KR20130097636A - 고분자량 쌍성이온-함유 중합체 - Google Patents

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스티븐 에이. 찰스
빅토르 디. 펄로트
디디어 지. 베노이트
래인 에이. 크리즈베
웨인 토
린다 제이. 자디크
잔느 엠. 프라트
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올리가시스
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Abstract

본 발명은 친수성 기 및 하나 이상의 기능성 작용제를 함유하는 멀티-아암 고 MW 중합체, 및 이러한 중합체를 제조하는 방법을 제공한다.

Description

고분자량 쌍성이온-함유 중합체{HIGH MOLECULAR WEIGHT ZWITTERION-CONTAINING POLYMERS}
관련 출원에 대한 상호 참조:
본 출원은 2010년 4월 15일에 출원된 미국 가출원 번호 61/324,413에 대해 우선권을 주장하며, 이는 모든 목적을 위해 그 전부가 본원에 포함된다.
컴팩트 디스크로 제출한 "서열 목록", 표, 또는 컴퓨터 프로그램 목록 부록에 대한 참조:
해당 없음.
현재 '의학적으로 차별화된 제품'을 다루고자 전념을 다하고 있는 대형 제약 회사들간에 일종의 군비 경쟁이 일어나고 있다. 바이오의약품이 핵심 수단으로 보인다. 그 신념은 차별화가 반드시 타겟 신규성을 통해서만 나오는 것이 아니고 신규한 약물 포맷에서도 나올 것이라는 점이다. 이 포맷들은 생성되는 약물이 포맷 중심적이라기 보다는 생물학 중심적일 수 있도록 유연성이 있을 것이다. 바이오의약품의 이러한 차세대 조류는 모듈식, 다기능성, 및 타겟화된 것일 것이다. 이들 약물은 타겟화될 더 넓은 질병 생물학의 이해 및 다면적 약물에 대한 지식의 적용을 향한 관점으로 설계될 것이다. 항체는 매우 훌륭한 약물이지만, 상당한 양의 항체 단백질 공학에도 불구하고 이들은 융통성이 없고(rigid) 유연성이 없는(inflexible) 포맷이며 계속 그럴 것이다.
제약 단백질 엔지니어들은 더 작은 단백질 포맷에 기대를 걸고 있다. 2006년이라는 기간에 아드넥틴(Adnexus가 개발하고 BMS가 매수함), 아비머(Avidia가 개발하고 Amgen이 매수함), 디아바디(Domantis가 개발하고 GSK가 매수함), 합토젠(Wyeth가 매수함), BiTES(Micromet가 개발함), 카멜리드(Ablynx가 개발함), 펩티드(Gryphon Therapeutics 및 Compugen 및 기타 다수에서 개발함)와 같은 진보의 조류가 있었다. 그러나 이러한 제약 파이프라인 내의 다중 제품으로의 플랫폼 기술의 전환은 구체화되기까지는 속도가 더디었다. 지난 20년간, 이러한 비-전(non-whole) 항체 포맷을 끊임없이 따라다니는 문제점들은 차선적(suboptimal) 친화성, 불량한 안정성, 낮은 제조 수율뿐만 아니라 도구 개발과도 관련되었다. 이 문제들은 많은 부분 해결되었거나 해결되고 있다. 하지만 이들 포맷의 아킬레스건은 이들의 부적절한 생체 내(in vivo) 체류 시간에 남아 있고, 이는 중요한 제품 기회의 조류를 저지하고 있다.
전 항체는 250 시간 이상의 생체 내 배설(elimination) 반감기를 갖고, 이는 몸에서 1 개월 초과의 신체 체류(physical residency)에 해당한다. 이 점이 이들을 투여의 관점에서 훌륭한 제품 포맷이 되게 한다. 이들은 종종 한 달 간격 또는 덜 빈번한 주입(injection)을 달성할 수 있다. 궤적(trajectory)은 또한 더 적은 양(1mL, 0.8mL, 0.4mL)으로, 더 안정한 액체 제형(의사의 재구성이 요구되는 동결건조된(lyophilized) 제형과 대비됨)으로, 더 높은 농도(50mg/mL, 100mg/mL, 200mg/mL)에서 저장 및 더 높은 온도(-80 도, -20 도, 2 - 8 도, 실온)에서 피하 투여하는 것이 선호된다.
항체는 특히 광범위한 항체 발견 및 개발 생태계에서의 모든 작용으로 타의 추종을 불허한다. 하지만, 항체는 아쉬운 점을 많이 남긴다. 이들은 어색하고(ungainly), 유연하지 않고, 크고, 단일-타겟 한정이고, 포유류 계에서 제조되고, 전반적으로 불량하게 특성화되고(poorly characterized), 타겟 결합, 상피 FcRn수용체 재순환, 항체-의존성 세포-매개 세포독성(ADCC), 보체 의존성 세포독성(CDC), 결합활성(avidity), 고차 구성(higher order architectures) 등을 몇몇 예로 들 수 있는 많은 상이한 생체 내 생명 작용의 중심이 된다.
더 작은 모듈식 포맷은 더 안전하고, 타겟화된, 다기능성, 고효능의, 잘 특성화되고(well-characterized) 더 값싼 치료법에 대하여 주요한 공헌을 할 수 있다. 게다가, 재조합 단백질 및 펩티드(네이티브이거나 뮤테인) 및 올리고뉴클레오티드와 같은 다른 유형의 약물 작용제의 혈청 체류 시간 및 연관된 신체 성질을 개선하기 위한 유사한 요구가 있다. 어려운 점은 이러한 가용성 바이오의약품에 대한 생체 내 체류 시간을 급격히 증가시키고(수행 문제), 약물 용해성, 안정성, 점도, 특성가능성(characterizability)과 같은 다른 핵심 파라미터에서 타협을 강제하지 않고 그렇게 할 수 있고(관련된 신체 특성 문제), 초기 동물 연구부터 스케일-업 제조 및 후기-단계 인간 임상 시험에 이르기까지 타겟 클래스(class) 및 약물 개발 경로를 통틀어 예측가능성을 부여하는 접근법을 이용하는(포트폴리오 계획 문제) 기술적 해법을 고안하는 것이다.
해법 중 첫 번째 시도된 클래스는 생물학-기반이고 단백질 작용제를 트랜스페린, 알부민, 면역글로불린 감마(IgG), IgG 불변 영역(IgG-Fc) 및/또는 기타 혈청 단백질에 융합함에 의존하는 것이다. 하지만 생물학-기반 혈청 확장 모이어티(moiety)를 기능성 생물학적 모이어티에 융합하는 것은 동시발생하는 생물학적 상호 작용의 수 및 복잡성을 증가시킨다. 이 비-타겟-매개 상호 작용은 약물의 바람직한 치료 작용을 거의 촉진하지 않고, 오히려 복잡하고 거의 이해되지 않은 방식으로 약물의 목적하는 치료 작용을 더 빈번하게 손상시킨다. 순(net) 영향은 예측가능성, 수행, 및 안전성을 약화시키는 것이다.
해법 중 두 번째 시도된 클래스는 약물에 부착되는 상이한 유형의 중합체를 이용하는 일련의 접근법에 폭 넓게 기반한다. 이 중합체들은 대체로 물을 결합시키고 조직하는 능력을 기반으로 작용한다. 결합된 물은 무수한 생체 내 제거(clearance) 메커니즘에 의한 제거를 수동적 및 능동적으로 감소시키는 한편, 또한 용해성, 안정성, 점도와 같은 중합체-약물 컨쥬게이트의 물리적 성질을 개선시킨다. 이 해법의 두 번째 클래스는 다음과 같은 두 가지 방식으로 더 하위 분류된다: (1) 중합체 내 물 결합 실체(entity)에 의해, 및 (2) 중합체가 약물 작용제에 부착되는 방식에 의해. (1)과 관련하여, 당(탄수화물), 아미노산(친수성 단백질 영역), 폴리에틸렌 옥시드, 폴리옥사졸린, 폴리비닐 알코올, 폴리비닐 피롤리돈 등과 같은 사용되고 있는 수 많은 상이한 중합체성 물 결합 모이어티가 있다. (2)와 관련하여, 중합체가 세포 기구(machinery)에 의해 약물 작용제에 첨가되는지, 또는 반-합성(semi-synthetic) 콘쥬게이션 단계에서 첨가되는지 여부에 따라 크게 구별된다.
세포 기구에 의해(즉, 반-합성 단계를 거치지 않고) 약물 작용제에 첨가되는 중합체와 관련하여, 한 예는 코딩 뉴클레오티드 서열(예를 들어, Aranesp) 수준에서 글리콜실화 부위를 첨가 또는 변경함에 의해 세포-매개 글리코실화 과정을 통해 친수성 탄수화물 중합체를 번역된 단백질의 표면에 첨가하는 것이다. 또 다른 예는 오픈 리딩 프레임 코돈(즉, Amunix의 XTEN 플랫폼) 수준에서 단백질 번역 동안에 일련의 반복 뉴클레오티드 단위를 첨가함에 의해 여러 개의 친수성 아미노산을 첨가하는 것이다.
반-합성과 관련하여: 폴리에틸렌 옥시드의 중합체가 기능화된 다음 약물 작용제에 컨쥬게이션되는 페길화(PEGylation)에 가장 많은 경험이 존재한다. 또한, Fresenius는 장쇄 메이즈(maize) 전분이 기능화된 다음 약물 작용제에 컨쥬게이션되는 헤실화(HESylation) 접근법을 이용한다. 또한, Serina Therapeutics는 친수성 폴리옥사졸린 백본(PEG의 폴리에틸렌 백본과 상반됨)을 이용한다. Haddleton 등에 의해 기재된 폴리PEG라 일컫는 또 다른 방법은 라디칼 중합이 가능한 중합체 백본 및 여러 개의 짧은 PEG이거나 당인 물 결합 실체를 이용한다.
이 상이한 기술 접근법들을 실제로 어떻게 잘 작용시킬 것인가? 일반적으로, 바이오의약 및 의약에 의해 소요되는 상당한 시간 및 돈에도 불구하고, 일반적인 결론은 이 기술들은 요구되는 수행 이득(특히 생체 내 체류 시간)의 수준을 달성하지 못하고 있고, 게다가 추가 공정을 통한 그 이상의 진보를 달성하기 위한 능력 측면에서 한계(flat of the curve)에 있다는 것이다. 요구되는 개선의 수준은 약물 및 이의 생물학적 성질 및 요구되는 제품 프로파일에 의존하지만, 많은 경우에서 3 내지 4 배나 된다. 많은 회사는 이 개선의 수준을 달성하기 위해 일하고 있지만 실제로 이용되는 기술은 이에 미치지 못하고 이들의 이용가능성에서 전반적으로 틈새(niche)에서 증대하는 개선을 달성하고 있다.
예를 들어:
40 kDa 분지형 PEG로 GM-CSF (Micromet 데이터)의 항체 단편 scFv (대략 22 kD의 크기) 억제제의 페길화는 쥣과(murine)에서 부적절한 59 시간의 정맥내 주입 후 제거 반감기를 야기한다. 유용하려면 쥣과의 반감기는 150 시간 (3x 개선) 초과, 바람직하게는 250 시간 (4x 개선) 초과이어야 한다.
40 kDa 분지형 PEG (Pegasys 데이터)로 대략 19.5 kDa의 재조합 인터페론 알파의 페길화는 대략 50 시간의 피하 주입 후 쥣과 제거 반감기 및 80 시간 범위의 인간 반감기를 야기한다. Pegasys는 인간에 일주일 단위로 투여된다.
증가된 크기 및 구성의 일련의 PEG 중합체로 IL-8 (Genentech 데이터, Leong 등, 2001)에 대한 대략 50 kDa의 Fab' 항체 단편의 페길화. 토끼에서 정맥내 주입 후 반감기는 PEG 20 kDa 선형 44 시간에서 PEG 40 kDa 분지형 105 시간의 범위이다. 이는 40 kDa 분지형 중합체와 컨쥬게이션된 TNFa에 대한 Fab'을 갖는 승인된 제품 Cimzia의 반감기에 대해 상호관련될 수 있다. 피하 주입 후 인간 반감기는 311 시간이고, 일개월 단위 피하 투여량에 대해 충분하다(류마티스성 관절염에 대해 FDA 승인). 하지만 PEG 모이어티(용해성, 안정성, 점도)에 의해 유도되는 성질은 피하 주입(제한 1mL, 바람직하게는 0.8mL 이하)를 위해 전체 투여량 (400mg)이 단일 바이알(vial)로 제형화되는 것을 가능하게 할 만큼 충분하지 않다. 오히려 Cimzia는 바람직하게는 각각 제품의 200mg을 전달하는 두 개의 분리된 주입을 위해 두 개의 바이알에 고체로 제형화된다. 나아가, PEG 시약은 매우 비싸고 약물의 평균 도매가의 20 퍼센트까지 구성한다. 그러므로, Cimzia 제품은 Humira (항-TNFα 항체, 액체 제형, 단일 사용 주사기, 단일 피하 주입에 의해 투여, 월 2회)에 대해 시장에서 그다지 경쟁력이 없고, Simponi (항-TNFa 항체, 액체 제형, 단일 사용 주사기, 단일 피하 주입으로 투여, 월 1회)에 대해서는 더더욱 경쟁력이 없다.
40 kDa 분지형 PEG 중합체로 에리스로포이에틴 수용체 (Hematide 데이터)의 펩티드 미메틱 (대략 4kDa)의 페길화는 피하 주입 후 래트에서 23 내지 31 시간의 반감기를 보였다(투여량 의존). 원숭이에서 반감기는 15 시간 내지 60 시간의 범위였다(Fan 등 Experimental Hematology, 34, 2006). 분자의 계획된 투여 빈도는 일개월 단위이다. 이 경우, 이 분자로 일개월 단위로 투여하는 능력은 약물 자체의 신체 반감기 및 체류 시간을 훨씬 초과하여 지속하는 약역학적 효과에 의해 가능해진다. 이 특성은 어떠한 효능이 강한 효현(agonistic) 약물에서는 유지되지만, 일반적으로 최소 억제 농도를 유지하는 것이 필요한 억제제에서는 유지되지 않고, 효소에 대해서도 유지되지 않고, 고투여량 효현 단백질에서도 유지되지 않는다.
인터페론 베타 (대략 20 kDa)는 40 kDa 선형 PEG 중합체로 페길화되었다. 비페길화 형태인 Avonex는 원숭이에서 정맥내 주입 후 5.5 시간의 평균 말단 반감기 및 근육내 주입 후 10 시간의 반감기를 보여준다. 40 kDa 선형 PEG 중합체의 컨쥬게이션은 정맥내 주입 후 대략 15 시간 및 피하 주입 후 30 시간의 반감기를 보여줄 수 있다. 40 kDa 분지형 PEG 중합체의 컨쥬게이션은 정맥내 주입 후 30 시간 및 피하 주입 후 60 시간의 반감기를 보여줄 수 있다. 계획된 투여 빈도는 월 2회이므로, 이 분자로 월 2회 투여하는 능력은 약물 자체의 신체 반감기 및 체류 시간을 초과하여 지속하는 생물학적 또는 약역학적 효과에 의해 가능해진다. 현존하는 인터페론 베타 제품에 대적하기 위한 매력적인 타겟 제품 프로파일로서 월 1회라는 투여 빈도가 요구된다. 대안적으로, 월 2회 투여되지만 매우 플랫(flat)하고, 잠재적으로 영차 카이네틱스(zero order kinetics)인 중합체 컨쥬게이트가 이상적일 수 있다. 이는 대단히 생체적합한 컨쥬게이트로 수득가능하고 더 낮은 전체 투여량으로 투여된다. 나아가, 인터페론 베타는 불안정하고 전반적으로 다루기 '어려운' 단백질이고, 용해성 및 안정성에서 추가 개선이 바람직하다.
60 kDa 분지형 PEG 중합체로 재조합 인간 인자 VIII(300 kDa 이상)의 페길화가 수행되었다. 비페길화된 FVIII가 인간에서 12 내지 14 시간 순환 반감기를 보여준다. 이는 출혈 위기에 대응하여 급박하게 사용된다. 이는 또한 주 3회 정맥내 주사(infusion)를 통해 예방을 위해 사용되고 있다. 쥣과의 평균 말단 반감기는 비페길화 형태에서 6 시간이고 부위-지정 페길화 형태에서 11 시간이다. 토끼에서 비페길화 형태인 전장 FVIII 단백질에서는 6.7 시간의 평균 말단 반감기를 보여주었다. 60kDa 분지형 PEG로 페길화된 형태에서, 반감기는 12 시간으로 증가되었다. PEG-FVIII의 반감기 증가의 규모는 PEG 질량(mass)의 증가와 상관관계가 있다. 하지만, 핵심 목적은 주 1회 정맥내 주사로 예방을 가능하게 하는 것이다. 매우 큰(그리고 비싼) 60kDa PEG 시약에 의해 전달되는 이득 조차도 주 1회 투여 빈도를 가능하게 할 것이라 생각되지 않고 그럴 것 같지도 않다. 이것이 게임체인저(game changer)가 되기 위해서는 PEG에 대해 추가적인 >2x 바람직하게는 4x를 필요로 한다. 개선해야 할 또 다른 생체 내 수행 지표(performance metric)는 투여된 FVIII 약물에 대해 생성되는 중화 항체의 발생률을 실질적으로 감소시키는 것이 될 것이다. 이 목적은 부적절하게 FVIII-PEG 컨쥬게이트를 통해 만났다. 개선해야 할 또 다른 시험관 내(in vitro) 수행 지표는 정맥내 투여 보다 피하 투여를 가능하게 하기 위해 충분한 안정하고 고농도의 제형을 달성하는 것이 될 것이다 - 이는 또한 피하 부위에 면역-자극 항원 제시 세포 수준이 높기 때문에 생체 내 면역원성 특성의 개선을 요구할 것이다. 최근, Biogen-개발 FVIII의 면역글로불린 Fc 단편에의 융합은 시험되어 페길화된 FVIII외 생체 내 반감기의 유사한 수준을 가지지만 짐작컨대 약물의 FcRn-매개 내피 세포 제거 때문에 흥미롭게도 매우 불량한 생체이용률을 보였다. 이 데이터는 FVIII 약물 개발자들이 현존하는 기술이 "난관에 부딪쳤다(hit a wall)"는 결론을 내도록 이끌었다.
Amunix XTEN 기술은 대략 850 개의 친수성 아미노산(대략 80kDa의 크기)을 GLP-1 펩티드에 융합시킨다. 이는 cynomolgus 원숭이에서 반감기를 40kDa 분지형 PEG 중합체에 컨쥬게이션된 GLP-1 등가물 보다 약간 열등한 60 시간으로 신장시킨다. 그래서 2x 증가된 크기의 중합체는 본질적으로 동등한 수행 이득을 달성한다. 유사한 이득의 수준이 인간 성장 호르몬에 부착된 XTEN에서 관찰되었다. 반감기 이득의 수준을 더 확장하고자 하는 면에서 수 많은 도전이 있다. 다른 무엇보다도 더, 물에 결합하고 물을 구성함에 사용되는 친수성 아미노산이 그들의 물 결합 특성의 면에서 최선은 아니다. 둘째로, 중합체를 첨가하기 위한 리보솜 번역 기구의 필수 사용은, 분자량을 일정하게 유지하고 분지의 수준을 증가시킬 때 많은 페길화 예에서 분지형 구성에 대해 열등한 것으로 나타났던 단일 아암(arm), 선형 구조로 구성을 제한한다. 셋째로, 중합체 백본으로 사용되는 펩티드 결합은 충분히 불안정하여 이종성이 실질적인 측면에서 제한이 되어 친수성 중합체의 길이가 40kDa 분지형 PEG 보다 우수한 반감기를 달성할 수 있을 만큼 쉽게 증가될 수 없는, 다분산성을 보여줄 것이다(이는 자체로 제한이 되는 인코딩 플라스미드 벡터에서 다중의 긴 반복 단위의 사용과 관련된 다른 복잡성 중 상위에 있다). 그리고 이 기술은 이의 적용에서 틈새가 되며, 예를 들어 화학 합성을 통해 이전에 합성적으로 만들어진 펩티드를 지각된 (새로운 불리한 점 뿐만 아니라) 이점을 갖지만 전반적으로 다른 기술, 특히 생체 내 제거 반감기와 가능한한 유사한 생체 내 수행을 갖는 세포-기반 계에서 만들 수 있게 한다.
rhEPO는 165 개의 아미노산과 3 개의 N-연결 및 1 개의 O-연결 글리코실화 부위를 갖는 30.4 kDa 단백질이다. 질량의 40%는 탄수화물이다. 탄수화물은 시험관 내 활성에는 필요없지만, 생체 내 활성에는 전적으로 필요하다. Aranesp은 3 개의 사슬을 함유하는 네이티브 형태에 반해 5 개의 N-연결 올리고당 사슬을 함유하도록 유전자 수준에서 개질된 인간 에리스로포이에틴의 형태이다. 첨가되는 탄수화물은 당단백질의 대략적인 분자량을 30kDa에서 37kDa으로 증가시킨다. 인간에서, 이 변화는 정맥내 주입 후 평균 말단 반감기를 7 시간에서 21 시간으로, 피하 주입 후 16 시간에서 46 시간으로 증가시키는데, 이는 두 경우에 모두 대략 3배 개선이다. 재조합 인간 에리스로포이에틴의 페길화된 형태인 Mircera는 만성 신장 질환 환자에서 대략 140 시간의 피하 주입 후 생체 내 반감기를 보여주었지만, 약물의 신장 여과 때문에 환자는 기계적 제거를 감소시키는 수용체 친화도의 감소 뿐만 아니라 반감기에서 2x 초과의 증가를 보이며, 실제 신체 반감기는 70 시간 미만을 의미하고 이는 (40kDa 분지형 PEG로 페길화된) Affymax의 Hematide 펩티도미메틱과 비슷한 정도이다.
헤실화 기술은 메이즈 유래 전분 중합체의 약물에의 반-합성 컨쥬게이션을 이용한다. 데이터는 100kDa 헤실화 중합체가 마우스에서 에리스로포이에틴 상 30kDa 선형 PEG 중합체와 등가(Mircera 제품 등가물)임을 보여준다. 더 큰 중합체를 사용하는 것이 가능하지만, 그 접근법은 기본적으로 전분 물 결합의 성질에 의해 제한된다. 또한, (40kDa 분지형 PEG에 대해 그 자체로 열등한) 30kDa 선형 PEG에의 100kDa 중합체의 등가성은 이것이 필수적인 4x 이득을 제공하기 전은 물론이고 40kDa 분지형 PEG와 동등해지기 전에 수행의 면에서 갈 길이 멀다는 점을 보여준다.
이들 예는 시도된 몇몇 접근법 및 그들이 달성한 전반적인 수행의 예시이다. 요컨대, 이 접근법들 및 기술은 부족하다. 비-항체 스캐폴드의 경우, 그들은 원숭이에서 대략 60 내지 80 시간의 제거 반감기에서 모여들어 난관에 부딪친다. 비록 그 계통은 각기 다르지만, 인간에서 주 1회 투여를 가능하게 하기 위해서는 원숭이에서 100 시간 이상의 평균 말단 반감기를 달성하는 것이 일반적으로 바람직하다. 그리고, 투여 빈도가 반감기 보다 더 길 때, 이는 제형의 용해성, 안정성 및 점도에 부가적인 요구를 두게 된다. 인자 VIII과 같은 다른 유형의 단백질에서는, 시작 반감기의 절대값 및 따라서 필수적인 타겟값은 더 낮지만, 매력적인 타겟 제품 프로파일에 도달하기 위해 요구되는 수행 배수는 유사하고 대략 3x 내지 4x이다. 그렇다면 문제는 거기에 어떻게 도달하는가이다.
첫째로, 더 많은 배경이다. 전달을 위한 생물학적 활성제를 제형화하려는 노력은 투여 경로, 활성제의 생물학적 안정성 및 생리학적으로 양립되는 매질에서의 활성제의 용해도를 포함하는 다양한 변수와 함께 다루어져야 한다. 생물학적 활성제를 제형화하는데 선택이 이루어지며, 선택된 투여 경로는 활성제의 생체이용률에 영향을 미칠 수 있다. 예를 들어, 생물학적 활성 단백질 및 폴리펩티드에 대해 전신 순환으로의 비경구 투여의 선택은 위장관에서 발견되는 단백질분해 환경을 회피한다. 하지만, 생물학적 활성제의 주입과 같은 직접 투여가 가능한 경우에도, 제형은 투여되는 작용제에 대한 면역 반응의 발생 및 작열통 및 자통을 포함하는 임의의 부형제에 대한 반응을 포함하는 다양한 이유로 인해 불만족스러울 수 있다. 활성제가 면역원성이 아니고, 만족스러운 부형제가 이용될 수 있다 하더라도, 생물학적 활성제는 고통스럽고/거나 불편할 수 있는 반복 복용 또는 지속적 주사를 요구할 수 있는 제한된 용해성 및 짧은 생물학적 반감기를 가질 수 있다.
일부 생물학적 활성제에 대해, 작용제를 수용성 중합체에 컨쥬게이션시킴으로써 기능성 작용제의 적합한 제형을 개발하는데 있어서 어느 정도의 성공이 달성되었다. 수용성 중합체에 대한 생물학적 활성제의 컨쥬게이션은 일반적으로 생물학적 활성제, 특히 단백질 및 펩티드의 전달에 대해 다양한 이득을 제공하는 것으로 보인다. 이용되는 수용성 중합체 중에서, 폴리에틸렌 글리콜(PEG)이 생물학적 활성 펩티드를 포함하는 다양한 생물학적 활성제에 가장 광범위하게 컨쥬게이션된다. 면역원성 또는 항원성의 감소, 증가된 반감기, 증가된 용해성, 신장에 의한 감소된 제거 및 감소된 효소적 분해가 PEG 컨쥬게이트를 포함하는 다양한 수용성 중합체 및 기능성 작용제의 컨쥬게이트에 기인되었다. 이러한 속성의 결과로서, 생물학적 활성제의 중합체 컨쥬게이트는 치료 종점을 달성하기 위해 덜 빈번한 투여를 필요로 하며, 더 적은 활성제의 사용을 허용케 할 수 있다. 덜 빈번한 투여는 고통스러울 수 있고, 건강관리 전문가를 방문하는 불편함을 필요로 하는 주입의 전체 횟수를 감소시킨다.
PEG 컨쥬게이션으로 몇몇 성공이 달성되었을지라도, 생물학적 활성제의 "페길화"는 난제로 남아있다. 약물 개발자들은 에리스로포이에틴 및 다양한 인터페론과 같은 효능이 강한 효현 단백질을 넘어서는 진척을 이루었으나, PEG 친수성 중합체의 이득은 상업적으로 성공적인 제품에 필요한 (i) 시험관 내 용해성, 안정성의 증가 및 점도의 감소, 및 (ii) 생체 내 생체이용률, 혈청 및/또는 조직 반감기의 증가 및 면역원성의 감소를 이끌어냄에 불충분하다.
컨쥬게이트 제조에 사용하기 위한 PEG의 분지된 형태는 긴 직쇄형 PEG 중합체 사슬의 사용에 의해 조우되는 어려움 및 제한 중 일부를 완화시키기 위해 도입되었다. 지금까지의 경험은 PEG의 분지된 형태는 동일한 전체 분자량의 선형 직쇄 PEG 중합체 사슬에 대해 수행 이득에서 "곡선-이동(curve-shift)"을 달성한다는 점을 보여준다. 분지형 중합체가 긴 선형의 PEG 중합체로 형성된 컨쥬게이트와 연관된 제한 중 일부를 극복할 수 있는 반면, 분지형 및 선형 PEG 중합체 컨쥬게이트는 모두 컨쥬게이션된 기능성 작용제, 특히 억제제의 사용과 연관된 문제를 적절히 해결하지 못한다. 그러나, 페길화는 친수성 중합체의 타겟 작용제에 대한 컨쥬게이션에서 가장 앞선 기술을 나타낸다. 페길화된 화합물 제품, 이 중 페그인터페론 알파-2a (PEGASYS), 페그필그라스팀(Neulasta), 페그아프타니브(Macugen), 및 세르톨리주마브 페골(Cimzia)은 2009년에 연간 매출액으로 60억$를 초과했었다. (컨쥬게이션에 적합한) 기능화된 PEG는 이후 다중으로 기능화되고 두 개의 컨쥬게이션 반응으로 리신 잔기에 부착되어 2-아암 PEG 시약이 되는, 짧은 선형 중합체의 중합을 포함하는 힘든 공정을 통해 제조되었다. 합성 단계의 수 및 고품질의 요구로 인해, 다중 크로마토그래피 단계가 요구된다. 낮은 다분산성 (<1.2) 선형 PEG 중합체는 20kDa이 경제적으로 실현가능한 한계가 되어 대략 20kDa, 30kDa 또는 40kDa의 크기 한계를 갖는다. 그리고 분지형 시약으로 형성될 때, 최종 시약 크기는 40 kDa (2 x 20 kDa), 60 kDa (2 x 30 kDa), 80 kDa (2 x 40 kDa)이다. 크기가 클수록, 낮은 다분산성으로 제조하기에 비용이 많이 든다. 또한, 크기가 클수록, 중합체 및 연관된 중합체-약물 컨쥬게이트의 용해성, 안정성, 및 점도의 최적성이 작아진다.
요약하자면, PEG 중합체는 에리스로포이에틴 및 인터페론과 같은 저-투여량, 고-효능 효현 분자와 잘 어울린다. 하지만, 이의 상업적 성공에도 불구하고, 페길화된 제품은 부적절한 안정성 및 용해성을 가지고, PEG 시약은 제조하기 비싸고, 가장 중요한 것은 페길화된 제품은 생체 내 및 시험관 내 수행을 개선하는 관점에서 더 여지가 제한된다.
기능성 작용제를 수용성 중합체에 컨쥬게이션하는 인정된 이점 및 치료 목적에 적합한 컨쥬게이트를 형성함에 PEG와 같은 수용성 중합체의 제한을 고려하여, 기능성 작용제와 컨쥬게이트를 형성함에 있어서 부가적인 수용성 중합체가 바람직하다. 수용성 중합체, 특별히 컨쥬게이트 형성에 사용되는 PEG의 많은 이점을 갖고 컨쥬게이트 작용제로서 PEG에 관찰되는 불리한 점에 시달리지 않는 것이 치료 및 진단 작용제를 형성함에 사용하는 것이 바람직할 것이다.
그럼에도 불구하고 페길화는 전체 생체적합성 문제에 대한 해법으로의 길을 지시한다. PEG는 체내에서 무수한 비-특이적 생체 내 제거 메커니즘으로부터 컨쥬게이션된 생물학적 작용제를 보호하는 중합체의 친수성 특성 때문에 효과가 있다. 물의 중요성은 일반적으로 인지되어 있지만, 이 기술에서 특별한 통찰력은 물이 어떻게 결합되는가와 수행 향상에 중대한 회합된 물 구조를 인정하기 위해 더 깊게 파고드는 것이다. PEG는 그의 친수성 성질 때문에 효과가 있지만, 물은 상기 중합체 및 따라서 컨쥬게이션된 작용제에 단단히 결합되지 않는다. 물 분자는 페길화된 화합물 및 이를 둘러싼 대량의 물 사이에 자유 교환 상태에 있어, 제거계(clearance system)가 상기 단백질을 인지하는 것을 가능하게 한다. 해답은 복합체 전체를 비-특이적 상호 작용으로부터 단단히 가릴 수 있도록 물을 상기 중합체 및 따라서 컨쥬게이션된 모이어티에 매우 단단히 "풀로 붙이는(glue)" 방법을 찾는 것이다. 이를 달성하기 위해, 상기 중합체가 양성 및 음성 전하 모두를 유지하여 최종적으로(net) 중성인 본질적 쌍성이온이 되는 것이 필요하다. 어떤 쌍성이온성 중합체는 그들의 구조에 결합된 물 분자를 유지하고 방출하지 않으려 한다.
그러면 더 진보를 하기 위해서는 (i) 물을 더 많이 결합하고 더 선호되는 물리적 성질을 갖고 있어 생체 내 및 시험관 내에서 개선된 기초 생체적합성을 갖는 친수성 모이어티의 다른 예 및 (ii) 생체 내 및 시험관 내 수행의 관련된 핵심 동인(driver)인 훨씬 더 크고, 확장된 형태 중합체(크기 및 구성)의 예를 자세히 살펴 볼 필요성이 있다.
이들 중합체에서 중요한 것은 이들이 물 분자를 결합하는 정도 및 물 결합 상호 작용의 물리적 성질이다. 이러한 성질의 조합은 중합체의 기초적인 생체적합성 및 그러한 중합체가 컨쥬게이션되는 기능성 작용제에 생체적합성을 부여할 수 있는 정도를 유도한다. 이상적인 기술은 비가역적이지 않다면 많은 양의 물을 매우 단단히 결합하는 물 결합 모이어티를 사용하려 하고, 이 물 결합 모이어티를 확장된 형태(즉, 멀티-아암) 구성을 가질 수 있는, 목적하는 다양한 약물 및 포맷을 가리기 위해 충분한 길이 및 유연성의 중합체 백본으로 갖추려고 할 것이고, 약물 모이어티에의 고효율 컨쥬게이션을 위해 기능화될 것이고, 최소의 수의 제조 단계를 가지고 저렴하게 제조될 것이고, 분석적으로 판단하여 매우 높은 품질 및 작용 면에서 판단하여 생체 내(말단 반감기, 면역원성, 생활성) 및 시험관 내(용해성, 안정성, 점도, 생활성)에서 매우 높은 수행을 보일 것이다. 이들 요소의 극대화를 가능케 하는 기술은 생체 내 및 시험관 내 수행의 새로운 수준으로 진출할 것이다.
그러한 기술의 한가지는 물 결합 모이어티로서 다각도 광 산란으로 측정할 때 총 크기 50 kDa 초과의 피크 분자량(Mp)의 중합체 상에, 상당히 분지된 구성 또는 슈도 구성(pseudo architecture)의 가능성을 가지고, 관심있는 바이오의약품(들)에 부위-특이적 컨쥬게이션을 위해 기능화되고, 고품질 및 낮은 다분산성의 잘 특성화된 치료법을 가능하게 하는 기술로 제조되고, 바이오의약품에 컨쥬게이션될 때 또 다른 반감기 확장 기술(예를 들어, PEG 중합체로 컨쥬게이션된)로 개질된 동등한 바이오의약품과 대비해 평균 말단 반감기에서 급격한 증가를 부여하고, 컨쥬게이트에 PEG 또는 기타 기술에서 보여지는 것의 배수인 용해성, 안정성, 점도, 및 특성화능력 파라미터를 부여하는, 포스포릴콜린 유래 2-메타크릴로일옥시에틸 포스포릴콜린 (HEMA-PC) 또는 관련된 쌍성이온을 사용한다.
중합체의 크기가 매우 중요하다. 가용성 중합체-약물 컨쥬게이트의 맥락에서 치료적 목적으로 사용될 때, 선행 기술은 중합체의 크기 및 이의 품질 사이에는 잘 정의되고 기재된 트레이드-오프(trade-off)가 있다고 교시한다. 다분산성 지수(품질에 대한 핵심 대용물)는, 관심있는 의약품에 컨쥬게이션될 때 지속적인 유효성이 요구되는 치료용 단백질의 믿을만한 합성을 상당히 복잡하게 하고, 제조, 규제, 임상, 및 환자의 관점에서 바람직하지 않은 약물 자체에 그러한 이종성을 부여하는 잠재적인 통계적 중합체의 이종성을 말해주므로 특별히 중요하다.
본 발명은 예를 들어 가용성 약물에 화학적 컨쥬게이션을 위해 기능화된 매우 높은 품질 및 매우 낮은 다분산성 지수를 갖는 매우 큰 중합체를 기재한다. 중요한 것은, 중합체는 불활성이 아니고, 표면에 부착을 예정하고 있지 않고 히드로겔과 같이 겔화되지 않는다. 이는 완전히 새롭고, 놀라운 것이고, 매우 유용하고 이전에 기재되지 않은 것이다. 이들의 치료적 의도를 위해, 잘 정의된 약물 물질이 필수적이다. 이는 그 자체로 중합체, 의약, 및 컨쥬게이트의 수준에서 드러난다. 특히, 많은 접근법 및 비기능화된 중합체를 갖는 요소를 사용하여 만들어온 중합체에 대한 연구 결과물(body of work)가 있다. 그 연구 결과물은 요구되는 단계가 특정 컨쥬게이션인 본원에서는 직접적인 관련이 없다.
기능화된 중합체와 관련된 기술의 현재 상태는, 종래의 슈도 또는 조절된 라디칼 중합에 의해 친수성 단량체로부터 제작되었고, 오직 저분자량 중합체 (전형적으로 <50 kDa)가 기재되어 왔다. 게다가, 이 분자량에 근접할수록, 다분산성 지수(PDI)에 의해 입증된 바와 같이, 분자량의 조절은 길을 잃었다.
예를 들어, Ishihara 등(2004, Biomaterials 25, 71-76)은 2-메타크릴로일옥시에틸 포스포릴콜린(HEMA-PC)의 선형 중합체를 37 kDa의 분자량까지 제작하기 위해 조절된 라디칼 중합을 활용하였다. PDI는 1.35였고, 이는 약학적으로 관련되기에는 너무 높은 것이다. 게다가, 이들 저자는 "이 방법에서, 분자량 분산을 조절하고 분자량을 증가시키는 것은 어렵다"라고 분명히 언급하였다. Lewis 등(US 특허 2004/0063881)은 또한 조절된 라디칼 중합을 이용하여 이 단량체의 동종 중합을 기재하고, 1.45의 PDI를 가진 11 kDa까지 분자량을 보고하였다. 이후의 간행물에서, Lewis 등(2008, Bioconjugate Chem. 19, 2144-2155)은 이번에는 HEMA-PC의 기능화된 동종중합체를 분자량 37 kDa까지 다시 합성하였다. PDI는 2.01이었다. 그들은 오직 급격히 증가된 다분산성을 가진 매우 한정된(불충분한) 분자량에서만 양호한 조절을 달성했다고 언급하였다. 그들은 최고점의 분자량 범위(37 kDa)에서 조절의 상실을 보고하면서, 이러한 다분산성의 엄격한 조절을 가진 종류의 고분자량 중합체의 생성은 가능하지 않다는 결론에 이르게 한 것은 더 높은 단량체 농도에서 빠른 전환 때문이라 하였다.
예를 들어, Haddleton 등(2004, JACS 126, 13220-13221)은 단백질과의 컨쥬게이션에 사용하기 위하여 11,000 내지 34,000 달톤의 크기 범위인 폴리(메톡시PEG)메타크릴레이트의 작은 선형 중합체를 제작하기 위해 조절된 라디칼 중합을 활용하였다. 이들 중합체의 더 큰 것을 만들어 내기 위한 시도에서, 상기 저자들은 반응 온도를 증가시켰고 더 빠른 중합을 유도할 수 있는 촉매를 찾아내려 했다. 이후의 간행물에서, Haddleton 등(2005, JACS 127, 2966-2973)은 4.1 내지 35.4 kDa의 크기 범위에서 이 작고 불충분한 분자량 분포에서 조차 1.25를 초과하는 PDI 범위를 갖는 단백질 컨쥬게이션을 위해 조절된 라디칼 중합을 통해 폴리(메톡시PEG)메타크릴레이트의 기능화된 동종중합체를 다시 합성하였다. 그 다음의 간행물에서, Haddleton 등(2007, JACS 129, 15156-15163)은 1.20 - 1.28의 PDI 범위를 갖는 8 내지 30 kDA의 낮은 크기 범위에서 단백질 컨쥬게이션을 위해 조절된 라디칼 중합을 통해 기능화된 중합체를 다시 합성하였다. Haddleton 등의 사고방식 및 접근법은 본 발명과 관련된 고분자량, 낮은 다분산성 중합체를 만들기 위해 사용될 것이 요구되는 방법에 대해 부정적으로 교시(teach away)하는 것이다. 나아가, 단백질 컨쥬게이션을 위한 저분자량 중합체에 대한 집중은 바이오의약품 분야를 다음 수준으로 데려가기에 필요한 크기, 구성, 및 중합체의 품질에 관한 이해의 결여를 반영한다.
본 발명은 부수적으로 낮은 PDI를 가진 고분자량 쌍성이온-함유 중합체(다각도 광 산란으로 측정할 때 피크 분자량 >50 kDa)를 기재한다. 이는 전술한 기술의 현재 상태의 요약에 비추어 볼 때 놀라운 것이다.
발명의 개요
일부 구현예에서, 본 발명은 각각 독립적으로 아크릴레이트, 메타크릴레이트, 아크릴아미드, 메타크릴아미드, 스티렌, 비닐-피리딘, 비닐-피롤리돈 또는 비닐-에스테르로부터 선택되는 다수의 단량체를 각각 갖는 2 이상의 중합체 아암을 갖는 중합체로서, 각각의 단량체는 친수성 기를 포함하는 중합체를 제공한다. 상기 중합체는 또한 중합체 아암의 근위 말단에 연결된 개시제 단편(여기서 개시제 모이어티는 라디칼 중합에 적합함)을 포함한다. 상기 중합체는 또한 중합체 아암의 원위 말단에 연결된 말단기를 포함한다. 상기 중합체의 개시제 단편 및 말단기 중 하나 이상은 기능성 작용제 또는 연결기를 포함한다.
다른 구현예에서, 본 발명은 각각 독립적으로 아크릴레이트, 메타크릴레이트, 아크릴아미드, 메타크릴아미드, 스티렌, 비닐-피리딘, 비닐-피롤리돈 또는 비닐-에스테르로 이루어진 군으로부터 선택되는 다수의 단량체를 각각 갖는 2 이상의 중합체 아암(각각의 단량체는 친수성 기를 포함함), 중합체 아암의 근위 말단에 연결된 개시제 단편(여기서 개시제 모이어티는 라디칼 중합에 적합함), 및 중합체 아암의 원위 말단에 연결된 말단기를 갖는 하나 이상의 중합체를 포함하는 컨쥬게이트를 제공한다. 본 발명의 컨쥬게이트는 또한 개시제 단편 또는 말단기에 연결된, 생물활성 작용제 또는 진단 작용제를 갖는 하나 이상의 기능성 작용제를 포함한다.
일부 다른 구현예에서, 본 발명은 하기 화학식의 중합체를 제공한다:
Figure pct00001
상기 식에서, R1 은 H, L3-A1, LG1 또는 L3-LG1일 수 있다. 각각의 M1 및 M2는 독립적으로 아크릴레이트, 메타크릴레이트, 아크릴아미드, 메타크릴아미드, 스티렌, 비닐-피리딘, 비닐-피롤리돈 또는 비닐-에스테르로부터 선택될 수 있다. G1 및 G2의 각각은 각각 독립적으로 친수성 기이다. 각각의 기 I는 개시제 단편이고 I'는 라디칼 스캐빈저로, I-I'의 조합은 라디칼 중합을 통해 중합체의 중합을 위해 개시제 I1 이다. 대안적으로, 각각의 I'은 독립적으로 H, 할로겐 또는 C1 -6 알킬로부터 선택될 수 있다. 각각의 L1, L2 및 L3는 링커일 수 있다. 각각의 A1은 기능성 작용제일 수 있다. 각각의 LG1은 연결기일 수 있다. 하첨자 x 및 y1은 각각 독립적으로 1 내지 1000의 정수일 수 있다. 각각의 하첨자 z는 독립적으로 1 내지 10의 정수일 수 있다. 하첨자 s는 1 내지 100의 정수일 수 있다.
발명의 상세한 설명
I. 총론
본 발명은 친수성 기 또는 포스포릴콜린과 같은 쌍성이온, 및 하나 이상의 기능성 작용제(본원에 정의됨)를 갖는 고 MW 중합체를 제공한다. 고도로 생체적합한 분자로서의 포스포릴콜린은 기초적인 생체적합성을 유도한다. 그것은 또한 온도 또는 다른 스트레스 하에서 단백질을 보호하는 면에서 샤프론(chaperone) 유형 기능을 갖는다. 그것은 또한 가역적 세포 흡수와 같은 다른 기능을 가능케 할 수 있다. 기능성 작용제는 검출 작용제, 영상화 작용제, 표지 작용제 또는 진단 작용제 뿐만 아니라 약물, 치료 단백질 또는 타겟화 작용제와 같은 생물활성 작용제일 수 있다. 고 MW 중합체는 하나 이상의 적절한 기능성 작용제를 선택함으로써 다양한 상태 및 질병 상태의 치료에 유용하다. 하나 초과의 생물활성 작용제가 고 MW 중합체에 연결될 수 있고, 이에 따라 단지 단일 질병 증상 또는 메커니즘이 아니라 전체 질병의 치료를 가능하게 한다. 게다가, 고 MW 중합체는 적합한 타겟화 작용제 및 영상화 작용제의 부착에 의해 진단 및 영상화 목적에 유용하다. 고 MW 중합체는 단일 중합체 중에 치료 및 진단 작용제 양자 모두를 포함할 수 있어, 질병을 치료할 뿐만 아니라 검출하고 진단하는 치료진단(theranostic) 작용제를 제공한다. 상기 중합체는 안정한 또는 불안정한 연결을 통해 생물활성 작용제(들)에 연결될 수 있다.
상기 중합체는 포스포릴콜린과 같은 쌍성이온을 함유하는 단량체를 이용하여, 원자 이동 라디칼 중합(ATRP)과 같은, 통상적인 자유-라디칼 중합 또는 조절/리빙(living) 라디칼 중합을 통해 제조될 수 있다. 고 MW 중합체의 제조에 사용되는 개시제는 다중 개시 부위를 가질 수 있어, 스타(star)와 같은 멀티-아암 중합체가 제조될 수 있다. 개시제는 또한 생물활성 작용제, 또는 생물활성 작용제에 연결할 수 있는 연결기 중 하나를 함유할 수 있다.
본 발명은 또한 생물활성 표면상에 분지형 중합체 구성을 달성할 수 있는 새로운 방식을 기재한다. 그 개념은 타겟 분자 상 국소 부위(들)에 부착된 ≥1 아암 중합체를 갖는 효과적인 ≥2 아암 중합체를 재형성하기 위한 타겟 분자 상 "분지 지점(branching point)" 또는 "근위 부착 지점(proximal attachment point)" 중 하나이다. 선행 기술에서, 비 부위-특이적 시약(예를 들어 NHS 기능화 PEG 시약)으로 단백질의 무분별한 페길화는 단백질 전체에 흩어져 있는 다중 아민기에 컨쥬게이션된 다중 PEG 중합체를 초래할 것이다. 여기서, 기재된 것은 바람직하게는 타겟 작용제가 개질되어 두 개의 고유 컨쥬게이션 부위(예를 들어, 시스테인 아미노산)를 찾아내는 한 단계 접근법으로, 일단 단백질 또는 펩티드 또는 작용제의 3차 구조가 형성되면 상기 두 개의 부위가 서로 근접해 있을 것이다. 그러면, 이 개질된 타겟 작용제는 대응하는 컨쥬게이션 화학적 성질(예를 들어, 티올 반응성)을 함유하는 중합체와 함께 컨쥬게이션 반응에서 사용된다. 결과는 서로 근접한 두 개의 중합체와 컨쥬게이션된 단일 타겟 작용제이고, 그렇게 함으로써 분지 지점 또는 "슈도" 분지를 형성한다. 또 다른 구현예에서, 타겟 작용제는 단일 고유 부위, 예를 들어 유리(free) 시스테인을 함유하게 되고, 트리(헤테로)기능성 연결 작용제는 ≥2 선형 중합체를 이 단일 부위에 부착하는데 이용되게 되어, 다시 "슈도" 분지를 형성한다.
본 발명은 또한 인테인을 거쳐 매우 높은 효율 및 부위 특이적으로 펩티드 및 단백질에의 컨쥬게이션을 달성하기 위한 새로운 방식을 기재한다.
II . 정의
"중합체"는 함께 연결된 일련의 단량체 군을 의미한다. 고 MW 중합체는 아크릴레이트, 메타크릴레이트, 아크릴아미드, 메타크릴아미드, 스티렌, 비닐-피리딘, 비닐-피롤리돈, 및 비닐 아세테이트와 같은 비닐 에스테르를 포함하나, 이에 제한되지는 않는 단량체로부터 제조된다. 추가 단량체가 본 발명의 고 MW 중합체에서 유용하다. 두 개의 상이한 단량체가 사용될 때, 두 개의 단량체는 "공단량체"라 부르며, 이는 상이한 단량체가 공중합되어 단일 중합체를 형성하는 것을 의미한다. 중합체는 선형 또는 분지형일 수 있다. 중합체가 분지형일 때, 각각의 중합체 사슬은 "중합체 아암"으로 언급된다. 개시제 모이어티에 연결된 중합체 아암의 말단은 근위 말단(proximal end)이고, 중합체 아암의 성장하는-사슬 말단은 원위 말단(distal end)이다. 중합체 아암의 성장하는 사슬-말단에서, 중합체 아암 말단기는 라디칼 스캐빈저, 또는 또 다른 기일 수 있다.
"친수성 기"는 물을 끄는 화합물 또는 중합체를 의미하고, 통상적으로 수용성이다. 친수성 기의 예는 친수성 중합체 및 쌍성이온 모이어티를 포함한다. 다른 친수성 기는 히드록시, 아민, 카르복실산, 아미드, 술포네이트 및 포스포네이트를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 친수성 중합체는 폴리에틸렌 옥시드, 폴리옥사졸린, 셀룰로오스, 전분 및 기타 다당류를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 쌍성이온 모이어티는 양성 및 음성 전하 둘 모두를 갖는 화합물을 의미한다. 고 MW 중합체에서 유용한 쌍성이온 모이어티는 4차 질소 및 포스포릴콜린: RO-P(=O)(O-)O-CH2CH2-N+(Me)3와 같은 음성으로 하전된 포스페이트를 포함할 수 있다. 다른 쌍성이온 모이어티가 본 발명의 고 MW 중합체에 유용하고, 특허 WO 1994/016748호 및 WO 1994/016749호는 이의 전체 내용이 본원에 포함된다.
"개시제"는 본 발명의 공단량체를 이용한 중합을 개시시킬 수 있는 화합물을 의미한다. 중합은 원자 전달 라디칼 중합(ATRP), 가역적 첨가-단편화-종결(RAFT) 중합 또는 니트록시드 매개 중합(NMP)과 같은 통상적인 자유 라디칼 중합 또는 조절/리빙 라디칼 중합일 수 있다. 중합은 변성 전달(degenerative transfer)과 같은 "슈도" 조절 중합일 수 있다. 개시제가 ATRP에 대해 적합할 때, 그것은 균일하게 분해되어 라디칼 중합을 개시시킬 수 있는 라디칼인 개시제 단편 I, 및 성장하는 중합체 사슬의 라디칼과 반응하여 중합을 가역적으로 종결시키는 라디칼 스캐빈저 I'을 형성시킬 수 있는 불안정한 결합을 함유한다. 라디칼 스캐빈저 I'은 통상적으로 할로겐이지만, 또한 니트릴과 같은 유기 모이어티일 수 있다.
"링커"는 두 개의 기를 함께 연결하는 화학 모이어티를 의미한다. 링커는 분해성 또는 비-분해성일 수 있다. 분해성 링커는 그 중에서도 가수분해성, 효소적 분해성, pH 민감성, 광불안정성, 또는 디설피드 링커일 수 있다. 다른 링커는 동종이기능성 및 이종이기능성 링커를 포함한다. "연결기"는 생물활성 작용제에의 하나 이상의 결합으로 이루어지는 공유 연결을 형성할 수 있는 작용기이다. 비제한적인 예는 표 1에 예시된 것을 포함한다.
"가수분해성 링커"는 생리학적 조건 하에서 가수분해를 겪는 공유 결합과 같은 화학적 연결 또는 결합을 의미한다. 결합이 가수분해되는 경향은 결합이 엄격한 곳 사이의 두 개의 중심 원자를 연결하는 연결의 일반적 유형 뿐만 아니라, 이 중심 원자들에 부착되는 치환기에 의존될 수 있다. 가수분해적으로 민감한 연결의 비제한적인 예는 카르복실산의 에스테르, 포스페이트 에스테르, 아세탈, 케탈, 아실옥시알킬 에테르, 이민, 오르토에스테르, 및 일부 아미드 연결을 포함한다.
"효소적 분해성 링커"는 하나 이상의 효소에 의한 분해의 대상이 되는 연결을 의미한다. 일부 효소적으로 민감한 연결이 또한 효소적으로 분해될 수 있다. 예를 들어, 에스테라아제는 카르복실산의 에스테르 또는 포스페이트 에스테르에서 작용할 수 있고, 프로테아제는 펩티드 결합 및 일부 아미드 연결에서 작용할 수 있다.
"pH 민감성 링커"는 하나의 pH에서 안정적이고, 또 다른 pH에서 분해되기 쉬운 연결을 의미한다. 예를 들어, pH 민감성 링커는 중성 또는 염기성 조건에서는 안정할 수 있으나, 약산성 조건에서는 불안정할 수 있다.
"광불안정성 링커"는 빛에 대한 노출 후에 분해되는 공유 결합과 같은 연결을 의미한다. 광불안정성 링커는 유입되는 빛을 흡수한 후, 광불안정성 링커에 의해 연결된 두 개의 기를 분해시키기 위해 결합의 재배열을 유발하는 방향족 모이어티를 포함한다.
"자가-희생 또는 이중 프로드러그 링커"는, 링커의 주요 기능이 선택적 트리거 활성화(예를 들어, pH의 강하 또는 조직-특이적 효소의 존재) 후에 기능성 작용제를 방출하는 자발적 화학 분해 후에만 기능성 작용제를 방출하는 것인 연결을 의미한다.
"기능성 작용제"는 생물활성 작용제 또는 진단 작용제를 포함하는 것으로 정의된다. "생물활성 작용제"는 특정 생물학적 위치를 타겟으로 하고/하거나(타겟화 작용제), 생체 내 또는 시험관 내에서 입증될 수 있는 일부 국소적 또는 전신적 생리학적 또는 약리학적 효과를 제공하는 임의의 작용제, 약물, 화합물, 또는 이의 혼합물을 포함하는 것으로 정의된다. 비제한적 예는 약물, 백신, 항체, 항체 단편, scFvs, 디아바디, 아비머, 비타민 및 보조인자, 다당류, 탄수화물, 스테로이드, 지질, 지방, 단백질, 펩티드, 폴리펩티드, 뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드, 및 핵산(예를 들어, mRNA, tRNA, snRNA, RNAi, DNA, cDNA, 안티센스 구조물, 리보자임 등)을 포함한다. "진단 작용제"는 조직 또는 질병의 검출 또는 영상화를 가능하게 하는 임의의 작용제를 포함하는 것으로 정의된다. 진단 작용제의 예는 방사성표지, 형광단 및 염료를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
"치료 단백질"은 약물을 전체적 또는 부분적으로 구성하는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 또는 단백질을 의미하고, 이는 인간 또는 동물의 약학적 적용에 사용될 수 있다. 본원에 개시된 것을 포함하나, 이에 제한되지는 않는 수 많은 치료 단백질이 당업계의 실무가(practitioner)에게 공지되어 있다.
"PC"로도 표시되는 "포스포릴콜린"은 하기를 의미한다:
Figure pct00002
상기 식에서, *는 부착 지점을 표시한다. 포스포릴콜린은 쌍성이온 기이고, 염(예를 들어, 내부 염), 및 이의 양성자화된(protonated) 형태 및 탈양성자화된(deprotonated) 형태를 포함한다.
"포스포릴콜린 함유 중합체"는 포스포릴콜린을 함유하는 중합체이다. 각각의 예에서, 포스포릴콜린 함유 중합체가 특정 용도에 대해 본 출원에서 상술되는 경우, 그러한 용도에서 단일 포스포릴콜린이 또한 이용될 수 있는 것이 분명히 고려된다. "쌍성이온 함유 중합체"는 쌍성이온을 함유하는 중합체를 의미한다.
"폴리(아크릴로일옥시에틸 포스포릴콜린) 함유 중합체"는 2-메타크릴로일옥시에틸 포스포릴콜린(즉, 2-메타크릴로일-2'-트리메틸암모늄 에틸 포스페이트)과 같은, 하나 이상의 아크릴로일옥시에틸 포스포릴콜린 단량체를 함유하는 아크릴산의 중합체를 의미한다.
"접촉시키는"은 2 이상의 별개의 종을 접촉시켜 이들이 반응하도록 이끄는 과정을 의미한다. 하지만, 생성되는 반응 생성물은 첨가된 시약 사이의 반응으로부터 직접 제조되거나, 반응 혼합물에서 제조될 수 있는 첨가된 시약 중 하나 이상으로부터의 중간체로부터 제조될 수 있는 것으로 이해되어야 한다.
"수용성 중합체"는 물에서 가용성인 중합체를 의미한다. 수용성 중합체의 용액은 여과 후의 동일 용액에 의해 투과되는 빛의 약 75% 이상, 더욱 바람직하게는 약 95% 이상을 투과시킬 수 있다. 중량을 기준으로, 수용성 중합체 또는 이의 분획은 물 중에서 약 35% 이상, 약 50% 이상, 약 70%, 약 85%, 약 95% 또는 100%(건조 중합체의 중량을 기준으로 함) 존재할 수 있다.
중합체의 맥락에서 "분자량"은 수평균 분자량, 또는 중량 평균 분자량 또는 피크 분자량으로 표현될 수 있다. 달리 나타내지 않는 한, 본원의 분자량에 대한 모든 언급은 피크 분자량을 의미한다. 이러한 분자량 결정, 수 평균, 중량 평균 및 피크는 겔 투과 크로마토그래피 또는 다른 액체 크로마토그래피 기술을 이용하여 측정될 수 있다. 수평균 분자량을 결정하기 위한 말단-기 분석의 이용 또는 총괄성 특성(예를 들어, 빙점 저하, 비등점 상승, 또는 삼투압)의 측정, 또는 중량 평균 분자량을 결정하기 위한 광산란 기술, 초원심분리 또는 점도측정의 이용과 같은 분자량 값을 측정하는 다른 방법이 또한 이용될 수 있다. 본 발명의 중합 시약은 통상적으로 다분산성(즉, 중합체의 수평균 분자량 및 중량 평균 분자량이 동등하지 않음)이며, 겔 투과 크로마토그래피에 의한 판단시 바람직하게는 약 1.5 미만의 낮은 다분산성 값을 갖는다. 다른 구체예에서, 다분산성은 약 1.4 내지 약 1.2, 더욱 바람직하게는 약 1.15 미만, 더욱 더 바람직하게는 약 1.10 미만, 더욱 더 바람직하게는 약 1.05 미만, 가장 바람직하게는 약 1.03 미만의 범위일 수 있다.
본원에서 사용되는 단수 형태 구의 개체는 이러한 개체 하나 이상을 의미하며, 예를 들어, 화합물은 하나 이상의 화합물 또는 적어도 하나의 화합물을 의미한다. 이와 같이, 단수 형태의 용어, 및 "하나 이상" 및 "적어도 하나"는 본원에서 상호교환적으로 사용될 수 있다.
본원에서 사용되는 "약"은 상이한 기구, 샘플, 및 샘플 제제에서 취해진 측정에서 알 수 있는 편차를 의미한다.
"보호된", "보호된 형태", "보호하는 기" 및 "보호기"는 특정 반응 조건 하에서 분자 내의 특별한 화학적 반응성 작용기의 반응을 예방하거나 차단하는 기(즉, 보호하는 기)의 존재를 의미한다. 보호기는 이용되는 반응 조건 및 존재시 분자 내에 추가 반응성 기 또는 보호기의 존재뿐만 아니라 보호되는 화학적 반응기의 종류에 따라 다양할 것이다. 당업자는 Greene 등의 논문, "Protective Groups In Organic Synthesis," 3rd Edition, John Wiley and Sons, Inc., New York, 1999에서 발견되는 것과 같은 기술 분야에서 공지된 보호기를 인지할 것이다.
"스페이서" 및 "스페이서 기"는 본원에서 상호교환적으로 사용되고, 이는 수용성 중합체의 말단 및 기능성 작용제의 반응기 및 반응기와 같은 상호연결 모이어티를 연결하는데 임의로 사용되는 원자 또는 원자의 집합체를 의미한다. 스페이서는 가수분해적으로 안정적일 수 있거나, 가수분해적으로 민감하거나 효소적으로 분해성인 연결을 포함할 수 있다.
"알킬"은 지정된 탄소 원자 수를 갖는 선형 또는 분지형, 포화, 지방족 라디칼을 의미한다. 예를 들어, C1-C6 알킬은 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 이소부틸, sec-부틸, tert-부틸, 펜틸, 이소펜틸, 헥실 등을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 다른 알킬기는 헵틸, 옥틸, 노닐, 데실 등을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 알킬은 1-2, 1-3, 1-4, 1-5, 1-6, 1-7, 1-8, 1-9, 1-10, 2-3, 2-4, 2-5, 2-6, 3-4, 3-5, 3-6, 4-5, 4-6 및 5-6과 같은 임의의 수의 탄소를 포함할 수 있다. 알킬기는 통상적으로 1가이나, 알킬기가 2개의 모이어티를 함께 연결시키는 때와 같이 2가일 수 있다.
유기 라디칼 또는 화합물과 관련하여 상기 및 하기에서 언급되는 용어 "저급"은 각각 7개 이하, 바람직하게는 4개 이하 및 (분지되지 않은 경우) 1개 또는 2개의 탄소 원자를 갖는 분지되거나 분지되지 않을 수 있는 화합물 또는 라디칼을 정의한다.
"알킬렌"은 2 이상의 다른 기를 연결시키는 상기 정의된 바와 같은 알킬기, 즉, 2가 탄화수소 라디칼을 의미한다. 알킬렌에 연결된 두 개의 모이어티는 알킬렌의 동일한 원자 또는 상이한 원자에 연결될 수 있다. 예를 들어, 직쇄형 사슬 알킬렌은 -(CH2)n의 2가 라디칼일 수 있고, 여기서 n은 1, 2, 3, 4, 5 또는 6이다. 알킬렌기는 메틸렌, 에틸렌, 프로필렌, 이소프로필렌, 부틸렌, 이소부틸렌, sec-부틸렌, 펜틸렌 및 헥실렌을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
알킬 및 헤테로알킬 라디칼(알킬렌, 알케닐, 헤테로알킬렌, 헤테로알케닐, 알키닐, 시클로알킬, 헤테로시클로알킬, 시클로알케닐, 및 헤테로시클로알케닐로 종종 언급되는 기를 포함함)에 대한 치환기는 0 내지 (2m'+1)(여기서, m'은 상기 라디칼 내의 탄소 원자의 전체 수이다) 범위의 수의 -OR' , =O, =NR', =N-OR', -NR'R'', -SR', -할로겐, -SiR'R''R''', -OC(O)R', -C(O)R', -CO2R', -CONR'R'', -OC(O)NR'R'', -NR''C(O)R', -NR'-C(O)NR''R''', -NR''C(O)2R', -NH-C(NH2)=NH, -NR'C(NH2)=NH, -NH-C(NH2)=NR', -S(O)R', -S(O)2R', -S(O)2NR'R'', -CN 및 -NO2로부터 선택된 다양한 기일 수 있다. R', R'' 및 R'''는 각각 독립적으로 수소, 비치환된 (C1-C8)알킬 및 헤테로알킬, 비치환된 아릴, 1-3 개의 할로겐으로 치환된 아릴, 비치환된 알킬, 알콕시 또는 티오알콕시기, 또는 아릴-(C1-C4)알킬기를 의미한다. R' 및 R''가 동일 질소 원자에 부착되는 경우, 이들은 질소 원자와 조합되어 5-, 6-, 또는 7-원 고리를 형성할 수 있다. 예를 들어, -NR'R''은 1-피롤리디닐 및 4-모르폴리닐을 포함하는 것을 의미한다. 상기 치환기의 논의로부터, 당업자는 용어 "알킬"이 할로알킬(예를 들어, -CF3 및 -CH2CF3) 및 아실(예를 들어, -C(O)CH3, -C(O)CF3, -C(O)CH2OCH3 등)과 같은 기를 포함하는 것을 의미하는 것을 이해할 것이다. 바람직하게는, 치환된 알킬 및 헤테로알킬기는 1 내지 4 개의 치환기, 더욱 바람직하게는 1, 2 또는 3 개의 치환기를 갖는다. 본 발명에 의해 고려되고 또한 바람직한 것에서 퍼할로 알킬기(예를 들어, 펜타플루오로에틸 등)는 예외이다.
알킬 및 헤테로알킬 라디칼(알킬렌, 알케닐, 헤테로알킬렌, 헤테로알케닐, 알키닐, 시클로알킬, 헤테로시클로알킬, 시클로알케닐, 및 헤테로시클로알케닐로 종종 언급되는 기를 포함함)에 대한 치환기는 0 내지 (2m'+1)(여기서, m'은 상기 라디칼 내의 탄소 원자의 전체 수) 범위의 수의 -OR', =O, =NR', =N-OR', -NR'R'', -SR', -할로겐, -SiR'R''R''', -OC(O)R', -C(O)R', -CO2R', -CONR'R'', -OC(O)NR'R'', -NR''C(O)R', -NR'-C(O)NR''R''', -NR''C(O)2R', -NR-C(NR'R''R''')=NR'''', -NR-C(NR'R'')=NR''', -S(O)R', -S(O)2R', -S(O)2NR'R'', -NRSO2R', -CN 및 -NO2로부터 선택되나, 이에 제한되지는 않는 다양한 기 중 하나 이상일 수 있다. R', R'', R''' 및 R''''는 각각 바람직하게는 수소, 치환되거나 비치환된 헤테로알킬, 치환되거나 비치환된 아릴, 예를 들어, 1-3 개의 할로겐으로 치환된 아릴, 치환되거나 비치환된 알킬, 알콕시 또는 티오알콕시기, 또는 아릴알킬기를 의미한다. 본 발명의 화합물이 하나 초과의 R기를 포함하는 경우, 예를 들어, R기의 각각은, 상기 기의 하나 초과가 존재하는 경우에 각각 R', R'', R''' 및 R'''' 기인 것과 같이 독립적으로 선택된다. R' 및 R''가 동일 질소 원자에 부착될 때, 이들은 질소 원자와 조합되어 5-, 6-, 또는 7-원 고리를 형성할 수 있다. 예를 들어, -NR'R''은 1-피롤리디닐 및 4-모르폴리닐을 포함하나, 이에 제한되지는 않는 것을 의미한다. 상기 치환기 논의로부터, 당업자는 용어 "알킬"이 수소 기 이외의 기에 결합된 탄소 원자를 포함하는 기, 예를 들어, 할로알킬(예를 들어, -CF3 및 -CH2CF3) 및 아실(예를 들어, -C(O)CH3, -C(O)CF3, -C(O)CH2OCH3 등)을 포함하는 것을 의미하는 것을 이해할 것이다.
"알콕시"는 부착 지점에 알콕시기를 연결시키거나 알콕시기의 2 개의 탄소에 연결되는 산소 원자를 갖는 알킬기를 의미한다. 알콕시기는, 예를 들어, 메톡시, 에톡시, 프로폭시, 이소-프로폭시, 부톡시, 2-부톡시, 이소-부톡시, sec-부톡시, tert-부톡시, 펜톡시, 헥스옥시 등을 포함한다. 알콕시기는 본원에 기재된 다양한 치환기로 추가 치환될 수 있다. 예를 들어, 알콕시기는 할로겐으로 치환되어 "할로-알콕시" 기를 형성할 수 있다.
"카르복시알킬"은 카르복시기로 치환된 알킬기(본원에 정의됨)를 의미한다. 용어 "카르복시시클로알킬"은 카르복시기로 치환된 시클로알킬기(본원에 정의됨)를 의미한다. 용어 알콕시알킬은 알콕시기로 치환된 알킬기(본원에 정의됨)를 의미한다. 본원에서 이용되는 용어 "카르복시"는 카르복실산 및 이의 에스테르를 의미한다.
"할로알킬"은 수소 원자의 일부 또는 전부가 할로겐 원자로 치환된 상기 정의된 알킬을 의미한다. 할로겐(할로)은 바람직하게는 클로로 또는 플루오로를 나타내나, 또한 브로모 또는 아이오도일 수 있다. 예를 들어, 할로알킬은 트리플루오로메틸, 플루오로메틸, 1,2,3,4,5-펜타플루오로-페닐 등을 포함한다. 용어 "퍼플루오로"는 불소로 대체된 모든 이용가능한 수소를 갖는 화합물 또는 라디칼을 정의한다. 예를 들어, 퍼플루오로페닐은 1,2,3,4,5-펜타플루오로페닐을 의미하고, 퍼플루오로메틸은 1,1,1-트리플루오로메틸을 의미하고, 퍼플루오로메톡시는 1,1,1-트리플루오로메톡시를 의미한다.
"플루오로-치환된 알킬"은 하나, 일부 또는 전부의 수소 원자가 불소로 대체된 알킬기를 의미한다.
본 발명의 맥락에서 "사이토카인"은 면역 및 염증 반응에서 세포-세포 통신에 참여할 수 있는 단백질 신호전달 분자 군의 일원이다. 사이토카인은 통상적으로 약 8-35 kDa의 질량을 갖는 작은 수용성 당단백질이다.
"시클로알킬"은 약 3 내지 12, 3 내지 10, 또는 3 내지 7 개의 엔도시클릭 탄소 원자를 함유하는 시클릭 탄화수소기를 의미한다. 시클로알킬기는 융합된, 브릿지된 및 스피로 고리 구조를 포함한다.
"엔도시클릭"은 시클릭 고리 구조의 일부를 포함하는 원자 또는 원자의 기를 의미한다.
"엑소시클릭"은 시클릭 고리 구조에 부착되나, 시클릭 고리 구조를 정의하지 않는 원자 또는 원자의 군을 의미한다.
"시클릭 알킬 에테르"는 3 또는 4 개의 엔도시클릭 탄소 원자 및 1 개의 엔도시클릭 산소 또는 황 원자를 갖는 4 또는 5원 시클릭 알킬기(예를 들어, 옥세탄, 티에탄, 테트라히드로푸란, 테트라히드로티오펜); 또는 1 또는 2 개의 엔도시클릭 산소 또는 황 원자를 갖는 6 내지 7원 시클릭 알킬기(예를 들어, 테트라히드로피란, 1,3-디옥산, 1,4-디옥산, 테트라히드로티오피란, 1,3-디티안, 1,4-디티안, 1,4-옥사티안)를 의미한다.
"알케닐"은 하나 이상의 이중 결합을 갖는 2 내지 6 개의 탄소 원자의 직쇄형 사슬 또는 분지형 탄화수소를 의미한다. 알케닐기의 예는 비닐, 프로페닐, 이소프로페닐, 1-부테닐, 2-부테닐, 이소부테닐, 부타디에닐, 1-펜테닐, 2-펜테닐, 이소펜테닐, 1,3-펜타디에닐, 1,4-펜타디에틸, 1-헥세닐, 2-헥세닐, 3-헥세닐, 1,3-헥사디에닐, 1,4-헥사디에닐, 1,5-헥사디에닐, 2,4-헥사디에닐, 또는 1,3,5-헥사트리에닐을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 알케닐기는 또한 2 내지 3, 2 내지 4, 2 내지 5, 3 내지 4, 3 내지 5, 3 내지 6, 4 내지 5, 4 내지 6 및 5 내지 6 개의 탄소를 가질 수 있다. 알케닐기는 통상적으로 1가이나, 알케닐기가 2 개의 모이어티를 함께 연결시키는 때와 같이 2가일 수 있다.
"알케닐렌"은 2 이상의 다른 기를 연결시키는 상기 정의된 알케닐기, 즉, 2가 탄화수소 라디칼을 의미한다. 알케닐렌에 연결된 2 개의 모이어티는 알케닐렌의 동일한 원자 또는 상이한 원자에 연결될 수 있다. 알케닐렌기는 에테닐렌, 프로페닐렌, 이소프로페닐렌, 부테닐렌, 이소부테닐렌, sec-부테닐렌, 펜테닐렌 및 헥세닐렌을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
"알키닐"은 하나 이상의 삼중 결합을 갖는 2 내지 6 개의 탄소 원자의 직쇄형 사슬 또는 분지형 탄화수소를 의미한다. 알키닐기의 예는 아세틸레닐, 프로피닐, 1-부티닐, 2-부티닐, 이소부티닐, sec-부티닐, 부타디이닐, 1-펜티닐, 2-펜티닐, 이소펜티닐, 1,3-펜타디이닐, 1,4-펜타디이닐, 1-헥시닐, 2-헥시닐, 3-헥시닐, 1,3-헥사디이닐, 1,4-헥사디이닐, 1,5-헥사디이닐, 2,4-헥사디이닐, 또는 1,3,5-헥사트리이닐을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 알키닐기는 또한 2 내지 3, 2 내지 4, 2 내지 5, 3 내지 4, 3 내지 5, 3 내지 6, 4 내지 5, 4 내지 6 및 5 내지 6 개의 탄소를 가질 수 있다. 알키닐기는 통상적으로 1가이나, 알키닐기가 2 개의 모이어티를 함께 연결시키는 때와 같이 2가일 수 있다.
"알키닐렌"은 2 이상의 다른 기를 연결시키는 상기 정의된 알키닐기, 즉, 2가 탄화수소 라디칼을 의미한다. 알키닐렌에 연결된 2 개의 모이어티는 알키닐렌의 동일한 원자 또는 상이한 원자에 연결될 수 있다. 알키닐렌기는 에티닐렌, 프로피닐렌, 부티닐렌, sec-부티닐렌, 펜티닐렌 및 헥시닐렌을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
"시클로알킬"은 3 내지 12 개의 고리 원자 또는 지정된 원자 수를 함유하는 포화되거나 부분적으로 불포화된, 모노시클릭, 융합된 바이시클릭 또는 브릿지된 폴리시클릭 고리 집합체를 의미한다. 모노시클릭 고리는, 예를 들어, 시클로프로필, 시클로부틸, 시클로펜틸, 시클로헥실, 및 시클로옥틸을 포함한다. 바이시클릭 및 폴리시클릭 고리는, 예를 들어, 노르보르난, 데카히드로나프탈렌 및 아다만탄을 포함한다. 예를 들어, C3 -8 시클로알킬은 시클로프로필, 시클로부틸, 시클로펜틸, 시클로헥실, 시클로옥틸, 및 노르보르난을 포함한다.
"시클로알킬렌"은 2 이상의 다른 기를 연결시키는 상기 정의된 시클로알킬기, 즉, 2가 탄화수소 라디칼을 의미한다. 시클로알킬렌에 연결된 2 개의 모이어티는 시클로알킬렌의 동일한 원자 또는 상이한 원자에 연결될 수 있다. 시클로알킬렌기는 시클로프로필렌, 시클로부틸렌, 시클로펜틸렌, 시클로헥실렌, 및 시클로옥틸렌을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
"헤테로시클로알킬"은 3 내지 약 20 개의 고리 원, 및 1 내지 약 5 개의 N, O 및 S와 같은 헤테로원자를 갖는 고리계를 의미한다. B, Al, Si 및 P를 포함하나, 이에 제한되지는 않는 추가 헤테로원자가 또한 유용할 수 있다. 헤테로원자는 또한, 비제한적인 예로, -S(O)- 및 -S(O)2-와 같이 산화될 수 있다. 예를 들어, 헤테로사이클은 테트라히드로푸라닐, 테트라히드로티오페닐, 모르폴리노, 피롤리디닐, 피롤리닐, 이미다졸리디닐, 이미다졸리닐, 피라졸리디닐, 피라졸리닐, 피페라지닐, 피페리디닐, 인돌리닐, 퀴누클리디닐 및 1,4-디옥사-8-아자-스피로[4.5]데-8-실을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
"헤테로시클로알킬렌"은 2 이상의 다른 기를 연결시키는 상기 정의된 헤테로시클알킬기를 의미한다. 헤테로시클로알킬렌에 연결된 2 개의 모이어티는 헤테로시클로알킬렌의 동일한 원자 또는 상이한 원자에 연결될 수 있다.
"아릴"은 6 내지 16 개의 고리 탄소 원자를 함유하는 모노시클릭 또는 융합된 바이시클릭, 트리시클릭 또는 그 이상의 방향족 고리 어셈블리를 의미한다. 예를 들어, 아릴은 페닐, 벤질 또는 나프틸, 바람직하게는 페닐일 수 있다. "아릴렌"은 아릴기로부터 유래된 2가 라디칼을 의미한다. 아릴기는 알킬, 알콕시, 아릴, 히드록시, 할로겐, 시아노, 아미노, 아미노-알킬, 트리플루오로메틸, 알킬렌디옥시 및 옥시-C2-C3-알킬렌으로부터 선택된 1, 2 또는 3 개의 라디칼에 의해 일치환, 이치환 또는 삼치환될 수 있거나; 이들 모두는 임의로, 예를 들어, 상기 정의된 바와 같이 추가로 치환되거나; 1- 또는 2-나프틸; 또는 1- 또는 2-페난트레닐일 수 있다.
알킬렌디옥시는 페닐의 2 개의 인접한 탄소 원자에 부착된 2가 치환기, 예를 들어, 메틸렌디옥시 또는 에틸렌디옥시이다. 옥시-C2-C3-알킬렌은 또한 페닐의 2 개의 인접한 탄소 원자에 부착된 2가 치환기, 예를 들어, 옥시에틸렌 또는 옥시프로필렌이다. 옥시-C2-C3-알킬렌-페닐에 대한 예는 2,3-디히드로벤조푸란-5-일이다.
아릴로서 바람직한 것은 나프틸, 페닐 또는 알콕시, 페닐, 할로겐, 알킬 또는 트리플루오로메틸에 의해 일치환되거나 이치환된 페닐, 특히 페닐 또는 알콕시, 할로겐 또는 트리플루오로메틸에 의해 일치환되거나 이치환된 페닐, 특히 페닐이다.
R로서 치환된 페닐기의 예는, 예를 들어, 헤테로시클릭 고리 내에서 임의로 치환된 4-클로로펜-1-일, 3,4-디클로로펜-1-일, 4-메톡시펜-1-일, 4-메틸펜-1-일, 4-아미노메틸펜-1-일, 4-메톡시에틸아미노메틸펜-1-일, 4-히드록시에틸아미노메틸펜-1-일, 4-히드록시에틸-(메틸)-아미노메틸펜-1-일, 3-아미노메틸펜-1-일, 4-N-아세틸아미노메틸펜-1-일, 4-아미노펜-1-일, 3-아미노펜-1-일, 2-아미노펜-1-일, 4-페닐-펜-1-일, 4-(이미다졸-1-일)-펜-일, 4-(이미다졸-1-일메틸)-펜-1-일, 4-(모르폴린-1-일)-펜-1-일, 4-(모르폴린-1-일메틸)-펜-1-일, 4-(2-메톡시에틸아미노메틸)-펜-1-일 및 4-(피롤리딘-1-일메틸)-펜-1-일, 4-(티오페닐)-펜-1-일, 4-(3-티오페닐)-펜-1-일, 4-(4-메틸피페라진-1-일)-펜-1-일, 및 4-(피페리디닐)-페닐 및 4-(피리디닐)-페닐이다.
"아릴렌"은 2 이상의 다른 기를 연결하는 상기 정의된 아릴기를 의미한다. 아릴렌에 연결된 2 개의 모이어티는 아릴렌의 상이한 원자에 연결된다. 아릴렌기는 페닐렌을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
"아릴렌-옥시"는 아릴렌에 연결된 모이어티 중 하나가 산소 원자를 통해 연결된 상기 정의된 아릴렌기를 의미한다. 아릴렌-옥시기는 페닐렌-옥시를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
유사하게, 아릴 및 헤테로아릴기에 대한 치환기는 다양하며, 이는 방향족 고리계에서 0 내지 개방 원자가의 전체 수 범위의 수의 -할로겐, -OR', -OC(O)R', -NR'R'', -SR', -R', -CN, -NO2, -CO2R', -CONR'R'', -C(O)R', -OC(O)NR'R'', -NR''C(O)R', -NR''C(O)2R' ,-NR'-C(O)NR''R''', -NH-C(NH2)=NH, -NR'C(NH2)=NH, -NH-C(NH2)=NR', -S(O)R', -S(O)2R', -S(O)2NR'R'', -N3, -CH(Ph)2, 퍼플루오로(C1-C4)알콕시, 및 퍼플루오로(C1-C4)알킬로부터 선택되고; 여기서 R', R'' 및 R'''는 독립적으로 수소, (C1-C8)알킬 및 헤테로알킬, 비치환된 아릴 및 헤테로아릴, (비치환된 아릴)-(C1-C4)알킬, 및 (비치환된 아릴)옥시-(C1-C4)알킬로부터 선택된다.
아릴 또는 헤테로아릴 고리의 인접한 원자 상의 치환기 중 두 개는 화학식 -T-C(O)-(CH2)q-U-의 치환기로 임의로 대체될 수 있고, 상기 식에서, T 및 U는 독립적으로 -NH-, -O-, -CH2- 또는 단일 결합이고, q는 0 내지 2의 정수이다. 대안적으로, 아릴 또는 헤테로아릴 고리의 인접한 원자 상의 치환기 중 두 개는 화학식 -A-(CH2)r-B-의 치환기로 임의로 대체될 수 있고, 상기 식에서, A 및 B는 독립적으로 -CH2-, -O-, -NH-, -S-, -S(O)-, -S(O)2-, -S(O)2NR'- 또는 단일 결합이고, r은 1 내지 3의 정수이다. 이렇게 하여 형성된 새로운 고리의 단일 결합 중 하나는 임의로 이중 결합으로 대체될 수 있다. 대안적으로, 아릴 또는 헤테로아릴 고리의 인접한 원자 상의 치환기 중 두 개는 화학식 -(CH2)s-X-(CH2)t-의 치환기로 임의로 대체될 수 있고, 상기 식에서, s 및 t는 독립적으로 0 내지 3의 정수이고, X는 -O-, -NR'-, -S-, -S(O)-, -S(O)2-, 또는 -S(O)2NR'-이다. -NR'- 및 -S(O)2NR'-에서 치환기 R'은 수소 또는 비치환된 (C1-C6)알킬로부터 선택된다.
"헤테로아릴"은 5 내지 16 개의 고리 원자를 함유하는 모노시클릭 또는 융합된 바이시클릭 또는 트리시클릭 방향족 고리 집합체를 의미하고, 여기서 고리 원자의 1 내지 4 개는 N, O 또는 S와 같은 헤테로원자이다. 예를 들어, 헤테로아릴은 피리딜, 인돌릴, 인다졸릴, 퀴녹살리닐, 퀴놀리닐, 이소퀴놀리닐, 벤조티에닐, 벤조푸라닐, 푸라닐, 피롤릴, 티아졸릴, 벤조티아졸릴, 옥사졸릴, 이속사졸릴, 트리아졸릴, 테트라졸릴, 피라졸릴, 이미다졸릴, 티에닐, 또는, 예를 들어, 알킬, 니트로 또는 할로겐에 의해 치환된, 특히 일치환되거나 이치환된 임의의 다른 라디칼을 포함한다. 피리딜은 2-, 3- 또는 4-피리딜, 유리하게는 2- 또는 3-피리딜이다. 티에닐은 2- 또는 3-티에닐이다. 퀴놀리닐은 바람직하게는 2-, 3- 또는 4-퀴놀리닐을 나타낸다. 이소퀴놀리닐은 바람직하게는 1-, 3- 또는 4-이소퀴놀리닐을 나타낸다. 벤조피라닐, 벤조티오피라닐은 바람직하게는 각각 3-벤조피라닐 또는 3-벤조티오피라닐을 나타낸다. 티아졸릴은 바람직하게는 2- 또는 4-티아졸릴, 가장 바람직하게는 4-티아졸릴을 나타낸다. 트리아졸릴은 바람직하게는 1-, 2- 또는 5-(1,2,4-트리아졸릴)이다. 테트라졸릴은 바람직하게는 5-테트라졸릴이다.
바람직하게는, 헤테로아릴은 피리딜, 인돌릴, 퀴놀리닐, 피롤릴, 티아졸릴, 이속사졸릴, 트리아졸릴, 테트라졸릴, 피라졸릴, 이미다졸릴, 티에닐, 푸라닐, 벤조티아졸릴, 벤조푸라닐, 이소퀴놀리닐, 벤조티에닐, 옥사졸릴, 인다졸릴, 또는 치환된, 특히 일치환되거나 이치환된 임의의 라디칼이다.
본원에서 사용되는 용어 "헤테로알킬"은 N, O 및 S와 같은 1 내지 3 개의 헤테로원자를 갖는 알킬기를 의미한다. B, Al, Si 및 P를 포함하나, 이에 제한되지는 않는 추가 헤테로원자가 또한 유용할 수 있다. 비제한적인 예로, -S(O)- 및 -S(O)2-와 같이 헤테로원자는 또한 산화될 수 있다. 예를 들어, 헤테로알킬은 에테르, 티오에테르, 알킬-아민 및 알킬-티올을 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "헤테로알킬렌"은 2 이상의 다른 기를 연결하는 상기 정의된 헤테로알킬기를 의미한다. 헤테로알킬렌에 연결된 2 개의 모이어티는 헤테로알킬렌의 동일한 원자 또는 상이한 원자에 연결될 수 있다.
"친전자체"는 친핵체와 반응할 수 있는 친전자성 중심, 즉, 전자를 찾는 중심을 갖는 이온성일 수 있는 이온 또는 원자 또는 원자의 집합을 의미한다. 친전자체(또는 친전자성 시약)는 반응 파트너로부터 둘 모두의 결합 전자를 수용함으로써 반응 파트너(친핵체)에 대한 결합을 형성하는 시약이다.
"친핵체"는 친핵성 중심, 즉, 친전자성 중심을 찾거나 친전자체와 반응할 수 있는 중심을 갖는, 이온성일 수 있는 이온 또는 원자 또는 원자의 집합을 의미한다. 친핵체(또는 친핵성 시약)은 둘 모두의 결합 전자를 제공함으로써 반응 파트너(친전자체)에 대한 결합을 형성하는 시약이다. "친핵성 기"는 반응성 기와 반응한 후의 친핵체를 의미한다. 비제한적인 예로 아미노, 히드록실, 알콕시, 할로알콕시 등을 포함한다.
"말레이미도"는 술프히드릴(예를 들어, 티오 알킬)과 반응시 구조
Figure pct00003
를 갖는 -S- 말레이미도기를 형성하는, 구조
Figure pct00004
를 갖는 피롤-2,5-디온-1-일기를 의미하며, 상기 식에서, "
Figure pct00005
"는 말레이미도기에 대한 부착 지점을 나타내고, "
Figure pct00006
"는 본래의 술프히드릴 함유 기의 나머지에 대한 황 원자 티올의 부착 지점을 나타낸다.
본 발명의 개시의 목적상, 단백질 및 폴리펩티드에서 발견되는 "자연 발생 아미노산"은 L-알라닌, L-아르기닌, L-아스파라긴, L-아스파르트산, L-시스테인, L-글루타민, L-글루탐산, L-글리신, L-히스티딘, L-이소류신, L-류신, L-리신, L-메티오닌, L-페닐알라닌, L-프롤린, L-세린, L-트레오닌, L-트립토판, L-티로신, 및/또는 L-발린이다. 단백질에서 발견되는 "비자연 발생 아미노산"은 자연 발생 아미노산으로 언급된 것 이외의 임의의 아미노산이다. 비자연 발생 아미노산은, 비제한적인 예로, 자연 발생 아미노산의 D 이성질체, 및 자연 발생 아미노산의 D 및 L 이성질체의 혼합물을 포함한다. 4-히드록시프롤린, 데스모신, 이소데스모신, 5-히드록시리신, 엡실론-N-메틸리신, 3-메틸히스티딘과 같은 다른 아미노산은 비록 자연 발생 단백질에서 발견되나, 이들은 일반적으로 mRNA의 리보솜 번역 이외의 수단에 의해 도입됨에 따라 본 개시의 목적상 단백질에서 발견되는 비자연 발생 아미노산인 것으로 간주된다.
중합체의 기하학, 구성 또는 전체 구조와 관련하여 "선형"은 단일 중합체 아암을 갖는 중합체를 의미한다.
중합체의 기하학, 구성 또는 전체 구조와 관련하여 "분지형"은 원자 전달 라디칼 중합 반응에서 이용되는 개시제로부터 유래될 수 있는 L 기와 같은 코어 구조로부터 연장된 2 이상의 중합체 "아암(arm)"을 갖는 중합체를 의미한다. 분지형 중합체는 2 개의 중합체 아암, 3 개의 중합체 아암, 4 개의 중합체 아암, 5 개의 중합체 아암, 6 개의 중합체 아암, 7 개의 중합체 아암, 8 개의 중합체 아암 또는 그 이상을 가질 수 있다. 본 발명의 개시의 목적상, 단일 선형 기로부터 연장된 3 개 이상의 중합체 아암을 갖는 화합물은 "코움(comb)" 구조 또는 "코움" 구성을 갖는 것으로 표시된다. 분지형은 또한 더 넓은 덴드리머-유사 구성을 형성시키는 "통계(statistical)" 구조를 통해 달성될 수 있다.
"약학적으로 허용되는" 조성물 또는 "약학적 조성물"은 본 발명의 화합물 및 약학적으로 허용되는 부형제 또는 약학적으로 허용되는 부형제들을 포함하는 조성물을 의미한다.
"약학적으로 허용되는 부형제" 및 "약학적으로 허용되는 담체"는 본 발명의 조성물에 포함될 수 있고, 환자에 대해 어떠한 유의한 해로운 독물학적 효과도 야기시키지 않는 부형제를 의미한다. 약학적으로 허용되는 부형제의 비제한적인 예는 물, NaCl, 일반(normal) 염수 용액, 락테이트화된 링거액(lactated Ringer's), 일반 수크로오스, 일반 글루코오스 등을 포함한다.
"환자" 또는 "~ 를 필요로 하는 피검체"는 본원에서 제공된 약학적 조성물의 투여에 의해 예방되거나 치료될 수 있는 질환을 앓고 있거나 이러한 질환에 걸리기 쉬운 살아있는 생물체를 의미한다. 비제한적인 예로 인간, 다른 포유류 및 다른 비-포유류 동물을 포함한다.
"치료적 유효량"은 확인된 질병 또는 상태를 치료하거나, 개선시키거나, 예방하거나, 검출가능한 치료 또는 억제 효과를 나타내는데 유용한 컨쥬게이션된 기능성 작용제 또는 약학적 조성물의 양을 의미한다. 상기 효과는 당해 기술 분야에서 공지된 임의의 검정법에 의해 검출될 수 있다.
물질의 "생물학적 반감기"는 생물체로의 물질의 도입 후에 물질의 절반이 생물체로부터 제거되는데 필요한 시간을 특정하는 약동학적 파라미터이다.
III . 고분자 중합체
본 발명은 친수성 기 및 작용기 또는 연결기를 갖는 고분자 중합체를 제공한다. 몇몇 구체예에서, 본 발명은 아크릴레이트, 메타크릴레이트, 아크릴아미드, 메타크릴아미드, 스티렌, 비닐 피리딘, 비닐 피롤리딘 또는 비닐 에스테르 예컨대 비닐 아세테이트로부터 각각 독립적으로 선택되는 복수의 단량체를 각각 갖는 둘 이상의 중합체 아암을 갖는 중합체를 제공하며, 여기서 각 단량체는 친수성 기를 포함한다. 중합체는 또한 중합체 아암의 근위 말단에 연결된 개시제 단편을 포함하며, 여기서 개시제 모이어티는 라디칼 중합에 적합하다. 중합체는 또한 중합체 아암의 원위 말단에 연결된 말단기를 포함한다. 중합체의 하나 이상의 개시제 단편 및 말단기는 기능성 작용제 (functional agent) 또는 연결기를 포함한다.
다른 구체예에서, 본 발명은 아크릴레이트, 메타크릴레이트, 아크릴아미드, 메타크릴아미드, 스티렌, 비닐 피리딘, 비닐 피롤리딘 또는 비닐 에스테르 예컨대 비닐 아세테이트로부터 각각 독립적으로 선택되는 복수의 단량체를 갖는 중합체 아암을 갖는 중합체를 제공하며, 여기서 각 단량체는 친수성 기를 포함한다. 중합체는 또한 중합체 아암의 근위 말단에 연결된 개시제 단편을 포함하며, 여기서 개시제 모이어티는 라디칼 중합에 적합하다. 중합체는 또한 중합체 아암의 원위 말단에 연결된 말단기를 포함한다. 중합체의 하나 이상의 개시제 단편 및 말단기는 기능성 작용제 또는 연결기를 포함한다. 게다가, 중합체는 다각도 광산란에 의해 측정된 바와 같이, 약 50 kDa 내지 약 1,500 kDa의 피크 분자량 (Mp)을 갖는다.
본 발명의 중합체는 임의의 적합한 분자량을 가질 수 있다. 본 발명의 고 MW 중합체를 위한 예시적인 분자량은 약 50 내지 약 1,500 킬로-달톤 (kDa)이 될 수 있다. 몇몇 구체예에서, 본 발명의 고 MW 중합체는 약 50 kDa, 약 100 kDa, 약 200 kDa, 약 250 kDa, 약 300 kDa, 약 350 kDa, 약 400 kDa, 약 450 kDa, 약 500 kDa, 약 750 kDa, 약 1,000 kDa 또는 약 1,500 kDa의 분자량을 가질 수 있다.
몇몇 다른 구체예에서, 본 발명은 아래 화학식의 중합체를 제공한다:
Figure pct00007
여기서 R1은 H, L3-A1, LG1 또는 L3-LG1이 될 수 있다. 각각의 M1 및 M2는 아크릴레이트, 메타크릴레이트, 아크릴아미드, 메타크릴아미드, 스티렌, 비닐 피리딘, 비닐 피롤리딘 또는 비닐-에스테르로부터 독립적으로 선택될 수 있다. 각각의 G1 및 G2는 각각 독립적으로 친수성 기이다. 라디칼 중합을 통한 중합체의 중합을 위해 I-I'의 조합이 개시제가 되도록 각각의 군 I는 개시제 단편이고 I'는 라디칼 스캐빈저이다. 택일적으로, 각각의 I'은 H, 할로겐 또는 C1 -6 알킬로부터 독립적으로 선택될 수 있다. 각각의 L1, L2 및 L3은 링커가 될 수 있다. 각각의 A1은 기능성 작용제가 될 수 있다. 각각의 LG1은 연결기가 될 수 있다. 아랫첨자 x 및 y1은 각각 독립적으로 1 내지 1000의 정수가 될 수 있다. 각각의 아랫첨자 z는 독립적으로 1 내지 10의 정수가 될 수 있다. 아랫첨자 s는 독립적으로 1 내지 100의 정수가 될 수 있다.
다른 구체예에서, 본 발명은 화학식 I의 중합체를 제공한다:
Figure pct00008
(I)
여기서 화학식 I의 R1은 H, L3-A1, LG1 또는 L3-LG1이 될 수 있다. 각각의 화학식 I의 M1 및 M2는 아크릴레이트, 메타크릴레이트, 아크릴아미드, 메타크릴아미드, 스티렌, 비닐 피리딘, 비닐 피롤리딘 또는 비닐-에스테르로부터 독립적으로 선택될 수 있다. 각각의 화학식 I의 ZW 및 ZW1은 독립적으로 쯔비터이온성 모이어티가 될 수 있다. 라디칼 중합을 통한 화학식 I의 중합체의 중합을 위해 I-I'의 조합이 개시제가 되도록 각각의 I는 개시제 단편이고 I'는 라디칼 스캐빈저이다. 택일적으로, 각각의 I'은 H, 할로겐 또는 C1 -6 알킬로부터 독립적으로 선택될 수 있다. 각각의 L1, L2 및 L3은 링커가 될 수 있다. 각각의 화학식 I의 A1은 기능성 작용제가 될 수 있다. 각각의 화학식 I의 LG1은 연결기가 될 수 있다. 화학식 I의 아랫첨자 x 및 y1은 각각 독립적으로 1 내지 1000의 정수가 될 수 있다. 각각의 화학식 I의 아랫첨자 z는 독립적으로 1 내지 10의 정수가 될 수 있다. 화학식 I의 아랫첨자 s는 독립적으로 1 내지 100의 정수가 될 수 있다. s, x, y1 및 z의 합은, 다각도 광산란에 의해 측정된 바와 같이, 화학식 I의 중합체가 약 50kDa 내지 약 1,500kDa의 피크 분자량을 가지도록 될 수 있다.
다른 구체예에서, 중합체는 아래 화학식을 가질 수 있다:
Figure pct00009
몇몇 다른 구체예에서, 중합체는 아래 화학식을 가질 수 있다:
여기서 R2는 H 또는 C1 -6 알킬로부터 선택될 수 있으며, PC는 포스포릴콜린이 될 수 있다.
본 발명의 고 MW 중합체는 또한 임의의 적합한 수의 공단량체, M2를 가질 수 있다. 예를 들어, 공단량체의 수, 아랫첨자 z는 1 내지 10, 예컨대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10이 될 수 있다. 공단량체의 수, 아랫첨자 z는, 또한 1 내지 5, 1 내지 4, 1 내지 3, 또는 1 내지 2가 될 수 있다. 몇몇 구체예에서, 본 발명의 고 MW 중합체는, 예컨대 화학식 (Ia)에서 아랫첨자 z가 1인 두 개의 다른 단량체를 가질 수 있다:
Figure pct00011
(Ia)
추가적인 공단량체 M2가 본 발명의 고 MW 중합체에 존재할 수 있으며, 예컨대 M2a, M2b, M2c, M2d, M2e, M2f, M2g, M2h, 등은 상기 M2에 대해 정의된 바와 같고, 각각의 공단량체가 동일하거나 다른 y1값으로 존재하며, 상응하는 ZW1 기를 가지는 각각의 공단량체가 결합된다.
고 MW 중합체의 다른 단량체는 또한 임의의 적합한 비율로 존재할 수 있다. 예를 들어, M2 단량체는, 총괄적이거나 개별적으로, M1 단량체에 대해 100:1, 50:1, 40:1, 30:1, 20:1, 10:1, 9:1, 8:1, 7:1, 6:1, 5:1, 4:1, 3:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:20, 1:30, 1:40, 1:50 및 1:100의 비율로 존재할 수 있다. 게다가, 각각의 M2 단량체는 M1 또는 임의의 다른 M2 단량체에 대해 임의의 적합한 비율, 예컨대 100:1, 50:1, 40:1, 30:1, 20:1, 10:1, 9:1, 8:1, 7:1, 6:1, 5:1, 4:1, 3:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:20, 1:30, 1:40, 1:50 및 1:100으로 존재할 수 있다.
본 발명의 고 MW 중합체는 임의의 적합한 아키텍쳐를 가질 수 있다. 예를 들어, 고 MW 중합체는 선형 또는 분지형이 될 수 있다. 고 MW 중합체가 분지형인 경우, 이들은 화학식 I의 아랫첨자 s에 정의된 바와 같이, 예컨대 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 및 100 아암에 이르는 임의의 적합한 수의 중합체 아암을 가질 수 있다. 몇몇 구체예에서, 아랫첨자 s는 1 내지 32, 1 내지 16, 1 내지 10, 1 내지 9, 1 내지 8, 1 내지 7, 1 내지 6, 1 내지 5, 1 내지 4, 1 내지 3 또는 1 내지 2가 될 수 있다. 본 발명의 고 MW 중합체는 임의의 적합한 아키텍쳐를 채택할 수 있다. 예를 들어, 고 MW 중합체는 선형, 분자형, 스타형, 덴드리머, 코움(combs)형, 등이 될 수 있다.
고 MW 중합체의 기능성 작용제는 개시제 단편 I, 또는 라디칼 스캐빈저 I', 또는 둘 모두에 결합될 수 있다. 다중 기능성 작용제가 존재하는 경우, L1은 둘 이상의 기능성 작용제가 개시제 단편 I에 결합될 수 있도록 분지형 링커가 될 수 있다. 몇몇 구체예에서, 고 MW 중합체는 화학식(Ib)를 갖는다:
Figure pct00012
(Ib)
화학식(Ib)에서, 기능성 작용제 A1은 약물, 치료적 단백질 또는 목적 작용제가 될 수 있다. 링커 L1은, 예컨대 약물 또는 치료적 단백질의 원활한 방출을 위해 약물 또는 치료적 단백질에 결합하는 경우, 절단 가능한 링커가 될 수 있다. 택일적으로, 링커 L1은 절단 불가능한 링커가 될 수 있다.
다중 공단량체 M2가 존재하는 경우, 각각의 공단량체 M2는 결합된 다른 쯔비터이온성 기를 가질 수 있다. 예를 들어, 고 MW 중합체는 화학식(Ic)를 가질 수 있다:
Figure pct00013
(Ic)
여기서 각각의 ZW1a 및 ZW1b는 ZW에 대해 상기에서 정의한 바와 같고, 각각의 y1a 및 y1b는 y1에 대해 상기에서 정의한 바와 같다.
몇몇 구체예에서, 고 MW 중합체는, 예컨대 아래의 구조식에서 보여지는 바와 같은 개시제 단편 I에 결합된 연결기 LG를 갖는다:
Figure pct00014
몇몇 구체예에서, 본 발명의 고 MW 중합체는 하나 이상의 부가적인 단량체를 갖는 차후의 중합을 통해 변경될 수 있다. 예를 들어, 상기 화학식(Ic)에서, 단량체 M1 및 M2a는 제1 중합에서 공중합될 수 있으며, 단량체 M2b는 제2 중합에서 중합될 수 있다. 블록 공중합체는, M1 및 M2a의 고 MW 중합체가 되는 제1 블록, 및 M2b의 제2 블록 호모중합체, 두 블록들을 가지도록 형성된다. 택일적으로, 단량체 M1 및 M2a의 중합 후, 단량체 M2b가 단량체 M2c와 공중합될 수 있으며, 따라서 제1 블록이 M1 및 M2a의 고 MW 중합체이고, 제2 블록이 M2b 및 M2c의 고 MW 중합체인 블록 공중합체가 형성된다. 부가적인 중합체 구조는 제1 중합에서 단량체 M1, M2a 및 M2b의 공중합에 의해 제조될 수 있으며, 이후 제2 공중합에서 단량체 M2c, M2d, 및 다른 것들이 공중합된다. 부가적인 블록은 부가적인 단량체를 사용한 제3 중합에 의해 제조될 수 있다. 이러한 중합체는 다른 특성, 약물 및 기능성 작용제를 가질 수 있는 공중합체의 블록을 제공한다.
몇몇 구체예에서, 중합체는,
Figure pct00015
Figure pct00016
, 또는
Figure pct00017
이 될 수 있으며, 여기서 PC는 포스포릴콜린이다.
몇몇 다른 구체예에서, 중합체는,
Figure pct00018
Figure pct00019
Figure pct00020
이 될 수 있다.
몇몇 구체예에서, R1은 L3-A1, LG1 또는 L3-LG1이고; A1은 약물, 항체, 항체 단편, 단일 도메인 항체, 아비머, 아드넥틴, 디아보디, 비타민, 코펙터, 폴리사카라이드, 카보하이드레이트, 스테로이드, 지질, 지방, 단백질, 펩티드, 폴리펩티드, 뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드, 핵산. 라디오레벨, 대조 작용제, 플루오르포어 또는 염료이고; L3는 -(CH2CH2O)1-10-이고; LG1은 말레이미드, 아세탈, 비닐, 알릴, 알데히드, -C(O)O-C1 -6 알킬, 히드록시, 디올, 케탈, 아지드, 알킨, 카르복실산, 또는 숙신이미드이다. 다른 구체예에서, 각각의 LG1은 히드록시, 카르복시, 비닐, 비닐옥시, 알릴, 알릴옥시, 알데히드, 아지드, 에틴, 프로핀, 프로파길, -C(O)O-C1 -6 알킬,
Figure pct00021
이다.
A. 개시제
본 발명의 고 MW 중합체는 임의의 적합한 개시제를 사용하여 중합된다. 본 발명에서 유용한 개시제는 화학식 I-(I')m에 의해 기재될 수 있으며, 여기서 아랫첨자 m은 1 내지 100의 정수이다. 개시제 단편 I은 중합을 개시하는 임의의 기가 될 수 있다. 라디칼 스캐빈저 I'은 중합체 사슬 성장을 가역적으로 종결시키는 임의의 기가 될 수 있다. 라디칼 스캐빈저 I'는 할로겐 예컨대 브롬이 될 수 있으며, 중합체의 말단이 중합 이후 관능화되도록 한다. 몇몇 구체예에서, 라디칼 스캐빈저 I'은 말단기로서 언급된다. 또한, 개시제 단편 I은 고 MW 중합체의 관능화 정도(functionality)를 조정하기 위한 다양한 작용기를 포함할 수 있는 R1기로 임의로 관능화될 수 있다.
본 발명에서 유용한 개시제는, 각각 중합체 사슬의 성장을 가역적으로 종결시킬 수 있는, 단일의 라디칼 스캐빈저 I' 또는 다중 라디칼 스캐빈저 I'가 있는 임의의 적합한 수의 가지들을 가질 수 있다. 개시제 단편 I이 분지화되고 다중 중합체 사슬을 개시할 수 있는 경우, 아랫첨자 m은 중합체 사슬이 성장함에 따라 많은 라디칼 스캐빈저 I'가 있도록 1 초과이다.
본 발명의 중합체는 복수의 중합체 아암을 가질 수 있다. 예를 들어, 중합체는 1 내지 약 100개의 중합체 아암, 또는 약 1 내지 약 50개의 중합체 아암, 또는 약 1 내지 약 20개의 중합체 아암, 또는 1 내지 약 10개의 중합체 아암, 또는 2 내지 약 10개의 중합체 아암, 또는 약 1 내지 약 8개의 중합체 아암, 또는 약 2 내지 약 8개의 중합체 아암, 또는 1 내지 약 4개의 중합체 아암, 또는 약 2 내지 약 4개의 중합체 아암을 가질 수 있다. 중합체는 또한, 수평균 분자량 (Mn)으로 나누어진 중량 평균 분자량 (Mw)으로 측정되는 임의의 적합한 다분산성 지수 (PDI)을 가질 수 있으며, 1.0의 PDI가 완전한 단일분산 중합체를 나타낸다. 예를 들어, PDI는 약 2.0 미만, 또는 약 1.9, 1.8, 1.7, 1.6, 1.5, 1.4, 1.3, 1.2 또는 1.1 미만이 될 수 있다.
몇몇 구체예에서, 개시제 단편은 1개의 중합체 아암과 연결되고, 중합체는 약 1.5 미만의 다분산성 지수를 갖는다. 다른 구체예에서, 개시제 단편은 2 내지 약 100개의 중합체 아암의 근위 말단에 연결된다. 몇몇 다른 구체예에서, 중합체는 약 2.0 미만의 다분산성 지수를 갖는다. 여전히 다른 구체예에서, 개시제 단편은 2개의 중합체 아암의 근위 말단에 연결된다. 아직 다른 구체예에서, 개시제 단편은 4개의 중합체 아암의 근위 말단에 연결된다. 다른 구체예에서, 개시제 단편은 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9 또는 12개의 중합체 아암의 근위 말단에 연결된다.
유사-분지형 (Pseudo-branched) 중합체는 또한 중합체와 인접되도록 다중 선형, 비분지형, 본 발명의 중합체에 단일 기능성 작용제를 결합함에 의해 얻어질 수 있다. 근접성은 중합체를 기능성 작용제, 예를 들어, 단백질 상의 시스테인 상의 인접 포인트에 결합함에 의해 얻어질 수 있다. 택일적으로, 근접성은, 단백질의 이질적인 영역에 결합된 중합체가 단백질의 폴딩 및 2차 및 3차 구조에 기인하여 가까이 근접되도록 기능성 작용제, 예를 들어 단백질의 구조에 의해 얻어질 수 있다. 단일 기능성 작용제 상의 본 발명의 두 중합체의 근접성은, 어떻게 근접성이 달성되었는지에 상관없이, 복수의 중합체 아암을 가진 본 발명의 중합체의 그것과 유사한 특성이 부여될 수 있다.
개시제 단편 I 및 라디칼 스캐빈저 I' 사이의 결합은 불안정하며, 중합 공정 동안 단량체 M1 및 공단량체 M2가 개시제 단편 I 및 라디칼 스캐빈저 I' 사이에 삽입되도록 한다. 예를 들어, 자유 라디칼, 예컨대 ATRP 중합 동안, 도 1에 도시된 바와 같이, 개시제 단편 I 및 라디칼 스캐빈저 I'는 분리되어 I 및 I'의 라디칼을 형성한다. 후에 개시제 단편 I의 라디칼은 용액 중의 단량체들과 반응하여 중합체를 성장시키며 전달 중합체 라디칼 (도 1의 종 A 및 종 C)을 형성한다. 중합 공정 동안, 라디칼 스캐빈저 I'의 라디칼은 전달 중합체 라디칼과 가역적으로 반응하여 중합체의 성장을 일시적으로 정지시킬 것이다. 단량체 및 라디칼 스캐빈저 I' 사이의 결합 또한 불안정하여, 결합이 끊어질 수 있고 전달 중합체 라디칼이 부가적인 단량체와 반응하여 중합체를 성장시킬 수 있도록 한다. 중합 공정의 결과, 개시제 단편 I은 중합체 사슬의 한쪽 말단에 있고 라디칼 스캐빈저 I'은 중합체 사슬의 반대쪽 말단에 있게 된다.
개시제 단편 I의 라디칼은 일반적으로 2차 또는 3차 탄소 상이며, 인접한 카르보닐 탄소에 의해 안정화 될 수 있다. 라디칼 스캐빈저 I'은 일반적으로 할로겐, 예컨대 브롬, 클로인 또는 아이오딘이다. 이와 함께, 개시제 단편 I 및 라디칼 스캐빈저 I'은 본 발명의 고 MW 중합체의 제조에 유용한 개시제 I1을 형성한다.
US 6,852,816 (여기서 참조로 통합됨)에 기재된 몇몇 개시제를 포함하는, 넓은 다양성의 개시제가 본 발명의 고 MW 중합체의 제조에 사용될 수 있다. 몇몇 구체예에서, 본 발명의 고 MW 중합체의 제조를 위해 ATRP 반응에 사용되는 개시제가 알칸, 시클로알칸, 알킬 카르복실산 또는 이들의 에스테르, 시클로알킬카르복실산 또는 이들의 에스테르, 에테르 및 시클릭 알킬 에테르, 알킬 아릴기, 알킬 아미드, 알킬 아릴 카르복실산 및 이들의 에스테르로부터 선택되며, 또한, 비분지형 고 MW 중합체가 제조되는 경우 하나의 라디칼 스캐빈저 I'을 포함하고, 분지형 분자가 제조되는 경우, 하나 이상의 라디칼 스캐빈저 I'을 포함한다.
본 발명에 유용한 라디칼 스캐빈저 I'은, 제한되는 것은 아니지만, 할로겐, 예컨대 Br, Cl 및 I, 티오시아네이트 (-SCN) 및 이소티오시아네이트 ( N=C=S)이다. 다른 기들은 본 발명의 라디칼 스캐빈저 I'에 유용하다. 몇몇 구체예에서, 라디칼 스캐빈저 I'은 브롬이다.
ATRP 반응을 위해 사용되는 개시제는 하이드록실화될 수 있다. 몇몇 구체예에서, 본 발명의 고 MW 중합체의 제조를 위한 ATRP 반응을 위해 사용된 개시제가 알칸, 시클로알칸, 알킬 카르복실산 또는 이들의 에스테르, 시클로알킬카르복실산 또는 이들의 에스테르, 에테르 및 시클릭 알킬 에테르, 알킬 아릴기, 알킬 아미드, 알킬 아릴 카르복실산 및 이들의 에스테르로부터 선택되며, 하이드록실기를 포함하며, 또한, 비분지형 고 MW 중합체를 제조하기 위해서는 하나의 라디칼 스캐빈저 I'을 포함하거나, 택일적으로 분지형 분자를 제조하기 위해서는, 하나 이상의 라디칼 스캐빈저 I'을 포함한다.
ATRP 반응을 위해 사용되는 개시제는 하나 이상의 아민기를 포함할 수 있다. 몇몇 구체예에서, 본 발명의 고 MW 중합체의 제조를 위한 ATRP 반응을 위해 사용된 개시제가 알칸, 시클로알칸, 알킬 카르복실산 또는 이들의 에스테르, 시클로알킬카르복실산 또는 이들의 에스테르, 에테르 및 시클릭 알킬 에테르, 알킬 아릴기, 알킬 아미드, 알킬 아릴 카르복실산 및 이들의 에스테르로부터 선택되며, 아민기를 포함하며, 또한, 비분지형 고 MW 중합체를 제조하기 위해서는 하나의 라디칼 스캐빈저 I'을 포함하거나, 택일적으로 분지형 분자를 제조하기 위해서는, 하나 이상의 라디칼 스캐빈저 I'을 포함한다.
알킬 디카르복실산을 포함하는, 하나 이상의 라디칼 스캐빈저 I'을 갖는, 아미노 또는 히드록시기로 치환된, 알킬카르복실산이 또한 개시제로서 사용될 수 있다. ATRP 반응이 본 발명의 고 MW 중합체의 제조를 위해 사용되는 본 발명의 몇몇 구체예에서, 개시제는 클로린 및 브롬으로부터 선택된 하나 이상의 할로겐을 함유한 알킬카르복실산이 될 수 있다.
COOH, OH 및 NH2, 및 하나 이상의 라디칼 스캐빈저 I'로부터 선택된 둘 이상의 기로 치환된 알칸은, 또한 ATRP 반응이 본 발명의 고 MW 중합체의 제조를 위해 사용되는 경우 고 MW 중합체의 제조를 위한 개시제로서 사용될 수 있다.
개시제는 또한, 제한되는 것은 아니지만, OH, 아미노, 모노알킬아미노, 디알킬아미노, -O-알킬, -COOH, -COO알킬, 또는 포스페이트 기 (또는 이들의 보호된 형태)를 포함하는 하나 이상의 기들을 함유할 수 있다.
개시제의 넓은 다양성은 상업적으로 구입가능한, 예를 들어 시그마 알드리치 (St. Louis, MO)로부터 구매 가능한 브로모아세트산 N-히드록시숙신이미드 에스테르이다. 이러한 개시제의 적합한 보호 형태는 필요에 따라 당업계의 표준 방법을 사용하여 제조될 수 있다.
다른 개시제는, 예를 들어, 알킬 퍼옥사이드, 치환된 알킬 퍼옥사이드, 아릴 퍼옥사이드, 치환된 아릴 퍼옥사이드, 아실 퍼옥사이드, 알킬 하이드로퍼옥사이드, 치환된 아릴 하이드로퍼옥사이드, 아릴 하이드로퍼옥사이드, 치환된 아릴 하이드로퍼옥사이드, 헤테로알킬 퍼옥사이드, 치환된 헤테로알킬 퍼옥사이드, 헤테로알킬 하이드로퍼옥사이드, 치환된 헤테로알킬 하이드로퍼옥사이드, 헤테로아릴 퍼옥사이드, 치환된 헤테로아릴 퍼옥사이드, 헤테로아릴 하이드로퍼옥사이드, 치환된 헤테로아릴 하이드로퍼옥사이드, 알킬 퍼에스테르, 치환된 알킬 퍼에스테르, 아릴 퍼에스테르, 치환된 아릴 퍼에스테르, 아조 화합물 및 할라이드 화합물을 포함하는 열, 산화환원 또는 광 개시제를 포함한다. 특정 개시제는 큐멘 하이드로퍼옥사이드 (CHP), tert-부틸 하이드로퍼옥사이드 (TBHP), tert-부틸 퍼벤조에이트, (TBPB), 소듐 카보네이트퍼옥사이드, 벤조일 퍼옥사이드 (BPO), 라우로일 퍼옥사이드 (LPO), 메틸에틸 케톤 45%, 포타슘 퍼술페이트, 암모늄 퍼술페이트, 2,2-아조비스(2,4-디메틸 발레로니트릴), 1,1-아조비스(시클로 헥산카보니트릴), 2,2-아조비스(N,N-디메틸렌이소부티라미딘) 디하이드로클로라이드, 및 2,2-아조비스 (2-아미도 프로판) 디하이드로클로라이드를 포함한다. 산화환원 페어는 예컨대 퍼술페이트/설파이트 및 Fe (2+) 퍼옥사이드 또는 암모늄 퍼술페이트 및 N,N,N'N'-테트라메틸에틸렌디아민 (TEMED)이다.
본 발명의 고 MW 중합체의 제조에 유용한 다른 개시제는 분지형이다. 단일 분지 포인트를 갖는 적합한 개시제는 아래의 화합물을 포함한다:
Figure pct00022
여기서 라디칼 R은 임의의 아래의 것들이 될 수 있다:
Figure pct00023
몇몇 구체예에서, 개시제는
Figure pct00024
이 될 수 있으며, 이는 부가적인 작용기를 갖는 반응을 위한 말레이미드를 형성하기 위한 중합 후 탈보호화될 수 있는 보호된 말레이미드이다.
부가적인 분지형 개시제는, 제한되는 것은 아니지만, 아래의 것들이고, 여기서, 라디칼 R은 상기 정의된 바와 같다:
Figure pct00025
몇몇 구체예에서, 분지형 개시제는, 제한되는 것은 아니지만, 아래의 것들을 포함한다:
Figure pct00026
본 발명의 고 MW 중합체의 제조에 유용한 다른 분지형 개시제는 아래의 것들을 포함한다:
Figure pct00027
여기서 라디칼 R은 상기에 정의된 바와 같고, 라디칼 X는 CHO, SO2Cl, SO2CH=CH2, NHCOCH2I, N=C=O 및 그 중에서도 N=C=S가 될 수 있다. 부가적인 X기는 아래의 것들을 포함할 수 있다:
Figure pct00028
여전히 다른 개시제는, 제한되는 것은 아니지만, 아래의 것들을 포함한다:
Figure pct00029
다른 구체예에서, 개시제는 복수의 중합체 아암을 얻기 위한 다양한 분지형 포인트를 가질 수 있다, 예컨대:
Figure pct00030
여기서 라디칼 R은 상기에서 정의된 바와 같다. 몇몇 다른 구체예에서, 개시제는 아래의 구조를 가질 수 있다:
Figure pct00031
몇몇 다른 구체예에서, 개시제는 아래의 구조를 가질 수 있다:
Figure pct00032
Figure pct00033
Figure pct00034
Figure pct00035
Figure pct00036
상술한 바와 같이, 개시제는 별도로 중합 혼합물에 첨가될 수 있거나, 다른 분자, 예컨대 단량체 (하이퍼브랜치 구조) 또는 중합체 단편 (예컨대 그라프트 공중합체)에 포함될 수 있다. 중합의 개시는 열, UV 광, 또는 당업자에게 알려진 다른 방법에 의해 달성될 수 있다.
몇몇 구체예에서, 본 발명의 개시제 I-I'는 아래 화학식을 갖는다:
(F)r-Sp1-C-Sp2-I'
여기서 개시제 단편 I은 F-Sp1-C-Sp2에 대응한다. 각각의 라디칼 F는 본 발명의 기능성 작용제 또는 연결기와 반응하기 위한 작용기이다. 라디칼 r은 1 내지 10이다. 라디칼 Sp1 및 Sp2는 스페이서이며 공유 결합, 예컨대 C1 -6 알킬, 아릴 또는 헤테로아릴을 형성하기 위한 임의의 적합한 기가 될 수 있다. 라디칼 C는 하나 이상의 스페이서, Sp2 (동일하거나 다를 수 있는), 및 하나 이상의 라디칼 스캐빈저, I'에 연결되기 위한 하나 또는 복수의 포인트를 제공하고, 하나 이상의 스페이서, Sp1 (동일하거나 다를 수 있는), 및 하나 이상의 작용기, F (동일하거나 다를 수 있는)에 연결되기 위한 하나 또는 복수의 포인트를 제공하는 임의의 코어가 될 수 있다. 코어 C는 임의의 적합한 구조, 예컨대 분지형 구조, 헤테로원자가 포함된 가교 구조, 예컨대 실세스퀴록산, 및 다중 펜던트 작용기를 갖는 선형, 쇼트 중합체가 될 수 있다. 또한, 코어 C는, 제한되는 것은 아니지만, 에스테르, 아미드, 에테르, 및 케톤을 포함하는 공유결합을 형성하기 위한 임의의 적합한 기에 의해 하나 이상의 Sp1 및 Sp2 스페이서에 결합될 수 있다. 라디칼 스캐빈저 I'는 라디칼성 이동성 원자 또는 기 예컨대, 제한되는 것은 아니지만, 할로겐, Cl, Br, I, OR10, SR11, SeR11, OC(=O)R11, OP(=O)R11, OP(=O)(OR11)2, O-(R11)2, S-C(=S)N(R11)2, CN, NC, SCN, CNS, OCN, CNO, N3, OH, O, C1-C6-알콕시, (SO4), PO4, HPO4, H2PO4, 트리플레이트, 헥사플루오로포스페이트, 메탄술포네이트, 아릴술포네이트, 카르복실산 할라이드이다. R10은 1 내지 20개의 탄소 원자의 알킬 또는 각각의 수소 원자가 할라이드에 의해 대체될 수 있는 1 내지 20개의 탄소 원자의 알킬, 2 내지 20개의 탄소 원자의 알켄일, 2 내지 10개의 탄소 원자의 알킨일, 페닐, 1 내지 5개의 할로겐 원자 또는 1 내지 4개의 탄소 원자를 갖는 알킬기, 아랄킬, 아릴, 아릴 치환된 알킬로 치환된 페닐, 여기서 아릴기는 페닐 또는 치환된 페닐이고 알킬기는 1 내지 6개의 탄소 원자이며, R11은 아릴 또는 직쇄 또는 분지쇄 C1-C20 알킬기이거나 여기서 N(R11)2기가 존재하고, 두 개의 R11기는 5, 6 또는 7원 헤테로시클릭 고리를 형성하도록 결합될 수 있다. 스페이서 Sp1는 작용기 F 및 코어 C에 공유적으로 결합하며 동시에 스페이서 Sp2는 코어 C 및 라디칼 스캐빈저 I'와 공유적으로 결합한다.
다른 구체예에서, 본 발명의 개시제는 아래 화학식을 갖는다:
Figure pct00037
여기서 각각의 I'은 독립적으로 할로겐, -SCN, 또는 NCS로부터 선택된다. L4 및 L5는 각각 독립적으로 결합 또는 링커이며, L4 및 L5 중 하나는 링커가 되도록 한다. C는 결합 또는 코어기이다. LG2는 연결기이다. 아랫첨자 p는 1 내지 100이며, 여기서 아랫첨자 p가 1인 경우, C는 결합이고, 아랫첨자 p가 2 내지 100인 경우, C는 코어기이다. 몇몇 다른 구체예에서, 개시제는 아래 화학식을 갖는다:
Figure pct00038
여기서 각각의 R3 및 R4는 독립적으로 H, CN 또는 C1 -6 알킬로부터 선택된다.
B. 단량체
본 발명의 고분자량(high MW) 중합체를 준비하는데 유용한 단량체들은 라디칼 중합이 가능한 임의의 단량체를 포함한다. 전형적으로, 이러한 단량체들은 비닐 기를 갖는다. 적합한 단량체들은 아크릴레이트, 메타크릴레이트, 아크릴아미드, 메타크릴아미드, 스티렌, 비닐-피리딘, 비닐-피롤리돈 및 비닐 아세테이트 단량체들과 같은 비닐 에스테르들을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 본 발명에 유용한 단량체들은 친수성 기를 포함한다. 본 발명의 친수성 기는 임의의 적합한 친수성기 일 수 있다. 예를 들면, 친수성기는 쌍성이온 기들 및 친수성 중합체들을 포함할 수 있다. 일부 구현예들에서, 각각의 친수성 기는 쌍성이온 기를 포함한다. 본 발명의 쌍성이온 기들은 음전하 및 양전하 모두를 띄는 임의의 화합물을 포함한다. 음전하를 띄고, 본 발명의 쌍성이온의 사용에 적합한 기들은 포스페이트, 술페이트, 기타 옥소어니언(oxoanions) 등을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 양전하를 띄고, 본 발명의 쌍성이온의 사용에 적합한 기들은 암모늄 이온들을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 일부 구현예에서, 쌍성이온은 포스포릴콜린일 수 있다. 본 발명에 유용한 다른 쌍성이온은 WO1994016748 및 WO1994016749(참조로 여기에 포함됨)에 기술된 것들을 포함한다. 본 발명에 유용한 친수성 중합체는 폴리에틸렌옥사이드, 폴리옥사졸린, 셀룰로오즈, 덱스트란 및 기타 다당류 중합체들을 포함한다. 본 기술분야의 당업자는 다른 친수성 중합체도 본 발명에 유용하다는 것을 인정할 것이다.
다른 친수성 기는 히드록시, 아민, 카르복실산, 아미드, 술포네이트 및 포스포네이트를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 이러한 친수성 기를 포함하는 본 발명에 유용한 단량체들은 아크릴아미드, N-이소프로필 아크릴아미드 (NiPAAM) 및 기타 치환된 아크릴아미드, 아크릴 산 등을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
쌍성이온성 모이어티, ZW 를 함유하는 단량체들, M1 은 다음의 것들을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다:
Figure pct00039
다른 단량체들은 당업자에게 잘 알려져 있고, 비닐 아세테이트 및 그 유도체들을 포함한다.
일부 구현예들에서, 친수성 기는 쌍성이온 기가 될 수 있다. 일부 구현예에서, 단량체는 2-(메타크릴로일옥시에틸)-2′(트리메틸암모늄에틸) 포스페이트 (HEMA-PC)일 수 있다. 일부 구현예에서, 단량체는 2-(아크릴로일옥시에틸)-2'-(트리메틸암모늄에틸) 포스페이트가 될 수 있다.
C. 링커
본 발명의 고분자량 중합체들은 또한 임의의 적합한 링커 L을 포함할 수 있다. 링커 L3는 개시제 단편 I에 기능성 작용제의 부착을 제공하고, 링커 L1 및 L2 은 공중합체 M1및M2에 쌍성이온 기의 부착을 제공한다. 링커는 절단성(cleavable) 또는 비절단성( non-cleavable), 동질적양기능성(homobifunctional) 또는 이질적양기능성(heterobifunctional)일 수 있다. 다른 링커는 이질적양기능성과 절단성 모두, 또는 동질적양기능성 및 절단성 모두 일 수 있다.
절단성 링커들은 그중에서도 가수분해성 링커, 효소 절단성 링커, pH 민감성 링커, 디설피드(disulfide) 링커 및 광불안정성(photolabile) 링커인 것들을 포함한다. 가수분해성 링커는 물과의 반응으로 링커를 절단하도록 링커 내에 에스테르, 카보네이트 또는 카르바메이트 작용 기를 갖는 것들을 포함한다. 효소 절단성 링커는 효소에 의해 절단되고, 링커 내에 에스테르, 아미도, 또는 카르바메이트 작용기를 포함할 수 있는 것들을 포함한다. pH 민감성 링커는 하나의 pH에서 안정하지만, 또 다른 pH에서는 불안정한 것을 포함한다. pH 민감성 링커는, 산성에서 염기성 상태로, 염기성에서 산성 상태로, 약 산성에서 강 산성 상태로, 또는 약 염기성에서 강 염기성 상태로 pH가 변화될 수 있다. 적합한 pH 민감성 링커가 당업자에게 잘 알려져 있으며, 케탈, 아세탈, 이민 또는 이미늄( imminiums), 실록산(siloxane), 실라잔(silazanes), 실란(silanes) , 말리메이트-아미드 결합 (maleamates-amide bond), 오르쏘(ortho) 에스테르, 히드라존(hydrazones) 활성 카르복실산 유도체 및 비닐 에테르를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 디설피드 링커는 링커내에 디설피드 결합을 갖는 것으로 특징되고, 환원 조건하에서 절단된다. 광불안성 링커는 가시광선, 적외선, 자외선, 또는 다른 파장에서 전자기 방사선과 같은 빛에 노출에 의해 절단되는 것들을 포함한다.
본 발명에서 유용한 다른 링커들은 미국 특허 출원 제 2008/0241102호(어센디스/컴플렉스 바이오시스템에 양도)와 제 2008/0152661호(미러스에 양도) 및 국제특허출원 번호 WO2004/010957 및 WO2009/117531 (시애틀 제네틱스에 양도) 및 01/24763, 2009/134977 및 2010/126552 (이뮤노젠에 양도) (여기서 전체로서 포함됨)에서 기술된 것들을 포함한다. 본 발명에 유용한 미러스(Mirus) 링커는 다음의 것들을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다:
Figure pct00040
다른 링커는 Bioconjugate Techniques, Greg T. Hermanson, Academic Press, 2008년 제 2판(여기서 전체로서 포함됨)에 기술된 것 및 Angew. Chem. Int. 2009년 판, 48, 6974-6998 (Bertozzi, C.R. 및 Sletten, E.M) (여기에 전체로서 포함됨)에 기술된 것을 포함한다.
일부 구현예에서, 링커 L1, L2 및 L3은 각 원자는 독립적으로 C, N, O, S 및 P인, 최대 30 원자의 길이를 갖을 수 있다. 다른 구현예에서, 링커 L1 및 L2는 다음의 것들 중 하나일 수 있다:
-C1-12 알킬-, -C3-12 시클로알킬-, -(C1 -8 알킬)-(C3-12 시클로알킬)-(C0 -8 알킬)-, -(CH2)1-12O-, (-(CH2)1-6-O-(CH2)1-6-)1-12-, (-(CH2)1-4-NH-(CH2)1-4)1-12-, (-(CH2)1-4-O-(CH2)1-4)1-12-O-, (-(CH2)1-4-O-(CH2)1-4-)1-12O-(CH2)1-12-, -(CH2)1-12-(C=O)-O-, -(CH2)1-12-O-(C=O)-, -(페닐)-(CH2)1-3-(C=O)-O-, -(페닐)-(CH2)1-3-(C=O)-NH-, -(C1-6 알킬)-(C=O)-O-(C0-6 알킬)-, -(CH2)1-12-(C=O)-O-(CH2)1-12-, -CH(OH)-CH(OH)-(C=O)-O- -CH(OH)-CH(OH)-(C=O)-NH-, -S-말레이미도-(CH2)1-6-, -S-말레이미도-(C1 -3 알킬)-(C=O)-NH-, -S-말레이미도-(C1 -3 알킬)-(C5-6 시클로알킬)-(C0 -3 알킬)-, -(C1 -3 알킬)-(C5-6 시클로알킬)-(C0 -3 알킬)-(C=O)-O-, -(C1 -3 알킬)-(C5-6 시클로알킬)-(C0 -3 알킬)-(C=O)-NH-, -S-말레이미도-(C0 - 3알킬)-페닐-(C0 - 3알킬)-, -(C0 -3 알킬)-페닐-(C=O)-NH-, -(CH2)1-12-NH-(C=O)-, -(CH2)1-12-(C=O)-NH-, -(페닐)-(CH2)1-3-(C=O)-NH-, -S-(CH2)-(C=O)-NH-(페닐)-, -(CH2)1-12-(C=O)-NH-(CH2)1-12-, -(CH2)2-(C=O)-O-(CH2)2-O-(C=O)-(CH2)2-(C=O)-NH-, -(C1-6 알킬)-(C=O)-N-(C1-6 알킬)-, 아세탈, 케탈, 아실옥시알킬 에테르, -N=CH-, -(C1-6 알킬)-S-S-(C0-6 알킬)-, -(C1-6 알킬)-S-S-(C1-6 알킬)-(C=O)-O-, -(C1-6 알킬)-S-S-(C1-6 알킬)-(C=O)-NH-, -S-S-(CH2)1-3-(C=O)-NH-(CH2)1-4-NH-(C=O)-(CH2)1-3-, -S-S-(C0 -3 알킬)-(페닐)-, -S-S-(C1 -3-알킬)-(페닐)-(C=O)-NH-(CH2)1-5-, -(C1 -3 알킬)-(페닐)-(C=O)-NH-(CH2)1-5-(C=O)-NH-, -S-S-(C1 -3-알킬)-, -(C1 -3-알킬)-(페닐)-(C=O)-NH-, -O-(C1-C6 알킬)-S(O2)-(C1-6 알킬)-O-(C=O)-NH-, -S-S-(CH2)1-3-(C=O)-, -(CH2)1-3-(C=O)-NH-N=C-S-S-(CH2)1-3-(C=O)-NH-(CH2)1-5-, -(CH2)1-3-(C=O)-NH-(CH2)1-5-(C=O)-NH-, -(CH2)0-3-(hetero아릴)-(CH2)0-3-, -(CH2)0-3-페닐-(CH2)0-3-, N=C(R)-, -(C1 -6 알킬)-C(R)=N-(C1 -6 알킬)-, -(C1 -6 알킬)-(아릴)-C(R)=N-(C1-6 알킬)-, -(C1 -6 알킬)-C(R)=N-(아릴)-(C1 -6 알킬)-, 및 -(C1 -6 알킬)-O-P(O)(OH)-O-(C0-6 알킬)- 상기 R은 H, C1 -6 알킬, C3 -6 시클로알킬, 또는 5 내지 8의 내향고리(endocyclic) 원자를 갖는 아릴 기이다.
일부 구현예에서, 링커 L1, L2 및 L3은 다음 중 하나일 수 있다: -C1-C12 알킬-, -C3-C12 시클로알킬-, (-(CH2)1-6-O-(CH2)1-6-)1-12-, (-(CH2)1-4-NH-(CH2)1-4)1-12-, -(CH2)1-12O-, (-(CH2)1-4-O-(CH2)1-4)1-12-O-, -(CH2)1-12-(CO)-O-, -(CH2)1-12-(CO)-NH-, -(CH2)1-12-O-(CO)-, -(CH2)1-12-NH-(CO)-, (-(CH2)1-4-O-(CH2)1-4)1-12-O-(CH2)1-12-, -(CH2)1-12-(CO)-O-(CH2)1-12-, -(CH2)1-12-(CO)-NH-(CH2)1-12-, -(CH2)1-12-O-(CO)-(CH2)1-12-, -(CH2)1-12-NH-(CO)-(CH2)1-12-, -(C3-C12 시클로알킬)-, -(C1-C8알킬)-(C3-C12 시클로알킬)-, -(C3-C12 시클로알킬)-(C1 - 8알킬)-, -(C1 - 8알킬)-(C3-C12 시클로알킬)-(C1 - 8알킬)- 및 -(CH2)0-3-아릴-(CH2)0-3-.
여전히 다른 구현예에서, 각각의 링커 L1, L2 및 L3 는 가수분해성 링커, 효소 절단성 링커, pH 민감성 링커, 디설피드(disulfide) 링커 및 광불안정성(photolabile) 링커로 부터 독립적으로 선택된 절단성 링커이다.
본 발명에 유용한 다른 링커는 자기-희생적(self-immolative) 링커를 포함한다. 유용한 자기-희생적(self-immolative) 링커는 예를 들어 항체 약물 컨쥬게이트에 유용한 것들로 당업자에게 알려져 있다. 모범적인 자기-희색적(self-immolative) 링커는 미국 특허 제 7,754,681호에 기술되어 있다.
D. 연결기 LG
본 발명의 링커 및 기능성 작용제는 개시제 단편 I 상의 연결기와 반응하여 결합을 형성할 수 있다. 본 발명의 연결기는 다른 작용기에 결합을 형성함으로써 두 개의 기를 서로 연결할 수 있는 임의의 적합한 작용기일 수 있다. 예를 들면, 본 발명에 유용한 연결기(LG)는 그중에서도, 클릭 화학(click chemistry), 말레이미드 화학 및 NHS-에스테르에 사용되는 것들을 포함한다. 클릭 화학에 관련된 연결기는 휘스겐(Huisgen) 고리부가 프로세스(전체로서 여기에 포함된 미국 특허 7,375,234호 참조)를 통하여 트리아졸 고리를 형성하는 아지드 및 알킨을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 말레이미드 화학은 -OH,-SH, -NH2와 같은 친핵체(nucleophile)와 안정한 결합을 형성하는 말레이미드 올레핀의 반응을 수반한다. 다른 연결기는 Bioconjugate Techniques, Greg T. Hermanson, Academic Press, 제 2 판, 2008 (여기 전체로서 포함됨)에 기술된 것들을 포함한다.
연결기들과, 전형적으로 발견되거나 기능성 작용제에 도입되는 일부 기들과의 반응의 일부 비-제한적 예들이 표 I에 제시된다.
표 I
Figure pct00041
Figure pct00042
Figure pct00043
Figure pct00044
Figure pct00045
Figure pct00046
R'은 C1 -6 알킬, C3-6 시클로알킬, 또는 5-8 엔도시클릭(endocyclic) 원자를 갖는 아릴 기이고;
R''은 H, C1 -6 알킬, C3 -6 시클로알킬, 또는 5-8 엔도시클릭(endocyclic) 원자를 갖는 아릴 기이며;
R'''은 카르보닐 유도체*- (C=O)-, * - (C=O)-(CH2)1-8-S-S-, *- (C=O)-(CH2)1-8-(C=O)-O-, *- (C=O)-(CH2)1-8-O-(C=O)-, * - (C=O)-(CH2)1-8-(C=O)-NH- , 또는 *- (C=O)-(CH2)1-8-NH-(C=O)-, 또는 대안적으로, R'''은 *- (C=O)-O-(CH2)1-8-S-S-, *- (C=O)-O-(CH2)1-8-(C=O)-O- ,*- (C=O)-O-(CH2)1-8-O-(C=O)-, *- (C=O)-O-(CH2)1-8-(C=O)-NH- , 또는 *- (C=O)-O-(CH2)1-8-NH-(C=O)- 형태의 카르보닐 유도체이며, 여기서 "*"는 숙신이미딜(succinimidyl) 또는 벤조트리아졸(benzotriazolyl) 기들에 부착 지점을 나타내고;
X 및 Y는 각각의 활성화제(active agent), 링커, 단량체 또는 개시제 단편 I이다.
-C(O)NR1aR1b, -NR1aR1b, C1 -6　알킬-NR1aR1b, -N(R1a)C(O)R1b, -N(R1a)C(O)또는1 b, -N(R1a)C(O)NR1aR1b, -OP(O)(OR1a)2, -S(O)2OR1a, -S(O)2NR1aR1b, -CN, -NO2, 시클로알킬, 헤테로시클로알킬, 아릴 및 헤테로아릴.
E. 기능성 작용제
본 발명의 고분자량 중합체에 유용한 기능성 작용제는 특정 리간드,수용체(receptor), 복합체(complex), 세포기관(organelle), 세포, 조직, 상피막(epithelial sheet) 또는 기관을 타겟화(targeting)할 수 있거나 특정 조건 또는 질병 상태를 치료할 수 있는 임의의 생물학적 작용제 또는 합성 화합물을 포함한다. 일부 구현예에서, 생물활성 작용제는 약물, 치료적(치료적) 단백질, 저 분자, 펩티드, 펩토이드(peptoid), 올리고뉴클레오티드 (앱타머, siRNA, 마이크로RNA), 나노파티클, 탄수화물, 지질, 당지질, 인지질, 또는 타겟화 제(targeting agent)이다. 본 발명의 고분자량 중합체에 유용한 다른 기능성 작용제는 방사성표지, 조영제, 형광단 및 염료를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
기능성 작용제는 고분자량 중합체의 개시제 단편 I 또는 라디칼 청소부 (scavenger) I' 또는 둘 모두에 연결될 수 있다. 기능성 작용제는 상기에서 기술된 절단성 또는 비-절단성 링커를 통한 중합(polymerization)전 후에 개시제 단편 I 또는 라디칼 청소부 (scavenger) I' 양쪽에 연결될 수 있다. 기능성 작용제는 또한, 공유적 결합 대신 고분자량 중합체에 물리적 흡착 또는 이온적으로 흡수 될 수 있다.
기능성 작용제에 연결되는 본 발명의 고분자량 중합체의 제조는 첫째, 기능성 작용제를 개시제 단편에 부착된 연결기에 연결하고, 연결된 기능성 작용제를 본 발명의 고분자량 중합체 합성에 적합한 상태로 만듦으로써, 유도할 수 있다. 그러한 경우, 적합한 연결기는 ATRP 반응에 사용하기 위한 개시제 (예를 들면, 요오드화, 브롬화 또는 염소화된 화합물/기)일 수 있다. 기능성 작용제가 중합체 중합 반응 및 임의의 이어서 요구되는 시안과 양립 가능한 경우, 이러한 반응 계획은 가능하다. 그러나, 기능성 작용제의 미리 형성된 고분자량 중합체로의 결합은 기능성 작용제가 중합에 적합한 조건과 양립되지 않는 곳에도 사용될 수 있다. 또한, 비용으로 인해 합성 수득률을 불완전하게 하는 작용제의 부족을 초래하는 경우, 종종 다단계 합성 반응에서 특별히 접하게 되는, 미리 만들어진 본 발명의 고분자량 중합체에 기능성 작용제의 결합이 채용될 수 있다.
기능성 작용제가 중합 반응을 위해 채용된 조건에 맞지 않는 경우, 기능성 작용제를 중합반응 뒤에 도입하는 것이 바람직 할 수 있다.
생물활성 작용제는 광범위하게 선택될 수 있다. 일부 구현예에서 생물활성 작용제는 하나 이상의 약물, 백신, 앱타머(aptamers), 인간 A 도메인 스캐폴드(scafolds)에 의한 아비머 스캐폴드(avimer scaffolds), 디아바디, 카멜리드(camelids), 샤크 IgNAR 항체, 완환된 특이성을 갖는 피브로넥틴 타입Ⅲ스캐폴드, 항체, 항체 단편, 비타민 및 보조인자, 다당류, 탄수화물, 스테로이드, 지질, 지방, 단백질, 펩티드, 폴리펩티드, 뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드, 및 핵산(예를 들면, mRNA, tRNA, snRNA, RNAi, 마이크로RNA, DNA, cDNA, 안티센스 구성체들, 리보짐(ribozymes) 등, 및 이들의 조합들)로부터 선택될 수 있다. 일 구현예에서, 생물활성 작용제는 단백질, 펩티드, 폴리펩티드, 수용성 또는 세포-결합성, 세포 밖 또는 세포 안의, 키네신, 분자 모터, 효소, 세포 밖 매트릭스 물질 및 이들의 조합들로 부터 선택될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 생물활성 작용제는 뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드, 및 핵산(예를 들면, mRNA, tRNA, snRNA, RNAi, DNA, cDNA, 안티센스 구성체들, 리보짐(ribozymes) 등 및 이들의 조합들)으로 부터 선택될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 생물활성 작용제는 스테로이드, 지질, 지방 및 이들의 조합들로 부터 선택될 수 있다. 예를 들면, 생물활성 작용제는 세포 밖 매트릭스에 결합할 수 있는데, 예를 들면, 세포 밖 매트릭스가 히알루론산 또는 헤파린 술페이트 프로테오글리칸이고, 생물활성 작용제는 비-특이적, 정진기적, 벨크로(Velcro) 형태 결합 인터랙션을 위한 콜린과 같은 양전하를 갖는 모이어티일 때이다.
생물활성 작용제는 완전한 활성(고 레벨의 아고니즘 또는 안타고니즘과 같은)을 갖도록 설계 및/또는 선택될 수 있다. 대안적으로, 다 기능성의 생물활성 작용제는 완전히 다른 것과 충돌하는 동안 하나의 타겟 단백질의 활성을 조절하기 위하여 선택될 수 있다.
모자이크 단백질이 세포 밖 결합 도메인 또는 서브-도메인(예를 들면, VEGF 및 헤파린 결합 상피 성장 인자)를 포함하는 것처럼, 이러한 결합 지점들로 부터 서열은 중합체 부착을 위한 생물활성 작용제로서 복제될 수 있다. 보다 광범위하게, 모자이크 단백질은 많은 기능성(타겟 결합, 세포밖 매트릭스 결합, 스페이서, 어비디티(avidity) 증가, 효소적)도메인의 스트링(strings)을 나타낸다. 특정 적용을 위해 선택된 생물활성화제 세트는 요망되는 기능성 활성화제 세트를 복제하는 것과 유사한 방법으로 어셈블(assembled) 될 수 있다.
다른 기능성 작용제, A는 콜린, 리신, 아스파트 산, 글루타민 산 및 히알루론 산과 같은 그들 중에 전하를 띄는 종을 포함한다. 전하를 띄는 종은 이온성 부착, 예를 들어 유리(vitreous)로 촉진하는데 유용하다.
치료적 단백질 및 항체
하나의 특별히 유용한 구체예에서, 기능성 작용제는 치료적 단백질이다. 많은 치료적 단백질들은 본 출원을 통하여 에리스로포이에틴, 과립구집락자극인자(granulocyte colony stimulating factor, G-CSF), GM-CSF, 인터페론 알파, 인터페론 베타, 인간 성장 호르몬, 이미글루세라제(imiglucerase) 및 RANK 리간드와 같이, 제한됨 없이 개시되었다.
일 구체예에서, 기능성 작용제는 구체적으로 밝혀진 다당류, 단백질 또는 펩티드 생물활성 작용제로부터 선택될 수 있는데, 다음을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다: Aβ, 어갈시다제(agalsidase), 아레파셉트(alefacept), 알카리포스파타제, 아스파라기나아제(aspariginase), 암독소비어(amdoxovir)(DAPD), 안티드(antide), 베캅러민(becaplermin), A 타입 및 B 타입을 포함하는 보툴리눔 톡신과 보툴리눔 톡신 활성을 갖고 더 낮은 분자량 화합물, 칼시토닌, CD1d, 시아노비브린(cyanovirin), 데니류킨 디프티톡스(denileukin diftitox), 에리스로포이에틴 (EPO), EPO 작용제, 도르나제(dornase) 알파, 적혈구 생성 자극 단백질(NESP), V 인자, VII 인자, VIIa 인자, VIII 인자, VIII 인자가 빠진 도메인 B, IX 인자, X 인자, XII 인자, XIII 인자, 폰빌레브란트 인자와 같은 응고인자; 세레다제(ceredase), Fc 감마 r2b, 세레짐(cerezyme), 알파-글루코시다제, N-아세틸갈락토자민-6-술페이트 설파타제, 콜라겐, 시클로스포린, 알파 디펜신, 베타 디펜신, 디스모프레신, 익스펜딘-4, 사이토카인, 사이토카인 수용체, 과립구집락자극인자(G-CSF), 트롬보포이에틴(TPO),알파-1 프로테이나제 저해제, 과립구대식세포집락자극인자(granulocyte macrophage colony stimulating factor,GM-CSF), 피브리노겐, 필그래스팀(filgrastim), 성장 호르몬 인간성장 호르몬(hGH), 소마트로핀, 성장 호르르몬 촉진 호르몬(GHRH), GRO-베타, GRO-베타 항체, 뼈 모르포겐성 단백질-2, 뼈 모르포겐성 단백질-6, 부갑상선 호르몬, 부갑상선 관련 펩티드, OP-1과 같은 뼈 모르포겐성 단백질; 산성 섬유아 세포 성장인자(fibroblast 성장 factor), 염기성 섬유아 세포 성장인자, 섬유아 세포 성장 인자 21, CD40 리간드, ICOS, CD28, B7-1, B7-2, TLR 및 기타 선천적 면역 수용체, 헤파린, 인간 세럼 알부민, 저 분자량 헤파린(LMWH), 인터페론 알파, 인터페론 베타, 인터페론 감마, 인터페론 오메가, 인터페론 타우, 공통 인터페론; 인터류킨-1 리셉터, 인터류킨-2, 인터류킨-2 융합 단백질, 인터류킨-1 수용체 길항제, 인터류킨-3, 인터류킨-4, 인터류킨-4 수용체, 인터류킨-6, 인터류킨-8, 인터류킨-12, 인터류킨-17, 인터류킨-21, 인터류킨-13 수용체, 인터류킨-17 수용체와 같은 인터류킨 및 인터류킨 수용체; 락토페린 및 락토페린 파편, 황체 형성 호르몬 촉진 호르몬(LHRH), 인슐린, 프로-인슐린, 인슐린 유사체, 아밀린, C-펩티드, 소마토스타틴, 옥트레오티드(octreotide)를 포함하는 소마토스타틴 유사체, 바소프레신, 여포 자극 호르몬(FSH), 이미글루세라제(imiglucerase), 인플루엔자 백신, 인슐린-유사 성장 인자(IGF), 인슐린트로핀, 대식세포 집락자극인자(M-CSF), 알테플라제(alteplase), 유로키나제(urokinase), ㄹ리테플라제(reteplase), 스트렙토키나제(streptokinase), 파미테플라제(pamiteplase), 라노테플라제(lanoteplase) 및 테네테플라제(teneteplase)와 같은 플라즈미노겐 활성화제; 신경 성장 인자(NGF), trk A, trk B, 오스테오프로테게린(osteoprotegerin), 혈소판-유래 성장 인자, 조직 성장 인자, 형질전환 성장 인자-1, 혈관 내피(vascular endothelial) 성장 인자, 백혈병 저해 인자, 케라틴세포생장인자(KGF), 신경교 성장 인자(GGF), T 세포 수용체, CD 분자/항원, 종양 괴사 인자 (TNF) (예를들면, TNF-α 및 TNF-β), TNF 수용체(예를 들면, TNF-α수용체 및 TNF-β수용체), CTLA4, CTLA4 수용체, 모노사이트 키모어트랙턴트(monocyte chemoattractant) 단백질-1, 내피세포증식인자, 부갑상선 호르몬(PTH), PTHrP, 글루카곤-유사 펩티드, 소마토트로핀, 티모신 알파 1, 라스부리카제(rasburicase), 티모신 알파 1 IIb/IIIa 저해제, 티모신 베타 10, 티모신 베타 9, 티모신 베타 4, 알파-1 안티트립신, 포스포디에스테라아제(PDE) 화합물, VLA-4(very late antigen-4), VLA-4 저해제, 비스포스포네이트(bisphosponates), 호흡기 합포 바이러스 항체, 낭포성섬유종유발세포막단백질(cystic fibrosis transmembrane regulator, CFTR)유전자, 디옥시리보뉴클레아제(Dnase), 살균성/투과성 증가 단백질(BPI), 및 안티-CMV 항체. 모범적인 모노클로날 항체들은 이타네르셉트(etanercept)(IgG1의 Fc 부분에 연결된 인간 75 kD TNF 수용체의 세포외 리간드-결합 부분으로 구성된 2분자체 융합 단백질), 압시지맙(abciximab), 아달리무맙(adalimumab), 아펠리모맙(afelimomab), 알레튜주맙(alemtuzumab), B-림프구 항체, 아트리주맙(atlizumab), 바실리지맙(basiliximab), 베박시주맙(bevacizumab), 비시로맙(biciromab), 벌티리무맙(bertilimumab), CDP-484, CDP-571, CDP-791, CDP-860, CDP-870, 세투지맙(cetuximab), 클레노리지맙(clenoliximab), 다클리주맙(daclizumab), 에쿨리주맙(eculizumab), 에드레콜로맙(edrecolomab), 에팔리주맙(efalizumab), 에파투주맙(epratuzumab), 폰토리주맙(fontolizumab), 가빌리모맙(gavilimomab), 겜투주맙 오조가미신(gemtuzumab ozogamicin), 입리투모맙 티우제탄(ibritumomab tiuxetan), 인플리지맙(infliximab), 이놀리모맙(inolimomab), 켈리지맙(keliximab), 라베투주맙(labetuzumab), 레르델리무맙(lerdelimumab), 올리주맙(olizumab), 방사성 표지된 lym-1, 메텔리무맙(metelimumab), 메폴리주맙(mepolizumab), 미투모맙(mitumomab), 뮤로모나드(muromonad)-CD3, 네바쿠맙(nebacumab), 나타리주맙(natalizumab), 오둘리모맙(odulimomab), 오말리주맙(omalizumab), 오레고보맙(oregovomab), 팔리비주맙(palivizumab), 펨투모맙(pemtumomab), 펙셀리주맙(pexelizumab), rhuMAb-VEGF, 리투지맙(rituximab), ㅅ사투모맙 펜데티드(satumomab pendetide), 세비루맙(sevirumab), 시플리주맙(siplizumab), 토지투모맙(tositumomab),I131토지투모맙(tositumomab), 트래스투주모맙(trastuzumab), 투비루맙(tuvirumab), 비실리주맙(visilizumab) 및 이들의 단편들 및 유사제들을 포함한다.
일 구현예에서, 생물활성 작용제는 융합 단백질이다. 예를 들면, 생물활성 구성요소는 면역글로불린 또는 하나 이상의 어떤 유용한 펩티드 시퀀스에 융합된 면역 글로불린의 부분일 수 있지만, 제한되지 않는다. 예를 들면, 생물활성 작용제는 항체 Fc 단편을 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 생물활성 작용제는 CTLA4 융합 단백질일 수 있다. 예를 들면, 생물활성 작용제는 Fc-CTLA4 융합 단백질일 수 있다. 또 다른 구현예에서, 생물활성 작용제는 VIII인자 융합 단백질이다. 예를 들면, 생물활성 작용제는 Fc-VIII 인자 융합 단백질일 수 있다.
특정 유용한 일 구현예에서, 생물활성 작용제는 인간 단백질 또는 인간 폴리펩티드, 예를 들면, 이종의 방법으로(heterologously) 생산된 인간 단백질 또는 인간 폴리펩티드이다. 인간 형태(예를 들면, 단백질 또는 펩티드는 인체내의 인간 세포내에서 정상적으로 생성된 것임)에 대응하는 수많은 단백질 및 폴리펩티드가 여기에 개시되었다. 그러므로, 일 실시예에서, 생물활성 작용제는 여기서 인간형태로 개시되어 있는 각각의 단백질 및 폴리펩티드의 인간 형태이다. 이러한 인간 단백질의 예로서, 과립구 집락 자극요인, 과립구 대식세포 집락 자극 요인, 인터페론(예를들면, 알파 인터페론 및 베타 인터페론), 인간 성장 호르몬 및 에리스로포이에틴과 같은 인간 항체, 인간 효소, 인간 호르몬 및 인간 싸이토카인을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
생물활성 작용제의 역할을 할 수 있는 치료적 단백질의 다른 예들은(그들 자체 또는 항체 또는 항체 단편 또는 비-항체 단백질의 타겟으로서), VIII 인자, VIII 인자가 빠진 b-도메인, VIIa 인자, IX 인자, X 인자, 항응고인자; 히루딘, 알테플라제(alteplase), 조직플라스미노젠활성물질(tpa), 레테플라제(reteplase),tpa, 누락된 5 도메인들의 tpa-3, 인슐린, 인슐린 리스프로(lispro), 인슐린 아스파트(aspart), 인슐린 글라진(glargine), 장시간 작용하는 인슐린 아날로그(analogs), 보체 C5, hgh, 글루카곤, tsh, 폴리트로핀-베타, fsh, gm-csf, pdgh, ifn 알파2, ifn 알파2a, ifn 알파2b, inf-알파1, 공통 ifn, ifn-베타, ifn-베타 1b, ifn-베타 1a, ifn-감마 (예를 들면, 1 및 2), ifn-람다, ifn-델타, il-2, il-11, hbsag, ospa, t-림프구 항원을 겨냥하는 뮤린 항체(murine mab), tag-72를 겨냥하는 뮤린 항체(murine mab), 종양 관련 당단백질, 혈소판 표면 수용체gpII(b)/III(a)를 겨냥하는 키메릭 항체로 부터 유래된 fab 단편, 종양 관련 항원 ca125을 겨냥하는 뮤린 항체 단편, 리실 옥시다제(lysyl oxidase), LOX2, 인간 암배아성(carcinoembryonic) 항원을 겨냥하는 뮤린 항체 단편, cea, 인간 심장의 미오신을 겨냥하는 뮤린 항체 단편, 종양 표면 항원 psma를 겨냥하는 뮤린 항체 단편, hmw-maa를 겨냥하는 뮤린 항체 단편들(fab/fab2 혼합), 칼시노마-관련 항원을 겨냥하는 뮤린 항체 단편(fab), nca 90을 겨냥하는 단일 클론의 항체(mab) 단편들(fab), 표면 과립구 비특정 교차 반응 항원, b 림프구의 표면에서 발견된 cd20 항체를 겨냥하는 키메릭 항체, il2 수용체의 알파 체인을 겨냥하는 인간화 항체(humanized mab), il2 수용체의 알파 체인을 겨냥하는 키메릭 항체, tnf-알파를 겨냥하는 키메릭 항체, RS(respiratory synctial)바이러스 표면 위의 에피토프를 겨냥하는 인간화 항체, her 2를 겨냥하는 인간화 항체, 인간 상피(epidermal) 성장요인 수용체 2, 싸이토케라틴 ㅈ종양-관련 항원 항-ctla4를 겨냥하는 인간 항체(mab), b 림프구 도르나제-알파 디나제(dornase-alpha dnase)의 cd 20 표면 항체를 겨냥하는 키메릭 항체, 베타 글루코세레브로시다제(glucocerebrosidase), tnf-알파, il-2-디프테리아 톡신 융합 단백질, tnfr-lgg 단편 융합 단백질 라로니다제(laronidase), DNA아제(dnaases), 알레파셉트(alefacept), 다베포에틴(darbepoetin)알파 (집락 자극 요인), 토시투모맙(tositumomab), 뮤린 mab, 알레투주맙(alemtuzumab), 라스부리카제(rasburicase), 아갈시다제(agalsidase) 베타, 테리파라티드(teriparatide), 부갑상선 호르몬 유도체, 아달리무맙(adalimumab)(lgg1), 아나킨라(anakinra), 생물학적 모디파이어(modifier), 네시리티드(nesiritide), 인간 b-타입 나트륨이뇨(natriuretic)펩티드 (hbnp), 집락 자극 요인들, 페그비소먼트(pegvisomant), 인간 성장 호르몬 수용체 길항제, 재조합 활성 단백질 c, 오말리주맙(omalizumab), 면역글로불린 e (lge) 차단제, 입리투모맙 티우제탄(lbritumomab tiuxetan), ACTH, 글루카곤, 소마토스타틴, 소마토트로핀, 티모신, 부갑상선 호르몬, 피그멘터리 호르몬, 소마토메딘, 에리스로포이에틴, 황체 형성 호르몬, 융모성 고나트로핀, 뇌하수체 분비 요인, 에타널셉트(etanercept), 항이뇨 호르몬, 프로락틴 및 갑상선 자극 호르몬을 제한됨 없이, 포함한다. 그리고 이들 중 어느 것도 천연 (예를 들면, 세린- 시스테인 치환) (예를 들면, 레드우드 바이오사이언스의 방법에 대한 포밀알데히드) 또는 비-천연 아미노 산을 사용하여,위치-특정 컨쥬게이션 포인트(N-말단, 또는 C-말단, 또는 기타 위치)를 갖도록 변경될 수 있다. 비-천연 아미노 산 잔기(들)은 당다음으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다: 아지도노르류신(azidonorleucine), 3-(1-나프틸)알라닌, 3-(2-나프틸)알라닌, p-에티닐-페닐알라닌, p-프로파르글리-옥시-페닐알라닌, m-에티닐-페닐알라닌, 6-에티닐-트립토판, 5-에티닐-트립토판, (R)-2-아미노-3-(4-에티닐-1H-피롤-3-일)프로파닉 에시드(propanic acid), p-브로모페닐알라닌, p-아이오도페닐알라닌, p-아지도페닐알라닌, p-아세틸페닐알라닌, 3-(6-클로로인도릴)알라닌, 3-(6-브로모인도릴)알라닌, 3-(5-브로모인도릴)알라닌, 아지도호모알라닌, 호모프로파르길글리신, p-클로로페닐알라닌, α-아미노카프릴 산, O-메틸-L-티로신, N-아세틸갈락토자민-α-트레오닌, 및 N-아세틸갈락토자민-α-세린.
(스스로 또는 이런 항체의 단편으로) 생물활성제로서의 역할을 할 수 있는 치료적 항체의 예는 전이성 유방암을 가진 환자의 치료를 위한 인간화된 항 HER2 단일 클론 항체인 허셉틴(HERCEPTINTM) (Trastuzumab) (Genentech, CA); 응혈 형성의 방지를 위한 혈소판 상의 항 당단백질 IIb/IIIa 수용체인 레오프로(REOPROTM) (abciximab) (Centocor); 급성 신장 동종이식편 거부반응의 방지를 위한 면역억제성, 인간화된 항-CD25 단일 클론 항체인 제나팍스(ZENAPAXTM) (daclizumab) (Roche Pharmaceuticals, Switzerland); 쥣과(murine) 항-l7-IA 세포 표면 항원 IgG2a 항체 (Glaxo Wellcome/Centocor)인 파노렉스(PANOREX™); 쥣과 항-유전자형 (GD3 에피토프) IgG 항체 (ImClone System)인 BEC2; 키메라 항-EGFR IgG 항체 (ImClone System)인 IMC-C225; 인간화된 항-αVβ3 인테그린 항체 (Applied Molecular Evolution/MedImmune)인 비탁신(VITAXIN™); 캠패스(Campath); 인간화된 항 CD52 IgG1 항체 (Leukosite)인 캠패스 1H/LDP-03; 인간화된 항 CD33 IgG 항체 (Protein Design Lab/Kanebo)인 스마트(Smart) M195; 키메라 항 CD2O IgG1 항체 (IDEC Pharm/Genentech, Roche/Zettyaku)인 리툭산(RITUXAN™); 인간화된 항-CD22 IgG 항체 (Immunomedics)인 림포사이드(LYMPHOCIDE™); 인간화된 항-ICAM3 항체 (ICOS Pharm)인 ICM3; 영장류 항-CD80 항체 (IDEC Pharm/Mitsubishi)인 IDEC-114; 방사성표시된 쥣과 항-CD20 항체 (IDEC/Schering AG)인 제발린(ZEVALIN™); 인간화된 항-CD40L 항체 (IDEC/Eisai)인 IDEC-13l; 영장류화된(primatized) 항-CD4 항체 (IDEC)인 IDEC-151; 영장류화된 항-CD23 항체 (IDEC/Seikagaku)인 IDEC-152; 인간화된 항 CD3-IgG (Protein Design Lab)인 스마트 항-CD3; 인간화된 항-보완 인자 5 (CS) 항체 (Alexion Pharm)인 5G1.l; 인간화된 항-TNF-α 항체 (CATIBASF)인 D2E7; 인간화된 항-TNF-α Fab 단편 (Celltech)인 CDP870; 영장류화된 항-CD4 IgG1 항체 (IDEC Pharm/SmithKline Beecham)인 IDEC-151; 인간 항-CD4 IgG 항체 (Medarex/Eisai/Genmab)인 MDX-CD4; 인간화된 항-TNF-α IgG4 항체 (Celltech)인 CDP571; 인간화된 항-α4β7 항체 (LeukoSite/Genentech)인 LDP-02; 인간화된 항-CD4 IgG 항체 (Ortho Biotech)인 OrthoClone OKT4A; 인간화된 항-CD40L IgG 항체 (Biogen)인 안토바(ANTOVA™); 인간화된 항-VLA-4 IgG 항체 (Elan)인 안테그렌(ANTEGREN™); 인간 항-TGF-β2 항체 (Cambridge Ab Tech)인 CAT-152; 단일 클론 항-EGF 수용체 (EGFr) 항체인 세툭시맙(Cetuximab) (BMS); 항-VEGF 인간 단일 클론 항체인 베바시주마(Bevacizuma) (Genentech); 자가면역 장애를 치료하는데 사용되는 키메라 (마우스 및 인간) 단일 클론 항체인 인플릭시맙(Infliximab) (Centocore, JJ); 화학요법에 사용되는 단일 클론 항체인 젬투주맙 오조가마이신(Gemtuzumab ozogamicin) (Wyeth); 및 황반변성을 치료하는데 사용되는 키메라 (마우스 및 인간) 단일 클론 항체인 라니비주맙(Ranibizumab) (Genentech)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
단일 영역 항체와 같은, 다른 항체가 본 발명에서 유용하다. 단일 영역 항체 (Ablynx에 의해서 나노바디(Nanobody)로 불리는, sdAb)는 단일 단량체의 가변적인 항체 영역으로 이루어지는 항체 단편이다. 모든 항체와 같이, 단일 영역 항체는 특정 항원에 선택적으로 결합될 수 있다. 단지 12-15 kDa의 분자량을 가진, 단일 영역 항체는 보통 항체(150-160 kDa)보다 훨씬 작다. 단일 영역 항체는 중쇄 항체의, 또는 보통 IgG의 하나의 가변적인 영역 (VH)을 포함하는, 약 110개의 아미노산 길이의 펩티드 사슬이다.
모든 항체와 달리, 단일 영역 항체들은 보체계 촉발된(triggered) 세포독성을 보이지 않는데 왜냐하면 이들은 Fc 영역이 부족하기 때문이다. 낙타류(camelid) 및 어류 유래 단일 영역 항체들은 모든 항체에, 예를 들어 효소의 활성 위치에 접근 가능하지 않은 숨겨진 항원에 결합될 수 있다.
단일 영역 항체 (sdAb)은 원하는 항원과의 단봉 낙타(dromedaries), 카멜(camels), 라마, 알파카 또는 상어의 면역법 및 그 다음의 중쇄 항체를 위한 mRNA 코딩의 분리에 의해서 얻어질 수 있다. 대안적으로 이들은 합성 라이브러리를 스크리닝함으로써 만들어질 수 있다. 낙타류는 아목 타이로포다(suborder Tylopoda) 중 오직 살아 있는 과인, 생물학적 낙타과(family Camelidae)의 구성원이다. 카멜(Camels), 단봉 낙타(dromedaries), 쌍봉 낙타(Bactrian Camels), 라마(llamas), 알파카(alpacas), 비큐나(vicunas), 및 과나코(guanacos)가 이 군에 속한다.
단백질, 펩티드 및 아미노산
본원에 개시된 생물활성제로서 사용하기 위한 단백질 및 펩티드는 인 비트로 합성에 의한 그리고 생물학적 계의 생산에 의한 생산을 포함하는 임의의 유용한 방법에 의해서 생산될 수 있다. 당해 기술분야에서 주지된 인 비트로 합성 방법의 전형적인 예는 고체상 합성 ("SPPS") 및 고체상 단편 축합 ("SPFC")을 포함한다. 단백질의 생산을 위해서 사용되는 생물학적 계도 또한 당해 기술분야에서 잘 알려져 있다. 박테리아 (예컨대, E coli 및 Bacillus sp .) 및 이스트 (예컨대, Saccharomyces cerevisiae 및 Pichia pastoris)는 이종 단백질의 생산을 위해서 널리 사용된다. 게다가, 본원에 개시된 것과 같이 사용하기 위한 생물활성제의 생산을 위한 이종 유전자 발현은 포유류 세포계 (예컨대, CHO 세포)와 같은 동물 세포계를 사용함으로써 달성될 수 있다. 한 특히 유용한 구현예에서, 생물활성제는 유전자 이식 또는 복제 동물, 예컨대 암소, 양, 염소 및 조류 (예컨대, 닭, 메추라기, 오리 및 칠면조)에서 생산되며, 각각은 그대로 당해 기술분야에서 이해된다. 예를 들어, 2004년 8월 24일에 공표된, 미국특허 제6,781,030호를 보라. 이에 개시된 내용은 참조에 의해서 이의 전체로서 본원에 포함된다.
닭과 같은 길들인 조류에서 생성된 단백질과 같은 생물활성제는 "조류 유래" 생물활성제 (예컨대, 조류 유래 치료적 단백질)로 언급될 수 있다. 조류 유래 치료적 단백질의 생산은 당해 기술분야에 공지되어 있으며, 예를 들어, 2004년 5월 4일에 공표된, 미국특허 제6,730,822호에 기재되어 있으며, 이에 개시된 내용은 참조에 의해서 이의 전체로서 본원에 포함된다.
생물활성제가 단백질 또는 폴리펩티드인 경우의 구현예에서, 단백질 폴리펩티드 시퀀스의 아미노산에 존재하는 작용기는 작용제를 고분자량 중합체에 연결하는데 사용될 수 있다. 단백질 또는 폴리펩티드 생물활성제에 대한 연결은 이들의 시퀀스 내에서 자연적으로 발생하는 아미노산에 또는 그 시퀀스에 추가되거나 또 다른 아미노산 대신에 삽입된(예를 들어 세린의 시스테인으로의 교체) 자연적으로 발생하는 아미노산에 만들어질 수 있다.
본 발명에 유용한 펩티드는 또한 대환식 펩티드, 시클로티드, 앱타머, LDL 수용체 A-영역, (미국특허 제60/514,391호에 설명된 것과 같은) 단백질 스캐폴드, 가용성 수용체, 효소, 펩티드 다합체, 영역 다합체, 항체 단편 다합체, 및 융합 단백질을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
단백질 또는 폴리펩티드 생물활성제는 또한 단백질 및 폴리펩티드에서 발견되는 보통의 자연적으로 발생하는 아미노산에 더하여 비자연적으로 발생하는 아미노산을 포함할 수 있다. 폴리펩티드 또는 단백질의 특성을 변경하는 목적을 위해 존재하는 것에 더하여, 비자연적으로 발생하는 아미노산은 단백질 또는 폴리펩티드를 고분자량 중합체에 직접 연결하는데 사용될 수 있는 작용기를 제공하기 위해 도입될 수 있다. 더욱이, 자연적으로 발생하는 아미노산, 예컨대, 시스테인, 타이로신, 트립토판은 이 방법에서 사용될 수 있다.
비자연적으로 발생하는 아미노산은 여러 가지 수단에 의해서 단백질 및 펩티드 내로 도입될 수 있다. 비자연적인 아미노산의 도입에 대한 일부 기술이 미국특허 제5,162,218호 및 미국특허 제20080214439호에 설명되어 있으며, 이에 개시된 내용은 참조에 의해서 이의 전체로서 본원에 포함된다. 첫째, 비자연적으로 발생하는 아미노산은 아미노산 측 사슬 위의 또는 아미노 말단 또는 카르복실 말단에서의 폴리펩티드 또는 단백질의 화학적 변형에 의해서 도입될 수 있다. 단백질 또는 펩티드의 화학적 변형의 비제한적인 예는 디아조메탄과 같은 작용제에 의한 메틸화, 또는 리신 측 사슬에 존재하는 아미노기에서의 또는 펩티드 또는 단백질의 아미노 말단에서의 아세틸화의 도입일 수 있다. 비자연적인 아미노산을 제조하기 위한 단백질/폴리펩티드 아미노기 변형의 또 다른 예는 1차 아민을 갖는 단백질 또는 폴리펩티드 내의 위치에 연결된 작용성을 갖는 티올 (설프히드릴, -SH)을 도입하기 위한 메틸 3-메르캅토프로피온이미데이트 에스테르 또는 2-이미노티로란의 사용이다. 도입될 때, 이 기는 단백질 또는 폴리펩티드에 대한 공유 결합을 형성하는데 이용될 수 있다.
둘째, 비자연적으로 발생하는 아미노산은 화학적 합성 동안에 단백질 및 폴리펩티드 내로 도입될 수 있다. 합성 방법은 약 200 개보다 적은 아미노산을 갖는, 흔히 약 150 개보다 적은 아미노산을 갖는, 더 흔히 100개 이하의 아미노산을 갖는 폴리펩티드를 제조하는데 일반적으로 이용된다. 약 75 개 미만 또는 약 50 개 미만의 아미노산을 갖는 더 짧은 단백질 또는 폴리펩티드는 화학적 합성에 의해서 제조될 수 있다. 비자연적인 아미노산의 원하는 위치로의 삽입을 허용하기 위해 특히 편리한 합성 제조 방법은 당해 기술분야에서 공지되어 있다. 적합한 합성 폴리펩티드 제조 방법은 메리필드 고체상 합성 방법에 기초를 두고 있으며 여기서 아미노산은 성장하는 사슬에 순차적으로 첨가된다(Merrifield (1963) J. Am. Chem. Soc. 85:2149 2156). 이런 기술로 폴리펩티드를 합성하기 위한 자동화 시스템은 이제 Applied Biosystems, Inc., Foster City, Calif. 94404; New Brunswick Scientific, Edison, N.J. 08818; 및 Pharmacia, Inc., Biotechnology Group, Piscataway, N.J. 08854와 같은 공급자로부터 상업적으로 구입가능하다.
폴리펩티드의 화학적 합성 동안에 도입될 수 있는 비자연적으로 발생하는 아미노산의 예는 20개의 자연적으로 발생하는 아미노산의 D-아미노산 및 D 및 L-형의 혼합물, N-포르밀 글리신, 오르니틴, 노르류신, 히드록시프롤린, 베타-알라닌, 히드록시발린, 노르발린, 페닐글리신, 시클로헥실알라닌, 3차부틸글리신 (t-류신, 2-아미노-3,3-디메틸부탄산), 히드록시-3차-부틸글리신, 아미노 부티르산, 시클로류신, 4-히드록시프롤린, 피로글루탐산 (5-옥소프롤린), 아제티딘 카르복실산, 피페콜린산, 인돌린-2-카르복실산, 테트라히드로-3-이소퀴놀린 카르복실산, 2,4-디아미노부티르산, 2,6-디아미노피멜산, 2,4-디아미노부티르산, 2,6-디아미노피멜산, 2,3-디아미노프로피온산, 5-히드록시리신, 뉴라민산, 및 3,5-디아이오도타이로신을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
셋째, 비자연적으로 발생하는 아미노산은 비자연적인 아미노산이 삽입될 위치에 대응하는 코돈에 폴리펩티드를 인코딩하는 DNA 시퀀스 (예컨대, 유전자) 내의 무의미 코돈 (예컨대, 앰버 또는 오커 코돈)의 삽입에 의해서 인 비보 또는 인 비트로 생물학적 합성을 통하여 도입될 수 있다. 이런 기술은 예를 들어 미국특허 제5,162,218호 및 제6,964,859호에 설명되어 있으며, 이에 개시된 내용은 참조에 의해서 이의 전체로서 본원에 포함된다. 여러 가지 방법이 돌연변이생성 유도된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 돌연변이 코돈을 삽입하는데 사용될 수 있다. 변경된 시퀀스는 그 뒤에 원하는 비자연적으로 발생하는 아미노산으로 화학적으로 도는 효소로 아실화된 무의미 코돈에 대항하도록 유도된, 억제자 tRNA를 제공하는 시스템 내에서 인 비보 또는 인 비트로로 전사되고 번역된다. 합성 아미노산은 무의미 코돈에 대응하는 위치에 삽입될 것이다. 더 큰 그리고/또는 글리코실화된 폴리펩티드의 제조를 위해서, 이 유형의 재조합 제조 기술이 보통 선호된다. 아미노산 중에서 이 방식으로 도입될 수 있는 것은 포르밀 글리신, 플루오로알라닌, 2-아미노-3-메르캅토-3-메틸부탄산, 호모시스테인, 호모아르기닌 등이다. 단백질 내에 비자연적인 아미노산을 얻기 위한 다른 유사한 방법은 메티오닌 치환 방법을 포함한다.
비자연적으로 발생하는 아미노산이 선택적인 변형에 민감한 작용성을 가지는 경우에, 이들은 단백질 또는 폴리펩티드에 대한 공유 결합을 형성하는데 특히 유용하다. 작용성이 선택적인 변형에 민감한 환경은 작용성이 유일한 경우 또는 관심 조건 하에서 반응할 수 있는 다른 작용성이 입체화학적으로 숨겨지거나 또는 그 반대의 경우를 포함한다.
단일 영역 항체와 같은, 다른 항체는 본 발명에서 유용하다. 단일 영역 항체 (Ablynx에 의해서 나노바디(Nanobody)로 불리는, sdAb)는 단일 단량체의 가변적인 항체 영역으로 이루어지는 항체 단편이다. 모든 항체와 같이, 단일 영역 항체는 특정 항원에 선택적으로 결합될 수 있다. 단지 12-15 kDa의 분자량을 가진, 단일 영역 항체는 보통 모든 항체(150-160 kDa)보다 훨씬 작다. 단일 영역 항체는 중쇄 항체의, 또는 보통 IgG의 하나의 가변적인 영역 (VH)을 포함하는, 약 110개의 아미노산 길이의 펩티드 사슬이다.
모든 항체와 달리, 단일 영역 항체들은 보체계 촉발된(triggered) 세포독성을 보이지 않는데 왜냐하면 이들은 Fc 영역이 부족하기 때문이다. 낙타류(camelid) 및 어류 유래 단일 영역 항체들은 모든 항체에, 예를 들어 효소의 활성 위치에 접근 가능하지 않은 숨겨진 항원에 결합될 수 있다.
단일 영역 항체 (sdAb)은 원하는 항원과의 단봉 낙타(dromedaries), 카멜(camels), 라마, 알파카 또는 상어의 면역법 및 그 다음의 중쇄 항체를 위한 mRNA 코딩의 분리에 의해서 얻어질 수 있다. 대안적으로 이들은 합성 라이브러리를 스크리닝함으로써 만들어질 수 있다. 낙타류는 아목 타이로포다(suborder Tylopoda) 중 오직 살아 있는 과인, 생물학적 낙타과(family Camelidae)의 구성원이다. 카멜(Camels), 단봉 낙타(dromedaries), 쌍봉 낙타(Bactrian Camels), 라마(llamas), 알파카(alpacas), 비큐나(vicunas), 및 과나코(guanacos)가 이 군에 속한다.
본 발명에 유용한 펩티드는 또한 대환식 펩티드, 시클로티드, 앱타머, LDL 수용체 A-영역, (미국특허 제60/514,391호에 설명된 것과 같은, 이의 전체로서 본원에 포함되는) 단백질 스캐폴드, 가용성 수용체, 효소, 펩티드 다합체, 영역 다합체, 항체 단편 다합체, 및 융합 단백질을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 또한 생물활성 표면 위에 분지형 중합체 구조를 달성하기 위한 새로운 방식을 설명한다. 이 개념은 예컨대 목표 분자 위의 국소화된 위치(들)에 부착된 ≥1 아암 중합체로 효과적인 ≥2 아암 중합체를 재생성하기 위한 목표 분자 위의 "분지 지점" 또는 "근위 부착 지점" 중 하나이다. 선행기술에서, 비 위치-특이적 시약 (예를 들어 NHS 작용화된 PEG 시약)으로의 단백질의 무분별한 페길레이션(PEGylation)은 단백질을 통해서 흩어진 다수의 아민기로 컨쥬케이트된 다수의 PEG 중합체를 초래할 것이다. 여기에, 설명된 것은 바람직하게, 단백질 또는 펩티드의 3차 구조 또는 작용제가 형성되었을 때, 두 개의 위치가 서로에 대하여 근접하게 되도록, 타겟 물질이 두 개의 독특한 컨쥬게이션 위치(예를 들어, 시스테인 아미노산들)를 두도록 변형된 한 단계 방법이다. 그 다음에, 이 변형된 타겟 물질은 대응하는 컨쥬게이션 화합물 (예를 들어, 티올 반응성)을 포함하는 중합체와의 컨쥬케이션 반응에서 사용된다. 그 결과는 서로에 대하여 아주 근접한 두 개의 중합체로 컨쥬케이트됨으로써, 분지 지점 또는 "슈도" 분지를 생성하는 단일 타겟 물질이다. 또 다른 구현예에서, 타겟 물질은 단일의 독특한 위치, 예를 들어 자유 시스테인을 포함할 것이며, 트리(헤테로)작용성 연결 작용제는 이 단일 위치에 ≥2 선형 중합체를 부착하는데 이용되어, "슈도" 분지를 다시 생성할 것이다.
약물
또 다른 구현예에서, 생물활성제는 또한 태크린, 메만틴, 리바스티그민, 갈란타민, 도네페질, 레베디라세탐, 레파글리니드, 아토르바스타틴, 알레파셉트, 타달라필, 바르데나필, 실데나필, 포삼프레나비르, 오셀타미비르, 발라시클로비르 및 발간시클로비르, 아바레릭스, 아데포비르, 알푸조신, 알로세트론, 아미포스틴, 아미오다론, 아미노카프로산, 아미노힙퓨레이트 소듐, 아미노글루테티미드, 아미노레불린산, 아미노살리실산, 암로디핀, 암사크린, 아나그레리드, 아나스트로졸, 아프레피탄트, 아리피프라졸, 아스파라기나제, 아타자나비르, 아토목세틴, 안트라사이클린, 벡사로텐, 비칼루타미드, 블레오마이신, 보르테조밉, 부세레린, 부술판, 카베르골린, 카페시타빈, 카르보플라틴, 카르무스틴, 클로람부신, 실라스타틴 소듐, 시스플라틴, 클라드리빈, 클로드로네이트, 시클로포스파미드, 사이프로테론, 사이타라빈, 캄프토테신, 13-시스 레티노산, 모든 트랜스 레티노산; 다카르바진, 닥티노마이신, 답토마이신, 다우노루비신, 데페록사민, 덱사메타손, 디클로페낙, 디에틸스틸베스트롤, 도세탁셀, 옥소루비신, 두타스테라이드, 엘레트립탄, 엠트리시타빈, 엔푸비르티드, 에플레레논, 에피루비신, 에스트라무스틴, 에티닐 에스트라디올, 에토포시드, 엑세메스탄, 에제티미브, 펜타닐, 펙소페나딘, 플루다라빈, 플루드로코르티손, 플루오로우라실, 플루옥심에스테론, 플루타르니드, 플루티카존, 폰다파리눅스, 풀베스트란트, 감마 히드록시부티라트, 게피티닙, 겜시타빈, 에피네프린, L-도파, 히드록시우레아, 이코덱스트린, 이다루비신, 이포스파미드, 이마티닙, 이리노테칸, 이트라코나졸, 고세레린, 라노니다제, 란소프라졸, 레트로졸, 루코보린, 레바미졸, 리시노프릴, 로보티록신 소듐, 로무스틴, 메클로레타민, 메드록시프로그에스테론, 메게스트롤, 멜팔란, 메만틴, 메르캅토퓨린, 메퀴놀, 메타라미놀 비타르트레이트, 메토트렉세이트, 메토클로프라미드, 멕실레틴, 미글루스타트, 미토마이신, 미토탄, 미톡산트론, 모다피닐, 날록손, 나프록센, 네비라핀, 니코틴, 닐루타미드, 니타족사니드, 니티시논, 노르에틴드론, 옥트레오티드, 옥살리플라틴, 팔로노세트론, 파미드로네이트, 페메트렉시드, 페르골리드, 펜토스타틴, 필카마이신, 포르피메르, 프레드니손, 프로카르바진, 프로클로르페라진, 온단세트론, 팔로노세트론, 옥살리플라틴, 랄티트렉시드, 로수바스타틴, 시로리무스, 스트렙토조신, 피메크롤리무스, 세르타코나졸, 타크롤리무스, 타목시펜, 테가세로드, 테모졸로미드, 테니포시드, 테스토스테론, 테트라히드로카나비놀, 탈리도미드, 티오구아닌, 티오테파, 티오트로피움, 토피라메이트, 토포테칸, 트레프로스티닐, 스테티노인, 발데콕십, 셀레콕십, 로페콕십, 발루비신, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 빈데신, 비노르엘빈, 보리코나졸, 돌라세트론, 그라니세트론, 포르모테롤, 플루티카손, 루프롤리드, 미다졸람, 알프라졸람, 암포테리신 B, 포도필로톡신, 항바이러스성 뉴클레오시드, 아로일 히드라존, 수마트립탄, 엘레트립탄; 매크로라이드 예컨대 에리트로마이신, 올레안도마이신, 트롤레안도마이신, 록시트로마이신, 클래리트로마이신, 다베르신, 아지트로마이신, 플루리트로마이신, 디리트로마이신, 조사마이신, 스피로마이신, 미데카마이신, 로라타딘, 데슬로라타딘, 루코마이신, 미오카마이신, 로키타마이신, 안다지트로마이신, 및 스위놀리드 A; 플루오로퀴놀론 예컨대 시프로플록사신, 오플록사신, 레보플록사신, 트로바플록사신, 알라트로플록사신, 목시플록시신, 노르플록사신, 에녹사신, 가티플록사신, 게미플록사신, 그레파플록사신, 로메플록사신, 스파르플록사신, 테마플록사신, 페플록사신, 아미플록사신, 플레록삭신, 토수플록사신, 프룰리플록사신, 이르록사신, 파주플록사신, 클리나플록사신, 및 시타플록사신; 아미노글리코시드 예컨대 겐타미신, 네틸미신, 파라메신, 토브라마이신, 아미카신, 카나마이신, 네오마이신, 및 스트렙토마이신, 반코마이신, 테이코플라닌, 람폴라닌, 미데플라닌, 콜리스틴, 답토마이신, 그라미시딘, 콜리스티메테이트; 폴리믹신 예컨대 폴리믹신 B, 카프레오마이신, 바시트라신, 페넴스; 페니실린 G, 페니실린 V와 같은 페니실리나제 민감성 작용제를 포함하는 페니실린; 메티실린, 옥사실린, 클록사실린, 디클록사실린, 플록사실린, 나프실린과 같은 페니실리나제 저항성 작용제; 암피실린, 아목시실린, 및 헤타실린, 실린, 및 갈람피실린과 같은 그람 음성 미생물 활성제; 카르베니실린, 티카르실린, 아즐로실린, 메즐로실린, 및 피페라실린과 같은 항슈도모날 페니실린; 세프포독심, 세프프로질, 세프트부텐, 세프티족심, 세프트리악손, 세팔로틴, 세파피린, 세파렉신, 세프라드린, 세폭시틴, 세파만돌, 세파졸린, 세팔로리딘, 세파클로르, 세파드록실, 세팔로글리신, 세푸록심, 세포라니드, 세포탁심, 세파트리진, 세파세트릴, 세페핌, 세픽심, 세포니시드, 세포페라존, 세포테탄, 세프메타졸, 세프타지딤, 로라카르베프, 및 목살락탐 같은 세팔로스포린, 아즈트레오남 같은 모노박탐; 및 카르바페넴 예컨대 이미페넴, 메로페넴, 및 에르타페넴, 펜타미딘 이세티오네이트, 알부테롤 술페이트, 리도카인, 메타프로테레놀 술페이트, 베클로메타손 디프레피오네이트, 트리암시놀론 아세타미드, 부데소니드 아세토니드, 살메테롤, 이프라트로피움 브로마이드, 플루니솔리드, 크로모린 소듐, 및 에르고타민 타르트레이트; 탁산 예컨대 파클리탁셀; SN 38, 및 타이르포스틴을 포함하지만 이에 제한되지 않는 구체적으로 확인된 약물 또는 치료제로부터 선택될 수 있다. 생물활성제는 또한 또 다른 구현예에서 아미노힙퓨레이트 소듐, 암포테리신 B, 독소루비신, 아미노카프로산, 아미노레불린산, 아미노살리실산, 메타라미놀 비타르트레이트, 파미드로네이트 디소듐, 다우노루비신, 레보티록신 소듐, 리시노프릴, 실라스타틴 소듐, 멕실레틴, 세팔렉신, 데페록사민, 및 아미포스틴으로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명에서 유용한 다른 생물활성제는 세포외 기질 타겟 물질, 작용성 수송 모이어티 및 표지 작용제를 포함한다. 세포외 기질 타겟 물질은 헤파린 결합 모이어티, 매트릭스 메탈로프로티나제 결합 모이어티, 리실 옥시다제 결합 영역, 음전하 모이어티 또는 양전하 모이어티 및 히알루론산을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 작용성 수송 모이어티는 혈액 뇌 관문 수송 모이어티, 세포내 수송 모이어티, 세포 기관 수송 모이어티, 상피 수송 영역 및 종양 목표 모이어티 (폴레이트, 다른 것)를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 본 발명에서 유용한 타겟 물질은 다른 것들 중에서 항-TrkA, 항 A-베타 (펩티드 1-40, 펩티드 1-42, 단량체 형, 올리고머 형), 항-IGF1-4, 아고니스트 RANK-L, 항-ApoE4 또는 항-ApoA1을 포함한다.
진단제
본 발명의 고분자량 중합체에서 유용한 진단제는 방사성표지, 형광단, 염료 및 조영제와 같은 이미징제 및 탐지제를 포함한다.
이미징제는 대상의 종양, 기관, 또는 조직을 이미징하기 위해서 본 발명의 고분자량 중합체에 부착되는 라벨을 가리킨다. 이미징 모이어티는 고분자량 중합체에 공유결합으로 또는 비공유결합으로 부착될 수 있다. 본 발명에 사용하기에 적합한 이미징 모이어티의 예는 방사성 핵종, 형광단 예컨대 플루오레세인, 로다민, 텍사스 레드, Cy2, Cy3, Cy5, Cy5.5, Cy7 및 형광단 범위의 알렉사플루오르(AlexaFluor) (Invitrogen, Carlsbad, CA), 항체, 가돌리늄, 금, 나노물질, 홀스래디쉬 페록시다아제, 알칼라인 포스파타아제, 이들의 유도체, 및 이들의 혼합물을 제한없이 포함한다.
방사성표지는 방사능을 나타내는 핵종을 가리킨다. "핵종"은 이의 원자 번호, 원자량, 및 에너지 상태에 의해서 특정된 원자의 유형, 예컨대 탄소 14 (14C)를 가리킨다. "방사능"은 방사성 물질에 의해서 방출된, 알파 입자, 베타 입자, 핵자, 전자, 양전자, 중성미자, 및 감마선을 포함하는, 방사선을 가리킨다. 본 발명에 사용하기에 적합한 방사성 핵종은 불소 18 (18F), 인 32 (32P), 스칸듐 47 (47Sc), 코발트 55 (55Co), 구리 60 (60Cu), 구리 61 (61Cu), 구리 62 (62Cu), 구리 64 (64Cu), 갈륨 66 (66Ga), 구리 67 (67Cu), 갈륨 67 (67Ga), 갈륨 68 (68Ga), 루비듐 82 (82Rb), 이트륨 86 (86Y), 이트륨 87 (87Y), 스트론튬 89 (89Sr), 이트륨 90 (90Y), 로듐 105 (105Rh), 은 111 (111Ag), 인듐 111 (111In), 요오드 124 (124I), 요오드 125 (125I), 요오드 131 (131I), 주석 117m (117 mSn), 테크네튬 99m (99 mTc), 프로메튬 149 (149Pm), 사마륨 153 (153Sm), 홀뮴 166 (166Ho), 루테튬 177 (177Lu), 레늄 186 (186Re), 레늄 188 (188Re), 탈륨 201 (201Tl), 아스타틴 211 (211At), 및 비스무트 212 (212Bi)를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 본원에 사용된 것처럼, 117 mSn 및 99 mTc에서 "m"은 메타 상태를 나타낸다. 게다가, 방사성 동위 원소의 혼합물을 일반적으로 나타내는, 우라늄, 라듐, 및 토륨과 같은 자연적으로 발생하는 방사성 원소가 방사성 핵종의 적합한 예이다. 67Cu, 131I, 177Lu, 및 186Re는 베타 및 감마 방출 방사성 핵종이다. 212Bi는 알파 및 베다 방출 방사성 핵종이다. 211At는 알파 방출 방사성 핵종이다. 32P, 47Sc, 89Sr, 90Y, 105Rh, 111Ag, 117 mSn, 149Pm, 153Sm, 166Ho, 및 188Re는 베타 방출 방사성 핵종의 예이다. 67Ga, 111In, 99 mTc, 및 201Tl는 감마 방출 방사성 핵종의 예이다. 55Co, 60Cu, 61Cu, 62Cu, 66Ga, 68Ga, 82Rb, 및 86Y는 양전자 방출 방사성 핵종의 예이다. 64Cu는 베타 및 양전자 방출 방사성 핵종이다. 이미징제 및 탐지제는 또한 개시제, 링커, 연결기, 공단량체의 합성 동안에 듀테륨, 13C, 또는 15N과 같은 자연적으로 발생하는 동위 원소의 첨가를 통하여 본 발명의 중합체 내로 디자인될 수 있다.
본 발명에 유용한 조영제는 다른 것들 중에서, 가돌리늄계 조영제, 철계 조영제, 요오드계 조영제, 바륨 술페이트를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 당해 기술분야에서 숙련된 자는 다른 조영제가 본 발명에 유용함을 인식할 것이다.
나노입자
기능성 작용제는 나노입자를 포함할 수 있다. 본 발명에서 유용한 나노입자는 범위가 1 내지 1000 nm인 크기를 갖는 입자를 포함한다. 나노입자는 비드, 금속 입자일 수 있거나 일부 경우에서 미셀일 수 있고 일부 다른 경우에서 리포솜일 수 있다. 다른 나노입자는 탄소 나노튜브, 양자 점 및 콜로이드 금을 포함한다. 나노입자는 진단제 및/또는 치료제와 함께 싸일 수 있다.
당해 기술분야에서 숙련된 자들은 또한 본 발명이 동일하거나 상이한 유형의 하나 이상의 작용제의 동시적인 탐지를 가능하게 하는데 사용될 수 있다는 점을 인지할 것이다. 또한, 가요성 링커 화합물의 사용도, 예를 들어 분자가 세포 내로 그리고 낮은 pH 환경으로 채워질 때, 하나의 형광 라벨의 손실을 목격하는데 사용될 수 있다.
컨쥬게이트
본 발명의 중합체는 위에 설명된 여러 가지의 기능성 작용제에 연결되어 컨쥬게이트를 형성할 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명은 각각 독립적으로 아크릴레이트, 메타크릴레이트, 아크릴아미드, 메타크릴아미드, 스티렌, 비닐-피리딘, 비닐-피롤리돈 및 비닐-에스테르 예컨대 비닐-아세테이트로 이루어지는 군으로부터 선택되는 다수의 단량체를 갖는 중합체 아암을 갖는 하나 이상의 중합체를 포함하는 컨쥬게이트를 제공하며, 여기서 각각의 단량체는 친수성 기, 중합체 아암의 근위 말단에 연결된 개시제 단편, 및 중합체 아암의 원위 말단에 연결된 말단기를 포함하며, 여기서 개시제 모이어티는 라디칼 중합체 적합하다. 본 발명의 컨쥬게이트는 또한 개시제 단편 또는 말단기에 연결된, 생물활성제 또는 진단제를 갖는 하나 이상의 기능성 작용제를 포함한다.
본 발명의 컨쥬게이트의 생물활성제는 약물, 항체, 항체 단편, 단일 영역 항체, 아비머, 아드넥틴, 디아바디, 비타민, 보조인자, 다당류, 탄수화물, 스테로이드, 지질, 지방, 단백질, 펩티드, 폴리펩티드, 뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드, 또는 핵산을 포함할 수 있다. 컨쥬게이트의 진단제는 방사성표지, 조영제, 형광단 또는 염료일 수 있다. 일부 구현예에서, 2 이상의 중합체는 기능성 작용제에 연결된다. 일부 구현예에서, 2 이상의 중합체는 기능성 작용제 위의 근위 반응기를 통하여 기능성 작용제에 연결되어 슈도-분지형 구조를 생성한다. 다른 구현예에서, 컨쥬게이트는 중합체에 부착된 2 이상의 기능성 작용제를 포함한다.
IV . 쌍성이온/ 포스포릴 함유 고분자량 중합체의 제조
본 발명의 고분자량 중합체는 당해 기술분야에서 공지된 임의의 수단에 의해서 제조될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 고분자량 중합체를 제조하기 위한 공정을 제공하며, 공정은 자유 라디칼 중합을 통하여 고분자량 중합체를 제조하기에 충분한 조건 하에서, 제1 단량체 및 제2 단량체의 혼합물과 개시제, I1를 접촉시키는 단계를 포함하며, 여기서 제1 단량체는 포스포릴콜린을 포함하며, 각각의 제2 단량체 및 개시제는 독립적으로 하나 이상의 기능성 작용제 또는 기능성 작용제에 연결시키기 위한 연결기를 포함한다.
본 발명의 고분자량 중합체를 제조하기 위한 혼합물은 여러 가지의 다른 성분을 포함할 수 있다. 예를 들어, 혼합물은 또한 촉매, 리간드, 용매, 및 다른 첨가제를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 혼합물은 또한 촉매 및 리간드를 포함한다. 적합한 촉매 및 리간드가 아래에서 더 상세히 설명된다.
임의의 적합한 단량체가, 위에 설명한 것과 같이, 본 발명의 공정에서 사용될 수 있다.
본 발명의 고분자량 중합체는 임의의 적합한 중합 방법에 의해서, 예컨대 살아있는 라디칼 중합체 의해서 제조될 수 있다. Odian, G. in Principles of Polymerization, 4th , Wiley Interscience John Wiley & Sons: New York, 2004에 의해서 설명되고, 예를 들어 미국특허 제6,852,816호의 쌍성이온성 중합체에 적용되는 살아있는 라디칼 중합. 안정한 자유 라디칼 중합 (SFRP), 라디칼 첨가 단편화 이동 (RAFT), 및 니트록시드-매개 중합 (NMP)을 포함하는, 몇몇의 상이한 살아있는 라디칼 중합 방법론이 이용될 수 있다. 게다가, 원자 이동 라디칼 중합 (ATRP)은 본 발명의 고분자량 중합체의 제조를 위한 편리한 방법을 제공한다.
원자 이동 라디칼 중합을 통한 중합체의 제조는 하나 이상의 할로겐을 갖는 개시제로 시작되는 단량체의 라디칼 중합을 포함한다. 할로겐화된 개시제는 리간드(예컨대, 비피리딘 또는 PMDETA)에 의해서 가용화될 수 있는 전이 금속 염 (CuBr)과 같은 촉매 (또는 CuBr2가 이용될 경우에 촉매의 혼합물)에 의해서 활성화된다. 라디칼 첨가 단편화 이동 중합은 디티오에스테르, 디티오카르바메이트, 트리티오카보네이트, 및 크산테이트와 같은, 티오카르보닐티오 화합물을 사용하여, 가역적인 사슬 이동 공정을 통하여 중합 공정을 매개한다. 본 발명의 랜덤 공중합체의 제조에 유용한 다른 "살아있는" 또는 조절된 라디칼 공정은 니트록시드-매개 중합을 포함한다.
개시제
본 발명의 고분자량 중합체의 제조에 유용한 개시제는 라디칼 중합을 통한 중합에 적합한 임의의 개시제를 포함한다. 일부 구현예에서, 개시제는 위에 설명한 것과 같은, 원자 이동 라디칼 중합 (ATRP)에 적합하다. 다른 유용한 개시제는 니트록시드 매개 라디칼 중합 (NMP), 또는 가역적인 첨가 단편화 종결 (RAFT 또는 MADIX) 중합을 위한 것들을 포함한다. 자유 라디칼 중합 공정을 조절하기 위한 여전히 다른 기술이 사용될 수 있다. 예컨대 이니퍼터(iniferters), 퇴행성 이동 또는 텔로머화 공정의 사용. 더욱이, 본 발명에 유용한 개시제는 위에 설명한 것과 같은, 하나 이상의 분지 지점을 갖는 것들을 포함한다. 다른 구현예에서, 개시제는 조절된 라디칼 중합에 유용하다.
본 발명의 고분자량 중합체는 빗 및 별 구조를 포함하지만, 이에 제한되지 않는 다수의 중합체 아암을 갖는 분지형 화합물을 포함하는 복잡한 구조를 가진다. 빗 구조는 3 개 이상의 할로겐 원자를 가지는 선형 개시제를 이용함으로써 달성될 수 있고, 바람직하게 할로겐은 염소, 브롬, 또는 요오드 원자이고, 더 바람직하게 할로겐은 염소 또는 브롬 원자이다. 별 구조는 또한 단일 탄소 원자 위에 다수의 할로겐을 가지는 화합물 또는 다수의 할로겐을 가지는 고리형 분자를 이용함으로써 제조될 수 있다. 일부 구현예에서 별 구조를 갖는 화합물은 3 개의 중합체 아암을 가지며 다른 구현예에서 이들은 4 개의 중합체 아암을 가진다. 위에 설명한 개시제를 보라.
촉매 및 리간드
원자 이동 라디칼 중합 또는 그룹 라디칼 이동 중합에 사용하기 위한 촉매는 Cu1+, Cu2 +, Fe2 +, Fe3 +, Ru2 +, Ru.3+, Cr2 +, Cr3 +, Mo2 +, Mo.3+, W2 +, W3 +, Mn2 +, Mn2 +, Mn4 +, Rh3+, Rh4 +, Re2 +, Re3 +, Co1 +, Co.2+, Co3 +, V2 +, V3 +, Zn.1+, Zn2 +, Ni2 +, Ni3 +, Au1 +, Au2 +, Ag1+ 및 Ag2 +의 적합한 염을 포함할 수 있다. 적합한 염은 할로겐, C1-C6-alkoxy, 술페이트, 포스페이트, 트리플레이트, 헥사플루오로포스페이트, 메탄셀포네이트, 아릴셀포네이트 염을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서 촉매는 위에 열거한 금속 이온의 클로라이드, 브로마이드 염이다. 다른 구현예에서 촉매는 CuBr, CuCl 또는 RuCl2이다.
일부 구현예에서, 전이 금속 촉매를 가용화하기 위한 하나 이상의 리간드의 사용이 바람직하다. 적합한 리간드가, 구리 클로라이드 또는 브로마이드, 또는 루테늄 클로라이드 전이 금속염이 촉매의 일부인 경우를 포함하여 여러 가지의 전이 금속 촉매와 조합하여 유용하게 사용된다. 리간드의 선택은 전이 금속 촉매를 유기 반응 매체 내에 가용화하는데 도와줄 뿐만 아니라, 이들의 산화 환원 전위를 조절하는 리간드로서의 촉매의 기능에 영향을 미친다. 리간드의 선택은 또한 생성 혼합물로부터의 촉매의 용해도 및 분리성에 기초를 두고 있다. 중합이 액상에서 수행될 경우에 비록 고정화된 촉매가 이용될 수 있지만 가용성 리간드/촉매가 일반적으로 바람직하다. 적합한 리간드는 (알킬 피리딘 예컨대, 4.4. 디알킬-2,2’비피리딘을 포함하는) 피리딜 기 및 존재하는 경우에, 더 긴 알킬기가 덜 극성인 단량체 혼합물 및 용매 매체에서의 용해도를 제공하는, 알킬 치환된 이미노 기를 가지는 피리딜 기를 포함한다. 인다닐, 또는 시클로펜타디에닐 리간드에 더하여, 트리페닐 포스핀 및 다른 인 리간드는 또한 전이 금속 촉매와 함께 이용될 수 있다(예컨대, 트리페닐포스핀, 인다닐 또는 시클로펜타디에닐 리간드와의 Ru+2-할라이드 또는 Fe+2-할라이드 착물).
금속 이온이 완전히 착체를 이룰 때, 성분의 몰비를 기초로 촉매 내 금속 화합물 및 리간드의 대략적인 화학양론적 양이 일부 구현예에서 사용된다. 다른 구현예에서, 금속 화합물과 리간드 간 비율은 1:(0.5 내지 2) 또는 1:(0.8 내지 1.25) 범위이다.
일반적으로, 촉매가 구리인 경우, 바이덴테이트(bidentate) 또는 멀티덴테이트(multidentate) 질소 리간드는 더욱 활성인 촉매를 생성한다. 또한, 가교 또는 시클릭 리간드 및 분지형 지방족 폴리아민은 단순한 선형 리간드보다 더욱 활성인 촉매를 제공한다. 브롬이 반대 이온인 경우, 바이덴테이트 또는 1/2개의(one-half) 테트라덴테이트 리간드가 Cu+1마다 필요하다. 트리플레이트(triflate) 또는 헥사플루오로 포스페이트와 같은, 더욱 복잡한 반대 이온을 사용하는 경우, 2개의 바이덴테이트 또는 1개의 테트라덴테이트 리간드가 사용될 수 있다. 금속성 구리 및 Cu+2는 산화환원반응을 하여 Cu+1을 형성할 수 있으므로, 금속성 구리의 첨가는 특히 더욱 신속한 중합을 원하는 일부 구현예에서 바람직할 수 있다. 일부 ATRP 반응의 개시 단계에서 약간의 Cu+2를 부가하여, 정상적인 종결의 양을 감소시킬 수 있다.
일부 구현예에서, 중합 반응에서 사용되는 촉매의 양은 존재하는 개시제의 몰당량(molar equivalent)이다. 그러나 촉매는 반응에서 소비되지 않기 때문에, 개시제만큼 고용량의 촉매를 포함하는 것이 필수적인 것은 아니다. 개시제에 포함된 각각의 할로겐에 대한 촉매의 비율은 전이 금속 화합물을 기준으로, 일부 구현예에서 약 1:(1 내지 50)이고, 다른 구현예에서 약 1:(1 내지 10)이며, 또 다른 구현예에서 약 1:(1 내지 5)이고, 다른 예에서 1:1이다.
중합 조건
일부 구현예에서, 본 발명의 실제 라디칼 중합 공정은 바람직하게는 3 내지 약 2000 범위의 중합도, 다른 구현예에서 약 5 내지 약 500의 중합도를 달성하도록 수행된다. 다른 구현예에서 중합도는 10 내지 100 범위이거나, 대안적으로 약 10 내지 약 50 범위이다. 그룹 또는 원자 이동 라디칼 중합 기술에서 중합도는 단량체에 대한 개시제의 초기 비율과 직접적인 관련이 있다. 따라서 일부 구현예에서, 단량체에 대한 개시제의 초기 비율은 1:(3 내지 약 2,000), 또는 약 1:(5 내지 500), 또는 약 1:(10 내지 100), 또는 약 1:(10 내지 50)이다.
중합 반응은 통상 단일 균질 용액을 사용하는 액상에서 수행된다. 그러나 반응은 고상 및 액상을 포함하여 (예를 들어, 현탁액 또는 수성 유제) 비균질일 수 있다. 비중합성 용매가 사용되는 경우에는, 사용되는 용매는 쌍성이온성 단량체, 개시제, 촉매 및 그의 리간드의 특성; 그리고 사용가능한 임의의 공단량체를 고려하여 선택된다.
용매는 단일 화합물 또는 화합물의 혼합물을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서 용매는 물이며, 다른 구현예에서 물은 반응에 존재하는 단량체의 중량을 기준으로, 약 10 중량% 내지 약 100 중량%의 양으로 존재한다. 수불용성 공단량체가 쌍성이온성 단량체와 함께 중합되는 경우, 모든 단량체들을 가용화하는 용매 또는 공용매 (물과 함께)를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 적절한 유기 용매의 비제한적인 예로서는, 포름아미드 (예를 들어, N,N'-디메틸포름아미드), 에테르 (예를 들어, 테트라하이드로푸란), 에스테르 (에틸 아세테이트), 그리고 가장 바람직하게는 알콜을 포함한다. 물과 유기 용매의 혼합물이 사용되는 일부 구현예에서, C1-C4 수혼화성(water miscible) 알킬 알콜 (메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 부탄올, 이소부탄올 및 테트라부탄올)이 유용한 유기 용매들이다. 다른 구현예에서, 물과 메탄올 조합이 중합 반응을 수행하는데 적합하다. 반응은 또한 CO2와 같은 초임계 용매 내에서 수행될 수 있다.
전술한 바와 같이, 일부 구현예에서, 중합될 단량체의 중량을 기준으로, 중합 혼합물 중 약 10 중량% 내지 약 100 중량%의 물을 포함하는 것이 바람직하다. 다른 구현예에서, 전체 비중합성 용매의 양은, 반응 혼합물에 존재하는 단량체의 중량을 기준으로, 약 1 중량% 내지 약 500 중량%이다. 다른 구현예에서, 전체 비중합성 용매의 양은 반응 혼합물에 존재하는 단량체의 중량을 기준으로, 약 10 중량% 내지 약 500 중량%, 대안적으로 20 중량% 내지 400 중량%이다. 어떤 경우에는, 예를 들어, 온도 또는 용매 또는 다른 방법을 변경하여, 반응 조건을 역동적인 방식으로 변화시킴으로써, 개시제 또는 단량체와 같은 투입 시료의 용해도를 조정하는 것이 바람직하다.
일부 구현예에서, 개시제와 촉매가 접촉하기 전, 쌍성이온성 단량체 및 물의 접촉 시간은, 쌍성이온성 단량체 이외의 모든 성분들을 포함하는 프리믹스를 형성하여 최소화되고, 상기 프로믹스에 부가될 쌍성이온성 단량체에 대해서 지속된다.
중합 반응은 임의의 적절한 온도에서 수행될 수 있다. 일부 구현예에서 온도는 대략 주변 온도 (실온) 내지 약 120℃이다. 다른 구현예에서 중합은 약 60℃ 내지 80℃ 범위의 주변 온도로부터 상승된 온도에서 행해질 수 있다. 다른 구현예에서 반응은 주변 온도(실온)에서 행해진다.
일부 구현예에서, 본 발명의 화합물은 겔 침투 크로마토그래피에 의해 판단할 때, 1.5 미만의 (분자량의) 다분산도를 가진다. 다른 구현예에서 다분산도는 1.2 내지 1.4 범위이다. 또 다른 구현예에서, 다분산도는 1.2 미만일 수 있다.
중합체들의 침전, 분별(fractionation), 재침전, 막 분리 및 동결건조와 같은, 관심 있는 중합체를 정제하는데 다양한 워크업 과정이 사용될 수 있다.
비할로겐화 중합체 말단( Terminus )
일부 구현예에서, 할로겐, 또는 다른 개시제 단편 I'을 다른 기능기로 대체하는 것이 바람직할 수 있다. 지방족 할로겐의 전환을 위해 다양한 반응이 이용될 수 있다. 일부 구현예에서, 지방족 할로겐의 전환은 알킬, 알콕시, 시클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 또는 히드록시 기를 제공하는 반응을 포함할 수 있다. 또한 할로겐의 제거 반응으로 알켄 (이중 결합)을 생성할 수 있다. 할로겐화 말단을 변경하는 다른 방법이 [Matyjaszewski et al. Prog . Polym . Sci. 2001, 26, 337]에 기재되어 있으며, 상기 문헌은 원용에 의해 그 전문에 본 명세서에 포함된다.
작용제의 부착
작용제를 본 발명의 고분자량 중합체의 커플링을 화학적 조건 및 수행되는 반응에 적용될 수 있는 시약을 사용하여 수행하였다. 예시된 방법은 문헌[Bioconjugated Techniques, Greg T. Hermanson, Academic Press, 2d ed., 2008] (본원에 통합됨)에 기술되어 있다. 다른 생체컨쥬게이션 기술은 문헌[Bertozzi et al. Angewandte Chemie 2009, 48, 6974] 및 [Gauthier et al. Chem . Commun. 2008, 2591]에서 본원의 참고문헌으로 통합되어 있다.
예를 들어, 커플링이 에스테르 또는 아미드의 형성을 요구하는 경우에, 카르복실산 및 알콜 또는 아민 사이의 탈수산화는 탈수산화 제제 (예를 들어, 디시클로헥실카르보디이미드, DCC, 또는 물 가용제 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 하이드로클로라이드, EDC와 같은 카르보디이미드)를 사용할 수 있다. 또한, N-히드록시숙신이미드 에스테르(NHS)는 아미드를 제조하는데 사용될 수 있다. NHS 에스테르를 사용하는 아미드를 제조하는 반응을 전형적으로 포스페이트, 바이카보네이트, 보레이트, HEPES, 또는 다른 비-아민 함유 완충액상에서 4도 내지 25도의 중성 pH 근처에서 수행한다. 일부 구체예에서, 4.5-7.5의 pH에서 탈수산화제로서 EDC를 사용하는 반응을 사용될 수 있고, 다른 구체예에서, 4.5 내지 5의 pH에서 모르포리노에탄술폰산, MES가 효과적인 카르보디이미드 반응 완충액이다.
티올기는 상이한 생산물을 제조하기 위하여 다양한 조건하에서 반응을 시켰다. 말레이미드로 티올을 반응시켜서 티오에테르 결합을 형성시킨 경우에, 반응을 pH 6.5 -7.5에서 전형적으로 수행하였다. 과도한 말레이미드기를 머캅토에탄올과 같은 자유 티올 시약을 첨가하여 정지시켰다. 이황화 결합이 연결체로 존재하는 경우, 이 결합은 이황화 피리딜과 같은 이황화 X 기능성기 및 생활성 기로 존재하는 설프하이드릴 사이의 티올-이황화 상호교차로 제조할 수 있다. 이황화 피리딜를 수반하는 반응을 pH 4 - pH 5에서 수행할 수 있고, 반응을 343nm에서 모니터링하여 방출된 피리딘-2-티온을 검출할 수 있다. 티올기는 또한 수용액상 에폭사이드와 반응하여 히드록시 티오에테르를 생성할 수 있다. 티올은 또한 아이오도아세테이트와 같은 할로아세테이트로 다소 약알칼리성 pH에서 반응할 수 있다.
구아니도기(예를 들어, 관심있는 단백질 또는 폴리펩타이드상 알기닌의 반응들)와 글리옥살과 pH 7.0 - 8.0에서 수행할 수 있다. 반응은 전형적으로 25℃에서 진행하였다. 구아니도기당 2개의 페닐글리옥살 부분을 함유하는 유도체는 중성 또는 알칼리성 pH 보다 온화한 산성 조건(pH 4 미만)하에서 보다 안정적이고, 결합된 재료를 분리하도록 하였다. 중성 또는 알칼리성 pH 값에서 연결은 천천히 분해되었다. 단백질 또는 폴리펩타이드의 알기닌 잔기를 페닐글리옥산 시약과 반응시킨 경우, 연결의 약 80%가 가수분해되어 대략 48시간에서 37℃에서 약 pH 7에서 천연 알기닌 잔기(과도한 시약이 부재인 경우)를 재생시켰다.
아민과 이미도에스테르 반응을 전형적으로 pH 8-10에서 수행하고, 바람직하게는 약 pH 10에서 수행하였다. 이미도에스테르와 아민을 반응시켜서 형성된 아미딘 연결은 가역반응이고 특히 높은 pH에서 가역적이다.
할로아세탈은 광역의 pH 범위를 걸쳐 설피드릴기와 반응시킬 수 있다. 히스티딘 잔기간에 존재할 수 있는 특히, 설프하이드릴기가 단백질 또는 폴리펩타이드상에 존재할 수 있는 부반응을 피하기 위하여, 반응을 약 pH 8.3에서 수행할 수 있다.
알데히드는 다양한 조건하에 아민과 반응하여 이민을 형성할 수 있다. 알데히드 또는 아민 중 어느 한개가 즉시 아릴기와 근접한 경우에, 그 생성물은 아릴기가 존재하지 않는 경우보다 안정적인 경향을 보이는 시프(Schiff)이다. 이민 결합을 형성시키기 위하여, 아민과 알데히드를 반응시키는 조건은 pH 9 내지 11의 알킬리성을 사용하는 것을 포함하고, 1 내지 14시간동안 약 0℃ 내지 상온의 온도의 온도, 1 내지 24시간 동안을 포함한다. 또한, 단백질의 N 단말으로 우선적인 커플링이 요망되는 경우에, 약 4-7의 보다 낮은 pH를 이용할 수 있다. 보로하이드라이드 및 3차 아민 함유 완충액을 포함하는 완충액을 이민의 제조를 위하여 종종 사용할 수 있다. 가수분해가 허용되는 요망되는 이민 컨쥬게이트를 환원시켜서 가수분해가 허용되지 않는 아민 결합을 헝성시킬 수 있다. 환원과정을 소듐 보로하이드라이드 또는 소듐 시아노보로하이드라이드를 포함하는 다양한 적합한 환원제로 수행할 수 있다.
상기에서 제공되는 반응 조건은 수행자에게 일반적인 지침을 제공하려는 의도이다. 당업자는 반응조건이 필요에 따라 다양하여 본발명의 고분자량 중합체에 작용제를 부착시키는 것을 촉지할 수 있고, 반응의 변형을 위한 지침을 유기화학의 표준 교과서로 부터 수득할 수 있다는 것을 인지할 것이다. 추가적인 지침을 관련 화학반응을 논의하는 문헌[ Wong, S.S., Chemistry of protein Conjugation and Cross-Linking,"(CRC Press 1991)]와 같은 교과서로부터 수득할 수 있다.
상이한 조합 단백질을 다양한 크기의 본원 발명의 광역의 다양한 중합체에 성공적으로 컨쥬게이션시키는 것과 상이한 컨쥬게이션 화학을 통한 구조기술을 보여주었다. 많은 교훈을 공정 개발 노력(컨쥬게이션, 하류 공정, 분석 개발) 및 일부 독특한 특징을 가지는 기술을 하기에서 기술하였다. 컨쥬게이트는 본원 발명의 중합체에 공유결합되어 컨쥬게이션된 단백질 또는 다른 치료제를 배타적으로 지칭하는 것이다.
컨쥬게이션 반응 분야에서, 1-2 배의 저분자량 몰 과량 비율은 우수한 컨쥬게이션 효율을 수득하기 위하여 유용하다. 낮은 몰 중합체 과량을 달성하고 우수한 컨쥬게이션 효율(>20%)을 유지하기 위하여, 단백질 농도를 통상 수용되는 1-2mg/ml의 농도보다 매우 높게 하여야만 한다. 사용되는 어느 한 특정의 단백질에 대하여 달성될 수 있는 농도는 단백질의 안정성 및 생물리학적 성질에 의존할 것이다. 예시적 범위는 5 - 10 mg/ml, 10 - 15 mg/ml, 15 - 20 mg/ml, 20 - 25 mg/ml, 25 - 30 mg/ml, 30 - 50 mg/ml, 50 - 100 mg/mL, >100 mg/ml을 포함한다.
반응의 다른 측면에서, 주요한 도전은 중합체의 농도이고, 이 농도는 최적의 효율 100mg/ml의 상위하는 정상 농도에 대한 매우 높은 수준을 또한 요구한다. 재미있게도 이러한 발명의 중합체는 과량의 500mg/ml의 농도에서 조차 낮은 점도를 가지는 극단의 가용성을 증명한다. 이러한 특징은 매우 쉽게 혼합되는 것과 같은 컨쥬게이션 반을을 다루는 것이 가능하도록 하는 반면, 그와 같은 농도에서 PEG와 같은 다른 중합체로는 용액이 너무 점도가 있어서 다룰 수가 없다. 추가로 혼합을 개선시키는 다양한 기구의 사용은 공정을 개선한다. 예를 들어, 온도 제어기가 있는 초음파 용기를 중합체 가용화를 촉진하기위하여 초기 혼합에서 사용할 수 있고, 차례로 컨쥬게이션 효율을 향상시킬 수 있다. 히엘셔울트라소닉 GmbH로부터의 바이얼트윗터와 같은 대안적인 초음파 기구는 초음파 용기와 비교하여 초음파 에너지를 전달하는 효율을 개선한다. 이론적인 관점에서는 초음파파형은 중합체 및 단백질간에 상호작용을 촉진시키는 진동 파형을 생성한다. 이는 보다 높고 보다 개선된 컨쥬게이션 효율로 해석된다. 냉각 시스템과 같은 온도 조절 기작을 추가하는 것은 이러한 시스템에서 열 감수성 단백질을 보호한다. 이러한 공정을 큰 산업 규모로 스케일업(예를 들어, 킬로그램 또는 이보다 큰 단위)하기 위하여, 레소딘사에 의해 개발된 공명음향 혼합 기술과 같은 다른 장치가 유용하다. 사실, 이러한 유형의 혼합기는 성공적으로 사용되어 고점도 중합체 및 1,000cp 초과의 점도를 가지는 유체를 가용화시킨다. 최고 실질적인 농도에서 본원 발명의 중합체는 그와 같은 점도 수준의 분획물로 존재하여 공명 음향 혼합 기술이 특히 매력적이게 한다. 이와 같은 기술의 추가적인 장점은 비침습성이고 완전히 숨겨지는 특징뿐만 아니라 고속의 혼합시간을 포함한다. 이러한 성질은 일반적으로 단백질 의약품과 특이하게 본원 발명의 기술과 조합하는데 에 매우 바람직하다.
요망되지 않는 폴리-PEG화된 컨쥬게이션 부산물은 제조과정중에 제품의 비용을 증가시키는 것으로 본 산업에서 이슈가 된 반면, 조절된 복잡성 및 생산품 승인 장애를 또한 증가시켰다. 재미있게도 본원 발명의 모든 중합체로부터 유래된 많은 상이한 정제된 컨쥬게이트로 사용되어 온 것들은 항상 단백질과 중합체간에 동일한 몰 비율이 된다. 이는 다른 중합체 및 컨쥬게이션 기술과 비교해 볼때, 독특하고 매우 요망되는 특징이다. 이전에서 기술된 하류 공정 영역에서, 본 발명의 선호되는 중합체는 쌍성이온성 이온 성질로 인한 중화된 총 전하를 갖는다. 그러므로, 이 중합체는 광역의 pH 및 이온 강도를 포함하는 크로마토그래피 조건하에서 양이온 또는 음이온 교환 수지와 상호작용하지 않는다. 즉, 자유 중합체는 pH 및 이온 강도와 상관없이 어떠한 이온 수지를 통해서 흘러갈 것이다. 그러나, 상이한 단백질에 컨쥬게이션 되면, 켄쥬게이트의 크로마토그래피적 거동이 단백질에 의해 보여진다. 중합체 방어 효과의 존재 및 컨쥬게이션 화학반응 과정 중에 단백질의 변경된 전하로 인하여 컨쥬게이트의 이온 교환 수지와 상호작용은 천연의 단백질과 비교하여 약화된다. 이러한 성질은 양이온 및 음이온 교환 수지 각각 과 상호작용하는 염기성 및 산성 단백질에서 관찰된다. 이는 또한 다음을 포함하는 제품 관련 오염으로부터 컨쥬게이트를 분리하기 위한 고휴율, 단순, 비용-효과적 및 직교하는 정제 방법을 고려함으로써, 제조 관점의 고도로 요망되는 성질이다:미반응 자유 중합체, 미반응 자유 단백질 및 응집체와 독소, 컨쥬게이션 반응물과 첨가물과 같은 공정 오염물. 단일 이온 교환 크로마토그래피 단계가 충분하다.
예를 들어, 컨쥬게이션 반응이 단백질의 pI보다 높은 pH의 완충액을 가지는 낮은 이온 강도(예를 들어 0-20mM NaCl)로 수행되는 산성 단백질 컨쥬게이트에 대하여 컨쥬게이션 반응이 완료된 경우에 컨쥬게이션 반응 용기의 내용물을 음이온 교환 수지(예를 들어 Q 유형 IEX 수지)에 대하여 직접 적용할 수 있고, 여기서 미반응 자유 중합체가 수지를 통하여 흘러가게 되고 컬럼은 이때 추적되고 동일한 pH에서 컨쥬게이션 반응과 유사한 낮은 이온강도 완충액으로 세정된다. 결합 분획물은 이때 증가된 염 농도로 단계적으로 용출된다. 제 1 단백질 분획물은 정제된 컨쥬게이트이고, 천연 단백질 및 응집체와 독소와 같은 다른 오염물과 비교하여 이온 교환 수지에 보다 약하게 결합하기 때문이다. 농도 구배 단계는 고도로 요망되는데 이는 천연 단백질이 컬럼으로부터 여과되는 잠재적인 위험을 최소화시킬것이기 때문이다. 예를 들어, 강한 양이온 교환 수지를 사용하면, 사이토카인 중합체 컨쥬게이트는 pH 7에서 30-60mM NaCl 주변에서 용출되는 반면, 천연의 사이토카인은 100mM 또는 그 이상까지 용출되지 않을 것이고, 이러한 조건하에서 사이토카인은 이합체 및 응집체는 전형적으로 200mM NaCl 또는 그 이상에서 용출되며, 마지막으로 독소가 보다 높은 염 농도에서 용출된다.
염기성 단백질 컨쥬게이트에 대하여, 분리 단계는 단백질의 pI보다 낮은 pH의 완충액으로 낮은 이온 강도 (예를 들어 0-20mM NaCl)에서 양이온 수지(예를 들어 SP 유형 IEX 수지)를 사용하여 수행할 수 있다. 이러한 공정은 미반응 자유 중합체가 여전히 독소 및 다른 음성 전한 오염물과 함께 분획물을 통해서 흐름상에 존재하는 반면 컨쥬게이트 및 자유 미반응 단백질이 컬럼에 결합하여 남아있다. 용출 완충액의 이온 강도를 증가시켜서 천연 단백질과 비교하여 IEX 수지와 약한 상호작용때문에 분획된 제 1 단백질은 컨쥬게이트이다. 전형적인 Fab' 컨쥬게이트는 30-60mM NaCl에서 용출되는 반면 천연 Fab' 는 100-200mM NaCl에서 용출된다.
산성 단백질 컨쥬게이트 (예를 들면, 사이토카인 및 스캐폴드-기재 다중-도메인 기재 단백질) 뿐만 아니라 염기성 단백질 컨쥬게이트 (예를 들면, Fab')를 포함하는 다수의 다른 단백질 컨쥬게이트를 정제하기 위한 실험은 컨쥬게이트 용출에 요구되는 이온 강도가 (심지어 백만 달톤 이상의 경우에도) 중합체 크기 및 구조물 (멀티-아암 구조물)에 상당히 의존함을 나타낸다. 이것은 대부분의 공정 발전 노력들이 요구됨이 없이 중합체에서의 변화로 일부 치료제까지의 일반적인 제조 공정의 설계를 가능하게 하는 플랫폼 기술에서 매우 갈망하는 특징이다.
제조 관점에서 말하면, 상기 기술된 다운스트림 정제 공정은 하기와 같은 이점을 갖는다:
1. 고도의 계량화;
2. 수지가 상업적으로 이용가능하고 필요한 기구가 이미 산업적 표준을 따를 때 현재 상업 제작 공정의 적용가능성;
3. 샘플 기술은 공정 분석 (In Process Analytics, IPA)에서 뿐만 아니라 대량 생산에서도 사용될 수 있음;
4. 일반적 공정의 발전이 실현가능함;
5. 단일 단계 성질 및 직교 설계로 인한 비용 효율성;
6. 우수한 회수율 (현재 공정 수율은 80% 정도임).
분석 개발 분야에서, 본 발명에 따른 중합체의 쌍성이온성 성질은 컨쥬게이트의 SDS-PAGE 분석법의 개발에 2가지 영향을 미친다. 첫째, SDS-PAGE 분석법은 오랫동안 반-정량적인 단백질 특징화를 위한 신속, 고해상도, 고속 및 저비용 방법을 제공한다는 점에서, 단백질 분석에 편재하고 편리한 방법으로 여겨졌다. 그러나, 순 전하 중성 특성뿐만 아니라 큰 수력학적 반경을 갖는 중합체는 중합체가 심지어 4% 겔 만큼 낮게 폴리아크릴아미드 매트릭스로 (매우 큰 크기의 중합체의 경우) 열악하게 이동하거나 거의 이동하지 않음을 의미한다. 둘째, 본 발명에 따른 중합체는 잠재적으로 쿠마시 블루 염료가 중합체와 상호작용하는 것을 방지하는 그들의 순 전하 중성 특성으로 인해, 쿠마시 블루 염료에 의해 염색되지 않는다. 그러나, 일단 단백질이 상기 중합체에 컨쥬게이트 되는 경우, 상기 컨쥬게이트는 염색된다. 이들은 처음에는 대부분의 단백질 생화학자들에게 2가지의 원하지않는 특성이지만; 그러나, 이러한 두가지 특성의 조합은 추가의 정제 없이 반응 혼합물로부터 컨쥬게이션의 빠르고 용이한 분석을 직접적으로 효율적이게 하는 매우 원하고 유일한 기술의 설계를 가능하게 한다. 본 기술에서, 컨쥬게이션 반응 혼합물은 SDS-PAGE 겔로 로딩되고 표준 프로토콜에 따라 분리된다. 그 다음, 상기 겔은 쿠마시 블루로 염색된 후 표준 프로토콜에 따라 탈색된다. 작은 단백질은 그것의 분자량으로 이동하는 반면, 상기 컨쥬게이트의 존재는 로딩에 가까운 쿠마시 블루 염색된 밴드를 나타내고, 중합체가 없는 대조군 반응과 비교하여, 밴드 강도에서 부수적인 감소를 나타낼 것이다. 따라서, 중합체 단독으로는 겔의 고 분자량 영역에서 어떤 염색도 나타내지 않기 때문에 비효율적 컨쥬게이션을 갖는 반응들을 구별하기가 매우 용이하다. 컨쥬게이션 반응 분석 기술은 쿠마시 블루에 의한 PEG 중합체뿐만 아니라 PEG화 단백질 염색과 같은 PEG화 반응에서는 불가능하고, 겔 내의 매우 유사한 위치로, 특히 매우 큰 PEG 중합체를 이동시킨다; 게다가, PEG 중합체는 SDS-PAGE 겔의 이동 패턴을 왜곡시키는 매우 원하지 않는 특성을 나타낸다. 상기 후자의 문제는, 비반응 유리 중합체의 순 전차 중성 특성이 겔 매트릭스로 그들을 들어가지 않게 하므로 (반면, 컨쥬게이트와 비컨쥬게이트된 유리 단백질만 그렇게 할 것이다), 본 발명의 중합체에서는 관찰되지 않는다.
본 발명에 따른 중합체의 다른 흥미로운 특성은 그들은 방향족 기의 부재로 인해 UV 280nm 흡광도를 갖지 않는다는 점이다. 그러나, 그들은 220nm에서 흡광도를 갖는다. 이것은 단백질 용액의 동일한 중량 농도와 비교할 때, 중합체는 적어도 10x 낮은 흡광도를 갖는다. 이것은 크기 배제 또는 IEX 분석과 같은 다른 크로마토그래피 방법을 사용하여 컨쥬게이션 반응 혼합물 내의 컨쥬게이트의 존재를 확인하기 위하여 시도할 때 매우 유용하다 . UV280/UV220 비율을 비교함으로써, 비율이 급속도로 증가하기 때문에 컨쥬게이트의 존재를 확인하는 것은 매우 용이하다. 동일한 기술이 생성물 용출을 관찰하는 분석 스케일뿐만 아니라 생산 스케일에도 사용될 수 있다.
V. 조성물
본 발명은 일 또는 그 이상의 본 발명의 화합물 및 일 또는 그 이상의 약제학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 약제학적 조성물을 포함하고 제공한다. 본 발명의 화합물은 본 발명의 약제학적 조성물 내에서, 약제학적으로 허용가능한 염, 전구약물, 대사산물, 그들의 유사체 또는 유도체로서 존재할 수도 있다. 본 명세서에서 사용된, 용어 "약제학적으로 허용가능한 부형제" 또는 "약제학적으로 허용가능한 담체"는 약제학적 조성물 투여와 양립가능한, 임의의 모든 용매, 분산매, 코팅, 항균 및 항곰팡이제, 등가제 및 등장성 및 흡수 지연제 등을 포함한다.
본 발명에 따른 고 MW 중합체의 제형화에 사용하기 위한 약제학적으로 허용가능한 담체는 락토오스, 백토, 수크로오스, 활석, 젤라틴, 아가, 펙틴, 아카시아, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 등과 같은 고형 담체; 및 시럽, 식염수, 포스페이트 완충된 식염수, 물 등과 같은 약체 담체를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 담체는 단독으로 또는 왁스, 에틸셀룰로오스, 히드록시프로필메틸셀룰로오스, 메틸메타크릴레이트 등과 함께 글리세릴 모노스테아레이트 또는 글리세릴 디스테아레이트와 같은, 당업계에 알려진 임의의 시간-지연 물질을 포함할 수도 있다.
당업계에 공지된 바와 같은 다른 필러, 부형제, 풍미제, 및 그밖의 첨가제가 또한 본 발명에 따른 약제학적 조성물 내에 포함될 수도 있다. 약제학적 활성 물질에 상기 매질 및 작용제의 사용은 당업계에 잘 알려져 있다. 임의의 통상적인 매질 또는 작용제가 활성 화합물과 양립불가능한 경우를 제외하고는, 본 발명의 조성물 내에 상기의 사용이 고려된다. 보충적 활성 화합물이 또한 본 발명의 조성물 내에 첨가될 수 있다.
상기 약제학적 조성물 제제는 모든 종류의 제형을 포함한다. 일 구현예에서, 상기는 주입 또는 융합에 적합한 (피하, 근육, 정맥, 내피, 복막, 척추, 심실, 두개, 척수, 낭내, 및 골질 내를 포함하는) 비경구 제형 (예를 들면, 분말 또는 재구성되거나 희석될 수 있는 농축액뿐만 아니라 분산액 및 용액)이다. 상기 조성물이 액체 매질과의 희석될 필요가 있는 재구성 또는 농축이 요구되는 고체인 경우, 임의의 적합한 액체 매질이 사용될 수도 있다. 액체 매질의 바람직한 예는 물, 식염수, 포스페이트 완충 식염수, 링거 용액, 한크 용액, 덱스트로스 용액, 및 5% 인간 혈청 알부민을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 고 MW 중합체를 포함하는 화합물 또는 약제학적 조성물이 아암을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 세포 증식 장애의 치료에 적합한 경우, 화합물 또는 약제학적 조성물은 종양, 혈관 또는 체강 내로의 직접적인 주입을 포함하는 다양한 경로를 통해 피검체에 투여될 수 있다.
약제학적 조성물이 약체 용액, 부형제 또는 투여 바로 직전에 재구성될 수 있는 분말일 수도 있는 반면, 그들은 또한 다른 형태를 가질 수도 있다. 일부 구현예에서, 상기 약제학적 조성물은 시럽, 물약, 알약, 과립, 페이스트, 부형제, 크림, 연고, 정제, 캡슐 (경질 또는 연질) 스프레이, 에멀젼, 마이크로에멀젼, 패치, 좌약, 분말 등으로 제조될 수도 있다. 상기 조성물은 또한 (입 또는 설하를 포함하는) 국소, 폐, 직장, 경피, 경점막, 구강, 눈 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 비경구 투여 이외의 투여 경로를 위해 제조될 수도 있다. 무바늘 주입 장치가 피부하, 피하 및/또는 근육 투여를 달성하기 위하여 사용될 수 있다. 그러한 장치는 저 (<20 cP), 중 (20-50 cP), 및 고 (>100 cP) 점성 제형이 투여될 수 있도록 본 발명의 중합체 및 컨쥬게이트와 조합될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명에 따른 상기 약제학적 조성물은 본 발명의 일 또는 그 이상의 고 MW 중합체를 포함한다.
본 발명에 따른 다른 약제학적 조성물은 항원 또는 타겟 분자에 특이적인 생물학적 리간드로 기능을 하는 본 발명의 일 또는 그 이상의 고 MW 중합체를 포함할 수도 있다. 그러한 조성물은 생물학적 작용제가 항체, 또는 FAb2 또는 FAb' 단편 또는 항체 가변 영역과 같은 항체 단편의 아미노산 염기서열을 포함하는 폴리펩티느인 경우, 본 발명의 고 MW 중합체를 포함할 수도 있다. 대안적으로, 상기 화합물은 고 MW 중합체 일 수도 있고, 상기 폴리펩티드는 단쇄 항체의 항원 결합 염기서열을 포함할 수도 있다. 본 발명에 따른 고 MW 중합체 내에 존재하는 생활성 작용제가 항원 또는 타겟 분자에 특이적인 리간드로서 작용하는 경우, 이러한 화합물들은 또한 진단 및/또는 조영 시약 및/또는 진단 분석법으로 사용될 수도 있다.
약제학적 조성물 내의 화합물의 양은 다양한 인자에 따라 다양할 것이다. 일 구현예에서, 그것은 단일 투여 용기 (예를 들면, 바이알)에 적합한 치료적 유효량일 수도 있다. 일 구현예에서, 상기 화합물의 양은 단일 용도 실린저에 적합한 양이다. 다른 구현예에서는, 상기 양은 다중-용도 디스펜서 (예를 들면, 국소 제형을 전달하기 위해 사용되는 경우 제형의 방울의 전달하기에 적합한 용기)에 적합하다. 숙련자들은 임상적으로 원하는 결과를 달성하기 위하여 약제학적 조성물의 양을 증가시키는 반복적 투여에 의해 실험적으로 치료적 유효량을 측정함으로써 화합물의 양을 결정하는 것이 가능할 것이다.
일반적으로, 약제학적으로 허용가능한 부형제는 조성물 내에서 약 0.01 중량% 내지 약 99.999 중량%, 또는 약 1 중량% 내지 약 99 중량%로 존재할 것이다. 약제학적 조성물은 약 5 중량% 내지 약 10 중량%, 또는 약 10 중량% 내지 약 20 중량%, 또는 약 20 중량% 내지 약 30 중량%, 또는 약 30 중량% 내지 약 40 중량%, 또는 약 40 중량% 내지 약 50 중량%, 또는 약 50 중량% 내지 약 60 중량%, 또는 약 60 중량% 내지 약 70 중량%, 또는 약 70 중량% 내지 약 80 중량%, 또는 약 80 중량% 내지 약 90 중량%의 부형제를 함유할 수도 있다. 상기 부형제의 다른 적합한 범위는 약 5% 내지 약 98 중량%, 약 15 내지 약 95 중량%, 또는 약 20 중량% 내지 약 80 중량%를 포함한다.
약제학적으로 허용가능한 부형제는 문헌 ["Remington: The Science & Practice of Pharmacy" 19th ed., Williams & Williams, (1995) and Kibbe, A. H., Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3rd Edition, American Pharmaceutical Association, Washington, D.C., 2000]를 포함하나, 이에 제한되지 않는 다양한 공지 문헌에 기술되어 있다.
VI . 방법
본 발명에 따른 고 MW 중합체는 임의의 질병 상황 또는 상태를 치료하기에 유용하다. 상기 질병 상황 또는 상태는 급성이거나 만성일 수 있다.
본 발명에 따른 고 MW 중합체를 사용하여 치료될 수 있는 질병 상황 및 상태는 암, 자가면역 질환, 유전적 질환, 감염, 염증, 신경 장애, 및 대사 장애를 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 고 MW 중합체를 사용하여 치료될 수 있는 암은 난소암, 자궁암, 폐암, 방광암, 갑상선암, 간암, 흉부암, 췌장암, 자궁경부암, 고환암, 대장암, 항문암, 쓸개관암, 위장관 유암종, 식도암, 담낭암, 직장암, 맹장암, 소장암, 위 (위의)암, 신장암, 중추신경계암, 피부암, 융모암; 두경부암, 골육종, 섬유육종, 신경모세포종, 신경아교종, 흑색종, 백혈병 및 림프종을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 고 MW 중합체를 사용하여 치료될 수 있는 자가면역 질병은 다발성 경화증, 근무력증, 크론병, 괴양성 대장염, 원발성 담즙성 간경변증, 타입 1 당뇨병 (인슐린 의존성 당뇨병 또는 IDDM), 그레이브병, 자가면역 용혈성 빈혈, 악성 빈혈, 자가면역 저혈소판증, 혈관염, 예를 들면, 베게너 육아종증, 베체트병, 류마티스 관절염, 전신성 홍반성 낭창 (낭창), 피부경화증, 전신경화증, 갈리안바레 증후군, 히시모토 갑상선 척추관절증, 예를 들면, 강직성 척추염, 건선, 포진성 피부염, 염증성 장질환, 심상성 천포창 및 백반증을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 고 MW 중합체에 의해 치료가능한 신진대사 장애는 리소좀 축적 장애, 예를 들면, 뮤코다낭증 IV 또는 모르큐 증후군, 활성인자 결핍/GM2 강글리오사이드종, 알파-마노사이드종, 아스파르틸글루코사이뇨증, 콜레스테릴 에스테르 축적 질환, 만성 헥소사미니데이즈 A 결핍증, 시스틴축적증, 다논병, 파브리병, 파버병, 푸코사이드 축적증, 갈락토사이알도시스, 고셔병, GM1 강글리오사이드증, 저인산염혈증, I-세포병/뮤코리피드증 II, 영아 시알산 축적병/ISSD, 유아 헥소스아미니데이즈 A 결핍증, 크랩병, 이염성 백질 이영양증, 점액다당류증, 예를 들면 슈도-헬러 다발이상증/뮤코리피드증 IIIA, 헬러 증후군, 샤이에 증후군, 헬러-샤이에 증후군, 헌터 증후군, 산필리포 증후군, 모르퀴오, 히알루로니다아제 결핍증, 마로테옥소-라미, 슬라이 증후군, 뮤코리피드증 I/시알산증, 뮤코리피드증, 및 뮤코리피드증, 다중 설리피다제 결핍증, 니에만-피크 질병, 신경성 지방갈색소증, 폼페병/글리코겐 축적증 II, 농축이골증, 샌드호프병, 쉰들러병, 살라병/시알산 축적증, 테이-삭스/GM2 강글리오사이드증 및 월만병을 포함한다.
본 발명의 컨쥬게이트 및 본 발명에 따른 컨쥬게이트를 함유하는 조성물 (예를 들면, 약제학적 조성물)은 다양한 상태를 치료하기 위하여 사용될 수 있다. 예를 들면, 많은 상태를 위한 치료 요법이 본 명세서에 개시된, 기능성 작용제가 사용되는 당업계의 숙련자에게 알려져 있다. 본 발명은 본 발명의 컨쥬게이트 (예를 들면, 다양한 기능성 작용제에 컨쥬게이트된 중합체를 함유하는 포스포릴콜린) 및 본 발명의 컨쥬게이트를 함유하는 조성물이 상기 상태를 치료하기 위하여 사용될 수 있고, 그러한 컨쥬게이트가 중합체를 함유하는 포스포릴콜린에 결합하지 않는 동일한 기능성 작용제 비해 강화된 치료 요법을 제공한다고 이해된다.
따라서, 본 발명은 중합체를 함유하는 포스포릴콜린에 컨쥬게이트된 동일한 특정 생물활성 작용제를 사용하여 상태를 치료함으로써 상기 활성제 의해 치료가능한 것으로 알려진 상태의 치료를 고려한다.
본 발명의 다른 측면은 본 발명의 화합물 또는 상기 기술된 본 발명의 약제학적으로 허용가능한 조성물의 치료적 유효량을 그것이 요구되는 피검체에 투여하는 것을 포함하는 생물학적 작용제에 반응성인 상태를 치료하는 방법에 관한 것이다. 용량 및 투여는 원하는 효과를 유지하기 위한 생활성 작용제(들)의 충분한 수준이 제공될 수 있도록 조절된다. 임의의 주어진 피검체에 적절한 용량 및/또는 투여는 질병 상태의 중증도, 피검체의 일반적 건강상태, 연령, 체중, 및 피검체의 성별, 식이요법, 투여의 시간 및 빈도, 약물 조합(들), 반응 민감성, 및 치료 내성/반응성을 포함하는 다양한 인자들에 따라 변경될 수도 있다. 주어진 상황에서의 치료적 유효량은 임상의의 기술 및 판단 내에서 일반적 실험에 의해 측정될 수 있다.
본 명세서에 기술된 약제학적 조성물은 단독으로 투여될 수도 있다. 대안적으로, 2 또는 그 이상의 약제학적 조성물이 연속적으로, 또는 본 발명의 2개의 고 MW 중합체 또는 본 발명의 1개의 고 MW 중합체 및 다른 생활성 작용제를 함유하는 혼합물이나 조합물로 투여될 수도 있다. 본 명세서에서 설명된 다른 생활성 작용제의 용도가 문헌 [Merck Manual of Diagnosis and Therapy, Merck & Co., Inc., Whitehouse Station, NJ and Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, Pergamon Press, Inc., Elmsford, N.Y., (1990)]와 같은 표준 참고서에서 발견될 수도 있다.
본 발명은 혈액 관련 단백질, 예를 들면 인자 VIII, 인자 VII, 인자 IX, 인자 X 및 프로테아제의 변경, 예를 들면 천연 염기서열 또는 뮤테인 염기서열과 천연 기능 또는 변경된 (예를 들면, 문헌 [Catalyst Biosciences of South San Francisco with technology]를 참고하여 존재하는 효소의 결합 특이성을 변경하기 위하여 파지 디스플레이를 통해) 기능을 갖는 세린 프로테아제를 기술한다. US 특허 7,632,921는 전체내용이 본 명세서에 포함되어 있다. 작용화된 중합체의 부위-특이적 컨쥬게이션을 가능하게 하는 효소의 변경이 개시되어 있다. 그러한 단백질이 적절히 설정된 인체내에서 방출될 수 있도록, 예를 들면 0차 방출 프로파일이 가능하도록, 중합체와 효소 사이의 유연한 화학물질의 사용이 개시되어 있다. 다음 재생 인자 VIII에 대한 타겟 생산 프로파일은 50 kDa 분자량 이상의 확장된 형태인, 멀티-아암 쌍성이온-함유 중합체가 시스테인과 같은 부위-특이성 아미노산에 부착되어 있는, 재조합 FVIII 또는 재조합 B-도메인 결실된 FVIII의 공유 컨쥬게이트를 포함한다. 상기 컨쥬게이트의 임상적 약리학자들은 제거 및 면역 시스템으로부터 컨쥬게이트를 보호하기 위해 구조화되는 특수한 물을 입증할 것이다. 상기 컨쥬게이트는 인간에서 50 시간 제거 반감기 이상 (바람직하기는 80 시간 이상)을 입증할 것이다. 상기 컨쥬게이트는 동일한 생활성을 갖는 60 kDa PEG-BDD FVIII에 비해 2x (바람직하기는 4x) 증가된 반감기를 입증할 것이다. 환자에서 사용된 상기 컨쥬게이트는 임상적으로 무의미한 항체 형성을 나타낼 것이다. 상기 생약리학적 컨쥬게이트는 예방학적으로 (1주에 1회 미만의 빈도로) 뿐만 아니라 혈우병을 갖는 환자의 즉각적인 치료에 사용될 것이다. 또한, 존재하는 FVIII 중성화 항체, 예를 들면 종래 FVIII 생약리학적 치료로부터의 환자의 구조 치료에 사용될 것이다. 상기 약물은 IV 및/또는 피하 투여를 위해 액체 제형이 높은 안정성, 높은 농도, 및 저 점도를 가질 수 있도록 할 것이다. 활성 성분들은 0.4ml의 이상적인 명목 부피 내에서 30 내지 250 마이크로그램의 중합체 약물 컨쥬게이트로 구성된 250 내지 2,000 IU 범위 내일 수 있다. 상기 중합체의 비용은 낮을 것이고, FVIII 또는 BDD FVIII 단백질에 중합체의 컨쥬게이션 효능은 매우, 예를 들면 75% 정도 까지 높을 것이다. 그러한 생산물 및 생산 프로파일은 중합체의 우수한 생체친화성를 사용하고 단백질로 전환되도록 한다. 구체적으로, 극한 생체친화성은 그 자체로 매우 단단한 수분 결합, 극한 용해성, 매우 높은 농도, 매우 낮은 점도, 및 극한 안정성을 나타낸다. 기술적으로, 이것은 PEG화 또는 이와 동등한 기술에 비해 >2x (또는 이상적으로 >4x) 증가된 제거 반감기, 극한적으로 낮거나 없는 면역원성, 높은 농도, 및 실온 안정성 액체 제형으로 해석된다. 생산물 프로파일 이점은 낮은 투여 횟수, 동일한 곡선하 면적에서의 낮은 투여, 네이브 환자에 유효한 안전한 치료, 중성화 항체를 갖는 환자의 구조 치료, 가정에서의 피하 투여, 실온 저장된 미리-충전된 실린저/자동주입기, 높은 가우지 (낮은 직경) 시린저 바늘, 낮은 주입량, 및 긴 저장 수명을 포함한다. 제조시, 우선, 단일 포트 합성, 매우 높은 중합체 분자량, 복합 구조물, 및 제조시 낮은 비용이 달성가능하다. 또한, 약물로의 중합체의 높은 효율의 컨쥬게이션이 가능하다. 이러한 제조 이점은 저렴하고, 더 이용가능한 약물 및 높은 매출 이익으로 해석될 수 있다.
본 발명은 Avidia에 양도된 US 특허 출원 60/514,391에 기술된 바와 같이 재조합 변경된 LDL 수용체 클래스 A 도메인의 멀티머 또는 관계 공통 서열에 고 MW 쌍성이온-함유 중합체를 부착하는 것을 기술한다. 당업계의 숙련자들은 상기 아비머가 리신 결핍된 후 작용화된 중합체의 부위-특이적 부착을 위한 N- 및/또는 C- 말단에 첨가된 리신 및/또는 다른 아미노산일 것으로 이해할 것이다. N-말단 리신은 바람직하기는 (메티오닌 이후의) 제2 아미노산이고 알데히드 또는 아세탈기를 함유하는 작용화된 중합체와 같은 아민-유도 개시제의 상대적 부위 특이적 컨쥬게이션을 야기할 수 있다. 당업계의 숙련자는 단백질 내에 존재하는 N-말단 아미노기 또는 다른 아민기에도 컨쥬게이트하는 멀티-포인트 부착 보다는 리신의 아민에 우선적으로 컨쥬게이트되도록 pH가 컨쥬게이션 반응을 매우 낮게 유도하기 위하여, 상대적으로 친수성 아미노산 및 낮은 pI 및 높은 안정성을 갖는 아비머 조성물의 이점을 알 것이다. 상기 치료제는 N-말단에 컨쥬게이트된 중합체 및 C-말단 리신 (유효한 분지형 구조)를 통해 C-말단에 컨쥬게이트된 다른 중합체를 가질 수 있다. 그러한 아비머는 또한 티올-반응성 작용화된 중합체와 부위 특이적 컨쥬게이션을 위해 첨가된 여분의 N- 또는 C-말단 시스테인을 갖는 포유동물계 내에서 만들어질 수 있다. 상기 중합체 작용기는 또한 조직 타겟 인자를 함유할 수 있다. 아미버에 중합체를 부착하는 화학물질은 그것이 생체 내에서 예를 들면, 혈청 또는 pH 반응 방법 등을 통해 분해될 수 있도록 유연할 수 있다. 단량체 및 유사하게 사용되는 목적의 다른 도메인으로 구성된 다량체는 EGF 도메인, Notch/LNR 도메인, DSL 도메인, Anato 도메인, 인테그린 베타 도메인 또는 참조된 특허 패밀리에 기술된 다른 도메인을 포함한다.
본 발명은 또한 펩티드 및 합성 펩티드, 구체적으로 다수의 도메인을 갖는 더 합성된 펩티드에 고 MW 쌍성이온-함유 중합체의 부착을 기술한다. 다수의 도메인 펩티드에 의한 큰 문제는 그들이 안정하지 않고 또한 매우 빠른 속도로 분해된다는 것이다. 본 발명에 기술된 높은 생체이용성 쌍성이온-함유 중합체의 부착이 이 문제를 해결한다. 상기 중합체는 안정성을 증가시키고 또한 생체 거주 시간을 증가시킨다. 이것은 약물로서 단순 선형 (비구조화됨), 예를 들면 갈망하는 이점 또는 다기능적 이점을 달성하기 위해 목표로 하는 2, 3, 4 또는 그 이상의 모듈의 시리즈에서 기능적 모듈 마다 약 20개의 아미노산의 모듈을 가능하게 한다. 각각의 모듈은 또한 약간의 구조 ("제한적" 펩티드형)을 가지거나 각각의 모듈은 시스테인 노트 또는 실제로 마크로시클릭 인자와 같은 노트된 펩티드 도메인일 수 있다. 중요한 점은 이들이 합성되거나 N-말단 또는 C-말단 (또는 둘다)에 중합체 컨쥬게이션을 위한 부위 특이적 모이어티 또는 중앙에 중합체 컨쥬게이션 위치로 서로 연결될 수 있다는 것이고, 상기 부착 지점은 천연 아미노산 또는 비-천연 아미노산인 부위 특이적 아미노산일 수 있다는 것이다. 어떠한 의미에서, 이것은 우선적인 특성을 갖는 합성 아비머이다. 모든 아미노산은 합성될 수도 있다. 본 발명에 따른 펩티드 플러스 중합체는 미래의 신규하고 강력한 약물 형태를 기술한다.
당업계의 숙련자들은 본 발명에 따른 고 분자량 중합체의 적용 깊이가 매우 넓음을 이해할 것이다. 그러한 중합체의 컨쥬게이션으로부터 이득이 될 수 있는 치료적 양상에 대한 일부 리스트는: 아비머 (LDL 수용체 A-도메인 스캐폴드), 아드넥틴 (피브리노넥틴형 III 스케폴드), 애블링스 (카멜리드, IIama-ids), NAR (상어), 모든 종 (래트, 토기, 상어, IIama, 낙타 등)으로부터의 하나의-아암 및/또는 단일 도메인 항체, 디아바디, 기타 다중-도메인 기재 단백질, 예를 들면 변형된 피브로넥틴 도메인의 멀티머, 항체 단편 (효능제 또는 길항제로서 scFv 단량체, scFv 다이머), Fab', Fab'-2', 용해성 세포외 도메인 (sTNFR1, 예를 들면, 또는 용해성 cMet 수용체 단편), 오픈 리딩 프라임의 일부로 만들어진 1,500 개의 친수성 아미노산 스트링을 포함하는 Amunix XTEN와의 조합, 올리고뉴클레오티드, 예를 들면 앱타머, microRNA, siRNA, (Fc-영역에 컨쥬게이션된; 비-Fc 영역에 컨쥬게이션된) 전체 항체, (Fc-영역에 컨쥬게이션된; 융합 단백질에 컨쥬게이션된) Fc-융합, (고분자량 중합체가 펩티드 자체에 직접 컨쥬게이트된 경우) CovX 항체 백본의 치환체로서 상기 중합체의 사용, 더 광범위하게는 (CovX 바디, 펩티바디, 인간화된 항체 또는 다른 항체, 펩티드가 상기 항체의 다른 위치에서 컨쥬게이트됨으로서 항체 백본의 상단의 분자에 모듈식 다기능 약물을 형성하는 경우 Carlos Barbas로부터의 신규한 Zyngenia 플랫폼) 전장 천연 또는 뮤테인 항체에 본 발명의 중합체의 부착으로 이루어진다. 또한, 미국 특허 출원 60/514,391에 기술된 많은 도메인 구조가 본 명세서에 그것의 전체 내용이 포함되어 있다. 특히 세포-표면 타겟에 결합하거나 상기를 억제하기 위한 컨쥬게이트가 관심대상이고, 구조물로부터 확장되는 큰 크기의 설정 및 본 발명에 기술된 중합체 컨쥬게이트의 느린 속도가 유리한 생물학적 이점을 가질 수 있다.
본 발명은 안과의 우선적으로 활성 컨쥬게이트의 물리적 존재로 인해 측정된 10일 이상의 유리체내 평균 말단 반감기를 갖는 유리체내 또는 결막하부 투여를 위한 컨쥬게이트를 기술한다. 상기 활성 컨쥬게이트는 또한 상기 중합체의 일 말단에 가깝게 공유 결합된, 2개의 작용제를 함유할 수 있다. 이 경우, 2개의 작용제는 습식 및 건식 연령-관련 황반 변성의 치료를 위한 VEGF 및 PDGF의 앱타머일 수 있다.
본 발명은 췌장의 베타 세포에 결합하는 바와 같이 면역 또는 제거 과정으로부터 세포의 보호인자로서, GLP-1, 수용성 TACI 수용체, BAFF 뿐만 아니라 BAFF 억제제, 인슐린 및 그의 변이체, IL-12 뮤테인 (기능적 항-IL-23 등가물), 항-IL-17 등가물, FGF21 및 뮤테인, RANK 리간드 및 그의 길항체, 대체 보체의 억제를 위한 인자 H 및 융합체 단백질 (Taligen), 면역 시냅스의 억제제, 면역 시냅스의 활성인자, T-세포 및/또는 B/세포 공동자극 경로의 억제인자, 뉴런 세포 및/또는 그들의 지지 기질 세포의 활성인자 또는 억제인자, 세포외 기질 효소, 예를 들면 라이실 옥시다제 또는 메탈로프로테인아제/메탈로프로테아제, 조절 T 세포 또는 항체 생성 세포의 활성인자 또는 억제인자를 포함함으로써, 비만 세포와 같은 세포를 억제하기 위한 세포-표면 활성화 모듈 (ITAM)에 세포-표면 억제 모듈 ((ITAM))을 함께 제공하는 2개의 수용성 또는 세포-표면체의 공동-국지화를 조절하기 위한, 존재하지만 미스-폴딩된 단백질을 새프로닝하기 위한, 유전 질환을 치료하기 위한 체내에서 그들의 수명을 연장하기 위한 세포의 보호 기능을 발휘 (즉, 능동 또는 수동의 국지적 또는 일반화 면역 과정에서의 제거 및/또는 그들의 관여를 감소시키기 위한 생체적합성 증가로부터의 이점을 가질 수 있는 체내의 세포 또는 조직 또는 단백질을 위해 그들에 결합함으로써 생체적합성의 복구)한다.
본 발명은 세포-도입을 매개하기 위한 본 발명의 중합체의 사용을 의도한다. 예를 들면, 본 발명의 중합체의 그들의 개시제 구조 또는 2차 및 1차의 일 이상의 단백질-유도 펩티드 및 양친매성 펩티드의 말단을 통한 컨쥬게이션 (Current Opinion in Biotechnology, 2006, 17, 638-642). 당해 기술분야의 숙련자들은 또한 세포 도입을 용이하게 하기 위하여 펩티드에 탄화수소 모이어티를 결합하는 분류 펩티드 기술과의 조합 가능성을 인식할 것이다.
본 발명은 PLGA와 같은 다른 약물 전달 기술과 본 발명의 조합을 의도한다. PEG의 천연 친수성이 다수의 PLGA 특성을 개선시키므로, 현재 발명의 고 MW 중합체 기술도 이를 더욱 개선시킬 것이다. 예를 들면, 전체 중량의 퍼센트로서 증가된 약물 로딩 (본 기술분야의 현재 생약제학적 상태는 <20%이나 일반적으로는 10% 미만이다)은 또한 일반적인 증가 %로서 >5%이다. 현재 발명의 중합체의 강화된 물 결합은 수용성을 유도하고 생약제학적-중합체 컨쥬게이트로 로딩된 PLGA의 더 높은 로딩 및 생체 내 효율을 증가시킨다.
본 발명은 특정 약물-중합체 컨쥬게이트 (중화 항체의 더 낮은 새로운 발생)에 대한 더 낮은 면역원성을 나타내는 컨쥬게이트를 의도한다. 또한, 차단, 마스킹, 탈-면역화를 의도한다. 존재하는 중화 항체가 제거될 뿐만 아니라 약물-중합체 컨쥬게이트가 가지고 있거나 천연이거나 환자가 면역원성 생약제학적 및 발전된 항체로 이전에 치료되어 가지게된 환자에게 제공될 수 있다. 나중의 환자의 경우, 본 발명은 그러한 환자를 "구조"하는 능력이 의도된 것으로, 치료요법을 그들에게 제공가능하다. 예를 들면, 이것은 환자가 인자 VIII 치료요법 (예를 들면, 그것에 실패한 후 인자 VII 치료요법으로 바꾸는 것보다는)을 유지할 수 있기 때문에 인자 VIII로 유용하다. 본 기술의 측면을 가지고 있는 면역 시스템이 또한 약물이 국소 덴드리틱 및 다른 고유의 및 적응성 면역 세포 집단이 면역원성이 발생이 증가하는 경우 피하 또는 무-바늘 주입을 위한 제형화를 가능하게 한다 .본 발명의 약물-중합체 컨쥬게이트가 다시 면원원성이 감소되거나 존재하는 중성화 항체를 숨긴 후에, 본 기술은 피하 투여를 가능하게 하고 항체 상호작용을 막으므로 적합한 환자 베이스를 확장시켜 과민증과 같은 주입 관련 부작용의 발생을 감소시킬 것이다.
본 발명은 단일 제형으로 조합되는 동일하거나 다른 치료 모이어티에 다른 중합체 컨쥬게이트 집단을 포함시킬 가능성을 가능하게 한다. 결과는 원하는 생체 내 및 시험관내 특성을 조심스럽게 맞추는 것이다. 예를 들면, 단일의 치료 모이어티 및 컨쥬게이트를 단일 포트로 만들거나 다른 크기, 구조체의 2개의 종합체로 포트를 분리시킨다. 2개의 집단은 생체 내에서 다르게 행동할 것이다. 한 집단은 매우 작거나 적은 분지형 중합체를 함유할 수 있다. 두번째 집단은 크거나, 더 분지형인 구조체일 수 있다. 작은 중합체로의 컨쥬게이트는 더 빨리 제거될 것이다. 이것은 예를 들면, 로딩 용량으로서 또는 혈청으로부터 존재하는 사이토카인 (약물 모이어티로서 항-TNF 또는 항-IL-6 scFv의 컨쥬게이션)의 제거에 특이적인 볼루스 만큼 크다. 더 큰 중합체와의 컨쥬게이트는 더 느리고 예를 들면, 신규하게 생성된 TNFa 또는 IL-6를 제거할 것이다. 이것은 집단의 다른 비율, 예를 들면 1:1 또는 2:1 또는 10:1 또는 100:1 등으로 수행될 수 있다. 컨쥬게이트된 치료 모이어티는 동일하지만 다른 컨쥬게이트된 중합체의 결과로서 다른 말단 특성이 있고 다른 생물학적 효과를 가질 수 있다. 다른 예는 목표가 볼루스 측면 (빨리 활성화) 뿐만 아니라 기본 (연장된) 측면을 가지는 단일 주입을 가지는 경우 인슐린 또는 다른 길항적 단백질이 있다. 인자 VIII의 경우, 컨쥬게이트된 인자 VIII의 일 집단은 중합체와 효소 사이의 가수분해성 링커를 가지므로 효소가 빨리 빠져나온다. 두번째 집단은 안정한 링커를 가질 수 있으므로 긴 기간(만성, 예방) 측면을 위해 제공한다.
본 발명은 컨쥬게이션을 생성함으로써 IV 및/또는 SC 주입 이후에, 0차 방출 동역학이 달성될 수 있다. 방출 기간 (1달, 2달, 3달, 4달, 6달, 12달)은 중합체의 크기 및 구조 및 링커 화학에 의존할 것이다. 이는 지리적으로 국지화된 저장소로부터 일정한 양의 약물을 방출하는 의료 장치 또는 펌프와 기능적으로 동일할 것이다. 본 발명의 경우, 상기 약물은 물리적으로 함유될 것이다. 일정한 주기를 갖거나 특정 조직 내에 풍부하게 타겟화하는것 보다는, 발생이 선형 방출 및 최소한의 발사 및 100% 로딩과 유사한 를 갖는 0차 동력학 및 과 유사하거나 동일하도록 설계된다.
당해 기술분야의 숙련자들은 본 발명이 중합체 및 개시제 내에 절단 부위 또는 약한 부위의 도입을 가능하게 함으로써 더 큰 중합체 구조 및/또는 컨쥬게이션이 용이하고 빨리 체내에서 제거되는 작은 조작으로 시간에 따라 분해될 수 있음을 인지할 것이다. 우선 예를 들면 개시제 및 약물, (개시제, 중합체 백본, 단량체) 내의 에스테르 결합 사이의 민감한 링커를 포함한다.
그러한 약한 부위는 수동적으로(예, 가수분해에 의해) 또는 능동적으로(효소에 의해) 파괴될 수 있다. 파괴 또는 제거를 유도하는 그 밖의 접근법은 노출된 화학 물질에서의 변화가 노출된 화학 물질이 신장 또는 간, 또는 파괴 또는 제거를 위한 다른 부위에 대하여 시간에 걸쳐 파괴를 유도하거나, 방출된 중합체의 컨쥬게이트를 타겟으로 하여 이루어지도록 보호기 또는 전구약물 화학물질의 사용을 포함할 수 있다.
도 1은 본 발명의 랜덤 공중합체의 제조를 위한 도식을 보여준다. 개시제 I-I'은 개시제 단편 I 및 라디칼 스캐빈저 I'으로 분해된다. 이후, 개시제 단편 I는 공단량체 M1 및 M2와 반응하여 중합 과정을 개시시키고, 종 A를 생성한다. 이후, 라디칼 스캐빈저 I'은 종 A와 가역적으로 반응하여 종 B를 형성시킬 수 있다. 대안적으로, 종 A는 추가 단량체와 반응하여 중합체의 전파를 계속할 수 있다(종 C). 부수적으로, 종 C의 성장하는 중합체 사슬은 라디칼 스캐빈저 I'와 가역적으로 반응하여 랜덤 공중합체, 종 D를 형성할 수 있다.
도 2는 본 발명의 컨쥬게이트를 보여준다.
도 3은 본 발명의 컨쥬게이트를 보여준다.
VII . 실시예
실시예 1. N-(2- 히드록시에틸 )- 엑소 -3,6-에폭시-1,2,3,6- 테트라하이드로파탈이미드의 제조
Figure pct00047
교반바가 구비된 100-ml 둥근 바닥 플라스크에 50 ml의 에탄올 및 2.0 g의 엑소-3,6-에폭시-1,2,3,6-테트라하이드로프탈산 무수물을 충전시켰다. 교반된 혼합물을 얼음 수조로 냉각시키고, 20 ml의 에탄올 중의 0.73 g의 에탄올아민의 용액을 10분에 걸쳐 적가하였다. 반응을 4시간 동안 환류 가열시킨 후, 밤새 냉각시켰다. 여과하고, 에탄올로 세정하여 0.73 g의 요망되는 생성물을 백색 결정질 고형물로서 수득하였다. 여과액을 농축시키고 다시 냉각시켜 이차 결정물을 수득하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3):　δ= 2.90 (s, 2H, CH),　3.71 (m, 2H, OCH2), 3.77 (t, J=5.0 Hz, NCH2), 5.29 (t, J=1.0 Hz, 2H, OCH), 6.53 (t, J=1.0 Hz, 2H, CH=CH).
실시예 2. 이소프로필이덴 -2,2- 비스(히드록시메틸)프로피온산의 제조
Figure pct00048
교반바가 구비된 100-ml 둥근 바닥 플라스크에 50 ml의 아세톤, 13.8 ml의 2,2-디메톡시프로판, 10 g의 2,2-비스(히드록시메틸)프로피온산, 및 0.71 그램의 p-톨루엔술폰산 일수화물을 충전시켰다. 혼합물을 주위 온도에서 2시간 동안 교반시킨 후, 메탄올 중의 1 ml의 2M 암모니아로 중화시켰다. 용매를 증발시키고, 혼합물을 디클로로메탄 중에 용해시킨 후, 20 ml의 물로 2회 추출하였다. 유기 상을 마그네슘 술페이트 상에서 건조시키고, 증발시켜 백색 결정질 고형물로서 10.8 g의 생성물을 제공하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3):　δ= 1.20 (s, 3H, CH3CC=O), 1.43 (s, 3H, CH3),　1.46 (s, 3H, CH3), 3.70 (d, J=12.4 Hz, 2H, OCH2), 4.17 (d, J=12.4 Hz, 2H, OCH2).
실시예 3. N,N- 디메틸피리디늄 p- 톨루엔술포네이트 ( DPTS )의 제조
Figure pct00049
10 ml의 벤젠 중의 1.9 g의 p-톨루엔술폰산 일수화물의 용액을 Dean-Stark 트랩을 사용하여 공비 증류에 의해 건조시킨 후, 3.42 g의 4-디메틸아미노피리딘을 첨가하였다. 다량의 고형물이 형성되었고, 반응을 일으키는데 추가 25 ml의 벤젠이 필요했고, 실온으로 냉각시키면서 서서히 교반하였다. 생성된 고형물을 여과로 분리하고, 10 ml의 벤젠으로 세척하고, 건조시켜 백색 고형물로서 7.88 g의 생성물을 수득하였다.
실시예 4. 보호된 말레이미드 브로모프로피오네이트 개시제의 제조
Figure pct00050
교반바가 구비된 100-ml 둥근 바닥 플라스크에 50 ml 테트라하이드로퓨란, 2 g의 N-(2-히드록시에틸)-엑소-3,6-에폭시-1,2,3,6-테트라하이드로파탈이미드, 및 2.0 ml 트리에틸아민을 충전시켰다. 교반된 혼합물을 0도로 냉각시키고, 5 ml의 테트라하이드로퓨란 중의 1.18 ml의 2-브로모이소부티릴 브로마이드의 용액을 30분에 걸쳐 적가하였다. 반응물을 3시간 동안 얼음 상에서, 이어서 실온에서 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 농축시켜 오일성 잔류물을 제공하고, 이를 헥산 중의 30 내지 50% 에틸 아세테이트로 실리카 겔 플래시 크로마토그래피에 의해 정제하여 백색 분말로서 1.96 g의 요망되는 생성물을 제공하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3):　δ= 1.89 (s, 6H, CH3), 2.87 (s, 2H, CH),　 3.82 (t, J=5.4 Hz, 2H, NCH2), 4.33 (t, J=5.4 Hz, 2H, OCH2), 5.27 (t, J=1.0 Hz, 2H, OCH), 6.51 (t, J=1.0 Hz, 2H, CH비닐).
실시예 5. 보호된 말레이미드 비스 ( 브로모프로피오네이트 ) 개시제의 제조
보호된 말레이미드 이소프로필이덴 산.
Figure pct00051
30 ml의 건성 디클로로메탄 중의 2.00 g의 N-(2-히드록시에틸)-엑소-3,6-에폭시-1,2,3,6-테트라하이드로파탈이미드 및 1.67 g의 이소프로필이덴-2,2-비스(히드록시메틸)프로피온산의 용액을 563 mg의 DPTS와 함께 10 ml의 건성 디클로로메탄 중의 2.37 g의 N,N'-디시클로헥실카르보디이미드의 용액으로 적가처리하였다. 반응 혼합물을 주위 온도에서 밤새 교반시킴에 따라 다량의 고형물이 형성되기 시작하였다. 반응물을 여과시키고, 침전물을 소량의 디클로로메탄으로 세척하였다. 합한 유기층을 농축시켜 소량의 고형물을 함유하는 투명한 오일을 제공하였다. 이 오일을 헥산 중의 처음 20 내지 100% 에틸 아세테이트를 사용하여 실리카 겔 상의 플래시 컬럼 크로마토그래피 처리하였다. 요망되는 생성물을 함유하는 분획을 합하고 농축시켜 백색 고형물로서 3.17 g의 최종 생성물을 제공하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ= 1.19 (s, 3H, CH3CC=OO), 1.37 (s, 3H, CH3), 1.41 (s, 3H, CH3), 1.55 (s, 6H, (CH3)2C), 2.86 (s, 2H, C=OCHCHC=O), 3.58 (d, J=12Hz, CH2O), 3.78 (t, J=5.4Hz, CH2CH2O), 4.14 (d, J=12H, CH2O), 4.30 (t, J=5.4Hz, CH2CH2O), 5.27 (t, 2H, CHOCH), 6.51 (s, 2H, CH=CH).
보호된 말레이미드 디올.
Figure pct00052
50 ml의 메탄올 중의 상기로부터의 이소프로필이덴 화합물의 용액을 1.0 g의 Dowex 50Wx8-100 이온 교환 수지 (H+ 형태)로 처리하고, 반응물을 실온에서 밤새 교반하였는데, 이때 반응은 tlc (실리카 겔, 에틸 아세테이트)에 의해 완료된 것으로 나타났다. 혼합물을 여과시키고, 고체 수지를 소량의 메탄올로 세척하였다. 합한 유기물을 농축시키고, 고진공 하에 두어 추가의 정제 없이 다음 반응에서 사용되는 1.55 g의 약간 탁한 오일을 제공하였다.
보호된 말레이미드 비스(브로모프로피오네이트) 개시제.
Figure pct00053
40 ml의 무수 테트라하이드로퓨란 (THF) 중의 상기로부터의 미정제 생성물의 용액을 1.45 ml의 트리에틸아민과 함께 얼음 수조 중에서 냉각시키고, 20 ml의 무수 THF 중의 1.23 ml의 2-브로모이소부티릴 브로마이드의 용액을 수분에 걸쳐 적가하였다. 반응물을 30분 동안 차가운 조건에서 교반한 후, 실온으로 6시간에 걸쳐 가온시켰다. 추가 600 μl의 트리에틸아민, 이어서 추가 0.5 ml의 2-브로모이소부티릴 브로마이드를 첨가하였다. 반응물은 pH 시험지에 의해 측정하는 경우 산성이었고, 추가 200 μl의 트리에틸아민을 첨가하여 용액의 pH를 9로 조절하였다. 반응물을 밤새 교반하고, 농축시키고, 잔여물을 50 ml의 디클로로메탄과 50 ml의 물로 분배하였다. 유기 층을 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켜 오일을 제공하였다. 이를 헥산 중의 처음 20%, 이어서 30%, 마지막으로 40% 에틸 아세테이트로 실리카 겔 상의 플래시 컬럼 크로마토그래피 처리하였다. 생성물을 함유하는 분획을 합하고, 농축시켜 백색 고형물로 고형화된 1.63g의 오일을 제공하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3):　δ= 1.32 (s, 3H, CH 3CC=O), 1.91 [s, 12H, (CH3)2CBr], 2.90 (s, 2H, CHC=O), 3.78 (t, 2H, NCH2CH 2O), 4.28 (t, 2H, NCH 2CH2O), 4.31 (app q, 4H, CH2OC=O), 5.30 (s, 2H, CHOCH), 6.52 (s, 2H, CH=CH).
실시예 6. N-[2-(2- 히드록시에톡시 )에틸]- 엑소 -3,6-에폭시-1,2,3,6- 테트라하이드로파탈이미드의 제조
Figure pct00054
교반바가 구비된 250 ml 둥근 바닥 플라스크에 100 ml의 메탄올 및 20 g의 엑소-3,6-에폭시-1,2,3,6-테트라하이드로프탈산 무수물을 충전시켰다. 교반된 혼합물을 0도로 냉각시키고, 40 ml의 메탄올 중의 0.73 그램의 2-(2-아미노에톡시)에탄올의 용액을 45분에 걸쳐 적가하였다. 반응물을 실온에서 2시간 동안 교반한 후, 밤새 약하게 환류 가열시켰다. 용액을 농축시키고, 생성물을 100 ml의 디클로로메탄 중에 용해시킨 후, 100 ml의 브라인으로 세척하였다. 유기 층을 황산나트륨 상에서 건조시키고, 농축시키고, 100 ml의 디클로로메탄 및 100 ml의 에틸 아세테이트로 실리카 겔 플러그에 통과시켜 정제하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3):　δ= 2.90 (s, 2H, CH),　 3.49 (m, 2H, OCH2), 3.59 (m, 4H, OCH2), 3.65 (m, 2H, NCH2), 5.15 (t, J=0.8 Hz, 2H, OCH), 6.55 (t, J=0.8 Hz, 2H, CH=CH).
실시예 7. 비스 2,2-[(2- 브로모이소부티릴 ) 히드록시메틸 ]프로피온산의 제조
Figure pct00055
교반바가 구비된 500 ml 둥근 바닥 플라스크를 200 ml의 디클로로메탄, 8.0 g의 2,2-비스(히드록시메틸)프로피온산, 및 33.5 ml의 트리에틸아민으로 충전시켰다. 교반된 혼합물을 0도로 냉각시키고, 30 ml의 디클로로메탄 중의 14.7 ml의 2-브로모이소부티릴 브로마이드의 용액을 30분에 걸쳐 적가하였다. 반응물을 1.5시간 동안 얼음 상에서 교반시킨 후, 실온으로 밤새 가온시켰다. 침전물을 추가 디클로로메탄을 지닌 용액으로 취하고, 혼합물을 400 ml의 0.5 N 염산으로 세척하고, 무수 황산나트륨 상에서 건조시켰다. 반응 혼합물을 농축시켜 오일성 잔류물을 제공하고, 이를 1% 아세트산을 함유하는 헥산 중의 30 내지 40% 에틸 아세테이트를 사용하여 실리카 겔 상의 플래시 크로마토그래피에 의해 정제하여 백색 왁스형 고형물로서 27.4 g의 요망되는 생성물을 제공하였다. 1H NMR (400 MHz, CD3OD):　δ= 1.33 (s, 3H, CCH3), 1.90 (s, 12H, (CH 3)2CBr),　4.30 (d, J=5.4 Hz, 2H, NCH2), 4.39 (d, J=5.4 Hz, 2H, OCH2).
실시예 8. 보호된 말레이미드 연장형 비스 ( 브로모프로피오네이트 ) 개시제의 제조
Figure pct00056
교반바가 구비된 250 ml 둥근 바닥 플라스크에 100 ml의 디클로로메탄, 1.0 g의 N-[2-(2-히드록시에톡시)에틸]-엑소-3,6-에폭시-1,2,3,6-테트라하이드로파탈이미드, 실시예 7로부터의 2.5 g의 디브롬산, 0.5 g의 디메틸아미노피리딘, 및 0.35 그램의 DPTS을 충전시켰다.　 질소를 용액을 통해 잠시 동안 거품발생시키고, 1.6 그램의 DCC를 서서히 첨가하였다. 반응을 실온으로 밤새 교반시켰다. 여과시키고, 증발시켜 실리카 겔 플래시 크로마토그래피에 의해 정제된 분홍색 오일성 잔류물을 제공하였다. 1H NMR (400 MHz, CD3OD):　 δ= 1.34 (s, 3H, CH3), 1.90 (s, 6H, CH3), 2.94 (s, 2H, CH),　3.64 (m, 6H, OCH2), 4.22 (t, J=5.4 Hz, 2H, NCH2), 4.35 (app q, 4H, OCH2), 5.15 (t, J=1.0 Hz, 2H, OCH), 6.54 (t, J=1.0 Hz, 2H, CH=CH).
실시예 9. 아세탈 비스 ( 브로모프로피오네이트 ) 개시제의 제조
Figure pct00057
50 ml의 디클로로메탄 중의 1.03 g의 3,3-디에톡시-1-프로판올 및 3.0 g의 2,2-비스(2-브로모이소부티릴옥시메틸)프로피온산의 용액을 817 mg의 N,N-디메틸피리디늄 p-톨루엔술포네이트와 함께 1.58 g의 N,N'-디시클로헥실카르보디이미드로 처리하고, 반응물을 주위 온도에서 밤새 교반하였다. 반응물을 여과시키고, 침전물을 소량의 디클로로메탄으로 세척하였다. 합한 유기물을 농축시키고, 잔류물을 헥산 중의 10 내지 20% 에틸 아세테이트로 실리카 겔 상의 플래시 컬럼 크로마토그래피 처리하였다. 요망되는 생성물을 함유하는 분획을 합하고, 농축시켜 2.87 g의 투명한 무색 오일을 제공하였다. 1H NMR에 의해 측정하는 경우 물질이 여전히 순수하지 않아서 다시 디클로로메탄을 사용하여 실리카 겔상의 플래시 컬럼 크로마토그래피 처리하였다. 적절한 분획을 합하고, 농축시켜 점성의 투명 오일로서 2.00 g의 요망되는 생성물을 제공하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3):　δ= 1.20 (t, 6H, CH 3CH2O), 1.34 (s, 3H, CH 3CC=O), 1.92 [s, 12H, (CH3)2CBr], 1.98 (app q, 2H, CHCH 2CH2), 3.50 (m, 2H, OCH 2CH3), 3.66 (m, 2H, OCH 2CH3), 4.24 (t, 2H, CH2CH 2OC=O), 4.37 (app q, 4H, CH2OC=OCBr), 4.60 (t, 1H, O-CH-O).
실시예 10. 비닐 비스 ( 브로모프로피오네이트 ) 개시제 1의 제조
Figure pct00058
교반바가 구비된 100 ml 둥근 바닥 플라스크에 30 ml의 디클로로메탄, 86 밀리그램의 4-펜텐-1-올, 실시예 7로부터의 432 밀리그램의 디브롬산, 및 88 밀리그램의 DPTS을 충전시켰다. 질소를 용액을 통해 잠시 동안 기포발생시키고, 169 μl의 N,N'-디이소프로필카르보디이미드를 서서히 첨가하였다. 반응물을 실온에서 밤새 교반한 후, 추가 0.1 그램의 DPTS를 첨가하고, 반응물을 밤새 다시 교반하였다. 여과하고, 증발시키고, 헥산 중의 20 내지 40%를 사용하여 실리카 겔 상의 플래시 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 용매를 첫 번째 생성물로부터 제거하여 컬럼을 수행하여 무색 오일로서 0.13 g의 요망되는 생성물을 수득하였다. 1H NMR (400 MHz, CD3OD):　δ= 1.34 (s, 3H, CH3), 1.77 (m, 2H, CH2CH 2CH2), 1.90 (s, 12H, CH3), 2.15 (q, J=7.2 Hz, 2H, CHCH 2CH2), 4.16 (t, J=6.4 Hz, 2H, OCH2), 4.36 (app. q, 4H, CCH2O), 5.02 (m, 2H, CH 2=CH), 5.82 (m, 1H, CH2=CH).
실시예 11. 비닐 비스 ( 브로모프로피오네이트 ) 개시제 2의 제조
Figure pct00059
교반바가 구비된 100 ml 둥근 바닥 플라스크에 25 ml의 디클로로메탄, 370 밀리그램의 에틸렌 글리콜 모노비닐 에테르, 실시예 7로부터의 432 밀리그램의 디브롬산, 및 590 g의 DPTS을 충전시켰다. 플라스크를 질소로 채우고, 681 μl의 N,N'-디이소프로필카르보디이미드를 서서히 첨가하였다. 반응물을 실온에서 밤새 교반시켰다. 혼합물을 여과한 후, 건조시키고, 헥산 중의 5 내지 10% 에틸 아세테이트를 사용하여 실리카 겔 상의 플래시 크로마토그래피로 정제하여 무색 오일로서 생성물을 수득하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3):　δ= 1.36 (s, 3H, CH3), 1.92 (s, 12H, CH3),　3.90 (app q, J=5.4 Hz, 2H, NCH 2CH2O), 4.05 (dd, 1H, J=2.4, 6.8 Hz, =CH), 4.19 (dd, J=2.4, 14.4 Hz, 1H, =CH), 4.39 (m, 2H, NCH2CH 2O), 4.40 (app q, 4H, OCH2), 6.45 (dd, 1H, J=6.8, 14.4 Hz, =CHO).
실시예 12. Boc -아미노 비스 ( 말레이미드 ) 개시제의 제조
Figure pct00060
50 ml의 디클로로메탄 중의 2.19 g의 N-Boc-3-아미노-1-프로판올 및 5.20 g의 2,2-비스(2-브로모이소부티릴옥시메틸)프로피온산의 용액을 350 mg의 DPTS와 함께 3.0 g의 N,N'-디시클로헥실카르보디이미드로 처리하고, 반응물을 주위 온도에서 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 여과하고, 침전물을 소량의 디클로로메탄으로 세척하였다. 농축시키고, 헥산 중의 5 내지 20% 에틸 아세테이트로 실리카 겔 상의 플래시 컬럼 크로마토그래피로 처리하였다. 적절한 분획을 합하고, 농축시켜 소량의 고형 잔여물을 함유하는 오일을 제공하였다. 이러한 물질을 에틸 아세테이트 중에 취하고, 여과하였다. 다시 농축시켰는데 소량의 고형물을 여전히 함유하는 오일이 제공되어 물질을 다시 에틸 아세테이트 중에 취하고, 여과하고, 농축시켜 요망되는 생성물을 등명한 오일로서 수득하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ= 4.8 (br s, 1H, NH), 4.37 (app q, 4H, CH2OC=OCBr), 4.22 (t, 2H, CH2CH 2OC=O), 3.20 (app q, 2H, NHCH2), 1.92 [s, 12H, (CH3)2CBr ], 1.85 (t, 2H, CH2CH 2CH2), 1.43 (s, 9H, (CH3)3O), 1.35 (s, CH 3CC=O).
실시예 13. 보호된 말레이미드 4-올의 제조
Figure pct00061
교반바가 구비된 100 ml 둥근-바닥 플라스크에 30 ml의 디클로로메탄, 실시예 7로부터의 1.6 g의 디올, 1.71 g의 이소프로필이덴-2,2-비스(히드록시메틸)프로피온산, 및 0.5 g의 DPTS을 충전시켰다. 용액을 통해 질소를 잠시 동안 기포발생시키고, 1.70 ml의 N,N'-디이소프로필카르보디이미드를 서서히 첨가하고, 반응물을 실온에서 밤새 교반시켰다. 여과하고, 증발시키고, 헥산 중의 10 내지 40% 에틸 아세테이트를 사용하여 실리카 겔 상의 플래시 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 디클로로메탄 중의 2% 메탄을을 사용하여 실리카 겔 상의 플래시 크로마토그래피에 의해 이차 정제하여 약 2 g의 무색 오일을 수득하였다. 이 오일을 25 ml의 메탄올 중에 용해시키고, Dowex 50WX8-100 수지 (H+ 형태)로 실온에서 60시간 동안 교반하였다. 반응물을 여과하고, 농축시킨 후, 디클로로메탄 중의 150 ml의 15% 메탄올로 실리카 겔 플러그에 통과시켰다. 증발시켜 1.3 g의 거의 무색의 경성 포움을 수득하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3):　δ= 1.13 (s, 6H, CH3), 1.25 (s, 3H, CH3), 2.96 (s, 2H, CHC=ON), 3.57-3.65 (m, 8H, CH2OH), 3.64 (t, J=2.8 Hz, 2H, CH2CH 2OC=O),4.22 (app q, 4H, C(CH3)CH 2OC=Ol), 4.22 (t, J=2.8 Hz, CH 2CH2OC=O), 5.21 (t, J=0.8 Hz, CHOCH), 6.55 (t, J=0.8 Hz, CH=CH).
실시예 14. 보호된 말레이미드 테트라 ( 브로모프로피오네이트 ) 개시제의 제조
Figure pct00062
교반바가 구비된 100 ml 둥근 바닥 플라스크에 20 ml의 디클로로메탄, 실시예 13으로부터의 0.55 g의 테트라올, 및 1.69 ml의 트리에틸아민을 충전시켰다. 교반된 혼합물을 0도로 냉각시키고, 10 ml 디클로로메탄 중의 0.99 ml의 2-브로모이소부티릴 브로마이드의 용액을 적가하였다. 반응물을 실온에서 밤새 교반시킨 후, 50 ml의 반포화된 소듐 바이카보네이트로 세척하였다. 반응 혼합물을 농축시키고, 헥산 중의 40% 에틸 아세테이트로 실리카 겔 상의 플래시 크로마토그래피에 의해 정제하여 오일성 갈색 생성물을 제공하였다. 갈색 생성물을 메탄올 중에서 용해시키고, 차콜로 처리하여 색을 제거하여 0.68 g의 요망되는 생성물을 연한 갈색 오일로서 수득하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3):　δ= 1.26 (s, 3H, CH 3CC=O), 1.34 (s, 6H, CH 3CC=O), 1.90 (s, 24H, (CH3)2CBr), 2.95 (s, 2H, CH), 3.78 (t, J=5 Hz, 2H, NCH2), 4.25 (m, 6H, OCH2C (4H) and OCH 2CH2N (2H)), 4.35 (app q, 8H, OCH2), 5.23 (t, J=1 Hz, 2H, CHOCH), 6.55 (t, J=1 Hz, 2H, CH=CH).
실시예 15. 고분자량 쌍성이온성 중합체의 제조
"생" 조절된 자유 라디칼 공정인 원자 이동 라디칼 중합(ATRP)을 이용하여 고분자량의 쌍성이온성 단량체, 2-메타크릴로일옥시에틸 포스포릴콜린 (HEMA-PC)의 조절되어 제조된 친수성 중합체를 생성시키는 대표적인 프로토콜은 하기와 같다.
하기 개시제가 사용되었다:
PMC2M1(실시예 4로부터)
Figure pct00063
PMC2Ms(실시예 5로부터)
Figure pct00064
PMC2M4(실시예 14로부터)
Figure pct00065
개시제 및 리간드(2,2'-바이피리딜)를 Schlenk 튜브에 넣었다. 디메틸 포름아미드 또는 디메틸설폭사이드를 개시제와 리간드의 중량%가 약 20중량%가 되도록 적가하였다. 생성된 용액을 건조 얼음/아세톤 혼합물을 사용하여 -78℃로 냉각시키고, 10분 동안 진공 하에 탈기시켰다. 튜브를 질소 하에 다시 채우고, 촉매(달리 지시되지 않는 한 CuBr)를 질소하에 유지시키면서 Schlenck 튜브에 채웠다(브롬/촉매/리간드의 몰비는 1/1/2로 유지됨). 용액은 즉시 암갈색이 되었다. Schlenck 튜브를 밀봉하고 -78℃로 유지하였다. 용액을 진공/질소 사이클을 3회 적용시킴으로써 퍼징시켰다. 질소하에서 유지시키면서 소정량의 단량체를 200프루프의 탈기된 에탄올과 혼합함으로써 HEMA-PC의 용액을 제조하였다. 단량체 용액을 약한 교반에 의해 Schlenk 튜브에 적가하였다. 온도를 -78℃로 유지하였다. 관통 진공을 적어도 10 내지 15분 동안 용액으로부터 거품발생이 중지될 때까지 혼합물에 가하였다. 이후, 튜브를 질소로 재충전시키고, 실온으로 가온시켰다. 용액을 교반하고, 중합이 진행됨에 따라 용액은 점성이 되었다. 3 내지 8시간 후, 반응물을 공기에 직접적인 노출에 의해 켄칭시켜 Cu (I) 내지 Cu (II)로 산화시키자, 혼합물은 색깔이 청녹색이 되었고, 이를 실리카 컬럼에 통과시켜 구리 촉매를 제거하였다. 수집된 용액을 회전 증발기에 의해 농축시키고, 생성된 혼합물을 테트라하이드로푸란으로 침전시키거나 물에 대해 분석한 후 건조동결시켜 자유 유동하는 백색 분말을 수득하였다.
여러 중합 반응으로부터의 데이터가 하기 표에 기재되어 있다.
Figure pct00066
최고 분자량(g/mol) 및 다분산성 (PDI)을 폴리(에틸렌 옥사이드) 표준으로 보정된 Shodex OHpak SB-806M HQ 컬럼에 의해 측정하였다.
실시예 16. 레트로 Diel - Alder 반응을 사용하여 퓨란 -보호된 말레이미드 기능화 된 중합체의 비보호
실시예 15로부터의 중합체를 둥근 바닥 플라스크에서 에탄올 (20 내지 50중량%) 중에 용해시켰다. 에탄올을 회전 증발기에 의해 서서히 제거하여 플라스크 벽에 박막을 형성시켰다. 반응 용기를 진공 하에서 110℃ 이상의 온도의 오일 배쓰에 90분 동안 넣은 후, 실온으로 냉각시켰다.
1HNMR (400MHz, d-메탄올)에 의해 모니터링된 말레이미드 작용기의 비보호:
Figure pct00067
비보호 전: δ(ppm):5.2 (2H, -CH-O-CH-) 및 6.6 (2H, -CH=CH-).
비보호 후: δ(ppm): 6.95 (2H, -CO-CH=CH-CO-).
실시예 17. 인간 IgG 의 펩신 분해 및 F( ab' )2 단편의 정제
실시예 15의 기능화된 중합체로의 컨쥬게이션을 위한 F(ab')2 항체 단편의 생성에서 사용하기 위해 전체 인간 IgG를 Innovative Research, Jackson Immunochem, and/or Rockland Laboratories로부터 구입하였다. IgG를 고정된 펩신(Thermo Scientific)을 이용하여 분해한 후, 투석에 의하거나 PD-10 탈염 컬럼(GE Healthcare)을 이용함으로써 소듐 아세테이트 완충액을 이용하여 4.5로 pH 조정하였다. pH 조정 후, 0.5 ml 양의 고정된 펩신을 소듐 아세테이트 완충액, pH 4을 이용하여 3회 세척하고, 0.5 ml의 최종 부피로 재현탁시켰다. 1 ml의 IgG를 고정된 펩신에 10 mg/ml의 농도로 첨가하고, 37℃에서 로커(rocker)/진탕기 상에 두었다. 4시간 동안 분해시켰다. 4시간 후, 40 ㎕의 샘플을 분리시키고, PBS 이동상을 갖는 Shodex Protein KW-802.5 컬럼을 이용한 HPLC에 의해 분석하였다. IgG 피크를 F(ab')2 피크로부터 분리시키고, 분해된 퍼센트를 기초로 하여 분해의 진행을 결정하였다. 고정된 펩신은 힌지 영역을 넘어서는 Fc 도메인만을 분리시킴으로써 F(ab')2 항체 단편을 발생시키는데 사용되는 단백질분해성 효소이다. 이는 힌지 영역 내의 공유 이황화결합에 의해 연결된 2개의 항체-결합 Fab' 단편으로 구성되는 F(ab')2 단편을 발생시킨다.
IgG의 F(ab')2로의 분해 후, 샘플을 원심분리시켜 분해된 항체 단편으로부터 고정된 펩신의 겔을 분리시키고, 수지를 3회 세척하였다. 세척물을 본래의 상층액과 조합시켰다. F(ab')2 항체 단편을 Superdex 200 HR 10/30 컬럼(GE Healthcare) 및 PBS를 이용하여 Fc 단편으로부터 정제하였다. 정제된 F(ab')2가 먼저 용리된 후, Fc 단편이 용리되었다. 정제된 F(ab')2를 2-8℃에서 저장하였다.
실시예 18. Fab' 단편으로의 말레이미드 기능화 된 중합체의 컨쥬게이션
용액 중의 15 mM의 최종 농도의 소듐 보로히드라이드를 이용한 이황화결합의 환원에 의해 실시예 17의 F(ab')2 제조물로부터 Fab' 단편을 생성시켰다. F(ab')2 제조물을 4 mM EDTA를 함유하는 PBS를 이용하여 희석시키고, 동일 완충액 중의 동일 부피의 소듐 보로히드라이드를 첨가하고, 혼합물을 실온에서 교반 플레이트 상에 두었다. 반응을 실온에서 1-1.5시간 동안 진행시키고, 환원의 진행을 Shodex Protein KW-802.5 컬럼 및 이동상으로서 PBS를 이용하는 HPLC에 의해 모니터하였다. F(ab')2의 90% 이상이 소모된 경우에 환원이 완료된 것으로 간주하였다. 이황화물 환원 직후, 0.1N HCl을 이용하여 샘플 pH를 약 4-5로 조정하였다. 용액의 pH 조정 후, 샘플을 추가 10분 동안 혼합한 후, 0.1N NaOH를 이용하여 pH를 6.5-7.5로 조정하였다. 교반하면서, 10-몰 과량의 실시예 16으로부터의 말레이미드 기능화된 중합체를 혼합물에 첨가하고, 실온에서 인큐베이션하였다. HPLC에 의한 분석을 위해 0 시간에서 샘플을 분리시키고, 반응의 진행을 모니터하기 위해 1 및 2시간에서 다시 분리시켰다. Waters Alliance 2695 HPLC system 2695에는 Waters 2996 Photodiode Detector 및 PBS 이동상을 갖는 Shodex Protein KW-803 컬럼이 장비되었다. 컨쥬게이션 효율을 220 nm 및 280 nm에서 모니터하였다. 2시간 후, 샘플을 AKTA Prime Plus (GE Healthcare) 및 Superdex 200 HR 10/30 분취용 크기 배제 컬럼을 이용하여 정제하였다. 사용된 용리 완충액은 PBS였다. 중합체 컨쥬게이션된 Fab'가 먼저 용리된 후, 유리 중합체 및 반응되지 않은 Fab'이 용리되었다. 수거된 분획을 PBS 이동상을 갖는 Shodex Protein KW-803 컬럼을 이용하여 분석하였다. 정제된 Fab' 컨쥬게이트를 함유하는 분획을 조합시키고, Sartorius로부터의 Vivaspin 2 (3000 MWCO) 필터를 이용하여 농축시켰다.
실시예 19. 200 kDa 말레이미드 기능화 된 중합체로의 항- VEGF 앱타머의 컨쥬게이션
말단 아민을 함유하는 항-VEGF 앱타머 (Agilent, Boulder, CO)를 실시예 15의 말레이미드 기능화된 중합체(샘플 5)에 컨쥬게이션시킨 후, 실시예 16에 따라 탈보호시켰다. 하기와 같이 말단 아민을 티올로 전환시키는데 트라우트 시약(Traut's Reagent)을 사용하였다. 앱타머 (5.4 mg)를 500 ㎕의 0.1M 소듐 바이카보네이트 완충액, pH=8.0에 용해시켰다. 독립된 바이얼에서, 7.2 mg의 2-이미노티올란 HCl(트라우트 시약, Sigma)을 3.6 ml의 정제수에 용해시켜 2 mg/ml 용액을 생성시켰다. 100 ㎕ 양의 2-이미노티올란 HCl을 앱타머 혼합물에 첨가하고, 1시간 동안 실온에서 교반하였다. 트라우트 시약을 함유하는 앱타머 샘플을 PD-10 탈염 컬럼 상을 통과시켜 임의의 반응되지 않은 2-이미노티올란을 제거하고, 최종 완충액을 4 mM EDTA를 함유하는 PBS로 교환하였다. 말단 티올기를 함유하는 앱타머 샘플의 적은 일부를 실온에서 교반 막대와 혼합하고, 지속적으로 교반하면서 14.0 mg의 말레이미드 기능화된 중합체를 반응물에 첨가하였다. KW-803 컬럼, PBS 이동상 및 1 ml/분의 유속을 이용하는 HPLC에 의한 분석을 위해 0시간에서 60 ㎕ 샘플을 분리시켰다. 샘플을 220 and 280 nm의 파장에서 뿐만 아니라 굴절 지수 검출에 의해 모니터하였다. 분취량을 분리시키고, 2시간 후에 시험하고, 밤새 4℃에서 교반한 후에 다시 시험하였다.
앱타머 컨쥬게이트를 용리액으로서 포스페이트 완충액을 이용하는 Superdex 200 HR 10/30(GE Healthcare) 상에서의 동용매(isocratic) 구배를 이용하여 정제하였다. 정제된 컨쥬게이트가 먼저 용리된 후, 반응되지 않은 중합체 및 잔여 앱타머가 용리되었다.
실시예 20. 중합체- 아프타머 컨쥬게이트를 사용한 PLGA 미소 구체 제조
실시예 19로부터의 중합체-아프타머 컨쥬게이트를 폴리(락틱-코-글리콜)산 (PLGA) 미소 구체를 지닌 유중유 용매 혼합물로 제형화하였다. 중합체-아프타머 컨쥬게이트 (20 mg)를 실온에서 디클로로메탄 중 0.1% 클로로포름 중의 100 mg/ml PLGA의 용액에 현탁시켰다. 현탁된 컨쥬게이트를 폴리(디메틸) 실록산과 혼합하여 미소 구체의 균일한 분산액을 제조하였다. 상기 혼합물을 헵탄을 함유한 플라스크로 옮기고, 실온에서 3 시간 동안 교반하였다. 얻어진 미소 구체를 분리하고, 0.2 마이크론 필터를 이용하여 수집하고 진공 하에서 밤새 건조시켰다.
실시예 21. 무테인 인자 VIII 를 50, 100, 및 200 kDa 말레이미드 작용화된 중합체 (2개의 아암을 지닌 중합체)에 및 100 및 200 kDa 작용화된 중합체 (4개의 아암을 지닌 중합체)에 컨쥬게이션
BDD 인자 VIII와 시스테인 무테인의 사이트 특이적 컨쥬게이션(미국특허 제7,632,921호)을 고정화된 트리스(2-카르복시에틸)포스핀(TCEP) 또는 디티오트리에톨(DTT) 중 어느 하나를 사용하여 환원시켜 "캡(cap)"을 방출시켰다. 환원 후에, 환원제인 고정화된 TCEP를 원심분리를 통해 제거하거나, DTT를 사용할 때, PD-10 탈염화 컬럼(GE Healthcare)을 이용하여 제거를 수행하였다. BDD 인자 VIII 상의 환원된 시스테인을 실온에서 2 시간 이하 동안, 또는 4℃에서 밤새, 1배 내지 10배 몰 과량의, 50 내지 200 kDa (2-아암) 또는 100 내지 200 kDa (4-아암)의 분자량을 갖는 실시예 16으로부터의 말레이미드 작용화된 중합체로 처리하였다. 최종 컨쥬게이션된 BDD 인자 VIII 샘플을 소듐 클로라이드 구배를 이용한 음이온 교환 크로마토그래피를 이용하여 정제하였다. 컨쥬게이션된 무테인을 미반응된 인자 VIII 및 자유 말레이미드 작용화된 중합체로부터 분리하였다. 분별된 샘플들을 확인을 위해 SEC HPLC 및 SDS-PAGE로 분석하였다. 인자 VIII의 컨쥬게이션된 무테인을 함유한 모든 분획들을 합하고 PD-10 탈염화 컬럼을 이용하여 소듐 포스페이트 완충제 중에서 최종 제형으로 완충제 교환하였다. 특정 경우에서, 컨쥬게이션 반응에서 사용되는 말레이미드 작용화된 중합체의 분자량에 따라, 미반응된 종들로부터 컨쥬게이션된 인자 VIII를 분리시키기 위해 SEC를 이용한 추가 정제가 요구된다.
실시예 22. 50 내지 200 kDa 말레이미드 작용화된 중합체에 scFV 의 컨쥬게이션
c-말단 보호된 시스테인으로 개질된 scFv 분절을 4 mM EDTA를 함유한 PBS로 희석시키고, 동일한 완충제 중의 동일한 부피의 소듐 보로하이드라이드를 첨가하였다. 상기 혼합물을 실온에서 교반 플레이트 상에 배치시켰다. 대안적으로, 환원을 고정화된 TCEP를 이용하여 6 내지 7의 pH 범위에서 수행하였다. 반응물을 실온에서 0.5 내지 2 시간 동안 진행시키고, 환원의 진행을 Shodex 단백질 KW-802.5 컬럼 및 이동상으로서 PBS를 이용한 HPLC로 모니터링하였다. 디설파이드 환원 직후에, 샘플을 교반하면서 실온에서 10 몰 과량의 실시예 16으로부터의 말레이미드 작용화된 중합체와 반응시켰다. 샘플을 HPLC에 의한 분석을 위하여 시간 0(zero)에서 제거하였고, 반응의 진행을 모니터링하기 위하여 다시 1 시간 및 2 시간에 제거하였다. Waters Alliance 2695 HPLC 시스템 2695에 Waters 2996 광다이오드 검출기, 및 PBS 이동상을 구비한 Shodex 단백질 KW-803 컬럼을 장착하였다. 컨쥬게이션 효능을 220 nm 및 280 nm에서 모니터링하였다. 2 시간 후에, 샘플을 KTA Prime Plus (GE Healthcare) 및 Superdex 200 HR 10/30 제조용 크기 배제 컬럼을 이용하여 정제하였다. 사용된 용출 완충제는 PBS이었다. 중합체 컨쥬게이션된 scFv가 먼저 용출된 후에 자유 중합체 및 미반응된 Fab'가 용출되었다. 수집된 분획들을 PBS 이동상과 함께 Shodex 단백질 KW-803 컬럼을 이용하여 분석하였다. 정제된 scFv 컨쥬게이트를 함유한 분획들을 합하고 Sartorius로부터의 Vivaspin 2 (3000 MWCO) 필터를 이용하여 농축시켰다.
실시예 23. 2,2-[(2- 브로모이소부티릴옥시 ) 메틸 ]프로피온산, 3-히드록시프로필 에스테르의 합성
Figure pct00068
500 mg의 DPTS와 함께, 50 ml의 건조 아세토니트릴 중 4.40 그램의 1,3-프로판디올 및 5.00 그램의 비스 2,2-[(2-브로모이소부티릴옥시)메틸]프로피온산 (실시예 7로부터)의 용액을 2.86 그램의 DCC로 처리하고, 반응물을 실온에서 밤새 교반하였다. 이후에, 반응물을 여과하고, 여액을 농축시켜 일부 고형물을 함유한 오일을 수득하였다. 이를 헥산 중 30% 에틸 아세테이트를 이용하여 실리카겔 상에서 플래시 컬럼 크로마토그래피로 정제하고, 생성물 함유 분획들을 합하고, 농축시켜 1.75 그램의 생성물을 등명한 무색 오일로서 수득하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 1.35 (s, 3H, CCH3), 1.92 (s 및 중첩하는 m, 14H, (CH 3)2CBr 및 CH2CH 2CH2), 3.71 (app q, J=6 Hz, 2H, HOCH 2), 4.31 (t, J=6 Hz, 2H, CH2OC=O), 4.37 (app q, 4H, CH 2OC=OCBr).
실시예 24. 비스 2,2-[(2- 브로모이소부티릴옥시 ) 메틸 ]프로피온산, 3- 옥소프로판올 에스테르의 합성
Figure pct00069
25 ml의 디클로로메탄 중 1.01 그램의 비스 2,2-[(2-브로모이소부티릴옥시)메틸]프로피온산, 3-히드록시프로필 에스테르 (실시예 23로부터)의 용액을 1.75 그램의 데스-마틴 페리오디난[Org. Synth. Coll. Vol. X, 696 (2004)]로 처리하고, 반응물을 실온에서 30분 동안 교반하였으며, 이때에 반응은 tlc (실리카겔, 헥산 중 30% 에틸 아세테이트)에 의해 완료된 것으로 나타났다. 반응물을 여과하고 농축시키고, 잔류물을 헥산 중 30% 에틸 아세테이트를 이용하여 실리카겔 상에서 플래시 컬럼 크로마토그래피로 처리하여 730 mg의 요망되는 알데히드 생성물을 등명한 무색 오일로서 수득하였으며, 이를 빛으로부터 보호하였고 질소-충전된 글로브 박스의 냉장고에 저장하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 1.33 (s, 3H, CCH3), 1.92 (s, 12H, (CH 3)2CBr), 2.83 (t, J=6.4 Hz, 2H, HC=OCH2), 4.34 (app q, 4H, OCH2), 4.48 (t, J=6.4 Hz, HC=OCH2CH 2), 9.79 (br s, 1H, CHO).
실시예 25. 비스 2,2-[(2- 브로모이소부티릴옥시 ) 메틸 ]프로피온산, N- 히드록시숙신이미드 에스테르
Figure pct00070
5 ml의 디클로로메탄 중 500 mg의 비스 2,2-[(2-브로모이소부티릴옥시)메틸]프로피온산 (실시예 7로부터) 및 133 mg의 N-히드록시숙신이미드의 용액을 286 mg의 DCC로 처리하고, 반응물을 실온에서 1.5 시간 동안 교반하였으며, 이때에, 반응은 tlc (실리카겔, 헥산 중 30% 에틸 아세테이트)에 의해 완료된 것으로 나타났다. 반응물을 여과하고, 농축시키고, 잔류물을 헥산 중 30% 에틸 아세테이트를 이용하여 실리카겔 상에서 플래시 컬럼 크로마토그래피로 처리하였다. 생성물 함유 분획들을 합하고 농축시켜 518 mg의 요망되는 NHS 에스테르를 등명한 무색 오일로서 수득하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 1.55 (s, 3H, CCH3), 1.95 (s, 12H, (CH 3)2CBr), 2.84 (브로드 s, 4H, O=CCH 2CH 2C=O), 4.49 (s, 4H, CH 2OC=OCBr).
실시예 26. 고분자량 알데히드 및 NHS 에스테르 작용화된 쌍성이온성 중합체의 제조
"리빙(living)" 제어된 자유 라디칼 공정, 원자 이동 라디칼 중합(ATRP)을 이용하여 쌍성이온성 단량체, 2-메타크릴로일옥시에틸 포스포릴콜린 (HEMA-PC)의 고분자량, 주문-제조된 친수성 중합체를 생성시키기 위한 대표적인 프로토콜은 하기와 같다.
하기 개시제들을 사용하였다:
NHSM2 (실시예 25로부터)
Figure pct00071
AlC2M2 (실시예 24로부터)
Figure pct00072
개시제 및 리간드 (2,2'-비피리딜)를 슈랭크 튜브에 도입하였다. 디메틸 포름아미드 또는 디메틸설폭사이드를, 개시제 및 리간드의 중량 백분율이 대략 20%이도록 점적으로 도입하였다. 얻어진 용액을 드라이 아이스/아세톤 혼합물을 사용하여 -78℃로 냉각시키고, 진공 하에서 10분 동안 탈기시켰다. 상기 튜브를 질소 및 촉매 (달리 명시되지 않는 한 CuBr) 하에서 재충전하고, 질소 하에서 유지시키고, 슈랭크 튜브에 도입하였다(브롬/촉매/리간드의 몰 비는 1/1/2에서 유지됨). 용액은 바로 진한 갈색이 되었다. 슈랭크 튜브를 시일링하고 -78℃로 유지시켰다. 진공/질소 사이클을 3회 적용하여 용액을 퍼징하였다. 질소 하에서 유지된 규정된 양의 단량체를 200프로프(proof) 탈기된 에탄올과 혼합하여 HEMA-PC의 용액을 제조하였다. 단량체 용액을 슈랭크 튜브에 적가하고, 약하게 교반하여 균질화하였다. 온도를 -78℃로 유지시켰다. 용액으로부터의 버블링이 멈출 때까지, 완전한 진공을 반응 혼합물에 적어도 10 내지 15분 동안 적용하였다. 이후에, 튜브를 질소로 재충전하고 실온으로 가온시켰다. 용액을 교반시켰으며, 중합이 진행됨에 따라, 용액은 점성을 갖게 된다. 3 내지 8 시간 후에, Cu(I)를 Cu(II)로 산화시키기 위하여 공기에 직접 노출시켜 반응을 켄칭시켰으며, 혼합물은 청록색이 되었으며, 이를 구리 촉매를 제거하기 위하여 실리카 컬럼으로 통과시켰다. 수집된 용액을 회전 증발로 농축시키고, 얻어진 혼합물을 테트라히드로푸란으로 침전시키거나 물로 투석한 후에 냉동 건조시켜 자유-유동 백색 분말을 수득하였다.
중합 반응으로부터의 데이타는 하기 표에 나타낸다.
Figure pct00073
실시예 27. 75 kDa 알데히드 기능화 된 중합체에 인간 성장 호르몬의 컨쥬게이션
포스페이트 완충액 중 10 mg/ml 농도의 인간 성장 호르몬 (hGH)의 샘플을 제조하였다. 별도의 플라스크에, 소듐 시아노보로하이드라이드를 100 mM 농도에서 계량하고, 10 ml의 소듐 포스페이트 완충제, pH 6에서 희석시켰다. PBS로 희석시킨 직후에 이를 사용하였다. 동일 부피의 용액 중의 소듐 시아노보로하이드라이드를 실시예 26으로부터의 알데히드 기능화된 중합체 및 hGH를 함유한 반응 혼합물에 첨가하였다. 반응을 실온 또는 4℃에서 밤새 혼합하였다. 반응의 컨쥬게이션 백분율을 이동상으로서 PBS 및 Shodex 단백질 KW-803 컬럼을 이용한 HPLC로 모니터링하였다.
샘플을 AKTA Prime Plus (GE Healthcare) 및 Superdex 200 HR 10/30 제조용 크기 배제 컬럼을 이용하여 정제하였다. 사용된 용출 완충제는 PBS이다. 컨쥬게이션된 hGHrk 먼저 용출된 후에 자유 알데히드 기능화된 중합체 및 미반응된 hGH가 용출되었다. 합쳐진 분획들을 PBS 이동상과 함께 Shodex 단백질 KW-803 컬럼을 이용하여 HPLC로 분석하였다. 정제된 hGH 컨쥬게이트를 함유한 분획들을 합하고 Sartorius로부터의 Vivaspin 2 (3000 MWCO) 필터를 이용하여 농축시켰다.
실시예 28. 75 kDa NHS 에스테르 기능화 된 중합체에 헤마티드의 컨쥬게이션
1 내지 10 mg/ml 농도의 헤마티드의 용액을 PD-10 탈염화 컬럼 (GE Healthcare)을 이용하여 0.1 M 소듐 보레이트 완충제, pH 9로 완충제 교환하였다. 실시예 26으로부터의 NHS 에스테르 기능화된 중합체를 실온에서 일정하게 교반하는 헤마티드의 샘플에 10 몰 과량으로 첨가하였다. 반응물을 실온에서 2 시간 동안 또는 4℃에서 밤새 진행시켰다. 컨쥬게이션의 정도를 결정하기 위한 샘플을 Shodex KW-803 컬럼 및 PBS 이동상을 이용하여 HPLC로 분석하였다. 샘플의 분취액을 시간 0에 뽑아 내고 컨쥬게이션 후 1 및 2시간에 뽑아내었다. 2시간이 지난 후 또는 하룻 밤 후에, 1 M 글리세린을 첨가하여 반응을 켄칭시켰다.
샘플을 AKTA Prime Plus (GE Healthcare) 및 Superdex 200 HR 10/30 제조용 크기 배제 컬럼을 이용하여 정제하였다. 사용된 용출 완충제는 PBS이다. 헤마티드에 컨쥬게이션된 NHS 에스테르 기능화된 중합체가 먼저 용출되고 자유 중합체, 미반응된 헤마티드, 및 다른 소분자가 용출되었다. 수집된 분획들을 PBS 이동상과 함께 Shodex 단백질 KW-803 컬럼을 이용하여 HPLC로 분석하였다. 정제된 헤마티드 컨쥬게이트를 함유한 분획들을 합하고, Sartorius로부터의 Vivaspin 2 (3000 MWCO) 필터를 이용하여 농축시켰다.
실시예 29. HEMA - PC 의 고압 중합
고압 하에서 HEMA-PC 단량체의 중합을 유리-라이닝된 스테인레스 스틸 압력 용기에서 수행하였다. 비율 HEMA-PC/2-아암 보호된 말레이미드 개시제 (실시예 8로부터/CuBr/ 바이피리딜은 500-10000/1/2/4의 범위임; 에탄올 중 T=22℃; DMF (에탄올 중 1-1.5%w/w)를 함유한 에탄올 중 [HEMA-PC]0=0.86M). 압력은 1 bar 내지 6 kbar의 범위이다.
실시예 30. N-[2-(2- 히드록시에톡시 )에틸]- 엑소 -3,6-에폭시-1,2,3,6- 테트라히드로프탈이미드 , 이소프로필리덴 -2,2- 비스(히드록시메틸)프로피오네이트의 제조
Figure pct00074
1.3 g의 DPTS 및 5.24 g의 DMAP와 함께, 250 ml의 디클로로메탄 중 11.0 g의 N-[2-(2-히드록시에톡시)에틸]-엑소-3,6-에폭시-1,2,3,6-테트라히드로프탈이미드 및 8.22 g의 이소프로필리덴-2,2-비스(히드록시메틸)프로피온산의 용액을 12.9 g의 DCC로 처리하고, 반응물을 밤새 교반하였다. 반응물을 여과하고, 농축시켜 잔류물을 수득하고, 이를 헥산 중 40 - 50% 에틸 아세테이트를 이용하여 실리카겔 상에서 두 부분으로 플래시 컬럼 크로마토그래피하여 요망되는 생성물을 등명한 오일로서 수득하였다.
실시예 31. N-[2-(2- 히드록시에톡시 )에틸]- 엑소 -3,6-에폭시-1,2,3,6- 테트라히드로프탈이미드 , 2,2- 비스(히드록시메틸)프로피오네이트의 제조
Figure pct00075
상기로부터의 생성물을 100 ml의 메탄올에 용해시키고, 2.0 g의 Dowex 50Wx8-100 이온 교환 수지 (H+ 형태)로 처리하고, 반응물을 실온에서 밤새 교반하였다. 반응물을 여과하고, 농축시켜 요망되는 생성물을 오일로서 수득하였으며, 이를 추가 정제 없이 사용하였다. NMR (CD3OD): δ 6.546 (t, 2H, CH=CH, J=0.8 Hz), 5.158 (t, 2H, CH-O, J=0.8 Hz), 4.180 (m, 2H, CH2-CH 2-O-C=O, J= 4.9 Hz), 3.63 (m, 10H, N-CH2 및 N-CH2-CH 2 및 CH 2-CH2-O-C=O 및 CH2-OH), 2.936 (s, 2H, CH-CH), 1.147 (s, 3H, CH3).
실시예 32. N-[2-(2- 히드록시에톡시 )에틸]- 엑소 -3,6-에폭시-1,2,3,6- 테트라히드로프탈이미드 , 2,2- 비스 -[2,2- 비스 (2- 브로모이소부티릴옥시메틸 ) 프로피오닐옥시메틸 ] 프로피오네이트 개시제의 제조
Figure pct00076
500 mg의 DPTS 및 810 mg의 DMAP와 함께, 50 ml의 디클로로메탄 중 상기 단계로부터의 1.5 g의 디올 및 3.72 g의 2,2-비스[(2-브로모이소부티릴옥시)메틸]프로피온산의 용액을 1.40 g의 디이소프로필카르보디이미드로 처리하고, 반응물을 실온에서 밤새 교반하였다. 반응물을 농축시키고, 잔류물을 헥산 중 40% 에틸 아세테이트를 이용하여 실리카 겔 상에서 여러 차례 크로마토그래피하였다. 각 경우에서의 적절한 분획들을 합하고, 농축시켜 요망되는 생성물을 오일로서 수득하였다. NMR (CD3OD): δ 6.55 (t, 2H, CH=CH, J=0.8 Hz), 5.17 (t, 2H, CH-O, J=0.8 Hz), 3.34 (m, 12H, CCH2), 4.23 (m, 2H, CH2-CH 2-O-C=O, J= 4.7 Hz), 3.68 (m, 2H, N-CH2, J=4.7 Hz), 3.64 (app q, 4H, N-CH2-CH 2 및 CH 2-CH2-O-C=O), 2.95 (s, 2H, CH-CH), 1.907 (s, 24H, Br-C-CH3), 1.34 (s, 6H, CH3), 1.308 (s, 3H, CH3).
실시예 33. N-(3-프로피온산)- 엑소 -3,6-에폭시-3,6-디메틸-1,2,3,6- 테트라히드로프탈이미드 , 2,2-비스[(2- 브로모이소부티릴옥시 ) 메틸 ] 프로피온산을 지닌 에스테르, 3-히드록시프로필 에스테르 개시제의 제조
Figure pct00077
50 mg의 DPTS 및 100 mg의 DMAP와 함께, 20 ml의 건조 아세토니트릴 중 738 mg의 2,2-비스[(2-브로모이소부티릴옥시)메틸]프로피온산, 3-히드록시프로필 에스테르 및 399 mg의 N-(3-프로피온산)-엑소-3,6-에폭시-3,6-디메틸-1,2,3,6-테트라히드로프탈이미드의 용액을 375 mg의 DCC로 처리하고, 반응물을 실온에서 밤새 교반하였다. 반응물을 여과하여 잔류물을 수득하고, 이를 헥산 중 30 - 40% 에틸 아세테이트를 이용하여 실리카 겔 상에서 플래시 컬럼 크로마토그래피하였다. 적절한 분획을 합하고, 농축시켜 1.02 g의 요망되는 생성물을 등명한 오일로서 수득하였다. 1H NMR에 의해, 생성물의 약 10%가 레트로 딜스-알더 반응을 이미 수행한 것으로 나타났다. NMR (CDCl3): δ 6.19 (s, 2H, CH=CH), 4.37 (app q, 4H, CCH2O, J=10.9, 29.7 Hz), 4.23 (t, 2H, CH2CH 2O, J=6.3 Hz), 4.15 (t, 2H, CH2CH 2O, J=6.3 Hz), 3.62 (t, 2H, NCH2, J=7.4 Hz), 3.22 (s, 2H, CHC=O), 2.48 (t, 2H, CH2C=O, J=7.4 Hz), 2.00 (m, 2H, CH2CH 2CH2, J=6.3 Hz), 1.92 (s, 12H, Br-C (CH3)2), 1.78 (s, 6H, CH3), 1.35(s, 3H,CH3).
실시예 34. N-(3-프로피온산, t-부틸 에스테르)-2,2-비스[(2- 브로모이소부티릴옥시 ) 메틸 ] 프로피온아미드의 제조
Figure pct00078
50 ml의 디클로로메탄 중 1.00 g의 b-알라닌 t-부틸 에스테르 히드로클로라이드의 용액을 25 ml의 중탄산나트륨 포화수용액으로 처리하고, 혼합물을 15분 동안 교반하였다. 층을 분리하고, 유기물을 황산나트륨으로 건조시켰다. 이러한 용액에 2.38 g의 2,2-비스[(2-브로모이소부티릴옥시]메틸)프로피온산을 첨가한 후에, 1.92 ml의 디이소프로필에틸아민 및 2.1 g의 HBTU를 첨가하고, 반응물을 실온에서 밤새 교반하였다. 이후에, 반응 혼합물을 다른 50 ml의 디클로로메탄으로 희석시키고, 2 x 50 ml의 물로 세척하고, 황산나트륨으로 건조시켰다. 여과하고 농축시켜 오일을 수득하고, 이를 헥산 중 20 - 25% 에틸 아세테이트로 플래시 컬럼 크로마토그래피하였다. 적절한 분획을 합하고, 농축시켜 730 mg의 백색 고형물을 수득하였다. NMR (CDCl3): δ 6.70 (t, 1H, NH, J=5.4 Hz), 4.33 (app q, 4H, CH2O, J=16.3, 11.4 Hz), 3.51 (q, 2H, NCH2, J=6.0 Hz), 2.46 (t, 2H, CH2CO, J=6.0 Hz), 1.93 (s, 12H, Br-C(CH3)2), 1.45 (s, 9H, C(CH3)3), 1.33 (s, 3H, CH3).
실시예 35. 2,2-비스[(2- 브로모이소부티릴옥시 ) 메틸 ]프로피온산, 2- 히드록시에틸 에스테르 개시제의 제조
Figure pct00079
883 mg의 DPTS와 함께, 50 ml의 디클로로메탄 중 4.32 g의 2,2-비스[(2-브로모이소부티릴옥시]메틸)프로피온산 및 12.41 g의 에틸렌 글리콜의 용액을 1.39 g의 디이소프로필카르보디이미드로 처리하고, 반응물을 실온에서 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 농축시킨 후에, 50 ml의 에틸 아세테이트 및 70 ml의 물로 분별하였다. 유기층을 농축시키고, 잔류물을 헥산 중 20% - 40% 에틸 아세테이트를 이용하여 실리카 겔 상에서 플래시 컬럼 크로마토그래피하였다. 적절한 분획을 합하고, 농축시켜 2.7 g의 요망되는 생성물을 등명한 오일로서 수득하였다. NMR (CD3OD): δ 4.38 (app q, 4H, CCH2, J=11.2, 30.2 Hz), 4.20 (t, 2H, CH 2OH, J=5.0 Hz), 3.75 (t, 2H, CH 2CH2OH, J=5.0 Hz), 1.90 (s, 12H, Br-CCH3), 1.36 (s, 3H, CH3).
실시예 36. 2,2-비스[(2- 브로모이소부티릴옥시 ) 메틸 ]프로피온산, 3-히드록시프로필 에스테르 개시제의 제조
Figure pct00080
80 ml의 디클로로메탄 및 20 ml의 아세토니트릴 중 5.31 g의 2,2-비스[(2-브로모이소부티릴옥시)메틸]프로피온산 및 4.68 g의 1,3-프로판디올의 용액을 1.0 g의 DPTS로 처리한 후에 3.0 g의 DCC로 처리하고, 반응물을 실온에서 2 시간 동안 교반하였다. 이어서, 반응물을 여과하고, 농축시키고, 잔류물을 헥산 중 30% 에틸 아세테이트를 이용하여 실리카 겔 상에서 플래시 컬럼 크로마토그래피하였다. 적절한 분획을 합하고, 농축시켜 등명한 오일을 수득하였는데, 이는 아주 순수하지는 않았다. 헥산 중 10 - 15% 아세톤을 이용하여 실리카 겔 상에서 리크로마토그래피(Rechromatography)하여 요망되는 생성물을 등명한 무색 오일로서 수득하였다. NMR (CDCl3): δ 4.38 (app q, 4H, CCH2O, J=11.2 Hz), 4.31 (t, 2H, CH2CH 2O, J=6.3 Hz), 3.71 (q, 2H, CH2OH, J=5.9 Hz), 1.92 (s, 12H, Br-C(CH3)2), 1.9 (m, 2H, CH2CH 2CH2), 1.35 (s, 3H, CH3).
실시예 37. 2,2-비스[(2- 브로모이소부티릴옥시 ) 메틸 ]프로피온산, 11-히드록시-3,6,9- 트리옥사운데카노에이트 개시제
Figure pct00081
250 mg의 DPTS와 함께, 50 ml의 디클로로메탄 중 1.86 g의 2,2-비스[(2-브로모이소부티릴옥시)메틸]프로피온산 및 4.18 g의 테트라에틸렌 글리콜의 용액을 1.15 g의 DCC로 처리하고, 반응물을 실온에서 밤새 교반하였다. 반응물을 여과하고, 여액을 50 ml의 디클로로메탄으로 희석시키고, 20 ml의 물로 세척하였다. 유기물을 황산나트륨으로 건조시키고, 여과하고, 농축시켜 잔류물을 수득하고, 이를 먼저 헥산 중 50 - 70% 에틸 아세테이트를 이용하여 실리카 겔 상에서 플래시 컬럼 크로마토그래피하였다. 적절한 분획을 합하고, 여과하고, 농축시켜 1.19 g의 요망되는 생성물을 등명한 무색 오일로서 수득하였다. NMR (CDCl3): δ 4.38 (app q, 4H, CCH2O, J=31.8, 11.2 Hz), 4.31 (t, 2H, CH2CH 2OC=O, J=5.0 Hz), 3.6 - 3.73 (m, 14H,CH2O), 2.46 (t, 1H, OH, J=6.3 Hz), 1.92 (s, 12H, Br-C(CH3)2), 1.35 (s, 3H, CH3).
실시예 38. 2,2-비스[(2- 브로모이소부티릴옥시 ) 메틸 ]프로피온산, 11-히드록시-3,6,9- 트리옥사운데카노에이트 , NHS 카보네이트 개시제의 제조
Figure pct00082
3 ml의 건조 아세토니트릴 중 630 g의 상기 히드록실 화합물 및 1.28 g의 디숙신이미딜 카보네이트의 용액을 610 mg의 DMAP로 처리하고, 반응물을 실온에서 교반하였다. 반응물은 여전히 불균일하였으며, 이에 따라 4 ml의 건조 THF를 첨가하고, 2 시간 후에, 반응물은 황색으로 변하였고 균질하게 되었지만, tlc(실리카겔, 헥산 중 50% 에틸 아세테이트) 상에서 여러 스폿을 함유하였다. 반응물을 농축시켜 잔류물을 수득하고, 이를 헥산 중 50 - 60% 에틸 아세테이트를 이용하여 실리카 겔 상에서 플래시 컬럼 크로마토그래피하였다. 두 개의 분획을 분리하고, 보다 낮은 rf를 갖는 분획을 농축시켜 260 mg의 요망되는 생성물을 등명한 오일로서 수득하였다. NMR (CDCl3): δ 4.47 (m, 2H, CH2O(C=O)O), 4.37 (app q, 4H, CCH2O, J=11.2, 31.6 Hz), 4.30 (m, 2H, CH2CH 2O(C=O)C), 3.79 (m, 2H, CH 2CH2O(C=O)C), 3.71 (t, 2H, CH 2CH2O(C=O)O, J=5.0 Hz), 3.67 (s, 4H,CH2O), 3.65 (s, 4H, CH2O), 2.84 (s, 4H, CH2C=O), 1.92(s, 12H, Br-C (CH3)2), 1.35(s, 3H, CH3).
실시예 39. 2,2-비스[(2- 브로모이소부티릴옥시 ) 메틸 ]프로피온산, 졸케탈 에스테르 개시제의 제조
Figure pct00083
200 mg의 DPTS와 함께, 918 mg의 졸케탈 및 3.0 g의 2,2-비스[(2-브로모이소부티릴옥시) 메틸]프로피온산의 용액을 2.15 g의 DCC로 처리하고, 반응물을 실온에서 밤새 교반하였다. 반응물을 여과하여 잔류물을 수득하고, 이를 헥산 중 10% 에틸 아세테이트를 이용하여 실리카 겔 상에서 플래시 컬럼 크로마토그래피하였다. 적절한 분획을 합하고, 농축시켜 1.85 g의 요망되는 생성물을 등명한 무색 오일로서 수득하였다. NMR (CDCl3): δ 4.38 (app q, 4H, CCH2O), 4.32 (m, 1H, OCH), 4.19 (m, 2H, CHCH 2OC=O), 4.07 (d의 d, 1H, OCH 2CH, J=6.7, 8.6 Hz), 3.76 (d의 d, 1H, OCH 2CH, J=5.7, 8.6 Hz), 1.92 (s, 12H, Br-C(CH3)2), 1.43 (s, 3H, (CH3)2CO), 1.36 (s, 3H, CH3), 1.35 (s, 3H, (CH3)2CO).
실시예 40. 2,2-비스[(2- 브로모이소부티릴옥시 ) 메틸 ]프로피온산, 2,3-디히드록시프로필 에스테르 개시제의 제조
Figure pct00084
50 ml의 메탄올 중 1.0 g의 상기 케탈의 용액을 750 mg의 Dowex 50Wx8-100으로 처리하고, 반응물을 밤새 교반하였다. 이후에, 반응물을 여과하고, 농축시키고, 잔류물을 헥산 중 20 - 40% 에틸 아세테이트를 이용하여 실리카 겔 상에서 플래시 컬럼 크로마토그래피하였다. 적절한 분획을 합하고, 농축시켜 630 mg의 요망되는 생성물을 등명한 무색 오일로서 수득하였다. NMR (CDCl3+D2O): δ 4.40 (d의 app q, 4H, CCH2O, J=2.8, 11.5, 30.2 Hz), 4.24 (d의 app q, 2H, CHCH 2OC=O, J=4.5, 6.6, 11.5 Hz), 3.96 (m, 1H, CH), 3.66 (d의 app q, 2H, HOCH 2CH, J=3.8, 5.6, 11.5, 37.9 Hz), 1.92 (s, 12H, Br-C(CH3)2), 1.37 (s, 3H, CH3).
실시예 41. 2,2-비스[(2- 브로모이소부티릴옥시 ) 메틸 ]프로피온산, 2-(2,3- 디히드록시프로폭시 )에틸 에스테르 개시제의 제조
15 ml의 물 및 15 ml의 t-부탄올 중 1.5 g의 2-[(2-브로모이소부티릴옥시)메틸]-2-히드록시메틸프로피온산, 2-(알릴옥시)에틸 에스테르의 용액에 2.86 그램 (3 eq)의 페리시안화칼륨, 1.20 그램 (3 eq)의 탄산칼륨, 7.5 mg의 칼륨 오스메이트 탈수화물, 11 mg의 퀴누클리딘, 및 276 mg (1 eq)의 메탄술폰아미드를 첨가하고, 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 반응은 TLC(실리카 겔, 헥산 중 50% 에틸 아세테이트)로 완료된 것으로 나타났으며, 이에 따라 반응물을 100 ml의 물에 부은 후에, 100 ml의 디클로로메탄으로 추출하였다. 합한 유기물들을 황산나트륨으로 건조시키고, 여과하고, 농축시켜 오일성 잔류물을 수득하고, 이를 헥산 중 30 - 40% 에틸 아세테이트를 이용하여 실리카 겔 상에서 플래시 컬럼 크로마토그래피하였다. 적절한 분획을 합하고, 탈색화 탄소로 처리하고, 여과하고, 농축시켜 850 mg의 요망되는 생성물을 거의 무색의 오일로서 수득하였다. NMR (CDCl3): δ 4.39 (d의 app q, 4H, CCH2O, J=4.1, 11.1, 3.0, 37.6 Hz), 4.31(t, 2H, OCH2CH 2OC=O, J=4.7 Hz), 3.87 (m, 1H, CH-OH), 3.54 - 3.77 (m, 2H,CH 2-OH), 3.72(m, 2H, OCH 2CH), 3.58(app t, 2H, OCH 2CH2OC=O), 2.68 (d, 1H, CH-OH, J=5.1 Hz), 2.15 (app t, 1H, CH2-OH, J=6.1 Hz), 1.92 (s, 12H, Br-C(CH3)2), 1.36 (s, 3H, CH3).
실시예 42. 2,2-비스[(2- 브로모이소부티릴옥시 ) 메틸 ]프로피온산, 12-( 알릴옥시 )-3,6,9,12- 테트라옥사도데카노에이트 개시제
Figure pct00086
30 ml의 무수 아세토니트릴 중의 1.60 g의 2,2-비스[(2-브로모이소부티릴옥시)메틸]프로피온산 및 870 mg의 12-(알릴옥시)-3,6,9,12-테트라옥사도데칸의 용액에 218 mg의 DPTS 및 362 mg의 DMAP과 함께, 917 mg의 DCC를 첨가하고, 반응물을 실온에서 밤새 교반하였다. 이후, 혼합물을 여과하고, 농축시키고, 잔류물을 먼저 헥산 중 50 - 60% 에틸 아세테이트를 사용하여 실리카 겔상의 플래시 컬럼 크로마토그래피로 처리하고, 생성물 함유 분획을 합하고, 농축시켜 1.35 g의 요망되는 생성물을 등명한 무색 오일로서 수득하였다. NMR (CDCl3): δ 5.87-5.97 (m, 1H, CH2CH=CH2), 5.28 (dq, 1H, H-CH=CH), 5.18 (dq, 1H, H-CH=CH), 4.37 (app q, CH 2OC=O), 4.30 (dd, 2H, CH2CH 2OC=O), 4.02 (d, 2H, CH2=CHCH 2), 3.60-3.72 (m, 14H, CH2CH 2OCH2), 1.92 (s, 12H, Br-C (CH3)2), 1.35 (s, 3H, CH3).
실시예 43. 2,2-비스[(2- 브로모이소부티릴옥시 ) 메틸 ]프로피온산, 12-(2,3-디히드록시프로폭시)-3,6,9,12- 테트라옥사도데실 에스테르 개시제의 제조
Figure pct00087
15 ml의 물 및 15 ml의 t-부탄올 중의 1.29 g의 2,2-비스[(2-브로모이소부티릴옥시)메틸]프로피온산, 12-(알릴옥시)-3,6,9,12-테트라옥사도데실 에스테르의 혼합물에, 1.98 g (3 eq)의 페리시안화칼륨, 829 mg (3 eq)의 탄산칼륨, 8 mg의 포타슘 오스메이트 디히드레이트, 11 mg의 퀴누클리딘, 및 190 mg (1 eq)의 메탄술폰아미드를 첨가하고, 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 반응이 TLC (실리카 겔, 헥산 중 50% 에틸 아세테이트)에 의해 완료된 것으로 나타남에 따라, 반응물을 50 ml의 물에 부은 후, 100 ml의 디클로로메탄로 추출하였다. 합한 유기물질을 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켜 오일성 잔류물을 얻었으며, 이를 디클로로메탄 중 5% 메탄올을 사용하여 실리카 겔상의 플래시 컬럼 크로마토그래피로 처리하였다. 생성물 함유 분획을 합하고, 작은 주걱 두개의 활성 탄소로 2회 처리하였다. 여과하고 농축시켜 소량의 고형물을 함유하는 연회색 오일을 얻었으며, 이에 따라 이를 에틸 아세테이트 중에 흡수시키고, 여과한 후, 농축시켜 1.06 g의 요망되는 생성물을 여전히 소량의 고형물을 함유하는 연회색 오일로서 얻었다. NMR (CDCl3): δ 4.38 (app q, 4H, CCH2OC=O), 4.30 (t, 2H, CH2CH 2OC=O, J=5.0 Hz), 3.85(p, 1H, CHOH, J=5 Hz), 3.71 (t, 2H, OCH 2CHOH, J= 4.8 Hz), 3.72 δ 3.55 (m, 16H, OCH 2CH 2O 및 CH 2OH), 3.12 (s, 1H, CHOH), 2.37 (s, 1H, CH2OH), 1.92 (s, 12H, Br-C(CH3)2), 1.35 (s, 3H, CH3).
실시예 44. 2,2,5- 트리메틸 -1,3-디옥산-5- 카르복실산 , 2-( 알릴옥시 )에틸 에스테르의 제조
Figure pct00088
25 ml의 무수 THF 중의 1.4 g의 에틸렌 글리콜 모노알릴 에테르 및 2.35 g의 2,2,5-트리메틸-1,3-디옥산-5-카르복실산의 용액을 500 mg의 4-디메틸아미노피리디늄 p-톨루엔술포네이트 (DPTS) 및 1.44 g의 디메틸아미노피리딘 (DMAP)로 처리한 후, 3.38 g의 디시클로헥실카르보디이미드를 첨가하고, 반응물을 실온에서 3일 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 여과하고, 농축시켜 반고형 잔류물을 얻었으며, 이를 헥산 중 20% 에틸 아세테이트를 사용하여 실리카 겔상의 플래시 컬럼 크로마토그래피로 처리하였다. 생성물 함유 분획을 합하고, 농축시키고, 여과하여 2.83 g (81%)의 소량의 고형물을 함유하는 등명한 오일을 얻었다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 1.23 (s, 3H, C=OCCH3), 1.39 (s, 3H, CH3), 1.43 (s, 3H, CH3), 3.66 (m, 4H), 4.02 (dd, 2H, CH2=CHCH 2), 4.20 (d, 2H), 4.31 (t, 2H, C=OOCH 2), 5.18 (dd, 1H, =CH), 5.28 (dd, 1H, =CH), 5.89 (m, =CHCH 2).
실시예 45. 2,2- 비스(히드록시메틸)프로피온산 , 2-( 알릴옥시 )에틸 에스테르
Figure pct00089
50 ml의 메탄올 중의 2.72 g의 2,2,5-트리메틸-1,3-디옥산-5-카르복실산, 2-(알릴옥시)에틸 에스테르의 용액을 1.0 g의 Dowex 50W-X8 수지 (H+ 형)으로 처리하고, 반응물을 실온에서 밤새 교반하였다. 반응물을 여과하고, 여액을 농축시켜 오일을 얻었으며, 이를 디클로로메탄 중 5% 메탄올을 사용하여 실리카 겔상의 플래시 컬럼 크로마토그래피로 처리하였다. 생성물 함유 분획을 합하고, 농축시켜 2.23 g의 생성물을 등명한 연황색 오일로서 얻었다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 5.84-5.94 (ddt, 1H, H2C=CHCH2), 5.28 (dq, 1H, HHC=CHCH2), 5.22 (dq, 1H, HHC=CHCH2), 4.36 (app t, 2H, OCH 2CH2), 4.02 (dt, 2H, H2C=CHCH 2), 3.86 (dd, 2H, CH2OH), 3.74 (dd, 2H, CH2OH), 3.68 (app t, 2H, OCH2CH 2), 2.90 (br d, 2H, OH), 1.11 (s, CH3).
실시예 46. 2,2-비스[(2- 브로모이소부티릴옥시 ) 메틸 ]프로피온산, 2-( 알릴옥시 )에틸 에스테르 개시제의 제조
Figure pct00090
2.86 g의 DCC가 소량의 디클로로메탄 중의 용액으로 첨가됨에 따라 100 ml의 디클로로메탄 중의 1.2 g의 알릴옥시에탄올, 5.0 g의 2,2-비스(2-브로모이소부티릴옥시메틸) 프로피온산 및 690 mg의 DPTS의 용액을 실온에서 교반하였다. 반응물을 실온에서 밤새 교반한 후, 여과하고, 농축시켜 오일을 얻었다. 이를 헥산 중 10% 에틸 아세테이트를 사용하여 실리카 겔상의 플래시 크로마토그래피로 처리하였다. 적절한 분획을 합하고, 농축시켜 등명한 오일을 수득하고, 이는 충분히 순수하지 않았다. 이 오일을 헥산 중 3 - 4% 에틸 아세테이트를 사용하여 실리카 겔상의 플래시 크로마토그래피로 다시 처리하였다. 생성물 함유 분획을 합하고, 농축시켜 2.78 g의 요망되는 생성물을 등명한 무색 오일로서 수득하였다. NMR (CDCl3): δ 5.89 (m, 1H, CH2CH=CH2), 5.28 (dq, 1H, H-CH=CH, J=17.2, 1.7 Hz), 5.20 (dq, 1H, H-CH=CH, J=10.5, 1.5 Hz), 4.38 (app q, 4H, CH2OC=O), 4.31 (t, 2H, OCH2, J=4.7 Hz), 4.01 (dt, 2H, OCH2, J=5.6, 1.5 Hz), 3.65 (t, 2H, OCH2, J=4.7 Hz), 1.91 (s, 12H, Br-C (CH3)2), 1.35 (s, 3H, CH3).
실시예 47. 2,2- 비스 -[2,2-비스(2- 브로모이소부티릴옥시메틸 ) 프로피오닐옥시메틸 ]프로피온산, 2-( 알릴옥시 )에틸 에스테르 개시제
Figure pct00091
25 ml의 무수 아세토니트릴 중의 2.42 g의 2-[(2-브로모이소부티릴옥시)메틸]-2-히드록시메틸프로피온산, 2-(알릴옥시)에틸 에스테르 및 1.73 g의 2,2-[비스-(2-브로모이소부티릴옥시)메틸] 프로피온산의 용액을 200 mg의 DPTS 및 580 mg의 DMAP과 함께 1.03 g의 DCC로 처리하고, 반응물을 실온에서 밤새 교반하였다. TLC (실리카 겔, 헥산중의 30% 에틸 아세테이트)에 의해 반응이 완료되지 않음을 확인함으로써 추가의 812 mg의 2,2-[비스-(2-브로모이소부티릴옥시)메틸]프로피온산 및 400 mg의 DCC를 첨가하고, 반응물을 다시 실온에서 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 여과하고, 농축시키고, 잔류물을 먼저 헥산 중의 20% 에틸 아세테이트를 사용하고, 다음에 헥산 중의 30% 에틸 아세테이트를 사용하여 실리카 겔상의 플래시 컬럼 크로마토그래피로 처리하였다. 생성물 함유 분획을 합하고, 농축시켜 1.27 g의 요망하는 화합물을 등명한 무색 오일로서 수득하였다. NMR (CDCl3): δ 5.88 (m, 1H, CH2CH=CH2), 5.28 (dq, 1H, H-CH=CH, J=17.4, 1.6 Hz), 5.20 (dq, 1H, H-CH=CH, J=10.3, 1.3 Hz), 4.24 δ 4.44 (m, 14H, CH2OC=O), 4.01 (d, 2H, CH2=CHCH 2, J=5.6), 3.65 (t, 2H, CH2CH 2OCH2, J=4.7 Hz), 1.91 (s, 24H, Br-C (CH3)2), 1.33 (s, 6H, CH3), 1.30 (s, 3H, CH3).
실시예 48. 2,2- 비스 -[2,2-비스[(2- 브로모이소부티릴옥시 ) 프로피오닐옥시메틸 ]프로피온산], 2-[(2,3-디히드록시) 프로폭시 ]에틸 에스테르 개시제의 제조
Figure pct00092
15 ml의 물 및 15 ml의 t-부탄올 중의 1.21 g의 2,2-비스[(2-브로모이소부티릴옥시)메틸]프로피온산, 2-(알릴옥시)에틸 에스테르의 혼합물에 1.14 g (3 eq)의 페리시안화칼륨, 480 mg (3 eq)의 탄산칼륨, 7.5 mg의 포타슘 오스메이트 디히드레이트, 11 mg의 퀴누클리딘, 및 110 mg (1 eq)의 메탄술폰아미드를 첨가하고, 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 반응이 tlc(실리카 겔, 헥산 중 50% 에틸 아세테이트)에 의해 완료된 것으로 나타남으로써, 반응물을 50 ml의 물에 부은 후, 100 ml의 디클로로메탄으로 추출한 후, 추가의 50 ml의 디클로로메탄으로 추출하였다. 합한 유기물질을 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켜 오일성 잔류물을 얻었으며, 이를 헥산 중 50% 에틸 아세테이트를 사용하여 실리카 겔상의 플래시 컬럼 크로마토그래피로 처리하고, 생성물 함유 분획을 합하고, 농축시켜 620 mg의 요망되는 생성물을 등명한 무색 오일로서 수득하였다. NMR (CDCl3): δ 4.28-4.41 (m, 14H, CCH2OC=O), 3.86 (m, 1H, CH2CHOHCH2), 3.69-3.75 (m, 3H), 3.56-3.65 (m, 3H), 2.78 (dd, 1H, OH), 2.23 (app t, 1H, OH), 1.92 (s, 24H, CH3CBr), 1.34 (s, 6H, CH3), 1.31 (s, 3H, CH3).
실시예 49. 2,2-비스[(2- 브로모이소부티릴옥시 ) 메틸 ]프로피온산, (2- 아지도에톡시 )에틸 에스테르 개시제의 제조
Figure pct00093
20 ml의 무수 아세토니트릴 중의 3.30 g의 2,2-비스[(2-브로모이소부티릴옥시)메틸]프로피온산 및 1.0 g의 2-(2-아지도에톡시)에탄올의 용액에, 225 mg의 DPTS과 함께, 1.89 g의 DCC를 첨가하고, 반응물을 실온에서 밤새 교반하였다. 반응물을 여과하고, 농축시켜 잔류물을 수득하고, 이를 헥산 중 10 - 15% 에틸 아세테이트를 사용하여 실리카 겔상의 플래시 컬럼 크로마토그래피로 처리하였다. 적절한 분획을 합하고, 농축시켜 2.06 g의 요망되는 생성물을 등명한 무색 오일로서 수득하였다. NMR (CDCl3): δ 4.39 (app q, 4H, CCH2O, J=11.1, 33.8 Hz), 4.31 (t, 2H, OCH2CH 2OC=O, J=5 Hz), 3.72 (t, 2H, CH2N3, J=5 Hz), 3.67 (t, 2H, CH 2CH2N3, J=5 Hz), 3.38 (t, 2H, OCH 2CH2OC=O, J=5 Hz), 1.92 (s, 12H, Br-C(CH3)2), 1.36 (s, 3H, CH3).
실시예 50. 3,5- 비스 -(2- 브로모이소부티릴옥시 ) 벤즈알데히드의 제조
Figure pct00094
20 ml의 디클로로메탄 중의 1.0 g의 3,5-디히드록시벤즈알데히드 및 4.0 ml (4 eq)의 트리에틸아민의 용액을 빙수조에서 냉각시키고, 5 ml의 디클로로메탄 중의 3.35 g의 2-브로모이소부티릴 브로마이드를 고형물이 형성되는 만큼의 수분에 걸쳐 적가하였다. 반응물을 1.5시간 동안 실온에서 교반하였으며, 이 시기에, 반응은 TLC (실리카 겔, 헥산중의 30% 에틸 아세테이트)에 의해 완료된 것으로 나타났다. 반응물을 25 ml의 물로 세척한 후, 농축시켜 잔류물을 수득하고, 이를 헥산 중 10% 에틸 아세테이트를 사용하여 실리카 겔상의 플래시 컬럼 크로마토그래피로 처리하였다. 적절한 분획을 합하고, 소량의 탈색용 탄소로 처리하고, 여과하고, 농축시켜 2.2 g의 오일을 얻었으며, 이를 냉각기에서 결정화시켜 백색 고형물을 얻었다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 2.08 (s, 12H, CH3), 7.29 (t, 1H, J=2.4 Hz, ArH), 7.61 (d, J=2.4 Hz, 2H, ArH), 10.0 (s, 1H, CHO).
실시예 51. 7-(13- 알릴옥시 -2,5,8,11- 테트라옥사트리데실 )-2,4,9- 트리페닐 - 1,3,5-트 리아자트리시클로[3.3.1.13,7] 데칸의 제조
Figure pct00095
10 ml의 무수 THF 중의 870 mg의 11-알릴옥시-3,6,9-트리옥사운데칸-1-올 메탄술포네이트 및 1.01 g의 2,4,9-트리페닐-1,3,5-트리아자트리시클로[3.3.1.13,7]데칸-7-메탄올 (WO2000/037658)의 용액을 410 mg의 소듐 히드라이드(오일 중 60%)로 처리하고, 반응물을 2시간 동안 80℃로 가열하였다. 반응물을 수 ml의 물을 첨가함으로써 조심스럽게 켄칭시키고, 20 ml의 sat NaCl에 부은 후, 3 x 10 ml의 디클로로메탄으로 추출하였다. 유기 물질을 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켜 잔류물을 수득하고, 이를 헥산 중 25-35% 에틸 아세테이트를 사용하여 실리카 겔상의 플래시 크로마토그래피로 처리하였다. 적절한 분획을 합하고, 농축시켜 920 mg의 요망되는 생성물을 무색 오일로서 수득하였다. NMR (DMSO-d6): δ 7.70-7.82 (m, 6H, PhH), 7.26-7.51 (m, 9H, PhH), 3.69-3.75 (m, 3H), 3.56-3.65 (m, 3H), 2.78 (dd, 1H, OH), 2.23 (app t, 1H, OH), 1.92 (s, 24H, CH3CBr), 1.34 (s, 6H, CH3), 1.31 (s, 3H, CH3).
실시예 52. 1-아미노-15- 알릴옥시 -2,2- 비스 ( 아미노메틸 )-4,7,10,13- 테트라옥사펜타데칸 트리히드로클로라이드의 제조
Figure pct00096
이전 반응들로부터의 트리아자아다만탄 화합물을 20 ml의 에탄올 및 4 ml의 에테르에 흡수시킨 후, 2 ml의 진한 염산으로 처리하였다. 반응물을 혼합한 후, 4℃에서 1.5 시간 동안 방치하였다. 이후, 30 ml의 에테르를 첨가하고, 혼합물을 다시 추가의 30분 동안 냉각시켰다. 이후, 100 ml의 에테르를 첨가하고, 여과에 의해 고형 생성물을 회수하고, 에테르로 세척하고, 진공 하에 건조시켜 564 mg의 생성물을 백색 고형물로서 얻었다. NMR (DMSO-d6): δ 7.75 (m, 6H, CCH), 7.44 (m, 6H, CCHCH), 7.30 (m, 3H, CCHCHCH), 5.86 (m, 1H, CH2=CH), 5.70 (s, 1H, NCH (적도방향)), 5.250 (s, 2H, NCH(축방향)), 5.23 (dq, 1H, CH 2=CH), 5.11 (dq, 1H, CH 2=CH), 3.93 (dt, 2H, CH-CH 2-O), 3.55-3.25 (m, 16H, OCH 2CH 2O), 3.26 (m, 2H, NCH2), 3.19 (d, 2H, NCH2), 2.88 (s, 2H, NCH2), 2.719 (s, 2H, CCH2O).
실시예 53. N-(2- 브로모 -2- 메틸프로피오닐 )-1-아미노-15- 알릴옥시 -2,2-비스[N-(2- 브로모 -2- 메틸프로피오닐 ) 아미노메틸 ]-4,7,10,13- 테트라옥사펜타데칸 개시제의 제조
Figure pct00097
이전 절차로부터의 트리아민 히드로클로라이드를 25 ml의 디클로로메탄 중에 흡수시키고, 용액을 빙수조로 냉각시키고, 1.35 ml의 트리에틸아민으로 처리한 후, 0.46 ml의 2-브로모이소부티릴 브로마이드를 첨가하였다. 이후, 반응물을 2시간에 걸쳐 실온으로 가온되게 하면서 교반하였다. 이후, 반응 혼합물을 3 x 10 ml의 1N HCl, 2 x 10 ml의 포화된 NaHCO3, 10 ml의 포화된 NaCl로 세척하고, 마그네슘 술페이트 상에서 건조시켰다. 용액을 여과하고, 농축시켜 잔류물을 수득하고, 이를 에틸 아세테이트를 사용하여 실리카 겔의 플러그를 통해 플러싱(flushing)시켰다. 농축시켜 989 mg의 요망되는 생성물을 점성 오일로서 얻었다. NMR (DMSO-d6): δ 8.004 (t, 3H, NH), 5.87 (m, 1H, CH), 5.23 (dq, 1H, CH 2=CH), 5.12 (dq, 1H, CH 2=CH), 3.93 (dt, 2H, CH 2-CH), 3.6 δ 3.45 (m, 16H, OCH 2CH 2O), 3.289 (s, 2H, CCH2O), 3.12 (d, 6H, CCH2N), 1.907 (s, 18H, CH3).
실시예 54. N-(2- 브로모 -2- 메틸프로피오닐 )-1-아미노-15-(2,3-디히드록시프로필)-2,2-비스[N-(2- 브로모 -2- 메틸프로피오닐 ) 아미노메틸 ]-4,7,10,13- 테트라옥사펜타데칸 개시제의 제조
Figure pct00098
5 ml의 t-부탄올 및 5 ml의 물 중의 이전 절차로부터의 350 mg의 알칸의 혼합물에, 433 mg (3 eq)의 페리시안화칼륨, 182 mg (3 eq)의 탄산칼륨, 42 mg (1 eq)의 메탄술폰아미드, 7.5 mg의 퀴누클리딘, 및 4 mg의 포타슘 오스메이트 디히드레이트를 첨가하고, 용액을 실온에서 밤새 교반하였다. 반응이 TLC (실리카 겔, 디클로로메탄 중 5% 메탄올)에 의해 완료된 것으로 나타났으며, 이에 따라 50 ml의 물을 첨가하고, 용액을 50 ml의 디클로로메탄으로 추출하고, 추가의 2 x 25 ml의 디클로로메탄으로 추출하였다. 합한 추출물을 황산나트륨 상에서 건조시키고, 농축시키고, 진한 회색 잔류물을 디클로로메탄 중의 2-5% 메탄올을 사용하여 실리카 겔상의 플래시 컬럼 크로마토그래피로 처리하였다. 적절한 분획을 합하고, 농축시켜 310 mg의 요망하는 디히드록시 화합물을 연한 회색 오일로서 얻었다. NMR (CDCl3): δ 7.91 (t, 3H, NH), 3.88 (m, 1H, HOCH2CHOHCH2), 3.55-3.72 (복합 m, 21H), 3.35 (s, 1H, OCH 2C(CH2)3), 3.19 (d, 6H, J=6.4 Hz, CH2NH), 1.99 (s, 18H, CH3).
실시예 55. 7-(7- 아지도 -2,5- 디옥사헵틸 )-2,4,9- 트리페닐 -1,3,5- 트리아자트리시클로[3.3.1.13,7]데칸의 제조
Figure pct00099
15 ml의 무수 THF 중의 1.1 g의 2,4,9-트리페닐-1,3,5-트리아자트리시클로[3.3.1.13,7]데칸-7-메탄올 (WO2000/037658) 및 585 mg의 2-(2-아지도에톡시)에틸 메탄술포네이트의 용액에 224 mg의 NaH (오일 중 60%)를 첨가하고, 용액을 밤새 70℃로 가열하였다. 추가의 245 mg의 NaH 및 600 mg의 2-(2-아지도에톡시)에틸 메탄술포네이트를 첨가하고, 다시 밤새 가열을 지속하였다. 반응 혼합물을 냉각시키고, 25 ml의 물로 희석하고, 50 ml의 디클로로메탄으로 추출하였다. 유기 층을 포화된 NaCl로 세척하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켜 잔류물을 얻었다. 이 물질을 헥산 중 10 내지 25% 에틸 아세테이트를 사용하여 실리카 겔상의 플래시 컬럼 크로마토그래피로 처리하였다. 적절한 분획을 합하고, 농축시켜 1.15 g의 요망되는 생성물을 오일로서 얻었으며, 이는 완전하게 순수하지는 않았지만, 다음 반응에 추가의 정제 없이 사용하였다. NMR(DMSO) 매우 복잡함.
실시예 56. 1-아미노-9- 아지도 -2,2- 비스 ( 아미노메틸 )-4,7- 디옥사노난 트리 히드로 클로라이드의 제조
Figure pct00100
20 ml의 에탄올 및 4 ml의 에테르 중의 이전 절차로부터의 1.15 g의 트리아자다만탄 화합물의 용액을 빙수욕으로 냉각시키고, 3 ml의 진한 HCl를 첨가하였다. 고형 생성물이 즉시 형성되기 시작하였으며, 반응물을 10분 동안 냉각 상태로 방치되게 하였다. 추가의 30 ml의 에테르를 첨가하고, 반응물을 밤새 냉각시켰다. 반응 혼합물을 추가의 100 ml의 에테르로 희석하고, 고형 생성물을 여과에 의해 분리하고, 보다 많은 에테르로 세척하고, 진공 하에 건조시켜 800 mg의 생성물을 백색 고형물로서 얻었다.
실시예 57. N-(2- 브로모 -2- 메틸프로피오닐 )-1-아미노-9- 아지도 -2,2-비스[N-(2-브로모-2- 메틸프로피오닐 ) 아미노메틸 ]-4,7- 디옥사노난 개시제의 제조
Figure pct00101
25 ml의 디클로로메탄 중의 이전 절차로부터의 800 mg의 트리히드로클로라이드 염의 용액을 빙수욕으로 냉각시킨 후, 3.5 ml의 트리에틸아민으로 처리하였다. 이 혼합물에 1.07 ml의 2-브로모이소부티릴 브로마이드를 적가하고, 반응물을 2시간에 걸쳐 실온으로 가온시키면서 교반하였다. 이후, 혼합물을 3 x 10 ml의 1N HCl, 2 x 10 ml의 포화된 NaHCO3, 및 10 ml의 포화된 NaCl로 세척한 후, 마그네슘 술페이트 상에서 건조시다. 여과하고 농축시켜 잔류물을 얻었으며, 이를 헥산 중의 20 내지 30% 에틸 아세테이트를 사용하여 실리카 겔상의 플래시 컬럼 크로마토그래피로 처리하였다. 적절한 분획을 합하고, 농축시켜 630 mg의 요망되는 생성물을 오일로서 얻었다. NMR(CDCl3): δ 7.76 (t, 3H, NH, J=6.3 Hz), 3.68 (m, 4H, OCH 2CH 2O), 3.63 (m, 2H, N3CH2CH 2O), 3.40 (t, 2H, N3CH2, J=5.0 Hz), 3.37 (s, 2H, CCH2O), 3.19 (d, 6H, CCH2N, J=6.8 Hz), 1.99 (s, 18H, CH3).
실시예 58. 13- 알릴옥시 -2,5,8,11- 테트라옥사트리데실 6- 아암 개시제
Figure pct00102
25 ml의 디클로로메탄 중의 0.9 g의 1-아미노-15-알릴옥시-2,2-비스(아미노메틸)-4,7,10,13-테트라옥사펜타데칸 트리히드로클로라이드 및 3.89 g의 2,2-비스[(2-브로모이소부티릴옥시]메틸)프로피온산의 용액에 530 mg의 DPTS 및 890 mg의 DMAP과 함께, 2.7 g의 DCC를 첨가하고, 반응물을 실온에서 밤새 교반하였다. 반응물을 여과하고, 농축시키고, 잔류물을 헥산 중 50-70% 에틸 아세테이트를 사용하여 실리카 겔상의 플래시 컬럼 크로마토그래피로 처리하였다. 적절한 분획을 합하고, 농축시켜 1.9 g의 요망되는 생성물을 점성 오일로서 얻었다. NMR (CDCl3): δ 7.78 (t, 3H, NH, J=6.5 Hz), 5.91 (m, 1H, CH), 5.27 (dq, 1H, CH 2=CH, J=17.4, 1.6 Hz), 5.18 (dq, 1H, CH 2=CH, J=10.4, 1.4 Hz), 4.38 (app q, 12H, CH2OC=O), 4.01 (dt, 2H, CH-CH 2, J=5.7, 1.4 Hz), 3.61 (두개의 m, 16H, OCH 2CH 2O), 3.30 (s, 2H, CCH2O), 3.14 (d, 6H, CH2N, J=6.1 Hz), 1.92 (d, 36H, BrC(CH3)2, J=1.2 Hz), 1.38 (s, 9H, CH3).
실시예 59. 13-(2,3-디히드록시프로필)-2,5,8,11- 테트라옥사트리데실 6- 아암 개시제
Figure pct00103
10 ml의 물 및 10 ml의 t-부탄올 중의 이전 절차로부터의 1.0 g의 알칸의 혼합물에 638 mg (3 eq)의 페리시안화칼륨, 268 mg (3 eq)의 탄산칼륨, 10 mg의 포타슘 오스메이트 디히드레이트, 12 mg의 퀴누클리딘, 및 61 mg (1 eq)의 메탄술폰아미드를 첨가하고, 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 반응물을 50 ml의 물에 부은 후, 50 ml의 디클로로메탄으로 추출하고, 추가의 25 ml의 디클로로메탄으로 추출하였다. 합한 유기물질을 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켜 오일성 잔류물을 얻었으며, 이를 디클로로 메탄 중 2-4% 메탄올을 사용하여 실리카 겔상의 플래시 컬럼 크로마토그래피로 처리하고, 생성물 함유 분획을 합하고, 농축시켜 417 mg의 요망되는 생성물을 점성 오일로서 얻었다. NMR (CDCl3): δ 7.78 (t, 3H, NH, J=6.0 Hz), 4.39 (app q, 12H, CH2OC=O), 3.86 (브로드 s, 1H, OH-CH), 3.62 (m, 20H, OCH 2CH 2O 및 OHCHCH 2O 및 OH-CH 2), 3.27 (s, 2H, CCH2O), 3.13 (s, 6H, NCH2), 2.40 (s, 2H, OH), 1.92 (s, 36H, BrC(CH3)2), 1.38 (s, 9H, CH3).
실시예 60. 2-( 아크릴로일옥시에틸 -2'-( 트리메틸암모늄 )에틸 포스페이트 , 내염의 제조
제 1 중간체
Figure pct00104
질소 대기 하에서, 100 ml의 무수 아세토니트릴 중의 11.6 g의 2-히드록시에틸아크릴레이트 및 14.0 ml의 트리에틸아민의 용액을 -20℃로 냉각시키고, 10 ml의 무수 아세토니트릴 중의 14.2 g의 2-클로로-2-옥소-1,3,2-디옥사포스폴란의 용액을 약 30분에 걸쳐 적가하였다. 반응물을 냉각 상태로 30분 동안 교반한 후, 질소 대기 하에서 여과하였다. 침전물을 10 ml의 냉각된 아세토니트릴로 세척하고, 여액을 다음 반응에 직접 사용하였다.
2-( 아크릴로일옥시에틸 -2'-( 트리메틸암모늄 )에틸 포스페이트 , 내염
Figure pct00105
상기 절차로부터의 용액에 14.0 ml의 트리메틸아민(질소하에서 드라이 아이스-아세톤 응축기를 이용하여 응축됨)을 첨가하고, 반응 혼합물을 가압 용기로 밀봉시키고, 4시간 동안 65℃에서 교반하였다. 반응 혼합물을 교반하면서 실온으로 냉각시키고, 이러한 반응 혼합물이 약 30℃에 도달함에 따라 고체가 형성되기 시작하였다. 이후, 용기를 밤새 4℃ 냉장고에 두었다. 엄격히 질소 대기하에서, 고체를 여과에 의해 수거하고, 20 ml의 저온 건조 아세토니트릴로 세척한 후, 15분 동안 질소 스트림 하에서 건조시켰다. 이후, 고체를 밤새 고진공하에서 건조시켜, 백색 고체로서 12.4 그램의 생성물을 생성시켰다. NMR (CDCl3): δ 6.41 (dd, 1H, J=1.6, 17.2 Hz, 비닐 CH), 6.18 (dd, 1H, J=10.6, 17.2 Hz, 비닐 CH), 5.90 (dd, 1H, J=1.6, 10.4 Hz, 비닐 CH), 4.35 (m, 2H), 4.27 (m, 2H), 4.11 (m, 2H), 3.63 (m, 2H), 3.22 (s, 9H, N(CH3)3).
실시예 61. 4- 펜틴 -1-올, NHS 에스테르의 제조
Figure pct00106
20 ml의 건조 아세토니트릴 중 1.02 그램의 4-펜틴산 및 1.20 그램의 N-히드록시숙신이미드의 용액에 300 mg의 DPTS를 처리한 후, 2.8 그램의 DCC를 첨가하고, 반응물을 밤새 실온에서 교반하였다. 반응물을 여과시키고, 농축시켜, 잔여물을 생성시키고, 이를 헥산 중 30% 에틸 아세테이트와 함께 실리카 겔 상의 플래시 컬럼 크로마토그래피에 적용시켰다. 생성물을 함유하는 분획을 조합시키고, 농축시켜, 백색 고체로 1.62 그램의 요망되는 생성물을 생성시켰다. NMR(CDCl3): δ 2.89 (d의 d, 2H, CH 2C=O, J=7.9, 6.4 Hz), 2.85 (s, 4H, O=CCH 2CH 2C=O), 2.62 (app d의 d의 d, 2H, CHCCH 2, J=8.6, 6.9, 2.7 Hz), 2.06 (t, 1H, CH, J=2.7 Hz).
실시예 62. N- 프로파르길말레이미드의 제조
Figure pct00107
50 ml의 포화 소듐 바이카보네이트 중의 1.08 그램의 프로파르길아민 히드로클로라이드의 용액을 얼음 수조를 이용하여 냉각시키고, 2.0 그램의 N-카보에톡시말레이미드를 수분에 걸쳐 나누어 첨가하였다. 반응물을 30분 동안 저온에서 교반시킨 후, 25분에 걸쳐 실온으로 가온시켰다. 이후, 반응물을 3 x 25 ml의 디클로로메탄으로 추출하고, 이를 소듐 술페이트 상에서 건조시키고, 여과시키고, 농축시켰다. 잔여물을 10 ml의 에틸 아세테이트에 용해시키고, 2시간 동안 50℃에서 가열시켜 고리화를 완료시켰다. 반응물을 농축시키고, 잔여물을 헥산 중 30% 에틸 아세테이트와 함께 실리카 겔 상의 플래시 컬럼 크로마토그래피에 적용시켰다. 상기와 같은 두번째 크로마토그래피로 매우 담황색인 오일로 1.24 g의 생성물을 생성시켰다. NMR(CDCl3): δ 6.77 (s, 2H, CHC=O), 4.30 (d, 2H, NCH2, J=2.4 Hz), 2.22 (t, 1H, CCH, J=2.5 Hz).
실시예 63. 5- 헥신 -1-알의 제조
Figure pct00108
20 ml의 디클로로메탄 중 694 mg의 5-헥신-1-올의 용액에 3.0 그램의 데스-마틴 페리오디난(Dess-Martin periodinane)을 실온에서 처리하고, 용액을 2시간 동안 실온에서 교반하였다. 반응물을 여과시키고, 여과액을 농축시켜, 잔여물을 생성시키고, 이를 헥산 중 에틸 아세테이트와 함께 실리카 겔 상의 플래시 컬럼 크로마토그래피에 적용시켰다. 적절한 분획을 농축시켜, 매우 담황색인 오일로 생성물을 생성시켰다. NMR(CDCl3): δ 9.81 (t, 1H, CH=O, J=2.6 Hz), 2.61 (d의 t, 2H, CH 2CH=O, J=7.1, 1.2 Hz), 2.28 (d의 t, 2H, CCH2, J=7.1, 2.6 Hz), 1.99 (t, 1H, CCH, J=2.6 Hz), 1.86 (p, 2H, CCH2CH 2, J=7.0 Hz).
실시예 64. 비스 [2,2-(2- 브로모이소부티릴 ) 히드록시메틸 ] 프로피온산, 3,6,9,12-테 트라옥사펜 타데크-14-인-1-올 에스테르의 제조
Figure pct00109
교반 막대가 장비된 100-ml 둥근-바닥 플라스크에 30 ml의 건조 아세토니트릴, 3.0 그램의 비스[2,2-(2-브로모이소부티릴)히드록시메틸]프로피온산 및 1.63 그램의 3,6,9,12-테트라옥사펜타데크-14-인-1-올을 충전시켰다. 용액에 300 mg의 DPTS를 첨가한 후, 1.86 그램(1.3 eq)의 DCC를 첨가하고, 반응 혼합물을 밤새 실온에서 교반시켰다. 반응 혼합물을 여과 및 농축시켜 잔여물을 생성시키고, 이를 헥산 중 20-50% 에틸 아세테이트와 함께 실리카 겔 상의 플래시 크로마토그래피로 정제하였다. 적절한 분획을 조합시키고, 농축시켜, 소량의 고체를 함유하는 투명한 오일로 1.82 그램의 요망되는 생성물을 생성시켰다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3):　 δ = 1.35 (s, 3H, CH 3CC=O), 1.92 (s, 12H, (CH3)2CBr), 2.43 (t, J=2.4, 1H, CCH), 3.64-3.72 (m, 14H, OCH2CH2O), 4.21 (d, 2H, J=2.4, HCCCH 2), 4.30 (app q, 2H, OCH2CH 2OC=O), 4.34 (dd, 2H, CH 2OC=OCBr).
실시예 65. 3,6,9,12- 테트라옥사펜타데크 -14-인-1- 아민의 제조
Figure pct00110
50 mL의 농축 수성 암모니아 중 3.5 그램의 3,6,9,12-테트라옥사펜타데크-14-인-1-올, 1-메탄술포네이트의 용액을 교반하고, 2시간 동안 압력 용기에서 100℃에서 가열하였다. 이후, 용기를 냉각시키고, 반응물을 농축시켜, 황색 오일을 생성시켰다. 여기에 20 ml의 무수 에탄올을 첨가하고, 용액을 농축시켜, 황색 오일을 생성시키고, 이를 디클로로메탄 중 7% 메탄올과 함께 실리카 겔 상의 크로마토그래피에 적용시켰다. 적절한 분획을 조합시키고, 농축시켜, 황색 오일로 2.24 그램의 요망되는 생성물을 생성시켰다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3):　 δ = 2.54 (t, 1H, J=2.4, CCH), 3.23 (app t, 2H, CH2NH2), 3.66 (m, 8H, OCH2CH2O), 3.74 (m, 4H, OCH2CH2O), 3.86 (app t, 2H, CH2CH2NH2), 4.26 (d, J=2.4, 2H, CH2CCH).
실시예 66. 7- 알릴옥시메틸 -2,4,9- 트리페닐 -1,3,5- 트리아자트리시클로 [3.3.1.13,7] 데칸의 제조
Figure pct00111
50 ml의 DMSO 및 2.8 그램의 분말화된 KOH의 혼합물을 10분 동안 실온에서 교반한 후, 4.0 그램의 2,4,9-트리페닐-1,3,5-트리아자트리시클로 [3.3.1.13,7] 데칸-7-메탄올을 첨가하고, 바로 직후에 1.46 그램(1.2 eq)의 알릴 브로마이드를 첨가하였다. 반응 혼합물을 3시간 동안 실온에서 교반한 후, 100 ml의 에테르와 100 ml의 물 사이에 분배시켰다. 수성층을 또 다른 3 x 50 ml의 에테르로 추출하고, 조합된 유기물을 소듐 술페이트 상에서 건조시켰다. 여과 및 농축시켜 고체 포말을 생성시키고, 이를 헥산 중 5% 에틸 아세테이트와 함께 실리카 겔 상의 플래시 크로마토그래피에 적용시켰다. 적절한 분획을 조합시키고, 농축시켜, 분쇄가능한 황색 포말로 3.51 그램(80%)의 요망되는 생성물을 생성시켰다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3):　 δ= 2.68 (s, 2H, NCH2 적도 페닐에 인접), 2.92 (s, 2H, CCH2), 3.28 (d, J=13.4 Hz, 2H, NCH2 축 페닐과 적도 페닐 사이), 3.51 (d, J=13.4 Hz, 2H, NCH2 가장 가까운 축 페닐), 3.73 (t의 d, J=1.5, 5.4 Hz, 2H, CHCH 2 O), 5.04 (q의 d, J=1.5, 10.4 Hz, 1H, CH 2 =CH), 5.07 (q의 d, J=1.7, 17.2 Hz, 1H, CH 2 =CH), 5.42 (s, 2H, NCH 축), 5.65 (s, 1H, NCH 적도), 5.71 (m, J=5.4, 10.4, 17.2 Hz, 1H, CH2=CH), 7.2 - 7.9 (m, 15H, 페닐).
실시예 67. 2,2- 비스 ( 아미노메틸 )-4- 옥사헵트 -6- 에닐아민 트리히드로클로라이드의 제조
Figure pct00112
30 ml의 테트라히드로푸란 중 3.51 그램의 7-알릴옥시메틸-2,4,9-트리페닐-1,3,5-트리아자트리시클로 [3.3.1.13,7] 데칸의 용액에 30 ml의 1N HCl을 처리하고, 반응물을 30분 동안 실온에서 교반하였다. THF를 rotovap 상에서 제거하고, 수성 잔여물을 3 x 25 ml의 에테르로 추출하였다. 수성층을 건조 농축시키고, 20 ml의 메탄올을 첨가하고, 용액을 다시 건조 농축시켰다. 생성된 백색 고체를 밤새 고진공 하에 두어, 백색 고체로 2.10 그램(93%)의 요망되는 생성물을 생성시켰다. 1H NMR (400 MHz, D-2O):　 δ = 3.34 (s, 6H, CH 2NH3), 3.76 (s, 2H, OCH 2C(CH2)3), 4.11 (m, 2H, CH2=CHCH 2), 5.28-5.39 (m, 2H, CH 2=CHCH2), 5.92-6.03 (m, CH2=CHCH2).
실시예 68. N-(2- 브로모 -2- 메틸이소부티릴 )-2,2-비스[N-(2- 브로모 -2- 메틸프로피오닐 ) 아미노메틸 ]-4- 옥사헵트 -6- 에닐 아민의 제조
Figure pct00113
250 ml의 디클로로메탄 중 2.10 그램의 2,2-비스(아미노메틸)-4-옥사-헵트-6-일아민 트리히드로클로라이드의 혼합물에 10 ml의 트리에틸아민을 처리한 후, 얼음 수조를 이용하여 냉각시켰다. 이러한 용액에 수분에 걸쳐 5.77 그램의 2-브로모이소부티릴 브로마이드를 적가하였다. 얼음 배쓰를 제거하고, 용액을 2시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 100 ml의 물로 추출하고, 유기층을 소듐 술페이트 상에서 건조시켰다. 여과 및 농축시켜 잔여물을 생성시키고, 이를 디클로로메탄 중 2-6% 에틸 아세테이트와 함께 실리카 겔 상의 플래시 크로마토그래피에 적용시켰다. 적절한 분획을 조합시키고, 농축시켜, 백색 고체로 3.66 그램(79%)의 요망되는 생성물을 생성시켰다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3):　 δ = 1.99 (s, 18H, CH3), 3.20 (d, 6H, J=6.8, CH 2NH2), 3.34 (s, 2H, OCH 2C(CH2)3), 3.99 (m, 2H, CH2=CHCH 2), 5.19-5.30 (m, 2H, CH 2=CHCH2), 5.87-5.97 (m, 1H, CH2=CHCH2), 7.72 (app t, J=6.8, 3H, NH).
실시예 69. N-(2- 브로모 -2- 메틸프로피오닐 )-2,2-비스[N-(2- 브로모 -2- 메틸프로피오닐 ) 아미노메틸 ]-4-옥사-6,7- 디히드록시헵틸 아민의 제조
Figure pct00114
60 ml의 t-부탄올 및 60 ml의 물 중의 5.39 그램의 N-(2-브로모-2-메틸프로피오닐)-2,2-비스[N-(2-브로모-2-메틸프로피오닐)아미노메틸]-4-옥사헵트-6-에닐 아민의 용액에 8.8 그램(3 eq)의 포타슘 페리시아니드, 3.68 그램(3 eq)의 포타슘 카보네이트, 850 mg(1 eq)의 메탄술폰아미드, 160 mg의 퀴누클리딘, 및 130 mg의 포타슘 오스메이트 데히드레이트를 처리하고, 반응물을 4시간 동안 실온에서 교반하였다. 혼합물을 150 ml의 에틸 아세테이트와 150 ml의 물 사이에 분배시키고, 수성층을 또 다른 2 x 30 ml의 에틸 아세테이트로 추출하였다. 조합된 유기물을 소듐 술페이트 상에서 건조시키고, 여과시키고, 농축시켜, 반고체 잔여물을 생성시켰다. 이를 디클로로메탄 중 2-4% 메탄올과 함께 실리카 겔 상의 플래시 크로마토그래피에 적용시키고, 적절한 분획을 조합시키고, 농축시켜, 회색 포말로 5.33 그램의 요망되는 생성물을 생성시켰다.
실시예 70. N-(2- 브로모 -2- 메틸프로피오닐 )-6-아미노-5,5-비스[N-(2- 브로모 -2-메 틸프로피오 닐) 아미노메틸 ]-3- 옥사헥사날
Figure pct00115
200 ml의 THF 및 50 ml의 물 중 5.33 g의 N-(2-브로모-2-메틸프로피오닐)-2,2-비스[N-(2-브로모-2-메틸프로피오닐)아미노메틸]-4-옥사-6,7-디히드록시헵틸 아민의 용액에 3.5 그램의 소듐 메타페리오데이트를 첨가하고, 반응물을 3시간 동안 실온에서 교반한 후, 농축시켜, 대부분의 THF를 제거하였다. 잔여물을 100 ml의 에틸 아세테이트와 50 ml의 물 사이에 분배시키고, 수성층을 25 ml의 에틸 아세테이트로 세척하였다. 조합된 유기물을 50 ml의 포화 NaCl로 세척하고, 소듐 술페이트 상에서 건조시켰다. 여과 및 농축시켜 회색 잔여물을 생성시키고, 이를 헥산 중 50% 에틸 아세테이트와 함께 실리카 겔 상의 플래시 크로마토그래피에 적용시키고, 적절한 분획을 조합시키고, 농축시켜, 거의 백색의 고체로 3.87 그램의 요망되는 생성물을 생성시켰다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3):　 δ = 2.00 (s, 18H, CH3), 3.19 (d, 6H, J=6.8, CH 2NH), 3.31 (s, 2H, OCH 2C(CH2)3), 4.32 (s, 2H, CHOCH 2), 8.01 (app t, J=6.8, 3H, NH), 9.70 (s, 1H, CHO).
실시예 71. N-(2- 브로모 -2- 메틸프로피오닐 )-5,5-비스[N-(2- 브로모 -2- 메틸프로피오닐 ) 아미노메틸 ]-3-옥사-6- 아미노헥산산의 제조
Figure pct00116
2.2 ml의 농축 황산 중 2.55 그램의 크롬 트리옥시드를 용해시켜 크롬산(존스 시약(Jones reagent))의 용액을 제조하고, 얼음 배쓰를 이용하여 냉각시키고, 혼합물을 물을 이용하여 10 ml로 조심스럽게 희석시켰다. 이러한 시약의 7 ml 분취량을 얼음 수조를 이용하여 냉각시키고, 20 ml의 아세톤 중 3.67 그램의 N-(2-브로모-2-메틸프로피오닐)-2,2-비스[N-(2-브로모-2-메틸프로피오닐)아미노메틸]-4-옥사-6-옥소헥실 아민의 용액을 5분에 걸쳐 적가하였다. 반응물을 20분 동안 얼음 중에서 교반시킨 후, 200 ml의 에틸 아세테이트와 200 ml의 물 사이에 분배시켰다. 수성층을 또 다른 25 ml의 에틸 아세테이트로 추출하고, 조합된 유기물을 25 ml의 포화 NaCl로 세척하고, 소듐 술페이트 상에서 건조시켰다. 용액을 여과시키고, 농축시켜, 진한 어두운 색의 오일을 생성시켰다. 이를 0.1% 아세트산을 함유하는 디클로로메탄 중 2% 메탄올과 함께 실리카 겔 상의 플래시 컬럼 크로마토그래피에 적용시켰다. 적절한 분획을 조합시키고, 농축시켜, 포말로서 3.58 그램의 요망되는 생성물을 생성시켰다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3):　 δ = 2.01 (s, 18H, CH3), 3.21 (d, 6H, J=2.8, CH 2NH), 3.36 (s, 2H, OCH 2C(CH2)3), 4.13=2 (s, 2H, CH 2CO2H), 8.15 (app t, J=2.8, 3H, NH).
실시예 72. N- Boc -β-알라닌, N- 히드록시숙신이미드 에스테르의 제조
Figure pct00117
80 ml의 무수 아세토니트릴 중 8.0 그램의 N-Boc-β-알라닌 및 5.0 그램의 N-히드록시숙신이미드와 함께 100 mg의 DPTS의 용액에 10.5 그램의 DCC를 처리하고, 반응물을 밤새 실온에서 교반하였다. 혼합물을 여과시키고, 침전물을 아세토니트릴로 세척하였다. 여과액을 농축시켜 오일을 생성시키고, 이를 헥산 중 30-40% 에틸 아세테이트와 함께 실리카 겔 상의 플래시 크로마토그래피에 적용시켜, 백색 고체로 요망되는 생성물을 생성시켰다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3):　 δ = 1.45 (s, 9H, C(CH3)3), 5.93 (m, 6H, NHS, CH 2COON), 3.53 (app q, 2H, NHCH2), 5.2 (br s, 1H, NH).
실시예 73. 3,6,9,12- 테트라옥사 -14- 인펜타데카날의 제조
Figure pct00118
5 ml의 디클로로메탄 중의 1.0 그램의 3,6,9,12-테트라옥사펜타데크-14-인-1-올 및 67 mg의 TEMPO의 용액에 1.52 그램의 아이오도벤젠 디아세테이트를 첨가하고, 반응물을 밤새 실온에서 교반하였다. 반응물을 농축시켜 황색 오일을 생성시키고, 이를 헥산 중 50-100% 에틸 아세테이트와 함께 실리카 겔 상의 플래시 크로마토그래피에 적용시켰다. 적절한 분획을 조합시키고, 농축시켜, 투명한 무색 오일로 300 mg의 생성물을 생성시켰다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3):　 δ = 2.44 (t, 1H, J=2.4, CCH), 3.65-3.77 (m, 12H, OCH 2CH 2O), 4.17 (d, J=0.8, 2H, CH 2CHO), 4.21 (d, 2H, J=2.4, CH 2CCH), 9.74= (s, 1H, CHO).
실시예 74. 7- 아지도옥시 -2,5- 디옥사헵틸 6- 아암 개시제의 제조
Figure pct00119
디클로로메탄 중 800 mg의 1-아미노-9-아지도-2,2-비스(아미노메틸)-4,7-디옥사노난 트리히드로클로라이드, 3.89 g의 비스[2,2-(2-브로모이소부티릴)히드록시메틸]프로피온산, 530 mg의 DPTS, 및 890 mg의 디메틸아미노피리딘의 용액에 2.7 g의 N,N'-디시클로헥실카르보디이미드를 처리하고, 실온에서 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 여과시키고, 농축시키고, 헥산 중 50% 에틸 아세테이트와 함께 실리카 겔 플래시 크로마토그래피로 정제하여, 2.1 g의 요망되는 생성물을 생성시켰다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3):　 δ = 1.38 (s, 9H, CH3), 1.92 (s, 36H, CH3),　3.15 (d, J=6.6 Hz, 6H, CH 2NH), 3.32 (s, 2H, OCH2C), 3.42 (t, J=5.2 Hz, 2H, N3CH2), 3.60 (m, 2H, OCH2CH2O), 3.66 (m, 2H, OCH2CH2O), 3.69 (t, J=5.2 Hz, 2H, N3CH2), 4.38 (dd, J=11.1, 17.0 Hz, 12H, CCH2O), 7.57 (브로드 t, J=6.6 Hz, NH2).
실시예 75. N-(2- 브로모 -2- 메틸프로피오닐 )-5,5-비스[N-(2- 브로모 -2- 메틸프로피오닐 ) 아미노메틸 ]-3-옥사-6- 아미노헥산산 , N- 히드록시숙신이미딜 에스테르의 제조
Figure pct00120
64.5 mg의 N-히드록시숙신이미드, 358 mg의 N-(2-브로모-2-메틸프로피오닐)-5,5-비스[N-(2-브로모-2-메틸프로피오닐)아미노메틸]-3-옥사-6-아미노헥산산, 및 26 mg의 DPTS의 용액에 300 mg의 N,N'-디시클로헥실카르보디이미드를 처리하고, 실온에서 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 여과시키고, 농축시키고, 헥산 중 50% 에틸 아세테이트와 함께 실리카 겔 플래시 크로마토그래피로 정제하여, 백색 분말로 270 mg의 요망되는 생성물을 생성시켰다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3):　 δ = 1.99 (s, 18H, CH3), 2.87 (s, 4H, CH2CO),　3.17 (d, J=6.6 Hz, 6H, CH 2NH), 3.39 (s, 2H, CCH2O), 4.51 (s, 2H, OCH2CO), 7.86 (t, J=6.6 Hz, 3H, NH).
실시예 76. N-(3,7,10,13- 테트라옥사펜타데크 -14- 이닐 )-3- 메틸말레이미드의 제조
Figure pct00121
3,6,9,12-테트라옥사펜타데크-14-인-1-아민의 346 mg 분취량을 질소하에서의 교반과 함께 224 mg의 시트라콘산 무수물 분말에 천천히 첨가하였다. 발열 반응이 발생하여 황갈색 고체가 생성되었다. 생성된 혼합물을 6시간 동안 120℃로 가열한 후, 실온으로 냉각시켰다. 생성물을 헥산 중 50% 에틸 아세테이트와 함께 실리카 겔 플래시 크로마토그래피로 분리시켜, 투명한 무색 오일로 160 mg의 순수한 생성물을 생성시켰다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3):　 δ = 2.08 (d, 3H, CH3), 2.43 (t, 1H, J=2.4 Hz, CHCCH2),　3.58-3.72 (m, 18H, CH 2CH 2O), 4.20 (d, J=2.4 Hz, 2H, CCH2O), 6.32 (q, J=1.8 Hz, 1H, CHCO).
실시예 77. N-(3,7,10,13- 테트라옥사펜타데크 -14- 이닐 ) 말레이미드의 제조
Figure pct00122
3,6,9,12-테트라옥사펜타데크-14-인-1-아민의 1.15 g 분취량을 질소 하에서의 교반과 함께 660 mg의 분말화된 말레산 무수물에 천천히 첨가하였다. 이후, 혼합물을 6시간 동안 120℃로 가열한 후, 실온으로 냉각시켰다. 생성물을 헥산 중 50% 에틸 아세테이트와 함께 실리카 겔 플래시 크로마토그래피로 분리시켰다.
실시예 78. 7- 프로파르길옥시메틸 -2,4,9- 트리페닐 -1,3,5- 트리아자트리시클로[3.3.1.13,7]데칸의 제조
Figure pct00123
20 ml의 디메틸술폭시드 중의 3.0 g의 2,4,9-트리페닐-1,3,5-트리아자트리시클로[3.3.1.13,7] 데칸-7-메탄올(WO2000/037658) 및 850 mg의 포타슘 히드록시드의 용액에 1.46 g의 80% 프로파르길 브로마이드 용액을 처리하고, 반응물을 실온에서 밤새 교반하였다. 혼합물을 각각 100 ml의 물과 디에틸 에테르 사이에 분배시키고, 수성층을 50 ml 에테르로 2회 추출하였다. 조합된 유기물을 20 ml의 물로 세척한 후, 건조시키고, 여과시키고, 농축시켰다. 잔여물을 헥산 중 5% 에틸 아세테이트 중 실리카 겔 플래시 크로마토그래피에 적용시켜 0.9 g의 요망되는 생성물을 생성시켰다.
실시예 79. 2,2- 비스 ( 아미노메틸 )-4- 옥사헵트 -6- 이닐아민 트리히드로클로라이드의 제조
Figure pct00124
10 ml의 테트라히드로푸란 중 [상기 절차로부터의 프로파르길 아다만탄 생성물]의 900 mg 샘플에 10 ml의 1N 수성 염산을 처리하고, 30분 동안 실온에서 교반하였다. 이후, 테트라히드로푸란을 실온에서 회전 증발에 의해 제거하고, 생성된 수용액을 3 x 25 ml의 에테르로 추출하였다. 수성층을 조심스럽게 농축시키고, 20 ml 메탄올에 용해시키고, 다시 농축시켜, 어두운 갈색 분말로 568 mg의 요망되는 생성물을 생성시켰다.
실시예 80. N-(2- 브로모 -2- 메틸이소부티릴 )-2,2-비스[N-(2- 브로모 -2- 메틸프로피오닐 ) 아미노메틸 ]-4- 옥사헵트 -6- 이닐아민의 제조
Figure pct00125
[상기 절차로부터의 프로파르길 트리아민]의 580 mg 샘플을 2.5 ml의 트리에틸아민과 함께 25 ml의 디클로로메탄에 현탁시키고, 얼음 상에서 교반하였다. 이후, 1.43 g의 브로모이소부티릴 브로마이드를 적가하고, 반응물을 2시간 동안 교반하였고, 반응물은 실온으로 점차 가온되었다. 혼합물을 3 x 10 ml의 1N 염산, 2 x 10 ml의 포화 소듐 바이카보네이트, 및 10 ml의 포화 소듐 클로라이드로 세척하였다. 유기상을 무수 마그네슘 술페이트 상에서 건조시키고, 여과시키고, 농축시키고, 잔여물을 디클로로메탄 중 5% 에틸 아세테이트와 함께 실리카 겔 플래시 크로마토그래피에 적용시켜, 700 mg의 요망되는 생성물을 생성시켰다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3):　 δ = 1.99 (s, 18H, CH3), 2.46 (t, 1H, J=2.4 Hz, CCH),　3.18 (d, J=6.7 Hz, 6H, CH 2NH), 3.39 (s, 2H, CH2O), 4.18 (d, J=2.4 Hz, CHCCH 2O), 7.73 (t, J=6.7 Hz, 3H, NH).
실시예 81. 1- 아지도 -2,2- 비스 ( 아지도메틸 )-4,7,10,13,16- 펜타옥사노나데크 -18-엔의 제조
Figure pct00126
10 ml의 테트라히드로푸란 중 530 mg의 펜타에리트리톨 트리아지드의 용액에 380 mg의 소듐 히드라이드(60% 분산액)를 처리하였다. 버블링(bubbling)이 가라앉는 경우, 1.24 g의 3,6,9,12-테트라옥사펜타데크-14-엔-1-올, 1-메탄술포네이트를 첨가하고, 반응물을 70-80℃에서 밤새 교반하였다. 혼합물을 냉각시키고, 물 몇 방울을 임의의 잔여 소듐 히드라이드를 켄칭시키기 위해 첨가하였고, 이후 대부분의 THF를 농축에 의해 제거하였다. 잔여물을 각각 50 ml의 물과 디클로로메탄 사이에 분배시켰다. 수성상을 25 ml의 디클로로메탄으로 2회 추출하고, 조합된 유기물(100 ml)을 25 ml의 포화 소듐 클로라이드로 2회 세척하였다. 유기상을 무수 마그네슘 술페이트 상에서 건조시키고, 여과시키고, 농축시키고, 잔여물을 헥산 중 10-50% 에틸 아세테이트와 함께 실리카 겔 플래시 크로마토그래피에 적용시켜, 2개의 밀접하게 이격된 스폿을 분리시켰다. 최종 수득량은 260 mg의 투명한 무색 오일이었다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3):　 δ = 3.34 (s, 2H, CCH2O), 3.35 (s, 6H, CH2N3),　3.59 - 3.68 (m, 16H, OCH2CH2O), 4.03 (t의 d, J=1.4, 5.6 Hz, 2H, CHCH 2O), 5.18 (q의 d, J=1.4, 10.4 Hz, 1H, CH 2 =CH), 5.28 (q의 d, J=1.6, 17.3 Hz, 1H, CH2=CH), 5.92 (m, J=5.6, 10.4, 17.2 Hz, 1H, CH).
실시예 82. 2,5,8,11,14- 펜타옥사헵타데크 -16- 에닐 9- 아암 클릭-계열 개시제의 제조
Figure pct00127
3 ml의 무수 에탄올 중 알릴 테트라에틸렌 글리콜 트리아지드(120mg, 0.28mmol)의 탈기된 용액에 253 ㎕의 DMF 중 PMDETA의 용액(100mg/ml)(25.3mg, 0.146mmol)을 첨가한 후, 3 ml의 에탄올에 용해된 700 mg의 3-아암 알킨 유도체(1.1 mmol, 개시제의 mol에 비해 4 당량)를 첨가하였다. 혼합물을 3회의 신속한 진공-질소 주기에 의해 탈기시켰다. 이후, 21mg의 CuBr(0.146 mmol, 0.5 당량, 또는 아지드 당 0.17 Cu)을 반응 혼합물에 첨가하였다. 반응물을 신속히 탈기시키고, 실온에서의 교반과 함께 질소하에서 밤새 진행시켰다. 실리카 겔 플래시 크로마토그래피로 요망되는 생성물을 생성시켰다.
실시예 83. 16,17-디히드록시-2,5,8,11,14- 펜타옥사헵타데실 9- 아암 클릭-기반 개시제의 제조
Figure pct00128
교반바가 구비된 둥근 바닥 플라스크에 15 ml의 물, 15 ml의 t-부탄올, 이전 절차로부터의 456 mg의 알릴 테트라에틸렌 글리콜 트리아졸, 198 mg의 페리시안화칼륨, 83 mg의 탄산칼륨, 19 mg의 메탄술폰아미드, 1 mg의 퀴누클리딘, 및 1 mg의 오스뮴산칼륨 이수화물을 충전시키고, 실온에서 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 각각 100 ml의 물과 디클로로메탄 사이에서 분배시켰다. 수성층을 25 ml의 디클로로메탄으로 두 번 더 추출하고, 유기층을 합하고, 무수 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켰다. 잔류물을 디클로로메탄 중 5% 메탄올을 이용하는 실리카 겔 플래시 크로마토그래피로 처리하여 요망되는 생성물을 수득하였다.
실시예 84. 2,5,8,11,14- 펜타옥사헵타덱 -16- 에닐 9- 아암 아미드-기반 개시제의 제조
Figure pct00129
아세토니트릴 중 1-아미노-15-알릴옥시-2,2-비스(아미노메틸)-4,7,10,13-테트라옥사펜타데칸 트리히드로클로라이드의 용액이 6 당량의 트리에틸아민과 함께, 아세토니트릴 중 3 당량의 N-(2-브로모-2-메틸프로피오닐)-5,5-비스[N-(2-브로모-2-메틸프로피오닐)아미노메틸]-3-옥사-6-아미노헥산산, N-히드록시숙신이미딜 에스테르의 용액과 반응하게 하고, 혼합물을 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 농축시켜 잔류물을 수득하고, 이를 디클로로메탄에 취하고, 1N HCl에 이어 염화나트륨 포화용액으로 세척한 다음, 황산나트륨 상에서 건조시켰다. 여과하고 농축시켜 잔류물을 수득하였고, 이것을 헥산중의 에틸 아세테이트의 혼합물에 의한 실리카 겔상의 플래시 크로마토그래피에 의해 정제시켜 요망되는 생성물을 수득하였다.
실시예 85. 프로파르길 테트라에틸렌 글리콜 아이오도아세타미드의 제조
Figure pct00130
아이오도아세트산 무수물 (8.8 mmol, 3.11 g)을 드라이 아세토니트릴 (20 ml) 중 프로파르길 테트라에틸렌 글리콜 아민 (8 mmol, 1.85 g) 및 N,N-디이소프로필에틸아민 (8 mmol, 1.39 g)의 교반된 용액에 첨가하였다. 90분 후에, 혼합물을 농축시켰다. 잔류물을 100 ml의 에틸 아세테이트에 용해시키고, 100 ml의 물로 3회에 이어 50 ml의 염화나트륨 포화용액으로 세척하였다. 유기물을 무수 황산나트륨 상에서 건조시키고, 농축시키고, 잔류물을 헥산중의 30-40% 에틸 아세테이트에 의한 실리카 겔 플래시 크로마토그래피로 처리하였다.
실시예 86. 프로파르길 테트라에틸렌 글리콜 브로모아세타미드의 제조
Figure pct00131
교반바가 구비된 둥근 바닥 플라스크에 프로파르길 테트라에틸렌 글리콜 아민 (8 mmol, 1.85 g), 브로모아세트산 (12 mmol, 1.67 g), 디메틸아미노피리딘 (9.6 mmol, 1.17 g), 4-디메틸아미노피리디늄 4-톨루엔술포네이트 (2.4 mmol, 0.71 g), 및 디클로로메탄 (20 ml)을 충전시켰다. 교반 혼합물을 통해 질소를 10분간 버블링시킨 다음, N,N-디시클로헥실카르보디이미드 (15.6 mmol, 3.22 g)를 첨가하였다. 실온에서 밤새 교반시킨 후에, 혼합물을 여과하고, 농축시키고, 헥산중의 40% 에틸 아세테이트에 의한 실리카 겔 플래시 크로마토그래피로 처리하였다.
실시예 87. N-(2- 브로모 -2- 메틸이소부티릴 )-2,2-비스[N-(2- 브로모 -2- 메틸프로피오닐 ) 아미노메틸 ]-3-아미노-1- 프로판올의 제조
Figure pct00132
200 ml의 디클로로메탄 중 2.00 g의 2,2-아미노메틸-3-아미노-1-프로판올 트리히드로클로라이드 (WO2000/037658) 및 9.33 ml의 트리에틸아민의 용액을 빙수조로 냉각시키고, 9.33 ml의 2-브로모이소부티릴 브로마이드를 적가하였다. 반응 혼합물이 교반되게 하면서 3시간에 걸쳐 실온으로 가온시켰다. 그 후 용액을 3 x 50 ml의 1N HCl, 3 x 50 ml의 포화 소듐 비카르보네이트, 및 50 ml의 염화나트륨 포화용액으로 세척하였다. 이어서 용액을 무수 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켜 4.67 g의 요망되는 생성물을 백색 고형물로서 수득하였다. 이러한 물질은 헥산중의 30-50% 에틸 아세테이트에 의한 실리카 겔 크로마토그래피에 의해 추가로 정제될 수 있었다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6):　 δ = 1.91 (s, 18H, CH3), 3.05 (d, 6H, J=6.4 Hz, CH2N),　3.21 (d, 2H, J=4.4 Hz, CH 2OH), 8.17 (t, J=6.4 Hz, 3H, NH).
실시예 88. N-t- 부틸옥시카르보닐 -2,2-[비스(2- 브로모 -2- 메틸프로피오닐옥시 ) 메틸 ]-O-(2- 브로모 -2- 메틸프로피오닐 )- 에탄올아민의 제조
Figure pct00133
100 ml의 디클로로메탄 중 3.50 g의 N-Boc 트리스(히드록시메틸)아미노메탄 (J. Fluorine Chem. 2007, 128, 179)의 용액을 11 mL (5 eq)의 트리에틸아민과 함께 빙수조로 냉각시키고, 6.2 mL (3.2 eq)의 2-브로모이소부티릴 브로마이드를 적각하였다. 반응물을 찬 상태에서 3시간 동안 교반한 다음, tlc (실리카 겔, 헥산중의 30% 에틸 아세테이트)에 의해 조사하였다. 반응이 아직 완료되지 않았으므로, 추가의 3 g의 2-브로모이소부티릴 브로마이드를 적가하였다. 추가 1시간 동안 교반시킨 후에, 반응물을 여과시키고, 침전물을 소량의 디클로로메탄으로 세척하였다. 합친 유기물을 50 ml의 포화 소듐 비카르보네이트로 세척한 다음, 황산나트륨 상에서 건조시켰다. 여과하고 농축시켜 잔류물을 수득하였고, 이것을 헥산중의 10-30% 에틸 아세테이트를 이용하여 플래시 크로마토그래피로 처리하였다. 생성물 함유 분획을 약 50 mL의 부피로 농축시키고, 이어서 또 다른 200 ml의 헥산을 냉각 및 교반하면서 첨가하였다. 약 2시간에 걸쳐, 혼합물로부터 많은 고형 생성물이 결정화되었다. 이것을 여과에 의해 회수하고 공기-건조시켜 7.1 g (67%)의 요망되는 생성물을 백색 결정질 고형물로서 수득하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 1.43 (s, 9H, Boc), 1.95 (s, 18H, (CH3)2CBr),　4.54 (s, 6H, CH2O), 4.8 (br s, 1H, NH).
실시예 89. 2,2-[비스(2- 브로모 -2- 메틸프로피오닐옥시 ) 메틸 ]-O-(2- 브로모 -2-메틸프로피오닐) 에탄올아민 트리플루오로아세테이트의 제조
Figure pct00134
40 ml의 디클로로메탄 중 6.0 g의 N-t-부틸옥시카르보닐-2,2-[비스(2-브로모-2-메틸프로피오닐옥시)메틸]-O-(2-브로모-2-메틸프로피오닐)-에탄올아민의 용액을 10 ml의 트리플루오로아세트산으로 처리하고, 반응물을 실온에서 1시간 동안 교반시켰다. 그 후 반응물을 농축시키고 20 ml의 헥산을 첨가하였다. 혼합물을 다시 농축시킨 다음, 고진공하에 두어 6.14 g의 요망되는 생성물을 백색 고형물로서 수득하였다.
실시예 90. 디글리콜산 무수물을 갖는 2,2-[비스(2- 브로모 -2- 메틸프로피오닐옥시 ) 메틸 ]-O-(2- 브로모 -2- 메틸프로피오닐 ) 에탄올아민 하프 아미드의 제조
Figure pct00135
50 ml의 아세토니트릴 중 5.03 g의 2,2-[비스(2-브로모-2-메틸프로피오닐옥시)메틸]-O-(2-브로모-2-메틸프로피오닐)에탄올아민 트리플루오로아세테이트의 혼합물을 2.0 ml (2 eq)의 트리에틸아민으로 처리하였고, 그 직후에 반응물이 균질해졌다. DMAP의 50 mg 부분을 첨가하고, 이어서 860 mg (1 eq)의 디글리콜산 무수물을 첨가하고, 반응물을 실온에서 3시간 동안 교반시켰다. 그 후 반응물을 농축시키고 잔류물을 100 ml의 디클로로메탄에 용해시키고, 2 x 50 ml의 1N HCl에 이어서 50 ml의 염화나트륨 포화용액으로 세척하였다. 유기물을 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켜 잔류물을 수득하고, 이를 헥산중의 50% 에틸 아세테이트에 의한 실리카 겔상의 플래시 크로마토그래피로 처리하였다. 적절한 분획을 합하고, 농축시켜 요망되는 생성물을 수득하였다.
실시예 91. 디글리콜산 무수물을 갖는 2,2-[비스(2- 브로모 -2- 메틸프로피오닐옥시 ) 메틸 ]-O-(2- 브로모 -2- 메틸프로피오닐 ) 에탄올아민 하프 아미드, NHS 에스테르의 제조
Figure pct00136
30 ml의 무수 아세토니트릴 중 디글리콜산 무수물을 갖는 2.5 g의 2,2-[비스(2-브로모-2-메틸프로피오닐옥시)메틸]-O-(2-브로모-2-메틸프로피오닐)에탄올아민, 하프 아미드의 용액을 500 mg의 N-히드록시숙신이미드 및 85 mg의 DPTS와 함께, 900 mg의 DCC로 처리하고, 반응물을 실온에서 밤새 교반하였다. 그 후 혼합물을 여과하고, 여액을 농축시켜 잔류물을 수득하고, 이를 헥산중의 50% 에틸 아세테이트에 의한 실리카 겔상의 플래시 크로마토그래피로 처리하였다. 적절한 분획을 합하고, 농축시켜 요망되는 생성물을 수득하였다.
실시예 92. 2,5,8,11,14- 펜타옥사헵타덱 -16- 에닐 9- 아암 디글리콜산 -기반 개시제의 제조
Figure pct00137
아세토니트릴 중 1-아미노-15-알릴옥시-2,2-비스(아미노메틸)-4,7,10,13-테트라옥사펜타데칸 트리히드로클로라이드의 용액을 6 당량의 트리에틸아민과 함께, 디글리콜산 무수물을 갖는 2,2-[비스(2-브로모-2-메틸프로피오닐옥시)메틸]-O-(2-브로모-2-메틸프로피오닐)에탄올아민 하프 아미드, NHS 에스테르의 용액과 반응시키고, 반응물을 실온에서 밤새 교반하였다. 그 후 반응 혼합물을 농축시키고, 잔류물을 100 ml의 디클로로메탄에 용해시키고, 2 x 50 ml의 1N HCl에 이어 50 ml의 염화나트륨 포화용액으로 세척하였다. 유기물을 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켜 잔류물을 수득하고, 이를 헥산중의 에틸 아세테이트에 의한 실리카 겔상의 플래시 크로마토그래피로 처리하였다. 적절한 분획을 합하고, 농축시켜 요망되는 생성물을 수득하였다.
실시예 93. 2- 메틸 -2- 히드록시메틸 -4,7,10,13,16- 펜타옥사 -18- 에닐노나데칸올의 제조
Figure pct00138
100 ml의 무수 THF 중 3.6 g의 5-히드록시메틸-2,2,5-트리메틸-1,3-디옥산의 용액을 빙수조로 냉각시키고, 2.7 g의 NaH (오일 중 60%)로 처리하였다. 버블링 침강 후에, 7.0 g의 3,6,9,12-테트라옥사펜타덱-14-엔-1-올 메탄술포네이트를 첨가하고, 반응물을 70℃에서 2시간 동안 교반시켰다. 반응물을 냉각시키고, 3 ml의 물을 신중하게 첨가시키고, 반응 혼합물을 100 ml의 물과 100 ml의 에테르 사이에서 분배시켰다. 수성층을 추가의 2 x 50 ml의 에테르로 추출하고, 합한 유기물을 황산나트륨 상에서 건조시켰다. 여과하고 농축시켜 황색 오일을 수득하였고, 이것을 헥산중의 10-15% 아세톤에 의한 실리카 겔상의 플래시 크로마토그래피로 처리하여 5.62 g의 요망되는 아세토나이드 생성물을 등명한 오일로서 수득하였다. 이러한 오일의 4.84 g 부분을 50 ml의 메탄올에 취하고, 1.0 g의 Dowex 50Wx8 수지 (H+ 형태)로 처리하고, 반응물을 실온에서 밤새 교반하였다. 그 후 혼합물을 여과시키고, 여액을 농축시켜 4.30 g의 요망되는 생성물을 투명하고 거의 무색인 오일로서 수득하였다.
실시예 94. 비스 2,2-[(2- 브로모이소부티릴 ) 히드록시메틸 ] 프로피온산을 갖는 2- 메틸 -2- 히드록시메틸 -4,7,10,13,16- 펜타옥사 -18- 에닐노나데칸올 , 모노 에스테르의 제조
Figure pct00139
무수 아세토니트릴 중 2-메틸-2-히드록시메틸-4,7,10,13,16-펜타옥사-18-에닐노나데칸올의 샘플을 1 당량의 비스 2,2-[(2-브로모이소부티릴)히드록시메틸] 프로피온산, 촉매량의 DPTS 및 1.2 당량의 DCC로 처리하고, 반응물을 실온에서 교반하였다. 여과하고 농축시켜 오일을 수득하고, 이를 헥산중의 에틸 아세테이트에 의한 실리카 겔상의 플래시 크로마토그래피에 의해서 정제하여 요망되는 화합물을 수득하였다.
실시예 95. 2,5,8,11,14- 펜타옥사헵타덱 -16- 에닐 5- 아암 하이브리드 개시제의 제조
Figure pct00140
무수 아세토니트릴 중 비스 2,2-[(2-브로모이소부티릴)히드록시메틸]프로피온산을 갖는 2-메틸-2-히드록시메틸-4,7,10,13,16-펜타옥사-18-에닐노나데칸올, 모노 에스테르의 용액을 디글리콜산 무수물을 갖는 1 당량의 2,2-[비스(2-브로모-2-메틸프로피오닐옥시)메틸]-O-(2-브로모-2-메틸프로피오닐)에탄올아민 하프 아미드, 촉매량의 DPTS 및 1.2 당량의 DCC로 처리하고, 반응물을 실온에서 교반하였다. 여과하고 농축시켜 오일을 수득하고, 이를 헥산중의 에틸 아세테이트에 의한 실리카 겔상의 플래시 크로마토그래피에 의해서 정제하여 요망되는 5-아암 개시제를 수득하였다.
실시예 96. 보호된 말레이미드 8- 아암 개시제의 제조
Figure pct00141
교반바가 구비된 둥근 바닥 플라스크에 보호된 말레이미드 테트라올 (1 mmol, 543 mg), 비스(브로모) 산 (4.5 mmol, 1.94 g), 디메틸아미노피리딘 (3.6 mmol, 440 mg), 4-디메틸아미노피리디늄 4-톨루엔술포네이트 (0.9 mmol, 265 mg), 및 디클로로메탄 (20 ml)을 충전시켰다. 교반 혼합물을 통해 10분간 질소를 버블링시킨 다음, N,N-디시클로헥실카르보디이미드 (5.85 mmol, 1.21 g)를 첨가하였다. 실온에서 밤새 교반시킨 후에, 혼합물을 여과하고, 농축시키고, 헥산중의 40% 에틸 아세테이트에 의한 실리카 겔 플래시 크로마토그래피로 처리하였다.
실시예 97. 보호된 말레이미드 12- 아암 개시제의 제조
Figure pct00142
교반바가 구비된 둥근 바닥 플라스크에 보호된 말레이미드 테트라올 (1 mmol, 543 mg), 3-아암 하프 아미드 산 (4.5 mmol, 3.14 g), 디메틸아미노피리딘 (3.6 mmol, 440 mg), 4-디메틸아미노피리디늄 4-톨루엔술포네이트 (0.9 mmol, 265 mg), 및 디클로로메탄 (20 ml)을 충전시켰다. 교반 혼합물을 통해 10분간 질소를 버블링시킨 다음, N,N-디시클로헥실카르보디이미드 (5.85 mmol, 1.21 g)를 첨가하였다. 실온에서 밤새 교반시킨 후에, 혼합물을 여과하고, 농축시키고, 헥산중의 40% 에틸 아세테이트에 의한 실리카 겔 플래시 크로마토그래피로 처리하였다.
실시예 98. 고분자량 쌍성이온성 중합체의 제조
NHSM2 개시제를 이용하여 합성된 실시예 2-아암 중합체
Figure pct00143
"리빙" 제어성 자유 라디칼 공정인 원자 이동 라디칼 중합반응 (ATRP)을 이용하여 쌍성이온성 단량체의 고분자량 테일러-메이드 친수성 중합체인 2-메타크릴로일옥시에틸 포스포릴콜린 (HEMA-PC)을 생산하기 위한 대표적인 프로토콜은 하기와 같다.
하기 개시제를 이용하였다:
PMC2M1 (실시예 4로부터)
Figure pct00144
PMC2M2 (실시예 5로부터)'
Figure pct00145
PMC2EOM2 (실시예 8로부터)
Figure pct00146
PMC2M4 (실시예 14로부터)
Figure pct00147
PMC2EOM4 (실시예 32로부터)
Figure pct00148
NHSM2 (실시예 25로부터)
Figure pct00149
NHSEO4M2 (실시예 38로부터)
Figure pct00150
N3C2EOM2 (실시예 49로부터)
Figure pct00151
N3EOM6 (실시예 74로부터)
Figure pct00152
AlC2M2 (실시예 24로부터)
Figure pct00153
BAlM2 (실시예 50으로부터)
Figure pct00154
AcC2M2 (실시예 9로부터)
Figure pct00155
DC1M2 (실시예 40으로부터)
Figure pct00156
DC1EOM2 (실시예 41로부터)
Figure pct00157
DC1EO4M2 (실시예 43으로부터)
Figure pct00158
DC1EOM4 (실시예 48로부터)
Figure pct00159
DC1EO4M6 (실시예 59로부터)
Figure pct00160
AKC1EO4M2 (실시예 64로부터)
Figure pct00161
AEC1EO4M9 (실시예 92로부터)
Figure pct00162
개시제 및 리간드 (달리 지시하지 않는 한, 2,2'-바이피리딜)을 슈랭크 튜브에 도입시켰다. 개시제와 리간드 둘 모두의 총 중량 퍼센트가 20%를 초과하지 않도록 디메틸 포름아미드 또는 디메틸설폭사이드를 적가식으로 도입시켰다. 개시제 또는 리간드가 오일이거나, 포함된 양이 저울의 정확도 한계 미만인 경우, 시약들을 디메틸 포름아미드 (100 mg/ml) 중의 용액으로서 도입시켰다. 생성된 용액을 드라이 아이스/아세톤 혼합물을 이용하여 -78℃로 냉각시키고, 추가의 버블링이 나타나지 않을 때까지 진공하에 탈기시켰다. 혼합물이 이러한 온도에서 여전히 균질한 채로 남아 있었다. 질소 하에 튜브를 재충전하고, 질소 하에 유지된 촉매 (달리 지시하지 않는 한, CuBr)를 슈랭크 튜브에 도입시켰다. 용액은 즉시 암갈색이 되었다. 슈랭크 튜브를 밀봉시켜 -78℃에서 유지시키고, 진공을 적용시킨 즉시 용액을 퍼징시켰다. 사용 준비가 될 때까지 단량체인 HEMA-PC가 항상 비활성 조건하에 건조 고형물로서 유지될 것을 보장하도록 주의하였다. 소정량의 단량체를 질소하에 200proof의 탈기된 에탄올과 혼합시킴에 의해 HEMA-PC의 용액을 새로 제조하였다. 단량체 용액을 슈랭크 튜브에 적가시키고 광 산란에 의해 균질화시켰다. 달리 지시하지 않는 한, 단량체 (g)/에탄올 (ml)의 비율은 0.255였다. 온도를 -78℃로 유지시켰다. 용액으로부터 버블링이 멈출 때까지 철저한 진공을 반응 혼합물에 적어도 10 내지 15분간 적용시켰다. 혼합물은 이러한 온도에서 균질한 채로 있었고, 즉 어떠한 반응 성분들 (예컨대, 개시제 또는 리간드)도 침전되지 않아서 조기 중합 또는 원치않는 중합을 피할 수 있었다. 튜브를 질소로 재충전시키고, 진공-질소 사이클을 2회 반복하였다. 그 후 튜브를 질소로 재충전하고 실온 (25℃)으로 가온시켰다. 중합이 진행됨에 따라, 용액은 점성이 되었다. 약간의 시간이 흐른 후에 (하기 표에 정의됨), 반응물을 공기에 직접 노출시켜 켄칭시킴으로써 혼합물의 색이 청녹색이 되게 하였고, 실리카 컬럼을 통해 통과시켜 구리 촉매를 제거하였다. 수집된 용액을 회전 증발에 의해 농축시키고, 생성된 혼합물을 테트라히드로푸란으로 신중하게 침전시킴에 의해 정제시킨 후에 디에틸 에테르로 충분히 세척하거나, 물에 대해 투석시켰다. 중합체를 백색 플러피(fluffy) 분말로서 수집하고 (물에 대해 투석시킨 경우 동결 건조 후에) 실온에서 진공하에 두었다.
수 회의 중합 반응으로부터의 데이터를 하기 표에 도시한다.
Figure pct00163
Figure pct00164
Figure pct00165
Figure pct00166
피크 분자량 (Mp), 수분자량 (Mn) 및 다분산성 (PDI)을 멀티-앵글 광 산란에 의해 측정/획득하였다.
실시예 99. 고분자량 쌍성이온성 중합체의 추가 제조
DC1EO4NM3 개시제를 이용하여 합성된 실시예 3-아암 중합체
Figure pct00167
"리빙" 제어성 자유 라디칼 공정인 원자 이동 라디칼 중합반응 (ATRP)을 이용하여 쌍성이온성 단량체의 고분자량 테일러-메이드 친수성 중합체인 2-메타크릴로일옥시에틸 포스포릴콜린 (HEMA-PC)을 생산하기 위한 대안적인 대표적인 프로토콜은 하기와 같다.
하기 개시제를 이용하였다:
HOC1NM3 (실시예 87로부터)
Figure pct00168
DC1EO4NM3 (실시예 54로부터)
Figure pct00169
N3EO2NM3 (실시예 57로부터)
Figure pct00170
개시제 및 리간드 (달리 지시하지 않는 한, 2,2'-바이피리딜)을 슈랭크 튜브에 도입시켰다. 개시제와 리간드 둘 모두의 총 중량 퍼센트가 20%를 초과하지 않도록 디메틸 포름아미드 또는 디메틸설폭사이드를 적가식으로 도입시켰다. 개시제 또는 리간드가 오일이거나, 포함된 양이 저울의 정확도 한계 미만인 경우, 시약들을 디메틸 포름아미드 (100 mg/ml) 중의 용액으로서 도입시켰다. 생성된 용액을 드라이 아이스/아세톤 혼합물을 이용하여 -78℃로 냉각시키고, 추가의 버블링이 나타나지 않을 때까지 진공하에 탈기시켰다. 혼합물이 이러한 온도에서 여전히 균질한 채로 남아 있었다. 질소 하에 튜브를 재충전하고, 질소 하에 유지된 촉매 (달리 지시하지 않는 한, CuBr)를 슈랭크 튜브에 도입시켰다. 용액은 즉시 암갈색이 되었다. 슈랭크 튜브를 밀봉시켜 -78℃에서 유지시키고, 진공을 적용시킨 즉시 용액을 퍼징시켰다. 사용 준비가 될 때까지 단량체인 HEMA-PC가 항상 비활성 조건하에 건조 고형물로서 유지될 것을 보장하도록 주의하였다. 소정량의 단량체를 질소하에 200proof의 탈기된 에탄올과 혼합시킴에 의해 HEMA-PC의 용액을 새로 제조하였다. 디메틸 포름아미드 (100 mg/ml) 중 CuBr2의 탈기된 용액을, 할라이드/CuBr/CuBr2의 비가 24시간까지의 반응 시간에 대해 1/0.9/0.1이고 24시간보다 긴 반응 시간에 대해 1/0.75/0.25이도록 하여 질소하에 HEMA-PC의 용액에 첨가하였다. 생성된 용액을 슈랭크 튜브에 적가시키고 광 산란에 의해 균질화시켰다. 달리 지시하지 않는 한, 단량체 (g)/에탄올 (ml)의 비율은 0.50이었다. 온도를 -78℃로 유지시켰다. 용액으로부터 버블링이 멈출 때까지 철저한 진공을 반응 혼합물에 적어도 10 내지 15분간 적용시켰다. 혼합물은 이러한 온도에서 균질한 채로 있었고, 즉 어떠한 반응 성분들 (예컨대, 개시제 또는 리간드)도 침전되지 않아서 조기 중합 또는 원치않는 중합을 피할 수 있었다. 튜브를 질소로 재충전시키고, 진공-질소 사이클을 2회 반복하였다. 그 후 튜브를 질소로 재충전하고 실온 (25℃)으로 가온시켰다. 중합이 진행됨에 따라, 용액은 점성이 되었다. 약간의 시간이 흐른 후에 (하기 표에 정의됨), 반응물을 공기에 직접 노출시켜 켄칭시킴으로써 혼합물의 색이 청녹색이 되게 하였고, 실리카 컬럼을 통해 통과시켜 구리 촉매를 제거하였다. 수집된 용액을 회전 증발에 의해 농축시키고, 생성된 혼합물을 테트라히드로푸란으로 신중하게 침전시킴에 의해 정제시킨 후에 디에틸 에테르로 충분히 세척하거나, 물에 대해 투석시켰다. 중합체를 백색 플러피 분말로서 수집하고 (물에 대해 투석시킨 경우 동결 건조 후에) 실온에서 진공하에 두었다.
수 회의 중합 반응으로부터의 데이터를 하기 표에 도시한다.
Figure pct00171
Figure pct00172
피크 분자량 (Mp), 수분자량 (Mn) 및 다분산성 (PDI)을 멀티-앵글 광 산란에 의해 측정/획득하였다.
실시예 100. 고분자량 PEG 중합체의 제조
"현재 사용되는(living)" 제어된 자유 라디칼 공정, 원자 이동 라디칼 중합 (ATRP)을 사용한, 친수성 단량체, 폴리 (에틸렌 글리콜) 메틸 에테르 메타크릴레이트, MW 475 (HEMA-PEG475)의 고분자량의 주문-제조되는 친수성 중합체를 생성시키는 대표적인 원안은 다음 차이를 제외하고는 실시예 98에 개괄된 원안과 기본적으로는 동일하다. 단량체 (HEMA-PEG 475 )를 200 푸르프(200 proof)로 용해시키고, 용액을 동결-펌프-해동 기술 (freeze-pump-thaw technique)(3회)을 이용하여 탈기시켰다. 생성되는 탈기된 혼합물을 개시제, 리간드 및 CuBr의 탈기된 용액에 -78℃에서 질소하에 도입하였다. 생성되는 혼합물을 -78℃에서 탈기시키고, 해동시키고, 실온에서 질소하에 넣었다.
Figure pct00173
1단량체(g)/용매(ml) 0.50
2-78℃에서의 혼합물의 동결로 인한 불균일 중합에 기인한 더 높은 PDI
3에틸렌 글리콜 공용매(-78℃에서의 동결을 방지)의 첨가에 기인한 더 낮은 PDI
실시예 101. 고분자량 아크릴아미드 중합체의 제조
"현재 사용되는" 제어된 자유 라디칼 공정, 원자 이동 라디칼 중합 (ATRP)을 이용한, 친수성 단량체, N,N-디메틸 아크릴아미드 (DMA), 아크릴아미드 (AM) 또는 N-이소프로필 아크릴아미드 (NIPAM)의 고분자량 주문-제조되는 친수성 중합체를 생성시키는 대표적인 원안은 다음 차이를 제외하고는 실시예 99에 개괄된 원안과 기본적으로는 동일하다. 사용된 리간드는 트리스[2-디메틸아미노)에틸]아민 (Me6TREN)이고, 3.3 mol x 10-5이 샘플 1 및 샘플 2에 첨가되고, 1.5 mol x 10-5이 모든 다른 샘플에 첨가되며, 용매는 물이었다. 할라이드/CuBr/CuBr2/Me6TREN의 비는 각각의 경우에 1/0.75/0.25/1이었다. 촉매의 첨가 후에, 용기를 밀봉하고, 0℃에서 두었다. 아크릴아미드 유도체, DMA, AM 또는 NIPAM의 수용액을 동결-펌프-해동 기술을 이용하여 탈기시키고(3회), 질소하에 캐눌라를 통해서 개시제, 리간드 및 촉매를 함유하는 슈렝크 튜브(Schlenk tube)에 도입하였다. 용기를 밀봉하고, 4℃에서 반응이 진행되게 하였다. 잠시 후에, 반응물을 공기에 직접 노출시켜서 켄칭시켰다. 블루-그린 반응 혼합물을 짧은 실리카 겔 플러그를 통해서 통과시켜서 구리 촉매를 제거하였다. 수집된 용액을 동결건조에 의해서 농축시켰다.
Figure pct00174
1AM 단량체
2DMA 단량체
3NIPAM 단량체
할라이드/CuBr/CuBr2/Me6TREN의 비율은 각각의 경우에 1/0.75/0.25/1이었다.
실시예 102. 디올 기능화 된 개시제의 중합 후의 디올 전구체로부터의 알데히드 작용기의 생성
증류수에 용해된 아주 과량의 소듐 퍼아이오데이트를 증류수중의 디올 기능화된 중합체의 용액(10중량%)에 첨가하였다. 반응을 암실에서 90분 동안 실온에서 진행시켰다.
Figure pct00175
반응을 글리세롤(NaIO4에 대해 1.5배)의 수용액으로 켄칭시켜서 어떠한 미반응 소듐 퍼아이오데이트를 제거하였다. 혼합물을 실온에서 15분 동안 교반하고, 투석 백 (MWCO 14 내지 25 kDa)에 넣고, 실온에서 1일 동안 투석에 의해서 정제하였다. 이어서, 물을 동결건조에 의해서 제거하고, 중합체를 무수 분말로서 수거하였다.
Cy5.5 하이드라지드 형광 염료(GE Healthcare)의 결합에 의해서 알데히드 정량화를 수행하였다..
실시예 103. 아지도 기능화 된 중합체에 대한 N- 프로파르길 말레이미드 및 5-헥신-1-알의 결합
하기 시약을 아지도 기능화된 중합체에 결합시켰다.
N-프로파르길 말레이미드 (실시예 62로부터)
Figure pct00176
5-헥신-1-알 (실시예 63으로부터)
Figure pct00177
200 프루프 에탄올 중의 아지도 기능화된 중합체의 탈기된 용액에 과량의 알킬 유도체(아지도 기 당 1.2 당량)를 첨가한 다음, DMF (100mg/ml)중의 원액으로서 리간드 N,N,N',N",N"-펜타 메틸디에틸렌트리아민 (PMDETA)를 첨가하였다. 혼합물을 3회 진공/질소 사이클에 의해서 탈기시켰다. 구리 브로마이드 (I)를 전형적으로는 아지도 기에 대해서 0.2 내지 1의 비율로 반응 혼합물에 첨가하였다. CuBr/PMDETA의 비율은 1/1이었다. 반응물을 다시 탈기시키고, 실온에서 밤새 교반하였다.
하기 중합체를 사용하였다(실시예 98로부터의 샘플 1, 2, 8, 9 및 10; 실시예 100으로부터의 샘플 4; 및 실시예 99로부터의 샘플 3, 5, 6 및 7):
Figure pct00178
실시예 104. 말레이미드 기능화 된 중합체에 대한 재조합 인간 모노클로날 Fab'의 컨쥬게이션
말레이미드 기능화된 중합체(실시예 16에 따른 탈보호 후에 실시예 98로부터)를 제조하였다:
Figure pct00179

재조합 인간 Fab'(분자량 50 kDa)의 컨쥬게이션을 2mM EDTA를 함유하는 pH 5의 10 mM 소듐 아세테이트중에서 10x 몰 과량의 TCEP 및 5 내지 10 배 몰 과량의 말레이미드 기능화된 중합체로 수행하였다. 반응 혼합물중의 최종 Fab'농도는 1 내지 2mg/ml이었으며, 반응은 암실에서 5시간 동안 실온에서 수행한 다음, 록킹 테이블(rocking table)을 사용하여 약하게 혼합하면서 4℃에서 밤새 수행하였다. 생성되는 Fab’-중합체 컨쥬게이트를 결합 완충액으로서 20mM Tris pH 7.4를 사용하는 GE Healthcare로부터의 MacroCap SP (MSP) 컬럼상에서 이온 교환 크로마토그래피를 사용하여 정제하였다. 일반적으로, 컨쥬게이션 반응물(약 5 mg 단백질을 함유)을 결합 완충액으로 4 배 희석시키고, 중력 흐름에 의해서 2 ml MSP 컬럼에 로딩하였다. 컬럼을 10 이상의 컬럼 용적(CV)의 결합 완충액으로 세척하였다. 컨쥬게이트의 용리는 컬럼을 10 이상의 CV 동안 40 내지 50mM NaCl을 함유하는 결합 완충액으로 용리시킴으로써 달성되었다. 수거된 분획을 10 kDa MW 컷오프 막을 지니는 Amicon Ultrafree 농축기로 농축시키고, 0.5M NaCl을 함유하는 결합 완충액내로 완충액을 교환하고, 주가로 약 1mg/ml의 최종 단백질 농도로 농축시켰다. 최종 컨쥬게이트를 0.22 마이크론 필터로 무균 여과하고, 사용전에 4℃에서 저장하였다. 최종 단백질 농도는 1.46의 Fab' 흡광계수(10mm 통과길이 큐벳 중의 1mg/ml 용액)를 지닌 OD280nm를 사용하여 측정하였다. 이어서, 컨쥬게이트 농도를 Fab'외에 중합체의 MW를 포함시킴으로써 계산하였다.
컨쥬게이트의 MW를 2996 광다이오드 어레이 검출기및 Wyatt miniDAWN Treos 다중 각도 광 산란 검출기가 장착된 Waters 2695 HPLC 시스템과 함께 Shodex 806MHQ 컬럼을 사용하여 분석하였다. PDI및 Mp를 Wyatt MALS 검출기와 연결된 ASTRA 소프트웨어를 사용하여 계산하고, 데이터를 상기 표에 나타낸다. 또한, 모든 경우에, 컨쥬게이트의 화학양론은 Fab’와 중합체 사이에 1 대 1인 것으로 밝혀졌다.
실시예 105. 알데히드 기능화 된 중합체에 대한 재조합 인간 시토카인의 컨쥬게이션
하기 알데히드 기능화된 중합체 (달리 명시된 것 외에는 실시예 102에 따른 산화 후에 실시예 98 및 실시예 99로부터)를 사용하였다:
Figure pct00180
1실시예 103으로부터의 중합체 (클릭 화학을 통해서 결합된 알데히드)
2DC1M2 개시제 (즉, 스페이서 없음)
3DC1EOM2 개시제 (즉, 에틸렌 옥사이드 스페이서)
5.02의 pI와의 22 kDa 재조합 인간 시토카인의 컨쥬게이션을 40mM 소듐 시아노보로하이드라이드를 함유하는 pH 7의 10mM 헤페스 완충액에서 수행하였다. 최종 단백질 농도는 컨쥬게이션 완충액중에 용해된 6 내지 7 배 몰 과량의 중합체의 존재하에 1 내지 1.5mg/ml이었다. 반응물을 실온으로 옮기거나, 록킹 테이블을 사용하여 약하게 혼합하면서 암실에서 밤새 4℃에 보관하였다.
컨쥬게이션 효율을 두 가지 방법을 이용하여 모니터링하였다: (i) SDS-PAGE 분석을 사용한 세미-정량적인 방법 및 (ii) Dionex Corporation으로부터의 ProPac SEC-10 컬럼, 4x300mm 에 의한 분석용 크기 배제 크로마토그래피 (SEC) 를 사용한 정량적인 방법.
생성되는 시토카인-중합체 컨쥬게이의 정제를 GE Healthcare로부터의 음이온 교환 Q Sepharose HP (QHP) 컬럼을 사용하여 수행하였다. 일반적으로, 컨쥬게이션 반응물(약 1 mg 단백질을 함유함)을 20 mM Tris pH 7.5을 함유하는 QHP 세척 완충액으로 약 4배 희석시키고, 중력흐름으로 2ml QHP 컬럼상에 로딩시켰다. 컬럼을 10 컬럼 용적(CV) 이상의 세척 완충액으로 세척하였다. 컨쥬게이트의 용리가 5CV 이상을 위한 40 내지 50mM NaCl을 함유하는 세척 완충액으로 컬럼을 용리시킴으써 달성되었다. 수집된 분획을 10 kDa MW 컷오프 막을 지닌 Amicon Ultrafree 농축기로 농축시키고, 1xPBS pH 7.4 로 완충액 교환하고, 1mg/ml 이상의 최종 단백질 농도로 추가로 농축시켰다. 최종 컨쥬게이트를 0.22 마이크론 필터로 무균 여과하고, 사용 전에 4℃에서 저장하였다. 최종 단백질 농도는 0.81의 시토카인 흡광계수를 지니는 OD277nm(10mm 통과길이 큐벳(cuvette)내의 1mg/ml 용액)을 사용하여 측정하였다. 이어서, 컨쥬게이트 농도는 단백질에 추가로 중합체의 MW를 포함시킴으로써 계산된다.
시토카인-중합체 컨쥬게이트의 특성화는 하기 검정으로 수행하였다: (i) 컨쥬게이트 의 MW는 2996 광다이오드 어레이 검출기(2996 Photodiode Array Detector) 및 Wyatt miniDAWN Treos 다중 각도 광 산란 검출기가 장착된 Waters 2695 HPLC 시스템에 의한 Shodex 806MHQ 컬럼을 사용하여 분석하였다. PDI 및 Mp는 Wyatt MALS 검출기과 연결된 ASTRA 소프트웨어를 사용하여 계산하고, 데이터를 상기 표에 나타낸다. 또한, 모든 경우에, 컨쥬게이트의 화학양론은 단백질과 중합체 사이에 1 대 1인 것으로 나타났으며; (ii) 쿠마씨 블루 염료(Coomassie Blue stain)를 사용한 SDS-PAGE 분석. 비-환원 및 환원 조건 둘 모두 하의 고 MW 컨쥬게이트의 존재 및 유리 단백질의 결핍은 단백질이 중합체에 공유결합으로 컨쥬게이트되는 양호한 지표를 제공했다. 또한, 단백질과 중합체 사이의 비-공유 회합의 징후가 없었을 뿐만 아니라 정제된 단백질-중합체 컨쥬게이트 제조물 내의 분자간 디설파이드 결합 매개된 단백질 응집의 존재도 없었다.
아주 중요한 차이는 샘플 3과 샘플 4 사이에서 관찰되었다. 샘플 3은 말단 작용기와 개시제 코어 사이에 스페이서가 없는 DC1M2 개시제를 사용하여 제조된 중합체로부터의 구성되었다. 샘플 4는 말단 작용기와 개시제 코어 사이에 단일의 에틸렌 옥사이드 스페이서를 지니는 DC1EOM2 개시제를 사용하여 제조된 중합체로부터 구성되었다. 샘플 4에 대한 컨쥬게이션 효율은 샘플 3보다 5배 더 높아서, 작용기 반응성에 영향을 주는데 있어서의 스페이서 화학의 중요성을 나타냈다.
실시예 106. 알데히드 기능화 된 중합체에 대한 재조합 인간 다중-도메인 단백질의 컨쥬게이션
하기 알데히드 기능화된 중합체 (실시예 102에 따른 산화 후의 실시예 98 및 실시예 99로부터)를 사용하였다:
Figure pct00181
4.77의 pI와의 21 kDa 재조합 인간 다중-도메인 단백질의 컨쥬게이션을 40mM 소듐 시아노보로하이드라이드를 함유하는 pH 7의 10mM 헤페스 완충액중에서 수행하였다. 최종 단백질 농도는 컨쥬게이션 완충액에 용해된 6 내지 7배 몰 과량의 중합체의 존재하에 1 내지 1.5mg/ml이었다. 반응을 록킹 테이블을 사용하여 약하게 혼합하면서 실온에서 수행하거나 암실에서 밤새 4℃에서 수행하였다.
컨쥬게이션 효율을 두 가지 방법을 이용하여 모니터링하였다: (i) SDS-PAGE 분석을 사용한 세미-정량적인 방법 및 (ii) Dionex Corporation으로부터의 ProPac SEC-10 컬럼, 4x300mm 에 의한 분석용 크기 배제 크로마토그래피 (SEC) 를 사용한 정량적인 방법.
생성되는 단백질-중합체 컨쥬게이의 정제를 GE Healthcare로부터의 음이온 교환 Q Sepharose HP (QHP) 컬럼을 사용하여 수행하였다. 일반적으로, 컨쥬게이션 반응물(약 1 mg 단백질을 함유함)을 20 mM Tris pH 7.5을 함유하는 QHP 세척 완충액으로 약 4배 희석시키고, 중력흐름으로 2ml QHP 컬럼상에 로딩시켰다. 컬럼을 10 컬럼 용적(CV) 이상의 세척 완충액으로 세척하였다. 컨쥬게이트의 용리가 5CV 이상을 위한 40-50mM NaCl을 함유하는 세척 완충액으로 컬럼을 용리시킴으써 달성되었다. 수집된 분획을 10 kDa MW 컷오프 막을 지닌 Amicon Ultrafree 농축기로 농축시키고, 1xPBS pH 7.4 로 완충액 교환하고, 1mg/ml 이상의 최종 단백질 농도로 추가로 농축시켰다. 최종 컨쥬게이트를 0.22 마이크론 필터로 무균 여과하고, 사용 전에 4℃에서 저장하였다. 최종 단백질 농도는 1.08의 도메인 단백질 흡광계수를 지니는 OD280nm(10mm 통과길이 큐벳(cuvette)내의 1mg/ml 용액)을 사용하여 측정하였다. 이어서, 컨쥬게이트 농도는 단백질에 추가로 중합체의 MW를 포함시킴으로써 계산되었다.
단백질-중합체 컨쥬게이트의 특성화는 하기 검정으로 수행하였다: (i) 컨쥬게이트 의 MW는 2996 광다이오드 어레이 검출기(2996 Photodiode Array Detector) 및 Wyatt miniDAWN Treos 다중 각도 광 산란 검출기가 장착된 Waters 2695 HPLC 시스템에 의한 Shodex 806MHQ 컬럼을 사용하여 분석하였다. PDI 및 Mp는 Wyatt MALS 검출기과 연결된 ASTRA 소프트웨어를 사용하여 계산하고, 데이터를 상기 표에 나타낸다. 또한, 모든 경우에, 컨쥬게이트의 화학양론은 단백질과 중합체 사이에 1 대 1인 것으로 나타났으며; (ii) 쿠마씨 블루 염료(Coomassie Blue stain)를 사용한 SDS-PAGE 분석. 비-환원 및 환원 조건 둘 모두하의 고 MW 컨쥬게이트의 존재 및 유리 단백질의 결핍은 단백질이 중합체에 공유결합으로 컨쥬게이트되는 양호한 지표를 제공했다. 또한, 단백질과 중합체 사이의 비-공유 회합의 징후가 없었을 뿐만 아니라 정제된 단백질-중합체 컨쥬게이트 제조물 내의 분자간 디설파이드 결합 매개된 단백질 응집의 존재도 없었다.
실시예 107. 알데히드 기능화 된 HEMA - PEG 중합체에 대한 재조합 인간 시토카인 및 재조합 인간 다중-도메인 단백질의 컨쥬게이션
312.9 kDa의 분자량을 지닌 6-아암 아지도 기능화된 HEMA-PEG475 중합체를 실시예 100에 기재된 과정에 따라서 제조하였다. 알데히드 작용기를 실시예 103에 기재된 과정에 따라서 5-헥신-1-알을 아지도 작용기에 결합시킴으로써 도입되었다. 이러한 중합체는 하기 차이가 있으면서 일반적으로 각각 실시예 105 및 실시예 106에 기재된 과정에 따라서 22 kDa 재조합 시토카인 및 21 kDa 재조합 인간 다중-도메인 단백질에 컨쥬게이트되었다. 암실에서 불황성 조건하에 실온에서 밤새 인큐베이션 한 후에, 반응물을 20 mM Tris pH 7.5의 첨가에 의해서 켄칭시키고, 샘플을 구배 형성이 가능한 용매 전달 분자가 구비된 Waters HPLC 시스템 및 크로마토그램 흔적 검출을 위한 UV 검출기를 사용하는 약한 음이온 교환 크로마토그래피를 사용하여 크로마토그래피하였다. 15μl의 각각의 샘플을 1ml/min의 유량으로 컬럼에 가한 다음, 5분 완충액중 등용매 세척(20 mM Tris pH 7.4)을 수행한 후에, 9분에 걸친 80% 완충액의 선형 구배(0.5M NaCl를 함유하는 완충액 A)에 적용시켰다. 염 구배는 컬럼 재생을 위한 100% 완충액 A로 다시 감소시키기 전에 2분 동안 80%에서 유지시켰다. 크로마토그래피 분리 과정중에, OD220nm에 의해서 검출된 단백질 피크 분획을 SDS-PAGE에 의한 추가의 분석을 위해서 수작업으로 수집하였다. 세 개의 주요 피크가 수집되었다. 첫 번째 피크는 초기 등용매 세척액 동안 1.8 내지 3분에서 용리되었고, 이러한 분획은 중합체가 컬럼을 통해서 전하 중성으로 흐른다는 사실로 인해서 비컨쥬게이션된 유리 중합체와 동등하고; 두 번째 피크는 염 구배에서의 초기에 용리되는 약하게-결합된 컨쥬게이트 분획이였고; 구배에서 나중에 용리되는 마지막 피크는 비컨쥬게이션된 유리 단백질에 상응하였다. 3개의 분획들을 수집하여 10K MWCO 농축기가 장착된 Amicon Ultrafree 4로 농축시켰다. 농축된 분획은 상기 참조된 예에서 기재된 바와 같이 SDS-PAGE 에 이어진 쿠마씨 블루 염료 및 SEC-MALS에 의해서 추가로 분석되었으며, 데이터가 다음 표에 기재된다:
Figure pct00182
실시예 108. N-2- 브로모이소부티릴 -β-알라닌 t-부틸 에스테르의 제조
Figure pct00183
25 ml의 디클로로메탄중의 1.92 g의 t-부틸-β-알아미네이트 하이드로클로라이드의 혼합물을 빙수욕으로 냉각시키고, 25 ml의 1N NaOH를 첨가한 다음, 2.53 g의 2-브로모이소부티릴 브로마이드를 첨가하였다. 반응물을 15분 동안 냉각상태에서 교반하고, 이어서, 층을 분리하고, 유기층을 황산나트륨으로 건조시켰다. 여과하고 농축시켜 오일을 수득하고, 이를 헥산중의 40% 에틸 아세테이트에 의한 실리카 겔상의 플래시 크로마토그래피에 가하였다. 적절한 분획을 합하고, 농축시켜 2.78 g의 요망되는 생성물을 등명한 오일로서 수득하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 1.47 (s, 9H, Boc), 1.94 (s, 6H, (CH3)2CBr), 2.48 (t, 6H, J=6, CH2C=O), 3.50 (app q, 2H, J=6, CH2NH).
실시예 109. N-2- 브로모이소부티릴 -β-알라닌 2-( 디페닐포스피노 ) 페닐 에스테르의 제조
Figure pct00184
5 ml의 포름산 중의 2.78 g의 N-2-브로모이소부티릴-β-알라닌 t-부틸 에스테르의 용액을 실온에서 밤새 교반하였다. 이어서, 반응물을 농축시켜 오일을 수득하였고, 이를 50 ml의 에테르와 50 ml의 물 사이에 분배시켰다. 유기층을 황산나트륨으로 건조시키고, 여과하고, 농축시켜 1.66 g의 백색 고형물을 수득하였다. 이러한 고형물을 20 ml의 a무수 아세토니트릴에 취하고, 1.94 g의 (2-히드록시페닐)디페닐포스핀을 첨가한 다음, 200 mg의 DPTS 및 1.88 g의 DCC를 첨가하였다 반응물을 실온에서 2 시간 동안 교반하였는데, 이때, tlc(실시카겔, 헥산중의 50% 디클로로메탄)에 의해서 반응이 완료된 것으로 나타났다. 반응물을 여과하고 농축시켜 오일을 수득하고, 이를 헥산중의 10 내지 20% 아세톤에 의한 실리카 겔상의 플래시 크로마토그래피에 가하여 요망되는 생성물을 점성 오일로서 수득하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 1.95 (s, 6H, (CH3)2CBr), 2.55 (t, 2H, J=6, CH2C=O), 3.44 (app q, 2H, J=6, CH2NH), 6.85 (m, 1H, PhH), 7.15 (m, 2H, PhH), 7.25-7.42 (m, 12H, PhH).
이러한 유형의 화합물을 사용하여 작용기를 아지도 중합체와의 "흔적없는(traceless)" Staudinger 결찰(J. Am. Chem. Soc. 2006, 128, 8820)에서 도입시킬 수 있다.
실시예 110. 3- 말레이미도프로피온산 , (2- 디페닐포스피노 ) 페닐 에스테르의 제조
Figure pct00185
무수 아세토니트릴중의 1 당량의 2-(히드록시페닐)디페닐포스핀 (Catalysis Today 1998, 42, 413) 과 함께 3-말레이미도프로피온산 (J. Am. Chem. Soc. 2005, 127, 2966)의 혼합물을 촉매량의 DPTS로 처리한 다음, 1.2 당량의 DCC로 처리하고, 반응물을 실온에서 반응이 완료될 때까지 교반하였다. 반응물을 여과하고, 여액을 농축시켜 잔류물을 수득하고, 이를 헥산중의 에틸 아세테이트에 의한 실리카 겔상의 플래시 크로마토그래피 에 의해서 정제하여 요망되는 생성물을 수득하였다.
실시예 111. 9-히드록시-4,7- 디옥사노나노산 , 2-( 히드록시페닐 ) 디페닐포스피노 에스테르의 제조
Figure pct00186
THF 중의 9-t-부틸디페닐실릴옥시-4,7-디옥사노나노산, 2-(히드록시페닐)디페닐포스피노 에스테르의 용액을 테트라 부틸암모늄 플루오라이드로 처리하고, 반응물을 실온에서 교반하였다. 이를 농축시켜 잔류믈을 수득하고, 이를 에틸 아세테이트와 물 사이에 분배시켰다. 유기물을 황산나트륨으로 건조시키고, 추가의 정제 없이 다음 반응에서 사용하였다.
실시예 112. 9-옥소-4,7- 디옥사노나노산 , 2-( 히드록시페닐 ) 디페닐포스피노 에스테르의 제조
Figure pct00187
9-히드록시-4,7-디옥사노나노산, 2-(히드록시페닐) 디페닐포스피노 에스테르의 샘플을 데스-마틴(Dess-Martin) 퍼아이오디난으로 산화시켜서 상응하는 알데히드를 수득하고, 이를 헥산중의 에틸 아세테이트를 사용한 실리카 겔 크로마토그래피에 의해서 정제하였다.
실시예 113. N- Boc -β-알라닌, 2-( 히드록시페닐 ) 디페닐포스피노 에스테르의 제조
Figure pct00188
무수 아세토니트릴중의 N-Boc-β-알라닌의 용액을, 1 당량의 2-(히드록시페닐)디페닐포스핀과 함께, 촉매량의 DPTS로 처리한 다음, 1.2 당량의 DCC로 처리하고, 반응물을 실온에서 반응이 완료될 때까지 교반하였다. 반응물을 여과하고, 여액을 농축시켜 잔류물을 수득하고, 이를 헥산중의 에틸 아세테이트에 의한 실리카 겔상의 플래시 크로마토그래피 에 의해서 정제하여 요망되는 생성물을 수득하였다.
실시예 114. N- 아이오도아세틸 -β-알라닌, 2-( 히드록시페닐 ) 디페닐포스피노 에스테르의 제조
Figure pct00189
디클로로메탄 중의 N-Boc-β-알라닌, 2-(히드록시페닐)디페닐포스피노 에스테르의 용액을 트리플루오로아세트산으로 처리하고, 반응이 완료되면, 반응물을 농축시켜 잔류물을 수득하고, 이를 헥산으로 재농축시켜 가능한 많은 TFA를 제거하였다. 이러한 잔류물을 디클로로메탄에 취하고, 6 당량의 트리에틸아민으로 처리하고, 아이오도아세트산 무수물을 첨가하였다. 반응 혼합물을 물로 세척하고, 황산나트륨으로 건조시키고, 농축시켜 잔류물을 수득하고, 이를 헥산중의 에틸 아세테이트에 의한 플래시 크로마토그래피에 가하여 요망되는 생성물을 수득하였다.
실시예 115. 펜탄이산 , 모노 2-( 히드록시페닐 ) 디페닐포스피노 에스테르의 제조
Figure pct00190
디클로로메탄중의 2-(히드록시페닐)디페닐포스핀의 용액을 0.1 당량의 DMAP 및 2 당량의 트리에틸아민으로 처리한 다음, 1.0 당량의 글루타르산 무수물로 처리하였다. 반응물을 약하게 환류시키면서 밤새 가열하고, 이어서, 1N HCl 및 염화나트륨 포화용액으로 세척하고, 황산나트륨으로 건조시켰다. 여과하고 농축시켜 미정제 산을 수득하고, 이를 추가의 정제 없이 다음 반응에서 사용하였다.
실시예 116. 펜탄이산 , 하프( half ) 2-( 히드록시페닐 ) 디페닐포스피노 에스테르, 하프 N- 히드록시숙신이미드 에스테르의 제조
Figure pct00191
무수 아세토니트릴중의 펜탄이산, 모노 2-(히드록시페닐)디페닐포스피노 에스테르의 용액을 촉매량의 DPTS로 처리한 다음, 1.2 당량의 DCC로 처리하였다. 반응물을 여과하고, 농축시켜 잔류물을 수득하고, 이를 헥산중의 에틸 아세테이트에 의한 플래시 크로마토그래피에 가하여 요망되는 생성물을 수득하였다.
실시예 117. N-(3-히드록시-4- 카르보메톡시 )벤질- 비스 2,2-[(2- 브로모이소부티릴 ) 히드록시메틸 ] 프로피온아미드의 제조
Figure pct00192
비스 2,2-[(2-브로모이소부티릴옥시)메틸]프로피온산, N-히드록시숙신이미드 에스테르의 샘플을 트리에틸아민의 존재하에 메틸 4-(아미노메틸)-2-히드록시벤조에이트 (US 6,156,884)와 반응시키고, 생성물을 헥산중의 에틸 아세테이트에 의한 실리카 겔상의 플래시 크로마토그래피에 의해서 분리하였다.
실시예 118. N-(3-히드록시-4- 히드록시아미노카르보닐 ) 벤질- 비스 2,2-[(2-브로모이소부티릴) 히드록시메틸 ] 프로피온아미드의 제조
Figure pct00193
이전의 단계로부터의 생성물을 염기성 조건하에서 히드록실 아민 하이드로클로라이드로 처리하여 상응하는 히드록삼산을 수득하였다.
이러한 개시제를 사용하여 제조된 중합체를 페닐보론산?함유 컨쥬게이션 시약, 예컨대, 3-말레이미도페닐보론산모이어티(참조: US 6,156,884 및 이에 기재된 참고문헌, 이들 각각은 그 전체내용이 본원에서 참조로 통합된다)와의 커플링 반응에서 사용될 수 있다. 이하에서는 히드록삼산-함유 개시제로부터의 중합체와 3-말레이미도페닐보론산 사이의 컨쥬게이션 반응으로부터 형성된 생성물의 구조를 도시하고 있다. 이러한 중합체는 자유 티올을 함유하는 바이오분자와 컨쥬게이션할 준비가 되어 있다.
Figure pct00194
기본적으로, 어떠한 작용기가 혼입될 수 있으며, 말레이미드 외에 본 방법에서 사용될 수 있는 다른 예시적인 바이오컨쥬게이션기는 브로모아세타미드, 아이오도아세타미드, 하이드라지드, 카르복실산, 디티오피리딜, N-히드록시숙신이미딜 에스테르, 이미도 에스테르, 아미노 및 티올 모이어티 (표 참조, US 6,156,884)이다.
Figure pct00195
여기서,
R=
Figure pct00196
실시예 119. 알데히드 기능화 된 중합체에 대한 마쿠젠 앱타머의 컨쥬게이션
마쿠젠은 신생혈관 (습식) 노인성 황반 형성(age-related macular degeneration: AMD)의 처리를 위한 신생혈관 생성 억제 약물이다. 이는 펜틸 아미노 링커에서 말단되는 길이 28개의 뉴클레오티드(앱타머)의 올리고뉴클레오티드의 공유 컨쥬게이트이며, 이에 두 개의 20 kDa 모노메톡시 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 단위가 라이신 잔기상의 두 개의 아미노기를 통해서 공유결합으로 결합된다. 현재의 구체예에서, 유리 아미노기를 지닌 마쿠젠 앱타머는 하기 차이를 지닌 실시예 105에서 개괄된 원안을 이용한 알데히드 기능화된 중합체에 대한 컨쥬게이션을 위해서 사용되었다. 본 발명의 중합체와의 앱타머의 컨쥬게이션은 높은 안정성, 낮은 점도, 및 유익한 생체 내 성질, 예컨대, 마이크로RNA 및 RNAi 전달을 위한 염기임에 따른 긴 체류 시간을 지니는 컨쥬게이트를 생성시킨다.
20mg/ml 앱타머 원액을 헤페스 완충액at pH 7의 헤페스 완충액으로 제조하고, 이어서, 소듐 시아노보로하이드라이드 환원제와 혼합하여 33mM의 최종 농도를 생성시켰다. 이어서, 이러한 용액을 하기 계열의 알데히드 기능화된 중합체 (실시예 105에서 또한 사용됨)를 용해시키기 위해서 사용하였다:
Figure pct00197
앱타머에 대한 중합체의 최종 몰 과량 비율은 2내지 2.5배였으며, 최종 앱타머 농도는 4.4 내지 8.9 mg/ml이었다. 컨쥬게이션 혼합물을 22 내지 23℃ 수조에서 밤새 인큐베이션하고, 샘플을 용리 프로파일의 파장 모니터링을 위한 2669 PDA가 장착된 Waters 2695 용매 전달 시스템에 연결된 Shodex DEAE-825 음이온 교환 컬럼을 이용하여 분석하였다. 컨쥬게이션 반응을 분석하기 위해서, 2μl의 반응 혼합물을 20mM Tris pH 7.5 (완충액 A)으로 10배 희석시키고, 이어서, 컬럼에 가하고, 1 ml/min의 유량으로 추적한 다음, 5분 완충액 A중 등용매 세척액으로 용리시킨 후에, 9분에 걸쳐서 선형 구배의 80% 완충액(0.5M NaCl을 함유하는 완충액 A)으로 용리시켰다. 염 구배는 컬럼 재생을 위한 100% 완충액 A로 감소시키기 전에 2분 동안 80%에서 유지시켰다. 세 개의 주요 피크가 OD220nm에 의해서 검출되었다: 첫 번째 피크는 초기 등용매 세척액 동안 2.2분에서 용리되었고, 이러한 분획은 비컨쥬게이션된 유리 중합체(이러한 중합체는 컬럼에 결합되지 않는 전하 중성으로 유지된다)와 동등하고; 두 번째 피크는 염 구배에서 초기에 용리되는 5.4분에 약하게-결합된 컨쥬게이트였고; 마지막 피크는 나중에 13.6분에 구배에서 용리되었으며 비컨쥬게이션된 유리 앱타머에 상응하였다. 컨쥬게이트 피크와 유리 앱타머 피크 둘 모두는 OD254nm 흡광력을 보여서, 올리고뉴클레오티드의 존재를 나타낸다. 5.4 분 피크는 모든 중합체 함유 반응물에서 254nm 및 220nm 흔적 피크 둘 모두에서 검출되었지만, 중합체가 첨가되지 않은 대조 반응물에서는 검출되지 않아서, 이러한 피크가 사실 컨쥬게이트 피크임을 추가로 지지한다.
실시예 120. 2,5,8,11,14- 펜타옥사 -15,16- 디히드록시헵타데세닐 9- 아암 아미드-기반 개시제의 제조
Figure pct00198
15ml의 물중의 앞선 단계로부터의 생성물, 15 ml t-부탄올, 3 당량의 페리시안화칼륨, 3 당량의 탄산칼륨, 1 당량의 메탄술폰아미드, 10 mg의 퀴누클리딘, 및 7 mg의 오스뮴산칼륨 이수화물의 용액을 실온에서 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 100 ml 각각의 물 및 디클로로메탄 사이에 분배시켰다. 수성층을 25 ml 디클로로메탄으로 2회 이상 추출하고, 유기층을 합하고, 무수 황산마그네슘으로 건조시키고, 여과하고, 농축시켰다. 잔류물을 디클로로메탄중의 메탄올을 사용한 실리카 겔 플래시 크로마토그래피에 가하여 요망되는 생성물을 수득하였다.
상기 기재된 발명이 이해의 명확성을 위해서 예시 방법 및 예에 의해서 일부 상세하게 기재되고 있지만, 당업자에게는 특정의 변화 및 변경이 첨부됨 특허청구범위 내에서 실행될 수 있음이 자명할 것이다. 또한, 본원에 기재된 각각의 참고 문헌은 각각의 참고 문헌이 참고로서 개별적으로 포함되는 바와 동일한 범위로 그 전체내용이 참조로서 포함된다.

Claims (29)

  1. 각각 독립적으로 아크릴레이트, 메타크릴레이트, 아크릴아미드, 메타크릴아미드, 스티렌, 비닐-피리딘, 비닐-피롤리돈 및 비닐-에스테르로 이루어진 군으로부터 선택되는 다수의 단량체를 각각 포함하는 2 이상의 중합체 아암; 중합체 아암의 근위 말단에 연결된 개시제 단편; 및 중합체 아암의 원위 말단에 연결된 말단기를 포함하는 중합체로서, 각각의 단량체는 친수성 기를 포함하고, 개시제 모이어티는 라디칼 중합에 적합하고, 개시제 단편 및 말단기 중 하나 이상은 기능성 작용제 또는 연결기를 포함하는 중합체.
  2. 제 1 항에 있어서, 각각의 친수성 기가 쌍성이온 기를 포함하는 중합체.
  3. 제 2 항에 있어서, 각각의 쌍성이온 기가 포스포릴콜린을 포함하는 중합체.
  4. 제 3 항에 있어서, 단량체가 2-(아크릴로일옥시에틸)-2'-(트리메틸암모늄에틸) 포스페이트를 포함하는 중합체.
  5. 제 3 항에 있어서, 단량체가 2-(메타크릴로일옥시에틸)-2'-(트리메틸암모늄에틸) 포스페이트 (HEMA-PC)를 포함하는 중합체.
  6. 제 1 항에 있어서, 개시제 단편이 2 내지 약 100개의 중합체 아암의 근위 말단에 연결된 중합체.
  7. 제 6 항에 있어서, 중합체가 약 2.0 미만의 다분산성 지수를 갖는 중합체.
  8. 제 6 항에 있어서, 개시제 단편이 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9 또는 12개의 중합체 아암의 근위 말단에 연결된 중합체.
  9. 각각 독립적으로 아크릴레이트, 메타크릴레이트, 아크릴아미드, 메타크릴아미드, 스티렌, 비닐-피리딘, 비닐-피롤리돈 및 비닐-에스테르로 이루어진 군으로부터 선택되는 다수의 단량체를 각각 포함하는 2 이상의 중합체 아암, 중합체 아암의 근위 말단에 연결된 개시제 단편, 및 중합체 아암의 원위 말단에 연결된 말단기를 포함하는 하나 이상의 중합체; 및 개시제 단편 또는 말단기에 연결된, 생물활성 작용제 또는 진단 작용제를 포함하는 하나 이상의 기능성 작용제를 포함하는 컨쥬게이트로서, 각각의 단량체는 친수성 기를 포함하고, 개시제 모이어티는 라디칼 중합에 적합한 컨쥬게이트.
  10. 제 9 항에 있어서, 생물활성 작용제가 약물, 항체, 항체 단편, 단일 영역 항체, 아비머, 아드넥틴, 디아바디, 비타민, 보조인자, 다당류, 탄수화물, 스테로이드, 지질, 지방, 단백질, 펩티드, 폴리펩티드, 뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드 및 핵산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 컨쥬게이트.
  11. 제 9 항에 있어서, 진단 작용제가 방사성표지, 조영제(contrast agent), 형광단(fluorophore) 및 염료로 이루어진 군으로부터 선택되는 컨쥬게이트.
  12. 제 9 항에 있어서, 2 이상의 중합체가 작용제에 연결된 컨쥬게이트.
  13. 제 9 항에 있어서, 2 이상의 중합체가 기능성 작용제 상의 근위 반응기를 통해 기능성 작용제에 연결되어 슈도-분지형 구조를 형성하는 컨쥬게이트.
  14. 제 9 항에 있어서, 컨쥬게이트가 중합체에 부착된 2 이상의 기능성 작용제를 포함하는 컨쥬게이트.
  15. 하기 화학식의 중합체:
    Figure pct00199

    상기 식에서,
    R1 은 H, L3-A1, LG1 및 L3-LG1으로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    각각의 M1 및 M2는 독립적으로 아크릴레이트, 메타크릴레이트, 아크릴아미드, 메타크릴아미드, 스티렌, 비닐-피리딘, 비닐-피롤리돈 및 비닐-에스테르로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    G1 및 G2의 각각은 각각 독립적으로 친수성 기이고;
    각각의 I 및 I'은 독립적으로 개시제 단편으로, I-I'의 조합은 라디칼 중합을 통해 화학식 I의 중합체의 중합을 위한, 개시제 I1이고;
    대안적으로, 각각의 I'은 독립적으로 H, 할로겐 및 C1 -6 알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    L1, L2 및 L3의 각각은 독립적으로 결합 또는 링커이고;
    각각의 A1은 기능성 작용제이고;
    각각의 LG1은 연결기이고;
    하첨자 x 및 y1은 각각 독립적으로 1 내지 1000의 정수이고;
    각각의 하첨자 z는 독립적으로 0 내지 10의 정수이고;
    하첨자 s는 2 내지 100의 정수이다.
  16. 제 15 항에 있어서, 중합체가 하기 화학식을 갖는 중합체:
    Figure pct00200

    상기 식에서,
    R1은 H, L3-A1, LG1 및 L3-LG1으로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    각각의 M1 및 M2는 독립적으로 아크릴레이트, 메타크릴레이트, 아크릴아미드, 메타크릴아미드, 스티렌, 비닐-피리딘, 비닐-피롤리돈 및 비닐-에스테르로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    ZW 및 ZW1의 각각은 독립적으로 쌍성이온성 모이어티이고;
    각각의 I 및 I'은 독립적으로 개시제 단편으로, I-I'의 조합은 라디칼 중합을 통해 화학식 I의 중합체의 중합을 위한, 개시제 I1이고;
    대안적으로, 각각의 I'은 독립적으로 H, 할로겐 및 C1 -6 알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    L1, L2 및 L3의 각각은 링커이고;
    각각의 A1은 기능성 작용제이고;
    각각의 LG1은 연결기이고;
    하첨자 x 및 y1은 각각 독립적으로 1 내지 1000의 정수이고;
    각각의 하첨자 z 는 독립적으로 0 내지 10의 정수이고;
    하첨자 s는 2 내지 100의 정수이다.
  17. 제 15 항에 있어서, 각각의 친수성 기가 쌍성이온 기를 포함하는 중합체.
  18. 제 15 항에 있어서, 각각의 친수성 기가 포스포릴콜린을 포함하는 중합체.
  19. 제 15 항에 있어서, 하첨자 s가 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9 또는 12인 중합체.
  20. 제 15 항에 있어서, 중합체가 하기 화학식을 갖는 중합체:
    Figure pct00201
    .
  21. 제 15 항에 있어서, 중합체가 하기 화학식을 갖는 중합체:
    Figure pct00202

    상기 식에서,
    R2는 H 및 C1 -6 알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    PC는 포스포릴콜린이다.
  22. 제 15 항에 있어서, 개시제 I1이 하기 화학식을 갖는 중합체:
    Figure pct00203

    상기 식에서,
    각각의 I'은 독립적으로 할로겐, -SCN 및 -NCS로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    L4 및 L5는 각각 독립적으로 결합 또는 링커로, L4 및 L5 중 하나는 링커이고;
    C는 결합 또는 코어 기이고;
    LG2는 연결기이고;
    하첨자 p는 1 내지 20이고, 여기서 하첨자 p가 1일 때, C는 결합이고, 하첨자 p가 2 내지 20일 때, C는 코어 기이다.
  23. 제 22 항에 있어서, 개시제 I1의 각각이 하기 화학식인 중합체:
    Figure pct00204

    상기 식에서, 각각의 R3 및 R4는 독립적으로 H, CN 및 C1 -6 알킬로 이루어진 군으로부터 선택된다.
  24. 제 22 항에 있어서, 개시제 I1의 각각이 독립적으로 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 중합체:
    Figure pct00205
    ,
    Figure pct00206
    ,
    Figure pct00207
    ,
    Figure pct00208
    ,
    Figure pct00209
    ,
    Figure pct00210
    ,
    Figure pct00211
    ,
    Figure pct00212
    ,
    Figure pct00213
    ,
    Figure pct00214
    ,
    Figure pct00215
    ,
    Figure pct00216
    ,
    Figure pct00217
    ,
    Figure pct00218
    및
    Figure pct00219
    .
  25. 제 15 항에 있어서, 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 화학식을 갖는 중합체:
    Figure pct00220
    ,
    Figure pct00221
    ,
    Figure pct00222
    ,
    Figure pct00223
    ,
    Figure pct00224
    및
    Figure pct00225

    상기 식에서, PC는 포스포릴콜린이다.
  26. 제 25 항에 있어서,
    R1은 L3-A1, LG1 및 L3-LG1으로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    A1은 약물, 항체, 항체 단편, 단일 영역 항체, 아비머, 아드넥틴, 디아바디, 비타민, 보조인자, 다당류, 탄수화물, 스테로이드, 지질, 지방, 단백질, 펩티드, 폴리펩티드, 뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드, 핵산, 방사성표지, 조영제, 형광단 및 염료로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    L3는 -(CH2CH2O)1-10-이고;
    LG1은 말레이미드, 아세탈, 비닐, 알릴, 알데히드, -C(O)O-C1 -6 알킬, 히드록시, 디올, 케탈, 아지드, 알킨, 카르복실산 및 숙신이미드로 이루어진 군으로부터 선택된다.
  27. 제 26 항에 있어서, 각각의 LG1이 독립적으로 히드록시, 카르복시, 비닐, 비닐옥시, 알릴, 알릴옥시, 알데히드, 아지드, 에틴, 프로핀, 프로파르길, -C(O)O-C1 -6 알킬,
    Figure pct00226
    ,
    Figure pct00227
    ,
    Figure pct00228
    ,
    Figure pct00229
    ,
    Figure pct00230
    ,
    Figure pct00231
    ,
    Figure pct00232
    및
    Figure pct00233
    로 이루어진 군으로부터 선택되는 중합체.
  28. 제 15 항에 있어서, 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 화학식을 갖는 중합체:
    Figure pct00234
    ,
    Figure pct00235
    ,
    Figure pct00236
    ,
    Figure pct00237
    ,
    Figure pct00238
    ,
    Figure pct00239
    및
    Figure pct00240
    .
  29. 각각 독립적으로 아크릴레이트, 메타크릴레이트, 아크릴아미드, 메타크릴아미드, 스티렌, 비닐-피리딘, 비닐-피롤리돈 및 비닐-에스테르로 이루어진 군으로부터 선택되는 다수의 단량체를 독립적으로 포함하는 중합체 아암; 중합체 아암의 근위 말단에 연결된 개시제 단편; 및 중합체 아암의 원위 말단에 연결된 말단기를 포함하고, 광 산란으로 측정하여 약 50kD 내지 약 1,500kD의 피크 평균 분자량을 갖는 중합체로서, 각각의 단량체는 친수성 기를 포함하고, 개시제 모이어티는 라디칼 중합에 적합하고, 개시제 단편 및 말단기 중 하나 이상은 기능성 작용제 또는 연결기를 포함하는 중합체.
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