KR20190142393A

KR20190142393A - 항-ctla4 항체 단독의, 및 프로그램화된 사멸 수용체 1 (pd-1) 항체와 조합된 항-ctla4 항체의 안정한 제제 및 그의 사용 방법

Info

Publication number: KR20190142393A
Application number: KR1020197035373A
Authority: KR
Inventors: 소우멘두 밧타차리아; 알납 데; 차크라바르티 나추 나라시만; 마노즈 케이. 샤르마; 샤오위 양; 루비 벌레이지; 제이슨 케이. 청
Original assignee: 머크 샤프 앤드 돔 코포레이션
Priority date: 2017-05-02
Filing date: 2018-05-01
Publication date: 2019-12-26
Also published as: BR112019022695A2; CN110678199A; AU2018263837A1; US20200262922A1; KR102624564B1; TN2019000294A1; EP3618866A4; CO2019012143A2; WO2018204343A1; CL2019003143A1; JP2023109942A; MA50501A; EP3618866A1; MX2019013034A; CA3060695A1; EA201992526A1; JP2020518598A; SG11201910134SA

Abstract

본 발명은 세포독성 T 림프구 연관 항원 4 (CTLA4)에 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하고, 임의적으로, 항-인간 프로그램화된 사멸 수용체 1 (PD-1) 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 추가로 함유하는 안정한 제제에 관한 것이다. 본 발명의 제제를 이용하여 각종 암 및 만성 감염을 치료하는 방법을 또한 제공한다.

Description

항-CTLA4 항체 단독의, 및 프로그램화된 사멸 수용체 1 (PD-1) 항체와 조합된 항-CTLA4 항체의 안정한 제제 및 그의 사용 방법

본 발명은 치료 항체의 제제, 및 각종 장애 치료에서의 그의 용도에 관한 것이다. 한 측면에서, 본 발명은 세포독성 T 림프구 연관 항원 4 (CTLA4)에 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 제제에 관한 것이다. 또 다른 측면에서, 상기 제제는 항-인간 프로그램화된 사멸 수용체 1 (PD-1) 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 추가로 포함한다. 본원에 기술된 제제를 이용하여 각종 암 및 만성 감염을 치료하는 방법 또한 제공한다.

관련 출원에 대한 상호 참조

본 출원은 2017년 5월 2일에 출원된 U.S.S.N. 62/500,268의 이익을 주장하며, 이는 그 내용 전문이 본원에서 참조로 포함된다.

전자적으로 제출된 서열 목록에 관한 언급

본 출원의 서열 목록은 파일명이 "24449WOPCT-SEQTXT-30APR2018.TXT"이고, 작성일이 2018년 4월 30일이고, 크기가 96 Kb인, ASCII 포맷형 서열 목록으로서 EFS-Web을 통해 전자적으로 제출된 것이다. EFS-Web을 통해 제출된 본 서열 목록은 본 명세서의 일부이며, 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다.

인간용 항체 약물은 그의 불변 도메인의 아미노산 서열에서, 또는 가변 도메인 내의 그의 프레임워크 서열에서 다소 상이할 수 있지만, 상기 항체 약물은 전형적으로는 CDR 서열에서 가장 극적인 차이를 보인다. 비록 동일한 단백질, 동일한 폴리펩티드, 또는 심지어는 잠재적으로 동일한 에피토프에 결합하는 항체라도 완전히 상이한 CDR 서열을 포함할 수 있다. 인간용 치료 항체는 또한 예컨대, 인간화 항체에서와 같이, 인간 생식계열 항체 서열로부터, 또는 비-인간 (예컨대, 설치류) 생식계열 항체 서열로부터 수득될 수 있고, 이는 잠재적인 CDR 서열에서의 추가의 다양성을 유도한다. 이러한 서열 차이는 용액 중 상이한 안정성 및 용액 파라미터에 대한 상이한 반응성을 초래한다. 추가로, 아미노산 배열의 작은 변화 또는 하나 또는 수개의 아미노산 잔기의 변이가 극적으로 상이한 항체 안정성 및 서열 특이적 분해 경로에 대한 감수성을 초래할 수 있다. 그 결과, 현재는 항체 안정성을 최적화시키는 데 필요한 용액 조건을 예측할 수 없다. 최적의 용액 제제를 결정하기 위해서는 각 항체는 개별적으로 연구되어야 한다 (Bhambhani et al. (2012) J. Pharm. Sci. 101:1120).

항체는 또한 예를 들어, 다른 치료 단백질, 예컨대, 호르몬 및 시토카인과 비교하였을 때, 상대적으로 고분자량인 단백질이다 (~150,000 Da). 그 결과, 빈번하게는 원하는 몰 농도의 약물을 달성하기 위해서는 비교적 높은 중량의 양으로 항체를 투약하여야 한다. 추가로, 대개는 항체 약물을 피하로 투여하는 것이 바람직할 수 있는데, 그 이유는 피하 투여는 자기 투여가 가능하기 때문이다. 자기 투여는 예컨대, 정맥내 투여를 위해 의료 시설에 방문하는 것과 연관된 시간 및 비용을 면할 수 있게 한다. 피하 전달은 실제로 단일 주사시 주사 부위에 전달될 수 있는 용액의 부피, 일반적으로 약 1 내지 1.5 ml에 의해 제한한다. 피하 자기 투여는 전형적으로는 환자가 주사 전에 약물을 재현탁시켜야 할 필요성을 없애기 위해 동결건조된 형태보다는 약물의 액체 용액 제제로 미리 충전된 시린지 또는 자기주사기를 사용하여 달성된다. 항체 약물은 확실한 효능 및 일관된 투약을 위해서는 보관 동안 안정적이어야 하는 바, 이에, 선택되는 제제가 무엇이든 간에, 바람직한 특성, 예컨대, 고농도, 투명성 및 허용되는 점성을 지지하고, 또한 전형적인 보관 조건하에서 허용가능하게 긴 저장 기간 동안에 걸쳐 상기 특성 및 약물 효능을 유지하는 것이 중요하다.

CTLA4는 유전자 구조, 염색체 위치, 서열 상동성 및 유전자 발현에 있어서 CD28 분자와 매우 밀접한 관계를 가진다. 상기 둘은 모두 대개는 활성화된 T 세포 표면 상에서 발현되는, 공자극 분자 B7에 대한 수용체이다. B7에의 결합 후, CTLA4는 마우스 및 인간 T 세포의 활성화를 억제시킬 수 있으며, T 세포의 활성화에서 음성 조절 역할을 한다.

CTLA4 mAb 또는 CTLA4 리간드는 CTLA4가 그의 천연 리간드에 결합하지 못하게 막음으로써 CTLA4에 의한 T 세포 음성 조절 신호의 신호전달을 차단하고, T 세포의 다양한 항원에 대한 반응을 증진시킬 수 있다. 이러한 측면에서, 생체내 및 시험관내 연구로부터 얻은 결과는 일치한다. 현재, 일부 CTLA4 mAb가 전립선암, 방광암, 결장직장암, 위장관암, 간암, 악성 흑색종 등의 치료용으로 임상 시험에서 시험되고 있다 (Grosso et al., CTLA-4 blockade in tumor models: an overview of preclinical and translational research. Cancer Immun. 13:5 (2013)).

T 세포에 영향을 주는 중요한 인자로서, CTLA4 및 CTLA4 mAb는 체내 면역 미세환경을 간섭함으로써 질환에 특이적인 치료 효과를 가져올 수 있다. 이는 높은 효능을 가지며, 전통의 약물 치료의 부족한 부분을 해결함으로써 유전자 요법의 새로운 길을 열고 있다. CTLA4 및 CTLA4 mAb는 임상 시험의 실험 및 다양한 단계에서 시험되고 있다. 예를 들어, 자가면역 질환에서, 이는 동물 천식 모델에서 기도 과민반응성을 효과적으로 억제시켰고, 류머티스성 질환의 발생을 예방하였고, 체내에서 동종이식편에 대한 면역 내성을 매개하는 등, 그러한 효능을 보였다. 한편, 비록 생물학적 유전자 요법이 단기간이 임상 시험에서는 어떤 역효과도 보이지 않았지만, 장기간 적용 후의 잠재적인 효과에 대해 주의를 기울여야 한다. 예를 들어, CTLA4 mAb에 의한 CTLA4-B7 신호전달의 과도한 차단은 자가면역 질환을 발생시킬 수 있다. 항체는 특이적으로 그의 항원에 결합할 수 있고, 표적 세포의 용해를 유도하거나, 또는 병상의 진행을 차단할 수 있기 때문에, 항체, 특히, 인간화 항체 기반의 약물 및 사용이 인간에서의 악성 종양 및 다른 면역 질환의 임상 치료에서 중요한 의미를 가진다.

PD-1은 면역 조절 및 말초 내성의 유지에서 중요한 역할자인 것으로 인지된다. PD-1은 천연 T, B 및 NKT 세포 상에서는 중간 정도로 발현되고, 림프구, 단핵구, 골수성 세포 상에서는 T/B 세포 수용체 신호전달에 의해 상향조절된다 (Sharpe et al., The function of programmed cell death 1 and its ligands in regulating autoimmunity and infection. Nature Immunology (2007); 8:239-245). 항-PD-1 항체의 효능은 항-PD-1 항체가 다른 승인받은 또는 실험상의 암 요법, 예컨대, 방사선, 수술, 화학요법제, 표적화된 요법, 종양에서 조절이 되지 않는 다른 신호전달 경로를 억제시키는 작용제, 및 다른 면역 증강제와 함께 조합하여 투여된다면 증강될 수 있다고 제안되어 왔다. PD-1의 길항제와 함께 조합하여 시험되고 있는 상기 작용제 중 하나는 세포독성 T 림프구 연관 항원 4 (CTLA4로 약칭된다)이다.

예컨대, 각종 암 및 감염성 질환 치료를 위한 제약용 항-CTLA4 항체의 안정한 제제 뿐만 아니라, 항-인간 PD-1 항체와 함께 공동으로 제제화되는 항-CTLA4 항체의 안정한 제제가 요구되고 있다. 바람직하게, 상기 제제는 장기간의 저장 수명을 보일 것이고, 보관 및 수송시 안정적일 것이며, 바람직하게는 시린지 중 자기 투여용 약물의 보관에 전형적인 조건하에서, 즉, 냉장고 온도에서 수개월 내지 수년 동안 안정성을 나타냄에 따라, 상응하는 약물 제품을 위한 장기간 저장 수명을 얻게 될 것이다.

한 측면에서, 본 발명은 (i) 항-CTLA4 항체, 또는 그의 항원 결합 단편; (ii) 완충제, (iii) 비환원성 당; (iv) 비이온성 계면활성제; 및 항산화제를 포함하는, 항-CTLA4 항체, 또는 그의 항원 결합 단편의 제제를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 제제는 항-PD-1 항체, 예컨대, 펨브롤리주맙 또는 니볼루맙을 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, 제제는 킬레이터를 추가로 포함한다.

한 실시양태에서, 제제는 (i) 약 10 mg/ml 내지 약 200 mg/ml의 항-CTLA4 항체, 또는 그의 항원 결합 단편; (ii) 약 5 mM 내지 약 20 mM 완충제; (iii) 약 6% 중량/부피 (w/v) 내지 약 8% w/v 비환원성 당; (iv) 약 0.01% 내지 약 0.10% 비이온성 계면활성제; 및 (v) 약 1 mM 내지 약 20 mM 항산화제를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 제제는 항-PD-1 항체, 예컨대, 펨브롤리주맙 또는 니볼루맙을 추가로 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 제제는 킬레이터를 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, 킬레이터는 약 1 μM 내지 약 50 μM의 양으로 존재한다. 킬레이터는 DTPA이다. 한 실시양태에서, 제제의 pH는 4.5 - 6.5이다. 특정 실시양태에서, 제제의 pH는 약 pH 5.0 내지 약 pH 6.0이다. 추가 실시양태에서, 제제의 pH는 약 pH 5.3 내지 약 pH 5.8이다. 또 다른 실시양태에서, pH는 5.3이다. 또 다른 실시양태에서, pH는 5.4이다. 한 실시양태에서, pH는 5.5이다. 한 실시양태에서, pH는 5.6이다. 추가 실시양태에서, pH는 5.7이다. 한 실시양태에서, pH는 5.8이다.

제제의 한 실시양태에서, 완충제는 L-히스티딘 완충제 또는 아세트산 나트륨 완충제이고, 비환원성 당은 수크로스이고, 비이온성 계면활성제는 폴리소르베이트 80이고, 항산화제는 메티오닌, 또는 그의 제약상 허용되는 염이다. 한 실시양태에서, 항산화제는 L-메티오닌이다. 또 다른 실시양태에서, 항산화제는 L-메티오닌의 제약상 허용되는 염, 예컨대, 예를 들어, 메티오닌 HCl이다.

또 다른 실시양태에서, 제제는 (i) 약 10 mg/ml 내지 약 200 mg/ml의 항-CTLA4 항체, 또는 그의 항원 결합 단편; (ii) 약 5 mM 내지 약 20 mM의 L-히스티딘 또는 약 5 mM 내지 약 20 mM의 아세트산 나트륨 완충제; (iii) 약 6% w/v 내지 약 8% w/v 수크로스; (iv) 약 0.01% w/v 내지 약 0.10% w/v 폴리소르베이트 80; 및 (v) 약 1 mM 내지 약 20 mM L-메티오닌을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 제제는 항-PD-1 항체, 예컨대, 펨브롤리주맙 또는 니볼루맙을 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, 제제는 킬레이터를 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, 킬레이터는 약 1 μM 내지 약 50 μM의 양으로 존재한다. 한 실시양태에서, 킬레이터는 DTPA이다. 한 실시양태에서, 완충제는 L-히스티딘 완충제이다. 한 실시양태에서, 제제는 약 8 mM 내지 약 12 mM의 L-히스티딘을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 제제는 약 5 mM 내지 약 10 mM의 L-메티오닌을 포함한다. 추가 실시양태에서, 제제는 대략 0.02% w/v의 중량비로 폴리소르베이트 80을 포함한다. 한 실시양태에서, 항-CTLA4 제제는 약 7% (w/v)의 중량비로 수크로스를 포함한다.

제제의 실시양태에서, 항-CTLA4 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 농도는 약 10 mg/ml 내지 약 100 mg/ml이다. 또 다른 실시양태에서, 항-CTLA4 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 농도는 약 10 mg/ml, 12.5 mg/ml, 15 mg/ml, 20 mg/ml, 25 mg/ml, 50 mg/ml, 75 mg/ml 또는 100 mg/ml이다. 한 실시양태에서, 항-CTLA4 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 농도는 25 mg/mL이다. 추가 실시양태에서, 항-CTLA4 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 농도는 약 50 mg/ml이다. 또 다른 실시양태에서, 항-CTLA 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 농도는 약 75 mg/mL이다. 추가 실시양태에서, 항-CTLA4 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 농도는 100 mg/mL이다.

한 측면에서, 약 25 mg/mL의 항-CTLA4 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 10 mM L-히스티딘 완충제, 약 7% w/v 수크로스, 약 0.02% w/v 폴리소르베이트 80, 및 약 10 mM L-메티오닌을 포함하는 제제를 제공한다.

한 측면에서, 약 50 mg/mL의 항-CTLA4 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 10 mM L-히스티딘 완충제, 약 7% w/v 수크로스, 약 0.02% w/v 폴리소르베이트 80, 및 약 10 mM L-메티오닌을 포함하는 제제를 제공한다.

한 측면에서, 약 75 mg/mL의 항-CTLA4 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 10 mM L-히스티딘 완충제, 약 7% w/v 수크로스, 약 0.02% w/v 폴리소르베이트 80, 및 약 10 mM L-메티오닌을 포함하는 제제를 제공한다.

한 측면에서, 약 100 mg/mL의 항-CTLA4 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 10 mM L-히스티딘 완충제, 약 7% w/v 수크로스, 약 0.02% w/v 폴리소르베이트 80, 및 약 10 mM L-메티오닌을 포함하는 제제를 제공한다.

상기 제제 중 임의의 것의 한 측면에서, 제제의 pH는 약 5.3 내지 5.8이다. 또 다른 측면에서, 제제의 pH는 약 5.5 내지 약 5.6이다. 또 다른 측면에서, 제제의 pH는 약 5.5이다. 또 다른 측면에서, 제제의 pH는 약 5.6이다.

상기 제제 중 임의의 것의 한 측면에서, 제제는 항-PD1 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함한다. 한 측면에서, 항-PD1 항체는 펨브롤리주맙이다. 또 다른 측면에서, 항-PD1 항체는 니볼루맙이다.

또 다른 측면에서, 제제는 킬레이터를 추가로 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 킬레이터는 DTPA이다. 한 실시양태에서, 킬레이터는 EDTA이다. 한 측면에서, 킬레이터는 약 1μM 내지 약 50 μM의 양으로 존재한다. 한 실시양태에서, 제제는 약 5 μM의 킬레이터를 포함한다. 한 실시양태에서, 제제는 약 10 μM의 킬레이터를 포함한다. 한 실시양태에서, 제제는 약 15 μM의 킬레이터를 포함한다. 한 실시양태에서, 제제는 약 20 μM의 킬레이터를 포함한다. 한 실시양태에서, 제제는 약 25 μM의 킬레이터를 포함한다. 한 실시양태에서, 제제는 약 30 μM의 킬레이터를 포함한다. 한 실시양태에서, 제제는 약 35 μM의 킬레이터를 포함한다. 한 실시양태에서, 제제는 약 40 μM의 킬레이터를 포함한다. 한 실시양태에서, 제제는 약 45 μM의 킬레이터를 포함한다. 한 실시양태에서, 제제는 약 50 μM의 킬레이터를 포함한다. 한 실시양태에서, 킬레이트화제는 DTPA이며, 이는 상기 언급된 양 중 임의의 양으로 존재한다. 또 다른 실시양태에서, 킬레이트화제는 EDTA이며, 이는 상기 언급된 양 중 임의의 양으로 존재한다.

한 실시양태에서, 제제는 유리 바이알에 함유되어 있다. 또 다른 실시양태에서, 제제는 주사 장치에 함유되어 있다. 또 다른 실시양태에서, 제제는 액체 제제이다. 한 측면에서, 제제는 적어도 -70℃ 미만으로 냉동된다. 또 다른 실시양태에서, 제제는 동결건조된 제제로부터의 재구성된 액제이다.

특정 실시양태에서, 제제는 냉장 온도 (2-8℃)에서 적어도 3개월, 바람직하게, 6개월, 및 더욱 바람직하게, 1년, 및 더욱더 바람직하게, 최대 2년까지 안정적이다. 제제의 한 실시양태에서, 5℃에서 12개월 후, 크기 배제 크로마토그래피에 의해 측정 시, 항-CTLA4 항체의 단량체(%)는 ≥90%이다. 제제의 또 다른 실시양태에서, 5℃에서 12개월 후, 크기 배제 크로마토그래피에 의해 측정 시, 항-CTLA4 항체의 단량체(%)는 ≥95%이다. 제제의 또 다른 실시양태에서, 5℃에서 12개월 후, 환원된 CE-SDS에 의해 측정 시, 항-CTLA4 항체의 중쇄 및 경쇄(%)는 ≥90%이다. 제제의 또 다른 실시양태에서, 5℃에서 12개월 후, 환원된 CE-SDS에 의해 측정 시, 항-CTLA4 항체의 중쇄 및 경쇄(%)는 ≥95%이다. 제제의 또 다른 실시양태에서, 5℃에서 12개월 후, 비환원된 CE-SDS에 의해 측정 시, 항-CTLA4 항체의 무손상 IgG(%)는 ≥90%이다. 제제의 또 다른 실시양태에서, 5℃에서 12개월 후, 비환원된 CE-SDS에 의해 측정 시, 항-CTLA4 항체의 무손상 IgG(%)는 ≥95%이다.

상기 기술된 제제 중 임의의 것의 한 측면에서, 제제는 3개의 경쇄 CDR 및 3개의 중쇄 CDR을 포함하는 항-CTLA4 항체 또는 그의 항원 결합 단편으로서, 여기서, 경쇄 CDR은 서열식별번호(SEQ ID NO) 38의 CDRL1, 서열식별번호 39의 CDRL2, 서열식별번호 40의 CDRL3을 포함하고, 중쇄 CDR은 서열식별번호 35의 CDRH1, 서열식별번호 36의 CDRH2, 및 서열식별번호 37의 CDRH3을 포함하는 것인 항-CTLA4 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함한다. 또 다른 측면에서, 제제는 서열식별번호 88을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열식별번호 48을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항-CTLA4 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함한다. 또 다른 측면에서, 제제는 서열식별번호 99를 포함하는 중쇄 및 서열식별번호 100을 포함하는 경쇄를 포함하는 항-CTLA4 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함한다.

한 측면에서, 본 발명은 (i) 항-CTLA4 항체, 또는 그의 항원 결합 단편; (ii) 항-인간 PD-1 항체, 또는 그의 항원 결합 단편, (ii) 완충제, (iii) 비환원성 당; (iv) 비이온성 계면활성제; 및 항산화제를 포함하는, 항-CTLA4 항체, 또는 그의 항원 결합 단편, 및 항-인간 PD-1 항체, 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 복합 제제를 포함한다. 한 실시양태에서, 복합 제제는 킬레이터를 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, 킬레이터는 EDTA이다. 또 다른 실시양태에서, 킬레이터는 DTPA이다. 복합 제제의 한 실시양태에서, 항-인간 PD-1 항체 대 항-CTLA4 항체의 비는 1:2이다. 복합 제제의 또 다른 실시양태에서, 항-인간 PD-1 항체 대 항-CTLA4 항체의 비는 1:1이다. 복합 제제의 추가 실시양태에서, 항-인간 PD-1 항체 대 항-CTLA4 항체의 비는 2:1이다. 복합 제제의 또 다른 실시양태에서, 항-인간 PD-1 항체 대 항-CTLA4 항체의 비는 10:1이다. 복합 제제의 추가 실시양태에서, 항-인간 PD-1 항체 대 항-CTLA4 항체의 비는 1:10이다. 또 다른 실시양태에서, 항-인간 PD-1 항체 대 항-CTLA4 항체의 비는 8:1이다. 추가 실시양태에서, 항-인간 PD-1 항체 대 항-CTLA4 항체의 비는 8:3이다.

본 발명의 한 실시양태에서, 복합 제제는 (i) 약 1 mg/ml 내지 약 100 mg/ml의 항-CTLA4 항체, 또는 그의 항원 결합 단편; (ii) 약 1 mg/ml 내지 약 100 mg/ml의 항-인간 PD-1 항체 (ii) 약 5 mM 내지 약 20 mM 완충제; (iii) 약 6% 중량/부피 (w/v) 내지 약 8% w/v 비환원성 당; (iv) 약 0.01% 내지 약 0.10% 비이온성 계면활성제; 및 (v) 약 1 mM 내지 약 20 mM 항산화제를 포함한다. 한 실시양태에서, 복합 제제는 킬레이터를 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, 킬레이터는 DTPA이다. 복합 제제의 한 실시양태에서, 항-인간 PD-1 항체 대 항-CTLA4 항체의 비는 1:2이다. 복합 제제의 또 다른 실시양태에서, 항-인간 PD-1 항체 대 항-CTLA4 항체의 비는 1:1이다. 복합 제제의 추가 실시양태에서, 항-인간 PD-1 항체 대 항-CTLA4 항체의 비는 2:1이다. 복합 제제의 또 다른 실시양태에서, 항-인간 PD-1 항체 대 항-CTLA4 항체의 비는 10:1이다. 복합 제제의 추가 실시양태에서, 항-인간 PD-1 항체 대 항-CTLA4 항체의 비는 1:10이다. 또 다른 실시양태에서, 항-인간 PD-1 항체 대 항-CTLA4 항체의 비는 8:1이다. 추가 실시양태에서, 항-인간 PD-1 항체 대 항-CTLA4 항체의 비는 8:3이다. 한 실시양태에서, 복합 제제의 pH는 4.5 내지 6.5이다. 다른 실시양태에서, 제제의 pH는 약 pH 5.0 내지 약 pH 6.0이다. 추가 실시양태에서, 제제의 pH는 약 pH 5.3 내지 약 pH 5.8이다.

복합 제제의 한 실시양태에서, 완충제는 히스티딘 완충제 또는 아세트산 나트륨 완충제이고, 비환원성 당은 수크로스이고, 비이온성 계면활성제는 폴리소르베이트 80이고, 항산화제는 메티오닌 또는 그의 제약상 허용되는 염이고. 한 실시양태에서, 항산화제는 L-메티오닌이고. 또 다른 실시양태에서, 항산화제는 L-메티오닌의 제약상 허용되는 염, 예컨대, 예를 들어, 메티오닌 HCl이다.

또 다른 측면에서, 복합 제제는 (i) 약 1 mg/ml 내지 약 100 mg/ml의 항-CTLA4 항체, 또는 그의 항원 결합 단편; (ii) 약 1 mg/ml 내지 약 100 mg/ml의 항-인간 PD-1 항체 또는 그의 항원 결합 단편; (iii) 약 5 mM 내지 약 20 mM의 L-히스티딘 완충제 또는 약 5 mM 내지 약 20 mM의 아세트산 나트륨 완충제; (iv) 약 6% w/v 내지 약 8% w/v 수크로스; (v) 약 0.01% w/v 내지 약 0.10% w/v 폴리소르베이트 80; 및 (vi) 약 1 mM 내지 약 20 mM L-메티오닌을 포함한다. 한 실시양태에서, 복합 제제는 킬레이터를 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, 킬레이터는 DTPA이다. 한 실시양태에서, 완충제는 L-히스티딘 완충제이다. 한 실시양태에서, 복합 제제는 약 8 mM 내지 약 12 mM의 L-히스티딘 완충제를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 복합 제제는 약 5 mM 내지 약 10 mM의 L-메티오닌을 포함한다. 추가 실시양태에서, 복합 제제는 대략 0.02% w/v의 중량비로 폴리소르베이트 80을 포함한다. 한 실시양태에서, 복합 제제는 약 7% (w/v)의 중량비로 수크로스를 포함한다.

복합 제제의 실시양태에서, 항-CTLA4 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 농도는 약 1 mg/mL 내지 약 100 mg/mL이다. 또 다른 실시양태에서, 항-CTLA4 항체의 농도는 약 10 mg/ml 내지 약 100 mg/ml이다. 또 다른 실시양태에서, 항-CTLA4 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 농도는 약 10 mg/ml이다. 또 다른 실시양태에서, 항-CTLA4 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 농도는 1.25 mg/ml이다. 또 다른 실시양태에서, 항-CTLA4 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 농도는 2.5 mg/ml이다. 또 다른 실시양태에서, 항-CTLA4 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 농도는 5 mg/ml이다. 또 다른 실시양태에서, 항-CTLA4 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 농도는 12.5 mg/ml이다. 추가 실시양태에서, 항-CTLA4 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 농도는 25 mg/ml이다. 추가 실시양태에서, 항-CTLA4 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 농도는 50 mg/ml이다. 또 다른 실시양태에서, 항-CTLA4 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 75 mg/ml이다. 또 다른 실시양태에서, 항-CTLA4 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 농도는 100 mg/ml이다. 추가 실시양태에서, 항-CTLA4 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 농도는 약 50 mg/ml이다. 또 다른 실시양태에서, 항-CTLA4 항체의 농도는 2.9 mg/mL이다. 또 다른 실시양태에서, 항-CTLA4 항체의 농도는 7.9 mg/mL이다.

복합 제제의 실시양태에서, 항-인간 PD-1 항체의 농도는 약 1 mg/mL 내지 약 100 mg/mL이다. 또 다른 실시양태에서, 항-인간 PD-1 항체의 농도는 약10 mg/ml 내지 약 100 mg/ml이다. 또 다른 실시양태에서, 항-인간 PD-1 항체의 농도는 약 25 mg/ml이다. 또 다른 실시양태에서, 항-인간 PD-1 항체의 농도는 약 22.7 mg/ml이다. 또 다른 실시양태에서, 항-인간 PD-1 항체의 농도는 약 2.27 mg/ml이다. 또 다른 실시양태에서, 항-인간 PD-1 항체의 농도는 약 21.1 mg/ml이다. 또 다른 실시양태에서, 항-인간 PD-1 항체의 농도는 약 23.5 mg/ml이다.

한 실시양태에서, 복합 제제는 약 25 mg/mL의 항-PD1 항체, 약 12.5 mg/mL의 항-CTLA4 항체, 10 mM L-히스티딘 완충제, 약 7% w/v 수크로스, 약 0.02% w/v 폴리소르베이트 80, 및 약 10 mM L-메티오닌을 포함한다.

한 실시양태에서, 복합 제제는 약 25 mg/mL의 항-PD1 항체, 약 25 mg/mL의 항-CTLA4 항체, 10 mM L-히스티딘 완충제, 약 7% w/v 수크로스, 약 0.02% w/v 폴리소르베이트 80, 및 약 10 mM L-메티오닌을 포함한다.

한 실시양태에서, 복합 제제는 약 25 mg/mL의 항-PD1 항체, 약 50 mg/mL의 항-CTLA4 항체, 10 mM L-히스티딘 완충제, 약 7% w/v 수크로스, 약 0.02% w/v 폴리소르베이트 80, 및 약 10 mM L-메티오닌을 포함한다.

한 실시양태에서, 복합 제제는 약 22.72 mg/mL의 항-PD1 항체, 약 2.3 mg/mL의 항-CTLA4 항체, 10 mM L-히스티딘 완충제, 약 7% w/v 수크로스, 약 0.02% w/v 폴리소르베이트 80, 및 약 10 mM L-메티오닌을 포함한다.

한 실시양태에서, 복합 제제는 약 2.27 mg/mL의 항-PD1 항체, 약 22.7 mg/mL의 항-CTLA4 항체, 10 mM L-히스티딘 완충제, 약 7% w/v 수크로스, 약 0.02% w/v 폴리소르베이트 80, 및 약 10 mM L-메티오닌을 포함한다.

한 실시양태에서, 복합 제제는 약 23.5 mg/mL의 항-PD1 항체, 약 2.9 mg/mL의 항-CTLA4 항체, 10 mM L-히스티딘 완충제, 약 7% w/v 수크로스, 약 0.02% w/v 폴리소르베이트 80, 및 약 10 mM L-메티오닌을 포함한다.

한 실시양태에서, 복합 제제는 약 21.1 mg/mL의 항-PD1 항체, 약 7.9 mg/mL의 항-CTLA4 항체, 10 mM L-히스티딘 완충제, 약 7% w/v 수크로스, 약 0.02% w/v 폴리소르베이트 80, 및 약 10 mM L-메티오닌을 포함한다.

상기 기술된 제제 중 임의의 것의 한 측면에서, 제제는 3개의 경쇄 CDR 및 3개의 중쇄 CDR을 포함하는 항-CTLA4 항체 또는 그의 항원 결합 단편으로서, 여기서, 경쇄 CDR은 서열식별번호 38의 CDRL1, 서열식별번호 39의 CDRL2, 서열식별번호 40의 CDRL3을 포함하고, 중쇄 CDR은 서열식별번호 35의 CDRH1, 서열식별번호 36의 CDRH2, 및 서열식별번호 37의 CDRH3을 포함하는 것인 항-CTLA4 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함한다. 또 다른 측면에서, 제제는 서열식별번호 88을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열식별번호 48을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항-CTLA4 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함한다. 또 다른 측면에서, 제제는 서열식별번호 99를 포함하는 중쇄 및 서열식별번호 100을 포함하는 경쇄를 포함하는 항-CTLA4 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함한다. 상기 기술된 제제 중 임의의 것의 한 측면에서, 항-인간 PD-1 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 3개의 경쇄 CDR 및 3개의 중쇄 CDR을 포함하고, 여기서, 경쇄 CDR은 서열식별번호 1의 CDRL1, 서열식별번호 2의 CDRL2, 서열식별번호 3의 CDRL3을 포함하고, 중쇄 CDR은 서열식별번호 6의 CDRH1, 서열식별번호 7의 CDRH2, 및 서열식별번호 8의 CDRH3을 포함한다. 또 다른 측면에서, 제제는 서열식별번호 4를 포함하는 경쇄 가변 영역 및 서열식별번호 9를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항-인간 PD1 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함한다. 또 다른 측면에서, 제제는 서열식별번호 5를 포함하는 경쇄 및 서열식별번호 10을 포함하는 중쇄를 포함하는 항-인간 PD1 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함한다. 상기 기술된 제제 중 임의의 것의 한 측면에서, 항-인간 PD-1 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 펨브롤리주맙이다. 또 다른 측면에서, 항-인간 PD-1 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 니볼루맙이다.

상기 기술된 복합 제제 중 임의의 것의 한 측면에서, 제제는 (i) 3개의 경쇄 CDR 및 3개의 중쇄 CDR을 포함하는 항-CTLA4 항체 또는 그의 항원 결합 단편으로서, 여기서, 경쇄 CDR은 서열식별번호 38의 CDRL1, 서열식별번호 39의 CDRL2, 서열식별번호 40의 CDRL3을 포함하고, 중쇄 CDR은 서열식별번호 35의 CDRH1, 서열식별번호 36의 CDRH2, 및 서열식별번호 37의 CDRH3을 포함하는 것인 항-CTLA4 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 및 (ii) 3개의 경쇄 CDR 및 3개의 중쇄 CDR을 포함하는 항-인간 PD-1 항체 또는 그의 항원 결합 단편으로서, 여기서, 경쇄 CDR은 서열식별번호 1의 CDRL1, 서열식별번호 2의 CDRL2, 서열식별번호 3의 CDRL3을 포함하고, 중쇄 CDR은 서열식별번호 6의 CDRH1, 서열식별번호 7의 CDRH2, 및 서열식별번호 8의 CDRH3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항-인간 PD-1 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함한다.

상기 기술된 복합 제제 중 임의의 것의 한 측면에서, 제제는 (i) 서열식별번호 88을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열식별번호 48을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항-CTLA4 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 및 (ii) 서열식별번호 4를 포함하는 경쇄 가변 영역 및 서열식별번호 9를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항-인간 PD1 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함한다.

상기 기술된 복합 제제 중 임의의 것의 또 다른 측면에서, 제제는 (i) 서열식별번호 99를 포함하는 중쇄 및 서열식별번호 100을 포함하는 경쇄를 포함하는 항-CTLA4 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 및 (ii) 서열식별번호 5를 포함하는 경쇄 및 서열식별번호 10을 포함하는 중쇄를 포함하는 항-인간 PD1 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함한다.

한 측면에서, 유효량의 본원에 기술된 항-CTLA4 제제 또는 복합 제제를 투여하는 단계를 포함하는, 만성 감염 또는 암 치료를 필요로 하는 포유동물 대상체 (예컨대, 인간)에서 만성 감염 또는 암을 치료하는 방법을 제공한다.

도 1a는 8주 동안의 5℃, 25℃, 및 40℃에서의 제제 A1의 UV A350 흡광도를 보여주는 것이다. 도 1b는 8주 동안의 5℃, 25℃, 및 40℃에서의 제제 A2의 UV A350 흡광도를 보여주는 것이다.
도 2는 냉동 해동, 교반 및 광 스트레스 연구에 대한 제제 A1 및 A2의 UV A350 흡광도를 보여주는 것이다.
도 3a 및 3b는 각각 제제 A1 및 A2에 대해 5℃, 25℃, 및 40℃ 보관 조건에서 UP-SEC 대 시간 데이터에 의해 측정된 %HMW를 보여주는 것이다.
도 4a 및 4b는 각각 제제 A1 및 A2에 대해 5℃, 25℃, 및 40℃ 보관 조건에서 UP-SEC 대 시간 데이터에 의해 측정된 단량체(%)를 보여주는 것이다.
도 5는 냉동 해동, 교반 및 광 스트레스 연구에 대한 제제 A1 및 A2의, UP-SEC에 의해 측정된 %HMW를 보여주는 것이다.
도 6은 냉동 해동, 교반 및 광 스트레스 연구에 대한 제제 A1 및 A2의, UP-SEC에 의해 측정된 단량체(%)를 보여주는 것이다.
도 7a 및 7b는 각각 제제 A1 및 A2에 대해 5℃, 25℃, 및 40℃ 보관 조건에서 HP-IEX 대 시간 데이터에 의해 측정된 산성 피크(%)를 보여주는 것이다.
도 8a 및 8b는 각각 제제 A1 및 A2에 대해 5℃, 25℃, 및 40℃ 보관 조건에서 HP-IEX 대 시간 데이터에 의해 측정된 염기성 피크(%)를 보여주는 것이다.
도 9a 및 9b는 각각 제제 A1 및 A2에 대해 5℃, 25℃, 및 40℃ 보관 조건에서 HP-IEX 대 시간 데이터에 의해 측정된 주요 피크(%)를 보여주는 것이다.
도 10은 냉동 해동, 교반 및 광 스트레스 연구에 대한 제제 A1 및 A2의, HP-IEX에 의해 측정된 산성 피크(%)를 보여주는 것이다.
도 11은 냉동 해동, 교반 및 광 스트레스 연구에 대한 제제 A1 및 A2의, HP-IEX에 의해 측정된 염기성 피크(%)를 보여주는 것이다.
도 12는 냉동 해동, 교반 및 광 스트레스 연구에 대한 제제 A1 및 A2의, HP-IEX에 의해 측정된 주요 피크(%)를 보여주는 것이다.
도 13은 제제 A1 및 A2에 대해 펩티드 맵핑에 의해 측정된 LC-M4 산화 (메티오닌 산화) 비율(%)을 보여주는 것이다.
도 14는 제제 A1 및 A2에 대해 펩티드 맵핑에 의해 측정된 HC-M34 산화 (메티오닌 산화) 비율(%)을 보여주는 것이다.
도 15는 제제 A1 및 A2에 대해 펩티드 맵핑에 의해 측정된 HC-M250 산화 (메티오닌 산화) 비율(%)을 보여주는 것이다.
도 16은 제제 A1 및 A2에 대해 펩티드 맵핑에 의해 측정된 HC-M426 산화 (메티오닌 산화) 비율(%)을 보여주는 것이다.
도 17a는 8주 동안의 5℃, 25℃, 및 40℃에서의 제제 B1의 UV A350 흡광도를 보여주는 것이다. 도 17b는 8주 동안의 5℃, 25℃, 및 40℃에서의 제제 B2의 UV A350 흡광도를 보여주는 것이다.
도 18은 냉동 해동, 교반 및 광 스트레스 연구에 대한 제제 B1 및 B2의 UV A350 흡광도를 보여주는 것이다.
도 19a 및 19b는 각각 제제 B1 및 B2에 대해 5℃, 25℃, 및 40℃ 보관 조건에서 UP-SEC 대 시간 데이터에 의해 측정된 %HMW를 보여주는 것이다.
도 20a 및 20b는 각각 제제 B1 및 B2에 대해 5℃, 25℃, 및 40℃ 보관 조건에서 UP-SEC 대 시간 데이터에 의해 측정된 단량체(%)를 보여주는 것이다.
도 21은 냉동 해동, 교반 및 광 스트레스 연구에 대한 제제 B1 및 B2의, UP-SEC에 의해 측정된 %HMW를 보여주는 것이다.
도 22는 냉동 해동, 교반 및 광 스트레스 연구에 대한 제제 B1 및 B2의, UP-SEC에 의해 측정된 단량체(%)를 보여주는 것이다.
도 23a 및 23b는 각각 제제 B1 및 B2에 대해 5℃, 25℃, 및 40℃ 보관 조건에서 HP-IEX 대 시간 데이터에 의해 측정된 산성 피크(%)를 보여주는 것이다.
도 24a 및 24b는 각각 제제 B1 및 B2에 대해 5℃, 25℃, 및 40℃ 보관 조건에서 HP-IEX 대 시간 데이터에 의해 측정된 염기성 피크(%)를 보여주는 것이다.
도 25a 및 25b는 각각 제제 B1 및 B2에 대해 5℃, 25℃, 및 40℃ 보관 조건에서 HP-IEX 대 시간 데이터에 의해 측정된 주요 피크(%)를 보여주는 것이다.
도 26은 냉동 해동, 교반 및 광 스트레스 연구에 대한 제제 B1 및 B2의, HP-IEX에 의해 측정된 산성 피크(%)를 보여주는 것이다.
도 27은 냉동 해동, 교반 및 광 스트레스 연구에 대한 제제 B1 및 B2의, HP-IEX에 의해 측정된 염기성 피크(%)를 보여주는 것이다.
도 28은냉동 해동, 교반 및 광 스트레스 연구에 대한 제제 B1 및 B2의, HP-IEX에 의해 측정된 주요 피크(%)를 보여주는 것이다.
도 29는 제제 B1 및 B2에 대해 펩티드 맵핑에 의해 측정된 LC-M4 산화 (메티오닌 산화) 비율(%)을 보여주는 것이다.
도 30은 제제 B1 및 B2에 대해 펩티드 맵핑에 의해 측정된 HC-M34 산화 (메티오닌 산화) 비율(%)을 보여주는 것이다.
도 31은 제제 B1 및 B2에 대해 펩티드 맵핑에 의해 측정된 HC-M250 산화 (메티오닌 산화) 비율(%)을 보여주는 것이다.
도 32는 제제 B1 및 B2에 대해 펩티드 맵핑에 의해 측정된 HC-M426 산화 (메티오닌 산화) 비율(%)을 보여주는 것이다.
도 33은 제제가 3개의 상이한 pH 값 (5.0, 5.5, 및 6.0)에서 안정적이라는 것을 시사하는, 복합 제제에 대한 KD 데이터를 보여주는 것이다.
도 34는 이필리무맙에 대한 중쇄 및 경쇄의 아미노산 서열 (각각 서열식별번호 84 및 85)을 보여주는 것이다.

한 측면에서, 본 발명은 메티오닌을 포함하는 항-CTLA4 항체 및 그의 항원 결합 단편을 포함하는 제제를 제공한다. 항-CTLA4 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 및 메티오닌을 포함하는 항-인간 PD-1 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 복합 제제 또한 제공한다. 각 경우에서, 제제 및 복합 제제는 임의적으로 킬레이트화제를 포함한다.

I. 정의 및 약어

본 명세서 및 첨부된 청구범위 전역에 걸쳐 사용되는 바, 하기 약어가 적용된다:

API 활성 제약 성분

CDR 달리 명시되지 않는 한, 카파트 넘버링 체계(Kabat numbering system)를 사용하여 정의된, 면역글로불린 가변 영역 중의 상보성 결정 영역

CHO 차이니즈 햄스터 난소

CI 신뢰 구간

CTLA4 세포독성 T 림프구 연관 항원 4

DTPA 디에틸렌트리아민펜타아세트산

EC50 50% 효능 또는 결합을 초래하는 농도

ELISA 효소 결합 면역흡착 검정법

FFPE 포르말린 고정된, 파라핀 포매된

FR 프레임워크 영역

HRP 호스래디쉬 퍼옥시다제

HNSCC 두부경부 편평세포 암종

IC50 50% 억제를 초래하는 농도

IgG 면역글로불린 G

ICH 국제 조화 기구(International Conference of Harmonization)

IHC 면역조직화학법 또는 면역조직화학적

mAb 모노클로날 항체

MES 2-(N-모르폴리노)에탄술폰산

NCBI 미국 국립 생물학 정보 센터(National Center for Biotechnology Information)

NSCLC 비소세포 폐암

PCR 중합효소 연쇄 반응

PD-1 프로그램화된 사멸 1 (프로그램화된 세포 사멸-1 및 프로그램화된 사멸 수용체 1로도 공지되어 있다)

PD-L1 프로그램화된 세포 사멸 1 리간드 1

PD-L2 프로그램화된 세포 사멸 1 리간드 2

PS80 폴리소르베이트 80

TNBC 삼중 음성 유방암

V_H 면역글로불린 중쇄 가변 영역

VK 면역글로불린 카파 경쇄 가변 영역

V_L 면역글로불린 경쇄 가변 영역

v/v 부피/부피

WFI 주사용수

w/v 중량/부피.

이에, 본 발명이 보다 용이하게 이해될 수 있도록, 특정 기술 용어 및 과학 용어가 하기에서 구체적으로 정의된다. 본 명세서의 다른 곳에서 구체적으로 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 다른 기술 용어 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 의미를 갖는다.

본 명세서 전역에 걸쳐 및 첨부된 청구범위에서, 단수 형태는 문맥상 달리 명백하게 지시되지 않는 한, 복수의 지시 대상을 포함한다.

"또는"이라고 언급하는 것은 문맥상 명시된 가능성 중 하나를 명백하게 지시하지 않는 한, 두 가능성 중 하나 또는 그 둘 모두를 지시한다. 일부 경우에서, "및/또는"은 두 가능성 중 하나 또는 그 둘 모두를 강조하기 위해 사용된다.

본원에서 사용되는 바, 암을 "치료하다" 또는 "치료하는"이란, 면역 병태 또는 암성 병태를 앓거나, 암 또는 병원성 감염 (예컨대, 바이러스성, 박테리아성, 진균성 감염) 진단을 받은 대상체에게 본 발명의 제제를 투여하여 적어도 하나의 긍정적인 치료 효과, 예컨대 예를 들어, 암 세포수 감소, 종양 크기 축소, 주변 기관 내로의 암 세포 침윤 속도 감소, 또는 종양 전이 또는 종양 성장 속도 감소를 달성하는 것을 의미한다. "치료"는 하기: 항종양 면역 반응을 유도/증가시키는 것, 병원체, 독소 및/또는 자기 항원에 대한 면역 반응을 자극시키는 것, 바이러스 감염에 대한 면역 반응을 자극시키는 것, 하나 이상의 종양 마커의 개수를 감소시키는 것, 종양 세포의 성장 또는 생존을 억제시키는 것, 하나 이상의 암성 병변 또는 종양을 제거하거나, 또는 그의 크기를 축소시키는 것, 하나 이상의 종양 마커의 수준을 감소시키는 것, 암의 중증도 또는 지속 기간을 호전시키거나, 감소시키는 것, 유사한 비치료 환자에서의 예상 생존 기간과 비교하여 환자의 생존 기간을 연장시키는 것 중 하나 이상의 것을 포함할 수 있다.

"면역 병태" 또는 "면역 장애"는 예컨대, 병적 염증, 염증성 장애, 및 자가면역 장애 또는 질환을 포함한다. "면역 병태"는 또한 감염, 지속성 감염, 및 증식성 병태, 예컨대, 면역계에 의한 근절에 저항하는 감염, 종양, 및 암을 비롯한, 암, 종양, 및 혈관신생을 지칭한다. "암성 병태"로는 예컨대, 암, 암 세포, 종양, 혈관신생, 및 전암성 병태, 예컨대, 이형성증을 포함한다.

암에서의 긍정적인 치료 효과는 다수의 방식으로 측정될 수 있다 (문헌 [W. A. Weber, J. Nucl . Med. 50:1S-10S (2009)] 참조). 예를 들어, 종양 성장 억제와 관련하여, NCI 표준에 따르면, T/C ≤ 42%가 최소 수준의 항-종양 활성이다. T/C < 10%는 높은 항-종양 활성 수준으로 간주되며, T/C (%) = 치료된 것의 중간 종양 부피/대조군의 중간 종양 부피 × 100이다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 제제의 투여에 의해 달성된 치료는 무진행 생존 (PFS), 무질환 생존 (DFS) 또는 전체 생존기간 (OS) 중 임의의 것이다. "종양 진행까지의 시간"으로도 지칭되는 PFS는 치료 동안의 및 치료 후의 암이 성장하지 않는 시간의 길이를 나타내고, 환자가 완전 관해 또는 부분 관해를 경험한 시간의 양 뿐만 아니라, 환자가 안정 병변을 경험한 시간의 양을 포함한다. DFS는 치료 동안 및 치료 후에 환자가 병이 없는 상태를 유지하는 시간의 길이를 지칭한다. OS는 나이브한 또는 치료받지 않은 개체 또는 환자와 비교하여 기대 수명에서의 연장을 지칭한다. 본 발명의 제제, 치료 방법, 및 용도의 실시양태가 모든 환자에서 긍정적인 치료 효과를 달성하는 데 효과적이지 않을 수 있지만, 관련 기술분야에 공지된 임의의 통계 검정, 예컨대, 스튜던츠 t 검정, 카이²-검정, 만(Mann) 및 휘트니(Whitney)에 따른 U-검정, 크루스칼-왈리스(Kruskal-Wallis) 검정 (H-검정), 존키어-테르프트라(Jonckheere-Terpstra)-검정 및 윌콕슨(Wilcoxon)-검정에 의해 결정되는 바와 같이, 통계적으로 유의한 수의 대상체에서는 효과적이어야 한다.

"환자"라는 용어 (대안적으로 본원에서 "대상체" 또는 "개체"로 지칭된다)는 본 발명의 제제로 치료될 수 있는 포유동물 (예컨대, 래트, 마우스, 개, 고양이, 토끼) 및 가장 바람직하게는 인간을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 환자는 성인 환자이다. 다른 실시양태에서, 환자는 소아 환자이다.

"항체"는 원하는 생물학적 활성을 나타내는 항체의 임의의 형태를 지칭한다. 따라서, 이는 가장 넓은 의미로 사용되고, 구체적으로 모노클로날 항체 (전장 모노클로날 항체 포함), 폴리클로날 항체, 인간화, 완전 인간 항체, 키메라 항체를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. "모체 항체"는 의도된 용도를 위한 항체의 변형, 예컨대, 인간 치료용 항체로서 사용하기 위한 항체의 인간화 이전에 면역계를 항원에 노출시켜 수득된 항체이다.

일반적으로, 기본 항체 구조 단위는 사량체를 포함한다. 각 사량체는 폴리펩티드 쇄의 2개의 동일한 쌍을 포함하며, 각 쌍은 1개의 "경쇄" (약 25 kDa) 및 1개의 "중쇄" (약 50-70 kDa)를 갖는다. 각 쇄의 아미노-말단 부분은 주로 항원 인식을 담당하는 약 100개 내지 110개 또는 그 초과의 아미노산의 가변 영역을 포함한다. 각 경쇄/중쇄 쌍의 가변 영역이 항체 결합 부위를 형성한다. 따라서, 일반적으로, 무손상 항체는 2개의 결합 부위를 가진다. 중쇄의 카르복시-말단 부분은 주로 이펙터 기능을 담당하는 불변 영역을 규정할 수 있다. 전형적으로, 인간 경쇄는 카파 및 람다 경쇄로 분류된다. 추가로, 인간 중쇄는 전형적으로 뮤, 델타, 감마, 알파, 또는 엡실론으로 분류되고, 각각 IgM, IgD, IgG, IgA, 및 IgE로서 항체의 이소타입을 규정한다. 경쇄 및 중쇄 내에서, 가변 및 불변 영역은 약 12개 이상의 아미노산의 "J" 영역에 의해 연결되며, 중쇄는 또한 약 10개 초과의 아미노산의 "D" 영역을 포함한다. 일반적으로, 문헌 [Fundamental Immunology Ch. 7 (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y. (1989)]을 참조한다.

전형적으로, 중쇄 및 경쇄 둘 모두의 가변 도메인은 비교적 보존된 프레임워크 영역 (FR) 내에 위치하는, 상보성 결정 영역 (CDR)으로도 불리는 3개의 초가변 영역을 포함한다. CDR은 통상적으로 프레임워크 영역에 의해 정렬되며, 이는 특이적 에피토프에 결합하는 것을 가능하게 한다. 일반적으로, 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 둘 모두는 N-말단에서 C-말단으로 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4를 포함한다. 아미노산을 각 도메인에 할당하는 것은 일반적으로, 문헌 [Sequences of Proteins of Immunological Interest, Kabat, et al.; National Institutes of Health, Bethesda, Md. ; 5^th ed.; NIH Publ. No. 91-3242 (1991)]; [Kabat (1978) Adv. Prot . Chem. 32:1-75]; [Kabat, et al., (1977) J. Biol . Chem. 252:6609-6616]; [Chothia, et al., (1987) J Mol . Biol. 196:901-917] 또는 [Chothia, et al., (1989) Nature 342:878-883]의 정의에 따른다.

명시된 표적 단백질에 "특이적으로 결합하는" 항체는 다른 단백질에 비해 그 표적에 대해 우선적인 결합을 나타내는 항체이나, 이 특이성이 절대적인 결합 특이성을 요구하는 것은 아니다. 항체는 그의 결합이, 예컨대, 가양성과 같은 원치 않는 결과를 생성하지 않으면서, 샘플 중 표적 단백질의 존재를 결정하는 경우, 그의 의도된 표적에 대해 "특이적"인 것으로 간주된다. 본 발명에 유용한 항체 또는 그의 결합 단편은 비-표적 단백질과의 친화도보다 적어도 2배 더 큰, 바람직하게는 적어도 10배 더 큰, 더욱 바람직하게는 적어도 20배 더 큰, 가장 바람직하게는 적어도 100배 더 큰 친화도로 표적 단백질에 결합할 것이다. 본원에서 사용되는 바, 항체가 주어진 아미노산 서열, 예컨대, 성숙 인간 CTLA4 또는 인간 PD-1 분자의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드에는 결합하지만, 그 서열이 결핍되어 있는 단백질에는 결합하지 않는다면, 항체는 그 서열을 포함하는 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 것으로 지칭된다.

"키메라 항체"는, 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정한 종 (예컨대, 인간)으로부터 유래되거나, 특정한 항체 부류 또는 하위부류에 속하는 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성이고, 나머지 쇄(들)는 또 다른 종 (예컨대, 마우스)으로부터 유래되거나, 또 다른 항체 부류 또는 하위부류에 속하는 항체의 상응하는 서열과 동일하거나, 상동성인 항체 뿐만 아니라, 이들이 원하는 생물학적 활성을 나타내는 한 이러한 항체의 단편을 지칭한다.

본원에서 사용되는 바 "공동 제제화된" 또는 "복합 제제" 또는 "복합제제" 또는 "공동제제화된"은, 개별적으로 제제화되고, 보관된 후, 투여 전에 혼합되거나, 또는 별개로 투여되는 것이 아니라, 함께 제제화되고, 조합된 생성물로서 단일 바이알 또는 베쓸 (예를 들어, 주사 장치)에 보관된 적어도 2개의 상이한 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 지칭한다. 한 실시양태에서, 복합 제제는 2개의 상이한 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 함유한다.

"제약상 유효량의" 또는 "유효량의"라는 용어는 질환 또는 병태를 치료하는 데 충분한, 환자에게 도입되는 치료 조성물 또는 제제의 양을 의미한다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 환자의 특징, 예컨대, 연령, 체중 등에 따라 달라질 수 있다는 것을 이해할 것이다.

물질 또는 조성물의 양 (예컨대, mM, 또는 M), 제제 성분의 비율 (v/v 또는 w/v), 용액/제제의 pH, 또는 방법에서 단계를 특징화하는 파라미터의 값 등을 수식할 때, "약"이라는 용어는 예를 들어, 물질 또는 조성물의 제조, 특징화 및/또는 사용에 관여하는 전형적인 측정, 취급 및 샘플링 방법을 통해; 상기 방법에서의 기계상의 오류를 통해; 조성물을 제조 또는 사용하는 데, 또는 방법을 수행하는 데 사용되는 성분의 제조, 공급원, 또는 순도에서의 차이를 통해 발생할 수 있는 수량의 변동을 지칭한다. 특정 실시양태에서, "약"은 ± 0.1%, 0.5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 또는 10%의 변동을 의미할 수 있다.

본원에서 사용되는 바, "x% (w/v)"는 x g/100 ml와 같다 (예를 들어, 5% w/v는 50 mg/ml이다).

본 발명의 제제는 재구성되었을 때, 또는 액체 형태로 생물학적으로 활성인 항체 및 그의 단편을 포함한다.

"암", "암성," 또는 "악성"이라는 용어는 전형적으로 비조절된 세포 성장을 특징으로 하는 포유동물에서의 생리학적 병태를 지칭하거나 기술한다. 암의 예로는 암종, 림프종, 백혈병, 모세포종 및 육종을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 상기 암의 더욱 특정한 예로는 편평세포 암종, 골수종, 소세포 폐암, 비소세포 폐암, 신경교종, 호지킨 림프종, 비호지킨 림프종, 위장암 (위장관암), 신암, 난소암, 간암, 림프모구성 백혈병, 림프구성 백혈병, 결장직장암, 자궁내막암, 신장암, 전립선암, 갑상선암, 흑색종, 연골육종, 신경모세포종, 췌장암, 다형성 교모세포종, 자궁경부암, 뇌암, 위암, 방광암, 간세포암, 유방암, 결장 암종, 및 두부경부 암을 포함한다.

"코티아(Chothia)"는 문헌 [Al-Lazikani et al., JMB 273:927-948 (1997)]에 기술된 항체 넘버링 체계를 의미한다.

본원에서 사용되는 바, "카바트(Kabat)"는 엘빈 A. 카바트(Elvin A. Kabat)에 의해 개척된 면역글로불린 정렬 및 넘버링 체계를 의미한다 ((1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md.).

본원에서 사용되었을 때, "성장 억제제"란, 시험관내 또는 생체내에서 세포, 특히, 본원에서 확인된 유전자 중 임의의 것을 과다발현하는 암 세포의 성장을 억제시키는 화합물 또는 조성물을 지칭한다. 따라서, 성장 억제제는 S기에서 상기 유전자를 과다발현하는 세포의 비율을 유의적으로 감소시키는 것이다. 성장 억제제의 예로는 (S기 이외의 단계에서) 세포 주기 진행을 차단하는 작용제, 예컨대, G1 정지 및 M기 정지를 유도하는 작용제를 포함한다. 고전적인 M기 차단제로는 빈카 (빈크리스틴 및 빈블라스틴) 탁산, 및 토포 II 억제제, 예컨대, 독소루비신, 에피루비신, 다우노루비신, 및 에토포시드를 포함한다. G1을 정지시키는 상기 작용제는 또한 예를 들어, DNA 알킬화제, 예컨대, 다카르바진, 메클로레타민, 및 시스플라틴과 같이, S기 정지로까지 확산된다. 추가 정보는 문헌 [The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn and Israel, eds., Chapter 1, entitled "Cell cycle regulation, oncogens, and antineoplastic drugs" by Murakami et al. (WB Saunders: Philadelphia, 1995)]에서 살펴볼 수 있다.

"CTLA4 결합 단편," "그의 항원 결합 단편,", "그의 결합 단편" 또는 "그의 단편"이라는 용어는 항원 (인간 CTLA4)에 결합하고, 그의 활성을 억제하는 (예컨대, 인간 CTLA4가 그의 천연 리간드에 결합하는 것을 차단하는) 그의 생물학적 활성을 여전히 실질적으로 유지하는 항체의 단편 또는 유도체를 포함한다. 따라서, "항체 단편" 또는 CTLA4 결합 단편이라는 용어는 전장 항체의 일부분, 일반적으로는 그의 항원 결합 영역 또는 가변 영역을 지칭한다. CTLA4 항체 단편의 예로는 Fab, Fab', F(ab')₂, 및 Fv 단편을 포함한다. 전형적으로, 결합 단편 또는 유도체는 그의 CTLA4 억제 활성의 적어도 10%를 유지한다. 일부 실시양태에서, 비록 원하는 생물학적 효과를 발휘하도록 충분한 친화력이 있는 임의의 결합 단편이 유용하기는 하겠지만, 결합 단편 또는 유도체는 그의 CTLA4 억제 활성의 적어도 25%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% 또는 100% (또는 그 초과)를 유지한다. 일부 실시양태에서, 항원 결합 단편은 비관련 항원과의 친화도보다 적어도 2배 더 큰, 바람직하게, 적어도 10배 더 큰, 더욱 바람직하게, 적어도 20배 더 큰, 및 가장 바람직하게, 적어도 100배 더 큰 친화도로 그의 항원에 결합한다. 한 실시양태에서, 항체는 예컨대, 스캐차드 분석에 의해 측정 시, 약 약 10⁹ ℓ/mol 초과의 친화도를 가진다 (Munsen et al. (1980) Analyt . Biochem. 107:220-239). 또한, CTLA4 결합 단편은 실질적으로는 그의 생물학적 활성을 변경시키지 않는 보존적 아미노산 치환을 가지는 변이체를 포함할 수 있는 것으로 의도된다.

"PD-1 결합 단편," "그의 항원 결합 단편,", "그의 결합 단편" 또는 "그의 단편"이라는 용어는 항원 (인간 PD-1)에 결합하고, 그의 활성을 억제하는 (예컨대, PD-1이 PDL1 및 PDL2에 결합하는 것을 차단하는) 그의 생물학적 활성을 여전히 실질적으로 유지하는 항체의 단편 또는 유도체를 포함한다. 따라서, "항체 단편" 또는 PD-1 결합 단편이라는 용어는 전장 항체의 일부분, 일반적으로는 그의 항원 결합 영역 또는 가변 영역을 지칭한다. 항체 단편의 예로는 Fab, Fab', F(ab')₂, 및 Fv 단편을 포함한다. 전형적으로, 결합 단편 또는 유도체는 그의 PD-1 억제 활성의 적어도 10%를 유지한다. 일부 실시양태에서, 비록 원하는 생물학적 효과를 발휘하도록 충분한 친화력이 있는 임의의 결합 단편이 유용하기는 하겠지만, 결합 단편 또는 유도체는 그의 PD-1 억제 활성의 적어도 25%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% 또는 100% (또는 그 초과)를 유지한다. 일부 실시양태에서, 항원 결합 단편은 비관련 항원과의 친화도보다 적어도 2배 더 큰, 바람직하게, 적어도 10배 더 큰, 더욱 바람직하게, 적어도 20배 더 큰, 및 가장 바람직하게, 적어도 100배 더 큰 친화도로 그의 항원에 결합한다. 한 실시양태에서, 항체는 예컨대, 스캐차드 분석에 의해 측정 시, 약 약 10⁹ ℓ/mol 초과의 친화도를 가진다 (Munsen et al. (1980) Analyt. Biochem. 107:220-239). 또한, PD-1 결합 단편은 실질적으로는 그의 생물학적 활성을 변경시키지 않는 보존적 아미노산 치환을 가지는 변이체를 포함할 수 있는 것으로 의도된다.

"인간 항체"는 인간 면역글로불린 단백질 서열만을 포함하는 항체를 지칭한다. 인간 항체가 마우스, 마우스 세포, 또는 마우스 세포로부터 유래된 하이브리도마에서 생산되는 경우, 이는 뮤린 탄수화물 쇄를 함유할 수 있다. 유사하게, "마우스 항체" 또는 "래트 항체"는 각각 마우스 또는 래트 면역글로불린 서열만을 포함하는 항체를 지칭한다.

"인간화 항체"는 비-인간 (예컨대, 뮤린) 항체 뿐만 아니라, 인간 항체로부터의 서열을 함유하는 항체의 형태를 지칭한다. 상기 항체는 비-인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유한다. 일반적으로, 인간화 항체는 적어도 1개, 및 전형적으로 2개의 가변 도메인 모두를 실질적으로 포함할 것이고, 여기서, 모든 또는 실질적으로 모든 초가변 루프는 비인간 면역글로불린의 것들에 해당하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR 영역은 인간 면역글로불린 서열의 것이다. 인간화 항체는 또한 임의적으로 면역글로불린 불변 영역 (Fc)의 적어도 일부, 전형적으로, 인간 면역글로불린의 것을 포함할 것이다. 친화도를 증가시키기 위해, 인간화 항체의 안정성을 증가시키기 위해, 또는 다른 이유를 위해 특정 아미노산 치환도 포함될 수 있지만, 설치류 항체의 인간화 형태는 일반적으로 모체 설치류 항체의 동일한 CDR 서열을 포함할 것이다.

본 발명의 항체는 변경된 이펙터 기능을 제공하도록 Fc 영역이 변형된 (또는 차단된) 항체를 또한 포함한다. 예컨대, 미국 특허 번호 5,624,821; WO2003/086310; WO2005/120571; WO2006/0057702; 문헌 [Presta (2006) Adv . Drug Delivery Rev. 58:640-656]을 참조한다. 상기 변형은 면역계의 다양한 반응을 증진 또는 억제시키는 데 사용될 수 있고, 가능하게는 진단 및 요법에서의 유익한 효과가 있을 수 있다. Fc 영역의 변경은 아미노산 변이 (치환, 결실 및 삽입), 글리코실화 또는 탈글리코실화, 및 다중 Fc 부가를 포함한다. Fc에 대한 변이는 치료 항체에서의 항체 반감기를 또한 변경시킬 수 있고, 더 긴 반감기는 동반하여 편의성을 증가시키고, 물질 사용을 감소시키면서, 투약 빈도 감소시킬 것이다. 문헌 [Presta (2005) J. Allergy Clin . Immunol .116:731 at 734-35]를 참조한다.

"완전 인간 항체"란, 인간 면역글로불린 단백질 서열만을 포함하는 항체를 지칭한다. 완전 인간 항체가 마우스, 마우스 세포, 또는 마우스 세포로부터 유래된 하이브리도마에서 생산되는 경우, 이는 뮤린 탄수화물 쇄를 함유할 수 있다. 유사하게, "마우스 항체"는 각각 마우스 면역글로불린 서열만을 포함하는 항체를 지칭한다. 완전 인간 항체는 인간에서, 인간 면역글로불린 생식계열 서열을 가지는 트랜스제닉 동물에서, 파지 디스플레이에 의해 또는 다른 분자 생물학적 방법에 의해 생성될 수 있다.

"초가변 영역"은 항원-결합을 담당하는 항체의 아미노산 잔기를 지칭한다. 초가변 영역은 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"로부터의 아미노산 잔기 (예컨대, 카바트 넘버링 체계에 의해 결정된 바와 같은, 경쇄 가변 도메인 내의 24-34 (CDRL1), 50-56 (CDRL2) 및 89-97 (CDRL3) 및 중쇄 가변 도메인 내의 잔기 31-35 (CDRH1), 50-65 (CDRH2) 및 95-102 (CDRH3) ((Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md.)), 및/또는 "초가변 루프"로부터의 잔기 (즉, 경쇄 가변 도메인 내의 26-32 (L1), 50-52 (L2) 및 91-96 (L3) 및 중쇄 가변 도메인 내의 26-32 (H1), 53-55 (H2) 및 96-101 (H3) (Chothia and Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196: 901-917)를 포함한다. 본원에서 사용되는 바, "프레임워크" 또는 "FR" 잔기라는 용어는 본원에서 CDR 잔기로서 정의된 초가변 영역 잔기 이외의 이들 가변 도메인 잔기를 지칭한다. CDR 및 FR 잔기는 문헌 [Kabat. Kabat et al. (1987) Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda Md.]의 표준 서열 정의에 따라 결정된다.

"보존적으로 변형된 변이체" 또는 "보존적 치환"은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 아미노산 치환을 지칭하고, 심지어, 폴리펩티드의 필수 영역에서도, 일반적으로 생성된 분자의 생물학적 활성을 변경시키지 않으면서 이루어질 수 있다. 바람직하게는 상기 예시적인 치환은 하기의 표 1에 기재된 것에 따라 이루어진다:

<표 1>

예시적인 보존적 아미노산 치환

추가로, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 일반적으로, 폴리펩티드의 비-필수 영역 내의 단일 아미노산 치환이 생물학적 활성을 실질적으로 변경시키지 않는다는 것을 인지하고 있다. 예컨대, 문헌 [Watson et al. (1987) Molecular Biology of the Gene, The Benjamin/Cummings Pub. Co., p. 224 (4th Edition)]을 참조한다.

명세서 및 청구범위 전역에 걸쳐 사용된 바와 같이, "~으로 본질적으로 이루어진다" 또는 변형, 예컨대, "~으로 본질적으로 이루어지다" 또는 "~으로 본질적으로 이루어지는"이라는 어구는 임의의 언급된 요소들 또는 요소들 군의 포함, 및 명시된 투여 요법, 방법 또는 조성물의 기본적인 또는 신규 성질을 실질적으로 변화시키지 않는, 언급된 요소들과 성질이 유사하거나, 상이한 다른 요소들의 임의적인 포함을 가리킨다. 비제한적인 예로서, 언급된 아미노산 서열로 본질적으로 이루어지는 결합 화합물은 결합 화합물의 성질에 본질적으로 영향을 미치지 않는 하나 이상의 아미노산 (하나 이상의 아미노산 잔기의 치환 포함)을 또한 포함할 수 있다.

"포함하는," 또는 변형, 예컨대 "포함한다(comprise)", "포함한다(comprises)" 또는 "~로 구성된다"는 언어 또는 필요한 함축을 표현하기 위해 문맥상 달리 요구되지 않는 한, 명세서 및 청구범위 전역에 걸쳐 포괄적인 의미로, 즉, 언급된 특징의 존재를 명시하지만, 본 발명의 임의의 실시양태의 작용 또는 유용성을 실질적으로 증진시킬 수 있는 추가적인 특징의 존재 또는 추가를 배제하지 않도록 사용된다.

"단리된 항체" 및 "단리된 항체 단편"은 정제 상태를 지칭하고, 이러한 맥락에서, 명명된 분자는 다른 생물학적 분자, 예컨대, 핵산, 단백질, 지질, 탄수화물, 또는 다른 물질, 예컨대, 세포 파편 및 성장 배지가 실질적으로 없는 것을 의미한다. 일반적으로, "단리된"이라는 용어는 이러한 물질, 또는 물, 완충제, 또는 염이 본원에 기재된 바와 같은 결합 화합물의 실험적 또는 치료적 사용을 실질적으로 방해하는 양으로 존재하지 않는 한, 이러한 물질의 완전한 부재, 또는 물, 완충제, 또는 염의 부재를 지칭하도록 의도되지 않는다.

본원에서 사용된 바, "모노클로날 항체" 또는 "mAb" 또는 "Mab"는 실질적으로 동종인 항체의 집단을 지칭하며, 즉, 집단을 포함하는 항체 분자는 미량으로 존재할 수 있는 가능한 자연적으로 발생된 돌연변이를 제외한 아미노산 서열에서 동일하다. 대조적으로, 통상적인 (폴리클로날) 항체 제조는 전형적으로, 상이한 에피토프에 대해 종종 특이적인 그의 가변 도메인, 특히 그의 CDR에서 상이한 아미노산 서열을 갖는 다수의 상이한 항체를 포함한다. 수식어 "모노클로날"은 항체의 실질적으로 동종인 집단으로부터 수득되는 바와 같은 항체의 특징을 나타내고, 임의의 특정한 방법에 의해 항체의 생산을 요구하는 것으로서 해석되어서는 안된다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용하고자 하는 모노클로날 항체는 문헌 [Kohler et al. (1975) Nature 256: 495]에 의해 최초로 기술된 하이브리도마 방법에 의해 제조될 수 있거나, 또는 재조합 DNA 방법에 의해 제조될 수 있다 (예컨대, 미국 특허 번호 4,816,567 참조). "모노클로날 항체"는 또한 예를 들어, 문헌 [Clackson et al. (1991) Nature 352: 624-628] 및 [Marks et al. (1991) J. Mol . Biol. 222: 581-597]에 기재된 기술을 사용하여 파지 항체 라이브러리로부터 단리될 수 있다. 또한, 문헌 [Presta (2005) J. Allergy Clin. Immunol. 116:731]을 참조한다.

암 진단을 받은, 또는 암에 걸린 것으로 의심되는 대상체에 적용될 때의 "종양"은 임의의 크기의 악성 또는 잠재적 악성 신생물 또는 조직 종괴를 지칭하고, 원발성 종양 및 속발성 신생물을 포함한다. 고형 종양은 통상적으로 낭 또는 액체 영역을 함유하지 않는 조직의 비정상적 성장 또는 종괴이다. 고형 종양의 여러 유형은 이들을 형성하는 세포 유형에 대해 명명된다. 고형 종양의 예로는 육종, 암종, 및 림프종이 있다. 백혈병 (혈액암)은 일반적으로 고형 종양을 형성하지 않는다 (National Cancer Institute, Dictionary of Cancer Terms).

"종양 크기"라는 용어는 종양의 길이 및 너비로 측정될 수 있는 종양의 전체 크기를 지칭한다. 관련 기술분야에 공지된 다양한 방법에 의해, 예컨대, 예를 들어, 대상체로부터의 절제시 예컨대, 캘리퍼를 사용하여, 또는 신체 내에 있는 동안 영상화 기술, 예컨대, 골 스캔, 초음파, CT 또는 MRI 스캔을 사용하여 종양(들)의 치수를 측정함으로써 종양 크기를 측정할 수 있다.

본원에서 사용되는 바, "가변 영역" 또는 "V 영역"이란, 상이한 항체 사이에 서열이 가변적인 IgG 쇄의 절편을 의미한다. 이는 경쇄에서 카바트 잔기 109 및 중쇄에서 113까지 연장된다.

"완충제"라는 용어는 본 발명의 제제의 용액 pH를 허용가능한 범위 내에서 유지시키거나, 또는 본 발명의 동결건조된 제제의 경우, 동결건조 이전에 허용가능한 용액 pH를 제공하는 작용제를 포함한다.

"동결건조," "동결건조된" 및 "냉동-건조된"이라는 용어는 건조시키고자 하는 물질을 먼저 냉동시킨 후, 이어서, 진공 환경에서 승화에 의해 얼음 또는 냉동 용매를 제거하는 프로세스를 지칭한다. 보관시 동결건조된 제품의 안정성을 증강시키기 위해 부형제를 예비-동결건조된 제제 중에 포함시킬 수 있다.

"제약 제제"라는 용어는 활성 성분이 효과적이게 하는 것과 같은 형태이고, 제제가 투여될 대상체에게 독성인 추가적인 성분을 함유하지 않는 제제를 지칭한다. "제제" 및 "제약 제제"라는 용어는 전역에 걸쳐 상호교환적으로 사용된다.

"제약상 허용되는"이란, 부형제 (비히클, 첨가제) 및 조성물이, 사용되는 활성 성분을 유효량으로 제공하기 위해 대상체에게 합리적으로 투여될 수 있고, "일반적으로 안전한 것으로 간주되고," 예컨대, 생리적으로 허용되며, 전형적으로, 인간에게 투여되었을 때, 알레르기 반응 또는 원치않는 유사 반응, 예컨대, 위경련 등을 일으키지 않는다는 것을 지칭한다. 또 다른 실시양태에서, 상기 용어는 동물용으로 및 더욱 특히, 인간용으로, 연방 또는 주 정부의 규제 기관의 승인을 받은, 또는 미국 약전(U.S. Pharmacopeia) 또는 또 다른 일반적으로 인정되는 약전에 열거되어 있는 분자 엔티티 및 조성물을 지칭한다.

"재구성된" 제제는 재구성된 제제 내에 단백질이 분산되도록 동결건조된 단백질 제제를 희석제에 용해시킴으로써 제조된 것이다. 재구성된 제제는 투여, 예컨대, 비경구 투여에 적합하고, 임의적으로는 피하 투여에 적합할 수 있다.

"재구성 시간"은 용액으로 동결건조 제제를 입자가 없는 투명한 용액으로 재수화시키는 데 필요한 시간이다.

"안정한" 제제는 내부의 단백질이 보관시 이의 물리적 안정성 및/또는 화학적 안정성 및/또는 생물학적 활성을 본질적으로 유지하는 것이다. 단백질 안정성을 측정하기 위한 다양한 분석 기술이 관련 기술분야에서 이용가능하고, 문헌 [Peptide and Protein Drug Delivery, 247-301, Vincent Lee Ed., Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Pubs. (1991)] 및 [Jones, A. Adv. Drug Delivery Rev. 10:29-90 (1993)]에 리뷰되어 있다. 선택된 기간에 대해 선택된 온도에서 안정성을 측정할 수 있다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 안정한 제제는 냉장 온도 (2-8℃)에서 적어도 12개월 동안 유의적인 변화가 관찰되지 않는 제제이다. 또 다른 실시양태에서, 안정한 제제는 냉장 온도 (2-8℃)에서 적어도 18개월 동안 유의적인 변화가 관찰되지 않는 제제이다. 또 다른 실시양태에서, 안정한 제제는 실온 (23-27℃)에서 적어도 3개월 동안 유의적인 변화가 관찰되지 않는 제제이다. 또 다른 실시양태에서, 안정한 제제는 실온 (23-27℃)에서 적어도 6개월 동안 유의적인 변화가 관찰되지 않는 제제이다. 또 다른 실시양태에서, 안정한 제제는 실온 (23-27℃)에서 적어도 12개월 동안 유의적인 변화가 관찰되지 않는 제제이다. 또 다른 실시양태에서, 안정한 제제는 실온 (23-27℃)에서 적어도 18개월 동안 유의적인 변화가 관찰되지 않는 제제이다. 항체 제제의 안정성에 대한 기준은 하기와 같다. 전형적으로, SEC-HPLC에 의해 측정시, 항체 단량체의 10% 이하, 바람직하게, 5%가 분해된다. 전형적으로, 제제는 시각적 분석에 의해 무색이거나, 또는 투명 내지 약간 유백색이다. 전형적으로, 제제의 농도, pH 및 오스몰 농도의 변화가 +/-10%를 초과하지 않는다. 효능은 전형적으로 대조군 또는 참조의 60-140%, 바람직하게, 80-120% 이내이다. 전형적으로, 예를 들어, HP-SEC에 의해 측정 시, 10% 이하, 바람직하게, 5%의 항체 클리핑, 즉, 저분자량 종(%)이 관찰된다. 전형적으로, 예를 들어, HP-SEC에 의해 측정 시, 10% 이하, 바람직하게, 5% 이하의 항체 응집, 즉, 고분자량 종(%)이 관찰된다.

색상 및/또는 투명도의 육안 검사시 또는 UV 광 산란, 크기 배제 크로마토그래피 (SEC) 및 동적 광 산란에 의해 측정시, 항체가 응집, 침전 및/또는 변성의 유의한 증가를 보이지 않았다면, 항체는 제약 제제에서 "그의 물리적 안정성을 유지"하는 것이다. 단백질 3차 구조를 결정하는 형광 분광법 및 단백질 2차 구조를 결정하는 FTIR에 의해 단백질 형상의 변화를 평가할 수 있다.

항체가 유의적인 화학적 변경을 보이지 않았다면, 항체는 제약 제제에서 "그의 화학적 안정성을 유지"하는 것이다. 단백질의 화학적으로 변경된 형태를 검출 및 정량함으로써 화학적 안정성을 사정할 수 있다. 종종 단백질의 화학 구조를 변경시키는 분해 프로세스로는 가수분해 또는 클리핑 (예컨대, 크기 배제 크로마토그래피 및 SDS-PAGE와 같은 방법에 의해 평가), 산화 (예컨대, 질량 분광법 또는 MALDI/TOF/MS와 함께 펩티드 맵핑에 의한 것과 같은 방법에 의해 평가), 탈아미드화 (예컨대, 이온 교환 크로마토그래피, 모세관 등전 포커싱, 펩티드 맵핑, 이소아스파르트산 측정과 같은 방법에 의해 평가), 및 이성질체화 (이소아스파르트산 함량 측정, 펩티드 맵핑 등에 의해 평가)를 포함한다.

주어진 시간에 항체의 생물학적 활성이 제약 제제가 제조된 시점에 나타난 생물학적 활성의 미리 정해진 범위 내에 있다면, 항체는 제약 제제에서 "그의 생물학적 활성을 유지"하는 것이다. 예를 들어, 항원 결합 검정법에 의해 항체의 생물학적 활성을 측정할 수 있다.

"등장성"이라는 용어는 관심 제제의 삼투압이 인간 혈액과 본질적으로 동일하다는 것을 의미한다. 일반적으로 등장성 제제는 삼투압이 약 270-328 mOsm일 것이다. 약간 저장성인 삼투압은 250-269 mOsm이고, 약간 고장성인 삼투압은 328-350 mOsm이다. 예를 들어, 증기압 또는 빙동(ice-freezing) 유형 삼투압 측정기를 사용하여 삼투압을 측정할 수 있다.

II. 본 발명의 제제 및 본 발명의 복합 제제.

한 측면에서, 본 발명은 활성 제약 성분으로서 인간 CTLA4에 특이적으로 결합하는 항-CTLA4 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 안정한 생물학적 제제를 제공한다. 상기 제제 중 메티오닌 포함은 항-CTLA4 항체의 Fc 영역에 존재하는 메티오닌 잔기의 산화를 감소시킨다.

한 측면에서, 본 발명은 또한 항-PD-1 항체와 함께 항-CTLA4 항체로 이루어진 복합 제제를 제공한다. 펨브롤리주맙의 주요 분해 경로는 퍼옥시다제 스트레스시 중쇄 CDR3 중의 메티오닌 105 (Met105) (예컨대, 서열식별번호 10의 M105)의 산화, 및 광 노출시 Met105 및 Fc 메티오닌 잔기의 산화를 포함하였다. 펨브롤리주맙은 시험된 분해 수준에 대한 대부분의 스트레스 조건하에서 그의 생체활성을 유지하였다. 그러나, 표면 플라즈몬 공명 (SPR)에 의하면, 퍼옥시다제 스트레스를 받은 샘플의 경우, PD-1에 대한 친화도 감소가 관찰되었다. 노출된 메티오닌 잔기 또는 항체의 CDR 중의 메티오닌 잔기는 산화를 통해 항체의 생물학적 활성에 영향을 줄 수 있는 잠재능을 가지고 있다. 메티오닌 첨가는 펨브롤리주맙 중쇄 CDR 내의 Met105의 산화를 감소시킬 수 있다.

항-PD-1 항체 및 그의 항원 결합 단편

한 측면에서, 본 발명은 활성 제약 성분 (PD-1 API)으로서 인간 PD-1에 특이적으로 결합하는 항-인간 PD-1 항체 또는 그의 항원 결합 단편 (예컨대, 인간 또는 인간화 항-PD-1 항체)과 함께 공동 제제화된 항-CTLA4 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 안정한 생물학적 제제 뿐만 아니라, 본 발명의 제제를 사용하는 방법을 제공한다. 본 발명의 복합 제제 및 방법에서 임의의 항-PD-1 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, PD-1 API는 펨브롤리주맙 및 니볼루맙으로부터 선택되는 항-PD-1 항체이다. 구체적인 실시양태에서, 항-PD-1 항체는 펨브롤리주맙이다. 대안적 실시양태에서, 항-PD-1 항체는 니볼루맙이다. 하기 표 2는 예시적인 항-인간 PD-1 항체인 펨브롤리주맙 및 니볼루맙에 대한 아미노산 서열을 제공한다. 본 발명의 복합 제제 및 방법에서 유용한 대안적 PD-1 항체 및 항원 결합 단편은 하기 표 3에 제시되어 있다.

본원에서 사용되는 바, 대안적으로 본원에서는 "펨브로"으로도 지칭되는 "펨브롤리주맙" (이전에는 MK-3475, SCH 900475 및 람브롤리주맙으로 공지)은 문헌 [WHO Drug Information, Vol. 27, No. 2, pages 161-162 (2013)]에 기술된 구조를 가지고, 표 2에 기술된 중쇄 및 경쇄 아미노산 서열 및 CDR을 포함하는 인간화 IgG4 mAb이다. 펨브롤리주맙은 키트루다 (KEYTRUDA)™에 대한 처방 정보(Prescribing Information) (Merck & Co., Inc., Whitehouse Station, NJ USA; initial U.S. approval 2014, updated September 2017)에 기술된 바와 같이, 절제 불가능한 또는 전이성 흑색종을 앓는 환자 치료용으로, 및 재발성 또는 전이성 두부경부 편평세포암 (HNSCC), 고전적 호지킨 림프종 (cHL), 요로상피세포 암종, 위암, 현미부수체 불안정성이 높은 (MSI-H) 암 및 비소세포 폐암을 앓는 특정 환자 치료용으로 미국 FDA의 승인을 받았다.

일부 실시양태에서, 본 발명의 복합 제제에서 사용하기 위한 항-인간 PD-1 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 CDRL1, CDRL2 및 CDRL3으로 이루어진 3개의 경쇄 CDR 및/또는 CDRH1, CDRH2 및 CDRH3으로 이루어진 3개의 중쇄 CDR을 포함한다.

본 발명의 한 실시양태에서, CDRL1은 서열식별번호 1 또는 서열식별번호 1의 변이체이고, CDRL2는 서열식별번호 2 또는 서열식별번호 2의 변이체이고, CDRL3은 서열식별번호 3 또는 서열식별번호 3의 변이체이다.

한 실시양태에서, CDRH1은 서열식별번호 6 또는 서열식별번호 6의 변이체이고, CDRH2는 서열식별번호 7 또는 서열식별번호 7의 변이체이고, CDRH3은 서열식별번호 8 또는 서열식별번호 8의 변이체이다.

한 실시양태에서, 3개의 경쇄 CDR은 서열식별번호 1, 서열식별번호 2, 및 서열식별번호 3이고, 3개의 중쇄 CDR은 서열식별번호 6, 서열식별번호 7 및 서열식별번호 8이다.

본 발명의 대안적 실시양태에서, CDRL1은 서열식별번호 11 또는 서열식별번호 11의 변이체이고, CDRL2는 서열식별번호 12 또는 서열식별번호 12의 변이체이고, CDRL3은 서열식별번호 13 또는 서열식별번호 13의 변이체이다.

한 실시양태에서, CDRH1은 서열식별번호 16 또는 서열식별번호 16의 변이체이고, CDRH2는 서열식별번호 17 또는 서열식별번호 17의 변이체이고, CDRH3은 서열식별번호 18 또는 서열식별번호 18의 변이체이다.

대안적 실시양태에서, 3개의 경쇄 CDR은 서열식별번호 11, 서열식별번호 12, 및 서열식별번호 13이고, 3개의 중쇄 CDR은 서열식별번호 16, 서열식별번호 17 및 서열식별번호 18이다.

본 발명의 추가 실시양태에서, CDRL1은 서열식별번호 21 또는 서열식별번호 21의 변이체이고, CDRL2는 서열식별번호 22 또는 서열식별번호 22의 변이체이고, CDRL3은 서열식별번호 23 또는 서열식별번호 23의 변이체이다.

추가의 또 다른 실시양태에서, CDRH1은 서열식별번호 24 또는 서열식별번호 24의 변이체이고, CDRH2는 서열식별번호 25 또는 서열식별번호 25의 변이체이고, CDRH3은 서열식별번호 26 또는 서열식별번호 26의 변이체이다.

또 다른 실시양태에서, 3개의 경쇄 CDR은 서열식별번호 21, 서열식별번호 22, 및 서열식별번호 23이고, 3개의 중쇄 CDR은 서열식별번호 24, 서열식별번호 25 및 서열식별번호 26이다.

본 발명의 일부 항-인간 PD-1 항체 및 항원 결합 단편은 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 경쇄 가변 영역은 서열식별번호 4 또는 서열식별번호 4의 변이체를 포함하고, 중쇄 가변 영역은 서열식별번호 9 또는 서열식별번호 9의 변이체를 포함한다. 추가 실시양태에서, 경쇄 가변 영역은 서열식별번호 14 또는 서열식별번호 14의 변이체를 포함하고, 중쇄 가변 영역은 서열식별번호 19 또는 서열식별번호 19의 변이체를 포함한다. 추가 실시양태에서, 중쇄 가변 영역은 서열식별번호 27 또는 서열식별번호 27의 변이체를 포함하고, 경쇄 가변 영역은 서열식별번호 28 또는 서열식별번호 28의 변이체, 서열식별번호 29 또는 서열식별번호 29의 변이체, 또는 서열식별번호 30 또는 서열식별번호 30의 변이체를 포함한다. 상기 실시양태에서, 변이체 경쇄 또는 중쇄 가변 영역 서열은 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 아미노산 치환을 제외하면, 참조 서열과 동일하다. 일부 실시양태에서, 치환은 프레임워크 영역 내에 (즉, CDR 바깥쪽에) 위치한다. 일부 실시양태에서, 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 아미노산 치환은 보존적 치환이다.

본 발명의 복합 제제의 한 실시양태에서, 항-인간 PD-1 항체 또는 항원 결합 단편은 서열식별번호 4를 포함하거나, 또는 그로 이루어진 경쇄 가변 영역 및 서열식별번호 9를 포함하거나, 또는 그로 이루어진 중쇄 가변 영역을 포함한다. 추가 실시양태에서, 항-인간 PD-1 항체 또는 항원 결합 단편은 서열식별번호 14를 포함하거나, 또는 그로 이루어진 경쇄 가변 영역 및 서열식별번호 19를 포함하거나, 또는 그로 이루어진 중쇄 가변 영역을 포함한다. 본 발명의 제제의 한 실시양태에서, 항-인간 PD-1 항체 또는 항원 결합 단편은 서열식별번호 28를 포함하거나, 또는 그로 이루어진 경쇄 가변 영역 및 서열식별번호 27를 포함하거나, 또는 그로 이루어진 중쇄 가변 영역을 포함한다. 추가 실시양태에서, 항-인간 PD-1 항체 또는 항원 결합 단편은 서열식별번호 29를 포함하거나, 또는 그로 이루어진 경쇄 가변 영역 및 서열식별번호 27을 포함하거나, 또는 그로 이루어진 중쇄 가변 영역을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 서열식별번호 30을 포함하거나, 또는 그로 이루어진 경쇄 가변 영역 및 서열식별번호 27을 포함하거나, 또는 그로 이루어진 중쇄 가변 영역을 포함한다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명의 복합 제제는 항-인간 PD-1 항체, 또는 상기 기술된 V_L 도메인 또는 V_H 도메인 중 하나와 적어도 95%, 90%, 85%, 80%, 75% 또는 50%의 서열 상동성을 가지는 V_L 도메인 및/또는V_H 도메인을 가지고, PD-1에 특이적인 결합을 보이는 항원 결합 단백질을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 복합 제제의 항-인간 PD-1 항체 또는 항원 결합 단백질은 최대 1, 2, 3, 4, 또는 5개 또는 그 초과의 아미노산 치환을 가지는 V_L 및 V_H 도메인을 포함하고, PD-1에 특이적인 결합을 보인다.

상기 실시양태 중 임의의 것에서, PD-1 API는 인간 PD-1에 특이적으로 결합하는 전장 항-PD-1 항체 또는 그의 항원 결합 단편일 수 있다. 특정 실시양태에서, PD-1 API은 IgM, IgG, IgD, IgA, 및 IgE를 비롯한, 임의 부류의 면역글로불린으로부터 선택되는 전장 항-PD-1 항체이다. 바람직하게, 항체는 IgG 항체이다. IgG₁, IgG₂, IgG₃, 및 IgG₄를 비롯한, IgG의 임의의 이소타입이 사용될 수 있다. 상이한 불변 도메인은 본원에 제공된 V_L 및 V_H 영역에 첨부될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항체 (또는 단편)의 특정의 의도된 용도가 변경된 이펙터 기능을 요구하는 것이라면, IgG1 이외의 다른 중쇄 불변 도메인이 사용될 수 있다. IgG1 항체가 긴 반감기, 및 예컨대, 보체 활성화 및 항체-의존적 세포성 세포독성과 같은 이펙터 기능을 제공하지만, 상기 활성이 항체의 모든 용도에 바람직하지 않을 수 있다. 상기 경우에, 예를 들어, IgG4 불변 도메인이 사용할 수 있다.

본 발명의 실시양태에서, PD-1 API는 서열식별번호 5에 기재된 아미노산 잔기의 서열을 포함하거나, 또는 그로 이루어진 경쇄, 및 서열식별번호 10에 기재된 아미노산 잔기의 서열을 포함하거나, 또는 그로 이루어진 중쇄를 포함하는 항-PD-1 항체이다. 대안적 실시양태에서, PD-1 API는 서열식별번호 15에 기재된 아미노산 잔기의 서열을 포함하거나, 또는 그로 이루어진 경쇄, 및 서열식별번호 20에 기재된 아미노산 잔기의 서열을 포함하거나, 또는 그로 이루어진 중쇄를 포함하는 항-PD-1 항체이다. 추가 실시양태에서, PD-1 API는 서열식별번호 32에 기재된 아미노산 잔기의 서열을 포함하거나, 또는 그로 이루어진 경쇄, 및 서열식별번호 31에 기재된 아미노산 잔기의 서열을 포함하거나, 또는 그로 이루어진 중쇄를 포함하는 항-PD-1 항체이다. 추가 실시양태에서, PD-1 API는 서열식별번호 33에 기재된 아미노산 잔기의 서열을 포함하거나, 또는 그로 이루어진 경쇄, 및 서열식별번호 31에 기재된 아미노산 잔기의 서열을 포함하거나, 또는 그로 이루어진 중쇄를 포함하는 항-PD-1 항체이다. 추가의 또 다른 실시양태에서, PD-1 API는 서열식별번호 34에 기재된 아미노산 잔기의 서열을 포함하거나, 또는 그로 이루어진 경쇄, 및 서열식별번호 31에 기재된 아미노산 잔기의 서열을 포함하거나, 또는 그로 이루어진 중쇄를 포함하는 항-PD-1 항체이다. 본 발명의 일부 복합 제제에서, PD-1 API는 펨브롤리주맙 또는 펨브롤리주맙 바이오시밀러(biosimilar)이다. 본 발명의 일부 복합 제제에서, PD-1 API는 니볼루맙 또는 니볼루맙 바이오시밀러이다.

보통, 본 발명의 항-PD-1 항체 및 항원 결합 단편의 아미노산 서열 변이체, 또는 본 발명의 항-CTLA4 항체 및 항원 결합 단편은 참조 항체 또는 항원 결합 단편의 아미노산 서열 (예컨대 중쇄, 경쇄, V_H, V_L, 또는 인간화 서열)과 적어도 75%의 아미노산 서열 동일성, 더욱 바람직하게, 적어도 80%, 더욱 바람직하게, 적어도 85%, 더욱 바람직하게, 적어도 90%, 및 가장 바람직하게, 적어도 95, 98, 또는 99%의 아미노산 서열 동일성을 가지는, 아미노산 서열을 가질 것이다. 서열에 관한 동일성 또는 상동성은 본원에서 서열 동일성(%)이 최대치에 도달하도록 서열을 정렬하고, 필요할 경우, 갭을 도입한 후에 항-PD-1 잔기와 동일한 후보 서열 내의 아미노산 잔기의 백분율로서 정의되고, 이때 임의의 보존적 치환은 서열 동일성의 일부로 간주되지 않는다. N-말단, C-말단, 또는 내부 연장, 결실, 또는 항체 서열 내로의 삽입은 서열 동일성 또는 상동성에 영향을 미치는 것으로 해석되지 않을 것이다.

서열 동일성은 두 서열이 최적으로 정렬되었을 때, 두 폴리펩티드의 아미노산이 등가 위치에서 동일한 정도를 지칭한다. 서열 동일성은, 알고리즘의 파라미터가 전체 길이의 각 참조 서열에 대해 각 서열 사이가 가장 크게 매칭되도록 선택되는 것인 BLAST 알고리즘을 사용하여 측정될 수 있다. 하기 참조문헌은 서열 분석을 위해 자주 사용되는 BLAST 알고리즘에 관한 것이다: 문헌 [BLAST ALGORITHMS: Altschul, S.F., et al., (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410]; [Gish, W., et al., (1993) Nature Genet. 3:266-272]; [Madden, T.L., et al., (1996) Meth. Enzymol. 266:131-141]; [Altschul, S.F., et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402]; [Zhang, J., et al., (1997) Genome Res. 7:649-656]; [Wootton, J.C., et al., (1993) Comput. Chem. 17:149-163]; [Hancock, J.M. et al., (1994) Comput. Appl. Biosci. 10:67-70]; [ALIGNMENT SCORING SYSTEMS: Dayhoff, M.O., et al., "A model of evolutionary change in proteins." in Atlas of Protein Sequence and Structure, (1978) vol. 5, suppl. 3. M.O. Dayhoff (ed.), pp. 345-352, Natl. Biomed. Res. Found., Washington, DC]; [Schwartz, R.M., et al., "Matrices for detecting distant relationships." in Atlas of Protein Sequence and Structure, (1978) vol. 5, suppl. 3." M.O. Dayhoff (ed.), pp. 353-358, Natl. Biomed. Res. Found., Washington, DC]; [Altschul, S.F., (1991) J. Mol. Biol. 219:555-565]; [States, D.J., et al., (1991) Methods 3:66-70]; [Henikoff, S., et al., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915-10919]; [Altschul, S.F., et al., (1993) J. Mol. Evol. 36:290-300]; [ALIGNMENT STATISTICS: Karlin, S., et al., (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268]; [Karlin, S., et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877]; [Dembo, A., et al., (1994) Ann. Prob. 22:2022-2039]; 및 [Altschul, S.F. "Evaluating the statistical significance of multiple distinct local alignments." in Theoretical and Computational Methods in Genome Research (S. Suhai, ed.), (1997) pp. 1-14, Plenum, New York].

유사하게, 경쇄 부류 또한 본원의 조성물 및 방법에서 사용될 수 있다. 구체적으로, 카파, 람다, 또는 그의 변이체가 본 조성물 및 방법에서 유용하다.

<표 2>

예시적인 PD-1 항체 서열

<표 3>

본 발명의 복합 제제, 방법 및 용도에서 유용한 추가의 PD-1 항체 및 항원 결합 단편.

본 발명의 복합 제제의 일부 실시양태에서, PD-1 API (즉, 항-PD-1 항체 또는 그의 항원 결합 단편)는 약 25 mg/mL 내지 약 100 mg/mL의 농도로 존재한다. 대안적 실시양태에서, API는 약 10 mg/mL, 약 25 mg/mL, 약 50 mg/mL, 약 75 mg/mL, 또는 약 100 mg/mL의 농도로 존재한다.

항- CTLA4 항체 및 그의 항원 결합 단편

본 발명은 활성 제약 성분 (CTLA4 API)으로서 인간 CTLA4에 특이적으로 결합하는 항-CTLA4 항체 또는 그의 항원 결합 단편 (예컨대, 인간 또는 인간화 항-CTLA4 항체)을 포함하는 안정한 생물학적 제제 뿐만 아니라, 본 발명의 제제를 사용하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 (i) 인간 CTLA4에 특이적으로 결합하는 항-CTLA4 항체 또는 그의 항원 결합 단편 (예컨대, 인간 또는 인간화 항-CTLA4 항체) 및 (ii) 인간 PD-1에 특이적으로 결합하는 항-인간 PD-1 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 안정한 생물학적 복합 제제를 제공한다. 복합 제제를 비롯한 본 발명의 제제 및 방법에서 임의의 항-CTLA4 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 사용될 수 있다. 하기 표 4-8 및 도 34는 복합 제제를 비롯한 본 발명의 제제 및 방법에서 유용한 예시적인 항-CTLA4 항체 및 항원 결합 단편에 대한 아미노산 서열을 제공한다.

복합 제제를 비롯한, 제제의 한 실시양태에서, 항-CTLA-4 항체는 미국 특허 번호 6,984,720 및 문헌 [WHO Drug Information 19(4): 61 (2005)]에 개시된 현재 이필리무맙으로 공지되어 있고, 여보이(Yervoy)™로서 시판되는 인간 모노클로날 항체 10D1이다. 또 다른 실시양태에서, 항-CTLA-4 항체는 미국 특허 출원 공개 번호 2012/263677, 또는 PCT 국제 출원 공개 번호 WO 2012/122444 또는 2007/113648 A2에 기술되어 있는 IgG2 모노클로날 항체인 트레멜리무맙 (이는 또한 CP-675,206으로도 공지되어 있다)이다.

복합 제제를 비롯한, 제제 중 하나에서, 항-CTLA-4 항체는 서열식별번호 84에 기재된 아미노산 서열을 가지는 중쇄, 및 서열식별번호 85에 기재된 아미노산 서열을 가지는 경쇄를 포함하는 모노클로날 항체이다. 일부 실시양태에서, CTLA4 항체는 단편이 CTLA4에 특이적으로 결합하는 것인, 서열식별번호 84 및/또는 서열식별번호 85의 항원 결합 단편이다.

복합 제제를 비롯한, 본 발명의 제제의 한 실시양태에서, 항-CTLA-4 항체는 국제 출원 공개 번호 WO 2016/015675 A1에 개시된 항-CTLA-4 항체, 또는 그의 항원 결합 단편 중 임의의 것이다. 한 실시양태에서, 항-CTLA4 항체는 하기 CDR:

아미노산 서열 GFTFSDNW (서열식별번호 35)를 포함하는 HCDR1

아미노산 서열 IRNKPYNYET (서열식별번호 36)를 포함하는 HCDR2

아미노산 서열 TAQFAY (서열식별번호 37)를 포함하는 HCDR3

및/또는

아미노산 서열 ENIYGG (서열식별번호 38)를 포함하는 LCDR1

아미노산 서열 GAT (서열식별번호 39)를 포함하는 LCDR2

QNVLRSPFT (서열식별번호 40); QNVLSRHPG (서열식별번호 41); 또는 QNVLSSRPG (서열식별번호 42)로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 모노클로날 항체이다.

복합 제제를 비롯한, 본 발명의 제제의 한 실시양태에서, 항-CTLA4 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 가변 중쇄 및 가변 경쇄를 포함한다. 한 실시양태에서, 가변 중쇄 및 가변 경쇄는 8D2/8D2 (RE) 또는 그의 변이체의 VH 및 VL 서열을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 가변 중쇄 및 가변 경쇄는 8D2H1L1 또는 그의 변이체의 VH 및 VL 서열을 포함한다. 추가 실시양태에서, 가변 중쇄 및 가변 경쇄는 8D2H2L2 또는 그의 변이체의 VH 및 VL 서열을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 가변 중쇄 및 가변 경쇄는 8D3H3L3 또는 그의 변이체의 VH 및 VL 서열을 포함한다. 추가 실시양태에서, 가변 중쇄 및 가변 경쇄는 8D2H2l17 또는 그의 변이체의 VH 및 VL 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 8D2/8D2 (RE), 8D2H1L1, 8D2H2L2, 8D2H2L15, 또는 8D2H2L17 중 임의의 것의 변이체의 18번 위치의 메티오닌은 독립적으로 류신, 발린, 이소류신, 및 알라닌으로부터 선택되는 아미노산으로 치환된다. 변이체의 또 다른 실시양태에서, 8D2/8D2 (RE), 8D2H1L1, 8D2H2L2, 8D2H2L15, 또는 8D2H2L17 중 임의의 것의 변이체의 18번 위치의 메티오닌은 류신으로 치환된다.

복합 제제를 비롯한, 제제의 한 실시양태에서, 항-CTLA4 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 8D2H2L2 또는 그의 변이체이고, 여기서, 8D2H2L2 변이체의 가변 중쇄 (VH) 아미노산 서열에서 18번 위치의 메티오닌은 독립적으로 류신, 발린, 이소류신, 및 알라닌으로부터 선택되는 아미노산으로 치환된다.

<표 4>

항-CTLA4 항체의 예시적인 서열

복합 제제를 비롯한, 본 발명의 제제의 또 다른 실시양태에서, 복합 제제를 비롯한, 본 발명의 제제의 또 다른 실시양태에서, 항-CTLA4 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 8D2/8D2 (RE) 변이체 1의 VH 및 VL 쇄 서열을 포함한다. 추가 실시양태에서, 항-CTLA4 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 8D2H1L1 변이체 1의 VH 및 VL 쇄 서열을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 항-CTLA4 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 8D2H2L2 변이체 1의 VH 및 VL 쇄 서열을 포함한다. 추가 실시양태에서, 항-CTLA4 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 8D2H2L15의 변이체의 VH 및 VL 쇄 서열을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 항-CTLA4 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 8D2H2l17의 변이체의 VH 및 VL 쇄 서열을 포함한다.

복합 제제를 비롯한, 본 발명의 제제의 한 실시양태에서, 항-CTLA4 항체는 2016년 8월 23일 출원된 PCT 국제 출원 번호 PCT/CN2016/096357에 기술된 항-CTLA4 항체, 또는 그의 항원 결합 단편 중 임의의 것이다. 한 실시양태에서, 항-CTLA4 항체는 하기 VH 쇄 및 VL 쇄 아미노 서열을 포함하는 마우스 항체 4G10, 및 상기 항체의 인간화 버전이다.

<표 5>

뮤린 항-CTLA4 항체

복합 제제를 비롯한, 본 발명의 제제의 한 실시양태에서, 항-CTLA4 항체는 하기 CDR:

GYSFTGYT (서열식별번호 57) 또는 GYTX₁N (서열식별번호 58) (여기서, X₁은 M,V,L,I,G,A,S,T이다)으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1

INPYNX₁IX₂, (서열식별번호 59) (여기서, X₁은 N, D 또는 E이고, X₂는 T, D, E, G 또는 A이다); 또는 LINPYNX₁IX₂NYX₃QKFX₄G (서열식별번호 60) (여기서, X₁은 N, D이고; X₂는 T, D, E, G, 또는 A이고; X₃은 A 또는 N이고; X₄는 Q 또는 M이다)로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2

LDYRSY (서열식별번호 61) 또는 ARLDYRSY (서열식별번호 62)로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3

및/또는

TGAVTTSNF (서열식별번호 63), 또는 GSSTGAVTTSNFX₁N (서열식별번호 64) (여기서, X₁은 P 또는 A이다)으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1;

GTN, 또는 GTNNX₁AX₂ (서열식별번호 65) (여기서, X₁은 K, R, 또는 M 또는 C를 제외한 임의의 아미노산이고; X₂는 S 또는 P이다)로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2;

ALX₁YSNHX₂ (서열식별번호 66) (여기서, X₁은 W, 또는 M 또는 C를 제외한 임의의 아미노산이고; X₂는 W, 또는 M 또는 C를 제외한 임의의 아미노산이다); 또는 ALX₁YSNHX₂V (서열식별번호 67) (여기서, X₁은 W, 또는 M 또는 C를 제외한 임의의 아미노산이고, X₂는 W, 또는 M 또는 C를 제외한 임의의 아미노산이다)로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 모노클로날 항체이다.

또 다른 실시양태에서, 4G10 항체의 인간화 VH 서열은 하기 VH 서열 중 임의의 것을 포함한다:

<표 6>

예시적인 항-CTLA4 항체 서열

복합 제제를 비롯한, 본 발명의 제제의 다른 실시양태에서, 4G10 항체의 인간화 VL 서열은 하기 VL 서열 중 임의의 것을 포함한다:

<표 7>

예시적인 항-CTLA4 항체 서열

일부 실시양태에서, 항-CTLA4 항체는 4G10H1L1의 VH 및 VL 서열에 상응하는 가변 중쇄 및 가변 경쇄 서열을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 항-CTLA4 항체는 4G10H3L3의 VH 및 VL 서열에 상응하는 가변 중쇄 및 가변 경쇄 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 항-CTLA4 항체는 4G10H3L3의 VH 및 VL 서열에 상응하는 가변 중쇄 및 가변 경쇄 서열을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 항-CTLA4 항체는 4G10H5L3의 VH 및 VL 서열에 상응하는 가변 중쇄 및 가변 경쇄 서열을 포함한다.

<표 8>

예시적인 항-CTLA4 항체 서열

<표 9>

복합 제제를 비롯한, 본 발명의 제제의 또 다른 실시양태에서, 항-CTLA-4 항체는 이필리무맙, 트레멜리무맙, 또는 8D2/8D2 (RE) 또는 8D2/8D2 (RE) 변이체 1, 8D2H1L1 또는 8D2H1L1 변이체 1, 8D2H2L2 또는 8D2H2L2 변이체 1, 8D3H3L3, 8D2H2L15 또는 그의 8D2H2L15 변이체 1, 8D2H2L17 또는 8D2H2L17 변이체 1, 4G10H1L1 또는 그의 변이체, 4G10H3L3 또는 그의 변이체, 4G10H3L3 또는 그의 변이체, 및 4G10H5L3 또는 그의 변이체를 비롯한, 상기 기술된 항체 중 임의의 것과 같이, 인간 CTLA-4의 동일한 에피토프 영역과 인간 CTLA-4에의 결합에 대해 교차 경쟁하거나, 또는 그에 결합하는 항체, 또는 그의 항원 결합 단편이다.

제제

본 발명의 일부 측면에서, 본원에 기술된 제제는 항체 응집체 (고분자량 종) 및 미립자, 고분자량 및 저분자량 종의 형성을 최소화시키고, 메티오닌 잔기의 산화를 최소화시키고, 항체가 확실하게 시간 경과에 따라 생물학적 활성을 그대로 유지할 수 있게 한다.

한 측면에서, 본 발명은 항-CTLA4 항체, 또는 그의 항원 결합 단편으로 이루어진 다양한 제제를 포함한다. 예를 들어, 본 발명은 (i) 항-CTLA4 항체 또는 그의 항원 결합 단편, (ii) 완충제 (예컨대, L-히스티딘 또는 아세테이트), (iii) 비환원성 당 (예컨대, 수크로스); (iv) 비이온성 계면활성제 (예컨대, 폴리소르베이트 80); 및 (v) 항산화제 (예컨대, L-메티오닌)를 포함하는 제제를 포함한다. 한 측면에서, 제제는 항-PD-1 항체를 추가로 포함한다. 한 측면에서, 제제는 킬레이터를 추가로 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 킬레이터는 디에틸렌트리아민펜타아세트산 (DTPA)이다.

한 측면에서, 본 발명은 또한 항-CTLA4 항체, 또는 그의 항원 결합 단편 및 항-인간 PD-1 항체, 또는 그의 항원 결합 단편으로 이루어진 다양한 복합 제제를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 (i) 항-CTLA4 항체, 또는 그의 항원 결합 단편, (ii) 항-인간 PD-1 항체 또는 그의 항원 결합 단편, (iii) 완충제 (예컨대, L-히스티딘 또는 아세테이트), (iv) 비환원성 당 (예컨대, 수크로스), (v) 비이온성 계면활성제 (예컨대, 폴리소르베이트 80), 및 (vi) 항산화제 (예컨대, L-메티오닌)를 포함하는 제제를 포함한다. 한 실시양태에서, 제제는 킬레이터 (예컨대, DTPA)를 추가로 포함할 수 있다.

본원에 기술된 제약 제제는 완충제를 포함할 수 있다. "완충제"라는 용어는 본원에 기술된 액체 제제의 용액 pH를 허용가능한 범위 내에서 유지시키거나, 또는 본원에 기술된 동결건조된 제제의 경우, 동결건조 이전 및/또는 재구성 이후에 허용가능한 용액 pH를 제공하는 작용제를 포함한다.

본 발명의 제약 제제 및 방법에서 유용한 완충제로는 숙시네이트 (숙신산나트륨 또는 숙신산칼륨), L-히스티딘, 포스페이트 (인산나트륨 또는 인산칼륨), 트리스 (트리스(히드록시메틸) 아미노메탄), 디에탄올아민, 시트르레이트 (시트르산나트륨), 아세테이트 (아세트산나트륨) 등을 포함한다. 본 발명의 한 실시양태에서, 완충제는 제제 중에 약 1-20 mM (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 및 20 mM)의 농도로 존재한다. 본 발명의 구체적인 실시양태에서, 완충제는 히스티딘 완충제이다. 또 다른 실시양태에서, 완충제는 L-히스티딘 완충제이다.

한 실시양태에서, 완충제의 pH는 약 4.5 내지 약 6.5 범위이다. 또 다른 실시양태에서, pH는 약 5.0 - 6.0 범위이다. 추가 실시양태에서, pH 범위는 약 5.3 - 5.8이다. 또 다른 실시양태에서, pH는 약 5.5이다. 예시적인 제제에 이르렀을 때, pH 범위 5.0-6.0의 히스티딘 및 아세테이트 완충제가 적합성에 대해 연구되었다. 예컨대, "pH는 pH 5.5 내지 6.0"과 같이, pH 값이 범위로 언급될 때, 상기 범위는 언급된 값을 포함하는 것으로 의도된다. 예를 들어, 약 5.0 내지 약 6.0 범위는 5.0, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 및 6.0을 포함한다. 동결건조된 제제의 경우, 달리 명시되지 않는 한, pH는 재구성 이후의 pH를 지칭한다. pH는 전형적으로 표준 유리 벌브 pH 측정기를 이용하여 25℃에서 측정된다. 본원에서 사용되는 바, "pH X의 히스티딘 완충제"를 포함하는 용액이란, pH X이고, 히스티딘 완충제를 포함하는 용액을 지칭하고, 즉, pH는 상기 용액의 pH를 지칭하는 것으로 의도된다. 항-CTLA4 항체와 비교하여 더 높은 농도의 항-인간 PD-1 항체를 함유하는 복합 제제의 일부 실시양태에서, 복합 제제의 pH는 약 5.0이다.

본 발명의 한 실시양태에서, 항-CTLA4 제제, 및 항-CTLA4 및 항-인간 PD-1로 이루어진 복합 제제는 비환원성 당을 포함한다. 본원에서 사용되는 바, "비환원성 당"은 알데히드 기 또는 유리 케톤 기를 함유하지 않거나, 또는 그를 함유하도록 전환될 수 없기 때문에, 환원제로서 작용할 수 없는 당이다. 비환원성 당의 예로는 이당류, 예컨대, 수크로스 및 트레할로스를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 한 실시양태에서, 비환원성 당은 약 1-10% (w/v) (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10% (w/v))의 양으로 존재한다. 또 다른 실시양태에서, 비환원성 당은 약 6% (w/v) 내지 약 8% (w/v) (6, 7, 또는 8% (w/v))의 양으로 존재한다. 추가 실시양태에서, 비환원성 당은 약 6% (w/v)의 양으로 존재한다. 추가 실시양태에서, 비환원성 당은 약 7% (w/v)의 양으로 존재한다. 추가 실시양태에서, 비환원성 당은 약 8% (w/v)의 양으로 존재한다. 한 실시양태에서, 비환원성 당은 수크로스, 트레할로스, 또는 라피노스이다. 또 다른 실시양태에서, 비환원성 당은 수크로스이다. 추가 실시양태에서, 수크로스는 6-8% w/v로 존재한다. 한 실시양태에서, 수크로스는 6% (w/v)로 존재한다. 한 실시양태에서, 수크로스는 7% (w/v)로 존재한다. 한 실시양태에서, 수크로스는 8% (w/v)로 존재한다.

본원에 기술된 제제는 또한 계면활성제를 포함한다. 본원에서 사용되는 바, 계면활성제는 사실상 양쪽성인 표면 활성제이다. 계면활성제는 안정성을 제공하기 위해, 응집을 감소시키고/거나, 방지하기 위해, 또는 프로세싱 조건 동안, 예컨대, 정제, 여과, 냉동 건조, 수송, 보관 및 전달 동안 단백질 손상을 막고/거나, 억제시키기 위해 본원의 제제에 첨가될 수 있다. 본 발명의 한 측면에서, 계면활성제는 활성 성분(들)에 추가의 안정성을 제공하는 데 유용할 수 있다.

본원에 기술된 제제, 및 복합 제제에서 유용할 수 있는 비이온성 계면활성제로는 폴리소르베이트-20 (폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노라우레이트), 폴리소르베이트-40 (폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노팔미테이트), 폴리소르베이트-60 (폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노스테아레이트), 및 폴리소르베이트-80 (폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레에이트)을 포함하는 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르 (트윈(Tween)® (유니케마 아메리카 LLC(Uniquema Americas LLC: 미국 델라웨어주 윌밍톤))이라는 상표명으로 시판되는 폴리소르베이트); 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르, 예컨대, Brij® 58 (유니케마 아메리카 LLC: 미국 델라웨어주 윌밍톤) 및 Brij® 35; 폴록사머 (예컨대, 폴록사머 188); 트리톤(Triton)® X-100 (유니온 카파이드 코포레이션(Union Carbide Corp.: 미국 텍사스주 휴스톤)) 및 트리톤® X-114; NP40; 스팬(Span) 20, 스팬 40, 스팬 60, 스팬 65, 스팬 80 및 스팬 85; 에틸렌 및 프로필렌 글리콜의 공중합체 (예컨대, 비이온성 계면활성제의 플루로닉(pluronic)® 시리즈, 예컨대, 플루로닉® F68, 플루로닉® 10R5, 플루로닉® F108, 플루로닉® F127, 플루로닉® F38, 플루로닉® L44, 플루로닉® L62 (바스프 코포레이션(BASF Corp.: Ludwigshafen: 독일 루드빅샤펜)); 및 소듐 도데실 술페이트 (SDS)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 한 실시양태에서, 비이온성 계면활성제는 폴리소르베이트 80 또는 폴리소르베이트 20이다. 한 실시양태에서, 비이온성 계면활성제는 폴리소르베이트 20이다. 또 다른 실시양태에서, 비이온성 계면활성제는 폴리소르베이트 80이다.

본 발명의 제제에 포함되는 비이온성 계면활성제의 양은 원하는 기능을 수행하기에 충분한 양, 즉, 제제 중 활성 제약 성분 (즉, 항-CTLA4 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 또는 항-CTLA4 항체 또는 그의 항원 결합 단편 및 항-인간 PD-1 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 그 둘 모두)을 안정화시키는 데 필요한 최소량이다. 폴리소르베이트 80에 대하여 열거된 모든 백분율은 % w/v이다. 전형적으로, 계면활성제는 약 0.008% w/v 내지 약 0.1% w/v의 농도로 존재한다. 본 발명의 상기 측면의 일부 실시양태에서, 계면활성제는 제제 중 약 0.01% 내지 약 0.1%; 약 0.01% 내지 약 0.09%; 약 0.01% 내지 약 0.08%; 약 0.01% 내지 약 0.07%; 약 0.01% 내지 약 0.06%; 약 0.01% 내지 약 0.05%; 약 0.01% 내지 약 0.04%; 약 0.01% 내지 약 0.03%, 약 0.01% 내지 약 0.02%, 약 0.015% 내지 약 0.04%; 약 0.015% 내지 약 0.03%, 약 0.015% 내지 약 0.02%, 약 0.02% 내지 약 0.04%, 약 0.02% 내지 약 0.035%, 또는 약 0.02% 내지 약 0.03%의 양으로 존재한다. 구체적인 실시양태에서, 계면활성제는 약 0.02%의 양으로 존재한다. 대안적 실시양태에서, 계면활성제는 약 0.01%, 약 0.015%, 약 0.025%, 약 0.03%, 약 0.035%, 또는 약 0.04%의 양으로 존재한다.

본 발명의 예시적인 실시양태에서, 계면활성제는 폴리소르베이트 20 및 폴리소르베이트 80으로 이루어진 군으로부터 선택되는 비이온성 계면활성제이다. 바람직한 실시양태에서, 계면활성제는 폴리소르베이트 80이다.

구체적인 실시양태에서, 복합 제제를 비롯한, 본 발명의 제제는 약 0.01% w/v 내지 약 0.04% w/v 폴리소르베이트 80을 포함한다. 추가 실시양태에서, 본원에 기술된 제제는 약 0.008% w/v, 약 0.01% w/v의 양으로 폴리소르베이트 80을 포함한다. 한 실시양태에서, 폴리소르베이트 80의 양은 약 0.015 w/v%이다. 또 다른 실시양태에서, 폴리소르베이트 80의 양은 약 0.02% w/v이다. 추가 실시양태에서, 폴리소르베이트 80의 양은 약 0.025% w/v이다. 또 다른 실시양태에서, 폴리소르베이트 80의 양은 약 0.03% w/v이다. 추가 실시양태에서, 폴리소르베이트 80의 양은 약 0.035% w/v이다. 또 다른 실시양태에서, 폴리소르베이트 80의 양은 약 0.04% w/v이다. 추가 실시양태에서, 폴리소르베이트 80의 양은 약 0.045% w/v이다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 제제는 약 0.02% w/v 폴리소르베이트 80을 포함한다.

복합 제제를 비롯한, 본 발명의 제제는 또한 메티오닌, 또는 그의 제약상 허용되는 염을 포함한다. 한 실시양태에서, 메티오닌은 L-메티오닌이다. 또 다른 실시양태에서, 메티오닌은 L-메티오닌의 제약상 허용되는 염, 예컨대, 예를 들어, 메티오닌 HCl이다. 한 실시양태에서, 메티오닌은 제제 중 약 1-20 mM (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 및 20 mM)의 농도로 존재한다. 또 다른 실시양태에서, 메티오닌은 약 5 mM 내지 약 10 mM (5, 6, 7, 8, 9 및 10 mM)로 존재한다. 또 다른 실시양태에서, 메티오닌은 약 10 mM로 존재한다.

본원에 기술된 제제 및 복합 제제는 킬레이트화제를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 한 실시양태에서, 킬레이트화제는 제제 중 약 1-50 μM (예컨대, 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 또는 50 μM)의 농도로 존재한다. 한 실시양태에서, 킬레이트화제는 DTPA이다. 또 다른 실시양태에서, 킬레이트화제는 EDTA이다. 일부 추가의 실시양태에서, DTPA는 본원에 기술된 제제 중 임의의 것에서 하기 양 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 또는 50 μM 중 임의의 양으로 존재할 수 있는 항산화제이다.

동결건조된 조성물

치료 단백질의 동결건조된 제제는 여러 장점을 제공한다. 동결건조된 제제는 일반적으로 용액 제제보다 더 우수한 화학적 안정성을 제공하고, 따라서, 증가된 반감기를 제공한다. 또한 동결건조된 제제는 임상 인자, 예컨대, 투여 또는 투약 경로에 따라 상이한 농도에서 재구성될 수 있다. 예를 들어, 동결건조된 제제는 피하 투여용으로 필요한 경우 고농도로 (즉, 작은 부피로), 또는 정맥내로 투여되는 경우에는 더 낮은 농도로 재구성될 수 있다. 특정 대상체에 대해 높은 용량의 투약이 요구된다면, 특히 주사 부피가 최소화되어야 하는 경우에 피하 투여된다면, 높은 농도 또한 필요할 수 있다. 상기의 한 동결건조된 항체 제제는 미국 특허 번호 6,267,958에 개시되어 있으며, 상기 특허는 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다. 또 다른 치료 단백질의 동결건조된 제제는 미국 특허 번호 7,247,707에 개시되어 있으며, 상기 특허는 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다.

전형적으로, 동결건조된 제제는 고농도의 약물 제품 (DP, 예시적인 실시양태에서, 인간화 항-PD-1 항체 펨브롤리주맙, 또는 그의 항원 결합 단편)의 재구성을 예상하고, 즉, 낮은 부피의 물 중에서의 재구성을 예상하고 제조된다. 그 후, 이어서, 물 또는 등장성 완충제로 희석하는 것이 DP를 더 낮은 농도로 희석하는 데 쉽게 사용될 수 있다. 전형적으로, 예컨대, 피하 투여를 위해 높은 DP 농도로 재구성될 때, 거의 등장성인 제제를 초래할 수준으로 부형제가 본 발명의 동결건조된 제제 내에 포함된다. 더 낮은 DP 농도를 제공하도록 더 큰 부피의 물에서 재구성되는 것은 재구성된 액제의 장성을 필연적으로 감소시키겠지만, 그러한 감소는 비-피하 투여, 예컨대, 정맥내 투여에서는 거의 중요하지 않을 수도 있다. 더 낮은 DP 농도에서 등장성을 원하는 경우, 동결건조된 분제를 표준의 낮은 부피의 물에서 재구성시킨 후, 등장성 희석제, 예컨대, 0.9% 염화나트륨으로 추가로 희석할 수 있다.

본 발명의 동결건조된 제제는 예비-동결건조 액제의 동결건조 (냉동-건조)에 의해 형성된다. 냉동-건조는 제제를 냉동시키고, 이어서, 1차 건조에 적합한 온도에서 물을 승화시킴으로써 달성된다. 상기 조건하에서, 생성물 온도는 제제의 공융점 또는 붕괴 온도 미만이다. 전형적으로, 1차 건조에 대한 선반 온도는 적합한 압력, 전형적으로는 약 50 내지 250 mTorr 범위의 압력에서 약 -30 내지 25℃ 범위일 것이다 (단, 생성물이 1차 건조 동안 냉동 상태 그대로 유지된다). 제제, 샘플을 보유하는 용기 (예컨대, 유리 바이알)의 크기 및 유형, 및 액체의 부피가 건조에 필요한 시간을 좌우할 것이고, 이는 수시간 내지 수일 (예컨대, 40-60 hr) 범위일 수 있다. 2차 건조 단계는, 주로 사용된 단백질의 유형 및 용기의 유형 및 크기에 따라, 약 0-40℃에서 수행될 수 있다. 2차 건조 시간은 생성물 내의 원하는 잔류 수분 수준에 의해 좌우되고, 전형적으로는 적어도 약 5시간이 소요된다. 전형적으로, 동결건조된 제제의 수분 함량은 약 5% 미만이고, 바람직하게는 약 3% 미만이다. 압력은 1차 건조 단계 동안 사용된 것과 동일할 수 있다. 냉동-건조 조건은 제제 및 바이알 크기에 따라 달라질 수 있다.

일부 경우에서, 전이 단계를 피하기 위해 단백질의 재구성이 수행되는 용기 내에서 단백질 제제를 동결건조시키는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 경우, 용기는, 예를 들어, 3, 5, 10, 20, 50 또는 100 cc 바이알일 수 있다.

본 발명의 동결건조된 제제는 투여 전에 재구성된다. 단백질은 약 약 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 75, 80, 90 또는 100 mg/mL 또는 그 초과의 농도, 예컨대, 150 mg/mL, 200 mg/mL, 250 mg/mL, 또는 300 mg/mL up 내지 약 500 mg/mL인 농도로 재구성될 수 있다. 한 실시양태에서, 재구성 후의 단백질 농도는 약 10-300 mg/ml이다. 한 실시양태에서, 재구성 후의 단백질 농도는 약 20-250 mg/ml이다. 한 실시양태에서, 재구성 후의 단백질 농도는 약 150-250 mg/ml이다. 한 실시양태에서, 재구성 후의 단백질 농도는 약 180-220 mg/ml이다. 한 실시양태에서, 재구성 후의 단백질 농도는 약 50-150 mg/ml이다. 한 실시양태에서, 재구성 후의 단백질 농도는 약 100 mg/ml이다. 한 실시양태에서, 재구성 후의 단백질 농도는 약 75 mg/ml이다. 한 실시양태에서, 재구성 후의 단백질 농도는 약 50 mg/ml이다. 한 실시양태에서, 재구성 후의 단백질 농도는 약 25 mg/ml이다. 높은 단백질 농도는 재구성된 제제의 피하 전달이 의도되는 경우에 특히 유용하다. 그러나, 다른 투여 경로, 예컨대, 정맥내 투여를 위해, 더 낮은 단백질 농도가 바람직할 수 있다 (예컨대, 약 5-50 mg/mL).

재구성은 비록 원하는 경우에는 다른 온도도 사용될 수 있지만, 확실하게 완전히 수화될 수 있도록 하기 위해 일반적으로는 약 25℃의 온도에서 수행된다. 재구성에 필요한 시간은, 예컨대, 희석제의 유형, 부형제(들)의 양 및 단백질에 좌우될 것이다. 예시적인 희석제로는 멸균수, 주사용 정균수 (BWFI), pH 완충 용액 (예컨대, 포스페이트 완충처리된 용액), 멸균성 식염수, 링거 용액 또는 덱스트로스 용액을 포함한다.

액체 조성물

액체 항체 제제는 액체 형태의 약물 물질 (예컨대, 항-인간화 PD-1) (예컨대, 수성 제제 중의 펨브롤리주맙)을 취하고, 정제 프로세스의 마지막 단계로서 그의 완충제를 원하는 완충제로 교환함으로써 제조될 수 있다. 본 실시양태에서는 동결건조 단계가 없다. 최종 완충제 중 약물 물질은 원하는 농도로 농축된다. 부형제, 예컨대, 수크로스및 폴리소르베이트 80이 약물 물질에 첨가되고, 적절한 완충제를 사용하여 최종 단백질 농도로 희석한다. 제제화된 최종 약물 물질을 0.22 ㎛ 필터를 사용하여 여과하고, 최종 용기 (예컨대, 유리 바이알) 내로 충전한다.

III. 사용 방법

본 발명은 또한 대상체에게 유효량의, 본 발명의 제제 중 임의의 것; 즉, 본원에 기술된 임의의 제제를 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 암을 치료하는 방법에 관한 것이다. 본 방법의 일부 구체적인 실시양태에서, 제제는 정맥 투여를 통해 대상체에게 투여된다. 다른 실시양태에서, 제제는 피하 투여를 통해 대상체에게 투여된다. 한 실시양태에서, 본 발명은 인간 환자에게 본 발명의 임의의 제제를 투여하는 단계를 포함하는, 인간 환자에서 암을 치료하는 방법을 포함한다.

본 발명의 방법 중 임의의 것에서, 암은 흑색종, 폐암, 두부경부암, 방광암, 유방암, 위장암, 다발성 골수종, 간세포암, 림프종, 신암, 중피종, 난소암, 식도암, 항문암, 담도암, 결장직장암, 자궁경부암, 갑상선암, 침샘암, 전립선암 (예컨대, 호르몬 불응성 전립선 선암종), 췌장암, 결장암, 식도암, 간암, 갑상선암, 교모세포종, 신경교종, 및 다른 신생물성 악성 종양으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.

일부 실시양태에서, 폐암은 비소세포 폐암이다.

대안적 실시양태에서, 폐암은 소세포 폐암이다.

일부 실시양태에서, 림프종은 호지킨 림프종이다.

다른 실시양태에서, 림프종은 비호지킨 림프종이다. 특정 실시양태에서, 림프종은 종격동 큰 B 세포 림프종이다.

일부 실시양태에서, 유방암은 삼중 음성 유방암이다.

추가 실시양태에서, 유방암은 ER+/HER2- 유방암이다.

일부 실시양태에서, 방광암은 요로암이다.

일부 실시양태에서, 두부경부 암은 비인두암이다. 일부 실시양태에서, 암은 갑상선암이다. 다른 실시양태에서, 암은 침샘암이다. 다른 실시양태에서, 암은 두부경부 편평세포 암종이다.

한 실시양태에서, 본 발명은 인간 환자에게 본 발명의 제제를 투여하는 단계를 포함하는, 인간 환자에서 전이성 비소세포 폐암 (NSCLC)을 치료하는 방법을 포함한다. 구체적인 실시양태에서, 환자는 PD-L1 발현율이 높은 종양 [(종양 비율 점수 (TPS) ≥50%)]을 앓고 있고, 이전에 백금 함유 화학요법으로 치료받은 적이 없는 환자이다. 다른 실시양태에서, 환자는 PD-L1 발현을 보이는 종양 (TPS ≥1%)을 앓고 있고, 이전에 백금 함유 화학요법으로 치료받은 환자이다. 또 다른 실시양태에서, 환자는 PD-L1 발현을 보이는 종양 (TPS ≥1%)을 앓고 있고, 이전에 백금 함유 화학요법으로 치료받은 적이 없는 환자이다. 구체적인 실시양태에서, 환자는 백금 함유 화학요법을 받았을 때, 또는 그 이후에 질환 진행을 보인 환자이다. 특정 실시양태에서, PD-L1 TPS는 FDA 승인 검사에 의해 측정된다. 특정 실시양태에서, 환자의 종양은 EGFR 또는 ALK 게놈 이상을 보이지 않는 것이다. 특정 실시양태에서, 환자의 종양은 EGFR 또는 ALK 게놈 이상을 보이고, 항-PD-1 항체, 또는 그의 항원 결합 단편을 받기 전, EGFR 또는 ALK 이상(들)에 대한 치료를 받았을 때, 또는 그 이후에 질환 진행을 보인 환자이다.

일부 실시양태에서, 암은 높은 수준의 현미부수체 불안정성 (MSI-H)의 전이성 결장직장암이다.

일부 실시양태에서, 암은 높은 수준의 현미부수체 불안정성 (MSI-H)의 고형 종양이다.

일부 실시양태에서, 암은 돌연변이 부담이 높은 고형 종양이다.

일부 실시양태에서, 암은 흑색종, 비소세포 폐암, 재발성 또는 불응성 고전적 호지킨 림프종, 두부경부 편평세포 암종, 요로암, 식도암, 위암, 및 간세포암으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

상기 치료 방법의 다른 실시양태에서, 암은 혈액암이다. 특정 실시양태에서, 혈액암은 급성 림프모구성 백혈병 (ALL), 급성 골수성 백혈병 (AML), 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 만성 골수성 백혈병 (CML), 미만성 큰 B 세포 림프종 (DLBCL), EBV-양성 DLBCL, 원발성 종격동 큰 B 세포 림프종, T 세포/조직구 우월성 큰 B 세포 림프종, 소포성 림프종, 호지킨 림프종 (HL), 외투막 세포 림프종 (MCL), 다발성 골수종 (MM), 골수성 세포 백혈병-1 단백질 (Mcl-1), 골수이형성 증후군 (MDS), 비호지킨 림프종 (NHL), 또는 소림프구성 림프종 (SLL)이다.

생검 또는 수술 물질 내의 종양-침윤성 림프구의 존재와 관련하여 개선된 무질환 생존 및 전체 생존을 나타내는 악성 종양, 예컨대, 흑색종, 결장직장암, 간암, 신장암, 위/식도암, 유방암, 췌장암 및 난소암이 본원에 기술된 방법 및 치료에 포함된다. 상기 암 하위유형은 T 림프구에 의한 면역 제어에 대해 감수성인 것으로 공지되어 있다. 추가로, 본원에 기술된 항체를 사용하여 성장이 억제될 수 있는 불응성 또는 재발성 악성종양도 포함된다.

본원에 기술된 제제를 이용한 치료가 이로울 수 있는 추가적인 암으로는 예를 들어, 카포시 육종, 간암, 비인두암, 림프종, 자궁경부암, 외음부암, 항문암, 음경암 및 구강암에 대해 인과 관계로 관련된 것으로 공지된 인간 면역결핍 바이러스, 간염 바이러스 클래스 A, B 및 C, 엡스타인 바(Epstein Barr) 바이러스, 인간 유두종 바이러스와 같은 바이러스로의 지속적인 감염과 연관된 것들이 포함된다.

제제는 감염 및 감염성 질환을 예방 또는 치료하는 데에도 또한 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 포유동물 대상체에게 유효량의 본 발명의 제제를 투여하는 단계를 포함하는, 포유동물 대상체에서 만성 감염을 치료하는 방법을 제공한다. 본 방법의 일부 구체적인 실시양태에서, 제제는 정맥내 투여를 통해 대상체에게 투여된다. 다른 실시양태에서, 제제는 피하 투여에 의해 대상체에게 투여된다.

상기 작용제는 병원체, 독소 및 자기-항원에 대한 면역 반응을 자극시키도록 단독으로, 또는 백신과 함께 조합하여 사용될 수 있다. 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 인간 면역결핍 바이러스, 간염 바이러스 클래스 A, B 및 C, 엡스타인 바 바이러스, 인간 시토메갈로바이러스, 인간 유두종 바이러스, 및 헤르페스 바이러스를 포함하나, 이에 제한되지 않는, 인간에게 감염성인 바이러스에 대한 면역 반응을 자극시키는 데 사용될 수 있다. 길항제 항-PD-1 항체 또는 항체 단편은 박테리아 또는 진균 기생물, 및 다른 병원체로의 감염에 대한 면역 반응을 자극시키는 데 사용될 수 있다. B형 및 C형 간염 및 HIV로의 바이러스 감염이 특히 만성 바이러스성 감염인 것으로 간주된다.

본 발명의 제제는 하나 이상의 "추가 치료제"와 함께 조합하여 환자에게 투여될 수 있다. 추가 치료제는 생체치료제 (VEGF, EGFR, Her2/neu, VEGF 수용체, 다른 성장 인자 수용체, CD20, CD40, CD-40L, OX-40, 4-1BB, 및 ICOS에 대한 항체를 포함하나, 이에 제한되지 않음), 면역원성 작용제 (예를 들어, 약독화된 암성 세포, 종양 항원, 항원 제시 세포, 예컨대, 종양 유래 항원 또는 핵산이 펄싱된 수지상 세포, 면역 자극 시토카인 (예를 들어, IL-2, IFNα2, GM-CSF), 및 예컨대, 제한하는 것은 아니지만, GM-CSF와 같은 면역 자극 시토카인을 코딩하는 유전자로 형질감염된 세포)일 수 있다.

상기 언급된 바와 같이, 본 발명의 방법의 일부 실시양태에서, 본 방법은 추가 치료제를 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 추가 치료제는 항-LAG3 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 항-GITR 항체, 또는 그의 항원 결합 단편, 항-TIGIT 항체, 또는 그의 항원 결합 단편, 항-CD27 항체 또는 그의 항원 결합 단편이다. 한 실시양태에서, 추가 치료제는 IL-12를 발현하는 뉴캐슬병 바이러스 벡터이다. 추가 실시양태에서, 추가 치료제는 디나시클립이다. 또 다른 추가 실시양태에서, 추가 치료제는 STING 효능제이다.

적합한 투여 경로로는 예를 들어, 근육내, 피하 뿐만 아니라, 경막내, 직접적인 뇌실내, 정맥내, 복강내 전달을 비롯한, 비경구 전달을 포함한다. 다양한 통상적인 방식으로, 예컨대, 복강내, 비경구, 동맥내 또는 정맥내 주사에 의해 약물을 투여할 수 있다. 용액의 부피가 제한되어야 하는 투여 모드 (예컨대, 피하 투여)의 경우, 동결건조된 제제는 고농도로 재구성될 수 있어야 한다.

추가 치료제의 투여량을 선택하는 것은 엔티티의 혈청 또는 조직 교체율, 증상 수준, 엔티티의 면역원성, 및 치료받는 개체 내의 표적 세포, 조직 또는 기관의 접근가능성을 비롯한 수개의 인자에 의존한다. 추가 치료제의 투여량은 허용가능한 수준의 부작용을 제공하는 양이어야 한다. 따라서, 각 추가 치료제 (예컨대, 생체치료제 또는 화학요법제)의 투약량 및 투야 빈도는 부분적으로는 특정 치료제, 치료되는 암의 중증도, 및 환자 특징에 의존할 것이다. 항체, 시토카인, 및 소분자의 적절한 용량을 선택하는 것에서의 가이던스가 이용가능하다. 예컨대, 문헌 [Wawrzynczak (1996) Antibody Therapy, Bios Scientific Pub. Ltd, Oxfordshire, UK]; [Kresina (ed.) (1991) Monoclonal Antibodies, Cytokines and Arthritis, Marcel Dekker, New York, NY]; [Bach (ed.) (1993) Monoclonal Antibodies and Peptide Therapy in Autoimmune Diseases, Marcel Dekker, New York, NY]; [Baert et al. (2003) New Engl . J. Med . 348:601-608]; [Milgrom et al. (1999) New Engl. J. Med . 341:1966-1973]; [Slamon et al. (2001) New Engl . J. Med . 344:783-792]; [Beniaminovitz et al. (2000) New Engl . J. Med . 342:613-619]; [Ghosh et al. (2003) New Engl . J. Med . 348:24-32]; [Lipsky et al. (2000) New Engl. J. Med . 343:1594-1602]; [Physicians' Desk Reference 2003 (Physicians' Desk Reference, 57th Ed)]; [Medical Economics Company; ISBN: 1563634457; 57th edition (November 2002)]을 참조한다. 적절한 투여량 요법은 예컨대, 치료에 영향을 미치는 것으로 관련 기술분야에 공지되어 있거나, 의심되거나, 또는 치료에 영향을 미칠 것으로 예측되는 파라미터 또는 인자를 사용하여, 임상의에 의해 결정될 수 있고, 이는 예를 들어, 환자의 임상 병력 (예컨대, 기존 요법), 치료하고자 하는 암의 유형 및 병기, 및 조합 요법에서 치료제 중 하나 이상의 것에 대한 반응의 바이오마커에 의존할 것이다

다양한 참고문헌이 추가 치료제에 대한 제약상 허용되는 담체 또는 부형제의 선택을 용이하게 하는 데 이용가능하다. 예컨대, 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences and U.S . Pharmacopeia: National Formulary, Mack Publishing Company, Easton, PA (1984)]; [Hardman et al. (2001) Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, McGraw-Hill, New York, NY]; [Gennaro (2000) Remington : The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott, Williams, and Wilkins, New York, NY]; [Avis et al. (eds.) (1993) Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications, Marcel Dekker, NY; Lieberman, et al. (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets, Marcel Dekker, NY]; [Lieberman et al. (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems, Marcel Dekker, NY]; [Weiner and Kotkoskie (2000) Excipient Toxicity and Safety, Marcel Dekker, Inc., New York, NY]을 참조한다.

제약 항체 제제는 연속 주입에 의해, 또는 예컨대, 1일, 주당 1-7회, 1주일, 2주일, 3주일, 1개월, 2개월 등의 간격의 투약으로 투여될 수 있다. 바람직한 투약 프로토콜은 유의적인 비바람직한 부작용을 피하는 최대 용량 또는 투약 빈도를 수반하는 것이다. 총 1주 용량은 일반적으로 적어도 0.05 ㎍/kg (체중), 0.2 ㎍/kg (체중), 0.5 ㎍/kg (체중), 1 ㎍/kg (체중), 10 ㎍/kg (체중), 100 ㎍/kg (체중), 0.2 mg/kg (체중), 1.0 mg/kg (체중), 2.0 mg/kg (체중), 10 mg/kg (체중), 25 mg/kg (체중), 50 mg/kg (체중) 또는 그 초과이다. 예컨대, 문헌 [Yang et al. (2003) New Engl . J. Med . 349:427-434]; [Herold et al. (2002) New Engl . J. Med. 346:1692-1698]; [Liu et al. (1999) J. Neurol . Neurosurg . Psych. 67:451-456]; [Portielji et al. (20003) Cancer Immunol . Immunother . 52:133-144]을 참조한다. 소분자 치료제, 예컨대, 펩티드 모방체, 천연 생성물, 또는 유기 화학물질의 원하는 용량은 몰/kg 기준으로 항체 또는 폴리펩티드에 대한 것과 대략적으로 동일하다.

본 발명의 실시양태는 또한 (a) 요법 (예컨대, 인체에서의 요법); (b) 약물; (c) 항종양 면역 반응 유도, 또는 그의 증가 유도; (d) 환자에서 하나 이상의 종양 마커의 개수 감소; (e) 종양 또는 혈액암의 성장 중단 또는 지연; (f) CTLA4 또는 PD-1 관련 질환의 진행 중단 또는 지연; (g) 암 진행 중단 또는 지연; (h) CTLA4 또는 PD-1 관련 질환의 안정화; (i) 종양 세포의 성장 또는 생존 억제; (j) 하나 이상의 암성 병변 또는 종양 제거, 또는 그의 크기 축소; (k) CTLA4 또는 PD-1 관련 질환의 진행, 발병 또는 중증도 감소; (l) CTLA4 또는 PD-1 관련 질환, 예컨대, 암의 임상 증상의 중증도 또는 지속 기간 감소; (m) 유사한 비치료 환자에서의 예상 생존 기간 대비 환자의 생존 기간 연장; n) 암성 병태 또는 다른 CTLA4 또는 PD-1 관련 질환의 완전 또는 부분 관해 유도; o) 암 치료; 또는 p) 만성 감염 치료에 (i) 사용, (ii) 그를 위한 약물 또는 조성물로서의 사용, 또는 (iii) 그를 위한 약물의 제조에의 사용을 위한, 본원에 기술된 하나 이상의 생물학적 제제를 포함한다.

일반 방법

분자 생물학의 표준 방법은 문헌 [Sambrook, Fritsch and Maniatis (1982 & 1989 2^nd Edition, 2001 3^rd Edition) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY]; [Sambrook and Russell (2001) Molecular Cloning, 3 ^rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY]; [Wu (1993) Recombinant DNA, Vol. 217, Academic Press, San Diego, CA)]에 기술되어 있다. 표준 방법은 또한 박테리아 세포에서의 클로닝 및 DNA 돌연변이유발 (Vol. 1), 포유동물 세포 및 효모에서의 클로닝 (Vol. 2), 당접합체 및 단백질 발현 (Vol. 3), 및 생물정보학 (Vol. 4)을 기재하는 문헌 [Ausbel, et al. (2001) Current Protocols in Molecular Biology, Vols.1-4, John Wiley and Sons, Inc. New York, NY]에 제시되어 있다.

면역침전, 크로마토그래피, 전기영동, 원심분리, 및 결정화를 비롯한, 단백질 정제를 위한 방법이 기술되어 있다 (Coligan, et al. (2000) Current Protocols in Protein Science, Vol. 1, John Wiley and Sons, Inc., New York). 화학적 분석, 화학적 변형, 번역후 변형, 융합 단백질 제조, 단백질의 글리코실화가 기술되어 있다 (예컨대, 문헌 [Coligan, et al. (2000) Current Protocols in Protein Science, Vol. 2, John Wiley and Sons, Inc., New York]; [Ausubel, et al. (2001) Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 3, John Wiley and Sons, Inc., NY, NY, pp. 16.0.5-16.22.17]; [Sigma-Aldrich, Co. (2001) Products for Life Science Research, St. Louis, MO; pp. 45-89]; [Amersham Pharmacia Biotech (2001) BioDirectory, Piscataway, N.J., pp. 384-391] 참조). 폴리클로날 및 모노클로날 항체의 제조, 정제, 및 단편화가 기술되어 있다 ([Coligan, et al. (2001) Current Protocols in Immunology, Vol. 1, John Wiley and Sons, Inc., New York]; [Harlow and Lane (1999) Using Antibodies, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY]; [Harlow and Lane, 상기 문헌 동일]). 리간드/수용체 상호작용을 특징화하기 위한 표준 기술이 이용가능하다 (예컨대, 문헌 [Coligan, et al. (2001) Current Protocols in Immunology, Vol. 4, John Wiley, Inc., New York] 참조).

모노클로날, 폴리클로날, 및 인간화 항체가 제조될 수 있다 (예컨대, [Sheperd and Dean (eds.) (2000) Monoclonal Antibodies, Oxford Univ. Press, New York, NY]; [Kontermann and Dubel (eds.) (2001) Antibody Engineering, Springer-Verlag, New York; Harlow and Lane (1988) Antibodies A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, pp. 139-243]; [Carpenter, et al. (2000) J. Immunol. 165:6205; He, et al. (1998) J. Immunol. 160:1029]; [Tang et al. (1999) J. Biol. Chem. 274:27371-27378]; [Baca et al. (1997) J. Biol . Chem. 272:10678-10684]; [Chothia et al. (1989) Nature 342:877-883]; [Foote and Winter (1992) J. Mol . Biol . 224:487-499]; 미국 특허 번호 6,329,511 참조).

인간화에 대한 대안은 파지 상에 디스플레이된 인간 항체 라이브러리 또는 트랜스제닉 마우스의 인간 항체 라이브러리를 사용하는 것이다 ([Vaughan et al. (1996) Nature Biotechnol. 14:309-314]; [Barbas (1995) Nature Medicine 1:837-839]; [Mendez et al. (1997) Nature Genetics 15:146-156]; [Hoogenboom and Chames (2000) Immunol . Today 21:371-377]; [Barbas et al. (2001) Phage Display: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York]; [Kay et al. (1996) Phage Display of Peptides and Proteins: A Laboratory Manual, Academic Press, San Diego, CA]; [de Bruin et al. (1999) Nature Biotechnol. 17:397-399]).

항원의 정제는 항체의 생성에 필수적이지는 않다. 동물은 관심 항원을 보유하는 세포로 면역화될 수 있다. 이어서, 비장세포는 면역화된 동물로부터 단리될 수 있고, 비장세포는 골수종 세포주와 융합되어 하이브리도마를 생성할 수 있다 (예컨대, 문헌 [Meyaard et al. (1997) Immunity 7:283-290]; [Wright et al. (2000) Immunity 13:233-242]; [Preston et al., 상기 문헌 동일]; [Kaithamana et al. (1999) J. Immunol. 163:5157-5164] 참조).

항체는, 예컨대, 소형 약물 분자, 효소, 리포솜, 폴리에티렌 글리콜 (PEG)에 접합될 수 있다. 항체는 치료, 진단, 키트 또는 다른 목적에 유용하고, 예컨대, 염료, 방사성동위원소, 효소, 또는 금속, 예컨대, 콜로이드성 금에 커플링된 항체를 포함한다 (예컨대, 문헌 [Le Doussal et al. (1991) J. Immunol. 146:169-175]; [Gibellini et al. (1998) J. Immunol. 160:3891-3898]; [Hsing and Bishop (1999) J. Immunol. 162:2804-2811]; [Everts et al. (2002) J. Immunol. 168:883-889] 참조).

형광 활성화 세포 분류 (FACS)를 비롯한, 유세포 분석법에 대한 방법이 이용가능하다 (예컨대, 문헌 [Owens, et al. (1994) Flow Cytometry Principles for Clinical Laboratory Practice, John Wiley and Sons, Hoboken, NJ]; [Givan (2001) Flow Cytometry , 2 ^nd ed.]; [Wiley-Liss, Hoboken, NJ; Shapiro (2003) Practical Flow Cytometry, John Wiley and Sons, Hoboken, NJ] 참조). 예컨대, 진단 시약으로서 사용하기 위한, 핵산 프라이머 및 프로브를 비롯한, 핵산, 폴리펩티드, 및 항체를 변형시키는 데 적합한 형광 시약이 이용가능하다 ([Molecular Probesy (2003) Catalogue, Molecular Probes, Inc., Eugene, OR]; [Sigma-Aldrich (2003) Catalogue, St. Louis, MO]).

면역계 조직학의 표준 방법이 기술되어 있다 (예컨대, 문헌 [Muller-Harmelink (ed.) (1986) Human Thymus: Histopathology and Pathology, Springer Verlag, New York, NY]; [Hiatt, et al. (2000) Color Atlas of Histology, Lippincott, Williams, and Wilkins, Phila, PA]; [Louis, et al. (2002) Basic Histology: Text and Atlas, McGraw-Hill, New York, NY] 참조). 예컨대, 항원 단편, 리더 서열, 단백질 폴딩, 기능적 도메인, 글리코실화 부위, 및 서열 정렬을 결정하기 위한 소프트웨어 패키지 및 데이터베이스가 이용가능하다 (예컨대, 진뱅크(GenBank), 벡터 NTI® 스위트(Vector NTI® Suite) (인포르맥스, 인크(Informax, Inc: 미국 메릴랜드주 베데스다)); GCG 위스콘신 패키지(GCG Wisconsin Package) (악셀리스, 인크.(Accelrys, Inc.: 미국 캘리포니아주 샌디에고); 데시퍼(DeCypher)® (타임로직 코포레이션(TimeLogic Corp.: 미국 네바다주 크리스탈 베이); 문헌 [Menne, et al. (2000) Bioinformatics 16: 741-742]; [Menne, et al. (2000) Bioinformatics Applications Note 16:741-742]; [Wren, et al. (2002) Comput . Methods Programs Biomed . 68:177-181]; [von Heijne (1983) Eur. J. Biochem . 133:17-21]; [von Heijne (1986) Nucleic Acids Res. 14:4683-4690] 참조).

분석 방법

제품 안정성을 평가하기에 적합한 분석 방법으로는 크기 배제 크로마토그래피 (SEC), 동적 광 산란 시험 (DLS), 시차 주사 열량계 (DSC), 이소-asp 정량화, 효능, 340 nm에서의 UV, UV 분광법 및 FTIR을 포함한다. SEC ([J. Pharm. Scien., 83:1645-1650, (1994)]; [Pharm. Res., 11:485 (1994)]; [J. Pharm. Bio. Anal., 15:1928 (1997)]; [J. Pharm. Bio. Anal., 14:1133-1140 (1986)])는 제품 내의 단량체 비율(%)을 측정하고, 가용성 응집체의 양에 대한 정보를 제공한다. DSC ([Pharm. Res., 15:200 (1998)]; [Pharm. Res., 9:109 (1982)])는 단백질 변성 온도 및 유리 전이 온도에 대한 정보를 제공한다. DLS (American Lab., November (1991))는 평균 확산 계수를 측정하고, 가용성 및 불용성 응집체의 양에 대한 정보를 제공한다. 340 nm에서의 UV는 340 nm에서의 산란된 광 강도를 측정하고, 가용성 및 불용성 응집체의 양에 관한 정보를 제공한다. UV 분광법은 278 nm에서의 흡광도를 측정하고, 단백질 농도에 대한 정보를 제공한다. FTIR ([Eur. J. Pharm. Biopharm., 45:231 (1998)]; [Pharm. Res., 12:1250 (1995)]; [J. Pharm. Scien., 85:1290 (1996)]; [J. Pharm. Scien., 87:1069 (1998)])은 아미드 1 영역에서의 IR 스펙트럼을 측정하고, 단백질 2차 구조에 대한 정보를 제공한다.

이소퀀트 이소아스파르테이트 검출 시스템(Isoquant Isoaspartate Detection System) (프로메가(Promega))을 사용하여 샘플 내의 이소-asp 함량을 측정한다. 키트는 단백질 이소아스파르틸 메틸트랜스퍼라제 (PIMT) 효소를 사용하여 표적 단백질 내의 이소아스파르트산 잔기의 존재를 특이적으로 검출한다. PIMT는 알파-카르복실 위치에서 메틸기를 S-아데노실-L-메티오닌으로부터 이소아스파르트산으로 전달하는 것을 촉매화하여, 프로세스에서 S-아데노실-L-호모시스테인 (SAH)이 생성된다. 이는 상대적으로 소분자이며, 키트 내에 제공되는 SAH HPLC 표준을 사용하여 역상 HPLC에 의해 일반적으로 단리 및 정량화될 수 있다.

항체가 그의 항원에 결합할 수 있는 그의 능력에 의해 항체의 효능 또는 바이오아이덴티티(bioidentity)를 측정할 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 임의의 방법, 예를 들어, 면역검정법, 예컨대, ELISA (효소-결합 면역흡착 검정법)에 의해 항체의 그의 항원에의 특이적인 결합을 정량화할 수 있다.

본원에서 언급된 모든 공개문헌은 본 발명과 관련하여 사용될 수 있는 방법 및 물질을 기술 및 개시하기 위한 목적으로 참조로 포함된다.

첨부 도면을 참조로 하여 본원에서 본 발명의 상이한 실시양태를 기술하지만, 본 발명은 상기 정확한 실시양태로 제한되는 것은 아니며, 그 안에서 첨부된 청구범위에서 정의된 본 발명의 범주 또는 정신으로부터 벗어남 없이 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 다양하게 변경 및 변형될 수 있다는 것을 이해하여야 한다.

실시예

실시예 1

메티오닌 함유 또는 무함유에서의 항- CTLA4 항체 제제 안정성

본 연구는 10 mM L-메티오닌이 항-CTLA4 항체 제제의 안정성에 미치는 효과를 연구하기 위해 수행하였다. L-메티오닌 함유 및 무함유에서의 하기 하기 스트레스가 항-CTLA4 제제에 미치는 효과를 평가하였다:

(1) 열 스트레스 5±3℃ (주변 습도), 25℃ (60% 상대 습도), 40℃ (75% 상대 습도)에서 - 최대 3개월.

(2) 수평 위치에서 교반 스트레스 (300 rpm으로 3일 동안).

(3) 냉동-해동 스트레스 (-80℃ 내지 18-22℃에서 5회의 냉동-해동 사이클 (실온에서 4시간 해동)).

(4) 광 스트레스 (0.2x ICH, 0.5x ICH, 1x ICH 하에서의 ICH 조건).

데이터에 기초하면, L-메티오닌을 함유하는 제제가 L-메티오닌을 함유하지 않는 상응하는 제제보다 더 안정적이다.

물질 및 방법

IgG1 백본 상에 하기 CDR: 서열식별번호 35의 CDRH1, 서열식별번호 36의 CDRH2, 서열식별번호 37의 CDRH3, 서열식별번호 38의 CDRL1, 서열식별번호 39의 CDRL2, 및 서열식별번호 40의 CDRL3을 가지는 항-CTLA4 항체를 사용하여 하기 액체 제제를 제조하였다. 항-CTLA4 항체에 대한 가변 중쇄 및 가변 경쇄 서열은 각각 서열식별번호 88 및 48에 기재되어 있다. 각각의 제제를 2-mL 타입-1 유리 바이알 내에 1 mL로 충전시켰다. 제제 A1에 대해 총 36개의 바이알, 및 제제 A2에 대해 19개의 바이알을 충전시켰다. 각 제제에 대한 표적 pH는 5.5였다.

<표 10>

항-CTLA4 항체 제제

이어서, 바이알을 3개의 상이한 보관 조건: 5℃ (주변 습도), 25℃ (60% 상대 습도), 및 40℃ (75% 상대 습도)에서 인큐베이션시켰다. 하기와 같이 데이터를 수집하였다:

0.2X ICH; 0.5X ICH; 및 1X ICH하에 실온에서 유리 바이알 중 액체 제제 A1 및 A2 1 mL를 이용하여 광안정성 연구를 수행하였다.

280 nm에서의 UV 흡광도를 사용하여 단백질 농도를 측정하였다.

샘플을 실온으로 평형화시키고, 350 nm에서의 분광 흡광도로 샘플에 대한 혼탁도 연구 (A350)를 수행하였다.

단량체의 백분율(%) 뿐만 아니라, 고분자량 종 (HMW) 및 후기 용출 피크 (LMW 종)의 백분율(%)도 측정하여 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)에 의해 샘플을 순도에 대해 사정하였다. 이동상 (50 mM 인산나트륨, 450 mM 아르기닌 모노히드로클로라이드, pH 7.0) 중에서 샘플을 5.0 mg/mL로 희석하여 초고성능 - 크기 배제 크로마토그래피 (UP-SEC)을 수행하였다. 희석된 샘플을 워터스(Waters) BEH200 칼럼 및 UV 검출기가 장착된 UPLC 내로 주입하였다 (6 ㎕). 샘플 중 단백질을 크기에 의해 분리시키고, 280 nm에서의 UV 흡수에 의해 검출하였다.

이온 교환 크로마토그래피를 수행하여 화학적 안정성을 평가하고, 시간 경과에 따른 전하 변이체 프로파일의 변화를 모니터링하였다. 디오넥스 프로팩(Dionex ProPac) WCX-10 칼럼 및 UV 검출기를 이용하여 280 nm에서 이온 교환 HPLC 방법을 수행하였다. 샘플을 정제수 중에 희석하고, 분석을 위해 80 ㎍을 주입하였다. 열 안정성 샘플의 IEX 분석을 위해 사용된 이동상은 하기 이동상 (이동상 A: 20 mM MOPS, pH 7.2; 이동상 B: 50 mM 인산나트륨, 60 mM 염화나트륨 pH 8.0)의 구배였다. 20 mM MOPS, pH 7.2에서 50 mM 인산나트륨, 60 mM NaCl, pH 8.0으로의 이동상 구배를 사용하여 검정법을 수행하였다. 280 nm에서 UV 검출을 수행한다. 이들 방법은 등가인 것으로 간주되며, 결과는 크로마토그램의 총 면적 기준의 상대적인 백분율(%)로 제시된다.

Lys-C 소화에 의해 펩티드 맵핑을 수행하였다. 샘플을 30 ul/샘플로 Q 이그젝티브(Q Exactive) 상에 주입하였다. 핀포인트(PinPoint) 소프트웨어에 의해 데이터 분석을 수행하였다.

연구 결과는 하기 표에 기재되어 있다:

<표 11>

<표 12>

<표 13>

<표 14>

<표 15>

<표 16>

<표 17>

<표 18>

결과

280 nm에서 UV 흡광도에 의해 측정된 바와 같이, 연구 조건 및 지속 기간에 대한 제제 사이의 단백질 농도에 있어서 측정가능한 변화는 없었다.

연구의 시험된 조건 및 지속 기간에 대한 제제 사이의 pH에 있어서 측정가능한 변화는 없었다.

혼탁도 (A350) 데이터는 도 1a 및 도 1b에 제시되어 있다. 40℃에서는 두 제제 모두 최대 8주 시점 동안 혼탁도가 증가하는 성향을 보였다. 25℃ 및 5℃에서는 두 제제 모두 최대 8주 시점 동안 혼탁도의 실질적인 변화는 없었다. 도 2에 제시된 바와 같이, 제제 A1과 비교하였을 때, 제제 A2는 모든 광 스트레스 조건에 대하여 조금 더 큰 (그러나, 일관된) 혼탁도 증가를 보였다. 대조군 (T0) 샘플과 비교하였을 때, 제제 A1 샘플의 냉동-해동 (최대 5X) 또는 교반 스트레스 (300 rpm, 최대 3일 동안)에의 처리가 샘플 혼탁도를 변화시키지 않았다. 제제 A2에 대해서는 냉동-해동 또는 교반 스트레스 처리를 수행하지 않았다. 따라서, 혼탁도 데이터에 기초하면, L-메티오닌을 함유하는 제제 A1이 약간 바람직하다.

도 3a, 3b, 4a, 및 4b에 제시된 바와 같이, HMW의 백분율(%) 및 단량체의 백분율(%)을 측정한 샘플의 UP-SEC 분석 결과, 40℃에서 두 제제 모두 최대 12주 시점 동안 %HMW 피크 및 %LMW 피크가 증가하는 성향 (및 그 결과, 단량체 피크(%) 감소)을 보인 것으로 나타났다. 40℃와 비교하였을 때, 25℃에서는 두 제제 모두 더 작은 변화는 있었지만, 유사한 경향을 보였다. 5℃에서는 실질적인 변화는 관찰되지 않았다. 도 5에 제시된 바와 같이, 제제 A1과 비교하였을 때, 제제 A2는 연구된 모든 광 스트레스 조건에 대하여 %HMW에 있어 약간 더 큰, 그러나, 일관된 증가 (및 상응하는 약간 더 큰, 그러나, 일관된 단량체(%) 감소)를 보인다. 대조군 (T0) 샘플과 비교하였을 때, 제제 A1 샘플의 냉동-해동 (최대 5X) 또는 교반 스트레스 (300 rpm, 최대 3일 동안)에의 처리가 %HMW 또는 단량체(%)를 변화시키지 않았다 (도 5 및 도 6 참조). 제제 A2에 대해서는 냉동-해동 또는 교반 스트레스 처리를 수행하지 않았다. 따라서, UP-SEC 데이터에 기초하면, L-메티오닌을 함유하는 제제 A1이 약간 바람직하다.

도 7a, 7b, 8a, 8b, 9a, 및 9b에 제시된 바와 같이, HP-IEX 데이터는, 40℃에서 두 제제 모두 최대 12주 시점 동안 산성 피크(%) 및 염기성 피크(%)가 증가하는 성향과 함께, 상응하여 주요 피크(%)가 감소하는 성향을 보였다는 것을 나타낸다. 40℃와 비교하였을 때, 25℃에서는 두 제제 모두 더 작은 변화는 있었지만, 유사한 경향을 보였다. 5℃에서는 제제 1 또는 제제 2에 대해 실질적인 변화는 관찰되지 않았지만, 단, 예외적으로 제제 A2의 경우, 8주 시점 동안 염기성 피크(%)의 작은 증가 및 상응하는 주요 피크(%)의 작은 감소가 관찰되었다. 그러나, 이러한 성향은 12주/5℃ 시점에서는 확인할 수 없었는데, 그 이유는 제제 A2 샘플을 시험하지 않았기 때문이다. 도 10-12에 제시된 바와 같이, (제제 A1과 비교하였을 때) 제제 A2는 모든 광 스트레스 조건에 대하여 산성 피크(%) 및 염기성 피크(%)에 있어 약간 더 큰, 그러나, 일관된 증가 (및 상응하는 약간 더 큰, 그러나, 일관된 주요 피크(%) 감소)와 함께, 상응하는 주요 피크(%) 감소를 보인다. 또한, 도 10-12에 제시된 바와 같이, 대조군 (T0) 샘플과 비교하였을 때, 제제 A1 샘플의 냉동-해동 (최대 5X) 또는 교반 스트레스 (300 rpm, 최대 3일 동안)에의 처리가 산성 피크(%), 염기성 피크(%), 또는 주요 피크(%)를 변화시키지 않았다 (제제 2에 대해서는 냉동-해동 또는 교반 스트레스 처리를 수행하지 않았다). 따라서, HP-IEX 데이터에 기초하면, L-메티오닌을 함유하는 제제 A1이 약간 바람직하다.

모노클로날 항체는 빈번하게는 CDR 영역 및 Fc 영역 중에 광 스트레스하에서 쉽게 산화될 수 있는 메티오닌 잔기를 가진다. 항-CTLA4 항체의 경우, LC-M4, HC-M34, HC-M250 및 HC-M426이 광 스트레스하에서 쉽게 산화될 수 있다. 40℃ 또는 .2X/0.5X/1X ICH 광 스트레스 처리에서의 8주 노출시 상기 잔기의 산화 수준의 변화를 측정하는 펩티드 맵핑 연구를 수행하였다.

잔기 LC-M4, HC-M34, HC-M250 및 HC-M426 산화의 산화율(%)을 보여주는 펩티드 맵핑 연구 결과는 각각 도 13, 도 14, 도 15 및 도 16에 제시되어 있다.

도 13-16에 제시된 바와 같이, 광 스트레스 조건하에서는 특정 메티오닌 잔기의 산화가 증가한다. 특히, 잔기 HC-M250 및 HC-M426은 두 제제 모두에서 0.5X 및 1X ICH 광 스트레스 처리시 산화 수준에서 유의적인 증가를 보였다. 그러나, L-메티오닌을 함유하지 않은 제제 A2와 비교하였을 때, 제제 A1 중 10 mM L-메티오닌의 존재는 M250 및 M426의 산화 수준에서 더 작은 증가를 보이는 결과를 가져왔다. 따라서, 펩티드 맵핑 데이터에 기초하면, 제제 1 (L-Met 함유)이 약간 바람직할 것으로 보일 것이다.

상기 연구로부터의 분석 데이터의 비교에 기초하면, 제제 A1과 비교하여 제제 A1은 (i) 모든 광 스트레스 조건에 대하여 혼탁도 증가, (ii) 모든 광 스트레스 조건에 대하여 응집체 수준 (%HMW)의 더 낮은 증가, (iii) 모든 광 스트레스 조건에 대하여 주요 피크(%)의 약간 더 작지만, 일관된 감소, 및 (iv) 광 스트레스 후 잔기 HC M250 및 HC M426의 산화 수준의 더 낮은 증가를 보였다.

실시예 2

항- CTLA4 항체 제제 완충제 스크린

본 연구는 수크로스, 폴리소르베이트 80 및 L-메티오닌의 존재하에서 2개의 상이한 실행가능한 제제 완충제 (L-히스티딘 및 아세테이트) 중에서의, 서열식별번호 88을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열식별번호 48을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항-CLTA4 항체의 안정성을 비교한다. (하기 제시된 바와 같이, L-히스티딘 및 아세테이트 완충제 중에서 상기 두 제제의 (콜로이드성 및 열 안정성을 나타내는) 단백질-단백질 상호작용을 측정하였다. 확산 상호작용 파라미터 (K_D) 값이 양의 값으로 나타나는 (K_D>0), 반발 단백질-단백질 상호작용은 응집 성향이 낮은 안정한 제제를 나타낸다. 3개의 상이한 pH (pH 5, 5.5 및 6)에서 두 제제 모두에 대한 K_D를 각각 적어도 3회에 걸쳐 (N=3) 측정하여 표준 편차를 얻었다. 단백질-단백질 상호작용에 기초하면 (데이터는 제시되지 않거나, 또는 도 Y), 항-CTLA4 항체는 5.0-6.0 범위의 pH에 걸쳐 L-히스티딘 및 아세테이트 완충제, 둘 모두에서 안정적이다. 그러므로, 두 제제를 pH 5.5 하에 5℃, 25℃ 및 40℃의 추가의 열 안정성에 대해 평가하였다.

제제의 안정성을 평가하기 위해, 하기 스트레스가 두 항-CTLA4 제제 (L-히스티딘 완충제 및 아세테이트 완충제)에 미치는 효과를 평가하였다:

(2) 수평 위치에서 교반 스트레스 (300 rpm으로 3일 동안).

(4) 광 스트레스 (0.2x ICH, 0.5x ICH, 1x ICH 하에서의 ICH 조건).

데이터에 기초하면, 항-CTLA4 항체는 L-히스티딘 완충제 및 아세테이트 완충제, 둘 모두에서 안정적이다.

물질 및 방법

IgG1 백본 상에 하기 CDR: 서열식별번호 35의 HCDR1, 서열식별번호 36의 HCDR2, 서열식별번호 37의 HCDR3, 서열식별번호 38의 LCDR1, 서열식별번호 39의 LCDR2, 및 서열식별번호 40의 LCDR3을 가지는 항-CTLA4 항체를 사용하여 하기 액체 제제를 제조하였다. 각각의 제제를 2-mL 타입-1 유리 바이알 내에 1 mL로 충전시켰다. 두 제제에 대해 각각 총 72개의 배치를 제작하였다. 하기 표에는 두 제제의 조성이 열거되어 있다. 수크로스 7% (w/v)를 안정제로서 첨가하고; PS-80은 교반 유도 스트레스에 반하는 안정성을 부여하는 계면활성제이고; L-메티오닌은 광 스트레스 조건하에서 메티오닌 산화를 감소시켰는 바 (상기 실시예 1 참조), 항산화제이다.

<표 19>

표 19: 제제

이어서, 바이알을 3개의 상이한 보관 조건: 5℃ (주변 습도), 25℃에서 (60% 상대 습도), 및 40℃ (75% 상대 습도)에서 인큐베이션시켰다. 하기와 같이 데이터를 수집하였다:

<표 20>

<표 21>

0.2X ICH; 0.5X ICH; 및 1X ICH하에 실온에서 유리 바이알 중 액체 제제 B1 및 B2 1 mL를 이용하여 광안정성 연구를 수행하였다.

단량체의 백분율(%) 뿐만 아니라, 고분자량 종 (HMW) 및 후기 용출 피크 (LMW 종)의 백분율(%)도 측정하여 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)에 의해 샘플을 순도에 대해 사정하였다. 이동상 (50 mM 인산나트륨, 450 mM 아르기닌 모노히드로클로라이드, pH 7.0) 중에서 샘플을 5.0 mg/mL로 희석하여 초고성능 - 크기 배제 크로마토그래피 (UP-SEC)을 수행하였다. 희석된 샘플을 워터스 BEH200 칼럼 및 UV 검출기가 장착된 UPLC 내로 주입하였다 (6 ㎕). 샘플 중 단백질을 크기에 의해 분리시키고, 280 nm에서의 UV 흡수에 의해 검출하였다.

이온 교환 크로마토그래피를 수행하여 화학적 안정성을 평가하고, 시간 경과에 따른 전하 변이체 프로파일의 변화를 모니터링하였다. 디오넥스 프로팩 WCX-10 칼럼 및 UV 검출기를 이용하여 280 nm에서 이온 교환 HPLC 방법을 수행하였다. 샘플을 정제수 중에 희석하고, 분석을 위해 80 ㎍을 주입하였다. 열 안정성 샘플의 IEX 분석을 위해 사용된 이동상은 하기 이동상 (이동상 A:20 mM MOPS, pH 7.2; 이동상 B: 50 mM 인산나트륨, 60 mM 염화나트륨 pH 8.0)의 구배였다. 20 mM MOPS, pH 7.2에서 50 mM 인산나트륨, 60 mM NaCl, pH 8.0으로의 이동상 구배를 사용하여 검정법을 수행하였다. 280 nm에서 UV 검출을 수행한다. 이들 방법은 등가인 것으로 간주되며, 결과는 크로마토그램의 총 면적 기준의 상대적인 백분율(%)로 제시된다.

Lys-C 소화에 의해 펩티드 맵핑을 수행하였다. 샘플을 30 ul/샘플로 Q 이그젝티브 상에 주입하였다. 핀포인트 소프트웨어에 의해 데이터 분석을 수행하였다.

연구 결과는 하기 표에 기재되어 있다:

<표 22>

<표 23>

<표 24>

<표 25>

<표 26>

혼탁도 (A350) 데이터는 도 17a, 도 17b 및 도 18에 제시되어 있다. 데이터 비교시, 40℃에서는 두 제제 모두 최대 8주 시점 동안 혼탁도가 증가하는 성향을 보인 것으로 나타났다. 25℃ 및 5℃에서는 두 제제 모두 최대 8주 시점 동안 혼탁도의 실질적인 변화를 보이지 않았다. 도 14에 제시된 바와 같이, 제제 B2와 비교하였을 때, 제제 B1은 광 스트레스 조건 (0.5X ICH 및 1X ICH) 이후에 조금 더 큰, 그러나, 일관된 혼탁도 증가를 보였다. 대조군 (T0) 샘플과 비교하였을 때, 샘플의 냉동-해동 (최대 5X) 또는 교반 스트레스 (300 rpm, 최대 3일 동안)에의 처리가 샘플 혼탁도를 변화시키지 않았다.

도 19a, 19b, 20a, 및 20b에 제시된 바와 같이, HMW의 백분율(%) 및 단량체의 백분율(%)을 측정한 샘플의 UP-SEC 분석 결과, 40℃에서 두 제제 모두 최대 8주 시점 동안 %HMW 피크 및 %LMW 피크가 증가하는 성향 (및 그 결과, 단량체 피크(%) 감소)을 보인 것으로 나타났다. 40℃와 비교하였을 때, 25℃에서는 두 제제 모두 더 작은 변화는 있었지만, 유사한 경향을 보였다. 5℃에서는 실질적인 변화는 관찰되지 않았다. 도 21 및 22에 제시된 바와 같이, 제제 B1과 비교하였을 때, 제제 B2는 연구된 모든 광 스트레스 조건에 대하여 %HMW에 있어 약간 더 큰 (그러나, 일관된) 증가 (및 상응하는 약간 더 큰, 그러나, 일관된 단량체(%) 감소)를 보인다. 대조군 (T0) 샘플과 비교하였을 때, 샘플의 냉동-해동 (최대 5X) 또는 교반 스트레스 (300 rpm, 최대 3일 동안)에의 처리가 %HMW 또는 단량체(%)를 변화시키지 않았다 (도 21 및 22).

도 23a, 23b, 24a, 24b, 25a, 및 25b에 제시된 바와 같이, HP-IEX 데이터는, 40℃에서 두 제제 모두 최대 8주 시점 동안 산성 피크(%) 및 염기성 피크(%)가 증가하는 성향과 함께, 상응하여 주요 피크(%)가 감소하는 성향을 보였다는 것을 나타낸다. 그러나, 제제 B1과 비교하였을 때, 제제 B2는 약간 더 큰, 그러나, 주요 피크(%) 감소를 보였다. 40℃와 비교하였을 때, 25℃에서는 두 제제 모두 더 작은 변화는 있었지만, 유사한 경향을 보였다. 도 26, 27, 및 28에 제시된 바와 같이, 광 스트레스 조건 (0.5X ICH 및 1X ICH) 이후, 제제 B1은 조금 더 큰, 그러나, 일관된 산성 피크(%) 증가를 보인 반면, 제제 B2는 조금 더 큰 (그러나, 일관된) 염기성 피크(%) 증가를 보인다. 그러나, 상응하는 주요 피크(%) 감소는 두 제제 모두에 대해 유사하였다. 대조군 (T0) 샘플과 비교하였을 때, 샘플의 냉동-해동 (최대 5X) 또는 교반 스트레스 (300 rpm, 최대 3일 동안)에의 처리가 산성 피크(%), 염기성 피크(%), 또는 주요 피크(%)를 변화시키지 않았다 (도 26-28).

40℃ 또는 .2X/0.5X/1X ICH 광 스트레스 처리에서의 8주 노출시 상기 잔기의 산화 수준의 변화를 측정하는 펩티드 맵핑 연구를 수행하였다.

잔기 LC-M4, HC-M34, HC-M250 및 HC-M426 산화의 산화율(%)을 보여주는 펩티드 맵핑 연구 결과는 각각 도 29, 도 30, 도 31 및 도 32에 제시되어 있다.

도 29-32에 제시된 바와 같이, 광 스트레스 조건하에서는 특정 메티오닌 잔기의 산화가 증가하였다. 특히, 잔기 HC-M250 및 HC-M426은 두 제제 모두에서 0.5X 및 1X ICH 광 스트레스 처리시 산화 수준에서 유의적인 증가를 보였다. 그러나, 제제 B2와 비교하였을 때, 제제 B1은 M250 및 M426의 산화 수준에서 더 작은 증가를 보이는 결과를 가져왔다.

상기 연구로부터의 분석 데이터의 비교에 기초하면, 제제 B2 (아세테이트 완충제)와 비교하여 제제 B1 (L-히스티딘 완충제)은 (i) 모든 광 스트레스 조건에 대하여 응집체 수준 (%HMW)의 더 낮은 증가, (ii) 40℃에서 주요 피크(%)의 약간 더 작지만, 일관된 감소, 및 (iii) 광 스트레스 후 잔기 HC M250 및 HC M426의 산화 수준의 더 낮은 증가를 보였다. 그러므로, 단백질-단백질 상호작용 데이터 및 안정성 데이터에 기초하면, 항-CTLA4 항체는 L-히스티딘 완충제 및 아세테이트 완충제, 둘 모두에서 안정적인 것으로 보인다.

실시예 3

항- CTLA4 항체 및 항-PD-1 항체의 복합 제제

두 항체를 단일 제제로 공동 제제화하는 것이 환자에게 더욱 편리하고, 환자 순응도를 증가시킨다. (하기 제시된) 단백질-단백질 상호작용에 기초하면, (하기 제시된) 복합 제제는 모두 pH 5.0-6.0에 걸쳐 안정적인 것으로 나타났다. 그러므로, pH 5.5의 3개의 복합 제제 (P1C1, P1C2 및 P2C1)를 선택하였고, 2개의 대조군 (항-PD1 및 항-CTLA4)과 함께 5℃, 25℃ 및 40℃의 추가의 열 안정성에 대해 평가하였다.

본 연구는 하기와 같이 다양한 농도의 펨브롤리주맙과 함께 공동 제제화된, IgG1 백본 상에 하기 CDR: 서열식별번호 35의 HCDR1, 서열식별번호 36의 HCDR2, 서열식별번호 37의 HCDR3, 서열식별번호 38의 LCDR1, 서열식별번호 39의 LCDR2, 및 서열식별번호 40의 LCDR3을 가지는 항-CTLA4 항체의 안정성을 평가한다:

<표 27>

제제를 하기와 같이 액체 제제로서 제조하였다:

<표 28>

각각의 제제를 2R 바이알 내에 1 mL로 충전시켰다. 육안 검사, PD350에 의한 혼탁도, 단백질 농도, 마이크로플로우 영상화 (MFI) (미립자 평가), 혼합 모드 크기 배제 크로마토그래피 (SEC) (응집 평가), cIEF (전하 변이체 평가), IEX (전하 변이체 평가), 및 UP-SEC (응집 평가)에 의해 안정성을 측정하였다. UP-SEC에서 항-CTLA4 및 항-PD1이 공동으로 용출되기 때문에, 복합 제제의 경우, 복합 제제의 안정성을 평가하기 위해 항-PD1 및 항-CTLA4를 혼합 모드 SEC에 의해 분리시켰다. pH 5.5의 복합 제제를 열 안정성 연구에 사용하였다. 열 안정성 프로토콜은 하기와 같다:

<표 29>

상이한 복합 제제의, 콜로이드성 및 열 안정성을 나타내는 단백질-단백질 상호작용을 측정하였다 (3개의 복합 제제 및 2개의 대조군). 확산 상호작용 파라미터 (K_D) 값이 양의 값으로 나타나는 (K_D>0), 반발 단백질-단백질 상호작용은 응집 성향이 낮은 안정한 제제를 나타낸다. 여기 상이한 pH 값 (pH 5.0, 5.5, 및 6.0)에서의 모든 제제에 대한 Kd를 각각 적어도 3회에 걸쳐 측정하여 표준 편차를 얻었다. 도 33에 제시된 바와 같이, 복합 제제는 모두 K_D 값이 양의 값이기 때문에, P1C1, P2C2, 및 P1C2 콤보는 각각의 3개의 pH 값에서 안정적이다. CTLA4가 풍부한 조합 (P1C2)과 비교하였을 때, 펨브롤리주맙 (PD1) 및 펨브롤리주맙이 풍부한 조합 (P2C1)이 pH 5.0에서 더욱 안정적이다. CTLA4가 풍부한 조합 (P1C2)은 pH 5.0 및 pH 5.5에서 동일하게 안정적이다. 즉, pH 5.0 및 5.5에서 동일하게 안정적인, CTLA4의 분율이 더 큰 복합 제제와 비교하였을 때, 펨브롤리주맙의 분율이 더 큰 복합 제제는 pH 5.0에서 더욱 안정적이다.

12개월 안정성 결과

12개월째에는 어느 조건에서도 (UV 280에 의해 측정된) 총 단백질 농도의 큰 변화는 관찰되지 않았다 (데이터는 제시되지 않음).

혼탁도 변화: 최대 12개월 동안 각 제제에 대하여 하기 순서: 5℃<25℃<40℃로 혼탁도 변화가 관찰되었다. 최대 6개월 동안의 데이터에 대한 40℃에서의 혼탁도 변화율은 각 제제에서 총 단백질 농도와 정비례하였다 (데이터는 제시되지 않음).

모든 조건에서 모든 제제 중의 (MFI에 의해 측정된) 미립자의 개수는 매우 낮은 것으로 보인다 (데이터는 제시되지 않음). 마이크로플로우 (MFI) 영상화를 사용하여 공동 제제화된 샘플을 특징화하였다. 1 ml의 샘플을 피펫 팁 내로 인출하고, 현미경 시스템의 플로우 셀 (150 ㎛ 깊이의 시야)을 통해 온화하게 펌핑하여 (0.17 mL/min) 입자 계수 및 디지털 카메라에 의한 입자의 영상 포착을 가능하게 한다. 샘플이 플로우 셀을 통과함께 따라, 명시야 영상이 실시간으로 계속해서 연속으로 포착된다. 분석 종료시 출력값은 입자 계수 및 입자 농도 데이터이다. MFI 시스템은 또한 상이한 형태 파라미터, 예컨대, 크기, 강도, 투명도 및 형상에 대해 시스템 소프트웨어를 이용하여 프로세싱될 수 있다.

항-PD-1 및 항-CTLA4 항체 각각에 대해, 각 항체의, 탈아미드화를 나타내는 것인 산성 전하 변이체(%)의 증가가 더 높은 온도(25℃ 및 40℃)에서 관찰되었다. 디오넥스 프로팩 WCX-10 칼럼 및 UV 검출기를 이용하여 280 nm에서 이온 교환 HPLC 방법을 수행하였다. 샘플을 정제수 중에 희석하고, 분석을 위해 80 ㎍을 주입하였다. 열 안정성 샘플의 IEX 분석을 위해 사용된 이동상은 하기 이동상 (이동상 A: 24 mM MES pH 6, 4% 아세토니트릴; 이동상 B: 20 mM NaPO4, 95 mM NaCl pH 8, 4% 아세토니트릴)의 구배였다. 정규화된 cIEF 데이터 (초기, 3 및 6개월)의 요약이 하기에 열거되어 있다:

<표 30>

UPSEC 및 혼합 모드 SEC를 이용하여 응집을 측정하였다. 비록 UP-SEC에서 항-CTLA4 및 항-PD1 항체가 공동으로 용출되기는 하지만, 그를 분리하고, 혼합 모드 SEC에 의해 시각화한다. HMW 응집체 및 LMW 응집체는 온도에 따라 증가하였다. UP-SEC 결과, 극도로 낮은 백분율(%)의 응집체 (%HMW) 종이 최대 12개월까지 5℃ 및 25℃에서 검출되었고, 초기 시점과 비교하였을 때, 큰 변화는 없는 것으로 나타났다.

<표 31>

혼합 모드 SEC를 이용하여 복합 제제 중 두 항체를 응집체 및 산화 종에 대해 분석하였다. 결과는 하기 표에 기재되어 있다. 펨브롤리주맙은 고온에서 산화된 종 1 및 2의 증가를 보였고, 이는 각각 하나 및 두 아암 상의 M105의 산화를 반영하는 것이었다. M105는 펨브롤리주맙의 CDR3에 존재한다. 노출된 메티오닌 잔기, 또는 항체의 CDR 중의 메티오닌 잔기는 산화를 통해 항체의 생물학적 활성에 영향을 줄 수 있는 잠재능을 가지고 있다. 메티오닌은 펨브롤리주맙 중쇄 CDR 내의 Met105의 산화를 감소시킨다. 초기의 것과 비교하였을 때, 산화 종의 작은 변화는 복합 제제가 최대 12개월까지 5℃에서 안정적이라는 것을 시사하는 것이다.

12개월 동안의 데이터에 기초하면, 항체는 공동으로 제제화되었을 때, 단일 항체 제제와 유사하게 액제 중에서 우수한 작용을 보였다. 복합 제제는 콜로이드성 및 열 안정성의 지표인 단백질 확산 상호작용 파라미터 kD에 의해 측정된 바와 같이, 반발 단백질-단백질 상호작용을 나타내면서, pH 5.0-6.0에서 안정적인 것으로 보인다.

실시예 4

추가의 복합 제제

<표 32>

제제를 하기와 같이 액체 제제로서 제조하였다:

<표 33>

제제를 3개의 상이한 보관 조건: 5℃ (주변 습도), 25℃에서 ( 60% 상대 습도), 및 40℃ (75% 상대 습도)에 배치하였다. 75/200 제제를 또한 광 스트레스 (0 ICH, 0.5x ICH, 또는 1x ICH)에 노출시켰다.

결과

결과는 MFI 측정에 기초하여 (데이터는 제시되지 않음), 메티오닌 농도 증가가 모든 조건에서 육안으로 보이지 않는 미립자를 감소시킨다는 것을 시사한다. 메티오닌 농도 증가는 UP-SEC에 의해 관찰된 바, 40℃에서 %HMW 종을 감소시켰다. 메티오닌 농도 증가는 40℃에서 혼탁도를 약간 감소시켰다.

실시예 5:

CTLA4 단일 제제의 장기간 안정성

하기 CDR을 가지는 항-CTLA4 항체, 100 mg/mL 항-CTLA4 항체, 10 mM L-히스티딘 완충제, 7% w/v 수크로스, 0.02% w/v 폴리소르베이트 80을 사용하여 pH 5.5의 하기 액체 제제를 제조하였다. 생성물을 탄성중합체 마개 및 알루미늄 실이 있는 2R 타입 I 글래스 내로 분산시켰다. 최종 부피는 2.0 mL였고, 여기서, 초과 필은 0.2 mL였다. 샘플을 하기 조건하에서 안정성에 대해 평가하였다:

(i) 5℃/주변 습도

(ii) 25℃/60% 상대 습도

(iii) 40℃/75% 상대 습도.

샘플을 초기에, 및 1, 3, 6, 9, 및 12개월째에 시험하였다. 결과는 하기 표에 기재되어 있다:

<표 34>

<표 35>

<표 36>

결과:

상기 데이터에 제시된 바와 같이, 제제를 5℃에서 보관하였을 때, 어떤 유의적인 변화도 관찰되지 않았다. 상기 제제는 5℃에서 24개월의 기간 동안 안정적일 것으로 예상된다. 결합 ELISA에 의해 측정 시, 제제의 생물학적 효능은 모든 조건하에서 효능의 어떤 유의적인 변화도 관찰되지 않았다는 것을 나타내었다. 보관 시간 또는 조건의 함수로서 pH 변화도 없었다.

모든 보관 조건하에서 샘플의 단백질 농도는 안정성에 대해 최대 12개월 동안 시험된 3개의 모든 조건 간에 어떤 유의적인 변화도 보이지 않았다.

전하 변이체 (산성 변이체(%), 주요(%), 및 염기성 변이체(%))를 HP-IEX에 의해 측정하였다. 5℃ 조건의 경우, 12개월 동안에 걸쳐 어떤 유의적인 변화도 관찰되지 않았다. 25℃ 조건의 경우, 12개월 동안에 걸쳐 산성 변이체(%)의 증가, 및 총 주요 피크(%)의 감소가 있었고, 여기서, 염기성 변이체(%)는 변함없이 그대로 유지되었다. 이러한 결과는 보관 조건을 고려하면, 예상 밖의 결과는 아니다. 40℃ 조건의 경우, 총 주요 피크(%)는 초기 시점부터 6개월 시점까지 유의적인 감소를 보였고, 산성 변이체(%)는 유의적으로 증가하였고, 여기서, 염기성 변이체(%)는 변함없이 그대로 유지되었다. 이러한 결과는 보관 조건을 고려하면, 예상 밖의 결과는 아니다.

UP-SEC에 의해 순도를 측정하였다 (%HMW 종, 단량체(%), 및 %LMW 종). 단량체(%) 또는 %HMW 종의 경우, 5℃에서 최대 12개월 동안 안정성에 있어 어떤 변화도 없다. 5℃ 조건의 경우, 12개월 동안에 걸쳐 LMW 종에서는 어떤 피크도 검출되지 않았다. 25℃ 보관 조건의 경우, 12개월 동안에 걸쳐 HMW 종에서는 변화가 없었고, 단량체(%)는 약간 감소되었고, LMW 종은 약간 증가하였다. 40℃ 조건에서, 최대 6개월 동안 %HMW 종은 약간의 증가를 보이고, 단량체(%)는 6개월째인 시점에 85% 미만으로 감소되었다. 이러한 결과는 보관 조건을 고려하면, 예상 밖의 결과는 아니다.

보관 시간 또는 조건의 함수로서 pH 변화도 없었다.

실시예 6

임의적 부형제로서 킬레이터 첨가

킬레이터 (DTPA)의 존재 또는 부재에서의 제제의 안정성을 평가하였다. 제제의 안정성을 평가하기 위해, 두 제제를 바이알 내로 충전시키고, 차광하에 12주 동안 5℃ (주변 습도), 25℃ (60% 상대 습도), 및 40℃ (75% 상대 습도)에서 안정성에 대해 수행하였다. 두 제제는 하기와 같다:

단량체의 백분율(%) 뿐만 아니라, 고분자량 종 (HMW) 및 후기 용출 피크 (LMW 종)의 백분율(%)도 측정하여 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)에 의해 샘플의 콜로이드성 안정성을 순도에 대해 사정하였다. 고분자량 종 (HMW 또는 응집체), 단량체(%) 및 LMW (저분자량 종)의 수준을 평가하는 UPSEC 데이터가 하기 표에 있다.

<표 37>

상기 표에 제시된 바와 같이, HMW의 백분율(%) 및 단량체의 백분율(%)을 측정한 샘플의 UP-SEC 분석 결과, 5℃, 25℃ 및 40℃에서 두 제제 모두 최대 12주 시점 동안 %HMW 피크 및 %LMW 피크가 증가하는 성향 (및 그 결과, 단량체 피크(%) 감소)을 보인 것으로 나타났다. 40℃와 비교하였을 때, 25℃에서는 두 제제 모두 더 작은 변화는 있었지만, 유사한 경향을 보였다. 5℃에서는 실질적인 변화는 관찰되지 않았다. 데이터에 기초하면, 제제 2 (DTPA 함유)와 비교하였을 때, 제제 1 (DTPA 무함유)은 %HMW 및 %LMW에서 약간의 증가를 보였다. 추가로, 제제 2와 비교하였을 때, 제제 1은 더욱 큰 단량체(%) 감소를 보였다.

화학적 안정성을 측정한 샘플의 HP-IEX 분석 결과, 5℃, 25℃ 및 40℃에서 두 제제 모두 최대 12주 시점 동안 산성 피크(%)가 증가하고, 그 결과, 단량체 피크(%)가 감소하는 성향을 보인 것으로 나타났다. 40℃와 비교하였을 때, 25℃에서는 두 제제 모두 더 작은 변화는 있었지만, 유사한 경향을 보였다. 5℃에서는 실질적인 변화는 관찰되지 않았다 (데이터는 제시되지 않음).

하기 표의 결과는 최대 8주 시점까지 시간에 따라 PS80 농도가 감소하는 성향을 나타낸다. 40℃와 비교하였을 때, 25℃에서는 두 제제 모두 더 작은 변화는 있었지만, 유사한 경향을 보였다. 5℃에서는 실질적인 변화는 관찰되지 않았다. 제제 1 (DTPA를 함유하지 않는 항-CTLA4 항체)과 비교하였을 때, 제제 2 (DTPA를 함유하는 항-CTLA4)의 경우, 40℃에서 PS80의 분해는 더 적은 것으로 관찰되었다.

따라서, DTPA 또한 본원에 기술된 제제에 더욱더 큰 안정성을 제공할 수 있다.

SEQUENCE LISTING <110> Bhattacharya, Soumendu Narasimhan, Chakravarthy Nachu Sharma, Manoj K. Yang, Xiaoyu De, Arnab <120> STABLE FORMULATIONS OF ANTI-CTLA4 ANTIBODIES ALONE AND IN COMBINATION WITH PROGRAMMED DEATH RECEPTOR 1 (PD-1) ANTIBODIES AND METHODS OF USE THEREOF <130> 24449 <150> 62/500,268 <151> 2017-05-02 <160> 100 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR1 <400> 1 Arg Ala Ser Lys Gly Val Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Tyr Leu His 1 5 10 15 <210> 2 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR2 <400> 2 Leu Ala Ser Tyr Leu Glu Ser 1 5 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR3 <400> 3 Gln His Ser Arg Asp Leu Pro Leu Thr 1 5 <210> 4 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variable Region <400> 4 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Lys Gly Val Ser Thr Ser 20 25 30 Gly Tyr Ser Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro 35 40 45 Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Tyr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 65 70 75 80 Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg 85 90 95 Asp Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 5 <211> 218 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Light Chain <400> 5 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Lys Gly Val Ser Thr Ser 20 25 30 Gly Tyr Ser Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro 35 40 45 Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Tyr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 65 70 75 80 Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg 85 90 95 Asp Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 110 Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln 115 120 125 Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 130 135 140 Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser 145 150 155 160 Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 165 170 175 Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 180 185 190 His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro 195 200 205 Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 6 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR1 <400> 6 Asn Tyr Tyr Met Tyr 1 5 <210> 7 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR2 <400> 7 Gly Ile Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Phe Asn Glu Lys Phe Lys 1 5 10 15 Asn <210> 8 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR3 <400> 8 Arg Asp Tyr Arg Phe Asp Met Gly Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 9 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variable Region <400> 9 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Val Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Tyr Met Tyr Trp Val Arg 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Sequence <220> <223> 4G10H3L3 VL <400> 79 Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly 1 5 10 15 Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser 20 25 30 Asn Phe Pro Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Ser 35 40 45 Leu Ile Gly Gly Thr Asn Asn Lys Ala Ser Trp Thr Pro Ala Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Ile Ser Gly Ala 65 70 75 80 Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn 85 90 95 His Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 <210> 80 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 4G10H4L3 VH <400> 80 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Leu Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Ile Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Phe Thr Val Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 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Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Leu Ile Asn Pro Tyr Asn Asn Ile Asp Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Phe Thr Val Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Gly Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Leu Asp Tyr Arg Ser Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ala 115 <210> 83 <211> 109 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 4G10H5L3 VL <400> 83 Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly 1 5 10 15 Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser 20 25 30 Asn Phe Pro Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Ser 35 40 45 Leu Ile Gly Gly Thr Asn Asn Lys Ala Ser Trp Thr Pro Ala Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Ile Ser Gly Ala 65 70 75 80 Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn 85 90 95 His Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 <210> 84 <211> 448 <212> PRT 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Leu Thr Val Asp Lys Ser 405 410 415 Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 420 425 430 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 85 <211> 215 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Light Chain <400> 85 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Gly Ser Ser 20 25 30 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Ala Phe Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro 85 90 95 Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala 100 105 110 Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser 115 120 125 Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu 130 135 140 Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser 145 150 155 160 Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu 165 170 175 Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val 180 185 190 Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys 195 200 205 Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 86 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 8D2/8D2 RE Variant 1 VH <400> 86 Glu Val Lys Leu Asp Glu Thr Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Pro Ile Lys Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Asn 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Ala Gln Ile Arg Asn Lys Pro Tyr Asn Tyr Glu Thr Tyr Tyr Ser Asp 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ser 65 70 75 80 Val Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Arg Gly Glu Asp Met Gly Ile Tyr 85 90 95 Tyr Cys Thr Ala Gln Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ala 115 <210> 87 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 8D2H1L1 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Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Asn 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Ala Gln Ile Arg Asn Lys Pro Tyr Asn Tyr Glu Thr Tyr Tyr Ser Ala 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ser 65 70 75 80 Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Gly Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Thr Ala Gln Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 91 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRL1 <400> 91 Arg Ala Ser Gln Ser Val Gly Ser Ser Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 92 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRL2 <400> 92 Gly Ala Phe Ser Arg Ala Thr 1 5 <210> 93 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRL3 <400> 93 Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Trp Thr 1 5 <210> 94 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH1 <400> 94 Ser Tyr Thr Met His 1 5 <210> 95 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH2 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Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro 115 120 125 Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val 130 135 140 Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala 145 150 155 160 Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly 165 170 175 Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly 180 185 190 Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys 195 200 205 Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys 210 215 220 Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu 225 230 235 240 Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu 245 250 255 Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys 260 265 270 Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys 275 280 285 Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu 290 295 300 Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 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Claims

(i) 약 10 mg/ml 내지 약 200 mg/ml의 항-CTLA4 항체, 또는 그의 항원 결합 단편;
(ii) 약 5 mM 내지 약 20 mM 완충제;
(iii) 약 6% 중량/부피 (w/v) 내지 약 8% w/v 비환원성 당;
(iv) 약 0.01% w/v 내지 약 0.10% w/v 비이온성 계면활성제; 및
(v) 약 1 mM 내지 약 20 mM 항산화제를 포함하는 제제.
제1항에 있어서, 항-CTLA4 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 서열식별번호(SEQ ID NO) 38의 CDRL1, 서열식별번호 39의 CDRL2, 및 서열식별번호 40의 CDRL3을 포함하는 3개의 경쇄 CDR 및 서열식별번호 35의 CDRH1, 서열식별번호 36의 CDRH2, 및 서열식별번호 37의 CDRH3을 포함하는 3개의 중쇄 CDR을 포함하는 것인 제제.
제1항 또는 제2항에 있어서, 항-CTLA4 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 서열식별번호 88을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열식별번호 48을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 것인 제제.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 제제의 pH가 5.0 내지 6.0인 제제.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 완충제가 L-히스티딘 완충제이고, 비환원성 당이 수크로스이고, 비이온성 계면활성제가 폴리소르베이트 80이고, 항산화제가 L-메티오닌이고, 제제는
(i) 약 10 mg/ml 내지 약 200 mg/ml의 항-CTLA4 항체, 또는 그의 항원 결합 단편;
(ii) 약 5 mM 내지 약 20 mM의 L-히스티딘 완충제;
(iii) 약 6% w/v 내지 약 8% w/v 수크로스;
(iv) 약 0.01% w/v 내지 약 0.10% w/v 폴리소르베이트 80; 및
(v) 약 1 mM 내지 약 20 mM L-메티오닌을 포함하는 것인 제제.
제5항에 있어서, 약 8 mM 내지 약 12 mM의 L-히스티딘 완충제를 포함하는 제제.
제5항 또는 제6항에 있어서, 약 5 mM 내지 약 10 mM의 L-메티오닌을 포함하는 제제.
제5항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 대략 0.02% w/v의 중량비로 폴리소르베이트 80을 포함하는 제제.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 약 10 mg/mL 내지 약 100 mg/mL의 항-CTLA4 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 제제.
제9항에 있어서, 항-CTLA4 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 농도가 약 10 mg/ml, 12.5 mg/ml, 25 mg/ml, 50 mg/ml, 75 mg/ml 또는 100 mg/ml인 제제.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 약 25 mg/mL의 항-CTLA4 항체, 10 mM L-히스티딘 완충제, 약 7% w/v 수크로스, 약 0.02% 폴리소르베이트 80, 및 약 10 mM L-메티오닌을 포함하는 제제.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 약 50 mg/mL의 항-CTLA4 항체, 10 mM L-히스티딘 완충제, 약 7% w/v 수크로스, 약 0.02% 폴리소르베이트 80, 및 약 10 mM L-메티오닌을 포함하는 제제.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 약 75 mg/mL의 항-CTLA4 항체, 10 mM L-히스티딘 완충제, 약 7% w/v 수크로스, 약 0.02% 폴리소르베이트 80, 및 약 10 mM L-메티오닌을 포함하는 제제.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 약 100 mg/mL의 항-CTLA4 항체, 10 mM L-히스티딘 완충제, 약 7% w/v 수크로스, 약 0.02% 폴리소르베이트 80, 및 약 10 mM L-메티오닌을 포함하는 제제.
제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 제제의 pH가 약 5.3 내지 약 5.8인 제제.
제15항에 있어서, 제제의 pH가 약 5.5 내지 약 5.6인 제제.
제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 항-PD1 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 추가로 포함하는 제제.
제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 킬레이터를 추가로 포함하는 제제.
제18항에 있어서, 킬레이터가 DTPA인 제제.
제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 제제가 유리 바이알 또는 주사 장치에 함유되어 있는 것인 제제.
제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 액체 제제이거나, 적어도 -70℃ 미만으로 냉동되거나, 또는 동결건조된 제제로부터의 재구성된 액제인 제제.
제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 5℃에서 12개월 후:
(i) 크기 배제 크로마토그래피에 의해 측정 시, 항-CTLA4 항체의 단량체(%)가 ≥95%이고/거나;
(ii) 환원된 CE-SDS에 의해 측정 시, 항-CTLA4 항체의 중쇄 및 경쇄(%)가 ≥90%이고/거나;
(iii) 환원된 CE-SDS에 의해 측정 시, 항-CTLA4 항체의 중쇄 및 경쇄(%)가 ≥95%이고/거나;
(iv) 비환원된 CE-SDS에 의해 측정 시, 항-CTLA4 항체의 무손상 IgG(%)가 ≥90%이고/거나;
(v) 비환원된 CE-SDS에 의해 측정 시, 항-CTLA4 항체의 무손상 IgG(%)가 ≥95%인 제제.
(i) 약 1 mg/ml 내지 약 100 mg/ml의 항-CTLA4 항체, 또는 그의 항원 결합 단편;
(ii) 약 1 mg/ml 내지 약 100 mg/ml의 항-PD1 항체, 또는 그의 항원 결합 단편;
(iii) 약 5 mM 내지 약 20 mM 완충제;
(iv) 약 6% 중량/부피 (w/v) 내지 약 8% w/v 비환원성 당;
(v) 약 0.01% w/v 내지 약 0.10% w/v 비이온성 계면활성제; 및
(vi) 약 1 mM 내지 약 20 mM 항산화제를 포함하는 제제.
제23항에 있어서, 완충제가 L-히스티딘 완충제이고, 비환원성 당이 수크로스이고, 비이온성 계면활성제가 폴리소르베이트 80이고, 항산화제가 L-메티오닌이고, 제제는
(i) 약 1 mg/ml 내지 약 100 mg/ml의 항-CTLA4 항체, 또는 그의 항원 결합 단편;
(ii) 약 1 mg/ml 내지 약 100 mg/ml의 항-인간 PD1 항체, 또는 그의 항원 결합 단편;
(iii) 약 5 mM 내지 약 20 mM의 L-히스티딘 완충제;
(iv) 약 6% w/v 내지 약 8% w/v 수크로스;
(v) 약 0.01% w/v 내지 약 0.10% w/v 폴리소르베이트 80; 및
(vi) 약 1 mM 내지 약 20 mM L-메티오닌을 포함하는 것인 제제.
제23항 또는 제24항에 있어서, 항-CTLA4 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 서열식별번호 38의 CDRL1, 서열식별번호 39의 CDRL2, 및 서열식별번호 40의 CDRL3을 포함하는 3개의 경쇄 CDR 및 서열식별번호 35의 CDRH1, 서열식별번호 36의 CDRH2, 및 서열식별번호 37의 CDRH3을 포함하는 3개의 중쇄 CDR을 포함하는 것인 제제.
제23항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 항-CTLA4 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 서열식별번호 88을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열식별번호 48을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 것인 제제.
제23항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 항-인간 PD-1 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 서열식별번호 1의 CDRL1, 서열식별번호 2의 CDRL2, 및 서열식별번호 3의 CDRL3을 포함하는 3개의 경쇄 CDR 및 서열식별번호 6의 CDRH1, 서열식별번호 7의 CDRH2, 및 서열식별번호 8의 CDRH3을 포함하는 3개의 중쇄 CDR을 포함하는 것인 제제.
제23항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 항-인간 PD-1 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 서열식별번호 4에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 V_L 영역, 및 서열식별번호 9에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 V_H 영역을 포함하는 것인 제제.
제23항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 제제가 펨브롤리주맙인 항-인간 PD-1 항체를 포함하는 것인 제제.
제23항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 항-PD1 항체 대 항-CTLA4 항체의 비가 1:2, 1:1, 2:1, 10:1, 1:10, 8:3, 또는 8:1인 제제.
제30항에 있어서, 항-PD1 항체 대 항-CTLA4 항체의 비가 8:3인 제제.
제30항에 있어서, 항-PD1 항체 대 항-CTLA4 항체의 비가 8:1인 제제.
제23항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 제제의 pH가 5.0 내지 6.0인 제제.
제23항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 약 8 mM 내지 약 12 mM의 L-히스티딘 완충제를 포함하는 제제.
제23항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 약 5 mM 내지 약 10 mM의 L-메티오닌을 포함하는 제제.
제23항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 대략 0.02% w/v의 중량비로 폴리소르베이트 80을 포함하는 제제.
제23항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 항-CTLA4 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 농도가 약 1.25 mg/ml, 2.5 mg/ml, 2.9 mg/ml, 5 mg/ml, 7.9 mg/ml, 10 mg/ml, 12.5 mg/ml, 25 mg/ml, 50 mg/ml, 75 mg/ml, 또는 100 mg/ml인 제제.
제37항에 있어서, 항-CTLA4 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 농도가 약 7.9 mg/ml인 제제.
제23항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 항-PD1 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 농도가 약 25 mg/mL, 22.7 mg/mL, 2.27 mg/mL, 21.1 mg/mL 또는 23.5 mg/mL인 제제.
제23항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 항-CTLA4 항체의 농도가 약 7.9 mg/mL이고, 항-PD1 항체의 농도가 약 21 mg/mL인 제제.
제23항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 약 25 mg/mL의 항-PD1 항체 및 약 12.5 mg/mL 항-CTLA4 항체, 10 mM L-히스티딘 완충제, 약 7% w/v 수크로스, 약 0.02% w/v 폴리소르베이트 80, 및 약 10 mM L-메티오닌을 포함하는 제제.
제23항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 약 25 mg/mL의 항-PD1 항체 및 약 25 mg/mL 항-CTLA4 항체, 10 mM L-히스티딘 완충제, 약 7% w/v 수크로스, 약 0.02% w/v 폴리소르베이트 80, 및 약 10 mM L-메티오닌을 포함하는 제제.
제23항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 약 25 mg/mL의 항-PD1 항체 및 약 50 mg/mL 항-CTLA4 항체, 10 mM L-히스티딘 완충제, 약 7% w/v 수크로스, 약 0.02% w/v 폴리소르베이트 80, 및 약 10 mM L-메티오닌을 포함하는 제제.
제23항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 약 22.72 mg/mL의 항-PD1 항체 및 약 2.3 mg/mL 항-CTLA4 항체, 10 mM L-히스티딘 완충제, 약 7% w/v 수크로스, 약 0.02% w/v 폴리소르베이트 80, 및 약 10 mM L-메티오닌을 포함하는 제제.
제23항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 약 2.27 mg/mL의 항-PD1 항체 및 약 22.7 mg/mL 항-CTLA4 항체, 10 mM L-히스티딘 완충제, 약 7% w/v 수크로스, 약 0.02% w/v 폴리소르베이트 80, 및 약 10 mM L-메티오닌을 포함하는 제제.
제23항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 약 23.5 mg/mL의 항-PD1 항체 및 약 2.9 mg/mL 항-CTLA4 항체, 10 mM L-히스티딘 완충제, 약 7% w/v 수크로스, 약 0.02% w/v 폴리소르베이트 80, 및 약 10 mM L-메티오닌을 포함하는 제제.
제23항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 약 21.1 mg/mL의 항-PD1 항체 및 약 7.9 mg/mL 항-CTLA4 항체, 10 mM L-히스티딘 완충제, 약 7% w/v 수크로스, 약 0.02% w/v 폴리소르베이트 80, 및 약 10 mM L-메티오닌을 포함하는 제제.
제23항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 킬레이터를 추가로 포함하는 제제.
제23항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 킬레이터가 DTPA인 제제.
제23항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 제제가 유리 바이알 또는 주사 장치에 함유되어 있는 것인 제제.
제23항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 액체 제제이거나, 적어도 -70℃ 미만으로 냉동되거나, 또는 동결건조된 제제로부터의 재구성된 액제인 제제.
유효량의 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항의 제제를 투여하는 단계를 포함하는, 암 또는 만성 감염 치료를 필요로 하는 인간 환자에서 암 또는 만성 감염을 치료하는 방법.
암 치료용 또는 만성 감염 치료용 의약 제조를 위한 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항의 제제의 용도.