56	4,33	2,74	55,77	6,7	1,93
Pl	6M40C	83,33	12,15	4,53
C1H	6M40C				89,15	8	2,86

[0279] A agregação foi medida usando UPSEC e SEC de modo misto. Embora

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120/132 o anticorpo anti-CTLA4 e anti-PDl co-eluam em UP-SEC, eles são separados e visualizados pela SEC de modo misto. Agregados de HMW e agregados de LMW aumentaram com a temperatura. Os resultados de UP-SEC indicaram que a porcentagem muito baixa de espécies de agregados (% de HMW) foi detectada até 12 meses a 5 °C e 25 °C e não existe nenhuma mudança maior quando comparado ao ponto no tempo inicial.

Tabela 31

	% de HMW	% de LMW	% de Principal
Amostra	Valor inicial (T0)	Valor inicial (T0)	Valor inicial (T0)
C1H	0,93	0	99,07
PI	0,53	0	99,47
P1C2	1,12	0	98,88
P1C1	0,89	0	99,11
P2C1	0,73	0	99,27
Amostra	1M 5 °C	1M 25 °C	1M 40 °C	1M 5 °C	1M 25 °C	1M 40 °C	1M 5 °C	1M 25 °C	1M 40 °C
C1H	0,93	1,21	0,80	0,00	0,08	0,47	99,1	99,1	98,7
PI	0,48	0,56	0,63	0,00	0,00	0,00	99,5	99,5	99,4
P1C2	0,95	0,99	1,68	0,00	0,00	0,32	98,9	99,1	99,0
P1C1	0,71	0,79	1,33	0,00	0,00	0,24	99,1	99,3	99,2
P2C1	0,65	0,61	1,20	0,00	0,00	0,16	99,3	99,4	99,4
Amostra	3M 5 °C	3M 25 °C	3M 40 °C	3M 5 °C	3M 25 °C	3M 40 °C	3M 5 °C	3M 25 °C	3M 40 °C
C1H	0,82	0,84	1,32	0	0,15	1,21	99,18	99,01	97,46
PI	0,56	0,49	0,9	0	0	0,03	99,4	99,51	99,07
P1C2	0,84	1,2	2,04	0	0,16	0,95	99,16	98,64	97,07
P1C1	0,59	0,83	1,53	0	0	0,8	99,41	99,04	97,67
P2C1	0,52	0,52	0,98	0	0,02	0,37	99,48	99,45	98,65
Amostra	6M 5 °C	6M 25 °C	6M 40 °C	6M 5 °C	6M 25 °C	6M 40 °C	6M 5 °C	6M 25 °C	6M 40 °C

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121/132

C1H	0,68	0,71	0,77	0	0,3	1,5	99,32	99	97,74
PI	0,66	0,48	1,13	0	0	0	99,34	99,52	98,87
P1C2	0,66	0,9	1,87	0	0,15	1,29	99,34	98,95	96,83
P1C1	0,62	0,72	1,58	0	0	1	99,38	99,28	97,41
P2C1	0,58	0,62	1,25	0	0	0,67	99,42	99,38	98,08
Amostra	9M 5 °C	9M 25 °C	9M 40 °C	9M 5 °C	9M 25 °C	9M 40 °C	9M 5 °C	9M 25 °C	9M 40 °C
C1H	1,31	1,35	ND	0,08	0,77	ND	98,62	97,88	ND
PI	0,7	0,86	ND	0	0,07	ND	99,3	99,07	ND
P1C2	1,28	1,63	ND	0,09	0,54	ND	98,63	97,83	ND
P1C1	1,04	1,3	ND	0,08	0,43	ND	98,88	98,28	ND
P2C1	0,91	1,14	ND	0,08	0,34	ND	99,01	98,52	ND
Amostra	12M 5 °C	12M 25 °C	12M 40 °C	12M 5 °C	12M 25 °C	12M 40 °C	12M 5 °C	12M 25 °C	12M 40 °C
C1H	1,34	1,38	ND	0,09	0,94	ND	98,57	97,69	ND
PI	0,68	0,98	ND	0	0,09	ND	99,32	98,92	ND
P1C2	1,31	1,75	ND	0,07	0,72	ND	98,62	97,54	ND
P1C1	1,05	1,39	ND	0,06	0,54	ND	98,9	98,06	ND
P2C1	0,9	1,23	ND	0,06	0,44	ND	99,04	98,34	ND

[0280] SEC de modo misto foi usada para analisar os dois anticorpos na coformulação quanto aos agregados e espécies de oxidação. Os resultados são apresentados na tabela abaixo. Pembrolizumabe mostrou um aumento de espécies oxidadas 1 e 2 em temperaturas altas, refletindo a oxidação de M105 em um e dois braços, respectivamente. M105 está na CDR3 de pembrolizumabe. Um resíduo de metionina exposto ou um resíduo de metionina na CDR de um anticorpo tem o potencial de impactar a atividade biológica do anticorpo através de oxidação. Metionina reduz a oxidação de Metl05 dentro da CDR de cadeia pesada de pembrolizumabe. Mudanças menores em espécies de oxidação quando comparadas às iniciais indicam que a co-formulação é estável até 12 meses a 5 °C.

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122/132

Amostra	Anticorpo anti-CTLA4	Pembrolizumabe
% de HMW	Monômero	% de LMW	% de HMW	Metl05 (2 braços)	Metl05 (1 braço)	Monômero	% de LMW
P2C1 Inicial	0,4	98,7	0,9	0,0	6,2	1,3	92,4	0,00
P1C1 Inicial	0,4	98,7	0,9	0,0	5,6	1,4	93,0	0,00
P1C2 Inicial	0,5	98,6	0,9	0,0	4,3	1,4	94,2	0,00
PI Inicial	N/A	N/A	N/A	0,2	6,4	1,3	92,1	0,00
C1H Inicial	0,6	98,5	1,0	N/A	N/A	N/A	N/A	N/A
P2C1 12M/5C	0,9	99,1	0,0	0,0	8,6	4,6	86,8	0,00
P1C1 12M/5C	0,8	99,2	0,0	0,0	9,0	4,7	86,3	0,00
P1C2 12M/5C	0,9	99,1	0,0	0,0	9,6	4,8	85,6	0,00
PI 12M/5C	N/A	N/A	N/A	0,5	8,4	4,5	86,6	0,01
C1H 12M/5C	0,9	98,5	0,6	N/A	N/A	N/A	N/A	N/A

[0281] Com base nos dados de doze meses, os anticorpos, quando coformulados, comportaram-se bem em solução, similar à formulação de anticorpo única. A co-formulação é mostrada como sendo estável em pH 5,0 a 6,0 com interação proteína-proteína repulsiva como medido pelo parâmetro de interação de difusão de proteína kD, um indicador de estabilidade coloidal e térmica.

Exemplo 4

Co-Formulações Adicionais

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123/132

[0282] Este estudo avalia a estabilidade de um anticorpo anti-CLTA4 tendo as seguintes CDRs: HCDR1 da SEQ ID NO: 35, HCDR2 da SEQ ID NO: 36, HCDR3 da SEQ ID NO: 37, LCDR1 da SEQ ID NO: 38, LCDR2 da SEQ ID NO: 39 e LCDR3 da SEQ ID NO: 40 em uma cadeia principal de IgGl co-formulada com pembrolizumabe em várias concentrações como segue:

Tabela 32

Coformulações	Razão________de Pembrolizumabe/ Anti-CTLA4 (p/p)	Pembro	Anticorpo anti-CTLA4	Concentração total
25/200	8:1	23,5 mg/mL	2,9 mg/mL	26,4 mg/mL
75/200	8:3	21,1 mg/mL	7,9 mg/mL	29,0 mg/mL

[0283] As formulações foram preparadas como formulações líquidas como segue:

Tabela 33

Formulação	Tampão	pH	Crioprotetor/Modificador de tonicidade	Tensoativo	Antioxidante
25/200 A	L-Histidina (10 mM)	5,5	Sacarose (7 %)	PS-80 (0,02 %)	0
25/200 B	L-Histidina (10 mM)	5,5	Sacarose (7 %)	PS-80 (0,02 %)	1,6 mM
25/200 C	L-Histidina (10 mM)	5,5	Sacarose (7 %)	PS-80 (0,02 %)	10 mM
75/200 A	L-Histidina (10 mM)	5,5	Sacarose (7 %)	PS-80 (0,02 %)	0
75/200 B	L-Histidina (10 mM)	5,5	Sacarose (7 %)	PS-80 (0,02 %)	1,6 mM
75/200 C	L-Histidina (10 mM)	5,5	Sacarose (7 %)	PS-80 (0,02 %)	10 mM

[0284] As formulações foram colocadas em três condições de

Petição 870190110273, de 29/10/2019, pág. 544/597

124/132 armazenamento diferentes: 5 °C (umidade ambiente), 25 °C (60 % de umidade relativa) e 40 °C (75 % de umidade relativa). As formulações 75/200 também foram expostas a estresse de luz (0 ICH, 0,5x ICH ou lx ICH).

Resultados

[0285] Os resultados indicam que aumentar a concentração de metionina reduz os particulados subvisíveis em todas as condições, com base na medição de MFI (dados não mostrados). Aumentar a concentração de metionina diminuiu a % de espécies de HMW a 40 °C como observado por UP-SEC. Aumentar a concentração de metionina reduz levemente a turvação a 40 °C.

	Formulação 75/200 A	Formulação 75/200 B	Formulação 75/200 C
	3M, 5C	3M, 40C	3M 5C	3M 40C	3M 5C	3M40C
Pureza por % de UPSEC
Espécies de peso molecular alto (%)	1,10	2,70	1,07	2,41	1,07	2,25
Monômero (%)	98,8	96,7	98,9	97,0	98,9	97,1
Espécies de peso molecular baixo (%)	0,07	0,63	0,07	0,62	0,07	0,62
Variantes de carga por % de HP-IEX
Anti-PDl de variantes ácidas	20,5	59,1	20,3	58,4	19,9	58,1
Anti-PDl de principal total	56,4	29,3	56,6	29,6	56,6	29,6
Anti-PDl de variantes básicas	23,1	11,6	23,1	12,0	23,5	12,3
Anti-CTLA4 de variantes ácidas	14,8	60,5	14,9	59,2	14,9	59,1

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125/132

Anti-CTLA4 de principal total	75,5	30,2	75,2	30,8	75,4	31,0
Anti-CTLA4 de variantes básicas	9,8	9,3	9,9	10,0	9,7	9,9
pH	5,4	5,4	5,4	5,4	5,4	5,4
UVA350	0,065	0,105	0,067	0,097	0,065	0,090

Exemplo 5:

Estabilidade a longo prazo de Mono-formulação de CTLA4

[0286] A formulação líquida seguinte foi preparada usando um anticorpo anti-CTLA4 tendo as seguintes CDRs: 100 mg/mL do anticorpo anti-CTLA4, 10 mM de tampão L-histidina, 7 % p/v de Sacarose, 0,02 % p/v de Polisorbato 80, no pH 5,5. O produto foi dispensado em Vidro do Tipo I 2R com uma tampa elastomérica e selo de alumínio. O volume de enchimento foi 2,0 mL, com um enchimento em excesso de 0,2 mL. Amostras foram colocadas em estabilidade sob as condições seguintes:

(i) 5 °C/umidade ambiente (ii) 25 °C/60 % de umidade relativa (iii) 40 °C/75 % de umidade relativa

[0287] Amostras foram testadas inicialmente e nos meses 1, 3, 6, 9 e 12. Os resultados são apresentados nas tabelas seguintes:

Tabela 34

Petição 870190110273, de 29/10/2019, pág. 546/597

126/132

UPSEC
Espécies de peso molecular alto (%)	1,11	1,16	1,24	1,31	1,33	1,39
Monômero (%)	98,9	98,8	98,7	98,7	98,6	98,6
Espécies de peso molecular baixo (%)	< QL	< QL	< QL	< QL	< QL	< QL
Variantes de carga por % de HP-IEX
Variantes ácidas	15,42	15,46	15,00	15,71	15,79	15,96
Principal total	73,9	73,6	73,3	73,1	73,2	72,7
Variantes básicas	10,73	10,95	11,65	11,17	11,02	11,30
Pureza por % de CE- SDS não redutor	97,6	97,5	97,5	97,6	97,5	97,5
Pureza por % de CE- SDS redutor	96,7	96,7	96,8	96,0	97,2	96,2
pH	5,6	5,6	5,6	5,6	5,6	5,6
Concentração de proteína	52,3	52,7	53,2	53,3	52,0	52,3
UV A350	0,081	0,084	0,082	0,096	0,088	0,084
QL = Limite de quantificação (0,10 %) amostras de 6 meses coletadas 2 semanas antes do previsto.

Tabela 35

Petição 870190110273, de 29/10/2019, pág. 547/597

127/132

Espécies de peso molecular alto (%)	1,11	1,23	1,25	1,34	1,36	1,42
Monômero (%)	98,9	98,7	98,5	98,3	98,0	97,5
Espécies de peso molecular baixo (%)	< QL	< QL	0,30	0,39	0,69	1,05
Variantes de carga por % de HP-IEX
Variantes ácidas	15,42	16,92	20,74	26,70	33,41	38,97
Principal total	73,9	71,3	66,5	60,5	53,7	47,8
Variantes básicas	10,73	11,81	12,78	12,83	12,87	13,20
Pureza por % de CE- SDS não redutor	97,6	97,2	96,7	96,2	94,6	94,3
Pureza por % de CE- SDS redutor	96,7	96,6	96,2	95,5	94,9	94,7
pH	5,6	5,6	5,6	5,6	5,6	5,6
Concentração de proteína	52,3	52,8	53,4	52,8	52,3	51,9
UV A350	0,081	0,085	0,090	0,096	0,104	0,109
QL = Limite de quantificação (0,10 %) amostras de 6 meses coletadas 2 semanas antes do previsto.

Tabela 36

40 °C/75 % de umidade relativa
Atributo Medido	Ponto no tempo (meses)
	Inicial	1	3	6^C	9	12
Potência biológica por ELISA de ligação	95	89	100	91	95	89
Pureza por % de UPSEC
Espécies de peso molecular alto (%)	1,11	1,28	1,58	1,98	1,11	1,28

Petição 870190110273, de 29/10/2019, pág. 548/597

128/132

Monômero (%)	98,9	98,1	95,7	93,9	98,9	98,1
Espécies de peso molecular baixo (%)	< QL	0,59	2,75	4,12	< QL	0,59
Variantes de carga por % de HP-IEX
Variantes ácidas	15,42	33,50	60,13	79,20	15,42	33,50
Principal total	73,9	52,1	26,8	11,6	73,9	52,1
Variantes básicas	10,73	14,38	13,08	9,16	10,73	14,38
Pureza por % de CE- SDS não redutor	97,6	95,5	91,4	86,1	97,6	95,5
Pureza por % de CE- SDS redutor	96,7	94,8	91,8	86,3	96,7	94,8
pH	5,6	5,6	5,6	5,6	5,6	5,6
Concentração de proteína	52,3	52,9	53,4	53,0	52,3	52,9
UV A350	0,081	0,084	0,082	0,096	0,088	0,084
QL = Limite de quantificação (0,10 %) amostras de 6 meses coletadas 2 semanas antes do previsto.

Resultados:

[0288] Como mostrado nos dados acima, nenhuma mudança significativa foi observada quando a formulação foi armazenada a 5 °C. Espera-se que tal formulação seja estável por um período de 24 meses a 5 °C. A potência biológica da formulação como determinado por ELISA de ligação mostrou que sob todas as condições, nenhuma mudança significativa na potência foi observada. Não houve nenhuma mudança no pH como uma função de tempo ou condição de armazenamento.

[0289] A concentração de proteína das amostras sob todas as condições de armazenamento não mostrou nenhuma mudança significativa através de todas as três condições testadas até 12 meses em estabilidade.

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129/132

[0290] Variantes de carga (% de variantes ácidas, % de principal e % de variantes básicas) foram determinadas por HP-IEX. Para a condição a 5 °C, nenhuma mudança significativa foi observada durante os 12 meses. Para a condição a 25 °C, houve um aumento em % de variantes ácidas e uma diminuição na % de pico principal total, durante os 12 meses, com a % de variantes básicas permanecendo inalterada. Estes resultados não são inesperados considerando as condições de armazenamento. Para a condição a 40 °C, a % de pico principal total mostrou uma diminuição significativa do ponto no tempo inicial para o ponto no tempo de 6 meses, a % de variantes ácidas aumentou significativamente e a % de variantes básicas permaneceu inalterada. Estes resultados não são inesperados considerando as condições de armazenamento.

[0291] A pureza foi determinada por UP-SEC (% de espécies de HMW, % de monômero e % de espécies de LMW). Não existe nenhuma mudança na % de monômero ou na % de espécies de HMW até 12 meses de estabilidade a 5 °C. Nenhum pico foi detectado para as espécies de LMW para a condição a 5 °C durante os 12 meses. Para as condições de armazenamento a 25 °C, não houve nenhuma mudança nas espécies de HMW, uma diminuição leve na % de monômero e um aumento leve nas espécies de LMW durante os 12 meses. Na condição a 40 °C, existe um leve aumento em % de espécies de HMW até 6 meses e a % de monômero diminuiu abaixo de 85 % no ponto no tempo de 6 meses. Estes resultados não são inesperados dada a condição de armazenamento.

[0292] Não houve nenhuma mudança no pH como uma função do tempo ou condição de armazenamento.

EXEMPLO 6

Adição de quelante como excipiente opcional

[0293] A estabilidade de formulações na presença ou ausência de um quelante (DTPA) foi avaliada. Para avaliar a estabilidade das formulações, as duas

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130/132 formulações foram cheias em frascos e escalonadas em estabilidade a 5 °C (umidade ambiente), 25 °C (60 % de umidade relativa) e 40 °C (75 % de umidade relativa) - por doze semanas protegidos da luz. As duas formulações são como segue:

Número da formulação	Descrição
1	Anticorpo anti- CTLA4 (50 mg/mL)	10 mM de tampão L- histidina (pH=5,5)	7 % de sacarose (P/v)	10 mM de L-Met	0,02 % de PS80 (P/v)	NA
2	Anticorpo anti- CTLA4 (50 mg/mL)	10 mM de tampão L- histidina (pH=5,5)	7 % de sacarose (P/v)	10 mM de L-Met	0,02 % de PS80 (P/v)	20 uM de DTPA

[0294] A estabilidade coloidal das amostras foi avaliada por cromatografia de exclusão por tamanho (SEC) quanto à pureza em que a porcentagem de monômero foi determinada, assim como as porcentagens de espécies de peso molecular alto (HMW) e picos de eluição tardios (espécies de LMW). Os dados de UPSEC para avaliar os níveis de espécies de peso molecular alto (HMW ou agregados), % de monômero e LMW (espécies de peso molecular baixo) estão na Tabela abaixo.

Tabela 37

	% de HMW	% de LMW	% de principal
Formulação	Valor inicial (T0)	Valor inicial (T0)	Valor inicial (T0)
1	0,17	0,01	99,8
2	0,16	0,03	99,8
Amostra	2W 5 °C	2W 25 °C	2W 40 °C	2W 5 °C	2W 25 °C	2W 40 °C	2W 5 °C	2W 25 °C	2W 40 °C

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131/132

1	ND	ND	0,30	ND	ND	0,18	ND	ND	99,5
2	ND	ND	0,28	ND	ND	0,17	ND	ND	99,5
Amostra	4W 5 °C	4W 25 °C	4W 40 °C	4W 5 °C	4W 25 °C	4W 40 °C	4W 5 °C	4W 25 °C	4W 40 °C
1	0,19	0,29	0,35	0,01	0,06	0,38	99,8	99,7	99,3
2	0,17	0,26	0,33	0,03	0,07	0,35	99,8	99,7	99,8
Amostra	8W 5 °C	8W 25 °C	8W 40 °C	8W 5 °C	8W 25 °C	8W 40 °C	8W 5 °C	8W 25 °C	8W 40 °C
1	0,21	0,33	0,44	0,01	0,11	0,76	99,8	99,6	98,8
2	0,19	0,30	0,41	0,02	0,12	0,68	99,8	99,6	98,9
Amostra	12W 5 °C	12W 25 °C	12W 40 °C	12W 5 °C	12W 25 °C	12W 40 °C	12W 5 °C	12W 25 °C	12W 40 °C
1	0,28	0,44	0,82	0,5	0,25	2,12	99,7	99,3	97,1
2	0,29	0,42	0,68	0,04	0,23	1,79	99,7	99,3	97,5

[0295] Como mostrado na tabela acima, análise de UP-SEC das amostras para determinar a porcentagem de HMW e porcentagem de monômero indicou que a 5 °C, 25 °C e 40 °C, ambas as formulações mostraram uma tendência de aumento em % de pico de HMW e % de pico de LMW (e uma diminuição consequente em % de pico de monômero) para o ponto no tempo de até 12 semanas. A 25 °C, ambas as formulações mostraram tendências similares, mas mudanças menores, quando comparadas a 40 °C. A 5 °C, nenhuma mudança substancial foi observada. Com base nos dados, a Formulação 1 (nenhum DTPA) mostrou um leve aumento em % de HMW e % de LMW quando comparada à Formulação 2 (com DTPA). Além disso, a Formulação 1 mostrou uma maior diminuição de % de monômero quando comparada à Formulação 2.

[0296] A análise de HP-IEX das amostras para determinar a estabilidade

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132/132 química indicou que a 5 °C, 25 °C e 40 °C, ambas as formulações mostraram uma tendência de aumento em % de pico ácido e uma diminuição consequente em % de pico de monômero para o ponto no tempo de até 12 semanas. A 25 °C, ambas as formulações mostraram tendências similares, mas mudanças menores, quando comparadas a 40 °C. A 5 °C, nenhuma mudança substancial foi observada (dados não mostrados).

[0297] Os resultados na Tabela abaixo mostram uma tendência de descrever a concentração de PS80 com o tempo até o ponto no tempo de 8 semanas. A 25 °C, ambas as formulações mostraram tendências similares, mas mudanças menores, quando comparadas a 40 °C. A 5 °C, nenhuma mudança substancial foi observada. Menos degradação de PS80 foi observada na Formulação 2 (anti-CTLA4 com DTPA) quando comparada à Formulação 1 (anticorpo anti-CTLA4 sem DTPA) a 40 °C.


Polisorbato 80 conc. (mg/mL)	Form.	TO	4W	8W	4W	8W	2W	4W	8W
1	0,19	0,18	0,18	0,17	0,15	0,17	0,16	0,13
2	0,19	0,18	0,18	0,17	0,15	0,17	0,17	0,16

[0298] Assim, DTPA também pode fornecer estabilidade ainda maior para as formulações descritas aqui.

5 °C/umidade ambiente

Atributo Medido

Ponto no tempo (meses)

Potência biológica por ELISA de ligação

Pureza por % de

1. Uma formulação compreendendo:

(i) cerca de 10 mg/mL a cerca de 200 mg/mL de um anticorpo anti-CTLA4 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo;

(ii) cerca de 5 mM a cerca de 20 mM de tampão;

(iii) cerca de 6 % a cerca de 8 % em peso/volume (p/v) de açúcar nãoredutor;

(iv) cerca de 0,01 % a cerca de 0,10 % p/v de tensoativo não-iônico; e (v) cerca de 1 mM a cerca de 20 mM de antioxidante.

2. A formulação da reivindicação 1, em que o anticorpo anti-CTLA4 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende três CDRs de cadeia leve compreendendo CDRL1 da SEQ ID NO: 38, CDRL2 da SEQ ID NO: 39 e CDRL3 da SEQ ID NO: 40 e três CDRs de cadeia pesada compreendendo CDRH1 da SEQ ID NO: 35, CDRH2 da SEQ ID NO: 36 e CDRH3 da SEQ ID NO: 37.

3. A formulação da reivindicação 1 ou 2, em que o anticorpo anti-CTLA4 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo a SEQ ID NO: 88 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a SEQ ID NO: 48.

4. A formulação de qualquer uma das reivindicações 1-3, em que a formulação tem um pH entre 5,0 e 6,0.

5. A formulação de qualquer uma das reivindicações 1-4 em que o tampão é um tampão L-histidina, o açúcar não-redutor é sacarose, o tensoativo nãoiônico é polissorbato 80 e o antioxidante é L-metionina, a formulação compreendendo:

(ii) cerca de 5 mM a cerca de 20 mM de tampão L-histidina;

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2/8 (iii) cerca de 6 % a cerca de 8 % p/v de sacarose;

(iv) cerca de 0,01 % a cerca de 0,10 % p/v de polissorbato 80; e (v) cerca de 1 mM a cerca de 20 mM de L-metionina.

6. A formulação de qualquer da reivindicação 5, compreendendo cerca de 8 mM a cerca de 12 mM de tampão L-histidina.

7. A formulação de qualquer das reivindicações 5-6, compreendendo cerca de 5 mM a cerca de 10 mM de L-metionina.

8. A formulação de qualquer das reivindicações 5-7, compreendendo polissorbato 80 em uma razão em peso de aproximadamente 0,02 % p/v.

9. A formulação de qualquer das reivindicações 1-8, compreendendo cerca de 10 mg/mL a cerca de 100 mg/mL do anticorpo anti-CTLA4 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.

10. A formulação da reivindicação 9, em que a concentração do anticorpo anti-CTLA4 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é cerca de 10 mg/mL, 12,5 mg/mL, 25 mg/mL, 50 mg/mL, 75 mg/mL ou 100 mg/mL.

11. A formulação de qualquer das reivindicações 1-5, compreendendo cerca de 25 mg/mL do anticorpo anti-CTLA4,10 mM de tampão L-histidina, cerca de 7 % p/v de sacarose, cerca de 0,02 % de polissorbato 80 e cerca de 10 mM de L-metionina.

12. A formulação de qualquer das reivindicações 1-5, compreendendo cerca de 50 mg/mL do anticorpo anti-CTLA4,10 mM de tampão L-histidina, cerca de 7 % p/v de sacarose, cerca de 0,02 % de polissorbato 80 e cerca de 10 mM de L-metionina.

13. A formulação de qualquer das reivindicações 1-5, compreendendo cerca de 75 mg/mL do anticorpo anti-CTLA4,10 mM de tampão L-histidina, cerca de 7 % p/v de sacarose, cerca de 0,02 % de polissorbato 80 e cerca de 10 mM de L-metionina.

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3/8

14. A formulação de qualquer das reivindicações 1-5 compreendendo cerca de 100 mg/mL do anticorpo anti-CTLA4, 10 mM de tampão L-histidina, cerca de 7 % p/v de sacarose, cerca de 0,02 % de polissorbato 80 e cerca de 10 mM de Lmetionina.

15. Aformulação de qualquer das reivindicações 1-14, em que a formulação tem um pH de cerca de 5,3 a cerca de 5,8.

16. A formulação de qualquer da reivindicação 15, em que a formulação tem um pH de cerca de 5,5 a cerca de 5,6.

17. A formulação de qualquer das reivindicações 1-16, compreendendo ainda um anticorpo anti-PDl ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.

18. A formulação de qualquer das reivindicações 1-17, compreendendo ainda um quelante.

19. A formulação da reivindicação 18, em que o quelante é DTPA.

20. Aformulação de qualquer das reivindicações 1-19, em que a formulação é contida em um frasco de vidro ou um dispositivo de injeção.

21. Aformulação de qualquer da reivindicação 1-20, que é uma formulação líquida, que é congelada até pelo menos abaixo de -70°C, ou é uma solução reconstituída a partir de uma formulação liofilizada.

22. Aformulação de qualquer das reivindicações 1-21, em que depois de 12 meses a 5°C:

(i) a % de monômero do anticorpo anti-CTLA4 é > 95 % como determinado por cromatografia de exclusão por tamanho;

(ii) a % de cadeia pesada e cadeia leve do anticorpo anti-CTLA4 é > 90 % como medido por CE-SDS redutor;

(iii) a % de cadeia pesada e cadeia leve do anticorpo anti-CTLA4 é > 95 % como medido por CE-SDS redutor;

(iv) a % de IgG intacta do anticorpo anti-CTLA4 é > 90 % como medido por

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4/B

CE-SDS não redutor; e/ou (v) % de IgG Intacta do anticorpo anti-CTLA4 é > 95 % como medido por CESDS não redutor.

23. Uma formulação compreendendo:

(i) cerca de 1 mg/mL a cerca de 100 mg/mL de um anticorpo anti-CTLA4 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo;

(ii) cerca de 1 mg/mL a cerca de 100 mg/mL de um anticorpo anti-PDl ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo;

(iii) cerca de 5 mM a cerca de 20 mM de tampão;

(iv) cerca de 6 % a cerca de 8 % em peso/volume (p/v) de açúcar nãoredutor;

(v) cerca de 0,01 % a cerca de 0,10 % p/v de tensoativo não-iônico; e (vi) cerca de 1 mM a cerca de 20 mM de antioxidante.

24. A formulação da reivindicação 23, em que o tampão é um tampão Lhistidina, o açúcar não-redutor é sacarose, o tensoativo não-iônico é polissorbato 80 e o antioxidante é L-metionina, a formulação compreendendo:

(ii) cerca de 1 mg/mL a cerca de 100 mg/mL de um anticorpo anti-PDl humano ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo;

(iii) cerca de 5 mM a cerca de 20 mM de tampão L-histidina;

(iv) cerca de 6 % a cerca de 8 % p/v de sacarose;

(v) cerca de 0,01 % a cerca de 0,10 % p/v de polissorbato 80; e (vi) cerca de 1 mM a cerca de 20 mM de L-metionina.

25. A formulação da reivindicação 23 ou 24, em que o anticorpo anti-CTLA4 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende três CDRs de cadeia leve compreendendo CDRL1 da SEQ ID NO: 38, CDRL2 da SEQ ID NO: 39 e CDRL3

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5/8 da SEQ ID NO: 40 e três CDRs de cadeia pesada compreendendo CDRH1 da SEQ ID NO: 35, CDRH2 da SEQ ID NO: 36 e CDRH3 da SEQ ID NO: 37.

26. A formulação da reivindicação 23-25, em que o anticorpo anti-CTLA4 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo a SEQ ID NO: 88 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a SEQ ID NO: 48.

27. Aformulação de qualquer das reivindicações 23-26, em que o anticorpo anti-PD-1 humano ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende três CDRs de cadeia leve compreendendo CDRL1 da SEQ ID NO: 1, CDRL2 da SEQ ID NO: 2 e CDRL3 da SEQ ID NO: 3 e três CDRs de cadeia pesada compreendendo CDRH1 da SEQ ID NO: 6, CDRH2 da SEQ ID NO: 7 e CDRH3 da SEQ ID NO: 8.

28. Aformulação de qualquer das reivindicações 23-27, em que o anticorpo anti-PD-1 humano ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma região Vl que compreende a sequência de aminoácido apresentada na SEQ ID NO: 4 e uma região Vh que compreende a sequência de aminoácido apresentada na SEQ ID NO: 9.

29. A formulação de qualquer das reivindicações 23-28, em que a formulação compreende um anticorpo anti-PD-1 humano que é pembrolizumabe.

30. Aformulação da reivindicação 23-29, em que a razão do anticorpo antiPD1 para o anticorpo anti-CTLA4 é 1:2, 1:1, 2:1, 10:1, 1:10, 8:3 ou 8:1.

31. A formulação da reivindicação 30, em que a razão do anticorpo antiPD1 para o anticorpo anti-CTLA4 é 8:3.

32. A formulação da reivindicação 30, em que a razão do anticorpo antiPD1 para o anticorpo anti-CTLA4 é 8:1.

33. A formulação de qualquer das reivindicações 23-32, em que a formulação tem um pH entre 5,0 e 6,0.

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6/8

34. A formulação de qualquer das reivindicações 23-33, compreendendo cerca de 8 mM a cerca de 12 mM de tampão L-histidina.

35. A formulação de qualquer das reivindicações 23-34, compreendendo cerca de 5 mM a cerca de 10 mM de L-metionina.

36. A formulação de qualquer das reivindicações 23-35, compreendendo polissorbato 80 em uma razão em peso de aproximadamente 0,02 % p/v.

37. A formulação de qualquer uma das reivindicações 23-36, em que a concentração do anticorpo anti-CTLA4 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é cerca de 1,25 mg/mL, 2,5 mg/mL, 2,9 mg/mL, 5 mg/mL, 7,9 mg/mL, 10 mg/mL, 12,5 mg/mL, 25 mg/mL, 50 mg/mL, 75 mg/mL ou 100 mg/mL.

38. A formulação da reivindicação 37, em que a concentração do anticorpo anti-CTLA4 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é cerca de 7,9 mg/mL.

39. A formulação de qualquer das reivindicações 23-36, em que a concentração do anticorpo anti-PDl ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é cerca de 25 mg/mL, 22,7 mg/mL, 2,27 mg/mL, 21,1 mg/mL ou 23,5 mg/mL.

40. A formulação de qualquer das reivindicações 23-39, em que a concentração do anticorpo anti-CTLA4 é cerca de 7,9 mg/mL e a concentração do anticorpo anti-PDl é cerca de 21 mg/mL.

41. A formulação de qualquer das reivindicações 23-39, compreendendo cerca de 25 mg/mL do anticorpo anti-PDl e cerca de 12,5 mg/mL de anticorpo anti-CTLA4, 10 mM de tampão L-histidina, cerca de 7 % p/v de sacarose, cerca de 0,02 % p/v de polissorbato 80 e cerca de 10 mM de L-metionina.

42. A formulação de qualquer das reivindicações 23-39, compreendendo cerca de 25 mg/mL do anticorpo anti-PDl e cerca de 25 mg/mL de anticorpo anti-CTLA4, 10 mM de tampão L-histidina, cerca de 7 % p/v de sacarose, cerca

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V* de 0,02 % p/v de polissorbato 80 e cerca de 10 mM de L-metionina.

43. A formulação de qualquer das reivindicações 23-39, compreendendo cerca de 25 mg/mL do anticorpo anti-PDl e cerca de 50 mg/mL de anticorpo anti-CTLA4, 10 mM de tampão L-histidina, cerca de 7 % p/v de sacarose, cerca de 0,02 % p/v de polissorbato 80 e cerca de 10 mM de L-metionina.

44. A formulação de qualquer das reivindicações 23-39, compreendendo cerca de 22,72 mg/mL do anticorpo anti-PDl e cerca de 2,3 mg/mL de anticorpo anti-CTLA4, 10 mM de tampão L-histidina, cerca de 7 % p/v de sacarose, cerca de 0,02 % p/v de polissorbato 80 e cerca de 10 mM de L-metionina.

45. A formulação de qualquer das reivindicações 23-39, compreendendo cerca de 2,27 mg/mL do anticorpo anti-PDl e cerca de 22,7 mg/mL de anticorpo anti-CTLA4, 10 mM de tampão L-histidina, cerca de 7 % p/v de sacarose, cerca de 0,02 % p/v de polissorbato 80 e cerca de 10 mM de L-metionina.

46. A formulação de qualquer das reivindicações 23-39, compreendendo cerca de 23,5 mg/mL do anticorpo anti-PDl e cerca de 2,9 mg/mL de anticorpo anti-CTLA4, 10 mM de tampão L-histidina, cerca de 7 % p/v de sacarose, cerca de 0,02 % p/v de polissorbato 80 e cerca de 10 mM de L-metionina.

47. A formulação de qualquer das reivindicações 23-39, compreendendo cerca de 21,1 mg/mL do anticorpo anti-PDl e cerca de 7,9 mg/mL de anticorpo anti-CTLA4, 10 mM de tampão L-histidina, cerca de 7 % p/v de sacarose, cerca de 0,02 % p/v de polissorbato 80 e cerca de 10 mM de L-metionina.

48. A formulação de qualquer das reivindicações 23-47, compreendendo ainda um quelante.

49. A formulação da reivindicação 23-48, em que o quelante é DTPA.

50. A formulação de qualquer das reivindicações 23-49, em que a formulação é contida em um frasco de vidro ou um dispositivo de injeção.

51. A formulação de qualquer da reivindicação 23-50, que é uma

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8/8 formulação líquida ou que é congelada até pelo menos abaixo de -70 °C ou que é uma solução reconstituída a partir de uma formulação liofilizada.

52. Um método de tratar câncer ou infecção crônica em um paciente humano em necessidade do mesmo, o método compreendendo administrar uma quantidade eficaz da formulação de qualquer uma das reivindicações 1-51.

53. Uso da formulação de qualquer uma das reivindicações 1-51 para a preparação de um medicamento para tratar câncer ou para tratar infecção crônica.