MX2012011876A - Polimeros que contienen zwiteriones de alto peso molecular. - Google Patents

Abstract

La presente invención proporciona polímeros de alto peso molecular de varias ramas que contienen grupos hidrófilos y uno o más agentes funcionales y métodos para preparar dichos polímeros.

Description

POLÍMEROS QUE CONTIENEN ZWITERIONES DE ALTO PESO MOLECULAR Referencia Cruzada a Solicitudes de Patentes Relacionadas Esta solicitud de patente reivindica prioridad de la Solicitud de Patente Provisoria Estadounidense N° 61/324.413, presentada el 15 de abril de 2010, que se incorpora en la presente en su totalidad como referencia para todos los propósitos.

Referencia a un "Listado de Secuencias", una Tabla o un Apéndice de Listado de Programas de Computación Presentado en un Disco Compacto No corresponde .

Antecedentes de la invención Precisamente en este momento está ocurriendo una carrera armamentista de todo tipo entre las grandes empresas farmacéuticas que están todas intentando suministrar "productos diferenciados médicamente" . Los productos biofarmacéuticos se ven como un vehículo fundamental. La creencia en esa diferenciación no vendrá necesariamente a través de la novedad del objetivo sino a través de formatos de fármacos novedosos. Estos formatos serán flexibles de manera tal que los fármacos resultantes puedan estar centrados en la biología y no centrados en el formato. Esta próxima ola de productos biofarmacéuticos será modular, multifuncional y dirigida a objetivos. Estos fármacos se diseñarán con vistas a entender la biología de la enfermedad más amplia a la cual están dirigidos y a aplicar ese conocimiento en un fármaco multifacético . Los anticuerpos son fármacos fantásticos, pero a pesar de la cantidad importante de producción de proteínas de anticuerpos son y continuarán siendo un formato rígido e inflexible.

Los productores de proteínas farmacéuticas están mirando formatos de proteínas más pequeñas. Hubo una ola de progreso en el período 2006 con productos de la talla de las adnectinas (desarrolladas por Adeneux y adquiridas por BMS) , los avimer (desarrollados por Avidia y adquiridos por Amgen) , los diacuerpos (desarrollados por Domantis y adquiridos por GSK) , Haptogen (adquirido por Wyeth) , BiTES (desarrollado por Micromet) , los camelid (desarrollados por Ablynx) , los péptidos (desarrollados por Gryphon Therapeutics y Compugen y muchos otros) . Pero la conversión de estas tecnologías de plataforma en varios productos en el conducto farmacéutico se ha materializado lentamente. Durante las últimas dos décadas, los problemas que obsesionaron a estos formatos de anticuerpos no enteros se relacionaron con la afinidad inferior a la óptima, la mala estabilidad, el bajo rendimiento farmacéutico, así como el desarrollo de herramientas. En gran medida, estos problemas se han resuelto y se están resolviendo. Pero el talón de Aquiles de estos formatos sigue siendo su tiempo de residencia in vivo insuficiente, un problema que está refrenando una ola de oportunidades de productos importantes .

Los anticuerpos enteros tienen una semivida de eliminación in vivo de 250 horas, que corresponde a más de un mes de residencia física en el cuerpo. Esto los hace un formato de producto excelente desde un punto de vista de dosificación. Frecuentemente pueden alcanzar una inyección mensual o menos frecuente. La trayectoria también es hacia la inyección subcutánea en volúmenes más pequeños (1 mL, 0,8 mL, 0,4 mL) , formulaciones líquidas más estables (contra formulaciones liofilizadas que necesitan la reconstitución del médico) , un almacenamiento a concentraciones más altas (50 mg/mL, 100 mg/mL, 200 mg/mL) y a temperaturas más altas (-80 grados, -20 grados, 2 - 8 grados, temperatura ambiente) .

Los anticuerpos tienen una actividad difícil de seguir, especialmente con la totalidad de la actividad descubrimiento y desarrollo de anticuerpos amplios. Pero los anticuerpos sí dejan mucho que desear. Son inhábiles, inflexibles, de gran tamaño, limitados a un solo objetivo, fabricados en sistemas de mamíferos, en general mal caracterizados y son fundamentales para muchas biologías in vivo diferentes de las cuales la unión al objetivo, el reciclado del receptor de FcRn epitelial, la citotoxicidad mediada por células que depende del anticuerpo (ADCC) , la citotoxicidad que depende del complemento (CDC) , la avidez, las arquitecturas de orden superior, para mencionar solamente algunas.

Los formatos modulares, más pequeños pueden hacer un aporte fundamental al desarrollo de terapias más seguras, dirigidas, multifuncionales, de mayor eficacia, bien caracterizadas y de menor costo. Además, existe una necesidad similar de mejorar el tiempo de residencia en el suero y propiedades físicas asociadas de otros tipos de agentes farmacológicos tales como las proteínas y péptidos recombinantes (nativos o muteína) y oligonucleótidos . El desafío es crear una solución técnica que aumente dramáticamente el tiempo de residencia in vivo para estos productos biof rmacéuticos solubles (el problema del desempeño) , que lo haga sin empujar compromisos en otros parámetros fundamentales tales como la solubilidad del fármaco, la estabilidad, la viscosidad, la capacidad de caracterización (los problemas de las propiedades físicas relacionadas) y que emplee un enfoque que permita la previsibilidad a través de clases de objetivos y a través del camino de desarrollo de fármacos desde estudios animales anteriores hasta el aumento proporcional de la fabricación y los ensayos clínicos humanos de etapa tardía (el problema de la planificación de la cartera.

La primera clase de soluciones que se intentó está basada en la biología y depende de la fusión de los agentes proteínas a transíerrina, albúmina, inmunoglobulina gamma (IgG) , región constante de IgG y/u otras proteínas del suero. Pero la fusión de un grupo de extensión de suero basado en la biología a un grupo biológico funcional aumenta el número y la complejidad de las interacciones biológicas concurrentes. Estas interacciones no mediadas por el objetivo pocas veces promueven la acción terapéutica deseada del fármaco, sino que antes bien con más frecuencia se apartan de la acción terapéutica deseada del fármaco en formas complejas y poco comprendidas. El impacto neto es socavar la previsibilidad, el rendimiento y la seguridad.

La segunda clase de soluciones que se intentó está basada ampliamente en un grupo de enfoques que aprovechan los polímeros de diferentes tipos que están unidos al fármaco. Esos polímeros funcionan principalmente sobre la base de su capacidad para unirse y estructurar agua. El agua unida reduce el aclaramiento mediante los numerosos mecanismos de aclaramiento in vivo, tanto pasivo como activo, mientras que también mejora las propiedades físicas del conjugado de polímero y fármaco tal como la solubilidad, la estabilidad, la viscosidad. Esta segunda clase de soluciones se subclasifica también de dos maneras: (1) por la entidad que se une al agua dentro del polímero y (2) por la manera en que se une el polímero al agente farmacológico. En relación a (1) , existen numerosos grupos de unión al agua poliméricos diferentes en uso, tales como azúcares (carbohidratos) , aminoácidos (dominios de proteína hidrófilos) , óxido de polietileno, polioxazolina, alcohol polivinílico, polivinil pirrolidona, etc. En relación con (2), la distinción es principalmente si el polímero se agrega al agente farmacológico por la maquinaria celular o si se agrega en un paso de conjugación semisintética .

En relación con los polímeros agregados al agente farmacológico por la maquinaria celular (es decir, no a través de un paso semisintético) , un ejemplo es el agregado de polímeros de carbohidratos hidrófilos a la superficie de una proteína traducida a través de un proceso de glicosilacion mediada por las células agregando o modificando un sitio de glicosilacion al nivel de la secuencia de nucleotido de codificación (por ejemplo, Aranesp) . Otro ejemplo es el agregado de una cadena de aminoácidos hidrófilos durante la traducción de la proteína agregando una serie de unidades de nucleotido repetido al nivel de los codones de marco de lectura abierto (es decir, la plataforma XTEN de Amunix) .

En relación con los compuestos semisintéticos : Hay más experiencia con la PEGilación en la cual se da una funcionalidad a los polímeros de óxido de polietileno y luego se los conjuga hacia el agente farmacológico. Además, Fresenius emplea un enfoque de PEGilación en el cual se da una funcionalidad a almidones de maíz de cadena larga y luego se los conjuga al agente farmacológico. Además, Serina Therapeutias emplea una cadena principal de polioxazolina hidrófila (a diferencia de la cadena principal de polietileno de PEG) . Otro método denominado poliPEG descrito por Haddleton et al emplea una cadena principal de polímero capaz de la polimerización de radicales y una entidad de unión al agua que es una cadena corta de PEG o un azúcar.

¿Cuán bien funcionan estos enfoques de tecnologías diferentes en la práctica? En general, a pesar del tiempo y dinero importantes que les insumió las empresas biofarmacéuticas y farmacéuticas, la conclusión genera es que estas tecnologías no están brindando el nivel de beneficios de rendimiento necesarios (especialmente el tiempo de residencia in vivo) y además están en la parte plana de la curva en términos de su capacidad para brindar una mayor progreso a través de la ingeniería adicional. El nivel de mejora necesario depende del fármaco y de su biología y del perfil de producto necesario, pero en muchos casos es tan elevado como de tres a cuatro veces. Muchas compañías están trabajando para obtener este nivel de mejora pero en la práctica las tecnologías empeladas no están logrando brindar mejoras crecientes que sean un nicho completo en su aplicabilidad.

Por ejemplo: La PEGilación de un inhibidor de fragmento de anticuerpo scFv (aproximadamente 22 kDa de tamaño) de GM-CSF (datos de Micromet) con un PEG ramificado de 40 kDa derivó en una semivida de eliminación murina después de una inyección intravenosa de 59 horas que es insuficiente. Para ser útil, la semivida murina debe ser superior a 150 hors (una mejora de 3 veces) y preferentemente superior a 250 horas (una mejora de 4 veces) .

La PEGilación de un interferón alfa recombinante de aproximadamente 19,5 kDa con un PEG ramificado de 40 kDa (datos de Pegasys) deriva en una semivida de eliminación murina después de una inyección subcutánea de aproximadamente 50 horas y una semivida humana en la gama de 80 horas. Pegasys se dosifica semanalmente en los humanos.

La PEGilación de un fragmento de anticuerpo Fab' de aproximadamente 50 kDa contra IL-8 (datos de Genentech, Leong et al, 2001) con una serie de polímeros de PEG de tamaño y arquitectura crecientes. Las semividas en conejos después de la inyección intravenosa estuvieron en la gama de 44 horas con un PEG de 20 kDa lineal a 105 horas con un PEG de 40 kDa ramificado. Esto se puede relacionar con la semivida del producto aprobado Cimzia que tiene un Fab' contra TNFa conjugado con un polímero ramificado de 40 kDa. La semivida humana después de la inyección intravenosa es de 311 horas y es suficiente (aprobada por la Administración de Alimentos y Medicamentos para la artritis reumatoide) para la dosificación subcutánea mensual. Pero las propiedades impulsadas por el grupo PEG (solubilidad, estabilidad, viscosidad) no son suficientes para permitir que la cantidad de dosis completa (400 mg) se formule en un solo frasco para la inyección subcutánea (límite de 1 mL, preferentemente de 0,8 mL o menos). En cambio, Cimzia se formula preferentemente como un sólido y en dos frascos para dos inyecciones por separado que suministran cada una, 200 mg del producto. Además, el reactivo de PEG es muy expansivo y constituye hasta el veinte por ciento del precio mayorista promedio del fármaco. En consecuencia, el producto de Cimzia no es muy competitivo en el mercado contra Humira (anticuerpo anti-TNFa, en una formulación líquida, en una jeringa de un solo uso, administrado mediante una inyección subcutánea única, dos veces por mes y aún menos contra Simponi (anticuerpo anti-TNFa, en una formulación líquida, en una jeringa de un solo uso, administrado mediante una inyección subcutánea única, una vez por mes) .

La PEGilación de un péptido mimético (aproximadamente 4 kDa) de receptor de eritropoyetina (datos de Hematide) con un polímero PEG ramificado de 40 kDa después de una inyección subcutánea presentó una semivida de entre 23 y 31 horas en ratas (que depende de la dosis) . En los monos la semivida estuvo en la gama de 15 horas a 60 horas (Fan et al Hematología General, 34, 2006) . La frecuencia de la dosis proyectada para la molécula es mensual . En este caso, la capacidad de dosificación mensual con esta molécula está permitida por un efecto farmacodinámico cuya duración excede en mucho la semivida física y el tiempo de residencia del propio fármaco. Esta propiedad se mantiene para ciertos fármacos agonistas potentes pero generalmente no se mantiene para los inhibidores que necesitan mantener una concentración inhibitoria mínima ni se mantiene para enzimas ni para proteínas agonistas de dosis elevada.

Interferón beta (aproximadamente 20 kDa) se PEGiló con un polímero de PEG lineal de 40 kDa. Avonex, un a forma PEGilada, demuestra una semivida final media en monos después de una inyección intravenosa de 5,5 horas y una semivida de 10 horas después de una inyección intramuscular. La conjugación de un polímero de PEG lineal de 40 kDa puede demostrar una semivida de aproximadamente quince horas después de una inyección intravenosa y de treinta horas después de una inyección subcutánea. La conjugación de un polímero de PEG ramificado de 40 kDa puede demostrar una semivida de treinta horas después de la inyección intravenosa y de sesenta horas después de una inyección subcutánea. La frecuencia de dosificación proyectada es de dos veces por mes, entonces la capacidad de dosificación dos veces por mes con esta molécula está permitida por un efecto biológico o farmacodinámico cuya duración excede la semivida física y el tiempo de residencia del fármaco solo. Para que un perfil de producto blanco atractivo desafíe a los productos interferón beta existentes, se necesita una frecuencia de dosis de una vez por mes. Alternativamente, un conjugado de polímeros que se dosificó dos veces por mes pero con una cinética muy plana, potencialmente de orden cero, puede ser ideal. Esto se puede obtener con un conjugado altamente biocompatible y dosificar a una dosis total más baja. Además, el interferón beta es una proteína inestable y total con la cual es difícil funcionar y se desea una nueva mejora en la solubilidad y estabilidad.

Se ha realizado la PEGilación del Factor VIII humano recombinante (por encima de 300 kDa) con un polímero de PEG ramificado de 60 kDa. FVIII no PEGilado demuestra una semivida en circulación de doce a catorce horas en los humanos. Se usa en forma aguda en respuesta a una crisis de hemorragia. También se está usando para la profilaxis a través de infusiones intravenosas de tres veces por semana. La semivida final media murina es de seis horas en la forma no PEGilada y de once horas con una forma PEGilada dirigida al sitio. En los conejos, con una proteína de FVIII de longitud completa, una forma no PEGilada mostró una semivida final promedio de 6,7 horas. Con una forma PEGilada con un PEG ramificado de 60 kDa, la semivida aumentó a veinte horas. La magnitud del aumento en la semivida de PEG-FVIII se relaciona con el aumento en la masa de PEG. Un objetivo fundamental, sin embargo, es permitir la profilaxis con una infusión intravenosa de una vez por semana. No se piensa, ni es probable, que el beneficio ofrecido aún por el (reactivo de 60 kDa muy grande y costoso), permita la frecuencia de una vez por semana. Necesita un 2x preferentemente un 4x adicional contra PEG para ser un cambiador del juego. Otra medida de rendimiento in vivo para mejorar sería reducir sustancialmente la incidencia de la neutralización de anticuerpos generados contra el fármaco de FVIII administrado. La meta se cumple insuficientemente a través de conjugados de FVIII -PEG. Otra medida de rendimiento in vitro para mejorar sería lograr una formulación de concentración alta, estable suficiente para permitir la dosificación subcutánea en lugar de la dosificación intravenosa, esto también necesitaría una mejora de las propiedades de inmunogenicidad in vivo ya que las zonas subcutáneas tienen un alto contenido de células que presentan antígenos inmuno-estimulantes. Recientemente, se ensayó una fusión de FVIII a un fragmento de Fe de inmunoglobulina generada por Biogen y demostró que tiene un nivel similar de semivida in vivo como el FVIII PEGilado pero fue muy interesante que tuvo una biodisponibilidad muy pobre presumiblemente debido al aclaramiento del fármaco en las células endoteliales mediado por FcRn. Estos datos han llevado a los desarrolladores de fármacos FVIII a la conclusión de que las tecnologías existentes han "golpeado una pared" .

La tecnología XTEN de Amunix fusiona aproximadamente 850 aminoácidos hidrófilos (aproximadamente 80 kDa de tamaño) al péptido de GLP-1. Esto intensifica la semivida a sesenta horas en un mono Cynomologus que es ligeramente inferior a un equivalente de GLP-1 conjugado a un polímero de PEG ramificado de 40 kDa. Por lo tanto un polímero de un tamaño aumentado 2x brinda esencialmente el mismo beneficio de rendimiento. Un nivel similar de beneficio se observó con XTEN unido a la hormona de crecimiento humana. En términos de intentar extender adicionalmente el nivel de beneficio de semivida, existen numerosos desafíos. Primero y principal, los aminoácidos hidrófilos usados para unir y estructurar el agua son no óptimos en términos de sus características de unión de agua. En segundo lugar, el uso requerido de la maquinaria de traducción ribosomal para agregar el polímero limita la arquitectura a estructuras lineales de una sola rama que se ha demostrado en muchos ejemplos de PEGilación que son inferiores a las arquitecturas ramificadas cuando mantienen el peso molecular constante y aumentan el nivel de ramificación. En tercer lugar, un enlace de péptido usado como una cadena principal de polímero es suficientemente inestable como para que demuestre una polidispersidad, cuya heterogeneidad se hace limitante en términos prácticos de manera tal que la longitud del polímero hidrófilo no se puede incrementar fácilmente para alcanzar semividas superiores al PEG ramificado de 40 kDa (esto por encima de la complejidad exterior relacionada con el uso de varias unidades repetidas prolongadas en el vector de plásmido de codificación que solo se hace limitante) . Esta tecnología entonces se convierte en un nicho en su aplicación, por ejemplo, para permitir que un péptido que anteriormente se fabricaba en forma sintética a través de la síntesis química se fabrique en un sistema basado en células que tiene algunas ventajas percibidas (así como desventajas nuevas) pero en general con un rendimiento similar al que es posible con otras tecnologías, especialmente la semivida de eliminación in vivo. rhEPO es una proteína de 30,4 kDa con 165 aminoácidos y 3 sitios de glicosilación unidos a N más 1 unido a O. Un 40% de la masa es carbohidrato. Los carbohidratos no son necesarios para la actividad in vitro, pero son absolutamente necesarios para la actividad in vivo. Aranesp es una forma de eritropoyetina humana modificada a nivel genético para contener 5 cadenas de oligosacáridos unidos a N contra la forma nativa que contiene 3 cadenas. Los carbohidratos adicionales aumentan el peso molecular aproximado de la glicoproteína desde 30 kDa a 37 kDa. En los humanos, el cambio aumenta la semivida final promedio después de la inyección intravenosa de 7 horas a 21 hors y después de la inyección subcutánea de 16 horas a 46 horas, con una mejora umbral aproximada en ambos casos . Mircera que es una forma PEGilada de eritromicina humana recombinante demostró una semivida in vivo después de la inyección subcutánea de aproximadamente 140 horas pero en pacientes con enfermedad renal crónica, donde los pacientes debido a la filtración renal del fármaco muestran un aumento de más de 2x en la semivida así como una afinidad al receptor reducida que reduce el aclaramiento mecánico, lo cual significa que la semivida física real es menor de 70 horas y está en línea con el peptidomimético de Hematide de Affymax (PEGilado con un PEG ramificado de 40 kDa) .

La tecnología de PEGilación emplea una conjugación semisintética de un polímero de almidón derivado del maíz a un fármaco. Los datos muestran que un polímero de Hesitación de 100 kDa es equivalente a un polímero de PEG lineal de 30 kDa sobre eritromicina en ratones (equivalente al producto Mincera) . Es posible usar un polímero de mayor tamaño, pero el enfoque está fundamentalmente limitado por la naturaleza de la unión del agua al almidón. Además, la equivalencia de un polímero de 100 kDa a un PEG lineal de 30 kDa (que solo es inferior a un PEG ramificado de 40kDa) muestra que hay un largo camino para recorrer en términos del rendimiento antes de que pueda igualar a un PEG ramificado de 40 kDa y mucho menos brindar un beneficio necesario de 4x .

Estos ejemplos son ilustrativos de varios de los enfoques que se están ensayando y el rendimiento total que alcanzan. En síntesis, estos enfoques y tecnologías no lo logran. Para los andamios que no son anticuerpos, convergen y golpean la pared en las semividas de eliminación de aproximadamente 60 a 80 horas en monos. Aunque la línea varía, generalmente se desea alcanzar una semivida final promedio de por lo menos 100 horas en monos para permitir la dosificación de 1 vez por semana en humanos. Y cuando la frecuencia de la dosis es más prolongada que la semivida, esto crea demandas adicionales en la solubilidad, estabilidad y viscosidad de la formulación. Para otros tipos de proteínas, tales como el Factor VIII, el valor absoluto de la semivida de partida y por lo tanto el valor deseado requerido es más bajo, pero el rendimiento múltiple necesario para alcanzar un perfil de producto blanco atractivo es similar y del orden de 3x a 4x. La pregunta es, entonces, ¿cómo obtenerlo aquí? En primer lugar, algunos otros antecedentes. Los esfuerzos para formular agentes biológicamente activos para el suministro deben tratar con una variedad de variables que incluyen la vía de administración, la estabilidad biológica del agente activo y la solubilidad de los agentes activos en medios fisiológicamente compatibles. Las elecciones hechas en la formulación de agentes biológicamente activos y las vías de administración seleccionadas pueden afectar la biodisponibilidad de los agentes activos. Por ejemplo, la elección de la administración parenteral en la circulación sintética para proteínas y polipéptidos biológicamente activos evita el medio proteolítico hallado en el tracto gastrointestinal. Sin embargo, aún cuando la administración directa, tal como mediante inyección, de agentes biológicamente activos es posible, la formulación puede ser insatisfactoria por una variedad de motivos que incluyen la generación de una respuesta inmune al agente administrado y respuestas a todos los excipientes que incluyen ardor y escozor. Aún cuando el agente activo no sea inmunogénico y se puedan emplear excipientes satisfactorios, los agentes biológicamente activos pueden tener una solubilidad limitada y una semivida biológica breve que puede necesitar la administración repetida o la infusión continua, lo cual puede ser doloroso y/o poco conveniente .

Para algunos agentes biológicamente activos, se ha alcanzado un nivel de éxito en desarrollar formulaciones adecuadas de agentes funcionales conjugando los agentes a polímeros solubles. La conjugación ' de agentes biológicamente activos a polímeros solubles en agua generalmente se observa como que proporciona una variedad de beneficios para el suministro de agentes biológicamente activos y específicamente, proteínas y péptidos. Entre los polímeros solubles en agua empleados, el polietilenglicol (PEG) se ha conjugado más ampliamente a una variedad de agentes biológicamente activos que incluyen péptidos biológicamente activos. La reducción en la inmunogenicidad o antigenicidad, semivida aumentada, solubilidad aumentada, aclaramiento reducido por el riñon y degradación enzimática reducida se han atribuido al conjugado de una variedad de polímeros solubles en agua y agentes funcionales, que incluyen conjugados de PEG. Como resultado de estos atributos, el conjugado de polímeros de agentes biológicamente activos necesita una dosificación menos frecuente y puede permitir el uso de menos de una menor cantidad del agente activo para lograr un punto final terapéutico. Una dosificación menos frecuente reduce el número total de inyecciones, lo cual puede ser doloroso y que necesita visitas poco convenientes a profesionales de la salud.

Si bien se ha alcanzado algún éxito con la conjugación de PEG, la "PEGilacion" de agentes biológicamente activos sigue siendo un desafío. Cuando los desarrolladores de fármacos avanzan más allá de proteínas agonistas muy potentes tales como eritromicina y los diferentes interferones , los beneficios del polímero hidrófilo PEG son insuficientes para impulsar (in vitro el aumento en la solubilidad, estabilidad y la reducción de la viscosidad y (ii) in vivo los aumentos en la biodisponibilidad, la semivida en suero y/o tejido y las reducciones en la inmunogenicidad que son necesarias para un producto comercialmente exitoso.

Se han introducido formas ramificadas de PEG para su uso en una preparación conjugada para aliviar algunas de las dificultades y limitaciones enfrentadas con el uso de cadenas poliméricas de PEG rectas prolongadas. La experiencia hasta la fecha demuestra que las formas ramificadas del PEG suministran un "cambio de curva" en el beneficio de rendimiento contra cadenas poliméricas de PEG rectas lineales del mismo peso molecular total. Si bien los polímeros ramificados pueden resolver algunas de las limitaciones asociadas a conjugados formados con polímeros de PEG lineales largas, ni conjugados poliméricos de PEG ramificados ni lineales resuelven suficientemente los problemas asociados al uso de agentes funcionales conjugados, en particular, agentes inhibidores. La PEGilación sí representa, sin embargo, el estado del arte en la conjugación de polímeros hidrófilos a agentes blancos. Los productos compuestos PEGilados, entre ellos peginterferón alfa-2a (PEGASYS) , pegfilgrastim (Neulasta) , pegaptanib (Macugen) y certolizumab pegol (Cimzia) , tuvieron más de $6 billones en las ventas anuales en 2009. El PEG con una funcionalidad (adecuado para la conjugación) se fabrica a través de un proceso laborioso que consiste en la polimerización de polímeros lineales cortos que luego toman varias funcionalidades y luego se unen como dos reacciones de conjugación a un residuo de lisina que se hace un reactivo de PEG de dos brazos. Debido al número de pasos sintéticos y a la necesidad de alta calidad, se necesitan varios pasos de cromatografía. Los polímeros de PEG lineales de baja polidispersidad (<1,2) tienen una restricción del tamaño de aproximadamente 20kDa, 30kDa o 40kDa donde 20kDa es el límite económicamente viable. Cuando se forma un reactivo ramificado, entonces, el tamaño del reactivo final es de 40 kDa (2 x 20 kDa), 60 kDa (2 x 30 kDa), 80 kDa (2 x 40 kDa). Cuanto mayor sea el tamaño, más costoso de fabricar será con baja polidispersidad . Además, cuanto mayor sea el tamaño, menos óptima será la solubilidad, estabilidad y viscosidad del polímero y el conjugado de polímero y fármaco asociado.

En resumen, los polímeros de PEG funcionan bien con moléculas agonistas de baja potencia, de baja dosis tales como eritropoyetina e interferón. Sin embargo, a pesar de su éxito comercial, los productos PEGilados tienen estabilidad y solubilidad insuficientes, el reactivo de PEG es costoso refabricar y más fundamentalmente, los productos PEGilados han limitado aún más al alza en términos de mejorar el rendimiento in vivo e in vitro.

En vista de las ventajas reconocidas de conjugar agentes funcionales a polímeros solubles en agua y de las limitaciones de los polímeros solubles en agua tales como PEG en la formación de conjugados adecuados para fines terapéuticos, son deseables polímeros solubles en agua adicionales para formar conjugados con agentes funcionales. Los polímeros solubles en agua, particularmente aquellos que tienen muchas de las ventajas de PEG para su uso en la formación de conjugados y que no sufren las desventajas observadas con el PEG como un agente de conjugación serían deseables para su uso en la formación de agentes terapéuticos y de diagnóstico.

La PEGilación no obstante sí señala el camino hacia una solución para el problema de la biocompatibilidad . El PEG funciona debido a las características hidrófilas del polímero que protegen al agente biológico conjugado contra los numerosos mecanismos de aclaramiento in vivo no específico en el cuerpo. Generalmente se reconoce la importancia del agua, pero la percepción especial de esta tecnología es cavar más profundo para apreciar que lo que es crítico para la mejora del rendimiento es la manera en la que se une el agua y la estructura del agua asociada. El PEG funciona debido a su carácter hidrófilo, pero el agua no se une estrechamente al polímero y por lo tanto al agente conjugado. Las moléculas de agua están en intercambio libre entre el compuesto PEGilado y el agua global circundante, lo cual permite que los sistemas de aclaramiento reconozcan la proteína. La respuesta es encontrar una manera de "adherir" el agua tan estrechamente al polímero y por lo tanto al grupo conjugado como para enmascarar estrechamente la totalidad compleja a partir de interacciones no específicas. Para lograrlo, es necesario que el polímero mantenga las cargas positiva y negativa, que por lo tanto sea un zwiterión esencial neutro neto. Ciertos polímeros zwiteriónicos contienen y no liberan moléculas de agua unidas a sus estructuras.

Para progresar más, entonces, es necesario darle una mirada más cercana a: (1) otros ejemplos de grupos hidrófilos que unen el agua en una mayor medida y con propiedades más favorables y en consecuencia con una biocompatibilidad fundamental mejorada in vivo e in vitro y (ii) ejemplos de polímeros de forma extendida, de mucho mayor tamaño (tamaño y arquitectura) , que es el impulsor fundamental relacionado del rendimiento in vivo e in vitro.

Lo importante para estos polímeros es la magnitud en la cual se unen a las moléculas de agua y las propiedades físicas de esas interacciones de unión al agua. Esta combinación de propiedades impulsa la biocompatibilidad fundamental del polímero y la magnitud en la cual dicho polímero puede impartir biocompatibilidad a un agente funcional al cual s conjuga. La tecnología ideal usaría una grupo de unión al agua que se une muy estrechamente si no en forma irreversible a una cantidad importante de agua, daría un formato a estos grupos de unión al agua en una cadena principal de polímero con una longitud y flexibilidad suficientes para proteger a una gama de fármacos y formatos deseados, puede tener una arquitectura de forma extendida (es decir, de varias ramas) , tendría una funcionalidad para la conjugación de alta eficiencia al grupo fármaco, se fabricaría en forma poco costosa con un número mínimo de pasos de producción y demostraría una muy alta calidad si se lo juzga analíticamente y un muy alto rendimiento juzgado en sistemas in vivo funcionales (semivida terminal, inmunogenicidad, bioactividad) e in vitro (solubilidad, estabilidad, viscosidad, bioactividad) . Una tecnología que permite el máximo de estos elementos llevaría el campo a niveles nuevos de rendimiento in vivo e in vitro.

Una de tales tecnologías usa como el grupo de unión al agua la 2-metacriloiloxietil fosforilcolina derivada de fosforilcolina (HEMA-PC) o un zwiterión relacionado, sobre un polímero de un tamaño total mayor que el peso molecular pico de 50 kDa (Mp) medido mediante difusión de luz de varios ángulos, con la posibilidad de arquitecturas altamente ramificadas o pseudo arquitecturas, con una funcionalidad para la conjugación específica del sitio a un compuesto biofarmacéutico (s) de interés, fabricado con técnicas que permiten un compuesto terapéutico bien caracterizado con alta calidad y baja polidispersidad y cuando se conjuga a un compuesto biofarmacéutico imparte un aumento dramático en la semivida terminal promedio contra un compuesto biofarmacéutico equivalente modificado con otra tecnología de prolongación de la semivida (por ejemplo, conjugado con un polímero de PEG) y que imparte parámetros de solubilidad, estabilidad, viscosidad y capacidad de caracterización al conjugado que son un múltiplo de aquellos observados en otras tecnologías.

El tamaño del polímero es de importancia crítica. Cuando se usa con fines terapéuticos en el contexto de conjugados de polímero y fármaco solubles, el arte previo enseña que hay una compensación bien definida y descrita entre el tamaño del polímero y su calidad. El índice de polidispersidad (un proxy fundamental para la calidad) es particularmente importante ya que habla de la heterogeneidad del polímero estadístico subyacente que cuando se conjuga a un compuesto farmacéutico de interés imparte dicha heterogeneidad al propio fármaco que complica mucho la síntesis confiable de la proteína terapéutica necesaria para la eficacia consistente y que es indeseable desde un punto de vista de la fabricación, regulatorio, clínico y del paciente.

La presente invención describe polímeros de gran tamaño con muy alta calidad y un índice de polidispersidad muy bajo que tienen una funcionalidad para la conjugación química por ejemplo a un fármaco soluble. Fundamentalmente, los polímeros no son inertes, ni están destinados a la unión a una superficie o gelificados como hidrogel . Esto es completamente nuevo, sorprendente, muy útil y no se ha descrito previamente. Con su propósito terapéutico, una sustancia farmacéutica bien definida es esencial. Esto se manifiesta al nivel del polímero, la composición farmacéutica y el conjugado. Notablemente, existe un volumen de trabajo sobre los polímeros que se han fabricado usando una variedad de enfoques y componentes con polímeros sin una funcionalidad. Ese volumen de trabajo no es directamente relevante aquí donde un paso necesario es una conjugación específica .

El estado del arte actual relacionado con los polímeros con una funcionalidad construidos a partir de monómeros hidrófilos mediante la pseudo polimerización o polimerización controlada de radicales, que solamente se han descrito polímeros de bajo peso molecular (normalmente <50 kDa) . Además, a medida que se acerca a este peso molecular, se pierde el control del peso molecular, demostrado por el índice de polidispersidad .

Por ejemplo, Ishihara et al (2004, Biomateriales 25, 71-76) utilizó la polimerización controlada de radicales para construir polímeros lineales de 2-metacriloiloxietil fosforilcolina (HE A-PC) hasta un peso molecular de 37 kDa. El PDI fue 1,35, que es demasiado alto para ser relevante desde el punto de vista farmacéutico. Además, estos autores claramente expresaron: "En este método, es difícil controlar la distribución del peso molecular y aumentar el peso molecular" . Lewis et al (Patente Estadounidense 2004/0063881) también describen la homopolimerización de esta manera usando la polimerización controlada de radicales y pesos moleculares informados de hasta 11 kDa con un PDI de 1,45. En una publicación posterior, Lewis et al (2008, Bioconjugate Chem. 19, 2144-2155) nuevamente sintetizaron homopolímeros con una funcionalidad de HEMA-PC esta vez a pesos moleculares de hasta 37 kDa. El PDI fue 2,01. Expresaron que lograron un buen control solamente a pesos moleculares muy limitados (insuficientes) , con una polidispersidad que aumentaba dramáticamente. Informan una pérdida de control a una gama de pesos moleculares muy elevada (37 kDa) que ellos atribuyen a la conversión rápida a concentraciones de monómeros más altas que lleva a la conclusión de que no es posible crear polímeros de alto peso molecular de este tipo con un control estricto de la polidispersidad.

Por ejemplo, Haddleton et al (2004, JACS 126, 13220-13221) utilizaron la polimerización controlada de radicales para construir polímeros lineales de poli (metoxiPEG) metiacrilatos para su uso en la conjugación con proteínas y en una gama de tamaños de 11.000 a 34.000 Dalton. En un intento de construir los polímeros de mayor tamaño, los autores aumentaron la temperatura de la reacción y buscaron catalizadores que pudieran impulsar una polimerización más rápida. En una publicación posterior, Haddleton et al (2005, JACS 127, 2966-2973) sintetizaron nuevamente homopolímeros de poli (metoxiPEG) metacrilatos a través de la polimerización controlada de radicales para la conjugación de proteínas en la gama de tamaño de 4,1 a 35,4 kDa con PDIs en la gama superior a 1,25 aún en la misma distribución de peso molecular pequeña e insuficiente. En una publicación posterior, Haddleton et al (2007, JACS 129, 15156-15163) nuevamente sintetizaron polímeros con una funcionalidad a través de la polimerización controlada de radicales para la conjugación de proteínas en la gama de tamaño pequeño de 8 a 30 kDA con una gama de PDI de 1,20 - 1,28. La mentalidad y el enfoque de Haddleton et al están lejos de enseñar los métodos que se necesita usar para fabricar polímeros de baja polidispersidad, alto peso molecular importantes para esta invención. Además, el foco sobre los polímeros de bajo peso molecular para la conjugación de proteínas refleja una falta de comprensión en cuanto al tamaño, la arquitectura y la calidad de los polímeros que son necesarios para llevar el campo biofarmaceutico al nivel siguiente.

La presente invención describe polímeros que contienen un zwiterión de alto peso molecular (un peso molecular pico de >50 kDa medido usando la difusión de luz de varios ángulos) con PDI concomitantemente bajos. Esto es sorprendente a la luz del resumen precedente del estado del arte actual.

Breve Extracto de la invención En algunas realizaciones, la presente invención proporciona un polímero que tiene por lo menos dos ramas poliméricas que cada una tiene una pluralidad de monómeros cada uno de los cuales se selecciona independientemente de acrilato, metacrilato, acrilamida, metacrilamida, estireno, vinil-piridina, vinil-pirrolidona o éster de vinilo, en donde cada monómero incluye un grupo hidrófilo. El polímero también incluye un fragmento iniciador unido a un extremo próximo de la rama polimérica, en donde el grupo iniciador es adecuado para la polimerización de radicales. El polímero también incluye un grupo de extremo unido a un extremo distal de la rama polimérica. Por lo menos uno del fragmento iniciador y el grupo de extremo del polímero incluye un agente funcional o un grupo de unión.

En otras realizaciones, la presente invención proporciona un conjugado que incluye por lo menos un polímero que tiene por lo menos dos ramas poliméricas que tienen una pluralidad de monómeros cada uno de los cuales se selecciona independientemente del grupo formado por, metacrilato, acrilamida, metacrilamida, estireno, vinil-piridina, vinil -pirrolidona o éster de vinilo, en donde cada monómero incluye un grupo hidrófilo, un fragmento iniciador unido a un extremo próximo de la rama polimérica, en donde el grupo iniciador es adecuado para la polimerización de radicales, y un grupo de extremo unido a un extremo distal de la rama polimérica. Los conjugados de la presente invención también incluyen por lo menos un agente funcional que tiene un agente bioactivo o un agente de diagnóstico, unido al fragmento iniciador o al grupo de extremo.

En algunas otras realizaciones, la presente invención proporciona un polímero de la fórmula: en donde R1 puede ser H, L3-A1, LG1 o L3-LG1. Cada M1 y M2 se puede seleccionar independientemente de acrilato, metacrilato, acrilamida, metacrilamida, estireno, vinil-piridina, vinil-pirrolidona o éster de vinilo. Cada uno de G1 y G2 es independientemente un grupo hidrófilo. Cada grupo I es un fragmento de iniciador e l' un depurador de radicales de manera tal que la combinación de I-I' sea un iniciador, I1, para la polimerización del polímero a través de la polimerización de radicales. Alternativamente, cada I' se puede seleccionar independientemente de H, halógeno o alquilo de Ci-S. Cada L1, L2 y puede ser un ligador. Cada A1 puede ser un grupo funcional Cada LG1 puede ser un grupo ligador. Los subíndices x e y1 pueden ser independientemente cada uno un número entero de 1 a 1000. Cada subíndice z puede ser un número entero de 1 a 10. El subíndice s puede ser un número entero de 1 a 100.

Breve Descripción de los Dibujos La Figura 1 muestra un esquema para la preparación de los copolímeros aleatorios de la presente invención. El iniciador I-I' se descompone en el fragmento de iniciador I y el depurador de radicales I'. El fragmento de iniciador I luego reacciona con los comonómeros M1 y M2 para iniciar el proceso de polimerización y generar la especie A. el depurador de radicales I' puede entonces reaccionar con monómeros adicionales para continuar la propagación del polímero (especie C) . En forma concomitante, la cadena polimérica creciente de la especie C reacciona en forma reversible con el depurador de radicales I' para formar el copolímero aleatorio, especie D.

La Figura 2 muestra conjugados de la presente invención.

La Figura 3 muestra conjugados de la presente invención.

Descripción Detallada de la invención La presente invención proporciona polímeros de alto peso molecular que tienen grupos hidrófilos o zwiteriones, tales como fosforilcolina, y por lo menos un agente funcional (definido en la presente) . La fosforilcolina como una molécula altamente compatible impulsa la biocompatibilidad fundamental. También tiene funciones de tipo de chaperón, en términos de proteger a las proteínas bajo la temperatura u otro estrés. También puede permitir otras funciones tales como la captación celular reversible. El agente funcional puede ser un agente bioactivo tal como un fármaco, una proteína terapéutica o un agente dirigido a un blanco, así como un agente de detección, un agente de formación de imágenes, un agente marcador o un agente de diagnóstico. Los polímeros de alto peso molecular son útiles para el tratamiento de una variedad de condiciones y estados de enfermedad seleccionando uno o más agentes funcionales apropiados. Más de un agente bioactivo se puede unir al polímero de alto peso molecular, permitiendo por lo tanto el tratamiento de no solamente un solo síntoma o mecanismo de enfermedad, sino antes bien la enfermedad completa. Además, los polímeros de alto peso molecular son útiles con fines de diagnóstico y de formación de imágenes mediante la unión de agentes dirigidos a un blanco y agentes de formación de imágenes adecuados. Los polímeros de alto peso molecular pueden incluir tanto agentes terapéuticos como agentes de diagnóstico en un solo polímero, proporcionar agentes teranósticos que tratan la enfermedad y también detectan y diagnostican. Los polímeros se pueden unir al agente (s) bioactivo a través de uniones estables o inestables.

Los polímeros se pueden preparar a través de una polimerización de radicales libres convencional o polimerización controlada / de radicales vivos, tal como una polimerización de radicales de transferencia de átomos (ATRP) , usando monómeros que contienen zwiteriones, tales como fosforilcolina . Los iniciadores usados para la preparación de los polímeros de alto peso molecular pueden tener varios sitios de inicio de manera tal que se puedan preparar polímeros de varias ramas. El iniciador también puede contener el agente bioactivo, grupos de unión que pueden unirse al agente bioactivo.

La invención también describe nuevas maneras de alcanzar las arquitecturas de polímeros sobre una superficie bioactiva. El concepto es aquel de "puntos de ramificación" o "puntos de unión próxima" sobre la molécula blanco tal como para recrear un polímero de >2 ramas eficaz con >1 polímero de rama unido a un sitio (s) localizado sobre una molécula blanco. En el arte previo, la PEGilación indiscriminada de una proteína con un reactivo no específico del sitio (por ejemplo, un reactivo de PEG con funcionalidad de NHS) derivaría en varios polímeros de PEG conjugados a varios grupos amina esparcidos por toda la proteína. Aquí, lo que se describe es preferentemente un enfoque de un paso en el cual el agente blanco se modifica para ubicar sitios de conjugación (por ejemplo, aminoácidos de cisteína) de manera tal una vez que se forme la estructura terciaria de la proteína o el péptido o el agente, los dos sitios estén en proximidad uno de otro. Luego, este agente blanco modificado se usa en una reacción de conjugación con un polímero que contiene la química de conjugación correspondiente (por ejemplo, un reactivo de tiol) . El resultado es un agente blanco único que se conjuga con dos polímeros en proximidad estrecha uno a otro, creando de ese modo un punto de ramificación o "pseudo" rama. En otra realización, el agente blanco contendría un solo sitio único, por ejemplo, una cisteína libre, y se emplearía un agente de unión tri (hetero) funcional para unir >2 polímeros lineales a este sitio único, creando nuevamente una "pseudo" rama.

La invención también describe maneras nuevas de lograr una muy alta eficacia y conjugación específica del sitio para péptidos y proteínas a modo de inteinas.

II. Definiciones "Polímero" se refiere a una serie de grupos monoméricos unidos juntos. Los polímeros de alto peso molecular se preparan a partir de monómeros que incluyen, en forma no taxativa, acrilatos, metacrilatos, acrilamidas, metacrilamidas, estírenos, vinil-piridina, vinil -pirrolidona y ésteres de vinilo tales como acetato de vinilo. Otros monómeros son útiles en los polímeros de alto peso molecular de la presente invención. Cuando se usan dos monómeros diferentes, los dos monómeros se denominan "comonómeros" , lo que significa que los monómeros diferentes están copolimerizaos para formar un solo polímero. El polímero puede ser lineal o ramificado. Cuando el polímero es ramificado, cada cadena polimérica se denomina "rama polimérica" . El extremo de la rama polimérica unido al grupo iniciador es el extremo próximo y el extremo de cadena creciente de la rama polimérica es el extremo distal. En el extremo de cadena creciente de la rama polimérica, el grupo de extremo de la rama polimérica puede ser el depurador de radicales, u otro grupo.

"Grupo hidrófilo" se refiere a un compuesto o polímero que atrae agua y es típicamente soluble en agua. Ejemplos de grupos hidrófilos incluyen polímeros hidrófilos y grupos zwiteriónicos . Otros grupos hidrófilos incluyen, en forma no taxativa, hidroxi, amina, ácido carboxílico, amida, sulfonato y fosfonato. Los grupos hidrófilos incluyen, en forma no taxativa, óxido de polietileno, polioxazolina, celulosa, almidón y otros polisacáridos . El grupo zwiteriónico se refiere a un compuesto que tiene un cambio positivo así como negativo. Los grupos zwiteriónicos útiles en los polímeros de alto peso molecular pueden incluir un nitrógeno cuaternario y un fosfato de carga negativa, tal como fosforilcolina : RO-P (=0) (O") -0-CH2CH2-N+ (Me) 3. Otros grupos zwiteriónicos son útiles en los polímeros de alto peso molecular de la presente invención y las Patentes WO 1994/016748 y WO 1994/016749 se incorporan en la presente como referencia.

"Iniciador" se refiere a un compuesto capaz de iniciar una polimerización usando los comonómeros de la presente invención. La polimerización puede ser una polimerización de radicales libres convencional o una polimerización de radicales vivos/controlada, tal como la Polimerización de Radicales de Transferencia de Átomos (ATRP) , polimerización por Agregado-Fragmentación-Finalización Reversible (RAFT) o polimerización mediada por nitróxido (NMP) . La polimerización puede ser una polimerización "pseudo" controlada, tal como la transferencia degenerativa. Cuando el iniciador es adecuado para la ATRP, contiene un enlace lábil que puede descomponerse homolíticamente para formar un fragmento de iniciador, I, que es un radical capaz de iniciar una polimerización de radicales y un depurador de radicales, I', que reacciona con el radical de la cadena polimérica creciente para finalizar en forma reversible la polimerización. El depurador de radicales I' normalmente es un halógeno, pero también puede ser un grupo orgánico, tal como un nitrilo .

"Ligador" se refiere a un grupo químico que une dos grupos juntos. El ligador puede ser descomponible o no descomponible. Los ligadores descomponibles pueden ser hidrolizables , descomponibles enzimáticamente, sensibles al pH, fotolábiles, o ligadores de disulfuro, entre otros. Otros ligadores incluyen ligadores homobifuncionales y heterobifuncionales . Un "grupo de unión" es un grupo funcional capaz de formar una ligadura covalente que consiste en uno o más enlaces a un agente bioactivo. Ejemplos no taxativos incluyen aquellos ilustrados en la Tabla 1.

"Ligador hidrolizable" se refiere a una ligadura o enlace químico, tal como un enlace covalente, que experimenta la hidrólisis en condiciones fisiológicas. La tendencia de un enlace a hidrolizarse puede depender no solamente del tipo general de ligadura que conecta dos átomos centrales entre los cuales se corta el enlace, sino también sobre los sustituyentes unidos a estos átomos centrales. Ejemplos no taxativos de ligaduras susceptibles hidrolíticamente incluyen ésteres de ácidos carboxílicos, ésteres de fosfato, acétales, cetales, éter de acriloxialquilo, iminas, ortoésteres y algunas ligaduras de amida .

"Ligador descomponible enzimáticamente" se refiere a una ligadura que está sujeta a la degradación por una o más enzimas. Algunas ligaduras susceptibles hidrolíticamente también pueden ser degradables enzimáticamente. Por ejemplo, las esterasas pueden actuar sobre ésteres de ácido carboxílico o ésteres de fosfato y las proteasas pueden actuar sobre enlaces de péptido y algunas ligaduras de amida.

"Ligador sensible al pH" se refiere a una ligadura que es estable a un pH y experimenta la degradación a otro pH. Por ejemplo, el ligador sensible al pH puede ser estable en condiciones neutras o básicas, pero lábil en condiciones levemente ácidas.

"Ligador fotolábil" se refiere a una ligadura, tal como un enlace covalente, que se descompone al exponerlo a la luz. El ligador fotolábil incluye un grupo aromático para absorber la luz entrante, que luego dispara un reordenamiento de los enlaces para descomponer los dos grupos unidos por el ligador fotolábil.

"Ligador auto inmolado o de profármaco doble" se refiere a una ligadura en la cual la función principal del ligador es liberar un agente funcional solamente después de la activación de disparos selectivos (por ejemplo, una caída en el pH o la presencia de una enzima específica del tejido) seguida por la descomposición química espontánea para liberar el agente funcional .

"Agente funcional" se entiende que incluye un agente bioactivo o un agente de diagnóstico. Un "agente bioactivo" incluye cualquier agente, fármaco, compuesto, o una mezcla de ellos que se dirige a un lugar biológico específico (agente dirigido) y/o proporciona algún efecto fisiológico o farmacológico local o sistémico que se puede demostrar in vivo o in vitro. Ejemplos no taxativos incluyen fármacos, vacunas, anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, scFv, diacuerpos, avimers, vitaminas y cofactores, polisacáridos , carbohidratos, esteroides, lípidos, grasas, proteínas, péptidos, polipéptidos, nucleótidos, oligonucleótidos , polinucleótidos y ácidos nucleicos (por ejemplo, mARN, tARN, snARN, ARNi, ADN, cADN, constructos antisentido, ribozimas, etc) . Un "agente de diagnóstico" incluye todos los agentes que permiten la detección o la formación de imágenes de un tejido o enfermedad. Ejemplos de agentes de diagnóstico incluyen, en forma no taxativa, radiomarcadores , fluoróforos y colorantes.

"Proteína terapéutica" se refiere a péptidos o proteínas que incluyen una secuencia de aminoácidos que en su totalidad o en parte constituye un fármaco y se puede usar en aplicaciones farmacéuticas humanas o animales. Numerosas proteínas son conocidas para los practicantes expertos en el arte que incluyen, en forma no taxativa, aquellas que se revelan en la presente.

"Fosforilcolina" , también indicada "PC" se refiere a lo siguiente : en donde * indica el punto de unión. La fosforilcolina es un grupo zwiteriónico e incluye sales (tales como sales interiores) y formas protonadas y desprotonadas de ellas.

"Polímero que contiene fosforilcolina" es un polímero que contiene fosforilcolina. Está especialmente contemplado que en cada caso en que un polímero que contiene fosforilcolina se especifique en esta solicitud de patente para un uso particular, también se puede emplear una sola fosforilcolina en dicho uso. "Polímero que contiene un zwiterión" se refiere a un polímero que contiene un zwiterión.

"Polímero que contiene "Poli (acriloiloxietil fosforilcolina) se refiere a un polímero de ácido acrílico que contiene por lo menos un monómero de acriloiloxietil fosforilcolina tal como 2 -metacriloiloxietil fosforilcolina (es decir, fosfato de etilo de 2-metacriloil-2' -trimetilamonio) .

"Contacto" se refiere al proceso de poner en contacto por lo menos dos especies de ligadores de manera tal que puedan reaccionar. Se debe apreciar, sin embargo, que el producto de la reacción resultante se puede producir directamente a partir de la reacción entre los reactivos agregados o a partir de un compuesto intermedio a partir de uno o más reactivos que se pueden producir en la mezcla de la reacción.

"Polímero soluble en agua" se refiere a un polímero que es soluble en agua. Una solución de un polímero soluble en agua puede transmitir por lo menos un 75%, más preferentemente por lo menos un 95% de luz, transmitida por la misma solución después del filtrado. Sobre la base del peso, un polímero soluble en agua o un segmento de él puede ser por lo menos el 35%, por lo menos el 50%, el 70%, el 85%, el 95% o el 100% (en peso del polímero seco) soluble en agua.

"Peso molecular" en el contexto del polímero se puede expresar como un peso molecular promedio en número, o un peso molecular promedio en peso o un peso molecular pico. A menos que se indique de otro modo, todas las referencias al peso molecular en la presente se refieren al peso molecular pico. Estas determinaciones del peso molecular, el promedio de número, promedio en peso y pico, se pueden medir usando la cromatografía de penetración de gel u otras técnicas de cromatografía de líquidos. También se pueden usar otros métodos para medir valores del peso molecular, tales como el uso del análisis de grupo de extremo o la medición de las propiedades coligativas (por ejemplo, la depresión del punto de congelamiento, la elevación del punto de ebullición, o la presión osmótica) para determinar el peso molecular promedio en número o el uso de técnicas de difusión de luz, ultracentrifugación o viscometría para determinar el peso molecular promedio en peso. Los reactivos poliméricos de la invención normalmente están polidispersos (es decir, el peso molecular promedio en número y el peso molecular promedio en peso de los polímeros no son iguales) , poseen valores de polidispersidad bajos preferentemente inferiores a 1,5, a juzgar por la cromatografía de penetración de gel. En otras realizaciones, las polidispersidades pueden estar en cualquier gama de 1,4 a 1,2, más preferentemente inferiores a 1,15, aún más preferentemente inferiores a 1,10, aún más preferentemente inferiores a 1,05, y más preferentemente inferiores a 1,03.

La frase "un" o "una" como se usa en la presente se refiere a una o más de esa entidad, por ejemplo, un compuesto se refiere a uno o más compuestos o por lo menos un compuesto. Como tales, los términos "un" (o "una") "uno o más" y "por lo menos uno" se usan en forma intercambiable en la presente.

"Aproximadamente" como se usa en la presente significa la variación que se podría ver en medidas tomadas entre diferentes instrumentos, muestras y preparaciones de muestras.

"Protegido", "protegido de", "grupo de protección" y "grupo protector" se refieren a la presencia de un grupo (es decir, el grupo de protección) que impide o bloquea la reacción de un grupo funcional químicamente reactivo particular en una molécula en ciertas condiciones de reacción. El grupo protector varía según el tipo de grupo químicamente reactivo que se esté protegiendo así como las condiciones reactivas que se empleen y la presencia de grupos reactivos o protectores adicionales en la molécula, si correspondiera. El experto en el arte reconocerá los grupos protectores conocidos en el arte, tales como aquellos hallados en el tratado de Greene et al., "Grupos Protectores en Síntesis Orgánicas," 3a Edición, John iley and Sons, Inc., New York, "Separador" o "grupo separador" se usan en forma intercambiable en la presente para referirse a un átomo o un grupo de átomos opcionalmente usados para unir grupos de interconexión tales como el extremo de un polímero soluble en agua y un grupo reactivo de un agente funcional y un grupo reactivo. Un separador puede ser hidrolíticamente estable o puede incluir una ligadura hidrolíticamente susceptible o enzimáticamente degradable.

"Alquilo" se refiere a un radical recto o ramificado, saturado, alifático que tiene el número de átomos de carbono indicado. Por ejemplo, alquilo de Ci-C6 incluye, en forma no taxativa, metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, isobutilo, sec-butilo, tere-butilo, pentilo, isopentilo, hexilo, etc. Otros grupos alquilo incluyen, en forma no taxativa, heptilo, octilo, nonilo, decilo, etc. El alquilo puede incluir cualquier número de átomos de carbono, tal como 1-2, 1-3, 1-4, 1-5, 1-6, 1-7, 1-8, 1-9, 1-10, 2-3, 2-4, 2-5, 2-6, 3-4, 3-5, 3-6, 4-5, 4-6 y 5-6. El grupo alquilo es típicamente monovalente, pero puede ser divalente, tal como cuando el grupo alquilo une dos grupos juntos.

El término "inferior" referido arriba y en adelante en relación con los radicales o compuestos orgánicos respectivamente define un compuesto o radical que puede ser ramificado o no ramificado con hasta 7 e incluyendo 7, preferentemente hasta 4 e incluyendo 4 y (como no ramificado) uno o dos átomos de carbono.

"Alquileno" se refiere a un grupo alquilo, definido anteriormente, que une por lo menos otros dos grupos, es decir, un radical de hidrocarburo divalente. Los dos grupos unidos al alquileno se pueden unir al mismo átomo o a diferentes átomos del alquileno. Por ejemplo, un alquileno de cadena recta puede ser el radical bivalente de -(CH2)n/ donde n es l, 2, 3, 4, 5 o 6. Los grupos alquileno incluyen, en forma no taxativa, metileno, etileno, propileno, isopropileno, butileno, isobutileno, sec-butileno, pentileno y hexileno.

Los sustituyentes para los radicales de alquilo heteroalquilo (que incluyen aquellos grupos generalmente denominados alquileno, alquenilo, heteroalquileno, hteroalquenilo, alquinilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, cicloalquenilo y hterocicloalquenilo) pueden ser una variedad de grupos seleccionados de -0R' , =0, =NR' , =N-0R' , -NR'R", -SR' , -halogen, -SiR'R"R"', -0C(0)R', -C(0)R', -C02R' , -CONR'R", -0C(0)NR'R", -NR"C(0)R', -NR' -C (O) R"R" ' , -NR"C(0)2R', - H-C (NH2) =NH, -NR'C(NH2) =NH, -NH-C (NH2) =NR' , -S(0)R', -S(0)2R', -S(0)2NR'R", -CN y -N02 en un número en la gama de cero a (2m'+l), donde m' es el número total de átomos de carbono de dicho radical. R' , R" y R" ' cada uno independientemente se refiere a hidrógeno alquilo (de Ci-Ce) y heteroalquilo no sustituido, arilo no sustituido, arilo sustituido con 1-3 halógenos, alquilo no sustituido, grupos alcoxi o tioalcoxi, o grupos aril -alquilo (de C1-C4) . Cuando R' y R" se unen a los mismos átomos de nitrógeno, se pueden combinar con el átomo de nitrógeno para formar un anillo de 5, 6 o 7 miembros. Por ejemplo, -NR'R" incluye 1-pirrolidinilo y 4 -morfolinilo . A partir de la discusión anterior de los sustituyentes , un experto en el arte entenderá que el término "alquilo" incluye grupos tales como haloalquilo (e.g., -CF3 y -CH2CF3) y acilo (por ejemplo, -C(0)CH3, -C(0)CF3/ -C (0) CH2OCH3 y similares) . Preferentemente, los grupos alquilo y heteroalquilo sustituido tienen de 1 a 4 sustituyentes, más preferentemente 1, 2 o 3 sustituyentes. Son excepciones aquellos grupos perhalo alquilo (por ejemplo, pentafluoroetilo y similares) que también son preferidos y están contemplados por la presente invención.

Los sustituyentes para los radicales de alquilo y heteroalquilo (que incluyen aquellos grupos que suelen denominarse alquileno, alquenilo, heteroalquileno, heteroalquenilo, alquinilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, cicloalquenilo y heterocicloalquenilo) pueden ser uno o más de una variedad de grupos seleccionados de: -0R' , =0, =NR' , =N-0R' , -NR'R", -SR' , -halógeno, -SiR'R"R"', -0C(0)R', -C(0)R', -C02R' , -CONR'R", -OC(0)NR'R", -NR"C(0)R'( -NR' -C (0) NR"R" ' , -NR"C(0)2R' , -NR-C (NR' R"R' " ) =NR"" , -NR-C (NR' R" ) =NR' " , -S(0)R', -S (0) 2R' , -S(0)2NR'R", -NRS02R' , -CN y -N02 en un número en la gama desde cero hasta (2m'+l), donde m' es el número total de átomos de carbono de dicho radical. R' , R" , R" ' y R"" cada uno se refiere independientemente a hidrógeno, heteroalquilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, por ejemplo, arilo sustituido con 1-3 halógenos, alquilo sustituido o no sustituido, grupos alcoxi o tioalcoxi, o grupos arilalquilo. Cuando un compuesto de la invención incluye más de un grupo R, por ejemplo, cada uno de los grupos R se selecciona independientemente al igual que lo son los grupos R' , R" , R' " y R" " cuando más de uno de estos grupos está presente. Cuando R' y R" se unen al mismo átomo de nitrógeno, se pueden combinar con el átomo de nitrógeno para formar un anillo 5-, 6-, o 7 miembros. Por ejemplo, -NR'R" incluye, en forma no taxativa, 1 -pirrolidinilo y 4 -morfolinilo . A partir de la discusión precedente de sustituyentes, un experto en el arte entenderá que el término "alquilo" incluye grupos que incluyen átomos de carbono unidos a grupos diferentes de los grupos hidrógeno, tales como haloalquilo (por ejemplo, -CF3 y -CH2CF3) y acilo (por ejemplo, -C(0)CH3, -C(0)CF3, -C (0) CH2OCH3 y similares) .

"Alcoxi" se refiere a un grupo alquilo que tiene un átomo de oxígeno que se conecta al grupo alcoxi al punto de unión o se une a dos carbonos del grupo alcoxi. Los grupos alcoxi incluyen, por ejemplo, metoxi, etoxi, propoxi, iso-propoxi, butoxi, 2-butoxi, iso-butoxi, sec-butoxi, tere-butoxi, pentoxi, hexoxi , etc. Los grupos alcoxi se pueden sustituir además con una variedad de sustituyentes descritos en la presente. Por ejemplo, los grupos alcoxi se pueden sustituir con halógenos para formar un grupo "halo-alcoxi" .

"Carboxialquilo" significa un grupo alquilo (definido en la presente) sustituido con un grupo carboxi . El término "carboxicicloalquilo" significa un grupo cicloalquilo (definido en la presente) sustituido con un grupo carboxi. El término alcoxialquilo significa un grupo alquilo (definido en la presente) sustituido con un grupo alcoxi. El término "carboxi" empleado en la presente se refiere a ácidos carboxílicos y sus ásteres .

"Haloalquilo" se refiere a alquilo definido anteriormente donde algunos o la totalidad de los átomos de hidrógeno se sustituyen con átomos de halógeno. El halógeno (halo) preferentemente representa cloro o fluoro, pero también pueden ser bromo o yodo. Por ejemplo, haloalquilo incluye trifluorometilo, fluorometilo, 1 , 2 , 3 , 4 , 5-pentafluoro-fenilo, etc. El término "perfluoro" define un compuesto o radical que tiene todos los hidrógenos disponibles que se reemplazan con flúor. Por ejemplo, perfluorofenilo se refiere a 1 , 2 , 3 , 4 , 5-pentafluorofenilo, perfluorometilo se refiere a 1 , 1 , 1-trifluorometilo y perfluorometoxi se refiere a 1,1, 1-trifluorometoxi .

"Alquilo sustituido con fluoro" se refiere a un grupo alquilo donde un, algunos o la totalidad de los hidrógenos se han reemplazado por flúor.

"Citoquina" en el contexto de esta invención es un número de un grupo de proteínas que señala moléculas que pueden participar en la comunicación de célula a célula en respuestas inmunes e inflamatorias. Las citoquinas normalmente son glicoproteínas pequeñas, solubles en agua, que tienen una masa de 8-35 kDa .

"Cicloalquilo" se refiere a un grupo hidrocarburo cíclico que contiene de 3 a 12 , de 3 a 10 o de 3 a 7 átomos de carbono endocíclicos . Los grupos cicloalquilo incluyen estructuras de anillo fusionado, en puente y espiro.

"Endocíclico" se refiere a un átomo o grupo de átomos que comprenden parte de una estructura de anillo.

"Exocíclico" se refiere a un átomo o grupo de átomos que están unidos pero no definen la estructura de anillo cíclico. "Éter de cicloalquilo" se refiere a un grupo alquilo cíclico de 4 o 5 miembros que tiene 3 o 4 átomos de carbono endocíclicos y 1 oxígeno endocíclico o un átomo de azufre (por ejemplo, oxetano, tietano, tetrahidrofurano, tetrahidrotiofeno) ; o un grupo alquilo cíclico de 6 o 7 miembros que tiene 1 o 2 oxígeno endocíclico o átomos de azufre 1,3-dioxano, 1,4-dioxano, tetrahidrotiopirano, 1,3-ditiano, 1,4-ditiano, 1 , 4 -oxatiano) .

"Alquenilo" se refiere a un hidrocarburo de cadena recta o ramificado de 2 a 6 átomos de carbono, que tiene por lo menos un enlace doble. Ejemplos de grupos alquenilo incluyen, en forma no taxativa, vinilo, propenilo, isopropenilo, 1-butenilo, 2-butenilo, isobutenilo, butadienilo, 1-pentenilo, 2-pentenilo, isopentenilo, 1 , 3 -pentadienilo, 1 , 4 -pentadienilo, 1-hexenilo, 2-hexenilo, 3-hexenilo, 1 , 3 -hexadienilo, 1 , 4-hexadienilo, 1, 5-hexadienilo, 2 , 4 -hexadienilo o 1 , 3 , 5-hexatrienilo . Los grupos alquenilo también pueden tener de 2 a 3, 2 a 4, 2 a 5, 3 a 4, 3 a 5, 3 a 6, 4 a 5, 4 a 6 y 5 a 6 carbonos . El grupo alquenilo normalmente es monovalente, pero también puedes ser divalente, tal como cuando el grupo alquenilo une dos grupos juntos .

"Alquenileno" es refiere a un grupo alquenilo, definido anteriormente, que une por lo menos dos grupos, es decir un radical de hidrocarburo divalente. Los dos grupos unidos al alquenileno se pueden unir al mismo átomo o a átomos diferentes del alquenileno. Los grupos alquenileno incluyen, en forma no taxativa, etenileno, propenileno, isopropenileno, butenileno, isobutenileno, sec-butenileno, pentenileno y hexenileno.

"Alquinilo" se refiere a un hidrocarburo de cadena recta o ramificado de 2 a 6 átomos de carbono, que tienen por lo menos un enlace triple. Ejemplos de grupos alquinilo incluyen, en forma no taxativa, acetilenilo, propinilo, 1-butinilo, 2-butinilo, isobutinilo, sec-butinilo, butadiinilo, 1-pentinilo, 2-pentinilo, isopentinilo, 1, 3-pentadiinilo, 1 , 4 -pentadiinilo, 1-hexinilo, 2-hexinilo, 3-hexinilo, 1 , 3 -hexadiinilo, 1 , 4 -hexadiinilo , 1 , 5-hexadiinilo, 2 , 4 -hexadiinilo, o 1, 3 , 5-hexatriinilo. Los grupos alquinilo también pueden tener de 2 a 3, 2 a 4, 2 a 5, 3 a 4, 3 a 5, 3 a 6, 4 a 5, 4 a 6 y 5 a 6 carbonos. El grupo alquinilo normalmente es monovalente, pero puede ser divalente, tal como cuando el grupo alquinilo une dos grupos juntos.

"Alquinileno" se refiere a un grupo alquinilo, definido anteriormente, que une por lo menos otros dos grupos, es decir un radical de hidrocarburo divalente. Los dos grupos unidos al alquinileno se pueden unir al mismo átomo o a átomos diferentes del alquinileno. Los grupos alquinileno incluyen, en forma no taxativa, etinileno, propinileno, butinileno, sec-butinileno, pentinileno y hexinileno.

"Cicloalquilo" se refiere a un montaje de anillo saturado o parcialmente insaturado, monocíclico, bicíclico fusionado o policíclico de puente que contiene de 3 a 12 átomos de carbono, o el número de átomos indicados. Los anillos monocíclicos incluyen, por ejemplo, ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo y ciclooctilo. Los anillos bicíclicos o policíclicos incluyen, por ejemplo, norbornano, decahidronaftaleno y adamantano. Por ejemplo, ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo, ciclooctilo y norbornano.

"Cicloalquileno" se refiere a un grupo cicloalquilo, definido anteriormente, que une por lo menos otros dos grupos, es decir, un radical de hidrocarburo divalente. Los dos grupos unidos al cicloalquileno se pueden unir al mismo átomo o a diferentes átomos del cicloalqiuleno . Los grupos cicloalquileno incluyen, en forma no taxativa, ciclopropileno, ciclobutileno, ciclopentileno, ciclohexileno y ciclooctileno .

"Heterocicloalquilo" se refiere a un sistema de anillo que tiene desde 3 miembros del anillo hasta 20 miembros del anillo y desde 1 hasta 5 heteroátomos tales como N, 0 y S. Los heteroátomos adicionales también pueden ser útiles, que incluyen, en forma no taxativa, B, Al, Si y P. Los heteroátomos también pueden estar oxidados, tales como, en forma no taxativa, -S (0) - y -S(0)2-. Por ejemplo, heterociclo incluye, en forma no taxativa, tetrahidrofuranilo, tetrahidrotiofenilo , morfolino, pirrolidinilo, pirrolinilo, imidazolidinilo, imidazolinilo, pirazolidinilo, pirazolinilo, piperazinilo, piperidinilo, indolinilo, quinuclidinilo y 1 , 4 -dioxa-8-aza-espiro [4.5]dec-8-ilo.

"Heterocicloalquileno" se refiere a un grupo heterocicloalquilo, definido anteriormente, que une por lo menos otros dos grupos. Los dos grupos unidos al heterocicloalquilenose pueden unir al mismo átomo o a átomos diferentes del heterocicloalquileno.

"Arilo" se refiere a un montaje de anillo monocíclico o fusionado, tricíclico o mayor, aromático que contiene de 6 a 16 átomos de carbono del anillo. Por ejemplo, el arilo puede ser fenilo, bencilo o naftilo, preferentemente fenilo. "Arileno" significa un radical divalente derivado de un grupo arilo. Los grupos arilo pueden ser mono-, di-, o tri-sustituidos por uno, dos o tres radicales seleccionados de alquilo, alcoxi, arilo, hidroxi, halógeno, ciano, amino, amino-alquilo, trifluorometilo, alquilendioxi y oxi-alquileno de C2-C3, la totalidad de los cuales se sustituyen opcionalmente además, por ejemplo, como se definió anteriormente; o 1- o 2-naftilo; o 1- o 2 -fenantrenilo . Alquilendioxi es un sustituto divalente unido a átomos de carbono adyacentes de fenilo, por ejemplo, metilendioxi o etilendioxi. Oxi-alquileno de C2-C3 también es un sustituyente divalente unido a dos átomos de carbono adyacentes de fenilo, por ejemplo, oxietileno u oxipropileno . Un ejemplo para oxi-alquileno de C2-C3-fenilo es 2 , 3 -dihidrobenzofuran-5-ilo .

Se prefieren como naftilo, fenilo o fenil mono- o disustituido por alcoxi, halógeno, alquilo o trifluorometilo, especialmente fenilo o fenil-mono- o disustituido por alcoxi, halógeno o trifluorometilo y particularmente fenilo.

Ejemplos de grupos fenilo sustituidos como R son, por ejemplo 4-clorofen-l-ilo, 3 , 4-diclorofen-l-ilo, 4-metoxifen-l-ilo 4 -metilfen-l-ilo, 4 -aminometilfen-l-ilo 4 -metoxietilaminometilfen-l-ilo, 4 -hidroxietilaminometilfen-l-ilo, 4-hidroxietil- (metil) -aminometilfen-l-ilo, 3-aminometilfen-l-ilo 4 -N-acetilaminometilfen-l-ilo, 4 -aminofen-l-ilo 3-aminofen-l-ilo, 2-aminofen-l-ilo, 4-fenil-fen-l-ilo 4- (imidazol-l-il) -fenilo, 4- (imidazol-l-ilmetil) -fen-l-ilo 4- (morfolin-l-il) -fen-l-ilo, 4- (morfolin-l-ilmetil) -fen-l-ilo, 4- (2 -metoxietilaminometil ) -fen-l-ilo Y 4- (pirrolidin-l-ilmetil) -fen-l-ilo, 4- (tiofenil) -fen-l-ilo, 4- (3-tiofenil) -fen-l-ilo, 4- (4-metilpiperazin-l-il) -fen-l-ilo y 4- (piperidinil) -fenilo y 4- (piridinil) -fenilo opcionalmente sustituido en el anillo heterocíclico .

"Arileno" se refiere a un grupo arilo, definido anteriormente, que une por lo menos otros dos grupos . Los dos grupos unidos al arileno se unen a diferentes átomos del arileno. Los grupos arileno incluyen, en forma no taxativa, fenileno.

"Arileno-oxi" se refiere a un grupo arileno, definido anteriormente, donde uno de los grupos unidos al arileno está unido a través de un átomo de oxígeno. Los grupos arileno-oxi incluye, en forma no taxativa, fenileno-oxi .

En forma similar, los sustituyentes para los grupos arilo y heteroarilo se varían y se seleccionan de -halógeno, -0R' , -OC(0)R', -NR'R", -SR', -R' , -CN, -N02, -C02R' , -CONR'R", -C(0)R', -OC(0)NR'R", -NR"C(0)R', -NR"C(0)2R', , -NR' -C (0) NR"R" ' , -NH-C (NH2) =NH, -NR'C(NH2)=NH, -NH-C (NH2) =NR' , -S(0)R', -S (0) 2R' , -S(0)2NR'R", -N3, -CH(Ph)2, perfluoro alcoxi (de CÍ-C y perfluoroalquilo (de Ci-C4) , en un número que está en la gama de cero al número total de valencias abiertas sobre el sistema de anillo aromático; y donde R' , R" y R" ' se seleccionan independientemente de hidrógeno, alquilo (de Ci-C8) y heteroalquilo, arilo y heteroarilo no sustituidos, (arilo no sustituido) -alquilo (de C1-C4) y (arilo no sustituido) oxi-alquilo (de C1-C4) .

Dos de los sustituyentes sobre átomos adyacentes del anillo de arilo o heteroarilo se puede reemplazar opcionalmente con un sustituyente de la fórmula -T-C (O) - (CH2) q-U- , en donde T y U son independientemente -NH- , -0-, -CH2- o un enlace único y q es número entero de 0 a 2. Alternativamente, dos de los sustituyentes sobre los átomos adyacentes del anillo de arilo o heteroarilo opcionalmente se pueden reemplazar con un sustituyente de de la fórmula -A- (CH2) r-B- , en donde A y B son independientemente -CH2-, -0-, -NH-, -S-, -S(0)-, -S(0)2-, -S(0)2 R'- o un enlace simple y r es un número entero de 1 a 3. Uno de los enlaces simples del anillo nuevo así formado se puede reemplazar opcionalmente con un enlace doble. Alternativamente, dos de los sustituyentes sobre átomos adyacentes del anillo de arilo o heteroarilo pueden reemplazarse opcionalmente con un sustituyente de la fórmula - (CH2) S-X- (CH2) t- , donde s y t son independientemente números enteros de 0 a 3 y X es -0-, -NR'-, -S-, -S(0)-, -S(0)2-, o -S(0)2NR'-. El sustituyente R' en -NR' - y -S(0)2NR'- se selecciona de hidrógeno o alquilo (de Ci-C6) no sustituido .

"Heteroarilo" se refiere a un montaje de anillo aromático monocíclico o bicíclico fusionado o tricíclico que contiene de 5 a 16 átomos del anillo, donde de 1 a 4 de los átomos del anillo son heteroátomos cada uno N, 0 o S. Por ejemplo, el heteroarilo incluye piridilo, indolilo, indazolilo, quinoxalinilo, quinolinilo, isoquinolinilo, benzotienilo, benzofuranilo , furanilo, pirrolilo, tiazolilo, benzotiazolilo, oxazolilo, isoxazolilo, triazolilo, tetrazolilo, pirazolilo, imidazolilo, tienilo, o cualquier otro radical sustituido, especialmente mono-o disustituido, por ejemplo, por alquilo, nitro o halógeno. Piridilo representa 2-, 3- o 4 -piridilo, ventajosamente 2- o 3-piridilo. Tienilo representa 2- o 3-tienilo. Quinolinilo representa preferentemente 2-, 3- o 4-quinolinilo . Isoquinolinilo representa preferentemente 1-, 3- o 4 - isoquinolinilo . Benzopiranilo, benzotiopilo representa preferentemente 3 -benzopiranilo o 3-benzotiopiranilo, respectivamente. Tiazolilo representa preferentemente 2- o 4-tiazolilo y más preferentemente 4-tiazolilo. Triazolilo es preferentemente 1-, 2- o 5- (1 , 2 , 4-triazolilo) . Tetrazolilo es preferentemente 5-tetrazolilo .

Preferentemente, heteroarilo es piridilo, indolilo, quinolinilo, pirrolilo, tiazolilo, isoxazolilo, triazolilo, tetrazolilo, pirazolilo, imidazolilo, tienilo, furanilo, benzotiazolilo, benzofuranilo, isoquinolinilo, benzotienilo, oxazolilo, indazolilo, o cualquiera de los radicales sustituidos, especialmente mono- o di-sustituidos .

Como se usa en la presente, el término "heteroalquilo" se refiere a un grupo alquilo que tiene de 1 a 3 heteroátomos tales como N, O y S. Los heteroátomos adicionales también pueden ser útiles, que incluyen, en forma no taxativa, B, Al, Si y P. Los heteroátomos también se pueden oxidar, tales como, en forma no taxativa, -S (O) - y S(0)2-. Por ejemplo, el heteroalquilo puede incluir éteres, tioéteres, alquilaminas y alquil-tioles .

Como se usa en la presente, el término "heteroalqquileno" se refiere a un grupo heteroalquilo, definido anteriormente, que une por lo menos otros dos grupos. Los dos grupos unidos al heteroalquileno se pueden unir al mismo átomo o a átomos diferentes del heteroalquileno.

"Electrófilo" se refiere a un ion o átomo o un grupo de átomos, que pueden ser iónicos, que tienen un centro electrófilo, es decir un centro que busca electrones, capaz de reaccionar con un nucleófilo. Un electrófilo (o reactivo electrófilo) es un reactivo que forma un enlace a su compañero de reacción (el nucleofilo) aceptando ambos electrones de unión desde ese compañero de reacción.

"Nucleofilo" se refiere a un ion o átomo o un grupo de átomos, que pueden ser iónicos, que tienen un centro nucleofilo, es decir un centro que está buscando un centro electrófilo o es capaz de reaccionar con un electrófilo. Un nucleofilo (o reactivo nucleofilo) es un reactivo que forma un enlace a su compañero de reacción (el electrófilo) donando ambos electrones de unión. Un "grupo nucleofilo" se refiere a un nucleofilo después deque ha reaccionado con un grupo reactivo. " aleimido" se refiere a un grup pirrol-2 , 5-diona-l-ilo que tiene la estructura: que después de la reacción con un sulfhidrilo (por ejemplo, un tio alquilo) forma un grupo -S-maleimido que tiene la estructura: donde indica el punto de unión para el grupo maleimido y indica el punto de unión del átomo de azufre del tiol al resto del grupo que lleva el sulfhidrilo original.

Con el fin de esta invención, los "aminoácidos naturales" hallados en proteínas y polipéptidos son L-alanina, L-arginina, L-asparagina, ácido L-aspártico, L-cisteína, L-glutamina, ácido L-glutámico, L-glicina, L-histidina, L-isoleucina, L-leucina, L-lisina, L-metionina, L-fenilalanina, L-prolina, L-serina, L-treonina, L-triptófano, L-tirosina y/o L-valina. Los "aminoácidos no naturales" hallados en proteínas son cualquier aminoácido diferente de aquellos citados como aminoácidos naturales. Los aminoácidos no naturales incluyen, en forma no taxativa, los isómeros D de los aminoácidos naturales y mezclas de isómeros D y L de los aminoácidos naturales. Otros aminoácidos, tales como 4-hidroxiprolina, desmosina, isodesmosina, 5-hidroxilisina, epsilon-N-metillisina , 3 -metilistidina, aunque se hallan en proteínas naturales, se consideran aminoácidos no naturales hallados en proteínas a los fines de la invención ya que generalmente se introducen por medios diferentes de la traducción ribosomal del mARN.

"Lineal con referencia a la geometría, la arquitectura o la estructura total de un polímero, se refiere al polímero que tiene una sola rama polimérica.

"Ramificado", con referencia a la geometría, arquitectura o estructura total de un polímero, se refiere al polímero que tiene 2 o más "ramas" poliméricas que se extienden desde una estructura de núcleo, tal como un grupo L, que se puede obtener desde un iniciador empleado en una reacción de polimerización de radical de transferencia de átomos. Un polímero ramificado puede poseer 2 ramas poliméricas, 3 ramas poliméricas, 4 ramas poliméricas, 5 ramas poliméricas, 6 ramas poliméricas, 7 ramas poliméricas, 8 ramas poliméricas, 9 ramas poliméricas o más. A los fines de esta invención, los compuestos que tienen tres o más ramas poliméricas que se extienden desde un solo grupo lineal están indicadas como que tienen una estructura de "peine" o una arquitectura de "peine" . Ramificado también puede lograrse a través de estructuras "estadísticas" para crear arquitecturas similares a dendrímeros más amplias. El grupo que une las ramas poliméricas puede ser una molécula pequeña que tiene varios puntos de unión, tales como glicerol o más ejemplos de estructuras que tienen 4 o más puntos de unión de polímero, tales como dendrímeros y estructuras hiperramificadas . El grupo también puede ser una nanopartícula con una funcionalidad apropiada para permitir la unión de varias ramas poliméricas.

Una composición "farmacéuticamente aceptable" o una "composición farmacéutica" se refiere a una composición que comprende un compuesto de la invención y un excipiente farmacéuticamente aceptable o excipientes farmacéuticamente aceptables.

"Excipiente farmacéuticamente aceptable" y "portador farmacéuticamente aceptable" se refieren a un excipiente que se puede incluir en las composiciones de la invención y que produce un efecto toxicológico adverso importante sobre el paciente. Ejemplos no taxativos de excipientes farmacéuticamente aceptables incluyen agua, NaCl , soluciones salinas normales, solución de Ringer lactada, sacarosa normal, glucosa normal y similares.

"Paciente" o "sujeto que lo necesita" se refiere a un organismo vivo que experimenta o está propenso a una condición que se puede prevenir o tratar mediante la administración de una composición farmacéutica provista en la presente. Ejemplos no taxativos incluyen humanos, otros mamíferos y otros animales no mamíferos.

"Cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a una cantidad de un agente funcional conjugado o de una composición farmacéutica útil para tratar, mejorar o prevenir una enfermedad o condición identificada, o para presentar un efecto terapéutico o inhibidor detectable. El efecto se puede detectar mediante cualquier método de ensayo conocido en el arte.

La "semivida biológica" de una sustancia es un parámetro farmacocinético que especifica el tiempo necesario para que la mitad de la sustancia que se debe eliminar desde un organismo después de la introducción de la sustancia dentro del organismo.

Polímeros de Alto peso molecular La presente invención proporciona un polímero de alto peso molecular que tiene grupos hidrófilos y un grupo funcional o grupo de unión. En algunas realizaciones, la presente invención proporciona un polímero que tiene por lo menos dos ramas cada uno que tienen una pluralidad de monómeros que se seleccionan cada uno de acrilato, metacrilato, acrilamida, metacrilamida, estireno, vinil-piridina, vinil -pirrolidona o un éster de vinilo tal como acetato de vinilo, en donde cada monómero incluye un grupo hidrófilo. El polímero también incluye un fragmento de iniciador unido a un extremo próximo de la rama polimérica, en donde el grupo iniciador es adecuado para la polimerización de radicales. El polímero también incluye un grupo de extremo unido a un extremo distal de la rama polimérica. Por lo menos uno de los fragmentos de iniciador y el grupo de extremo del polímero incluye un agente funcional o un grupo de unión.

En otras realizaciones, la presente invención proporciona un polímero que tiene una rama polimérica que tiene una pluralidad de monómeros cada uno seleccionado independientemente de acrilato, metacrilato, acrilamida, metacrilamida, estireno, vinil-piridina, vinil-pirrolidona o un éster de vinilo tal como acetato de vinilo, en donde cada monómero incluye un grupo hidrófilo. El polímero también incluye un fragmento de iniciador unido a un extremo próximo de la rama polimérica, en donde el grupo iniciador es adecuado para la polimerización de radicales. El polímero también incluye un grupo de extremo unido a un extremo distal de la rama polimérica. Por lo menos uno del fragmento de iniciador y el grupo de extremo del polímero incluye un agente funcional o un grupo de unión. Además, el polímero tiene un peso molecular pico (Mp) de 50 kDa a 1.500 kDa, medido mediante difusión de luz de varios ángulos.

Los polímeros de la presente invención pueden tener cualquier peso molecular. Ejemplos de pesos moleculares para los polímeros de alto peso molecular de la presente invención pueden ser desde 50 hasta 1.500 kilo-Dalton (kDa). En algunas realizaciones, los polímeros de alto peso molecular de la presente invención pueden tener un peso molecular de 50 kDa, 100 kDa, 200 kDa, 250 kDa, 300 kDa, 350 kDa, 400 kDa, 450 kDa, 500 kDa, 750 kDa, 1.000 kDa o 1.500 kDa.

En algunas otras realizaciones, la presente invención proporciona un polímero de la fórmula: en donde R1 puede ser H, I^-A1, LG1 o I^-LG1. Cada M1 y M2 se puede seleccionar independientemente de acrilato, metacrilato, acrilamida, metacrilamida, estireno, vinil-piridina, vinil -pirrolidona o éster de vinilo. Cada uno de G1 y G2 es independientemente un grupo hidrófilo. Cada grupo I es un fragmento de iniciador e I' es un depurador de radicales de manera tal que la combinación de I-I' sea un iniciador, I1, para la polimerización del polímero a través de la polimerización de radicales. Alternativamente, cada I' se puede seleccionar independientemente de H, halógeno o alquilo de C1-s. Cada L1, L2 y L3 puede ser un ligador. Cada A1 puede ser un agente funcional. Cada LG1 puede ser un grupo de unión. Los subíndices x e y1 pueden ser cada uno independientemente un número entero de 1 a 1.000. Cada subíndice z puede ser independientemente un número entero de 1 a 10. El subíndice s puede ser un número entero de 1 a 100.

En otras realizaciones, la presente invención proporciona un polímero de la Fórmula I en donde R1 de la fórmula I puede ser H, I^-A1, LG1 o L^-LG1. Cada M1 y M2 de la fórmula I se pueden seleccionar independientemente de acrilato, metacrilato, acrilamida, metacrilamida, estireno, vinil-piridina, vinil -pirrolidona o éster de vinilo. Cada uno de ZW y ZW1 de la fórmula I puede ser independientemente un grupo z iteriónico. Cada I es un fragmento de iniciador e l' es un depurador de radicales de manera tal que la combinación de I-I' sea un iniciador, I1, para la polimerización del polímero de la fórmula I a través de la polimerización de radicales. Alternativamente, cada I' se puede seleccionar independientemente de H, halógeno o alquilo de Ci-6. Cada L1, L2 y L3 de la fórmula I puede ser un ligador. Cada A1 de la fórmula I puede ser un agente funcional. Cada LG1 de la fórmula I puede ser un grupo de unión. Los subíndices x e y1 de la fórmula I pueden ser cada uno independientemente un número entero de 1 a 1000. Cada subíndice z de la fórmula I puede ser independientemente un número entero de 1 a 10. El subíndice s de la fórmula I puede ser un número entero de 1 a 100. La suma de s, x, y1 y z pueden ser de manera tal que el polímero de la fórmula I tenga un peso molecular pico de 50 kDa a 1.500 kDa, medido mediante difusión de luz de varios ángulos .

En otras realizaciones, el polímero puede tener la fórmula: En algunas realizaciones, el polímero puede tener la fórmula: en donde R2 se puede seleccionar de H o alquilo de Ci-6 y PC puede ser fosforilcolina .

Los polímeros de alto peso molecular de la presente invención también pueden tener cualquier número de comonómeros, M2. Por ejemplo, el número de comonómeros, subíndice z, puede ser desde 1 hasta 10, tal como 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10. el número de comonómeros, subíndice z, puede ser desde l a 5, l a 4, l a 3, o 1 a 2. En algunas realizaciones, el polímero de peso molecular alto de la presente invención puede tener dos monómeros diferentes donde el subíndice z es 1, tal como en la fórmula la Comonómeros adicionales M2 pueden estar presentes en los polímeros de alto peso molecular de la presente invención, tales como M2a, 2b, M2c, M2d, M2e, M2f, M2g, 2h, etc. y se definen como anteriormente para M2, donde cada comonómero está presente en el mismo valor en un valor diferente de y1 y cada comonómero tiene un grupo ZW1 correspondiente unido.

Los diferentes monómeros de los polímeros de alto peso molecular también pueden estar presentes en cualquier relación adecuada. Por ejemplo los monómeros 2, colectiva o individualmente, pueden estar presentes en relación con el monómero 1 en una relación de 100:1, 50:1, 40:1, 30:1, 20:1, 10:1, 9:1, 8:1, 7:1, 6:1, 5:1, 4:1, 3:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:20, 1:30, 1:40, 1:50 y 1:100. Además, cada monómero 2 puede estar presente en cualquier relación adecuada en relación con el 1 o con cualquier otro monómero M2, tal como 100:1, 50:1, 40:1, 30:1, 20:1, 10:1, 9:1, 8:1, 7:1, 6:1, 5:1, 4:1, 3:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:20, 1:30, 1:40, 1:50 y 1:100.

Los polímeros de alto peso molecular de la presente invención pueden tener cualquier arquitectura adecuada. Por ejemplo, los polímeros de alto peso molecular pueden ser lineales o ramificados. Cuando los polímeros de alto peso molecular son ramificados, pueden tener cualquier número adecuado de ramas poliméricas, como se definieron anteriormente por el subíndice s de la fórmula I, tal como 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 y hasta 100 ramas. En algunas realizaciones, el subíndice s puede ser de l a 32, l a 16, l a 10, l a 9, l a 8, l a 7, l a 6, l a 5, l a 4, l a 3 o l a 2. Los polímeros de alto peso molecular de la presente invención pueden adoptar cualquier arquitectura adecuada. Por ejemplo, los polímeros de alto peso molecular pueden ser lineales, ramificados, estrellas, dendrímeros, peines, etc.

Un agente funcional de los polímeros de alto peso molecular se pueden unir al fragmento de iniciador I, o al depurador de radicales I', o a ambos. Cuando varios agentes funcionales están presentes, L1 puede ser un ligador de ramificación de manera tal que dos o más agentes funcionales se puedan unir al fragmento de iniciador I. En algunas realizaciones, el polímero de alto peso molecular tiene la fórmula Ib: fórmula Ib, el agente funcional A1 puede ser un fármaco, una proteína terapéutica o un agente dirigido. El ligador L1 puede ser un ligador descomponible, tal como cuando se une a un fármaco o a una proteína terapéutica para facilitar la liberación del fármaco o de la proteína terapéutica. Alternativamente, el ligador L1 puede ser un ligador no descomponible.

Cuando varios comonómeros M2 están presentes, cada comonómero M2 puede tener un grupo zwiteriónico diferente unido. Por ejemplo, el polímero de alto peso molecular puede tener la fórmula Ic: en donde cada uno de ZW y ZW es lo definido anteriormente para ZW y cada uno de yla y ylb es lo definido anteriormente para y1.

En algunas realizaciones, los polímeros de alto peso molecular tienen grupos de unión LG unidos al fragmento de iniciador I, tales como los que se muestran en la estructura siguiente En algunas realizaciones, los polímeros de alto peso molecular de la presente invención se pueden modificar a través de una polimerización posterior con uno o más monómeros adicionales. Por ejemplo, en la fórmula Ic anterior, los monómeros M1 y M2a se pueden polimerizar en una segunda polimerización. Se formaría un copolímero de bloques que tiene dos bloques, el primer bloque es un polímero de alto peso molecular de M1 y 2a y el segundo bloque es un homopolímero de M2c . Alternativamente, después de la polimerización de los monómeros M1 y M2a, el monómero M2b se puede copolimerizar con el monómero M2c, formando así un copolímero de bloques donde el primer bloque es un polímero de alto peso molecular de M1 y M2a y el segundo bloque es un polímero de alto peso molecular de M2b y 2c. Otras estructuras de polímeros se pueden preparar copolimerizando monómeros M1, M2a y M2b en una primera polimerización, seguida por la copolimerización de los monómeros M2c, Md y otros, en una segunda copolimerización . Otros bloques se pueden preparar mediante aún una tercera polimerización usando monómeros adicionales. Dichos polímeros proporcionan bloques de copolímeros que pueden tener diferentes propiedades, fármacos y agentes funcionales.

En algunas realizaciones, el polímero puede ser: O En algunas otras realizaciones, el polímero puede 20 En algunas realizaciones, R1 es L3-A1, LG1 o L3-LG1; A1 es un fármaco, un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, un anticuerpo de un solo dominio, un avimer, una adnectina, diacuerpos, una vitamina, un cofactor, un polisacárido, un carbohidrato, un esteroide, un lípido, una grasa, una proteína, un péptido, un polipéptido, un nucleótido, un oligonucleótido, un polinucleótido, un ácido nucleico, un radiomarcador, un agente de contraste, un fluoróforo o una colorante; L3 es - (CH2CH20) 1-10- ; y LG1 es maleimida, acetal, vinilo, alilo, aldehido, -C (0) O-alquilo de Ci_e, hidroxi, diol , cetal, azida, alquino, ácido carboxílico o succinimida . En otras realizaciones, cada LG1 puede ser hidroxi, carboxi, vinilo, viniloxi, alilo, aliloxi, aldehido, azida, etina, propina, propargilo, -C (O) 0-alquilo de Ci_6, A. Iniciadores Los polímeros de alto peso molecular de la presente invención se polimerizan usando cualquier iniciador adecuado. Los iniciadores útiles en la presente invención se pueden describir mediante la fórmula: I-(I')m, donde el subíndice m es un número entero de 1 a 100. El fragmento de iniciador I puede ser cualquier grupo que inicie la polimerización. El depurador de radicales I' puede ser cualquier grupo que termine en forma reversible la cadena polimérica creciente. El depurador de radicales I' puede ser un halógeno tal como bromo, que permite que el extremo del polímero tome una funcionalidad después de la polimerización. En algunas realizaciones, el depurador de radicales I' se denomina grupo de extremo. Además, el fragmento de iniciador I puede tomar opcionalmente la funcionalidad con un grupo de R1 que puede incluir una variedad de grupos funcionales para a ustar la funcionalidad del polímero de alto peso molecular.

Los iniciadores útiles en la presente invención pueden tener un solo depurador de radicales I', o cualquier número adecuado de ramificaciones de manera tal que haya varios depuradores de radicales I', cada uno de los cuales es capaz de terminar en forma reversible una cadena polimérica creciente. Cuando el fragmento de iniciador se ramifica y es capaz de iniciar varias cadenas poliméricas, el subíndice m es mayor que un de manera tal que haya tantos depuradores de radicales I' como hay cadenas poliméricas crecientes. El polímero de la presente invención puede tener una pluralidad de ramas poliméricas. Por ejemplo, el polímero puede tener de 1 a 100 ramas poliméricas, o de 1 a 50 ramas poliméricas, o de 1 a 20 ramas poliméricas o de 1 a 10 ramas poliméricas o de 2 a 10 ramas poliméricas, o de 1 a 8 ramas poliméricas, o de 2 a 8 ramas poliméricas o de 1 a 4 ramas poliméricas o de 2 a 4 ramas poliméricas. El polímero también puede tener cualquier índice de polidispersidad adecuado (PDI), medido mediante el peso molecular promedio en peso (Mw) dividido por el peso molecular promedio en número (Mn) , donde un PDI de 1,0 indica un polímero perfectamente monodisperso . Por ejemplo, el PDI puede ser menor de 1,9, 1,8, 1,7, 1,6, 1,5, 1,4, 1,3, 1,2 0 1,1.

En algunas realizaciones, el fragmento de iniciador está unido a 1 brazo polimérico, y el polímero tiene un índice de polidispersidad de 1,5. En otras realizaciones, el fragmento de iniciador está unido al extremo próximo y de 2 a 100 ramas poliméricas. En algunas otras realizaciones, el polímero tiene un índice de polidispersidad menor de 2,0. En aún otras realizaciones, el fragmento de iniciador está unido al extremo próximo de 2 ramas poliméricas. En aún otras realizaciones, el fragmento de iniciador está unido al extremo próximo de 4 ramas poliméricas. En otras realizaciones, el fragmento de iniciador puede estar unido al extremo próximo de 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9 o 12 ramas poliméricas.

Los polímeros pseudo-ramificados también se pueden obtener uniendo varios polímeros lineales, no ramificados de la presente invención a un solo agente funcional de manera tal que los polímeros estén a una proximidad estrecha. La proximidad se puede obtener uniendo el polímero a puntos cercanos sobre el agente funcional, cisteínas sobre una proteína, por ejemplo. Alternativamente, la proximidad puede verse afectada por la estructura del agente funcional, una proteína, por ejemplo, de manera tal que los polímeros unidos a regiones dispares de la proteína se coloquen en estrecha proximidad debido al pliegue y la estructura secundaria y terciaria de la proteína. La proximidad estrecha de ambos polímeros de la presente invención sobre un solo agente funcional, independientemente de cómo se logre la proximidad, puede impartir propiedades similares a aquella de un polímero de la presente invención que tiene una pluralidad de ramas poliméricas.

El enlace entre el fragmento de iniciador I y el depurador d radicales I' es lábil, de manera tal que durante el proceso de polimerización M1 y los comonómeros M2 se inserten entre el fragmento de iniciador I y el depurador de radicales I' . Por ejemplo, durante una polimerización de radicales libres, tal como ATRP, el fragmento de iniciador I y el depurador de radicales I' se disocian, como se muestra en la Figura 1, para formar radicales de I e I'. El radical del fragmento de iniciador I luego reacciona con los monómeros además de hacer crecer el polímero y formar un radical polimerico en propagación (especie A y especie C de la Figura 1) . Durante el proceso de polimerización, el radical del depurador de radicales I' reacciona en forma reversible con el radical polimérico en propagación para detener el crecimiento del polímero. El enlace entre el monómero y el depurador de radicales I' también es lábil, de manera tal que el enlace pueda descomponerse y permitir que el radical del polímero en propagación reacciones con el monómero adicional para hacer crecer el polímero. El resultado final del proceso de polimerización es que el fragmento de iniciador I está en un extremo de la cadena polimérica y el depurador de radicales I' está en el extremo opuesto de la cadena polimérica .

El radical del fragmento de iniciador I normalmente está sobre un carbono segundario o terciario y se puede estabilizar con un carbono de carbonilo adyacente. El depurador de radicales I' es normalmente un halógeno, tal como bromo, cloro o yodo. Juntos, el fragmento de iniciador I y el depurador de radicales I' forman el iniciador I1 útil en la propagación de los polímeros de alto peso molecular de la presente invención.

Se puede usar una amplia variedad de iniciadores para preparar los polímeros de alto peso molecular de la invención, que incluyen numerosos iniciadores expuestos en US 6.852.816 (incorporada en la presente como referencia) . En algunas realizaciones, los iniciadores empleados para reacciones de ATRP para preparar polímeros de alto peso molecular de la invención se seleccionan de alcanos, cicloalcanos, ácidos alquil carboxilicos o ásteres de ellos, ácidos cicloalquilcarboxilicos o ésteres de ellos, éteres y éteres de alquilo cíclico, grupos alquil arilo, alquil amidas, ácidos alquil-aril carboxilicos y ésteres de ellos y que también tienen un depurador de radicales I' en donde se preparan los polímeros de alto peso molecular y más de un depurador de radicales I' donde se preparan las moléculas ramificadas .

Los depuradores de radicales I' útiles en la presente invención incluyen, en forma no taxativa, halógenos, tales como Br, Cl e I , tiocianato (-SCN) e isotiocianato (-N=C=S) . Otros grupos son útiles para el depurador de radicales I' de la presente invención. En algunas realizaciones, el depurador de radicales I' es bromo .

Los iniciadores empleados para reacciones de ATRP es pueden hidroxilar. En algunas realizaciones, los iniciadores empleados para reacciones de ATRP para preparar polímeros de alto peso molecular de la invención se seleccionan de alcanos, cicloalcanos, ácidos alquil carboxilicos o ésteres de ellos, ácidos cicloalquilcarboxílicos o ésteres de ellos, éteres de alquilo cíclicos, grupos alquil arilo, alquil amidas, ácidos alquil -aril carboxílieos y ésteres de ellos, que transportan un grupo hidroxilo y también que llevan un depurador de radicales I' donde se deben preparar los polímeros de alto peso molecular no ramificados, o alternativamente, más de un depurador de radicales I' donde se deben preparar moléculas ramificadas.

Los iniciadores empleados para reacciones de ATRP pueden transportar uno o más grupos amina. En algunas realizaciones, los iniciadores empleados para reacciones de ATRP para preparar polímeros de alto peso molecular de la invención son alcanos, cicloalcanos , ácidos alquil carboxílieos o ésteres de ellos, ácidos cicloalquilcarboxílicos o ésteres de ellos, éteres, éteres de alquilo cíclicos grupos alquil arilo, alquil amidas, ácidos alquil -aril carboxílieos y ésteres de ellos, que llevan un grupo amina y que también llevan un depurador de radicales I' donde se deben preparar polímeros de peso molecular alto no ramificados, o alternativamente más de un depurador de radicales I' donde se deben preparar moléculas ramificadas.

Los ácidos alquilcarboxílicos , que incluyen ácidos alquil dicarboxílieos, que tienen por lo menos un depurador de radicales I' y sustituidos con grupos amino o hidroxi también se pueden emplear como iniciadores. En algunas realizaciones de la invención donde se emplea ATRP para preparar polímeros de alto peso molecular de la presente invención, los iniciadores pueden ser ácidos alquilcarboxílicos que llevan uno o más halógenos seleccionados de cloro y bromo.

Los alcanos sustituidos con dos o más grupos seleccionados de -COOH, -OH y -NH2/ por lo menos un depurador de radicales I', también se pueden emplear como iniciadores para la preparación de polímeros de alto peso molecular donde se emplea ATRP para preparar polímeros de alto peso molecular de la presente invención .

Los iniciadores también pueden contener uno o más grupos que incluyen, en forma no taxativa, grupos -OH, amino, monoalquilamino, ialquilamino, -O-alquilo, -COOH, -COO-alquilo, o fosfato (o formas protegidas de ellos) .

Un grupo amplio de iniciadores están comercialmente disponibles, por ejemplo, éster de N-hidroxisuccinimida del ácido bromoacético disponible en Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) . Las formas protegidas adecuadas de estos iniciadores se pueden preparar usando métodos estándar en el arte según sea necesario.

Otros iniciadores incluyen iniciadores térmicos, de reducción y oxidación o foto iniciadores, que incluyen, por ejemplo, peróxido de alquilo, peróxidos de alquilo sustituidos, peróxidos de arilo, peróxidos de arilo sustituidos, peróxidos de acilo, peróxidos de acilo, hidroperóxidos de alquilo, hidroperóxidos de alquilo sustituidos, hidroperóxidos de arilo, hidroperóxidos de arilo sustituidos, peróxidos de heteroalquio, peróxidos de heteroalquilo sustituidos, hidroperóxidos de heteroalquilo, hidroperóxidos de heteroalquilo sustituidos, peróxidos de heteroarilo, peróxidos de heteroarilo sustituidos, hidroperóxidos de heteroarilo, hidroperóxidos de heteroarilo sustituidos, perésteres de alquilo, perésteres de alquilo susituidos, perésteres de arilo, perésteres darilo sustituidos, compuestos azo y compuestos haluro. Los iniciadores específicos incluyen hidroperóxido de eumeno (CHP) , hidroperóxido de tere-butilo (TBHP) , perbenzoato de tere-butilo (TBPB) , peróxido de carbonato de sodio, peróxido de benzoilo (BPO) , peróxido de lauroilo (LPO) , metiletil cetona 45%, persulfato de potasio, persulfato de amonio, 2 , 2 -azobis (2 , 4-dimetil-valeronitrilo) , 1.1-azobis (ciclo-hexanocarbonitrilo) , diclorhidrato de 2.2 -azobis (N, N-dimetilenisobutiramidina) y diclorhidrato de 2, 2 -azobis (2 -amido-propano) . Los pares de reducción y oxidación tales como persulfato/sulfito y peróxido de Fe (2+) o persulfato de amonio y N, , N' N' -tetrametiletilendiamina (TEMED) .

Aún otros iniciadores útiles para preparar los polímeros de alto peso molecular de la presente invención, son ramificados. Los iniciadores adecuados que tienen un solo punto de ramificación incluyen los siguientes : donde el radical R puede ser cualquiera de los siguientes : En algunas realizaciones, el iniciador puede ser: que es maleimida protegida que se puede desproteger después de la polimerización para formar la maleimida para la reacción con otros grupos funcionales.

Otros iniciadores ramificados incluyen, en forma no taxativa, los siguientes, donde el radical R es lo definido anteriormente: En algunas realizaciones, los iniciadores ramificados incluyen, en forma no taxativa, los siguientes: Otros iniciadores ramificados útiles para preparar los polímeros de alto peso molecular de la presente invención incluyen los siguientes : donde R es lo definido anteriormente y el radical X puede ser CHO, S02C1, S02CH=CH2, NHCOCH21 , N=C=0 y N=C=S, entre otros. Otros grupos X pueden incluir los siguientes: Aún otros iniciadores incluyen, en forma no taxativa, los siguientes : En otras realizaciones, los iniciadores pueden tener varios puntos de ramificación para obtener una pluralidad de ramas poliméricas, tales como: donde el radical R es lo definido anteriormente. En algunas otras realizaciones, el iniciador puede tener la siguiente estructura: 15 20 Como se describió anteriormente, el iniciador se puede agregar a la mezcla de polimerización por separado, o se puede incorporar en otra molécula, tal como un monómero (estructura hiperramificada) o un fragmento de polímero (tal como copolímeros de injerto) . Los iniciadores de la polimerización se pueden lograr con calor, luz ultravioleta u otros métodos conocidos para los expertos en el arte.

En algunas realizaciones, el iniciador I-I' de la presente invención tiene la fórmula: (F) r-Sp1-C-Sp -I' donde el fragmento de iniciador I corresponde a F-Sp1-C-Sp2.

Cada radical F es un grupo funcional para la reacción con un agente funcional o un grupo de unión de la presente invención. El radical r es de 1 a 10. Los radicales Sp1 y Sp2 son separadores y pueden ser cualquier grupo adecuado para formar un enlace covalente tal como alquilo de Ci-e, arilo o heteroarilo. El radical C puede ser cualquier núcleo que proporcione uno o una pluralidad de puntos para la unión a uno o más separadores, Sp2 (que pueden ser iguales o diferentes) y uno o más depuradores de radicales, I', y proporcionar uno o una pluralidad de puntos para la unión a uno o más separadores, Sp1 (que pueden ser iguales o diferentes) y uno o más grupos funcionales, F (que pueden ser iguales o diferentes) . El núcleo C puede ser cualquier estructura adecuada, tal como una estructura ramificada, una estructura reticulada que incluye heteroátomos , tales como silsesquiloxanos y un polímero corto, lineal con varios grupos funcionales dependientes. Además, el núcleo C puede unirse a uno o más separadores Sp1 y Sp2 a través de cualquier grupo adecuado para formar un enlace covalente que incluye esteres, amidas, éteres y cetonas . El depurador de radicales I' es un átomo o grupo transferible radicalmente, tal como en forma no taxativa, halógeno, Cl, Br, I, OR10, SR11, SeR11, OC(=0)R1:L, OP(=0)R11, OP(=0) (OR11^, 0-(R11)2, S-C(=S)N(R11)2, CN, NC, SCN, CNS, OCN, CNO, N3, OH, O, alcoxi de Ci-Cg, (S04) , P04, HP04, H2 P04, triflato, hexafluorofosfato, metanesulfonato, arilsulfonato, haluro del ácido carboxílico. R10 es un alquilo de 1 a 20 átomos de carbono o un alquilo de 1 a 20 átomos de carbono en donde cada uno de los átomos de hidrógeno se puede reemplazar por un haluro, alquenilo de 2 a 20 átomos de carbono, alquinilo de 2 a 10 átomos de carbono, fenilo sustituido con 1 a 5 átomos de halógeno o grupos alquilo con 1 a 4 átomos de carbono, aralquilo, arilo, arilo sustituido, en donde el grupo arilo es fenilo o fenilo sustituido y el grupo alquilo tiene de 1 a 6 átomos de carbono y R11 es arilo o un grupo alquilo de Ci-C20 recto o ramificado o donde está presente un grupo N(R1:L)2, ambos grupos de R11 se pueden unir para formar un anillo heterocíclico de 5, 6 o 7 miembros. El separador Sp1 une en forma covalente el grupo funcional F y el núcleo C mientras que el separador Sp2 une en forma covalente el núcleo C y el depurador de radicales I' .

En otras realizaciones, el iniciador de la presente invención tiene la fórmula: en donde cada I' se selecciona independientemente de halógeno, -SCN o -NCS . L4 y L5 son cada uno independientemente un enlace o un ligador, de manera tal que uno de L4 y L5 sea un ligador. C es un enlace o un grupo central. LG es un grupo de unión. Y el subíndice p es de 1 a 100m, en donde cuando el subíndice p es 1, C es un enlace y cuando el subíndice p es de 2 a 100, C es un grupo central. En algunas otras realizaciones, el iniciador tiene la fórmula: en donde cada R3 y R4 se selecciona independientemente de H, CN o alquilo de Ci-6.

B . Monómeros Los monómeros útiles para preparar los polímeros de alto peso molecular de la presente invención incluyen cualquier monómero capaz de la polimerización de radicales. Normalmente, dichos monómeros tienen un grupo vinilo. Los monómeros adecuados incluyen, en forma no taxativa, acrilato, metacrilato, acrilamida, metacrilamida, estireno, vinil-piridina, vinil-pirrolidona y ásteres de vinilo tales como monómeros de acetato de vinilo. Los monómeros útiles en la presente invención incluyen un grupo hidrófilo. El grupo hidrófilo de la presente invención puede ser cualquier grupo hidrófilo adecuado. Por ejemplo, el grupo hidrófilo puede incluir grupos zwiteriónicos y polímeros hidrófilos. En algunas realizaciones, cada grupo hidrófilo incluye un grupo zwiteriónico . Los grupos zwiteriónicos de la presente invención incluyen cualquier compuesto que tenga tanto una carga negativa como una carga positiva. Los grupos que tienen una carga negativa y son adecuados para su uso en los zwiteriones de la presente invención incluyen, en forma no taxativa, fosfato, sulfato, otros oxoaniones, etc. Los grupos que tienen una carga positiva y son adecuados para su uso en los zwiteriones de la presente invención incluyen, en forma no taxativa, iones de amonio. En algunas realizaciones, el zwiterión puede ser fosforilcolina . Otros zwiteriones útiles en la presente invención incluyen aquellos descritos en O1994016748 y WO1994016749 (que incorporan en la presente como referencia) . Los polímeros hidrófilos útiles en la presente invención incluyen óxido de polietileno, polioxazolina, celulosa, dextrano y otros polímeros. Un experto en el arte apreciará que otros polímeros hidrófilos son útiles en la presente invención.

Otros grupos hidrófilos incluyen, en forma no taxativa, hidroxi, amina, ácido carboxílico, amida, sulfonato y fosfonato. Los monómeros útiles en la presente invención que incluyen dichos grupos hidrófilos incluyen, en forma no taxativa, acrilamida, N-isopropilacrilamida (NiPAAM) y otra acrilamida sustituida, ácido acrílico y otros.

Los monómeros, M1, que contienen el grupo zwiteriónico, ZW, incluyen, en forma no taxativa, los siguientes: Otros monómeros son adecuados para un experto en el arte e incluyen acetato de vinilo y sus derivados.

En algunas realizaciones, el grupo hidrófilo puede ser un grupo zwiteriónico. En algunas realizaciones, el monómero puede ser fosfato de 2- (metacriloiloxietil) -2 '- (trimetilamonioetilo) (HEMA-PC) . En algunas otras realizaciones, el monómero puede ser fosfato de 2- (acriloiloxietil ) -2 ' - (trimetilamonio etilo).

C . Ligadores Los polímeros de alto peso molecular de la presente invención también pueden incorporar cualquier ligador adecuado L. los ligadores L3 proporcionan la unión del agente funcional al fragmento de iniciador I y los ligadores L1 y L2 proporcionan la unión de los grupos zwiteriónicos a los comonómeros M1 y M2. Los ligadores pueden ser descomponibles o no descomponibles, homobifuncionales o heterobifuncionales . Otros ligadores pueden ser tanto heterobifuncionales como descomponibles, u homobifuncionales y descomponibles.

Los ligadores descomponibles incluyen aquellos que son ligadores hidrolizables , ligadores descomponibles en forma enzimática, ligadores sensibles al pH, ligadores de disulfuro y ligadores fotolábiles, entre otros. Los ligadores hidrolizables incluyen aquellos que tienen un grupo funcional éster, carbonato o carbamato en el ligador de manera tal que la reacción con agua descomponga el ligador. Los ligadores descomponibles en forma enzimática incluyen aquellos que se descomponen con enzimas y pueden incluir un grupo funcional éster, amida o carbamato en el ligador. Los ligadores sensibles al pH incluyen aquellos que son estables a un pH pero son lábiles a otro pH. Para los ligadores sensibles al pH, el cambio en el pH puede ser desde condiciones ácidas hacia condiciones básicas, desde condiciones básicas hacia condiciones ácidas, desde condiciones levemente ácidas hacia condiciones fuertemente ácidas, o desde condiciones levemente básicas hacia condiciones fuertemente básicas. Los ligadores sensibles al pH son conocidos para los expertos en el arte e incluyen, en forma no taxativa, cetales, acétales, iminas o iminios, siloxanos, silazanos, silanos, enlaces de maleamatos a amidas, ortoésteres, hidrazonas, derivados de ácidos carboxílicos activados y éteres de vinilo. Los ligadores de disulfuro se caracterizan porque tienen un enlace de disulfuro en el ligador y se descomponen en condiciones de reducción. Los ligadores fotolábiles incluyen aquellos que se descomponen al exponerlos a la luz, tal como radiaciones visible, infrarroja, ultravioleta o electromagnética a otras longitudes de onda.

Otros ligadores útiles en la presente invención incluyen aquellos descritos en las Solicitudes de Patentes Estadounidenses N° 2008/0241102 (cedida a Ascendis/Complex Biosystems) y 2008/0152661 (cedida a Mirus) y las Solicitudes de Patentes Internacionales N° WO 2004/010957 y 2009/117531 (cedida a Seattle Genetics) y 01/24763, 2009/134977 y 2010/126552 (cedida a Immunogen) (que se incorporan en su totalidad en la presente) . Los ligadores de Mirus útiles en la presente invención incluyen, en forma no taxativa, los siguientes: Otros ligadores incluyen aquellos descritos en Técnicas de Bioconjugados, Greg T. Hermanson, Academic Press, 2a ed., 2008 (incorporada en su totalidad en la presente) y aquellos descritos en Angew. Chem. Int. Ed. 2009, 48, 6974-6998 (Bertozzi, C.R. y Sletten, E. ) (incorporada en su totalidad en la presente) En algunas realizaciones, los ligadores L1, L2 y L3 pueden tener una longitud de hasta 30 átomos, cada átomo es independientemente C, N, 0, S y P. En algunas realizaciones, los ligadores L1 y L2 pueden ser cualquiera de los siguientes: -alquilo de Ci-i2-, -cicloalquilo de C3-i2-, -(alquilo de Ci-8) - (cicloalquilo de C3-12) - (alquilo de C0-B)-, - (CH2) 1-120- , ( - (CH2) 1-6-0- (CH2) 1-6- ) 1-12- , (- (CH2)i-4- H- (CH2)1-4)1-12-Í (- (CH2) 1-4-O- (CH2) 1-4) 1-12-0- , (- (CH2)1-4-0- (CH2)1-4-)i-i20- (CH2)i-i2-, - (CH^LI,- (C=0) -0-, - (CH2)1-12-0- (C=0) -, - (fenilo) - (CH2)i-3- (C=0) -0-, - (fenilo) - (CH2) 1-3- (C=0) -NH- , - (alquilo de Ci-6) - (C=0) -0- (alquilo de C0-6)-, - (C¾) 1-12- (C=0) -0-(CH2) Lia-, -CH (OH) -CH (OH) - (C=0) -0--CH (OH) -CH (OH) - (C=0) -NH- , -S-maleimido- (CH2) i-6- , -S-maleimido- (alquilo de Ci-3) - (C=0) -NH- , -S-maleimido- (alquilo de C1-3) - (cicloalquilo de C5-6) - (alquilo de C0-3) -, -(alquilo de Ci-3) - (cicloalquilo de C5-6) - (alquilo de C0-3) - (C=0) -0- , - (alqilo de Ci-3) - (cicloalquilo de C5-6) - (alquilo de C0-3) - (C=0) -NH- , -S-maleimido- (alquilo de C0-3) -fenilo- (alquilo de C0-3) - , -(alquilo de C0-3) -fenilo- (C=0) -NH- , - (CH2) ?.^-??- (C=0) - , - (CH2) 1-12- (C=0) -NH- , - (fenilo) - (CH2) !-3- (C=0) -NH- , -S- (CH2) - (C=0) -NH- (fenilo) - , - (CH2) .12- (C=0) -NH- (CH2) !-i2- , - (CH2)2- (C=0) -O- (CH2)2-0- (C=0) - (CH2)2- (C=0) -NH-, -(alquilo de Ci-6) - (C=0) -N- (alquilo de Ci-6)-, acetal, cetal, éter de aciloxialquilo, -N=CH-, -(alquilo de Ci-6) -S-S- (alquilo de Co-e)-/ -(alquilo de d-6) -S-S- (alquilo de Ci-6) - (C=0) -O- , -(alquilo de Ci-6) -S-S- (alquilo de Ci-6) - (C=0) -NH- , -S-S- (CH2) 1-3- (C=0) -NH- (CH2) 1-4-NH- (C=0) - (CH2)i-3-, -S-S- (alquilo de C0-3) - (fenilo) - , -S-S- (alquilo de C1-3-) - (fenilo) - (C=0) -NH- (CH2)i-5-, -(alquilo de C1-3) - (fenilo) - (C=0) -NH- (CH2) 1-5- (C=0) -NH- , -S-S- (alquilo de C1-3-) -, -(alquilo de C1-3- )- (fenilo) - (C=0) -NH- , -O- (alqilo de Ci-C6) -S (02) - (alquilo de d-6) -O- (C=0) -NH- , -S-S- (CH2) 1-3- (C=0) - , - (CH2) !_3- (C=0) -NH-N=C-S-S- (CH2) 1-3- (C=0) -NH- (CH2) 1-5- , - (CH2) 1-3- (C=0) -NH- (CH2) 1-5- (C=0) -NH- , - (CH2) 0-3- (heteroarilo) - (CH2) 0-3- , - (CH2) 0-3-fenilo- (CH2) 0-3- , -N=C(R)-, -(alquilo de d-e) -C (R) =N- (alquilo de d-s)-» -(alquilo de C1-6) - (arilo) -C (R) =N- (alquilo de d-6)-, -(alquilo de Ci-6) -C (R) =N- (arilo) - (alquilo de d-6)-, y -(alquilo de Ci-6) -O-P (O) (OH) -O- (alquilo de Co-e) -/ en donde R es H, alquilo de Ci-6, cicloalquilo de C3-6, o un grupo arilo que tiene 5-8 átomos endocíclicos .

En algunas otras realizaciones, los ligadores L1, L2 y L3 pueden ser cualquiera de los siguientes: -alquilo de d-Ci2-, -cicloalquilo de C3-d2~# ( - (CH2) 1-6-0- (CH2) i-6- ) ?-?2- , (- (CH2) 1-4-NH- (CH2)1-4)i.i2-, - (CH2)i-120-, (- (CH2)i_4-0- (CH2) 1-4) 1-12-O- , - (CH2) 1-12- (CO) -O- , - (CH2)i-i2- (CO) -NH-, - (C¾) 1-12-O- (CO) - , - (CH2)i-i2-NH- (CO) -, (- (CH2) 1-4-0- (CH2) 1-4) ?-?,-?- (CH2)1-12-, - (CH2) 1-12- (CO) -O- (CH2) 1-12- , - (CH2) 1-12- (CO) -NH- (CH2) 1-12- , - (CH2) !-i2-0- (CO) - (CH2) 1-12- , - (CH2) 1-12- H- (CO) - (CH2) 1-12- , - (cicloalquilo de C3-Ci2)-, -(alquilo de Ci-C8) - (cicloalquilo de C3-Ci2)-, -(cicloalquilo de C3-Ci2) - (alquilo de Ci-8)-, -(alquilo de Ci-ß) - (cicloalquilo de C3-Ci2) - (alquilo de Ca-e) - y - (CH2)0-3-arilo- (CH2)0-3-.

En aún otras realizaciones, cada uno de los ligadores L1, L2 y L3 es un ligador descomponible que se selecciona independientemente de ligadores hidrolizables, ligadores descomponibles enzimáticamente , ligadores sensibles al pH, ligadores de disulfuro y ligadores fotolábiles.

Otros ligadores útiles en la presente invención incluyen ligadores autoinmolados. Los ligadores autoinmolados útiles son conocidos para los expertos en el arte, tales como aquellos útiles para conjugados de anticuerpo y fármaco. Ejemplos de ligadores autoinmolados se describen en la Patente Estadounidense N° 7.754.681.

D. Grupos de Unión LG Los ligadores y agentes funcionales de la presente invención pueden reaccionar con un grupo de unión sobre el fragmento de iniciador I para formar un enlace. Los grupos de unión LG de la presente invención pueden ser cualquier grupo funcional adecuado capaz de formar un enlace a otro grupo funcional, uniendo de ese modo los dos grupos juntos. Por ejemplo, los grupos de unión LG útiles en la presente invención incluyen aquellos usados en la química de clic, la química de las maleimidas y los ésteres de HS, entre otros. Los grupos de unión que participan en la química de clic incluyen, en forma no taxativa, azidas y alquinos que forman un anillo de triazol a través del proceso de cicloagregado (véase la Patente Estadounidense N° 7.375.234, incorporada en la presente en su totalidad) . La química de las maleimidas consiste en la reacción de la maleimida olefina con un nucleófilo, tal como -OH, -SH o -NH2, para formar un enlace estable. Otros grupos de unión incluyen aquellos descritos en Técnicas de Bioconjugados, Greg T. Hermanson, Academic Press, 2d ed. , 2008 (que se incorpora en la presente en su totalidad) .

Algunos ejemplos no taxativos de la reacción de los grupos de unión y algunos grupos que normalmente se hallan o se introducen en los agentes funcionales se exponen en la Tabla 1.

Tabla I Ejemplos de Ejemplos de Grupos de Grupos que Unión Bioactivos (se reaccionan con Producto Y-X muestran anexados a - un grupo de X) unión (LG) Y-SH (halógeno) -CH2- (C=0) -0 Y- S -CH2- (C=0) -0-X -X Y- S -CH2- (C=0) -NH-X (halógeno) -CH2- (C=0) -N H-X Y- S -CH2- (C=0) -X (halógeno) -CH2- (C=0) -X (halógeno es preferentemente I o Br) R' es alquilo de Ci-6, cicloalquilo de C3-6, o un grupo acilo que tiene 5-8 átomos endocíclicos ; R" es H, alquilo de Ci-6, cicloalquilo de C3-6 o un grupo arilo que tiene 5-8 átomos de carbono; R " es un derivado de carbonilo *- (C=0)-, * (C=0) - (CH2)1-8-S-S-, *- (C=0) - (CH2)1-8- (00) -0-, (C=0)- (CH2) 1-8-0- (C=0)-, * - (C=0) - (CH2) 1-8- (C=0) -NH- , o *- (C=0) - (CH2) 1-8- H- (C=0) - , o alternativamente, R" ' es un derivado de carbonilo de la forma *- (C=0) -O- (CH2) ?-ß-S-S- , *- (C=0) -0- (CH2)1-8- (C=0) -0- , *- (C=0) -O- (CH2)1-8-0- (C=0) -, *- (C=0) -0- (CH2)i-8- (C=0) -NH- , O *-(C=0) -O- (CH2) 1-8-NH- (C=0) - , donde indica el punto de unión a succinimidilo o benzotriazolilo ; X y Y son cada uno un agente activo, un ligador, un monómero o un fragmento de iniciador I ; -C(0)NRlaRlb, -NRlaRlb, Ci_6 alkyl -NRlaRlb, -N (Rla) C (0) Rlb, -N(Rla)C(0)0Rlb, -N (Rla) C (0) NRlaRlb, -0P (0) (0Rla) 2 , -S(0)20Rla, -S (O) 2NRlaRlb, -CN, -N02/ cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo y heteroarilo .

E . Agentes funcionales Los agentes funcionales útiles en los polímeros de peso molecular alto de la presente invención incluyen todos los agentes biológicos o compuestos sintéticos capaces de dirigirse a un ligando, receptor, complejo, organelo, célula, tejido, capa epitelial, u órgano, o de tratar una condición o estado de enfermedad particular. En algunas realizaciones, el agente bioactivo es un fármaco, una proteína terapéutica, una molécula pequeña, un péptido, peptoide, un oligonucleótido (aptámero, siAR , microARN) , una nanopartícula, un carbohidrato, un lípido, un glicolípido, un fosfolípido, o un agente dirigido a un blanco. Otros agentes funcionales útiles en los polímeros de alto peso molecular de la presente invención incluyen, en forma no taxativa, radiomarcadores , agentes de contraste, fluoróforos y colorantes .

Los agentes funcionales pueden unirse al fragmento de iniciador I o al depurador de radicales I', o a ambos, de los polímeros de alto peso molecular. Los agentes funcionales pueden unirse al fragmento de iniciador I o al depurador de radicales I' antes o después de la polimerización a través de ligadores descomponibles o no descomponibles descritos anteriormente. Los agentes funcionales también pueden absorberse en forma física o iónica al polímero de alto peso molecular en lugar de unirse en forma covalente.

La preparación de los polímeros de alto peso molecular de la presente invención unidos a un agente funcional se puede realizar en primer lugar uniendo el agente funcional a un grupo de unión unido a un fragmento de iniciador y sometiendo al agente funcional unido a condiciones adecuadas para la síntesis de los polímeros de alto peso molecular de la invención. En esos casos, un grupo de unión adecuado puede ser un iniciador (por ejemplo, un compuesto/grupo yodado, bromado o clorado) para su uso e reacciones de ATRP. Dicho esquema de reacción es posible cuando el agente funcional es compatible con las reacciones de polimerización de polímeros y cualquier elaboración posterior necesaria. Sin embargo, la unión de los agentes funcionales a polímeros de alto peso molecular preformados se puede usar cuando el agente con funcionalidad no es compatible con las condiciones adecuadas para la polimerización. Además, cuando el costo hace la pérdida de un agente a rendimientos sintéticos imperfectos, frecuentemente enfrentados particularmente en las reacciones sintéticas de varios pasos, se puede emplear la unión de agentes funcionales a polímeros de alto peso molecular preformados de la presente invención.

Cuando un agente funcional no es compatible con las condiciones empleadas para las reacciones de polimerización, puede ser deseable introducir el agente funcional posterior a la reacción de polimerización.

Los agentes bioactivos, A, se puede seleccionar ampliamente. En algunas realizaciones los agentes bioactivos se pueden seleccionar de uno o más fármacos, vacunas, aptámeros, andamios de avimer basados en andamios del dominio A humano, diacuerpos, camelias, anticuerpos de IgARN de tiburón, andamios de fibronectina tipo III con especificidades modificadas, anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, vitaminas y cofactores, polisacáridos, carbohidratos, esteroides, lípidos, grasas, proteínas, péptidos, polipéptidos , nucleótidos, oligonucleótidos , polinucleótidos y ácidos nucleicos (por ejemplo, mARN, tARN, snARN, AR i, microARN, ADN, cADN, constructos antisentido, ribozinas, etc, y combinaciones de ellos) . En una realización, los agentes bioactivos se pueden seleccionar de proteínas, péptidos, polipéptidos , solubles o unidos a la célula, extracelulares o intracelulares , quinesinas, motores moleculares, enzimas, materiales de matriz extracelular y combinaciones de ellos. En otra realización, los agentes bioactivos se pueden seleccionar de nucleótidos, oligonucleótidos , polinucleótidos y ácidos nucleicos (por ejemplo, mARN, tARN, snARN, ARNi, ADN, cADN, constructos antisentido, ribozimas y combinaciones de ellos) . En otra realización, los agentes bioactivos se pueden seleccionar de esteroides, lípidos, grasas y combinaciones de ellos. Por ejemplo, el agente bioactivo se puede unir a la matriz extracelular, tal como cuando la matriz extracelular es ácido hialurónico o proteoglicano de sulfato de heparina y el agente bioactivo es un grupo de carga positiva tal como colina para interacciones de unión de tipo Velero, electrostáticas, no específicas. En otra realización, el agente bioactivo puede ser una secuencia de péptido que se une en forma no específica o específica .

Los agentes bioactivos pueden diseñarse y/o seleccionarse para tener una actividad amplia (tal como un nivel alto de agonismo o antagonismo) . Alternativamente, un agente bioactivo multifuncional se puede seleccionar para modular la actividad de una proteína blanco mientras que impactan completamente uno con otro .

De la misma manera que las proteínas de mosaico contienen dominios o subdominios de unión extracelular (por ejemplo, VEGF y Factor de Crecimiento Epidérmico de Unión a Heparina) , secuencias de estos sitios de unión se pueden replicar como un agente bioactivo para la unión al polímero. Más ampliamente, las proteínas de mosaico representan cadenas de dominios de muchas funciones (unión al blanco, unión a la matriz extracelular, separadores, aumentos de avidez, enzimáticos) . El grupo de agentes bioactivos elegidos para una aplicación particular se pueden montar en forma similar para replicar un grupo de actividades funcionales deseadas.

Otros agentes funcionales, A, incluyen especies con una carga tales como colina, lisina, ácido aspártico, ácido glutámico y ácido hialurónico, entre otros. Las especies con una carga son útiles para facilitar la unión iónica, a vitaminas por ejemplo.

Proteínas terapéuticas y anticuerpos En una realización particularmente útil, el agente funcional es una proteína terapéutica. Numerosas proteínas terapéuticas se revelan en toda la solicitud de patente tales como, en forma no taxativa, eritropoyetina, factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF) , GM-CSF, interferón alfa, interferón beta, hormona de crecimiento humano, imiglucerasa y ligando de RANK.

En una realización, los agentes funcionales se pueden seleccionar del polisacárido, agentes bioactivos de proteína o péptido identificados específicamente, que incluyen, en forma no taxativa, ?ß, agalsidasa, alefacept, fosfatasa alcalina, aspariginasa, amdoxovir (DAPD) , antide, becaplermina, toxina botulínica que incluye los tipos A y B y compuestos de peso molecular más bajo con actividad de toxina botulínica, calcitoninas, CDld, cianovirina, denileucina diftitox, eritropoyetina (EPO) , agonistas de EPO, dornasa alfa, proteína estimulante de eritropoyesis (NESP) , factores de coagulación tales como Factor V, Factor VII, Factor Vlla, Factor VIII, Factor VIII de dominio B eliminado, Factor IX, Factor X, Factor XII, Factor XIII, factor de von illebrand; ceredasa, Fe gamma r2b, cerezima, alfa-glucosidasa, N-Acetilgalactosamina-6-sulfato sulfatasa, colágeno, ciclosporina, alfa defensinas, beta defensinas, desmopresina, exendina 4, citoquinas, receptores de citoquinas, factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF) , trombopoyetina (TPO) , inhibidor de proteinasa alfa 1, elcatonina, factor estimulante de granulocitos y macrófagos (GM-CSF) , fibrinógeno, filgrastim, hormonas de crecimiento humano (hGH) , somatropina, hormona de liberación de hormona de crecimiento (GHRH) , GRO-beta, anticuerpo de GRO-beta, proteínas morfogenéticas óseas tales como la proteína morfogenética ósea 2, proteína morfogenéticas ósea 6, hormona paratiroidea, péptido relacionada con la hormona paratiroidea, OP-1; factor de crecimiento de fibroblastos ácidos, factor de crecimiento de fibroblastos básicos, Factor de Creimiento de Fibroblastos 21, ligando de CD40, ICOS, CD28, B7-1, B7-2, TLR y otros receptores inmunes innatos, heparina, albúmina del suero humana, heparina de bajo peso molecular (LMWH) , interferón alfa, interferón beta, interferón gamma, interferón omega, interferón tau, interferón de consenso; interleucinas y receptores de interleucina tales como receptor de interleucina 1 receptor, interleucina 2, proteínas de fusión de interleucina 2, antagonista de receptor de interleucina 1, interleucina 3, interleucina 4, receptor de interleucina 4, interleucina 6, interleucina 8, interleucina 12, interleucina 17, interleucina 21, receptor de interleucina 13, receptor de interleucina 17; lactoferrina y fragmentos e lactoferrina, hormona de liberación de hormona luteinizante (LHRH) , insulina, pro-insulina, análogos de insulina, amilina, péptido C, somatostatina, análogos de somatostatina que incluyen octreotida, vasopresina, hormona estimulante del folículo (FSH) , imiglucerasa, vacuna contra la influenza, factor de crecimiento similar a la insulina (IGF) , insulintropina, factor estimulante de colinas de macrófagos (M-CSF) , activadores de plasminógeno tales como alteplasa, uroquinasa, reteplasa, estreptoquinasa, pamiteplasa, lanoteplasa y teneteplasa factor de crecimiento de nervios (NGF) , trk A, trk B, osteoprotegerina , factor de crecimiento derivado de plaquetas, factores de crecimiento de tejidos, factor de crecimiento transformante 1, factor de crecimiento endotelial vascular, factor inhibidor de la leucemia, factor de crecimiento de queratinocitos (KGF) , factor de crecimiento glial (GGF) , receptores de células T, moléculas/antígenos CD, factor de necrosis tumoral (TNF) (por ejemplo, TNF-OÍ y TNF-ß) , receptores de TNF (por ejemplo, receptor de TNF-a y receptor de TNF-ß) , CTLA4, receptor de CTLA4 , proteína 1 de quimioatracción de monocitos, factores de crecimiento endotelial, hormona paratiroidea (PTH) , PTHrP, péptido similar a glucagón, somatotropina, timosina alfa 1, rasburicasa, inhibidor de timosina alpha 1 Ilb/lIIa, timosina beta 10, timosina beta 9, timosina beta 4, antitripsina alfa 1, compuestos de fosfodiesterasa (PDE) , VLA-4 (antígeno 4 muy tardío) , inhibidores de VLA-4, bisfosfonatos , anticuerpo de virus sincitial respiratorio, gen del regulador de transmembrana de fibrosis quística (CFTR) , desoxirribonucleasa (Dnase) , proteína bactericida/que aumenta la permeabilidad (BPI) , y anticuerpo anti-CMV. Ejemplos de anticuerpos monoclonales incluyen etanercept (una proteína de fusión dimérica que consiste en la parte de unión al ligando extracelular del receptor de TNF de 75 kD humano unida a la parte de Fe de IgGl) , abciximab, adalimumab, afelimomab, alemtuzumab, anticuerpo al linfocito B, atlizumab, basiliximab, bevacizumab, biciromab, bertilimumab, CDP-484, CDP-571, CDP-791, CDP-860, CDP-870, cetuximab, clenoliximab, daclizumab, eculizumab, edrecolomab, efalizumab, epratuzumab, fontolizumab, gavilimomab, gemtuzumab ozogamicin, ibritumomab tiuxetan, infliximab, inolimomab, keliximab, labetuzumab, lerdelimumab, olizumab, radiolabeled lym-1, metelimumab, mepolizumab, mitumomab, muromonad-CD3 , nebacumab, natalizumab, odulimomab, omalizumab, oregovomab, palivizumab, pemtumomab, pexelizumab, rhuMAb-VEGF, rituximab, satumomab pendetide, sevirumab, siplizumab, tositumomab, I131tosi umomab, trastuzumab, tuvirumab, visilizumab y fragmentos e imitadores de ellos.

En una realización, el agente bioactivo es una proteína de fusión. Por ejemplo, y en forma no taxativa, el componente bioactivo puede ser una inmunoglobulina o una parte de una inmunoglobulina fusionada a una o más secuencias de péptidos útiles determinadas. Por ejemplo, el agente bioactivo puede contener un fragmento de Fe de anticuerpo. En una realización, el agente bioactivo es una proteína de fusión de CTLA4. Por ejemplo, el agente bioactivo puede ser una proteína de fusión de Fc-CTLA4. En otra realización, el agente bioactivo es una proteína de fusión de Factor VIII. Por ejemplo, el agente bioactivo puede ser una proteína de fusión de Fc-Factor VIII.

En una realización particularmente útil, el agente bioactivo es una proteína humana o un polipéptido humano, por ejemplo, una proteína humana producida en forma heteróloga o un polipéptido humano. Numerosas proteínas y polipéptidos se discuten en la presente para los cuales existe una forma humana correspondiente (es decir, la proteína o el péptido normalmente se produce en células humanas en el cuerpo humano) . En consecuencia, en una realización, el agente bioactivo es la forma humana de cada una de las proteínas y polipéptidos revelados en la presente para los cuales existe una forma humana. Ejemplos de dichas proteínas humanas incluyen, en forma no taxativa, anticuerpos humanos, enzimas humanas, hormonas humanas y citoquinas humanas tales como el factor de estimulación de colonias de granulocitos, factor de estimulación de colonias de granulocitos y macrófagos, interferones (por ejemplo, interferones alfa e interferones beta), hormona de crecimiento humana y eritropoyetina .

Otros ejemplos de proteínas terapéuticas que (ellas solas o como el blanco de un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo o proteína de anticuerpo) pueden servir como agentes bioactivos incluyen, en forma no taxativa, factor VIII, factor VIII de dominio b eliminado, factor Vlla, factor IX, factor X, anticoagulantes, hirudina, alteplasa, tpa, reteplasa, tpa, tpa -3 de 5 dominios eliminados, insulina, insulina lispro, insulina aspártica, insulina glargina, análogos de insulina de acción prolongada, complemento C5, hgh, glucagones, tsh, folitropina beta, fsh, gm-csf, pdgh, ifn alfa2, ifn alfa2a, ifn alfa2b, inf-afal, ifn de consenso, ifn-beta, ifn-beta Ib, ifn-beta la, ifn-gamma (por ejemplo, 1 y 2) , ifn-lambda, ifn-delta, il-2, il-ll, hbsag, ospa, mab murino dirigido contra el antígeno de linfocitos T, mab murino dirigido contra tag-72, glicoproteína asociada a tumores, fragmentos de fab derivado del mab quimérico dirigido contra el receptor de la superficie de las plaquetas gpll (b) /III (a) , fragmento de mag murino dirigido contra el antígeno asociado al tumor cal25, lisil oxidasa, L0X2 , fragmento de mab murino dirigido contra el antígeno carcinoembrionario humano, cea, fragmento de mab murino dirigido contra miosina cardíaca humana, fragmento de mab murino dirigido contra el antígeno de la superficie del tumor psma, fragmentos de mab murino (fab/fab2 mix) dirigidos contra hmw-maa, fragmento de mab murino (fab) dirigido contra el antígeno asociado a carcinomas, fragmentos de mab (fab) dirigidos contra nca 90, un antígeno de 1 reacción cruzada no específica de granulocitos de la superficie, mab quimérico dirigido contra el antígeno de cd20 hallado sobre los linfocitos b, mab humanizado contra la cadena alfa del receptor de il2, mab quimérico dirigido contra la cadena alfa del _ receptor de il2, mab quimérico dirigido contra tnf-alfa, mab humanizado dirigido contra un epítope sobre la superficie del virus, mab humanizado dirigido contra her 2, receptor de factor 2 de crecimiento epidérmico humano, mab humano dirigido contra el antígeno asociado al tumor de citoqueratina anti-ctla4, mab quimérico dirigido contra el antígeno de superficie cd 20 de linfocitos b dornasa-alfa dnasa, beta glucocerebrosidasa, tnf-alfa, proteína de fusión de la toxina de il-2-difteria, laronidasa de proteína de fusión del fragmento de tnfr-lgg, dnaasas, alefacept, darbepoetina alfa (factor estimulante de colonias) , tositumomab, mab murina, alemtuzumab, rasburicasa, agalsidasa beta, teriparatida , derivados de hormona paratiroidea, adalimumab (lggl) , anakinra, modificador biológico, nesiritida, péptido natriurético de tipo b humano (hbnp) , factores estimulantes de colonias, pegvisomant, antagonista de receptor de 0 homrona de crecimiento humano, proteína C activada recombinante, omalizumab, bloqueador de inmunoglobulina e (lge) , lbritumomab tiuxetan, ACTH, glucagón, somatostatina, somatotropina, timosina, hormona paratiroidea, hormonas pigmentarias, somatomedina , eritropoyetina , hormona luteinizante, gonadotropina coriónica, factores liberadores hipotalámicos , etanercept, hormonas antidiuréticas, prolactina y hormona estimulante de la tiroides. Y cualquiera de éstos se puede modificar para tener un punto de conjugación específico del sitio (un extremo de N, o un extremo de C u otra ubicación) usando un aminoácido natural (por ejemplo, una sustitución de serina a cisteína) (por ejemplo, formilaldehído según el método de Redwood Biosciences) o no natural. El residuo (s) de aminoácido no natural se puede seleccionar del grupo formado por: azidonorleucina, 3-(l-naftil ) alanina , 3- (2-naftil) alanina, p-etinil-fenilalanina, p-propargil-oxi-fenilalanina, m-etinil-fenilalanina, 6-etinil-triptófano, 5-etinil-triptófano, ácido (R) -2-amino-3- (4-etinil-??-pirol -3 -il) propánico, p-bromofenilalanina, p-yodofenilalanina , p-azidofenilalanina, p-acetilfenilalanina, 3- (6-cloroindolil) alanina, 3 - (6-bromoindolil) alanina, 3- (5-bromoindolil) alanina, azidohomoalanina, homopropargilglicina, p-clorofenilalanina, ácido a-aminocaprílico, O-metil-L-tirosina, N-acetilgalactosamina-a-treonina y N-acetilgalactosamina-a-serina .

Ejemplos de anticuerpos terapéuticos que pueden servir como agentes bioactivos (solos o fragmentos de dichos anticuerpos) incluyen, en forma no taxativa, HERCEPTIN™ (Trastuzumab) (Genentech, CA) que es un anticuerpo monoclonal anti-HER2 para el tratamiento de pacientes con cáncer de mamas metastásico ; REOPRO™ (abciximab) (Centocor) que es un receptor de anti-glicoproteína Ilb/lIIa sobre las plaquetas para la prevención de la formación de coágulos; ZENAPAX™ (daclizumab) (Roche Pharmaceuticals, Suiza) que es un inmunosupresor, anticuerpo monoclonal anti-CD25 humanizado para la prevención del rechazo de aloinjerto renal agudo; PANOREX™ que es un anticuerpo de IgG2a de la superficie celular anti-17-?? murino (Glaxo Wellcome/Centocor) ; BEC2 que es un anticuerpo de IgG anti-idiotipo (epítope de GD3) murino (ImClone System) ; IMC-C225 que es un anticuerpo de IgG anti-EGFR quimérico (ImClone System) ; VITAXIN™ que es un anticuerpo de integrina anti-av 3 humanizado (Applied Molecular Evolution/Medlmmune) ; Campath; Campath 1H/LDP-03 que es un anticuerpo de IgGl anti CD52 humanizado (Leukosite) ; Smart M195 que es un anticuerpo de IgG anti-CD33 humanizado (Protein Design Lab/Kanebo) ; RITUXAN™ que es un anticuerpo de IgGl anti-CD20 humanizado (IDEC Pharm/Genentech, Roche/Zettyaku) ; LY PHOCIDE™ que es un anticuerpo de IgG anti-CD22 humanizado (Immunomedics) ; ICM3 es un anticuerpo anti-ICAM3 humanizado (ICOS Pharm) ; IDEC-114 es un anticuerpo anti-CD80 de primate (IDEC Pharm/Mitsubishi ) ; ZEVALIN™ es un anticuerpo anti-CD20 humanizado radiomarcado (IDEC/Schering AG) ; IDEC-131 es un anticuerpo anti-CD40L humanizado (IDEC/Eisai) ; IDEC-151 es un anticuerpo anti-CD4 de primate (IDEC) ; IDEC-152 es un anticuerpo anti-CD23 de primate (IDEC/Seikagaku) ; SMART anti-CD3 es una IgG anti-CD3 humanizado (Protein Design Lab) ; 5G1.1 es un anticuerpo de factor 5 anti-complemento humanizado (CS) (Alexion Pharm) ; D2E7 es un anticuerpo anti-TNF-a humanizado (CATIBASF) ; CDP870 es un fragmento de Fab anti-TNF-a humanizado (Celltech) ; IDEC-151 es un anticuerpo de IgGl anti-CD4 de primate (IDEC Pharm/SmithKline Beecham) ; MDX-CD4 es un anticuerpo de IgG anti-CD4 humano (Medarex/Eisai/Genmab) ; CDP571 es un anticuerpo de IgG4 anti-TNF-a humanizado (Celltech) ; LDP-02 es un anticuerpo anti-c^7 humanizado (LeukoSite/Genentech) ; OrthoClone 0KT4A es un anticuerpo de IgG anti-CD4 humanizado (Ortho Biotech) ; A TOVA™ es un anticuerpo de IgG anti-CD40L humanizado (Biogen) ; A TEGREN™ es un anticuerpo de IgG anti-VLA-4 humanizado (Elan) ; CAT-152, un anticuerpo anti-TGF^2 humano (Cambridge Ab Tech) ; Cetuximab (BMS) es un anticuerpo de receptor anti-EGF monoclonal (EGFr) ; Bevacizuma (Genentech) es un anticuerpo monoclonal humano anti-VEGF; Infliximab (Centocore, JJ) es un anticuerpo monoclonal quimérico (de ratón y humano) usado para tratar trastornos autoinmunes ; Gemtuzumab ozogamicina (Wyeth) es un anticuerpo monoclonal usado para quimioterapia; y Ranibizumab (Genentech) es un anticuerpo monoclonal (de ratón y humano) usado para tratar la degeneración macular.

Otros anticuerpos, tales como los anticuerpos de dominio único son útiles en la presente invención. Un anticuerpo de dominio único (sdAb, denominado Nanocuerpo por Ablynx) es un fragmento de anticuerpo que comprende un dominio de anticuerpo variable monomérico único. Al igual que un anticuerpo entero, el sdAb se puede unir selectivamente a un antígeno específico. Con un peso molecular de solamente 12-15 kDa, los anticuerpos de dominio único son mucho más pequeños que los anticuerpos comunes (150-160 kDa) . Un anticuerpo de dominio único es una cadena de péptido de 110 aminoácidos de longitud, que comprende un dominio variable (VH) de un anticuerpo de cadena pesada, o de una IgG común.

A diferencia de los anticuerpos enteros, los sdAb no muestran citotoxicidad disparada al sistema de complemento porque carecen de una región de Fe. Los sdAb derivados de camélidos y de pescado pueden unirse a antígenos ocultos que no son accesibles a anticuerpos enteros, por ejemplo a los sitios activos de enzimas.

Un anticuerpo de dominio único (sdAb) se pueden obtener mediante la inmunización de dromedarios, camellos, llamas, alpacas o tiburones con el antígeno deseado y el posterior aislamiento del mARN que codifica anticuerpos de cadena pesada. Alternativamente, se puede fabricar tamizando bibliotecas sintéticas. Los camélidos son miembros de la familia biológica Camelidae, la única familia viva del suborden Tylopoda. Los camellos, dromedarios, camellos bactrianos, llamas, alpacas, vicuñas y guanacos pertenecen a este grupo .

Proteínas, Péptidos y Aminoácidos Las proteínas y péptidos para su uso en agentes bioactivos que se revelan en la presente se pueden producir mediante cualquier método útil que incluye la producción mediante la síntesis in vitro y mediante la producción en sistemas biológicos. Los ejemplos típicos de métodos de síntesis in vitro que son conocidos en el arte incluyen la síntesis de fase sólida ("SPPS") y condensación de fragmento de fase sólida ("SPFC"). Los sistemas biológicos usados para la producción de proteínas también son conocidos en el arte. Las bacterias (por ejemplo, E coli y Bacillus sp.) y levadura (por ejemplo, Saccharomyces cerevisiae y Pichia pastoris) se usan ampliamente para la producción de proteínas heterólogas . Además, la expresión de genes heterólogos para la producción de agentes bioactivos para su uso como se revela en la presente se puede lograr usando líneas de células de animales tales como las líneas de células de mamíferos (por ejemplo, células CHO) . En una realización particularmente útil, los agentes bioactivos se producen en animales transgénicos o clonados tales como vacas, ovejas, cabras y aves (por ejemplo, pollos, codornices, patos y pavos) , cada uno como se entiende en el arte. Véase, por ejemplo, la Patente Estadounidense N° 6.781.030, concedida el 24 de agosto de 2004, cuya invención se incorpora en la presente en su totalidad en la presente.

Los agentes bioactivos tales como las proteínas producidas en aves domesticadas tales como pollos se pueden denominar "derivados aviares" (por ejemplo, proteínas terapéuticas derivadas aviares) . La producción de proteínas terapéuticas derivadas aviares es conocida en el arte y se describe, por ejemplo, en la Patente Estadounidense N° 6.730.822, concedida el 4 de mayo de 2004, cuya invención se incorpora en su totalidad en al presente como referencia.

En realizaciones donde el agente bioactivo es una proteína o un polipéptido, los grupos funcionales presentes en los aminoácidos de la secuencia de polipéptido de proteína se pueden usar para unir el agente al polímero de alto peso molecular. Las ligaduras a agentes bioactivos de proteína o polipéptido se pueden fabricar para aminoácidos naturales en su secuencia o a aminoácidos naturales que se han agregado a la secuencia o insertado en el lugar de otro aminoácido, por ejemplo el reemplazo de una serina por una cisteína.

Los péptidos útiles en la presente invención también incluyen, en forma no taxativa, un péptido macrocíclico, una ciclotida, un aptámero, un dominio A de receptor de LDL, un andamio de proteína (discutido en la Patente Estadounidense Número 60/515.391), un receptor soluble, una enzima, un multímero de péptido, un multímero de dominio, un multímero de fragmento de anticuerpo y una proteína de fusión.

Los agentes bioactivos de proteína o polipéptido también pueden comprender aminoácidos no naturales además de los aminoácidos naturales comunes hallados en proteínas y polipéptidos . Además de estar presentes con el fin de alterar las propiedades de un polipéptido o una proteína, los aminoácidos no naturales se pueden introducir para proporcionar un grupo funcional que se puede usar para unir la proteína o el polipéptido directamente al polímero de alto peso molecular. Además, los aminoácidos naturales, por ejemplo, cisteína, tirosina, triptófano se pueden usar de esta manera.

Los aminoácidos no naturales se pueden introducir en proteínas y péptidos por una variedad de medios. Algunas de las técnicas para la introducción de aminoácidos no naturales se discuten en la Patente Estadounidense N° 5.162.218 y la Patente Estadounidense N° 20080214439, cuya invención se incorpora en su totalidad en la presente como referencia. En primer lugar, los aminoácidos no naturales se pueden introducir mediante la modificación química de un polipéptido o proteína sobre la cadena lateral del aminoácido o en el extremo de amino o el extremo de carboxilo. Ejemplos no taxativos de modificaciones químicas de una proteína o un péptido podrían ser la mutilación por los agentes tales como diazometano, o la introducción de acetilación en un grupo amino presente en la cadena lateral de lisina o en el extremo de amino de un péptido o una proteína. Otro ejemplo de la modificación del grupo amino de proteína/polipéptido para preparar un aminoácido no natural es el uso del éster de éster de 3 -mercaptopropionimidato de metilo o 2 - iminotiolano para introducir una funcionalidad que lleva un tiol (sulfhidrilo, -SH) unida a la posición en una proteína o un polipéptido que lleva una amina primaria. Una vez introducidos, dichos grupos se pueden emplear para formar una ligadura covalente a la proteína o al polipéptido .

En segundo lugar, los aminoácidos no naturales pueden introducirse en proteínas y polipéptidos durante la síntesis química. Los métodos sintéticos normalmente se utilizan para preparar polipéptidos que tienen menos de 200 aminoácidos, que habitualmente tienen menos de 150 aminoácidos y más habitualmente que tienen 100 o menos aminoácidos. Las proteínas o polipéptidos más cortos que tienen menos de 75 o menos de 50 aminoácidos se pueden preparar mediante síntesis química.

Los métodos de preparación sintéticos que son particularmente convenientes para permitir la inserción de aminoácidos no naturales en un lugar deseado son conocidos en el arte. Los métodos de preparación de polipéptidos sintéticos adecuados pueden estar basados en los métodos de síntesis de fase sólida de Merrifield donde los aminoácidos se agregan secuencialmente a una cadena creciente (Merrifield (1963) J. Am. Chem. Soc . 85:2149-2156). Los sistemas automáticos para sintetizar polipéptidos mediante dichas técnicas están ahora comercialmente disponibles en proveedores tales como Applied Biosystems, Inc., Foster City, Calif . 94404; New Brunswick Scientific, Edison, N.J. 08818; y Pharmacia, Inc., Biotechnology Group, Piscataway, N.J. 08854.

Ejemplos de aminoácidos no naturales que se pueden introducir durante la síntesis química de los polipéptidos incluyen, en forma no taxativa, D-aminoácidos y mezclas de las formas D y L de los 20 aminoácidos naturales, N-formil glicina, ornitina, norleucina, hidroxiprolina, beta-alanina, hidroxivalina, norvalina, fenilglicina, ciclohexilalanina, t-butilglicina (t-leucina, ácido 2-amino-3 , 3 -dimetilbutanoico) , hidroxi -t -butilglicina, ácido amino butírico, cicloleucina, 4 -hidroxiprolina, ácido piroglutámico (5-oxoprolina) , ácido azetidina carboxílico, ácido pipecolínico, ácido indolina-2 -carboxílico, ácido tetrahidro-3-isoquinolina carboxílico, ácido 2 , 4-diaminobutírico, ácido 2 , 6-diaminopimélico, ácido 2 , 4 -diaminobutírico, ácido 2 , 6-diaminopimélico, ácido 2 , 3 -diaminopropionico, 5-hidroxilisina, ácido neuramínico y 3 , 5-diiodotirosina .

En tercer lugar, los aminoácidos no naturales se pueden introducir a través de la síntesis biológica in vivo o in vitro mediante la inserción de un codón no sentido (por ejemplo, un codón ámbar u ocre) en una secuencia de ADN (por ejemplo, el gen) que codifica el polipéptido en el codón que corresponde a la posición donde no se inserta el aminoácido no natural . Dichas técnicas se discuten por ejemplo en las Patentes Estadounidenses N° 5.162.218 y 6.964.859, cuyas invenciones se incorporan en la presente como referencia en su totalidad en la presente como referencia. Se puede usar una variedad de métodos para insertar el codón mutante que incluye la mutagénesis dirigida al oligonucleótido . La secuencia alterada posteriormente se transcribe y se traduce, in vivo o in vitro, en un sistema que proporciona un tAR supresor, dirigido contra el codón sin sentido que se ha acilado en forma química o enzimática con el aminoácido no natural deseado. El aminoácido sintético se inserta en el lugar que corresponde al codón sin sentido. Para la preparación de polipéptidos de mayor tamaño y/o glicosilados , habitualmente se prefieren las técnicas de preparación recombinantes de este tipo. Entre los aminoácidos que se pueden introducir de esta forma están: formil glicina, fluoroalanina, ácido 2-amino-3-mercapto-3-metilbutanoico, homocisteína, homoarginina y similares. Otros enfoques similares para obtener aminoácidos no naturales en una proteína incluyen métodos de sustitución de metionina.

Cuando los aminoácidos no naturales tienen una funcionalidad que es susceptible de modificación selectiva, son particularmente útiles para formar una ligadura covalente a la proteína o al polipéptido. Las circunstancias en las cuales una funcionalidad es susceptible de la modificación selectiva incluyen en las cuales la funcionalidad es única o donde otras funcionalidades que podrían reaccionar en las condiciones de interés se impiden en forma estereoquímica o de otro modo.

Otros anticuerpos, tales como anticuerpos de dominio único son útiles en la presente invención. Un anticuerpo de dominio único (sdAb, denominado Nanocuerpo por Ablynx) es un fragmento de anticuerpo que consiste en un dominio de anticuerpo variable monomérico único. Al igual que un anticuerpo entero, el sdAb puede unirse selectivamente a un antígeno específico. Con un peso molecular de solamente 12 - 15 kDa, los anticuerpos de dominio único son mucho más pequeños que los anticuerpos enteros comunes (150-160 kDa) . Un anticuerpo de dominio único es una cadena de péptido de 110 aminoácidos de longitud, que comprende un dominio variable (VH) de un anticuerpo de cadena pesada, o de una IgG común .

A diferencia de los anticuerpos enteros, los sdAb no presentan una citotoxicidad disparada contra el sistema de complemento porque carecen de una región de Fe. Los sdAb derivados de camélidos y pescado pueden unirse a antígenos ocultos que no son susceptibles a los anticuerpos enteros, por ejemplo a sitios activos de enzimas.

Se puede obtener un anticuerpo de dominio único (sdAb) mediante inmunización de dromedarios, camellos, llamas, alpacas o tiburones con el antígeno deseado y el posterior aislamiento del mARN que codifica anticuerpos de cadena pesada. Alternativamente, se pueden fabricar tamizando bibliotecas sintéticas. Los camélidos son miembros de la familia biológica Camelidae, la única familia viva del suborden Tylopoda. Los camellos, dromedarios, Camellos bactrianos, llamas, alpacas, vicuñas y guanacos están en este grupo.

Los péptidos útiles en la presente invención también incluyen, en forma no taxativa, péptido macrocíclico, una ciclotida, un dominio A de receptor de LDL, un andamio de proteína (que se discute en la Patente Estadounidense Número 60/514.391, incorporada en la presente en su totalidad) , un receptor soluble, una enzima, un multímero de péptido, un multímero de dominio, un multímero de fragmento de anticuerpo y una proteína de fusión.

La invención también describe nuevas maneras de lograr arquitecturas de polímeros ramificados sobre una superficie bioactiva. El concepto es uno de "puntos de ramificación" o "puntos de unión próxima" sobre la molécula objetivo tal como para recrear un polímero de >2 ramas eficaz con polímeros unidos de =1 unidos a un sitio (s) localizado sobre una molécula blanco. En el arte previo, la PEGilación indiscriminada de una proteína con un reactivo no específico del sitio (por ejemplo, un reactivo de PEG con funcionalidad de NHS) derivaría en varios polímeros de PEG conjugados a varios grupos amina esparcidos a través de la proteína. Aquí, lo que se describe es preferentemente un enfoque de un paso en donde el agente blanco se modifica para colocar dos sitios de conjugación únicos (por ejemplo, aminoácidos de cisteína) de manera tal que una vez que se forma la estructura terciaria de la proteína o del péptido o agente, ambos sitios están en la proximidad uno de otro. Por lo tanto, el agente blanco modificado se usa en una reacción de conjugación con un polímero que contiene la composición química de conjugación correspondiente (por ejemplo, reactivo de tiol) . El resultado es un agente blanco único que se conjuga con dos polímeros e proximidad estrecha uno a otro, creando de ese modo un punto de ramificación o una "pseudo" rama. En otra realización, el agente blanco contendría un sitio único, por ejemplo, una cisteína libre y un agente de unión tri (hetero) funcional se emplearía para unir >2 polímeros lineales a este sitio único, creando nuevamente una "pseudo" rama.

Fármacos En otra realización, los agentes bioactivos también se pueden seleccionar de fármacos o agentes terapéuticos identificados específicamente, que incluyen en forma no taxativa: tacrina, memantina, rivastigmina, galantamina, donepezil, levetiracetam, repaglinida, atorvastatina, alefacept, tadalafil, vardenafil, sildenafil, fosamprenavir, oseltamivir, valacyclovir y valganciclovir, abarelix, adefovir, alfuzosina, alosetron, amifostina, amiodarona, ácido aminocaproico, aminohipurato de sodio, aminoglutetimida, ácido aminolevulínico, ácido aminosalicílico, amlodipina, amsacrina, anagrelida, anastrozol, aprepitant, aripiprazol, asparaginasa, atazanavir, atomoxetina, antraciclinas , bexaroteno, bicalutamida, bleomicina, bortezomib, buserelina, busulfán, cabergolina, capecitabina, carboplatino, carmustina, clorambucina, cilastatina de sodio, cisplatino, cladribina, clodronato, ciclofosfamida, ciproterona, citarabina, camptotecinas , ácido 13-cis retinoico, todos los ácidos trans retinoicos; dacarbazina, dactinomicina, daptomicina, daunorubicina , deferoxamina, dexametasona, diclofenac, dietilstilbestrol, docetaxel, doxorubicina, dutasterida, eletriptán, emtricitabina, enfuvirtida, eplerenona, epirubicina, estramustina, etinil estradiol, etopósido, exemestano, ezetimibe, fentanilo, fexofenadina, fludarabina, fludrocortisona, fluorouracilo, fluoximesterona, flutarnida, fluticazona, fondaparinux, fulvestrant, gamma-hidroxibutirato, gefitinib, gemcitabina, epinefrina, L-Dopa, hidroxiurea, icodextrina, idarubicina, ifosfamida, imatinib, irinotecan, itraconazol, goserelina, laronidasa, lansoprazol, letrozol, leucovorina, levamisol, lisinopril, lovotiroxina de sodio, lomustina, mecloretamina, medroxiprogesterona, megestrol, melfalán, memantina, mercaptopurina, mequinol, bitartrato de metaraminol, metotrexato, metoclopramida, mexiletina, miglustat, mitomicina, mitotano, mitoxantrona, modafinil, naloxona, naproxeno, nevirapina, nicotina, nilutamida, nitazoxanida, nitisinona, noretindrona, octreotida, oxaliplatino, palonosetrón, pamidronato, pemetrexed, pergolida, pentostatina, pilcamicina, porfímero, prednisona, procarbazina, proclorperazina, ondansetrón, palonosetrón, oxaliplatino, raltitrexed, rosuvastatina , sirolimus, estreptozocina, pimecrolimus , sertaconazol , tacrolimus, tamoxifeno, tegaserod, temozolomida, tenipósido, testosterona, tetrahidrocannabinol, talidomida, tioguanina, tiotepa, tiotropio, topiramato, topotecan, treprostinil , tretinoina, valdecoxib, celecoxib, rofecoxib, valrubicina, vinblastina, vincristina, vindesina, vinorelbina, voriconazol, dolasetrón, granisetrón, formoterol, fluticasona, leuprolide, midazolam, alprazolam, anfotericina B, podofilotoxinas , antivirales de nucleósidos, aroil hidrazonas, sumatriptan, eletriptan; macrólidos tales como eritromicina, oleandomicina, troleandomicina, roxitromicina, claritromicina, davercina, azitromicina, fluritromicina, diritromicina, josamicina, spiromicina, midecamicina, loratadina, desloratadina, leucomicina, miocamicina, rokitamicina, andazitromicina y swinolide A; fluoroquinolonas tales como ciprofloxacina, ofloxacina, levofloxacina, trovafloxacina, alatrofloxacina, moxifloxicina , norfloxacina, enoxacina, gatifloxacina, gemifloxacina, grepafloxacina, lomefloxacina, sparfloxacino, temafloxacina , pefloxacina, amifloxacina, fleroxacina, tosufloxacina, prulifloxacina, irloxacina, pazufloxacina , clinafloxacina y sitafloxacina; aminoglicósidos tales como gentamicina, netilmicina, paramecina, tobramicina, amikacina, kanamicina, neomicina y estreptomicina, vancomicina, teicoplanina, rampolanina, mideplanina, colistina, daptomicina, gramicidina, colistimetato ; polimixinas tales como polimixina B, capreomicina, bacitracina, penems; penicilinas que incluyen agentes sensibles a penicilinasa como penicilina G, penicilina V; agentes resistentes a penicilinasa como meticilina, oxacilina, cloxacilina, dicloxacilina, floxacilina, nafcilina; agentes activos de microorganismos gram negativos como ampicilina, amoxicilina y hetacilina, cilina y galampicilina; penicilinas antipseudomona como carbenicilina, ticarcilina, azlocilina, mezlocilina y piperacilina; cefalosporinas como cefpodoxima, cefprozil, ceftbuteno, ceftizoxima, ceftriaxona, cefalotina, cefapirina, cef lexina, cefradrina, cefoxitina, cefamandol, cefazolina, cefaloridina, cefaclor, cefadroxil, cefaloglicina, cefuroxima, ceforanida, cefotaxima, cefatrizina, cefacétrilo, cefepima, cefixima, cefonicid, cefoperazona, cefotetan, cefmetazol, ceftazidima, loracarbef y moxalactam, monobactam como aztreonam; y carbapenem tales como imipenem, meropenem y ertapenem, isetionato de pentamidina, sulfato de albuterol , lidocaína, sulfato de metaproterenol , dipropionato de beclometasona, triamcinolona acetamida, budesonida acetonida, salmeterol, bromuro de ipratropio, flunisolida, cromolina de sodio y tartrato de ergotamina; taxanos tales como paclitaxel; SN-38 y tirfostinas. Los agentes bioactivos también se pueden seleccionar del grupo fomrado por aminohipurato de sodio, anfotericina B, doxorubicina, ácido aminocaproico, ácido aminolevulínico, ácido arninosalicílico, bitartrato de metaraminol , pamidronato de disodio, daunorubicina, levotiroxina de sodio, lisinopril, cilastatina de sodio, mexiletina, cefalexina, deferoxamina y amifostina en otra realización.

Otros agentes bioactivos útiles en la presente invención incluyen agentes dirigidos a la matriz extracelular, grupos de transporte funcionales y agentes marcadores. Los agentes dirigidos a la matriz extracelular incluyen, en forma no taxativa, grupos de unión a heparina, grupos de unión de la metaloproteinasa de la matriz, dominios de unión a lisil oxidasa, grupos de carga negativa o grupos de carga positiva y ácido hialurónico. Los grupos de transporte funcionales incluyen, en forma no taxativa, grupos de transporte de la barrera hematoencefálica, grupos de transporte intracelular, grupos de transporte de organelos, dominios de transporte epitelial y grupos dirigidos al tumor (folato, otro) . En algunas realizaciones, los agentes dirigidos a un blanco útiles en la presente invención se dirigen a anti-TrkA, anti A-beta (péptido 1-40, péptido 1-42, forma monomérica, forma oligomérica) , anti-IGFl-4, RA K-L de agonista, anti-ApoE4 o anti-ApoAl, entre otros.

Agentes de Diagnóstico Los agentes de diagnóstico útiles en los polímeros de alto peso molecular de la presente invención incluyen agentes de formación 5 de imágenes y agentes de detección tales como radiomarcadores , fluoróforos, colorantes y agentes de contraste.

El agente de formación de imágenes se refiere a un marcador que L0 se une al polímero de alto peso molecular de la presente invención para formar imágenes de un tumor, órgano o tejido de un sujeto. El grupo que forma imágenes se puede unir en forma covalente o no covalente al polímero de alto peso molecular. Ejemplos de grupos que forman imágenes para su uso en la presente ^5 invención incluyen, en forma no taxativa, radionucleótidos , fluoróforos tales como fluoresceína, rodamina, Rojo Texas, Cy2 , Cy3 , Cy5, Cy5.5, Cy7 y la gama de AlexaFluor (Invitrogen, Carlsbad, CA) de fluoróforos, anticuerpos, gadolinio, oro, nanomateriales, peroxidada de rábano picante, fosfatasa alcalina, 20 derivados de ellos y mezclas de ellos.

Por radiomarcador se entiende un nucleido que presenta radioactividad. Un "nucleido" se refiere a un tipo de átomo especificado por su número atómico, masa atómica y estado de energía, tal como carbono 14 ( C) . "Radioactividad" se refiere a la radiación, que incluye partículas alfa, partículas beta, nucleones, electrones, positrones, neutrinos y rayos gamma, emitidos por una sustancia radiactiva. Los radionucleidos adecuados para su uso en la presente invención incluyen, en forma no taxativa, flúor 18 (18F) , fósforo 32 (32P) , escandio 47 (4Sc) , cobalto 55 (55Co) , cobre 60 (60Cu) , cobre 61 (61Cu) , cobre 62 (62Cu) , cobre 64 (64Cu) , galio 66 (66Ga) , cobre 67 (67Cu) , galio 67 (67Ga) , galio 68 (68Ga) , rubidio 82 (82Rb) , itrio 86 (86Y) , itrio 87 (87Y) , estroncio 89 (89Sr) , itrio 90 (90Y) , rodio 105 (105Rh) , plasta 111 (llxAg) , indio 111 (luIn) , yodo 124 (124I) , yodo 125 (125I), yodo 131 (131I), estaño 117m (117mSn) , tecnecio 99m (99mTc) , prometió 149 (149Pm) , samario 153 (153Sm) , holmio 166 (166Ho) , lutecio 177 (177Lu) , renio 186 (186Re) , renio 188 (188Re) , talio 201 (201T1), astatina 211 (211At) y bismuto 212 ( 12Bi) . Como se usa en la presente la "m" en 117mSn y 99mTc significa el estado meta. Además, los elementos radioactivos naturales tales como uranio, radio y torio, que normalmente representan mezclas de radioisótopos, son ejemplos de radionucleidos adecuados. 67Cu, 131I, 1 7Lu y 186Re son radionucleidos que emiten radiación beta y gamma. 212Bi es un radionucleido que emite radiación alfa y beta. 211At es radionucleido que emite radiación alfa. 32P, 47Sc, 89Sr, 90Y, 105Rh, ulAg, 117mSn, 1 9Pm, 153Sm, 166Ho y 188Re son ejemplos de radionucleidos que emiten radiación beta. 67Ga, luIn, 99mTc y 201t? son ejemplos de radionucleidos que emiten radiación gamma. 55Co, 60Cu, 61Cu, 62Cu, 66Ga, 68Ga, 82Rb y 86Y son ejemplos de radionucleidos que emiten positrones. 6Cu es un radionucleido que emite radiación beta y positrones. Los agentes de formación de imágenes y de detección también se pueden diseñar en el polímero de la invención a través del agregado de isótopos naturales tales como deuterio, 13C o 15N durante la síntesis del iniciador, los ligadores, los grupos de unión y comonómeros .

Los agentes de contraste útiles en la presente invención incluyen, en forma no taxativa, agentes de contraste basados en gadolinio, agentes de contraste basados en hierro, agentes de contraste basados en yodo, sulfato de bario, entre otros. Uno experto en el arte apreciará que otros agentes de contraste son útiles en la presente invención.

Nanopartículas Los agentes funcionales también pueden incluir nanopartículas. Las nanopartículas útiles en la presente invención incluyen partículas que tienen un tamaño en la gama de 1 a 1000 nm. las nanopartículas pueden ser perlas, partículas metálicas o pueden en algunos casos ser micelas y en otros casos pueden ser liposomas. Otras nanopartículas incluyen nanotúbulos de carbono, puntos cuánticos y oro coloidal. Las nanopartículas pueden estar empaquetadas con agentes de diagnóstico y/o terapéuticos.

Los expertos en el arte también reconocerán que la invención se puede usar para permitir la detección coincidente de más de un agente del mismo tipo o de un tipo diferente. Además, el uso de composiciones químicas de ligadores flexibles también se puede usar para demostrar la pérdida de un marcador fluorescente, por ejemplo, cuando se capta la molécula dentro de la célula en un medio de bajo pH.

Conjugados Los polímeros de la presente invención se pueden unir a una variedad de agentes funcionales descritos anteriormente para formar un conjugado. En algunas realizaciones, la presente invención proporciona un conjugado que incluye por lo menos un polímero que tiene una rama polimérica que tiene una pluralidad de monómeros seleccionados cada uno independientemente del grupo formado por acrilato, metacrilato, acrilamida, metacrilamida, estireno, vinil-piridina, vinil-pirrolidona y ásteres de vinilo tales como acetato de vinilo, en donde cada monómero incluye un grupo hidrófilo, un fragmento de iniciador unido a un extremo próximo de la rama polimérica, en donde el grupo iniciador es adecuado para la polimerización de radicales y un grupo de extremo unido a un extremo distal de la rama polimérica. El conjugado de la presente invención también incluye por lo menos un agente funcional que tiene un agente bioactivo o un agente de diagnóstico, unido al fragmento de iniciador o el grupo de extremo .

Los agentes bioactivos del conjugado de la presente invención pueden incluir un fármaco, un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, un anticuerpo de dominio único, un avimer, una adnectina, diacuerpos, una vitamina, un cofactor, un polisacárido, un carbohidrato, un esteroide, un lípido, una grasa, una proteína, un péptido, un polipéptido, un nucleótido, un oligonucleótido, un polinucleótido, o un ácido nucleico. El agente de diagnóstico del conjugado puede ser un radiomarcador, un agente de contraste, un fluoróforo o un colorante. En algunas realizaciones, por lo menos dos polímeros están unidos al agente funcional. En algunas realizaciones, por lo menos dos polímeros están unidos al agente funcional a través de un grupo reactivo sobre el agente funcional para crear una estructura pseudo-ramificada. En otras realizaciones, el conjugado incluye por lo menos dos agentes funcionales unidos al polímero.

IV. Preparación de polímeros de alto peso molecular que contienen un zwiterión/fosforilo Los polímeros de alto peso molecular de la presente invención se pueden preparar por cualquier medio conocido en el arte. En algunas realizaciones, la presente invención proporciona un proceso para preparar un polímero de alto peso molecular de la presente invención, el proceso incluye el paso de poner una mezcla de un primer monómero y un segundo monómero con un iniciador, I1, en condiciones suficientes para preparar un polímero de alto peso molecular a través de la polimerización de radicales libres, en donde el primer monómero comprende una fosforilcolina y cada uno del segundo monómero y el iniciador independientemente comprende por lo menos uno de un agente funcional o un grupo de unión para la unión al agente funcional.

La mezcla para preparar los polímeros de alto peso molecular de la presente invención puede incluir una variedad de otros componentes. Por ejemplo, la mezcla también puede incluir un catalizador, un ligando, un solvente y otros aditivos. En algunas realizaciones, la mezcla también incluye un catalizador y un ligando. Los catalizadores y los ligandos se describen más detalladamente a continuación.

Todos los monómeros adecuados se pueden usar en el proceso de la presente invención, tal como aquellos descritos anteriormente. Los polímeros de alto peso molecular de la presente invención se pueden preparar mediante cualquier método de polimerización adecuado, tal como la polimerización de radicales vivos. La polimerización de radicales vivos, discutida por Odian, G. en Principios de Polimerización, 4a, iley- Interscience John iley & Sons: Nueva York, 2004 y aplicada a polímeros zwiteriónicos por ejemplo en US 6.852.816. Se emplean varias metodologías de polimerización de radicales libres, que incluyen Polimerización de Radicales Libres Estables (SFRP) , Transferencia de Fragmentación por Agregado de Radicales (RAFT) y Polimerización Mediada por Nitróxido (NMP) . Además, la Polimerización de Radicales por Transferencia de Átomos (ATRP) , proporciona un método covalente para la preparación de los polímeros de alto peso molecular de la invención.

La preparación de polímeros a través mediante ATRP consiste en la polimerización de radicales de monómeros que empiezan con un iniciador que lleva uno o más halógenos. El iniciador halogenado está activado por un catalizador (o una mezcla de catalizadores cuando se emplea CuBr2) tal como una sal de metal de transición (CuBr) que se puede solubilizar por un ligando (por ejemplo, bipiridina o PMDETA) . La polimerización por RAFT usa compuestos tiocarboniltio, tales como ditioésteres , ditiocarbonatos , tritiocarbonatos y xantatos, para mediar el proceso de polimerización a través de un proceso de transferencia de cadena reversible. Otros procesos de radicales "vivos" o controlados útiles en la preparación de los copolímeros aleatorios de la invención incluyen N P. 5 Iniciadores Los iniciadores útiles para la preparación del polímero de alto ?0 peso molecular de la presente invención incluyen cualquier iniciador adecuado para la polimerización a través de la polimerización de radicales. En algunas realizaciones, los iniciadores son adecuados para la polimerización de radicales de transferencia de átomos (ATRP) , tales como aquellos descritos ^5 anteriormente. Otros iniciadores útiles incluyen aquellos para la polimerización de radicalea mediada por nitróxido (NMP) , o polimerización por agregado- fragmentación-terminación reversible (RAFT o MADIX) . Se pueden usar aún otras técnicas para controlar un proceso de polimerización de radicales libres, tales como el 20 uso de iniferters, transferencia degenerativa o proceso de tolmerización . Además, los iniciadores útiles en la presente invención incluyen aquellos que tienen por lo menos un punto de ramificación, tal como aquellos descritos anteriormente. En otra realización, los iniciadores son útiles para la polimerización 1 controlada de radicales.

Los polímeros de alto peso molecular de la presente invención que tienen arquitecturas complejas que incluyen compuestos ramificados que tienen varias ramas que incluyen, en forma no taxativa, estructuras de peine y estrella. Las arquitecturas de peines se pueden lograr empleando iniciadores lineales que llevan tres o más átomos de halógeno, preferentemente los halógenos son átomos de cloro, bromo o yodo, más preferentemente los átomos de halógenos son cloro o bromo. Las arquitecturas de estrellas también se pueden preparar empleando compuestos que llevan varios halógenos sobre un átomo de carbono único, o moléculas cíclicas que llevan varios halógenos. En algunas realizaciones, los compuestos que tienen una arquitectura de estrella tienen 3 ramas poliméricas y en otras realizaciones tienen 4 ramas poliméricas. Véanse los iniciadores descritos anteriormente.

Catalizadores y Ligandos Los catalizadores para su uso en polimerizaciones por ATRP o por transferencia de radicales de grupos pueden incluir sales adecuadas de Cu1+, Cu2+, Fe2+, Fe3+, Ru2+, Ru. 3+, Cr2+, Cr3+, Mo2+, Mo. 3+, W+, W3+, Mn2+, Mn2+, Mn+, Rh3*, Rh4+, Re2+, Re3+, Co1+, Co . 2+, Co3+, V2+, V3\ Zn. 1+, Zn+, Ni2+, Ni3+, Au1+, Au\ Ag1+ y Ag2+. Las sales adecuadas incluyen, en forma no taxativa: halógeno, alcoxi de Ci - C6-/ sulfatos, fosfato, triflato, hexafluorofosfato, metanosulfonato, sales de arilsulfonato . En algunas realizaciones, el catalizador es un cloruro, sales de bromuro de los iones de metales citados anteriormente. En otras realizaciones, el catalizador es CuBr, CuCl o RuCl2.

En algunas realizaciones, el uso de uno o más fragmentos para solubilizar los catalizadores de metales de transición es deseable. Los ligandos adecuados son habitualmente útiles en combinación con una variedad de catalizadores de metales de transición que incluyen cloruro o bromuro de cobre, o sales de metal de transición de cloruro de rutenio forman parte del catalizador. La elección de un ligando afecta la función del catalizador como ligandos no solamente contribuye a solubilizar los catalizadores de metal de transición en medios de reacción orgánicos, sino que también ajustan su potencial de reducción y oxidación. La selección de un ligando también está basada en la solubilidad y la capacidad de separación del catalizador de la mezcla de producto. Cuando la polimerización se debe realizar en un ligando/catalizador soluble de fase líquida son generalmente deseables aunque se pueden emplear catalizadores inmovilizados. Los ligandos adecuados incluyen aquellos grupos piridilo (que incluyen alquil piridinas, por ejemplo, 4.4. dialquil-2 , 2 ' bipiridinas) y grupos piridilo que llevan un grupo imino alquil sustituido, cuando están presentes, grupos alquilo más largos proporcionan solubilidad en mezclas y medios de solventes menos polares. Trifenil fosfinas y otros ligandos de fósforo, además de indanilo, o ligandos de ciclopentadienilo, también se pueden emplear con catalizadores de metales de transición (por ejemplo, complejos de haluro de Ru+2 o haluro de Fe+2 con trifenilfosfina, indanilo o ligandos de ciclopentadienilo) .

Una cantidad aproximadamente estequiometrico de compuesto metal y ligando en el catalizador, basado en las relaciones molares de los componentes cuando el ion metal forma un complejo completo, se emplea en algunas realizaciones. En otras realizaciones, la relación entre el compuesto metal y el ligando está en la gama de 1: (0,5 a 2) o en la gama 1:(0,8 a 1,25).

Generalmente, cuando el catalizador es cobre, los ligandos de nitrógeno de bidentato o multidentanto producen catalizadores más activos. Además, los ligandos en puente o cíclicos y las poliaminas alifáticas ramificadas proporcionan catalizadores más activos que los ligandos lineales simples. Cuando el contra ion es bromo, se necesitan ligandos de bidentato o medio tetradentato por cada Cu+1. Cuando se emplean contra iones más complejos, tales como triflato o hexafluorofosfato, se pueden emplear dos bidentato o ligando de un tetradentato . El agregado de cobre metálico puede ser ventajoso en algunas realizaciones particularmente cuando se desea una polimerización más rápida como cobre metálico y Cu+2 puede experimentar una reacción de reducción y oxidación desde Cu+1. El agregado de algunos Cu+2 al comienzo de algunas reacciones de ATRP se puede emplear para reducir la cantidad de finalización normal.

En algunas realizaciones, la cantidad de catalizador empleada en las reacciones de polimerización es el equivalente molar del iniciador que está presente. Dado que el catalizador no se consume en la reacción, sin embargo, no es esencial para incluir una cantidad de catalizador tan alta como del iniciador. La relación del catalizador con cada halógeno contenido en el iniciador, basado en el compuesto metal de transición en algunas realizaciones es de 1: (1 a 50), en otras realizaciones de 1: (1 a 10), en otra realización de 1:(1 a 5) y en otras realizaciones de 1:1.

Condiciones de Polimerización En algunas realizaciones, el proceso de polimerización de radicales vivos de la invención preferentemente se realiza para lograr un nivel de polimerización en la gama de 3 a 2000 y en otras realizaciones de 5 a 500. El nivel de polimerización en otras realizaciones está en la gama de 10 a 100, o alternativamente en la gama de 10 a 50. El nivel de polimerización en la técnica de polimerización de radicales de transferencia de grupos o átomos, está directamente relacionado con la relación inicial de iniciador a monómero. En consecuencia, en algunas realizaciones las relaciones iniciales del iniciador al monómero están en la gama de 1 : (3 a 2.000) o de 1: (5 a 500) , o de 1: (10 a 100) o de 1: (10 a 50) .

Las reacciones de polimerización normalmente se llevan a cabo en la fase líquida, empleando una solución homogénea única. La reacción puede, sin embargo, ser heterogénea que comprende una fase sólida y una fase líquida (por ejemplo, una suspensión o emulsión acuosa) . En aquellas realizaciones donde se emplea un solvente no polimerizable , el solvente empleado se selecciona tomando en consideración el carácter del monómero zwiteriónico el iniciador, el catalizador y el ligando y además, todos los comonomeros que se pueden emplear.

El solvente puede comprender un compuesto único o una mezcla de compuestos. En algunas realizaciones el solvente es agua y en otras realizaciones el agua está presente en una cantidad del 10% al 100% en peso, basado en el peso de los monómeros presentes en la reacción. En aquellas realizaciones en las cuales un comonómero insoluble en agua se debe polimerizar con un monómero zwiteriónico, puede ser deseable emplear un solvente o cosolvente (en conjunto con el agua) que permite la solubilizacion de todos los monómeros presentes. Los solventes orgánicos adecuados incluyen, en forma no taxativa, formamidas (por ejemplo, ?,?'-dimetilformamida) , éteres (por ejemplo, tetrahidrofurano) , ésteres (acetato de etilo) y, más preferentemente, alcoholes. En algunas realizaciones en las cuales se debe emplear una mezcla de agua y solvente orgánico, alcoholes de alquilo miscibles con agua de C1-C4 (metanol, etanol, propanol, isopropanol, butanol, isobutanol y tercbutanol) son solventes orgánicos útiles. En otras realizaciones, las combinaciones de agua y metanol son adecuadas para realizar reacciones de polimerización. La reacción también se puede realizar en solventes supercríticos tales como C02.

Como se indicó anteriormente, en algunas realizaciones, es deseable incluir agua en la mezcla de polimerización en una cantidad desde el 10% hasta el 100% en peso basado en el peso de los monómeros que se deben polimerizar. En otras realizaciones, el solvente no polimerizable total es del 1% al 500% en peso, basado en el peso del monómero presente en la mezcla de la reacción. En otras realizaciones, el solvente no polimerizable total es del 10% al 500% en peso o alternativamente del 20% al 400%, basado en el peso de los monómeros presentes en la mezcla de la reacción. También es deseable en algunos casos manipular la solubilidad de un reactivo de entrada, tales como el iniciador o el monómero, por ejemplo, modificando la temperatura o el solvente u otro método de manera tal que se modifiquen las condiciones de la reacción en una forma dinámica.

En algunas realizaciones, el tiempo de contacto del monómero zwiterionico y el agua antes del contacto con el iniciador y el catalizador se mantienen formando una premezcla que comprende todos los componentes diferentes del monómero zwiterionico y para el monómero zwiterionico que se debe agregar a la premezcla en último lugar.

Las reacciones de polimerización se pueden realizar a cualquier temperatura adecuada. En algunas realizaciones la temperatura puede ser desde la temperatura ambiente (temperatura ambiente) hasta 120 °C. En otras realizaciones las polimerizaciones se pueden realizar a una temperatura elevada desde la temperatura ambiente en la gama de 60°C a 80°C. En otras realizaciones, la reacción se realiza a temperatura ambiente (temperatura ambiente) .

En algunas realizaciones, los compuestos de la invención tienen una polidispersidad (de peso molecular) inferior a 1,5, juzgada mediante cromatografía de penetración de gel . En otras realizaciones las polidispersidades pueden estar en la gama de 1,2 a 1,4. En aún otras realizaciones, las polidispersidades pueden ser inferiores a 1,2.

Se pueden usar numerosos procedimientos para purificar el polímero de interés tal como precipitación, fraccionamiento, reprecipitación, separación de membranas y secado por congelamiento de los polímeros.

Extremo de Polímero No Halogenado En algunas realizaciones, puede ser deseable reemplazar el halógeno, u otro fragmento de iniciador I' , con otra funcionalidad. Se puede emplear una variedad de reacciones para la conversión del halógeno alifático. En algunas realizaciones, la conversión de los halógenos alifáticos puede incluir una reacción para preparar un grupo alquilo, alcoxi, cicloalquilo, arilo, heteroarilo o hidroxi . Los halógenos también pueden estar sujetos a una reacción de eliminación para dar origen a un alqueno (enlace doble) . Otros métodos de modificación del extremo halogenado se describen en Matyj aszewski et al. Prog. Polym. Sci. 2001, 26, 337, que se incorpora como referencia en su totalidad en la presente.

Unión de agentes funcionales El acoplamiento de agentes funcionales a polímeros de alto peso molecular de la presente invención se puede realizar empleando condiciones químicas y reactivos aplicables a las reacciones que se están realizando. Ejemplos de métodos se describen en Bertozzi et al. Angewandte Chemie 2009, 48, 6974, y Gauthier et al. Chem. Commun. 2008, 2591, cada uno de los cuales se incorpora como referencia en su totalidad en la presente.

Cuando, por ejemplo, el acoplamiento necesita la formación de un éster o una amida, la reacción de deshidratación entre un ácido carboxílico y un alcohol o una amina puede emplear un gente de deshidratación (por ejemplo, una carbodiimida tal como diciclohexilcarbodiimida, DCC, o el agonista soluble en agua clorhidrato de l-etil-3- (3-dimetilaminopropil) carbodiimida, EDC) . Alternativamente, se pueden emplear esteres de N-hidroxisuccinimida (NHS) para preparar amidas. La reacción para preparar amidas empleando esteres de NHS normalmente se termina cerca del pH neutro en fosfato, bicarbonato, borato, HEPES u otros tampones que no contienen amina a una temperatura de 4o a 25°C. En algunas realizaciones, se pueden emplear reacciones que emplean EDC como un agente de deshidratación, un pH de 4,5-7,5; en otras realizaciones, se puede emplear un pH de 4,5 a 5.

Los grupos tiol pueden reaccionar en una variedad de condiciones para preparar diferentes productos. Cuando reacciona un tiol con una maleimida para formar un enlace de tioéter, la reacción normalmente se realiza a un pH de 6,5-7,5. se puede enfriar exceso de grupos maleimida agregando reactivos de tiol libres tales como mercaptoetanol . Cuando los enlaces de disulfuro están presentes como una ligadura, se pueden preparar mediante intercambio de tiol-disulfuro entre un sulfhidrilo presente en el grupo bioactivo y una funcionalidad de X que es un disulfuro tal como un disulfuro de piridilo. Las reacciones que consisten en disulfuros de piridilo se pueden realizar a pH 4 - pH 5 · y la reacción puede mantenerse a 343 nm para detectar la piridina-2-tiona liberada. Los grupos tiol también pueden reaccionar con epóxidos en solución acuosa para producir hidroxi tioéteres. Un tiol también puede reaccionar a pH ligeramente alcalino con un haloacetato tal como yodoacetato para formar un enlace de tioéter .

La reacción de grupos guanido (por ejemplo, aquellos de una arginina en una proteína o polipéptido de interés) con glioxal es puede realizar a pH 7,0-8,0. La reacción normalmente avanza a 25°C. El derivado, que contiene dos grupos fenilglioxal por cada grupo guanido, es más estable en condiciones levemente ácidas (por debajo de pH 4) que a pH neutro o alcalino y permite el aislamiento de los materiales unidos a valores de pH neutro o alcalino, la ligadura se descompone lentamente. Cuando un residuo orgánico de una proteína o un polipéptido reacciona con un reactivo de fenilglioxal, un 80% de la ligadura se hidroxila para regenerar el residuo de arginina original (en la ausencia del reactivo en exceso) en aproximadamente 48 horas a 37°C a pH 7.

Las reacciones de imidoéster con aminas normalmente se realizan a pH 8-10 y preferentemente a pH 10. La ligadura de amidina formada a partir de la reacción de un imidoéster con una amina es reversible, particularmente a pH alto.

Los haloacetales pueden reaccionar con grupos sulfhidrilo en una gama de pH amplia. Para evitar reacciones colaterales entre los residuos de histidina que pueden ser de interés, particularmente donde el grupo sulfhidrilo está presente sobre una proteína o polipéptido, la reacción se puede realizar a pH 8,3.

Los aldehidos pueden reaccionar con aminas en una variedad de condiciones, para formar iminas . Cuando el aldehido o la amina están inmediatamente unidos a un grupo arilo el producto es una base de Schiff que tiende a ser más estable que cuando no está presente ningún grupo arilo. Las condiciones para la reacción de aminas con aldehidos para formar un enlace de imina incluyen el uso de un pH básico de pH 9 a pH 11 y una temperatura desde 0°C hasta la temperatura ambiente, durante 1 a 24 horas. Alternativamente, cuando se desea el acoplamiento preferido a la amina de extremo de N de una proteína, se pueden emplear pH más bajos desde 4-7. Los tampones que incluyen borohidruro y amina terciaria que contienen tampones suelen emplearse para la preparación de iminas . Cuando se desean conjugados de iminas, que son susceptibles en forma hidrolítica, se pueden reducir para formar un enlace de amina que no es hidrolíticamente susceptible. La reducción se puede realizar con una variedad de agentes de reducción adecuados que incluyen borohidruro de sodio o cianoborohidruro de sodio.

Las condiciones de la reacción proporcionadas anteriormente proveen una guía general para el experto en el arte. El experto en el arte reconocerá que las condiciones de la reacción se pueden variar según sea necesario para promover la unión del agente funcional a los polímeros de alto peso molecular de la presente invención y esa guía para la modificación de las reacciones se puede obtener de textos estándar de la química orgánica. Otras guías se pueden obtener de textos tales como Wong, S.S., "Química de Conjugación de Proteínas y Reticulación," (CRC Press 1991), que discuten reacciones químicas relacionadas. Se han mostrado diferentes proteínas recombinantes para conjugar exitosamente a una amplia variedad de polímeros de la presente invención de diferentes tamaños y arquitecturas a través de diferentes composiciones químicas de conjugación. Se han aprendido muchas lecciones durante el transcurso de los esfuerzos e desarrollo del proceso (conjugación, procesamiento corriente abajo, desarrollo analítico) y algunas características únicas de la tecnología se describen a continuación. El conjugado se refiere exclusivamente a la proteína u otro s agentes terapéuticos conjugados en forma covalente a los polímeros de la presente invención.

En el área de las reacciones de conjugación, las bajas relaciones de exceso molar de polímero de 1 - 2 veces son útiles para obtener una buena eficiencia de conjugación. Para lograr el exceso molar y aún mantener la buena eficiencia de conjugación (>20%) , la concentración de la proteína debe ser mucho más alta que la concentración normalmente aceptable de 1 - 2 mg/ml . La concentración que es puede lograr para cualquier proteína particular y depende de la estabilidad y las propiedades biofísicas de esa proteína. Ejemplos de gamas incluyen 5 - 10 mg/ml, 10 - 15 mg/ml, 15 - 20 mg/ml, 20 - 25 mg/ml, 25 - 30 mg/ml, 30 - 50 mg/ml, 50 - 100 mg/mL, >100 mg/ml .

Del otro lado de la reacción, también es necesario que el principal desafío es la concentración del polímero sea a un nivel muy alto para las eficiencias óptimas, una concentración normal que es superior a 100 m/ml . Es interesante que los polímeros de la invención demuestran una solubilidad extrema con baja viscosidad aún a concentraciones superiores a 500 mg/ml. Esta característica hace posible manipular la reacción de conjugación tal como mezclando muy fácilmente mientras que con otros polímeros tales como PEG a dicha concentración la solución es demasiado viscosa para ser manipulada. El uso de una variedad de dispositivos para mezclar más mejora el proceso. Por ejemplo, se puede usar un baño ultrasónico con control de temperatura para la mezcla inicial para facilitar la solubilizacion de polímeros y a su vez mejorar la eficiencia de conjugación. Dispositivos ultrasónicos alternativos tales como VialTweeter de HielscherUltrasonic GmbH mejoran la eficiencia con la cual se administra la energía ultrasónica comparada con el baño ultrasónico. Desde un punto de vista teórico, la onda ultrasónica crea una onda de oscilación que facilita la interacción entre el polímero y la proteína. Esto se traduce en una eficiencia de conjugación más alta y mejor. El agregado de un mecanismo de temperatura controlada tal como un sistema de refrigeración protege a las proteínas lábiles al calor de este sistema. Para aumentar tal proceso a gran escala industrial (por ejemplo, kilogramo o escala superior) , otra instrumentación tal como la tecnología de mezcla acústica resonante desarrollada por Resodyn es útil. De hecho, este tipo de mezclador se ha usado exitosamente para solubilizar polímeros y fluidos altamente viscosos con una viscosidad superior a 1.000 cP. Los polímeros de esta invención a la concentración práctica más alta son solamente una fracción de dicho nivel de viscosidad y en consecuencia hacer a la tecnología de mezcla acústica resonante particularmente atractiva. Otras ventajas de dicha tecnología incluyen el carácter no invasivo y totalmente ocultable así como el tiempo de mezcla rápido. Estas propiedades la hacen altamente deseable para los productos farmacéuticos de proteínas en general y para la combinación con la tecnología de esta invención específicamente.

Los subproductos de la conjugación poli-PEGilados indeseables han sido durante mucho tiempo un problema en la industria que aumenta el costo de los productos durante la fabricación mientras que también aumenta la complejidad regulatoria y los obstáculos para la aprobación de los productos. Es interesante que muchos conjugados purificados diferentes derivados de todos los polímeros de esta invención y que se han ensayado siempre derivan en una relación molar igual entre la proteína y el polímero. Esta es una característica única y altamente deseable comparada con otros polímeros y tecnologías de conjugación.

En el área del procesamiento corriente abajo, que se describió previamente, los polímeros preferidos de esta invención tienen una carga neta neutra debido a su naturaleza zwiteriónica . En consecuencia no interactúan con resinas de intercambio de iones aniones o cationes en ninguna condición cromatográfica que incluye amplias gamas de pH y resistencia iónica. En Otras palabras, el polímero libre fluye a través de cualquier intercambiador de iones independientemente del pH y de la resistencia iónica. Sin embargo, después de la conjugación a diferentes proteínas, el comportamiento cromatográfico del conjugado está regido por la proteína. Debido a la presencia del efecto de protección de polímeros y a la carga alterada de la proteína durante la composición química de conjugación, la interacción del conjugado con la resina de intercambio de iones se debilita comparada con la proteína nativa. Esta propiedad se observa para proteínas básicas y ácidas que interactúan con resinas de intercambio de cationes y aniones, respectivamente. También hay propiedades altamente deseables desde el punto de vista de la fabricación ya que permiten el diseño de un método de purificación altamente eficiente, simple, eficaz en costo y ortogonal para la separación del conjugado de los contaminantes relacionados con el producto que incluyen: polímero libre no reactivo, proteínas y agregados libres sin reaccionar; y contaminantes del proceso tales como endotoxinas, reactivos y aditivos de conjugación. Es suficiente un solo paso de cromatografía de intercambio de iones.

Por ejemplo, para un conjugado de proteínas ácidas donde la reacción de conjugación se realiza a una baja resistencia iónica (por ejemplo, 0-20 mM NaCl) con un pH del tampón más alto que el pH del la proteína, después de finalizar la reacción de conjugación, el contenido del recipiente de la reacción de conjugación se puede aplicar directamente sobre la resina de intecambiador de aniones (por ejemplo, resina de IEX de tipo Q) donde el polímero libre sin reaccionar fluye a través de la resina, la columna entonces puede seguirse y lavarse con un tampón de baja resistencia iónica al mismo pH en forma similar a la reacción de conjugación. La fracción unida luego se puede eluir paso a paso aumentando la concentración de la sal . La primera fracción de proteína es el conjugado puro ya que se une en forma más débil a la resina de intercambio de iones comparada con la proteína nativa y otros contaminantes tales como agregados y endotoxina. Un gradiente de paso es altamente deseable ya que esto minimiza el riesgo potencial de que la proteína nativa se lixivie desde la columna. Por ejemplo, usando una resina de intercambio de aniones fuerte, un conjugado de polímero de citoquina eluye alrededor de 30-60 mM NaCl a pH 7 mientras que la citoquina nativa no eluye hasta 100 mM o más; en estas condiciones, la forma dimérica y agregada de la citoquina normalmente eluye a 200 mM NaCl o más; y finalmente la endotoxina eluye a una concentración de sal aún más alta.

Para un conjugado de proteína básico, la separación se realiza usando un intercambio de cationes (por ejemplo, resina IEX de tipo SP) a una resistencia de iones baja (por ejemplo, 0-2 mM NaCl) con un pH del tampón más bajo que el pH de la proteína. En este proceso, el polímero libre que no reaccionó aún está en el flujo a través de la fracción junto con la endotoxina y otros contaminantes con carga negativa mientras que el conjugado y la proteína libre sin reaccionar permanece unida a la columna. Mediante el aumento de la resistencia iónica del tampón de elución, la primera fracción de proteína eluida es el conjugado debido a las interacciones más débiles con la resina IEX comparada con la proteína nativa. Un conjugado de Fab' típico eluye a 30-60 mM NaCl mientras que el Fab' nativo eluye a 100-200 mM NaCl.

La experiencia con purificación de muchos conjugados de proteína diferentes que incluyen ambos conjugados de proteína ácida (tales como citoquinas y proteínas basadas en varios dominios basados en andamios) y conjugados de proteína básica (tales como FAb' ) muestran que la resistencia iónica necesaria para la elución del conjugado es principalmente independiente del tamaño (aún más de un millón de Dalton) y la arquitectura del polímero (arquitecturas de varias ramificaciones) . Esta es una característica altamente deseable de la tecnología de la plataforma que permite el diseño de un proceso de fabricación genérico donde no se necesitan esfuerzos de desarrollo del proceso con cambios en los polímeros y en alguna medida agentes terapéuticos .

Desde el punto de vista de la fabricación, el proceso de purificación corriente abajo descrito anteriormente, el proceso tiene las siguientes ventajas: 1. Altamente escalable; 2. Dócil a los procesos de producción comerciales actuales cuando las resinas están disponibles comercialmente y la instrumentación necesaria ya está al nivel industrial; 3. La muestra de técnica se puede usar tanto para el Análisis de proceso (IPA) como la producción de escala ascendente. 4. El desarrollo de un proceso genérico es viable; 5. Es eficaz en costos debido a su naturaleza de paso y diseño ortogonal único; 6. Recuperación excelente (los rendimientos actuales del proceso son hasta el 80%) .

En el área del desarrollo analítico, el carácter zwiteriónico de los polímeros de esta invención tiene dos impactos sobre el desarrollo del análisis de conjugados por SDS-PAGE. En primer lugar, el análisis por SDS-PAGE ha sido durante mucho tiempo un método ubicuo y conveniente para el análisis de proteína, en que proporciona un método rápido, de alta resolución, de alto rendimiento y bajo costo para la caracterización de proteína semi-cuantitativa . Sin embargo, la propiedad neutra de carga neta y también el radio hidrodinámico grande del mutante polimérico significa que el polímero migra mal o (para polímeros de tamaño muy grande) casi absolutamente en una matriz de poliacrilamida aún con tan poco como un 40% de gel. En segundo lugar, los polímeros de esta invención no se pueden manchar con manchas de tipo de Azul de Coomassie, potencialmente debido a su propiedad neutra de carga neta que impide que el colorante Azul de Coomassie interactúe con el polímero. Sin embargo, una vez que la proteína se conjuga al polímero, el conjugado se hace manchable. Éstas son dos propiedades indeseables para la mayor parte de los bioquímicos de proteína a primera vista sin embargo, la combinación de estas dos propiedades permite el diseño de una técnica altamente deseable y única que permite el análisis rápido y fácil de la eficiencia de conjugación directamente desde la mezcla de la reacción sin nueva purificación. En esta técnica, la mezcla de la reacción de conjugación se carga en el gel de SDS-PAGE y se separa según el protocolo estándar. Luego el gel se mancha con Azul de Coomassie y luego se desmancha de acuerdo con el protocolo estándar. La presencia del conjugado presenta bandas manchadas de azul de Coomassie cerca del pozo de carga mientras que la proteína más pequeña migra a su peso molecular y presenta una reducción concomitante a una intensidad de banda comparada con una reacción de control sin polímero. En consecuencia es muy fácil distinguir esas reacciones con una conjugación ineficiente ya que el polímero solo no presenta ninguna mancha en la región de peso molecular alto del gel. Se debe señalar que dicha técnica para el análisis de reacción de conjugación es imposible para la reacción de PEGilación ya tanto el polímero de PEG como las proteínas PEGiladas se manchan con Azul de Coomassie y migran en una posición muy similar en el gel, especialmente los polímeros de PEG muy grandes; además, los polímeros de PEG presentan la propiedad altamente indeseable de perturbar el patrón de migración de los geles de SDS-PAGE. Este último problema no se observa para los polímeros de esta invención, ya que la propiedad neutra de carga neta del polímero libre sin reaccionar hace improbable que entren a la matriz del gel (mientras que solamente el conjugado y la proteína libre no conjugada lo hacen) .

Otra propiedad interesante de los polímeros de esta invención es que no tienen absorbencia de UV 280 nm debido a la ausencia de un grup aromático. Sin embargo, sí absorben 220 nm. Existe por lo menos lOx menor absorbencia para el polímero comparado con una concentración de masa igual de la solución de proteína. Esto es muy útil cuando se intenta identificar la presencia del conjugado en la mezcla de la reacción de conjugación usando diferentes métodos cromatográficos tales como la exclusión de tamaño o el análisis de IEX. Comparando la relación de UV280/UV220, se muy fácil identificar la presencia del conjugado ya que la relación aumenta dramáticamente. Se puede usar la misma técnica para el monitoreo de la escala analítica así como de la escala de producción de la elución del producto.

Composiciones La presente invención incluye y proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden uno o más compuestos de la invención y uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables. Los compuestos de la invención pueden estar presentes como una sal, profármaco, metabolito, análogo o un derivado farmacéuticamente aceptable de ellos, en las composiciones de la invención. Como se usa en la presente, el "excipiente farmacéuticamente aceptable" o el "portador farmacéuticamente aceptable" incluye todos y cada uno de los solventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y de retardo de absorción y similares, compatibles con la administración farmacéutica.

Los portadores farmacéuticamente aceptables para su uso en la formulación de los polímeros de alto peso molecular de la presente invención incluyen, en forma no taxativa, portadores sólidos tales como lactosa, térra alba, sacarosa, talco, gelatina, agar, pectina, acacia, estearato de magnesio, ácido esteárico y similares; y portadores líquidos tales como jarabes, solución salina, solución salina con tampón de fosfato, agua y similares. Los portadores pueden incluir cualquier material de retardo de tiempo conocidos en el arte, tales como monoestearato de glicerilo o diestearato de glicerilo, solos o con una cera, etilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, metacrilato de metilo o similares .

Otros rellenos, excipientes, saborizantes y otros aditivos tales como los conocidos en el arte también pueden estar incluidos en una composición farmacéutica de acuerdo con esta invención. El uso de dichos medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas es conocido en el arte. Excepto siempre que todos los medios o agentes convencionales sean incompatibles con el compuesto activo, su uso en las composiciones de la invención está contemplado. Los compuestos complementarios también se pueden incorporar en las composiciones de la presente invención.

Las preparaciones farmacéuticas comprenden todos los tipos de formulaciones. En algunas realizaciones son formulaciones parenterales (que incluyen subcutáneas, intramusculares, intravenosas, intradérmicas , intraperitoneales , intratecales , intraventriculares, intracraneanas, intraspinales , intracapsulares e intraóseas) adecuadas para la inyección o infusión (por ejemplo, polvos o soluciones concentradas que se pueden reconstituir o diluir así como suspensiones y soluciones) . Cuando la composición es un sólido que necesita la reconstitución o un concentrado que necesita dilución con medios líquidos, se puede emplear cualquier medio líquido adecuado. Ejemplos preferidos de medios líquidos incluyen, en forma no taxativa, agua, solución salina, solución salina con tampón de fosfato, solución de Ringer, solución de Hank, solución de dextrosa y 5% de albúmina de suero humano .

Cuando un compuesto o una composición farmacéutica que comprende un polímero de alto peso molecular de la presente invención se adecuada para el tratamiento de trastornos proliferativos de células, que incluyen en forma no taxativa, cánceres, el compuesto o la composición farmacéutica se puede administrar a un sujeto a través de una variedad de vías que incluyen la inyección directamente en los tumores, el torrente sanguíneo o las cavidades corporales.

Si bien las composiciones farmacéuticas pueden ser soluciones líquidas, suspensiones, o polvos que se pueden reconstituir inmediatamente antes de la administración, también pueden tomar otras formas. En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas se pueden preparar como jarabes, remojos, bolos, gránulos, pastas, suspensiones, cremas, ungüentos, tabletas, cápsulas (duras o blandas) , aspersiones, emulsiones, microemulsiones, parches, supositorios, polvos y similares. Las composiciones también se pueden preparar para vías de administración diferentes de la administración parenteral que incluye, en forma no taxativa, tópica (que incluye bucal y sublingual), pulmonar, rectal, transdérmica , transmucosal , oral, ocular, etc. Se pueden usar dispositivos de inyección sin aguja para lograr la administración subdérmica, subcutánea y/o intramuscular. Dichos dispositivos se pueden combinar con los polímeros y conjugados de esta invención para administrar formulaciones de baja (<20 cP) , media (20 - 50 cP) , alta (>100 cP) viscosidad.

En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas de la presente invención comprenden uno o más polímeros de alto peso molecular de la presente invención.

Otras composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden comprender uno o más polímeros de alto peso molecular de la presente invención que funcionan como ligandos biológicos que son específicos de una molécula de antígeno o blanco. Dichas composiciones pueden comprender un polímero de alto peso molecular de la presente invención, donde el agente bioactivo es un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácido de un anticuerpo, o un fragmento de anticuerpo tal como un fragmento de FAb2 o Fab' o una región variable de anticuerpo. Alternativamente, el compuesto puede ser un polímero de alto peso molecular y el polipéptido puede comprender la secuencia de unión al antígeno de un anticuerpo de cadena única. Cuando un agente bioactivo presente en un polímero de alto peso molecular de la presente invención funciona como un ligando específico de una molécula de antígeno o blanco, esos compuestos también se pueden emplear como reactivos de diagnóstico y/o de formación de imágenes y/o ensayos de diagnóstico.

La cantidad de un compuesto en una composición farmacéutica varía según numerosos factores. En una realización, una dosis terapéu icamente eficaz puede ser adecuada para un contenedor de dosis única (por ejemplo, un frasco) . En una realización, la cantidad del compuesto es una cantidad adecuada para una jeringa de un solo uso. En aún otra realización, la cantidad es adecuada para los distribuidores de varios usos (por ejemplo, contenedores adecuados para el suministro de gotas de formulaciones cuando se usan para suministrar formulaciones tópicas) . Un experto en el arte podrá determinar la cantidad de un compuesto que produce una dosis terapéuticamente eficaz experimentalmente mediante la administración repetida de cantidades crecientes de una composición farmacéutica para lograr un punto final clínicamente deseado.

Generalmente, un excipiente farmacéuticamente aceptable está presente en la composición en una cantidad del 0,01% al 99,999% en peso, o del 1% al 99% en peso. Las composiciones farmacéuticas pueden contener del 5% al 10% o del 10% al 20%, o del 20% al 30%, o del 30% al 40% o del 40% al 50%, o del 50% al 60%, o del 60% al 70%, o del 70% al 80%, o del 80% al 90% en peso del excipiente. Otra gama adecuada de excipientes incluye del 5% al 98%, del 15% al 95%, o del 20% al 80% en peso.

Los excipientes farmacéuticamente aceptables se describen en una variedad de fuentes conocidas, que incluyen en forma no taxativa, "Remingon. La Ciencia y la Práctica de la Farmacia", 19a Edición, Williams & Williams, (1995) y Kibbe, A. H. Manual de Excipientes Farmacéuticos, 3a Edición, Asociación Estadounidense de Farmacéuticos, Washington, DC, 2000.

VI. Métodos Los polímeros de alto peso molecular de la presente invención son útiles para tratar cualquier estado o condición de enfermedad. El estado o condición de enfermedad puede ser agudo o crónico.

Los estados y condiciones de enfermedad que se pueden tratar usando los polímeros con alto peso molecular de la presente invención incluyen, en forma no taxativa, cáncer, trastornos autoinmunes, trastornos genéticos, infecciones, inflamación, trastornos neurológicos y trastornos metabólicos.

Los cánceres que se pueden tratar usando los polímeros de alto peso molecular de la presente invención incluyen, en forma no taxativa, cáncer de ovarios, cáncer de mamas, cáncer de pulmón, cáncer de vejiga, cáncer de tiroides, cáncer de hígado, cáncer de pleura, cáncer pancreático, cáncer de cuello, cáncer testicular, cáncer de colon y cáncer, cáncer de conducto biliar, tumores carcinoides gastrointestinales, cáncer esofágico, cáncer de vesícula biliar, cáncer rectal, cáncer de apéndice, cáncer de intestino delgado, cáncer de estómago (gástrico), cáncer renal, cáncer del sistema nervioso central, cáncer de piel, coriocarcinomas , cánceres de cabeza y cuello, carcinomas osteogénicos , fibrosarcomas, neuroblastomas , gliomas, melanomas, leucemia y linfoma.

Las enfermedades autoinmunes que se pueden tratar con usando los polímeros de alto peso molecular de la presente invención incluyen, en forma no taxativa, esclerosis múltiple, miastenia grave, enfermedad de Crohn, colitis ulcerativa, cirrosis biliar primaria, diabetes mellitus tipo I (diabetes mellitus insulino dependiente o IDDM) , enfermedad de Grave, anemia hemolítica autoinmune, anemia perniciosa, trombocitopenia autoinmune, vasculitis tales como granulomatosis de Wegener, enfermedad de Behcet, artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico (lupus) , esclerodermia, esclerosis sistémica, síndrome de Gillain-Barré , tiroiditis de Hashimoto, espondiloartropatías tales como espondilitis anquilosante, soriasis, dermatitis herpetiforme , enfermedades intestinales inflamatorias, pénfigo vulgar y vitíligo .

Algunos trastornos metabólicos que se pueden tratar con los polímeros de alto peso molecular de la presente invención incluyen trastornos de almacenamiento lisosomal, tales como mucopolisacaridosis IV o Síndrome de orquio, Insuficiencia de Activador/Gangliosidosis GM2, alfa-manosidosis , Aspartilglucosaminuria, enfermedad de almacenamiento del éster de colesterilo, Insuficiencia de Hexosaminidasa A Crónica, Cistinosis, enfermedad de Danon, enfermedad de Fabry, enfermedad de Farber, Fucosidosis, Galactosialidosis , Enfermedad de Gaucher, gangliosidosis GMl, hipofosfatasia, enfermedad de células i/Mucolipidosis II, Enfermedad de Almacenamiento de Ácido Siálico Libre Infantil/lSSD, Insuficiencia de Hexosaminidasa A Juvenil, enfermedad de Krabbe, Leucodistrofia Metacrom tica, trastornos de Mucopolisacaridosis tales como polidistrofia de Pseudo-Hurler/Mucolipidosis IIIA, Síndrome de Hurler, Síndrome de Scheie, Síndrome de Hurler-Scheie, síndrome de Hunter, síndrome de Sanfilippo, Morquio, Insuficiencia de Hialuronidasa , Maroteaux-Lamy, síndrome de Sly, Mucolipidosis I/Sialidosis , Mucolipidosis , y Mucolipidosis, insuficiencia de sulfatasa múltiple, Enfermedad de Niemann-Pick, Lipofuscinosis Ceroidea Neuronal, enfermedad de Pompe/enfermedad de almacenamiento de glucógenos tipo II, Picnodisostosis, enfermedad de Sandhoff, enfermedad de Schindler, enfermedad de Salla/Enfermedad de Almacenamiento de Ácido Siálico, Tay-Sachs/gangliosidosis GM2 y enfermedad de Wolman.

Los conjugados y las composiciones de la invención (por ejemplo, composiciones farmacéuticas) que contienen conjugados de la invención es pueden usar para tratar una variedad de condiciones. Por ejemplo, existen muchas condiciones cuyas terapias de tratamiento son conocidas para los expertos en el arte en las cuales se emplean agentes funcionales, que se revelan en la presente. La invención contempla que los conjugados de la invención (por ejemplo, polímeros que contienen fosforilcolina conjugados a una variedad de agentes funcionales) y composiciones que contienen los conjugados de la invención se pueden emplear para tratar dichas condiciones y que dichos conjugados proporcionan una terapia de tratamiento mejorada en relación con el mismo agente funcional no acoplado a un polímero que contiene fosforilcolina .

En consecuencia, la invención contempla el tratamiento de una condición que se sabe que es tratable por cierto agente bioactivo tratando la condición usando el mismo agente bioactivo conjugado a un polímero que contiene fosforilcolina .

Otro aspecto de la presente invención se relaciona con métodos para tratar una condición sensible a un agente biológico que comprende administrar a un sujeto que lo necesita una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto de la invención o de una composición farmacéuticamente eficaz de la invención que se describió anteriormente. La dosificación y la administración se ajustan para proporcionar niveles suficientes del agente (s) bioactivo para mantener el efecto deseado. El protocolo de dosificación y/o administración apropiado para cualquier sujeto dado puede variar según diferentes factores que incluyen la gravedad del estado de enfermedad, la salud general del sujeto, la edad, el peso y el género del sujeto, la dieta, el horario y la frecuencia de administración, la combinación (es) de fármacos, las sensibilidades de reacción y la tolerancia/respuesta a la terapia. Las cantidades terapéuticamente eficaces para una situación dada se pueden determinar mediante experimentación de rutina que está dentro de la pericia y juicio del médico.

Las composiciones farmacéuticas descritas en la presente pueden administrarse en forma simple. Alternativamente, dos o más composiciones farmacéuticas se pueden administrar secuencialmente, o en un cóctel o combinación que contiene dos polímeros de alto peso molecular de la presente invención o un polímero de alto peso molecular de la presente invención y otro agente bioactivo. Otros usos de los agentes bioactivos expuestos en la presente se pueden hallar en textos de referencia estándar tales como El Manual Merck del Diagnóstico y la Terapia, Merck & Co., Inc., Whitelow Station, NJ y El Fundamento Farmacológico de la Terapia de Goodman y Gilman, Pergamon Press, Inc., Elmsforth, NY (1990) .

La invención describe las modificaciones de las proteínas relacionadas con la hematología tales como Factor VIII, Factor VII, Factor IX, Factor X y proteasas tales como proteasas de serina de la secuencia nativa o la secuencia de muteína y de la función nativa o alterada (por ejemplo a través de la presentación de fagos, referencia Biociencia de Catalizadores de South San Francisco con tecnología para alterar la especificidad de la unión de una enzima existente) . La Patente Estadounidense 7.632.921 está incluida en su totalidad en la presente. Se revela la modificación de la enzima para permitir la conjugación específica del sitio de un polímero con una funcionalidad. Se revela el uso de composiciones químicas flexibles entre el polímero y la enzima, de manera tal que la proteína pueda liberarse in vivo en el lugar correcto, por ejemplo, para permitir el perfil de liberación del orden de cerca de cero. Un perfil de producto blanco para un Factor VIII de generación siguiente puede consistir en un conjugado covalente de FVIII recombinante o FVIII de dominio B eliminado recombinante al cual se une un polímero que contiene un zwiterión de varias ramas, de forma extendida con un peso molecular mayor de 50 kDa a un aminoácido específico del sitio tal como una cisteína. La farmacología clínica del conjugado demostraría la estructuración de agua incomparable para proteger al conjugado del aclaramiento y los sistemas inmunes. El conjugado demostraría una semivida de eliminación superior a 50 horas en humanos (preferentemente más de 80 horas) . El conjugado demostraría una semivida aumentada de 2x (preferentemente 4x) contra un FVIII de PEG-BDD de 60 kDa con la misma bioactividad. El conjugado como se usa en los pacientes mostraría una formación de anticuerpos clínicamente insignificante. El conjugado biofarmacéutico se usaría tanto en forma profiláctica (una vez por semana o menos frecuentemente) y para el tratamiento a demanda de pacientes con hemofilia. También se utilizaría como terapia de rescate para pacientes con anticuerpos de neutralización de FVIII existentes, por ejemplo desde la terapia biofarmacéutica de FVIII anterior. El fármaco permitiría una formulación líquida para la adminis ración intravenosa y/o intramuscular y con alta estabilidad, alta concentración y baja viscosidad. El ingrediente activo podría estar en la gama de 250 a 2.000 IU compuesto por 30 a 250 microgramos del conjugado de polímero y fármaco en un volumen nominal idealmente de 0,4 mi. El costo del polímero sería bajo y la eficiencia de la conjugación del polímero al FVIII o la proteína de BDD FVIII sería muy alta, por ejemplo superior al 75%. Dicho producto y perfil de producto aprovecharía la biocompatibilidad extrema del polímero y se transferiría sobre la proteína. Específicamente, la biocompatibilidad extrema se manifestaría con una unión de agua muy apretada, solubilidad extrema, concentración muy alta, viscosidad muy baja y una estabilidad extrema. Técnicamente, esto se traduce en una semivida de eliminación aumentada de >2x (o idealmente >4x) contra la PEGilación o sus tecnologías equivalentes, muy baja o ninguna inmunogenicidad, alta concentración y formulaciones líquidas estables de temperatura ambiente. Se pueden obtener beneficios del perfil de producto que incluyen una dosificación menos frecuente, una dosis más baja para la misma Área Debajo de la Curva, un tratamiento seguro eficaz para pacientes ingenuos, una terapia de rescate para pacientes con anticuerpos de neutralización, una administración subcutánea en el hogar, una jeringa prellenada/autoinyector con almacenamiento a temperatura ambiente, agujas de jeringa de calibre más alto (diámetro más bajo) , volúmenes de inyección más bajos y vidas útiles más prolongadas. En el frente de fabricación, la síntesis de un solo recipiente, pesos moleculares muy altos del polímero, arquitecturas complejas y bajo costo para la fabricación. Además, es posible la conjugación de alta eficiencia del polímero al fármaco. Estos beneficios de fabricación se pueden traducir en medicamentos de menor costo, más disponibles y márgenes brutos más altos.

Esta invención describe la unión de polímeros que contienen un zwiterión de alto peso molecular a multímeros de dominios de la clase A de receptores de LDL modificado recombinante de la clase A o secuencias de consenso descritos en la Solicitud de Patente Estadounidense 60/514.391 cedida a Avidia. Los expertos en el arte entenderán que los avimers pueden ser lisina agotada y luego las lisinas y/u otros aminoácidos agregados los extremos de N y/o C para la unión específica del sitio de un polímero con una funcionalidad. Una lisina del extremo de N es preferentemente el segundo aminoácido (después de metionina) y puede impulsar la conjugación específica del sitio relativa de un iniciador impulsado por una amina tal como un polímero con una funcionalidad que contiene un aldehido o un grupo acetal . Los expertos en el arte también conocen el beneficio de composiciones de avimer con aminoácidos relativamente hidrófilos y bajo pl y alta estabilidad, de manera tal que se pueda impulsar un pH muy bajo en la reacción de conjugación tal como para conjugar en forma preferencial a la amina de la lisina en lugar de uniones de varios puntos que también se conjugan a un grupo amino del extremo de N o a otros grupos amina presentes en la proteína. El producto terapéutico puede tener un polímero conjugado al extremo de N y otro conjugado al extremo de C a través de la lisina del extremo de C (una estructura ramificada eficaz) . Dicho avimer también se puede fabricar en sistemas de mamíferos con una cisteína del extremo de N o de C adicional agregada para la conjugación específica del sitio con un polímero con una funcionalidad que reacciona con tiol. El grup funcional del polímero también puede contener elementos dirigidos al tejido. La composición química que une al polímero al avimer puede ser flexible de manera tal que se rompa in vivo, por ejemplo, en suero o en una forma .sensible al pH, etc. Los monómeros y multímeros compuestos de otros dominios de interés usados de manera similar incluyen dominios de EGF, dominios de Notch/LNR, dominios de DSL, dominios de Anato, dominios de integrina beta o aquellos otros dominios que se describen en la familia de la patente citada.

La invención también describe la unión de los polímeros que contienen un zwiterión de alto peso molecular a péptidos y péptidos sintéticos y especialmente péptidos sintéticos más prolongados con varios dominios. Un problema grande con varios péptidos de dominio es que son inestables y también tienen un aclaramiento muy rápido. La unión de un polímero que contiene un zwiterión altamente biocompatible tal como aquellos descritos en esta invención resuelve estos problemas. El polímero aumenta la estabilidad y también aumenta el tiempo de residencia in vivo. Esto permite que los péptidos lineales simples (no estructurados) como fármacos, por ejemplo módulos de alrededor de veinte aminoácidos por cada módulo funcional en serie de dos, tres, cuatro o más módulos con el objetivo de alcanzar un beneficio de avidez o un beneficio de multifuncionalidad. Cada módulo también puede tener un pedazo de estructura (similar a péptido "limitado") o cada módulo puede realmente ser un dominio de péptido anudado tal como un nudo de cisteína o un elemento macrocíclico. La clave es que se fabrican sintéticamente y pueden ser fuertes junto con un grupo específico del sitio para la conjugación del polímero en el extremo de N o en el extremo de C (o ambos) o con el punto de conjugación del polímero en el centro, cuyo punto de unión puede ser un aminoácido específico del sitio que es un aminoácido natural o un aminoácido no natural. En un sentido, éste es un avimer sintético con propiedades preferenciales . La totalidad de los aminoácidos podrían ser sintéticos, también. Dicho péptido más los polímeros de esta invención describen un formato de fármaco novedoso y poderoso del futuro.

Los expertos en el arte comprenden que la amplitud de la aplicación de los polímeros de alto peso molecular de esta invención es muy amplia. Un listado parcial de modalidades terapéuticas que pueden beneficiarse con la conjugación de dichos polímeros consiste en: avimer (andamio de dominio A de receptor de LDL) , adnectina (andamio de fibronectina tipo III) , Ablynx (camélido, llama-idos) , NAR (tiburón) , anticuerpos de una rama y/o de dominio único de todas las especies (rata, conejo, tiburón, llama, camello, otro) , diacuerpos, otras proteínas basadas en varios dominios tales como multímeros de dominios de fibronectina modificada, fragmentos de anticuerpos (monómero de scFv, dímeros de scFv como agonistas o antagonistas) , Fab' , Fab' -2, dominios extracelulares solubles (sTNRFl, por ejemplo, o fragmento de receptor de cMet soluble) , combinación con Amunix XTEN que comprende una cadena de aminoácido hidrófila de hasta 1.500 aminoácidos hechos como parte del marco de lectura abierto, oligonucleótidos tales como aptámeros, microARN, siARN, cuyos anticuerpos (conjugados a la región de Fe; conjugados a regiones que no son de Fe), fusiones de Fe (conjugadas a la región de Fe; conjugados a la proteína fusionada) , el uso de dichos polímeros como un reemplazo para la cadena principal del anticuerpo de CovX (donde el polímero de alto peso molecular está conjugado directamente al propio péptido) , más ampliamente la unión de los polímeros de esta invención aún a un anticuerpo natural o de muteína de longitud completa (cuerpo de CovX, Pepticuerpo, humanizado u otro anticuerpo, la plataforma de Zyngenia nueva de Carlos Barbas donde los péptidos están conjugados a lugares diferentes sobre el anticuerpo para crear un fármaco multifuncional modular arriba de una cadena principal de anticuerpo) . También las numerosas estructuras de dominios descritas en la Solicitud de Patente Estadounidense 60/514.391 están incluidas en su totalidad en la presente. Son de particular interés los conjugados para la unión e inhibición de blancos de la superficie celular, en donde en los cuales fijar las arquitecturas de gran tamaño, de forma extendida y velocidades lentas de los conjugados de polímeros descritos en esta invención puede tener un efecto biológico particularmente ventajoso.

Esta invención describe conjugados para administración oftálmica y preferentemente intravítrea o subconjuntival que tienen una semivida de extremo promedio intravítrea mayor de 10 días medida por la presencia física del conjugado activo. El conjugado activo también puede contener dos agentes funcionales, unidos en forma covalente en forma próxima en un extremo del polímero. En este caso ambos agentes funcionales podrían ser aptámeros a VEGF y PDGF para el tratamiento de la degeneración macular relacionada con la edad húmeda y seca.

La invención contempla la conjugación de los polímeros de alto peso molecular de la invención a GLP-1, receptor de TAC1 soluble, BAFF así como inhibidores de BAFF, insulina y sus variantes, muteína de IL-12 (equivalente ani-IL-23 funcional) , equivalente anti-IL-17, FGF21 y muteínas, ligando de RANK y sus antagonistas, factor H y proteína de fusión para la inhibición del complemento alternativo (Taligen) , inhibidores de la sinapsis inmune, activadores de la sinapsis inmune, inhibidores de vías coestimuladores de células T y/o células B, activadores o inhibidores de células neuronales y/o sus células de la matriz de soporte, enzimas de la matriz extracelular tales como lisil oxidasa o metaloproteinasa/metaloproteasas, activadores y/o inhibidores de células T reguladoras o células productoras de anticuerpos, como protectores de células contra procesos inflamatorios o de aclaramiento tales como la unión a células beta del páncreas y ejercer de ese modo una función protectora para la célula para prolongar el lapso de vida en el cuerpo (es decir, la reparación de la biocompatibilidad mediante la unión a ellas para células o tejidos o proteínas del cuerpo que pueden beneficiarse con una intensificación de la biocompatibilidad para reducir el aclaramiento y/o su participación en procesos inflamatorios localizados o generalizados activos o pasivos) , para tratar enfermedades genéticas para acompañar a una proteína existente pero plegada en forma incorrecta, para estimular la localización conjunta de dos entidades solubles o de la superficie celular tal como uniendo en puente un módulo de inhibidor de la superficie celular (ITIM) a un módulo activador de la superficie celular (ITAM) para inhibir un tipo de célula tal como una célula madre.

Esta invención contempla usar los polímeros de la invención para mediar la penetración celular. Por ejemplo, la conjugación de los polímeros de esta invención a través de su estructura de iniciador o extremos finales a uno o más péptidos derivados de proteínas y péptidos anfifáticos secundarios o primarios (Opinión Actual en Biotecnología, 2006, 17, 638-642) . Los expertos en el arte también reconocerán la posibilidad de la combinación con la tecnología de péptido acoplado que agrega grupos hidrocarburos a péptidos para facilitar la penetración celular.

La invención contempla la combinación de estas invenciones con otras tecnologías de suministro de fármacos, tales como PLGA. Del mismo modo que la naturaleza hidrófila del PEG mejoró numerosas propiedades del PEG, la tecnología de los polímeros de alto peso molecular de la presente invención debería mejorarlo más. Por ejemplo, la carga de fármacos aumentada como un porcentaje de la masa total (estado del arte biofarmacéutico actual <20% pero generalmente menos del 10%), también generalmente el porcentaje de impulso es >5%. La unión de agua aumentada del polímero de la presente invención impulsa la solubilidad e impulsa la carga más alta y el menor rendimiento in vivo de PLGA cargado con un conjugado de compuesto biofarmacéutico y polímero.

Esta invención contempla conjugados que demuestran una inmunogenicidad más baja para un conjugado de fármaco y polímero particular (por lo tanto una incidencia nueva más baja de los anticuerpos de neutralización) . También contempla la protección, el enmascaramiento o la des-inmunización. No es que los anticuerpos de neutralización existentes se eliminen sino que el conjugado del fármaco al polímero se puede dar a pacientes que ya tienen o han tenido una respuesta de anticuerpos en forma nativa o porque se trató al paciente particular con un fármaco biofarmacéutico inmunogénico y anticuerpos desarrollados. En este último grupo de pacientes, la presente invención contempla la capacidad para "rescatar" dichos pacientes y volver a permitir que reciban la terapia. Esto es útil, por ejemplo, cuando el Factor VIII porque los pacientes continuaban con la terapia de Factor VIII (en lugar de no hacerlo y luego se mudan hacia una terapia de Factor VII, por ejemplo). Este sistema inmune que protege los aspectos de la presente tecnología también permite que los fármacos se formulen para la inyección subcutánea o sin agujas donde las poblaciones dendríticas y otras poblaciones de células inmunes innatas y adaptivas aumentan la incidencia de la inmunogenicidad. Siempre que el conjugado de fármaco y polímero de la presente invención reduzca la inmunogenicidad de novo y oculte los anticuerpos de neutralización existentes, entonces la tecnología permite la dosificación subcutánea y evita las interacciones de anticuerpos y en consecuencia expande la base de pacientes elegibles y también reduce la incidencia de los eventos adversos relacionados con la inyección tal como anafilaxis.

La presente invención permite la posibilidad de incluir diferentes poblaciones de conjugados de polímeros a los mismos grupos o a grupos diferentes que se han de combinar en una formulación única. El resultado es adaptar cuidadosamente las propiedades in vivo e in vitro deseadas. Por ejemplo, tomar un grupo terapéutico único y conjugar a él en un solo recipiente o en recipientes por separado dos polímeros de arquitectura de tamaño diferente. Las dos poblaciones se comportan en forma diferente in vivo. Una población puede ser más pequeña o contener menos polímeros ramificados. La segunda población pueden ser arquitecturas más ramificadas de mayor tamaño. El conjugado con los polímeros más pequeños se elimina más rápidamente. Esto es tan importante como una dosis de carga o como un bolo específicamente por ejemplo para eliminar citoquinas existentes (por ejemplo con la conjugación de un scFv anti-TNF o un anti-IL-6 como el grupo fármaco) desde el suero. El conjugado con los polímeros de mayor tamaño se elimina más lentamente y eliminan TNFa o IL-6 producido de novo, por ejemplo. Esto se puede hacer con relaciones diferentes de las poblaciones, por ejemplo, 1:1 o 2:1 o 10:1 o 100:1, etc. El grupo terapéutico conjugado es el mismo, pero hay diferentes propiedades de extremo como resultado de los polímeros diferentes conjugados y es otra manera de impactar en la biología. Otro ejemplo sería con insulina u otras proteínas agonistas donde el objetivo es tener una sola inyección que tiene tanto el aspecto de un bolo (actividad rápida) como un aspecto basal (prolongado) . Para el Factor VIII, una población de Factor VIII conjugado puede tener un ligador hidrolizable entre el polímero y la enzima y por lo tanto la enzima sale rápidamente. La segunda población puede tener un ligador estable y por lo tanto proporcionar un aspecto de duración más prolongada (crónica, profilaxis) .

La presente invención puede crear conjugados de manera tal que después de la inyección intravenosa y/o subcutánea, se logra una cinética de liberación del orden de cero. La duración de la liberación (1 mes, 2 meses, 3 meses, 4 meses, 6 meses, 12 meses) depende del tamaño y de la arquitectura y la composición química del ligador del polímero. Esto puede ser equivalente desde el punto de vista funcional a un dispositivo médico o una bomba que libera una cantidad constante de fármaco desde un depósito localizado geográficamente. En el caso de la invención, el fármaco no está contenido físicamente. En cambio está en circulación continua o al estar dirigido se enriquece en un tejido particular, pero se crea de manera tal que el inicio sea similar o equivalente a la cinética del orden de cero con una liberación lineal y un impulso mínimo y equivalente del 100% de carga .

Los expertos en el arte reconocerán que la presente invención permite la introducción de los puntos de quiebre o puntos débiles en los polímeros e iniciadores de manera tal que las estructuras poliméricas de mayor tamaño y/o los conjugados se rompan en el transcurso del tiempo en pedazos más pequeños que el cuerpo elimina fácil y rápidamente. Ejemplos de primer orden incluyen un ligador sensible entre el iniciador y el fármaco, enlaces de éster en cualquier lugar (iniciador, cadena principal polimérica, monómeros) . Dichos puntos débiles pueden romperse pasivamente (por ejemplo mediante hidrólisis) o activamente (por medio de enzimas) . Otros enfoques para impulsar la rotura o el aclaramiento pueden consistir en el uso de grupos protectores o composiciones químicas de profármacos de manera tal que en el transcurso del tiempo, tiene lugar un cambio en la composición química expuesta cuya composición química impulsa la destrucción o se dirige al conjugado del polímero liberado al riñon o al hígado u otro sitio para la destrucción o el aclaramiento.

VII . Ejemplos Ejemplo 1. Preparación de N- (2-hidroxietil) -exo-3 , 6-epoxi-1,2,3, 6-tetrahidrof alimida Un matraz de fondo redondo de 100 mi equipado con una barra de agitación se cargó con 50 mi de etanol 2,0 gramos de anhídrido exo-3 , 6-epoxi-l , 2 , 3 , 6-tetrahidroftálico . La mezcla de agitación se enfrió con un baño de agua helada y una solución de 0,73 gramos de etanolamina en 20 mi de etanol se agregó gota a gota durante 10 minutos. La reacción se calentó a reflujo durante 4 horas, luego se refrigera durante toda la noche. La filtración y el enjuague con etanol dieron 0,73 gramo del producto deseado como un sólido cristalino blanco. El filtrado se concentró y se enfrió nuevamente para obtener una segunda cosecha de cristal. ? N R (400 MHz, CDC13) : d = 2,90 (s, 2H, CH) , 3,71 (m, 2H, 0CH2) , 3,77 (t, J=5,0 Hz, NCH2) , 5,29 (t, J=1,0 Hz, 2H, OCH) , 6,53 (t, J=l, 0 Hz, 2H, CH=CH) .

Ejemplo 2. Preparación del ácido isopropilideno-2 ,2-bis (hidroximetil)propiónico Un matraz de base redonda de 100 mi equipado con una barra de agitación se cargó con 50 mi de acetona, 13,8 mi de 2,2-dimetoxipropano, 10 gramos de ácido 2,2-bis (hidroximetil) propiónico y 0,71 gramo de monohidrato del ácido p-toluenosulfónico . La mezcla se agitó durante dos horas a temperatura ambiente, luego se neutralizó con 1 mi de 2M amoníaco en metanol . El solvente se evaporó y la mezcla se disolvió en diclorometano, luego se extrajo dos veces con 20 mi de agua. La fase orgánica se secó sobre sulfato de magnesio y se evaporó y dio 10,8 gramos del producto como un sólido cristalino blanco. 1H (400 Hz, CDCl3) : d = 1,20 (s, 3H, CH3CC=0) , 1,43 (s, 3H, CH3) , 1,46 (S, 3H, CH3) , 3,70 (d, J=12,4 Hz, 2H, OCH2) , 4,17 (d, J=12, 4 Hz, 2H, OCH2) .

Ejemplo 3. Preparación de p-toluenosulfonato de N,N-dimetilpiridinio (DPTS) Una solución de 1,9 gramos de ácido monohidrato de p-toluenosulfónico en 10 mi de benceno se secó mediante destilación azeotrópica usando una trampa de Dean-Stark, luego se agregaron 3,42 gramos de 4 -dimetilaminopiridina . Se formó gran cantidad de sólido y se necesitaron otros 25 mi de benceno para movilizar la reacción, que se agitó lentamente mientras se enfriaba a temperatura ambiente. El sólido resultante se aisló mediante filtración, se lavó con 10 mi de benceno y se secó y dio 7,88 gramos del producto como un sólido blanco.

Ejemplo 1. Preparación del iniciador de bromopropionato de maleimida Un matraz de fondo redondo de 100-ml equipado con una barra de agitación se cargó con 50 mi de tetrahidrofurano, 2 gramos de N- (2 -hidroxietil ) -exo-3 , 6-epoxi-l , 2 , 3 , 6-tetrahidroftalimida y 2,0 mi de trietilamina . La mezcla resultante se enfrió a 0 grados y se agregó una solución de 1,18 mi de bromuro de 2 -bromoisobútilo en 5 mi de tetrahidrofurano gota a gota durante 30 minutos. Se dejó que la reacción se agitara durante 3 horas y luego a temperatura ambiente durante toda la noche. La concentración de la mezcla de la reacción dio un residuo aceitoso, que se purificó mediante cromatografía rápida de gel de sílice con 30-50% de acetato de etilo en hexano, que dio 1,96 gramo del producto deseado como un polvo blanco. 1H MR (400 MHz, CDC13) : d = 1,89 (s, 6H, CH3) , 2,87 (s, 2H, CH) , 3,82 (t, J=5,4 Hz, 2H, NCH2) , 4,33 (t, J=5,4 Hz, 2H, OCH2) , 5,27 (t, J=1,0 Hz, 2H, OCH) , 6,51 (t, J=l, 0 Hz, 2H, CHvinüo) .

Ejemplo 2. Preparación de iniciador de bis (bromopropionato) de maleimida protegido Ácido de isopropilideno de maleimida.

Una solución de 2,00 gramos de N- (2 -hidroxietil ) -exo-3 , 6-epoxi-1 , 2 , 3 , 6-tetrahidroftaalimida y 1,67 gramo de ácido isopropilideno-2 , 2 -bis (hidroximetil) propiónico en 30 mi de diclorometano seco, junto con 563 mg de DPTS se trató gota a gota con una solución de 2,37 gramos de ?,?' -diciclohexilcarbodiimida en 10 mi de diclorometano seco. Se empezó a formar gran cantidad de sólido cuando la mezcla de la reacción se agitó a temperatura ambiente toda la noche. La reacción se filtró y el precipitado se lavó con una pequeña cantidad de diclorometano. Las capas orgánicas combinadas se concentraron y dieron un aceite transparente que contenía una pequeña cantidad de sólido. Este aceite se sometió a cromatografía de columna rápida sobre gel de sílice, usando en primer lugar 20%-100% de acetato de etilo en hexano. Las fracciones que contienen el producto deseado se combinaron y se concentraron y dieron 3,17 gramos del producto final como un sólido blanco. XH MR (400 MHz , CDC13) : d = 1,19 (S, 3H, CH3CC=00) , 1,37 (s, 3H, CH3) , 1,41 (s, 3H, CH3) , 1,55 (s, 6H, (CH3)2C), 2,86 (s, 2H, C=0CHCHC=0) , 3,58 (d, J=12Hz, CH20) , 3,78 (t, J=5,4Hz, CH2CH20) , 4,14 (d, J=12H, CH20) , 4,30 (t, J=5,4Hz, CH2CH20) , 5,27 (t, 2H, CHOCH) , 6,51 (s, 2H, CH=CH) .

Diol de maleimida protegido.

Una solución del compuesto isopropilideno del paso anterior en 50 mi de metanol se trató con 1,0 gramo de resina de intercambio de iones Dowex 50 x8-100 (forma de H+) y la reacción se agitó a temperatura ambiente toda la noche, en cuyo momento la reacción pareció terminar mediante tic (gel de sílice, acetato de etilo) . La mezcla se filtró y la resina sólida se lavó con una pequeña cantidad de metanol. Los elementos orgánicos se concentraron y se colocaron bajo alto vacío y dieron 1,55 gramo de un aceite levemente turbio, que se usó en la reacción siguiente.

Iniciador de bis (bromopropionato) de maleimida.

Una solución del producto crudo precedente en 40 mi de tetrahidrofurano anhidro (THF) , junto con 1,45 mi de trietilamina se enfrió en un baño de agua helada y se agregó gota a gota una solución de 1,23 mi de bromuro de 2 -bromoisobutirilo en 20 mi de THF anhidro durante algunos minutos . La reacción se agitó al frío durante 30 minutos, luego se la dejó calentar a la temperatura ambiente durante 6 horas. Se agregaron otros 600 µ? de trietilamina, seguidos por otro 0,5 mi de bromuro de 2-bromoisobutirilo . La reacción fue ácida con papel de pH, luego se agregaron otros 200 µ? de trietilamina que llevaron el pH de la solución a 9. La reacción se agitó toda la noche, se concentró y el residuo se repartió entre 50 mi de diclorometano y 50 mi de agua. La capa orgánica se secó sobre sulfato de sodio, se filtró y se concentró y dio un aceite. Éste se sometió a cromatografía de columna rápida sobre gel de sílice, primero con 20%, luego 30% y finalmente 40% de acetato de etilo en hexano. Las fracciones que contienen el producto se combinaron y se concentraron y dieron 1,63 g de un aceite que se solidificó hacia un sólido blanco. 1H NMR (400 MHz, CDC13) : d = 1,32 (s, 3H, CH3CC=0) , 1,91 [s, 12H, (CH3)2CBr] , 2,90 (s, 2H, CHC=0) , 3,78 (t, 2H, NCH2CH20) , 4,28 (t, 2H, NCH2CH20) , 4,31 (app q, 4H, CH2OC=0) , 5,30 (s, 2H, CHOCH) , 6,52 (s, 2H, CH=CH) .

Ejemplo 6. Preparación de N- [2- (2-hidroxietoxi) etil] -exo-3 , 6-epoxi-1 ,2,3, 6-tetrahidroftalimida Un matraz de fondo redondo de 250 mi equipado con una barra de agitación se cargó con 100 mi de metanol y 20 gramos de anhídrido exo-3 , 6-epoxi-l , 2 , 3 , 6-tetrahidroftálico . La mezcla de agitación se enfrió a 0 grado y se agregó una solución de 0,73 gramo de 2- (2-aminoetoxi) etanol en 40 mi de metanol gota a gota durante 45 minutos. La reacción se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas, luego se calentó a reflujo suave durante toda la noche. La solución se concentró y el producto se disolvió en 100 mi de diclorometano, luego se lavó con 100 mi de salmuera. La capa orgánica se secó sobre sulfato de sodio, se concentró y se purificó pasándola a través de un tapón de gel de sílice con 100 mi de diclorometano y 100 mi de acetato de etilo. 1H NMR (400 MHz, CDC13) : d = 2,90 (s, 2H, CH) , 3,49 (m,- 2H, OCH2) , 3,59 (m, 4H, 0CH2) , 3,65 (m, 2H, NCH2) , 5,15 (t, J=0 , 8 Hz, 2H, OCH) , 6,55 (t, J=0,8 Hz, 2H, CH=CH) .

Ejemplo 3. Preparación de ácido bis 2,2- [ (2-bromoisobutiril) hidroximetil]propiónico Un matraz de fondo redondo de 500 mi equipado con una barra de agitación se cargó con 200 mi de diclorometano, 8,0 gramos de ácido 2 , 2 -bis (hidroximetil ) propiónico y 33,5 mi de trietilamina . La mezcla de agitación se enfrió a 0 grado y se agregó una solución de 14,7 mi de bromuro de 2 -bromoisobutirilo en 30 mi de diclorometano gota a gota durante 30 minutos. La reacción se dejó agitar sobre hielo durante 1,5 horas, luego se la dejó calentar a temperatura ambiente durante toda la noche. El precipitado se llevó a solución con diclorometano adicional y la mezcla se lavó con 400 mi de 0,5 N ácido clorhídrico y se secó sobre sulfato de sodio anhidro. La concentración de la mezcla de la reacción dio un residuo aceitoso, que se purificó mediante cromatografía rápida sobre gel de sílice usando 30-40% de acetato de etilo en hexano que contenía 1% de ácido acético, que dio 27,4 gramos del producto deseado como un sólido ceroso blanco. 1H MR (400 MHz, CD3OD) : d = 1,33 (s, 3H, CCH3) , 1,90 (s, 12H, (CH3)2CBr), 4,30 (d, J=5,4 Hz, 2H, NCH2) , 4,39 (d, J=5,4 Hz, 2H, OCH2) .

Ejemplo 8. Preparación de iniciador de bis (bromopropionato) de maleimida extendido protegido Un matraz de fondo redondo de 250 mi equipado con una barra de agitación se cargó con 100 mi de diclorometano, 1,0 gramo de N- [2 - (2 -hidroxietoxi ) etil] -exo-3 , 6 -epoxi -1,2,3,6-tetrahidroftalimida, 2,5 gramos del dibromo ácido del Ejemplo 7, 0,5 gramos de dimetilaminopiridina y 0,35 gramo de DPTS . Nitrógeno hirvió brevemente a través de la solución y se agregaron lentamente 1,6 gramos de DCC. La reacción se dejó agitar a temperatura ambiente toda la noche. La filtración y la evaporación dieron un residuo aceitoso rosa. 1H NMR (400 MHz, CD3OD) : d = 1,34 (s, 3H, CH3) , 1,90 (s, 6H, CH3) , 2,94 (s, 2H, CH) , 3,64 (m, 6H, 0CH2) , 4,22 (t, J=5,4 Hz, 2H, NCH2) , 4,35 (app q, 4H, OCH2) , 5,15 (t, J=1,0 Hz, 2H, OCH) , 6,54 (t, J=1,0 Hz, 2H, CH=CH) .

Ejemplo 4. Preparación de iniciador de bis (bromopropionato) de acetal A una solución de 1,03 gramo de 3 , 3-dietoxi-l-propanol y 3,0 gramos del ácido 2 , 2 -bis (2 -bromoisobutiriloximetil ) propiónico en 50 mi de diclorometano, junto con 817 mg de p-toluenosulfonato de N, N-dimetilpiridinio, se trató con 1,58 gramo de ?,?' -diciclohexilcarbodiimida y la reacción se agitó a temperatura ambiente toda la noche. La reacción se filtró y el precipitado se lavó con una pequeña cantidad de diclorometano. Los compuestos orgánicos combinados se concentraron y el residuo se sometió a cromatografía de columna rápida sobre gel de sílice con 10-20% de acetato de etilo en hexano. Las fracciones que contienen el producto deseado se combinaron y se concentraron y dieron 2,87 gramos de un aceite incoloro, transparente. Este material aún no era puro mediante 1H NMR, de manera que se lo sometió nuevamente a cromatografía de columna rápida sobre gel de sílice usando diclorometano. Las fracciones apropiadas se combinaron y se concentraron y dieron 2,00 gramos del producto deseado como un aceite transparente, viscoso. 1H NMR (400 MHz, CDC13) : d = 1,20 (t, 6H, CH3CH20) , 1,34 (s, 3H, CH3CC=0) , 1,92 [s, 12H, (CH3)2CBr], 1,98 (app q, 2H, CHCH2CH2) , 3,50 (m, 2H, OCH2CH3) , 3,66 (m, 2H, OCH2CH3) , 4,24 (t, 2H, CH2CH2OC=0) , 4,37 (app q, 4H, CH2OC=OCBr) , 4,60 (t, 1H, O-CH-O) .

Ejemplo 5. Preparación de iniciador de bis (bromopropionato) de vinilo Un matraz de fondo redondo de 100 equipado con una barra de agitación se cargó con 30 mi de diclorometano, 86 miligramos de 4-penten-l-ol , 432 miligramos del dibromo ácido del Ejemplo 7 y 88 miligramos de DPTS . Se hizo hervir nitrógeno brevemente a través de la solución y se agregaron lentamente 169 µ? de ?,?'-diisopropilcarbodiimida . La reacción se dejó agitar a temperatura ambiente toda la noche, luego se agregó otro 0,1 gramo de DPTS y la reacción se agitó nuevamente toda la noche. La filtración y la evaporación dieron un residuo aceitoso, que se purificó mediante cromatografía rápida sobre gel de sílice usando 20-40% de acetato de etilo en hexano . El solvente se eliminó del primer producto que salió de la columna y dio 0,13 gramo del producto deseado como un aceite incoloro. 1H NMR (400 MHz, CD30D) : d = 1,34 (s, 3H, CH3) , 1,77 (m, 2H, CH2CH2CH2) , 1,90 (s, 12H, CH3) , 2,15 (q, J=7,2 Hz, 2H, CHCH2CH2) , 4,16 (t, J=6,4 Hz, 2H, OCH2) , 4,36 (app. q, 4H, CCH20) , 5,02 (m, 2H, CH2=CH) , 5,82 (m, 1H, CH2=CH) .

Ejemplo 6. Preparación de iniciador de bis (bromopropionato) de vinilo Un matraz de fondo redondo de 100 mi equipado con una barra de agitación se cargó con 25 mi de diclorometano, 370 miligramos de éter de monovinilo de etilenglicol , 432 miligramos del dibromo ácido del Ejemplo 7 y 590 gramos de DPTS. El matraz se inundó con nitrógeno y se agregaron lentamente 681 µ? de ?,?'-diisopropilcarbodiimida . La reacción se dejó agitar a temperatura ambiente toda la noche. La mezcla se filtró y luego se secó sobre gel de sílice para la cromatografía rápida usando 5-10% de acetato de etilo en hexano, que dio el producto como un aceite incoloro. ¾ NMR (400 MHz, CDC13) : d = 1,36 (s, 3H, CH3) , 1,92 (s, 12H, CH3) , 3,90 (app q, J=5,4 Hz, 2H, NCH2CH20) , 4,05 (dd, 1H, J=2,4, 6,8 Hz, =CH) , 4,19 (dd, J=2,4, 14,4 Hz, 1H, =CH) , 4,39 (m, 2H, NCH2CH20) , 4,40 (app q, 4H, OC¾) , 6,45 (dd, 1H, J=6,8, 14,4 Hz, =CH0) .

Ejemplo 7. Preparación de iniciador de Boc-amino bis (maleimida) Una solución de 2,19 gramos de N-Boc-3 -amino-1-propanol y 5,20 gramos de ácido 2 , 2 -bis (2 -bromoisobutiriloximetil ) propiónico en 50 mi de diclorometano, junto con 350 mg de DPTS, se trató con 3,0 gramos de ?,?' -diciclohexilcarbodiimida y la reacción se dejó agitar a temperatura ambiente toda la noche. La mezcla de la reacción se filtró y el precipitado se lavó con una pequeña cantidad de diclorometano. La concentración dio un residuo, que se sometió a cromatografía de columna rápida sobre gel de sílice con 5-20% de acetato de etilo en hexano . Las fracciones apropiadas se combinaron y se concentraron y dieron un aceite que contiene un residuo sólido pequeño. Este material se recogió en acetato de etilo y se filtró. La concentración nuevamente dio un aceite que aún contenía un pequeño sólido, de manera que el material se recogió nuevamente en acetato de etilo, se filtró y se concentró y dio el producto deseado como un aceite incoloro.

¾ NMR (400 MHz, CDCl3): d = 4,8 (br s, 1H, NH) , 4,37 (app q, 4H, CH2OC=OCBr) , 4,22 (t, 2H, CH2CH2OC=0) , 3,20 (app q, 2H, NHCH2) , 1,92 [s, 12H, (CH3)2CBr], 1,85 (t, 2H, CH2CH2CH2) , 1,43 (s, 9H, (CH3) 30), 1, 35 (s, CH3CC=0) .

Ejemplo 8. Preparación de maleimida 4-ol protegido Un matraz de fondo redondo de 100 mi equipado con una barra de agitación se cargó con 30 mi de diclorometano, 1,6 gramos del diol del Ejemplo 7, 1,71 gramos de ácido isopropilideno-2 , 2 -bis (hidroximetil) propionico y 0,5 gramo de DPTS. Se hizo hervir nitrógeno a través de la solución brevemente, se agregaron lentamente 1,70 mi de ?,?' -diisopropilcarbodiimida y la reacción se dejó agitar a temperatura ambiente toda la noche. La filtración y la evaporación dieron un residuo aceitoso, que se purificó mediante cromatografía rápida sobre gel de sílice usando 10-40% de acetato de etilo en hexano. Una segunda purificación mediante cromatografía rápida sobre gel de sílice usando 2% de metanol en diclorometano dio 2 gramos de aceite incoloro. Este aceite se disolvió en 25 mi de metanol y se agitó durante 60 horas a temperatura ambiente con resina Dowex 50 X8-100 (forma de H+) . La reacción se filtró, se concentró, luego se pasó a través de un tapón de gel de sílice con 150 mi de 15% metanol en diclorometano. La evaporación dio 1,3 gramos de una espuma dura casi incolora. ¾ MR (400 MHz, CDC13) : d = 1,13 (s, 6H, CH3) , 1,25 (s, 3H, CH3) , 2,96 (s, 2H, CHC=ON) , 3,57-3,65 (m, 8H, CH2OH) , 3,64 (t, J=2,8 Hz, 2H, CH2CH20C=O) , 4,22 (app q, 4H, C (CH3) CH2OC=Oi) , 4,22 (t, J=2 , 8 Hz, CH2CH2OC=0) , 5,21 (t, J=0,8 Hz, CHOCH) , 6,55 (t, J=0 , 8 Hz, CH=CH) .

Ejemplo 9. Preparación del iniciador de tetra (bromopropionato) de maleimida protegido Un matraz de fondo redondo de 100 mi equipado con una barra de agitación se cargó con 20 mi de diclorometano, 0,55 gramo del tetraol del Ejemplo 13 y 1,69 mi de trietilamina . La mezcla de agitación se enfrió a 0 grado y se agregó gota a gota una solución de 0,99 mi de bromuro de 2 -bromoisobutirilo en 10 mi de diclorometano. La reacción se dejó agitar a temperatura ambiente toda la noche, luego se lavó con 50 mi de bicarbonato de sodio semisaturado . La concentración de la mezcla de la reacción dio un residuo marrón aceitoso, que se purificó mediante cromatografía rápida sobre gel de sílice con 40% de acetato de etilo en hexano.

El residuo marrón se disolvió en metanol y se trató con carbón para eliminar el color y dio 0,68 gramo del producto deseado como un aceite marrón claro. ¾ NMR (400 MHz , CDC13) : d = 1,26 (s, 3H, CH3CC=0) , 1,34 (s, 6H, CH3CC=0) , 1,90 (s, 24H, (CH3)2CBr), 2,95 (S, 2H, CH) , 3,78 (t, J=5 Hz, 2H, NCH2) , 4,25 (m, 6H, OCH2C (4H) y OCH2CH2N (2H) ) , 4,35 (app q, 8H, OCH2) , 5,23 (t, J=l Hz, 2H, CHOCH) , 6,55 (t, J=l Hz, 2H, CH=CH) .

Ejemplo 10. Preparación de polímeros que contienen un zwiterión de alto peso molecular Un protocolo representativo para producir polímeros hidrófilos hechos a medida, de alto peso molecular, del monómero zwiteriónico, 2 -metacriloiloxietil fosforilcolina (HEMA-PC) , usando un proceso de radicales libres controlados vivos, polimerización de radicales de transferencia de átomos es el siguiente .

Se usaron los siguientes iniciadores: PMC2M1 (del Ejemplo 4) PMC2M4 (del Ejemplo El iniciador y el ligando (2 , 2 ' -bipiridilo) se introdujeron en un tubo de Schlenk. Se introdujo dimetil formamida o sulfóxido de dimetilo gota a gota de manera tal que el porcentaje en peso del iniciador del ligando fuera aproximadamente 20%. La solución resultante se enfrió a -78°C usando una mezcla de hielo/acetona y se desgasificó bajo vacío durante 10 minutos. El tubo se rellenó bajo nitrógeno y el catalizador (CuBr a menos que se indique de otro modo) , mantenido bajo nitrógeno, se introdujo en el tubo de Schlenck (la relación molar de bromo/catalizador/ligando se mantuvo a 1/1/2) . La solución se hizo marrón oscura inmediatamente. El tubo de Schlenck se selló y se mantuvo a -78°C. La solución se purgó aplicando un ciclo de vacío/nitrógeno tres veces. Una solución de HEMA-PC se preparó mezclando una cantidad definida de monómero, mantenido bajo nitrógeno con 200 de etanol desgasificado de prueba. La solución monomérica se agregó gota a gota en el tubo de Schlenck y se homogeneizó con agitación leve. La temperatura se mantuvo a -78°C. Se aplicó un vacío completo a la mezcla de la reacción durante por lo menos 10 a 15 minutos, hasta que cesó el burbujeo desde la solución. El tubo se rellenó con nitrógeno y se calentó a temperatura ambiente. La solución se agitó y cuando avanzó la polimerización, la solución se hizo viscosa. Después de 3 a 8 horas, la reacción se enfrió mediante exposición directa al aire para oxidar Cu (I) hacia Cu (II) , la mezcla se hizo de color azul verdoso y se pasó a través de una columna de sílice para eliminar el catalizador de cobre. La solución recogida se concentró mediante evaporación giratoria y la mezcla resultante se precipitó con tetrahidrofurano o se dializó contra agua seguida por el secado por congelamiento que dio un polvo blanco que fluye libremente.

Los datos de varias extracciones de polimerización se muestran en la siguiente tabla: ** Isopropanol/etanol (2/1, v/v) El peso molecular pico (g/mol) y la polidispersidad (PDI) se determinaron mediante cromatografía de penetración de gel (GPC) sobre una columna de Shodex OHpak SB-806M HQ calibrada con estándares de óxido de poli (etileno) .

Ejemplo 11. Desprotección de polímeros con funcionalidad de maleimida protegida por furano usando la reacción de retro Diels- Alder Los polímeros del Ejemplo 15 se disolvieron en etanol (20 al 50 % p/p) en un matraz de fondo redondo. El etanol se eliminó lentamente mediante evaporación giratoria y produjo una película delgada sobre la pared del matraz. El recipiente de la reacción se colocó en un baño de aceite a una temperatura de por lo menos 110°C durante 90 minutos bajo vacío y luego se enfrió a temperatura ambiente .

La desprotección del grupo funcional maleimida se monitoreó mediante XHN1VIR (400MHz, d-metanol) : Antes de la desprotección: d (ppm) : 5,2 (2H, -CH-0-CH-) y 6,6 (2H, -CH=CH-) .

Después de la desprotección: 6(ppm): 6,95 (2H, -CO-CH=CH-CO- ) .

Ejemplo 12. Digestión con pepsina de IgG humana y purificación de fragmentos F(ab')2 IgG humana entera se compró a Innovative Research, Jackson Immunochem, y/o a Rockland Laboratories para su uso en la producción fragmentos del anticuerpo F(ab')2 para la conjugación a los polímeros con funcionalidad del Ejemplo 15. La IgG se digirió usando pepsina inmovilizada (Thermo Scientific) después del ajuste del pH a 4,5 con tampón de acetato de sodio mediante diálisis o usando una columna de desalado PD-10 (GE Healthcare) . Después del ajuste del pH, una cantidad de 0,5 mi de pepsina inmovilizada se lavó tres veces con un tampón de acetato de sodio, pH 4, y se resuspendio en un volumen final de 0,5 mi. Se agregó 1 mi de IgG a la pepsina inmovilizada a una concentración de 10 mg/ml y se colocó sobre un oscilador/agitador a 37°C. La digestión se dejó avanzar durante cuatro horas. Después de cuatro horas, se extrajo una muestra de 40 µ? y se la analizó mediante HPLC usando una columna de Shodex Protein KW-802.5 con una fase móvil de PBS. El pico de IgG se resolvió desde el pico de F(ab')2 y el avance de la digestión se determinó basado en el porcentaje digerido. La pepsina inmovilizada es una enzima proteolítica usada para generar fragmentos de anticuerpo F(ab')2 eliminando solamente los dominios de Fe más allá de las regiones bisagra. Esto deriva en fragmentos de F(ab')2 compuestos por dos fragmentos de Fab' de unión al anticuerpo conectados por un enlace de disulfuro covalente en la región bisagra.

Después de la digestión de IgG hacia F(ab')2, las muestras se centrifugaron para separar el gel de la pepsina inmovilizada de los fragmentos de anticuerpo digeridos y la resina se lavó tres veces. Los enjuagues se combinaron con el sobrenadante original. Los fragmentos de anticuerpo de F(ab')2 se purificaron a partir de fragmentos de Fe usando una columna de Superdex 200 HR -10/30 (GE Healthcare) y PBS . El F(ab')2 purificado eluyó en primer lugar seguido por los fragmentos de Fe. El F(ab')2 purificado se almacenó a 2-8°C.

Ejemplo 13. Conjugación de polímeros con funcionalidad de maleimida a fragmentos de Fab' Los fragmentos de Fab' se produjeron desde la preparación de F(ab')2 del Ejemplo 17 mediante la reducción de los enlaces de disulfuro usando borohidruro de sodio a una concentración final de 15 mM en solución. La preparación de F(ab')2 se diluyó con PBS que contiene 4 mM EDTA y se agregó un volumen igual de borohidruro de sodio en el mismo tampón y la mezcla se colocó sobre una placa de agitación a temperatura ambiente. Se dejó avanzar la reacción durante 1-1,5 hora a temperatura ambiente y el progreso de la reducción se monitoreó mediante Pie usando una columna de Shodex Protein KW-802.5 y PBS como la fase móvil. La reducción se consideró completa cuando más del 90% del F(ab')2 se había consumido. Inmediatamente después de la reducción del disulfuro, se ajustó el pH de la muestra hacia abajo hasta aproximadamente 4-5 con 0,1 N HC1. Después de ajustar el pH de la solución, la muestra se mezcló durante otros 10 minutos y luego el pH se ajustó hasta 6,5-7,5 usando 0,1 N NaOH. Mientras se agitaba, se agregó un exceso de 10 molares de un polímero con funcionalidad de maleimida del Ejemplo 16 a la mezcla y se incubó a temperatura ambiente. Se extrajo una muestra a la hora cero para el análisis mediante HPLC y nuevamente a 1 y 2 horas para monitorear el progreso de la reacción. Un sistema 2695 de HPLC Waters Alliance se equipó con un Detector de Fotodiodos Waters 2996 y una columna de Shodex Protein KW-803 con una fase móvil de PBS. La eficiencia de la conjugación se monitoreó a 220 nm y a 280 nm. Después de 2 horas, las muestras se purificaron usando un AKTA Prime Plus (GE Healthcare) y una columna de exclusión de tamaños preparativos Superdex 200 HR 10/30. El tampón de elución usado fue PBS. El Fab' conjugado al polímero eluyó en primer lugar seguido por el polímero y el Fab' sin reaccionar. Las fracciones recogidas se analizaron usando la columna de Shodex Protein KW-803 con fase móvil de PBS. Las fracciones que contienen el conjugado de Fab' purificado se combinaron y se concentraron usando filtros Vivaspin 2 (3000 MWCO) de Sartorius .

Ejemplo 14. Conjugación de aptámero anti-VEGF al polímero con funcionalidad de maleimida de 200 kDa El aptámero anti-VEGF (Agilent, Boulder, CO) que contiene una amina terminal se conjugó al polímero con funcionalidad de maleimida del Ejemplo 15 (Muestra 5) después de la desprotección de acuerdo con el Ejemplo 16. Se usó el Reactivo de Traut para convertir la amina terminal en un tiol de la siguiente manera. El aptámero (5,4 mg) se disolvió en 500 µ? de 0,1 M Tampón de Bicarbonato de Sodio, pH=8,0. En un frasco separado, 7,2 mg de 2-Iminotiolano HCl (Reactivo de Traut, Sigma) se disolvió en 3,6 mi de agua purificada que dio 2 mg/ml de solución. Una cantidad de 100 µ? del 2 -Iminotiolano HCl se agregó al aptámero y se agitó a temperatura ambiente durante una hora. La muestra de aptámero que contiene el reactivo de Traut se pasó sobre una columna de desalación de PD-10 para eliminar el 2 -Iminotiolano sin reaccionar y el tampón final se intercambió con PBS que contiene 4 mM EDTA. Una pequeña parte de la muestra de aptámero que contiene el grupo tiol final se mezcló a temperatura ambiente con una barra de agitación y se agregaron 14,0 mg de polímero con funcionalidad de maleimida a la reacción, agitando constantemente. Se extrajo una muestra de 60 µ? a la hora 0 para el análisis mediante HPLC usando una columna de KW-803, una fase móvil de PBS y una velocidad de flujo de 1 ml/min. Las muestras se monitorearon a longitudes de onda de 220 y 280 nm así como mediante detección de índice de refracción. Se extrajeron alícuotas y se ensayaron después de 2 horas y nuevamente después de agitar a 4°C toda la noche.

El conjugado de aptámero se purificó usando un gradiente isocrático sobre Superdex 200 HR 10/30 (GE Healthcare) con tampón de fosfato como eluyente. El conjugado purificado eluyó en primer lugar seguido por el polímero sin reaccionar y el aptámero residual .

Ejemplo 20. Preparación de microesfera usando el conjugado de polímero y aptámero El conjugado de polímero y aptámero del Ejemplo 19 se formuló en una mezcla de solventes de aceite en aceite con microesferas de ácido poli (láctico con glicólico) (PLGA) . El conjugado de polímero y aptámero (20 mg) se suspendió en una solución de 100 mg/ml de PLGA en 0,1% de cloroformo en diclorometano a temperatura ambiente. El conjugado suspendido se mezcló con poli (dimetil) siloxano para producir una dispersión homogénea de la microesfera . La mezcla se transfirió a un matraz que contenía heptano y se agitó durante 3 horas a temperatura ambiente . La microesfera resultante se aisló y se recogió usando un filtro de 0,2 micrones y se secó bajo vacío toda la noche.

Ejemplo 21. Conjugación del Factor VIII de muteina a 50, 100 y 200 kDa de polímero con funcionalidad de maleimida (polímero de 2 ramas) y a 100 y 200 kDa de polímero con funcionalidad (polímero de 4 ramas) La conjugación específica del sitio de BDD factor VIII con muteina de cisteína (Patente Estadounidense 7.632.921) se redujo usando Tris (2-carboxietil) fosfina inmovilizada (TCEP) o ditiotrietol (DTT) para liberar la "tapa" . Después de la reducción, el agente de reducción, TCEP inmovilizada, se eliminó a través de centrifugación, o cuando se usa DTT, la eliminación se realizó usando una columna de desalado de PD-10 (GE Healthcare) . La cisteína reducida sobre BDD Factor VIII se trató con 1 a 10 veces exceso molar de los polímeros con funcionalidad de maleimida del Ejemplo 16 con pesos moleculares de 50-200 kDa (2 ramas) o 100-200 kDa (4 ramas) durante hasta 2 horas a temperatura ambiente o toda la noche a 4°C. Las muestras de BDD Factor VIII conjugadas finales se purificaron usando cromatografía de intercambio de aniones usando un gradiente de cloruro de sodio. La muteína conjugada se separó del Factor VIII sin reaccionar y el polímero con funcionalidad de maléimida libre. Las muestras fraccionadas se analizaron mediante SEC HPLC y SDS-PAGE para la confirmación. Todas las fracciones que contenían la muteína conjugada de Factor VIII se combinaron y el tampón se intercambió usando columnas de desalado de PD-10 en la formulación final en tampón de fosfato de sodio. En ciertos casos, según el peso molecular del polímero con funcionalidad de maléimida que se use en las reacciones de conjugación, se necesitó una nueva purificación usando SEC para separar el Factor VIII conjugado de las especies sin reaccionar.

Ejemplo 22. Conjugación de scFV a 50-200 kDa de polímeros con funcionalidad de maléimida Fragmentos de scFv con cisteínas protegidas de extremo de C se diluyeron con PBS que contiene 4 mM de EDTA y se agregó un volumen igual de borohidruro de sodio en el mismo tampón. La mezcla se colocó sobre una placa de agitación a temperatura ambiente. Alternativamente, la reducción se realizó usando TCEP inmovilizada a una gama de pH de 6-7. La reacción se dejó avanzar durante 0,5-2 horas a temperatura ambiente y el progreso de la reducción se monitoreó mediante HPLC usando una columna de Shodex Protein K -802.5 y PBS como la fase móvil. Inmediatamente después de la reducción de disulfuro, las muestras reaccionaron mientras se agitaba con un exceso de 10 molar de un polímero con funcionalidad de maleimida del Ejemplo 16 a temperatura ambiente. Se extrajo una muestra a la hora cero para el análisis mediante HPLC y nuevamente a 1 y 2 hors para monitorear el progreso de la reacción. Un sistema de HPLC Waters Alliance 2695 se equipó con un Detector de Fotodiodos Waters 2996 y una columna de Shodex Protein KW-803 con una fase móvil de ??? . La eficiencia de la conjugación se monitoreó a 220 nm y a 280 nm. Después de 2 horas, las muestras se purificaron usando un AKTA Prime Plus (GE Healthcare) y una columna de exclusión de tamaño preparativa Superdex 200 HR 10/30. El tampón de elución fue PBS . El scFv conjugado a polímero eluyó en primer lugar seguido por el polímero libre y el Fab' sin reaccionar. Las fracciones recogidas se analizaron usando la columna de Shodex Protein KW-803 con fase móvil de PBS. Las fracciones que contienen el conjugado de scFv purificado se combinaron y se concentraron usando los filtros Vivaspin 2 (3000 MWCO) de Sartorius . 7 Ejemplo 23. Síntesis del éster de 3-hidroxipropilo del ácido bis 2 ,2- [ (2-bromoisobutiriloxi)metil]propionico Una solución de 4,40 gramos de 1 , 3 -propanodiol y 5,00 gramos de ácido bis 2 , 2- [ (2-bromoisobutiriloxi) metil] propionico (del Ejemplo 7) en 50 mi de acetonitrilo seco, junto con 500 mg de DPTS, se trató con 2,86 gramos de DCC y la reacción se agitó a temperatura ambiente toda la noche. La reacción luego se filtró y el filtrado se concentró y dio un aceite que contiene algún sólido. Esto se purificó mediante cromatografía rápida sobre gel de sílice con 30% de acetato de etilo en hexano y las fracciones que contienen el producto se combinaron y se concentraron y dieron 1,75 gramos del producto como un aceite incoloro transparente. ?? N R (400 MHz, CDC13) : d = 1,35 (s, 3H, CCH3) , 1,92 (s y m superpuesto, 14H, (CH3)2CBr y CH2CH2CH2) , 3,71 (app q, J=6 Hz, 2H, HOCH2) , 4,31 (t, J=6 Hz, 2H, CH2OC=0) , 4,37 (app q, 4H, CH2OC=OCBr) .

Ejemplo 15. Síntesis de éster de 2-oxopropanol del ácido bis 2,2-[ (2-bromoisobutiriloxi) metil] propiónico Una solución de 1,01 gramo del éster de 3 -hidroxipropilo del ácido bis 2, 2- [ (2-bromoisobutiriloxi) metil] propiónico (del Ejemplo 23) en 25 mi de diclorometano se trató con 1,75 gramos de peryodinano de Dess-Martin [Org. Synth. Coll. Vol . X, 696 (2004)] y la reacción se agitó a temperatura ambiente durante 30 minutos, en cuyo momento la reacción pareció ser completa mediante tic (gel de sílice, 30% de acetato de etilo en hexano) . La reacción se filtró y se concentró y el residuo se sometió a cromatografía de columna rápida sobre gel de sílice con 30% de acetato de etilo en hexanos para dar 730 mg del producto deseado como un aceite incoloro transparente, que se protegió de la luz y se almacenó en un centrifugador bajo una caja de guantes llena de nitrógeno. 1H N R (400 MHz, CDC13) : d = 1,33 (s, 3H, CCH3) , 1,92 (s, 12H, (CH3)2CBr), 2,83 (t, J=6,4 Hz, 2H, HC=OCH2) , 4,34 (app q, 4H, OCH2) , 4,48 (t, J=6,4 Hz , HC=OCH2CH2) , 9,79 (br s, 1H, CHO) .

Ejemplo 16. Ester de N-hidxoxisuccinimida del ácido Bis 2,2- [(2-bromoisobutiriloxi)metil]propiónico Una solución de 500 mg de ácido bis 2,2- [(2-bromoisobutiriloxi) metil] ropiónico (del Ejemplo 7) y 133 mg de N-hidroxisuccinimida en 5 mi de diclorometano se trató con 286 mg de DCC y la reacción se agitó a temperatura ambiente durante 1,5 h, en cuyo momento la reacción pareció ser completa mediante tic (gel de sílice, 30% de acetato de etilo en hexano) . La reacción se filtró y se concentró y el residuo se sometió a cromatografía de columna rápida sobre gel de sílice con 30% de acetato de etilo en hexano. Las fracciones que contienen el producto se combinaron y se concentraron y dieron 518 mg del éster de MHS deseado como un aceite incoloro, transparente. 1H MR (400' MHz, CDC13) : d = 1,55 (s, 3H, CCH3) , 1,95 (s, 12H, (CH3)2CBr), 2,84 (s ancho, 4H, 0=CCH2CH2C=0) , 4,49 (s, 4H, CH2OC=OCBr) .

Ejemplo 17. Preparación de aldehido de alto peso molecular y polímeros zwiteriónicos con funcionalidad de éster de NHS Un protocolo representativo para producir polímeros hidrófilos hechos a medida de alto peso molecular del monómero zwiteriónico, 2-metacriloiloxietil fosforilcolina (HE A-PC) , usando un proceso de radicales libres controlados "vivos", polimerización de radicales de transferencia de átomos (ATRP) , es el siguiente.

Se usaron los siguientes iniciadores NHSM2 (del Ejemplo 25) El iniciador y el ligando (2 , 2 ' -bipiridilo) se introdujeron en un tubo de Schlenk. Se introdujo gota a gota dimetil formamida o sulfóxido de dimetilo de manera tal que el porcentaje en peso del iniciador y del ligando fuera aproximadamente 20%. La solución resultante se enfrió a -78°C usando una mezcla de hielo seco/acetona y se desgasificó bajo vacío durante 10 minutos. El tubo se rellenó bajo nitrógeno y el catalizador (CuBr a menos que se indique de otro modo) , se mantuvo bajo nitrógeno, se introdujo en el tubo de Schlenck (la relación molar de bromo/catalizador/ligando se mantuvo a 1/1/2) . La solución se hizo marrón oscura inmediatamente. El tubo de Schlenck se selló y se mantuvo a -78 °C. La solución se purgó aplicando un ciclo de vacío/nitrógeno tres veces. Una solución de HEMA-PC se preparó mezclando una cantidad definida del monómero, se mantuvo bajo nitrógeno, con 200 de etanol desgasificado prueba. La solución monomérica se agregó gota a gota en el tubo de Schlenk y se homogeneizo mediante agitación leve. La temperatura se mantuvo a -78°C. Se aplicó un vacío completo a la mezcla de la reacción durante por lo menos 10 a 15 minutos hasta que cesó el burbujeo desde la solución. El tubo luego se rellenó con nitrógeno y se calentó a temperatura ambiente. La solución se agitó y cuando avanzó la polimerización, la solución se hizo viscosa. Después de 3 a 8 horas, la reacción se enfrió mediante la exposición directa al aire para oxidar Cu (I) a Cu (II) , la mezcla se hizo de color verde azulado y se pasó a través de una columna de sílice para eliminar el catalizador de cobre. La solución recogida se concentró mediante evaporación giratoria y la mezcla resultante se precipitó con tetrahidrofurano o se dializó contra el agua seguido por el secado por congelamiento para dar un polvo blanco que fluye libremente.

Los datos de las reacciones de polimerización se muestran en la siguiente tabla: Ejemplo 18. Conjugación de hormona de crecimiento humano a 75 kDa de polímero con funcionalidad de aldehido Se preparó una muestra de hormona de crecimiento humano (hGH) a una concentración de 10 mg/ml en tampón de fosfato. En un matraz por separado, el cianoborohidruro de sodio se pesó a 100 mM de concentración y se diluyó en 10 mi de tampón de fosfato de sodio, pH 6. Esto se usó inmediatamente después de diluir con PBS . Un volumen igual de cianoborohidruro de sodio en solución se agregó a la mezcla de la reacción que contiene el polímero con funcionalidad de aldehido del Ejemplo 26 y hGH. La reacción se mezcló a temperatura ambiente o a 4°C toda la noche. El porcentaje de conjugación de la reacción se monitoreó mediante HPLC usando una columna de Shodex Protein KW-803 y PBS como la fase móvil .

Las muestras se purificaron usando AKTA Prime Plus (GE Healthcare) y la columna de exclusión de tamaño preparativa Superdex 200 HR 10/30. El tampón de elución usado fue PBS. La hGH conjugada eluyó en primer lugar seguida por el polímero con funcionalidad de aldehido y hGH sin reaccionar. Las fracciones recogidas se analizaron mediante HPLC usando una columna de Shodex Protein KW-803 con fase móvil de PBS. Las fracciones que contienen el conjugado de hGH purificada se combinaron y se concentraron usando filtros Vivaspin 2 (3000 MWCO) de Sartorius.

Ejemplo 19. Conjugación de Hematida a 75 kDa de polímero con funcionalidad de éster de NHS Una solución de Hematida a una concentración de entre 1-10 mg/ml se intercambió a 0,1 M tampón de borato de sodio, pH9, usando una columna de desalado de PD-10 (GE Healthcare) . El polímero con funcionalidad de éster de NHS del Ejemplo 26 se agregó en exceso de 10 Molar a las muestras en agitación constante de Hematida a temperatura ambiente. Las reacciones avanzaron a temperatura ambiente durante 2 horas o toda la noche a 4°C. Las muestras para determinar el nivel de conjugación se analizó mediante HPLC usando una columna de Shodex KW-803 y una fase móvil de PBS. Las alícuotas de muestras se tiraron a la hora cero y 1 y 2 horas después de la conjugación. Al final de las dos horas o después de toda la noche, se agregó 1 M para enfriar la reacción.

Las muestras se purificaron usando un AKTA Prime Plus (GE Healthcare) y una columna de exclusión de tamaños preparativa de Superdex 200 HR 10/30. El tampón de elución fue PBS . El polímero con funcionalidad de éster de NHS se conjugó a Hematide eluyó en primer lugar seguido por el polímero, Hematida sin reaccionar y otras moléculas pequeñas. Las fracciones recogidas se analizaron mediante HPLC usando una columna de Shodex Protein K -803 con una fase móvil de PBS. Las fracciones que contienen el conjugado de Hematida purificada se combinaron y se concentraron usando filtros Vivaspin 2 (3000 MWCO) de Sartorius .

Ejemplo 20. Polimerización de alta presión de HEMA-PC La polimerización del monómero de HEMA-PC bajo alta presión se realizó en un recipiente de presión de acero inoxidable, revestido con vidrio. La relación HEMA-PC/iniciador de maleimida protegida de 2 ramas (del Ejemplo 8/CuBr/ bipiridilo en la gama de 500-10000/1/2/4; T=22°C en etanol; [HEMA-PC] 0=0 , 86M en etanol con DMF (1-1,5% p/p en etanol) . La presión estuvo en la gama de 1 bar a 6 kbar.

Ejemplo 30. Preparación de isopropilideno-2 , 2-bis (hidroximetil)propionato de N- [2- (2-hidroxietoxi) etil] -exo-3 , 6-epoxi-l , 2 , 3 , 6-tetrahidroftalimida Una solución de 11,0 gramos de N- [2 - (2 -hidroxietoxi) etil] -exo-3 , 6-epoxi-l , 2 , 3 , 6-tetrahidroftalimida y 8,22 gramos de ácido isopropilideno-2 , 2 -bis (hidroximetil) propiónico en 250 mi de diclorometano, junto con 1,3 gramo de DPTS y 5,24 gramos de DMAP se trató con 12,9 gramos de DCC y la reacción se agitó toda la noche. La reacción se filtró y se concentró y dio un residuo, que se sometió a cromatografía de columna rápida en dos partes sobre gel de sílice con 40 - 50% de acetato de etilo en hexano para dar el producto deseado como un aceite transparente.

Ejemplo 31. Preparación de 2 ,2-bis (hidroximetil) propionato de N- [2- (2-hidroxietoxi) etil] -exo-3 , 6-epoxi-l ,2,3,6-tetrahidroftalimida El producto precedente se disolvió en 100 mi de metanol y se trató con 2,0 gramos de resina de intercambio de ion de Dowex 50Wx8-100 (forma de H+) y la reacción se agitó a temperatura ambiente toda la noche. La reacción se filtró y se concentró y dio el producto deseado como un aceite que se usó sin nueva purificación. NMR (CD3OD) : ? 6,546 (t, 2H, CH=CH, J=0,8 Hz) , 5,158 (t, 2H, CH-O, J=0,8 Hz) , 4,180 (m, 2H, CH2-CH2-0-C=0, J= 4,9 Hz) , 3,63 (m, 10H, N-CH2 y N-CH2-CH2 y CH2-CH2-0-C=0 y CH2-0H) , 2,936 (S, 2H, CH-CH) , 1,147 (s, 3H, CH3) .

Ejemplo 32. Preparación del iniciador de 2 , 2-bis- [2 , 2-bis (2-bromoi3obutiriloimetil)propioniloximetil]propionato de N- [2- (2-hidroxiefcoxi) etil] -exo-3 , 6-epoxi-l ,2,3, 6-tetrahidrof alimida Á una solución de 1,5 gramo del diol del paso previo y 3,72 gramos de ácido 2 , 2-bis [ (2-bromoisobutiriloxi) metil] propiónico en 50 mi de diclorometano, junto con 500 mg de DPTS y 810 mg de DMAP, se trató con 1,40 gramo de diisopropilcarbodiimida y la reacción se agitó a temperatura ambiente toda la noche. La reacción se concentró y el residuo se sometió a cromatografía varias veces sobre gel de sílice con 40% de acetato de etilo en hexano. Las fracciones apropiadas en cada caso se combinaron y se concentraron para dar el producto deseado como un aceite. MR (CD3OD) : ? 6,55 (t, 2H, CH=CH, J=0,8 Hz) , 5,17 (t, 2H, CH-O, J=0,8 Hz) , 3,34 (m, 12H, CCH2) , 4,23 (m, 2H, CH2-CH2-0-C=0, J= 4 , 7 Hz) , 3,68 (m, 2H, N-CH2, J=4 , 7 Hz) , 3,64 (app q, 4H, N-CH2-CH2 y CH2-CH2-0-C=0) , 2,95 (s, 2H, CH-CH) , 1,907 (s, 24H, Br-C-CH3) , 1,34 (s, 6H, CH3) , 1,308 (s, 3H, CH3) .

Ejemplo 33. Preparación de éster de N- (ácido 3-propiónico) -exo-3 , 6-epoxi-3 , 6-dimetil-l , 2 , 3 , 6-tetrahidroftalimida con iniciador de éster de 3-hidroxipropilo del ácido 2,2-bis[(2-bromoisobutiriloxi)metil] propiónico Una solución de 738 mg del éster de 3-hidroxipropilo del ácido 2,2-bis [ (2 -bromoisobutiriloxi) metil] propiónico y 399 mg de ácido N- (3-propiónico) -exo-3 , 6-epoxi-3 , 6-dimetil-l , 2,3,6-tetrahidroftalimida en 20 mi de acetonitrilo seco, junto con 50 mg de DPTS y 100 mg de DMAP, se trató con 375 mg de DCC y la reacción se agitó a temperatura ambiente toda la noche. La reacción se filtró y dio un residuo, que se sometió a cromatografía de columna rápida sobre de gel de sílice con 30 -40% de acetato de etilo en hexano. Las fracciones apropiadas se combinaron y se concentraron y dieron 1,02 gramo del producto deseado como un aceite transparente. Mediante 1H MR, pareció que un 10% del producto ya había experimentado la retro reacción de Diels-Alder. NMR (CDC13) : d 6,19 (s, 2H, CH=CH) , 4,37 (app q, 4H, CCH20, J=10,9, 29,7 Hz) , 4,23 (t, 2H,CH2CH20, J=6,3 Hz) , 4,15 (t, 2H, CH2CH20, L7=6.3 Hz) , 3,62 (t, 2H, NCH2, J=7,4 Hz) , 3,22 (s, 2H, CHC=0) , 2,48 (t, 2H, CH2C=0, J=7,4 Hz) , 2,00 (m, 2H, CH2CH2CH2, J=6,3 Hz) , 1,92 (s, 12H, Br-C (CH3)2), 1,78 (s, 6H, CH3) , l,35(s, 3H,CH3) .

Ejemplo 34. Preparación de (éster de t-butilo del ácido N-(3-propiónico) -2 ,2-Bis [ (2-bromoisobutiriloxi) metil] propionamida Una solución de 1,00 gramo de clorhidrato del éster de t-butilo de b-alanina en 50 mi de diclorometano se trató con 25 mi de bicarbonato de sodio acuoso saturado y la mezcla se agitó durante 15 minutos. Las capas se separaron y los elementos orgánicos se secaron sobre sulfato de sodio. A esta solución se agregaron 2,38 gramos de ácido 2 , 2 -bis [ (2-bromoisobutiriloxi] metil) propionico, seguido por 1,92 mi de diisopropiletilamina y 2,1 gramos de HBTU y la reacción se agitó a temperatura ambiente toda la noche. La mezcla de la reacción luego se diluyó con otros 50 mi de diclorometano, se lavó con 2 x 50 mi de agua y se secó sobre sulfato de sodio. La filtración y la concentración dieron un aceite, que se sometió a cromatografía de columna rápida con 20 -25% de acetato de etilo en hexano. Las fracciones apropiadas se combinaron y se concentraron y dieron 730 mg de un sólido blanco. NMR (CDC13) : d 6,70 (t, ??,??, <J=5,4 Hz) , 4,33 (app q, 4H, CH20, J=16,3, 11,4 Hz) , 3,51 (q, 2H, NCH2í J=6 , 0 Hz) , 2,46 (t, 2H, CH2CO, J=6,0 Hz) , 1,93 (s, 12H, Br-C(CH3)2), 1,45 (s, 9H, C (CH3) 3) , 1,33 (s, 3H, CH3) .

Ejemplo 35. Preparación de iniciador de éster de 2-hidroxietilo del ácido 2 ,2-Bis [ (2-bromoisobutiriloxi)metil]propiónico Una solución de 4,32 gramos del ácido 2, 2 -bis [(2-bromoisobutiriloxi] metil) propiónico y 12,41 gramos de etilenglicol en 50 mi de diclorometano, junto con 883 mg de DPTS se trató con 1,39 gramos de diisopropilcarbodiimid y la reacción se agitó a temperatura ambiente toda la noche. La mezcla de la reacción se concentró, luego se repartió entre 150 mi de acetato de etilo y 70 mi de agua. La capa orgánica se concentró y el residuo se sometió a cromatografía recolumna rápida sobre gel de sílice con 20% - 40% de acetato de etilo en hexano. Las fracciones apropiadas se combinaron y se concentraron y dieron 2,7 gramos del producto deseado como un aceite transparente. R (CD3OD) : d 4,38 (app q, 4H, CCH2, J=ll,2, 30,2 Hz) , 4,20 (t, 2H, CH2OH, J=5,0 Hz) , 3,75 (t, 2H, CH2CH2OH, J=5,0 Hz) , 1,90 (s, 12H, Br-CCH3) , 1,36 (s, 3H,CH3).

Ejemplo 36. Preparación del iniciador del éster de 3-hiroxipropilo del ácido 2 ,2-Bis [ (2-bromoisobutiriloxi) metil] ropiónico Una solución de 5,31 gramos del ácido 2,2-bis[(2-bromoisobutiriloxi) metil] ropiónico y 4,68 gramos de 1,3-propanodiol en 80 mi de diclorometano y 20 mi de acetonitrilo se trató con 1,0 gramos de DPTS, seguido por 3,0 gramos de DCC, y la reacción se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas. La reacción luego se filtró, se concentró y el residuo se sometió a cromatografía de columna rápida sobre gel de sílice con 30% de acetato de etilo en hexano. Las fracciones apropiadas se combinaron y se concentraron y dieron un aceite transparente, que no fue suficientemente puro. La nueva cromatografía sobre gel de sílice con 10 - 15% de acetona en hexano dio el producto deseado como un aceite incoloro, transparente. NMR (CDC13) : d 4,38 (app q, 4H, CCH20, J=ll,2 Hz) , 4,31 (t, 2H, CH2CH20, J=6,3 Hz) , 3,71 (q, 2H, CH2OH, J=5 , 9 Hz) , 1,92 (s, 12H, Br-C(CH3)2), 1,9 (m, 2H, CH2CH2CH2) , 1,35 (s, 3H, CH3) .

Ejemplo 37. Iniciador de ll-hidroxi-3 , 6 , 9-trioxanodecanoato del ácido 2,2-Bis[ (2-bromoisobutiriloxi)metil]propiónico Una solución de 1,86 gramo de ácido 2, 2 -bis [(2 -bromoisobutiriloxi) metil] propiónico y 4,18 gramos de tetraetilenglicol en 50 mi de diclorometano, junto con 250 mg de DPTS, se trató con 1,15 gramo de DCC y la reacción se agitó a temperatura ambiente toda la noche. La reacción se filtró y el filtrado se diluyó con 50 mi de diclorometano y se lavó con 20 mi de agua. Los elementos orgánicos se secaron sobre sulfato de sodio, se filtraron y se concentraron y dieron un residuo, que se sometió a cromatografía de columna rápida sobre gel de sílice primero con 50 - 70% de acetato de etilo en hexano. Las fracciones apropiadas se combinaron, se filtraron y se concentraron y dieron 1,19 gramos del producto deseado como un aceite incoloro, transparente. N R (CDC13) : d 4,38 (app q, 4H, CCH20, J=31,8, 11,2 Hz) , 4,31 (t, 2H, CH2CH2OC=0, J=5,0 Hz) , 3,6 -3,73 (m, 14H,CH20), 2,46 (t, 1H, OH, J=6,3 Hz) , 1,92 (s, 12H, Br-C(CH3)2) , 1,35 (s, 3H, CH3) .

Ejemplo 38. Preparación del iniciador de carbonato de NHS de 11-hidroxi-3 , 6 , 9-trioxaundecanoato del ácido 2 ,2-Bis [ (2-bromoisobutiriloxi)me il]propiónico Una solución de 630 gramos del compuesto hidroxilo precedente y 1,28 gramo de carbonato de disuccinimidilo en 3 mi deacetonitrilo seco se trató con 610 mg de DMAP y la reacción se agitó a temperatura ambiente. La reacción era aún heterogénea, de manera que se agregaron 4 mi de THF seco y después de 2 horas se tornó amarilla y se hizo homogénea, pero contenía varios puntos sobre tic (gel de sílice, 50% de acetato de etilo en hexano) . La reacción se concentró y dio un residuo que se sometió a cromatografía de columna rápida sobre gel de sílice con 50 - 60% de acetato de etilo en hexano. Se aislaron dos fracciones y la fracción con un rf inferior se concentró y dio 260 mg del producto deseado como un aceite transparente. N R (CDC13) : d 4,47 (m, 2H,CH20(C=0)0) , 4,37 (app q, 4H, CCH20, J=ll,2, 31,6 Hz) , 4,30 (m, 2H, CH2CH20 (C=0) C) , 3,79 (m, 2H, CH2CH20 (C=0) C) , 3,71 (t, 2H, CH2CH20(C=0)0, J=5,0 Hz) , 3,67 (s, 4H,CH20), 3,65 (s, 4H, CH20) , 2,84 (s, 4H,CH2C=0), l,92(s, 12H, Br-C (CH3)2), 1,35 (s, 3H,CH3) .

Ejemplo 39. Preparación del iniciador del éster de solcetal del ácido 2,2-Bis[ (2-bromoisobutiriloxi)metil]propiónico Una solución de 918 mg de solcetal y 3,0 gramos del ácido 2,2-bis [ (2 -bromoisobutiriloxi) metil] propiónico, junto con 200 mg de DPTS trató con 2,15 gramos de DCC y la reacción se agitó a temperatura ambiente toda la noche. La reacción se filtró para dar un residuo, que se sometió a cromatografía rápida sobre gel de sílice con 10% de acetato de etilo en hexano. Las fracciones apropiadas se combinaron y se concentraron para dar 1,85 gramo del producto como un aceite incoloro, transparente. NMR (CDC13) : d 4,38 (app q, 4H,CCH20), 4,32 (m, 1H, OCH) , 4,19 (m, 2H, CHCH2OC=0) , 4,07 (d de d, 1H, OCH2CH, J=6,7, 8,6 Hz), 3,76 (d de d, 1H, OCH2CH, J=5,7, 8,6 Hz) , 1,92 (s, 12H, Br-C(CH3)2), 1,43 (s, 3H, (CH3)2CO), 1,36 (s, 3H, CH3) , 1,35 (s, 3H, (CH3)2CO).

Ejemplo 40. Preparación del iniciador del éster de 2,3-dihidroxipropilo del ácido 2 , 2-Bis [ (2-bromoisobutiriloxi)metil]propi6nico Una solución de 1,0 gramo del cetal previo en 50 mi de metanol se trató con 750 mg de Dowex 50 x8-100 y la reacción se agitó toda la noche. La reacción luego se filtró, se concentró y el residuo se sometió a cromatografía de columna rápida sobre gel de sílice con 20 - 40% de acetato de etilo en hexano. Las fracciones apropiadas se combinaron y se concentraron y dieron 630 mg del producto deseado como un aceite incoloro, transparente. MR (CDC13+D20) : d 4,40 (app q de d, 4H,CCH20, J=2,8, 11,5, 30,2 Hz) , 4,24 (app q de d, 2H, CHCH2OC=0, J=4 , 5 , 6,6, 11,5 Hz), 3,96 (m, 1H, CH) , 3,66 (app q de d, 2H, HOCH2CH, J=3,8, 5,6, 11,5, 37,9 Hz) , 1,92 (s, 12H, Br-C(CH3)2), 1,37 (s, 3H, CH3) .

Ejemplo 41. Preparación del iniciador del éster de 2-(2,3-dihidroxipropoxi) etilo del ácido 2 , 2-Bis [ (2-bromoisobutiriloxi) metil]propiónico A una solución de 1,5 gramo de éster de 2- (aliloxi) etilo del ácido 2- [ (2 -bromoisobutiriloxi) metil] -2 -hidroximetilpropiónico en 15 mi de agua y 15 mi de t-butanol se agregaron 2,86 gramos (3 eq) de ferricianuro de potasio, 1,20 gramo (3 eq) de carbonato de potasio, 7,5 mg de osmato de potasio deshidratado, 11 mg de quinuclidina y 276 mg (1 eq) de metanosulfonamida y la mezcla de la reacción se agitó a temperatura ambiente toda la noche. La reacción pareció ser completa mediante TLC (gel de sílice, 50% de acetato de etilo en hexano) , de manera tal que la reacción se vertió en 100 mi de agua, luego se extrajo con 100 mi de diclorometano . Los elementos orgánicos combinados se secaron sobre sulfato de sodio, se filtraron y se concentraron y dieron un residuo aceitoso, que se sometió a cromatografía de columna rápida sobre gel de sílice con 30 - 40% de acetato de etilo en hexano. Las fracciones apropiadas se combinaron, se trataron con carbono decolorante, se filtraron y se concentraron y dieron 850 mg del producto deseado como un aceite casi incoloro. MR (CDC13) : d 4,39 (app q de d, 4H, CCH20, J=4,l, 11,1, 3,0, 37,6 Hz) , 4,31(t, 2H, OCH2CH2OC=0, J=4 , 7 Hz) , 3,87 (m, 1H, CH-OH) , 3,54 - 3,77 (m, 2H,CH2-OH), 3,72(tn, 2H, OCH2CH) , 3,58(app t, 2H, OCH2CH2OC=0) , 2,68 (d, 1H, CH-OH, J=5 , 1 Hz) , 2,15 (app t, 1H, CH2-OH, J=6,l Hz) , 1,92 (s, 12H, Br-C(CH3)2), 1,36 (s, 3H, CH3) .

E emplo 42. Iniciador del 12- (aliloxi) -3 , 6 , 9 , 12-tetraoxadodecanoato del ácido 2 , 2-Bis [ (2-bromoisobutiriloxi) metil] ropionico A una solución de 1,60 g de ácido 2, 2 -bis [(2-bromoisobutiriloxi) metil] propionico y 870 mg de 12 - (aliloxi) -3 , 6 , 9 , 12 -tetraoxadodecano en 30 mi de acetonitrilo, junto con 218 mg de DPTS y 362 mg de DMAP, se agregaron 917 mg de DCC y la reacción se agitó a temperatura ambiente toda la noche. La mezcla luego se filtró y se concentró y el residuo se sometió a cromatografía de columna rápida sobre gel de sílice primero con 50 - 60% de acetato de etilo en hexanos y las fracciones que contienen el producto se combinaron y se concentraron y dieron 1,35 gramo del producto deseado como un aceite incoloro, transparente. NMR (CDC13) : d 5,87-5,97 (m, 1H, CH2CH=CH2) , 5,28 (dq, 1H, H-CH=CH) , 5,18 (dq, 1H, H-CH=CH) , 4,37 (app q, CH2OC=0) , 4,30 (dd, 2H, CH2CH2OC=0) , 4,02 (d, 2H, CH2=CHCH2) , 3, 60-3, 72 (m, 14H, CH2CH2OCH2) , 1,92 (s, 12H, Br-C (CH3)2), 1,35 (s, 3H, CH3) .

Ejemplo 43. Preparación del iniciador del éster de 12- (2,3-dihidroxipropoxi) -3 , 6 , 9 , 12-tetraoxadodecilo del ácido 2,2-bis[(2-bromoisobutiriloxi) met.il]propiónico A una mezcla de 1,29 gramo de éster de 12- (aliloxi) -3 , 6 , 9 , 12-tetraoxadodecilo del ácido 2,2-bis[(2-bromoisobutiriloxi) metil] propiónico en 15 mi de agua y 15 mi de t-butanol se agregó 1,98 gramo (3 eq) de ferricianuro de potasio, 829 mg (3 eq) de carbonato de potasio, 8 mg de osmato de potasio deshidratado, 11 mg de quinuclidina y 190 mg (1 eq) de metanosulfonamida y la mezcla de la reacción se agitó a temperatura ambiente toda la noche. La reacción pareció ser completa mediante TLC (gel de sílice, 50% de acetato de etilo en hexano) , de manera tal que la reacción se vertió en 50 mi de agua, luego se extrajo con 100 mi de diclorometano. Los elementos orgánicos combinados se secaron sobre sulfato de sodio, se filtraron y se concentraron y dieron un residuo aceitoso, que se sometió a cromatografía de columna rápida, sobre gel de sílice con 5% de metanol en diclorometano . Las fracciones que contienen el producto se combinaron y se trataron dos veces con dos espátulas pequeñas de carbono activado, filtrando entre tratamientos. La filtración y la concentración dieron un aceite gris claro que contiene una pequeña cantidad de sólido, de manera tal que se recogió en acetato de etilo y se filtró, luego se concentró y dio 1,06 gramo del producto deseado como un aceite gris claro, que aún contenía una cantidad diminuta de sólido. MR (CDC13) : d 4,38 (app q, 4H, CCH2OC=0) , 4,30 (t, 2H, CH2CH2OC=0, J=5,0 Hz) , 3,85 (p, 1H, CHOH, J=5 Hz) , 3,71 (t, 2H, OCH2CHOH, J= 4,8 Hz) , 3,72 - 3,55 (m, 16H, OCH2CH20 y CH2OH) , 3,12 (s, 1H, CHOH), 2,37 (s, 1H, CH20H) , 1,92 (s, 12H, Br-C(CH3)2), 1,35 (s, 3H, CH3) .

Ejemplo 44. Preparación de éster de 2- (aliloxi) etilo del ácido 2,2, 5-trimetil-l , 3-dioxano-5-carboxilico Una solución de 1,4 gramo de éter de monoalilo de etilenglicol y 2,35 gramos de ácido 2 , 2 , 5-trimetil-l , 3 -dioxano-5-carboxílico en 25 mi de THF anhidro se trató con 500 mg de p-toluenosulfonato de 4 -dimetilaminopiridinio (DPTS) y 1,44 gramos de dimetilaminopiridina (DMAP) , seguido por el agregado de 3,38 gramos de diciclohexilcarbodiimida y la reacción se agitó a temperatura ambiente durante 3 días. La mezcla de la reacción se filtró y se concentró y dio un residuo semisólido, que se sometió a cromatografía de columna rápida sobre gel de sílice con 20% de acetato de etilo en hexano. Las fracciones que contienen el producto se combinaron, se concentraron y se filtraron y dieron 2,83 gramos (81%) de un aceite transparente que contenía una pequeña cantidad de sólido. ?? NMR (400 MHz, CDC13) : d = 1,23 (s, 3H, C=OCCH3) , 1,39 (s, 3H, CH3) , 1,43 (s, 3H, CH3) , 3,66 (ra, 4H) , 4,02 (dd, 2H, CH2=CHCH2) , 4,20 (d, 2H) , 4,31 (t, 2H, C=OOCH2) , 5,18 (dd, 1H, =CH) , 5,28 (dd, 1H, =CH) , 5,89 (m, =CHCH2) .

Ejemplo 45. Ester de 2- (aliloxi) etilo del ácido 2,2-bis (hidroximetil)propiónico Una solución de 2,72 gramos de éster de 2 - (aliloxi) etilo del ácido 2 , 2 , 5-trimetil-l , 3-dioxano-5-carboxílico en 50 mi de metanol se trató con 1,0 gramo de resina Dowex 50W-X8 (forma de H+) y la reacción se agitó a temperatura ambiente toda la noche. La reacción se filtró y el filtrado se concentró y dio un aceite, que se sometió a cromatografía de columna rápida sobre gel de sílice con 5% de metanol en diclorometano . Las fracciones que contienen el producto se combinaron y se concentraron y dieron 2,23 gramos del producto como un aceite amarillo claro, transparente. ¾ NMR (400 MHz, CDC13) : d = 5,84-5,94 (ddt, 1H, H2C=CHCH2) , 5,28 (dq, 1H, HHC=CHCH2) , 5,22 (dq, 1H, HHC=CHCH2) , 4,36 (app t, 2H, OCH2CH2) , 4,02 (dt, 2H, H2C=CHCH2) , 3,86 (dd, 2H, CH2OH) , 3,74 (dd, 2H, CH2OH) , 3,68 (app t, 2H, OCH2CH2) , 2,90 (br d, 2H, OH) , 1, 11 (s, CH3) .

Ejemplo 46. Preparación del iniciador del éster de 2- (aliloi) etilo del ácido 2,2-Bis[ (2-bromoisobutiriloxi) metil]propiónico Una solución de 1,2 gramo de aliloxietanol, 5,0 gramos del ácido 2 , 2-bis (2-bromoisobutiriloximetil) propiónico y 690 mg de DPTS en 100 mi de diclorometano se agitó a temperatura ambiente cuando se agregaron 2,86 gramos de DCC como una solución en una cantidad pequeña de diclorometano. La reacción se agitó a temperatura ambiente toda la noche, luego se filtró y se concentró y dio el aceite. Esto se sometió a cromatografía rápida sobre gel de sílice con 10% de acetato de etilo en hexano. Las fracciones apropiadas se combinaron y se concentraron y dieron un aceite transparente, que fueron suficientemente puros. Este aceite se sometió nuevamente a la cromatografía rápida sobre gel de sílice con 3-4% de acetato de etilo en hexano . Las fracciones que contienen el producto se combinaron y se concentraron y dieron 2,78 gramos del producto deseado como un aceite incoloro, transparente. NMR (CDC13) : d 5,89 (m, 1H, CH2CH=CH2) , 5,28 (d de q, 1H, H-CH=CH, J=17,2, 1,7 Hz) , 5,20 (d de q, 1H, H-CH=CH, J=10,5, 1,5 Hz) , 4,38 (app q, 4H, CH2OC=0) , 4,31 (t, 2H, OCH2, J=4,7 Hz) , 4,01 (d de t, 2H, OCH2, J=5,6, 1,5 Hz) , 3,65 (t, 2H, OCH2, J=4,7 Hz) , 1,91 (s, 12H, Br-C (CH3)2), 1,35 (s, 3H, CH3) .

Ejemplo 47. Iniciador del éster de 2- (aliloxi) etilo del ácido 2 ,2-Bis- [2 ,2-bis (2-bromoisobutiriloximetil) propioniloximetil] propiónico Una solución de 2,42 gramos de éster de 2- (aliloxi) etilo del ácido 2- [ (2-bromoisobutiriloxi) metil] -2 -hidroximetilpropiónico y 1,73 gramo del ácido 2 , 2 - [bis- (2 -bromoisobutiriloxi) metil] propiónico en 25 mi de acetonitrilo seco, junto con 200 mg de DPTS y 580 mg de DMAP, se trató con 1,03 gramo de DCC y la reacción se agitó a temperatura ambiente toda la noche. Mediante TLC (gel de sílice, 30% de acetato de etilo en hexano) pareció que la reacción era incompleta, de manera que se agregaron otros 812 mg del ácido 2 , 2 - [bis- (2 -bromoisobutiriloxi ) metil] propiónico y 400 mg de DCC y la reacción nuevamente se agitó a temperatura ambiente toda la noche. La mezcla de la reacción se filtró y se concentró y el residuo se sometió a cromatografía de columna rápida, sobre gel de sílice primero con 20% y luego con 30% de acetato de etilo en hexanos . Las fracciones que contienen el producto se combinaron y se concentraron y dieron 1,27 gramo del compuesto deseado como un aceite incoloro, transparente. MR (CDC13) : d 5,88 (m, 1H, CH2CH=CH2) , 5,28 (d de q, 1H, H-CH=CH, J=17,4, 1,6 Hz) , 5,20 (d de q, 1H, H-CH=CH, J=10,3, 1,3 Hz) , 4,24 - 4,44 (m, 14H, CH2OC=0) , 4,01 (d, 2H, CH2=CHCH2, J=5,6), 3,65 (t, 2H, CH2CH2OCH2, J=4 , 7 Hz) , 1,91 (s, 24H, Br-C (CH3)2), 1,33 (s, 6H, CH3) , 1,30 (s, 3H, CH3) .

Ejemplo 48. Preparación del iniciador del éster de 2-[(2,3-dihidroxi)propoxi] etilo del ácido 2 , 2-Bis- [2 , 2-Bis [ (2- Bromoisobutiriloxi) propioniloximetillpropiónico A una mezcla de 1,21 gramo del éster de 2- (aliloxi) etilo del ácido 2,2-bis [ (2-bromoisobutiriloxi) metil] propiónico en 15 mi de agua y 15 mi de t-butanol se agregó 1,14 gramo (3 eq) de ferricianuro de potasio, 480 mg (3 eq) de carbonato de potasio, 7,5 mg de osmato de potasio deshidratado, 11 mg de quinuclidina y 110 mg (1 eq) de metanosulfonamida y la mezcla de la reacción se agitó a temperatura ambiente toda la noche. La reacción pareció ser completa mediante tic (gel de sílice, 50% de acetato de etilo en hexano) , de manera que la reacción se vertió en 50 mi de agua, luego se extrajo con 100 mi de diclorometano, seguido por otros 50 mi de diclorometano. Los elementos orgánicos combinados se secaron sobre sulfato de sodio, se filtraron y se concentraron y dieron un residuo aceitoso, que se sometieron a cromatografía de columna rápida sobre gel de sílice con 50% de acetato de etilo en hexano y las fracciones que contienen el producto se combinaron y se concentraron y dieron 620 mg del producto deseado como un aceite incoloro, transparente. MR (CDC13) : d 4,28-4,41 (m, 14H, CCH2OC=0) , 3,86 (m, 1H, CH2CHOHCH2) , 3,69-3, 75 (m, 3H) , 3,56-3,65 (m, 3H) , 2,78 (dd, 1H, OH), 2,23 (app t, 1H, OH), 1,92 (s, 24H, CH3CBr) , 1,34 (s, 6H, CH3) , 1,31 (s, 3H, CH3) .

Ejemplo 49. Preparación del iniciador del éster de (2-azidoetoxi) etilo del ácido 2 , 2-bis [ (2-bromoisobutiriloxi) metil]propionico A una solución de 3,30 gramos del ácido 2,2-bis[(2-bromoisobutiriloxi) metil] propionico y 1,0 gramo de 2- (2-azidoetoxi) etanol en 20 mL de acetonitrilo seco, junto con 225 mg de DPTS, se agregó 1,89 gramo de DCC y la reacción se agitó a temperatura ambiente toda la noche. La reacción se filtró y se concentró y dio un residuo, que se sometió a cromatografía de columna rápida sobre gel de sílice con 10-15% de acetato de etilo en hexano. Las fracciones apropiadas se combinaron y se concentraron y dieron 2,06 gramos del producto deseado como un aceite incoloro, transparente. NMR (CDC13) : d 4,39 (app q, 4H, CCH20, J=ll,l, 33,8 Hz) , 4,31 (t, 2H, OCH2CH2OC=0, J=5 Hz) , 3,72 (t, 2H, CH2N3, J=5 Hz) , 3,67 (t, 2H, CH2CH2N3, J=5 Hz) , 3,38 (t, 2H, OCH2CH2OC=0, J=5 Hz) , 1,92 (s, 12H, Br-C(CH3)2), 1,36 (s, 3H, CH3) .

Ejemplo 50. Preparación de 3 , 5-bis- (2-bromoisobutiriloxi) benzaldehido Una solución de 1,0 gramo de 3 , 5-dihidroxibenzaldeh£do y 4,0 mi (4 eq) de trietilamina en 20 mi de diclorometano se enfrió con un baño de hielo y agua y se agregó una solución de 3,35 gramos de bromuro de 2 -bromoisobutirilo en 5 mi de diclorometano gota a gota durante algunos minutos en que se formó mucho sólido. La reacción se agitó a temperatura ambiente durante 1,5 hora, en cuyo momento la reacción pareció ser completa mediante TLC (gel de sílice, 30% de acetato de etilo en hexano) . La reacción se lavó con 25 mi de agua, luego se concentró y dio un residuo, que se sometió a cromatografía de columna rápida sobre gel de sílice con 10% de acetato de etilo en hexano. Las fracciones apropiadas se combinaron, se trataron con una cantidad pequeña de carbono decolorante, se filtró y se concentró y dio 2,2 gramos de un aceite, que se cristalizó en el refrigerador y dio un sólido blanco. ?? NMR (400 Hz, CDCI3) : d = 2,08 (s, 12H, CH3) , 7,29 (t, 1H, J=2,4 Hz, ArH) , 7,61 (d, J=2 , 4 Hz, 2H, ArH) , 10,0 (s, 1H, CHO) .

E emplo 51. Preparación de 7- (13-aliloxi-2 ,5,8, 11-tetraoxatridecil) -2,4, 9-trifenil-1 ,3,5-triazatriciclo [3.3.1.13, 7] decano Una solución de 870 mg de metanosulfonato de ll-aliloxi-3 , 6 , 9-trioxaundecan-l-ol y 1,01 gramo de 2, 4 , 9-trifenil-1, 3 , 5-triazatriciclo [3.3.1.13 , 7] decano-7-metanol ( O2000/037658 ) en 10 mi de THF seco se trató con 410 mg de hidruro de sodio (60% en aceite) y la reacción se calentó a 80°C durante 20 horas. La reacción luego se enfrió cuidadosamente agregando algunos mi de agua, se vertió en 20 mi de NaCl saturado, luego se extrajo "con 3 x 10 mi de diclorometano . Los elementos orgánicos se secaron sobre sulfato de sodio, se filtraron y se concentraron y dieron un residuo, que se sometió a cromatografía rápida sobre gel de sílice con 25-35% de acetato de etilo en hexano. Las fracciones apropiadas se combinaron y se concentraron y dieron 920 mg del producto deseado como un aceite incoloro. NMR (DMSO-d6) : d 7,70-7,82 (m, 6H, PhH) , 7,26-7,51 (m, 9H, PhH) , 3,69-3,75 (m, 3H) , 3,56-3,65 (m, 3H) , 2,78 (dd, 1H, OH), 2,23 (app t, 1H, OH), 1,92 (s, 24H, CH3CBr) , 1,34 (s, 6H, CH3) , 1,31 (s, 3H, CH3) .

Ejemplo 52. Preparación de triclorhidrato de l-Amino-15-aliloxi- 2 , 2-bis (aminometil) - , 7 , 10 , 13-tetraoxapentadecano El compuesto triazaadamantano de la reacción previa se recogió en 20 mi de etanol y 4 mi de éter, luego se trató con 2 mi de ácido clorhídrico concentrado. La reacción se mezcló y luego se dejó en reposo a 4°C durante 1,5 hora. Luego se agregaron 30 mi de éter y la mezcla se enfrió nuevamente durante otros 30 minutos. Luego se agregaron 100 mi de éter y el producto sólido se recuperó mediante filtración, se lavó con éter y se secó bajo vacío y dio 564 mg del producto como un sólido blanco. NMR (DMSO-d6) : d 7,75 (m, 6H, CCH) , 7,44 (m, 6H, CCHCH) , 7,30 (m, 3H, CCHCHCH) , 5,86 (m, 1H, CH2=CH) , 5,70 (s, 1H, NCH (ecuatorial)), 5,250 (s, 2H, NCH(axial)), 5,23 (d de q, 1H, CH2=CH) , 5,11 (d de q, 1H, CH2=CH) , 3,93 (d de t, 2H, CH-CH2-0) , 3,55-3,25 (m, 16H, OCH2CH20) , 3,26 (m, 2H, NCH2) , 3,19 (d, 2H, NCH2) , 2,88 (s, 2H, NCH2) , 2,719 (s, 2H, CCH20) .

Ejemplo 53. Preparación del iniciador de N- (2-Bromearmetilpropionil) -l-Amino-15-aliloxi-2 ,2-bis [N- (2-bromo-2-metilpropionil) aminometil] -4,7,10, 13-tetraoxapentadecano El clorhidrato de triamina del procedimiento previo se recogió en 25 mi de diclorometano, la solución se enfrió con el baño de agua y hielo y se trató con 1,35 mi de trietilamina, seguido por el agregado de 0,46 mi de bromuro de 2-bromoisobutirilo . La reacción luego se agitó cuando se la dejó calentar a temperatura ambiente durante 2 horas. La mezcla de la reacción luego se lavó con 3 x 10 mi de 1N HC1, 2 x 10 mL de NaHC03 saturado, 10 mi de NaCl saturado y se secó sobre sulfato de magnesio. La solución se filtró y se concentró y dio un residuo, que se inundó a través de un tapón de gel de sílice con acetato de etilo. La concentración dio 989 mg del producto deseado como un aceite viscoso. NMR (DMS0-d6) : d 8,004 (t, 3H, NH) , 5,87 (m, 1H, CH) , 5,23 (d de q, 1H, CH2=CH) , 5,12 (d de q, 1H, CH2=CH) , 3,93 (d de t, 2H, CH2-CH) , 3,6 - 3,45 (m, 16H, OCH2CH20) , 3,289 (s, 2H, CCH20) , 3,12 (d, 6H, CCH2N) , 1,907 (s, 18H, CH3) .

Ejemplo 54. Preparación del iniciador de N- (2-Bromo-2-metilpropionil) -l-Amino-15- (2 , 3-dihidroxipropil) -2 ,2-bis [N- (2-bromo-2-metilpropionil) aminometil] -4,7,10, 13-tetraoxapentadecano A una mezcla de 350 mg el alqueno del procedimiento previo en 5 mi de t-butanol y 5 mi de agua se agregaron 433 mg (3 eq) de ferricianuro de potasio, 182 mg (3 eq) de carbonato de potasio, 42 mg (1 eq) de metanosulfonamida, 7,5 mg de quinuclidina y 4 mg de osmato de potasio deshidratado y la solución se agitó a temperatura ambiente toda la noche. La reacción pareció ser completa mediante TLC (gel de sílice, 5% de metanol en diclorometano) , de manera tal que se agregaron 50 mi de agua y la solución se extrajo con 50 mi de diclorometano, seguido por otros 2 x 25 mi de diclorometano. Los extractos combinados se secaron sobre sulfato de sodio, se concentraron y el residuo gris oscuro se sometió a cromatografía de columna rápida sobre gel de sílice con 2-5% de metanol en diclorometano. Las fracciones apropiadas se combinaron y se concentraron y dieron 310 mg del compuesto dihidroxi deseado como un aceite gris claro. NMR (CDC13) : d 7,91 (t, 3H, NH) , 3,88 (m, 1H, HOCH2CHOHCH2) , 3,55-3, 72 (complejo m, 21H) , 3,35 (s, 1?, OCH2C (CH2) 3) , 3,19 (d, 6H, J=6,4 Hz , CH2NH) , 1,99 (s, 18H, CH3) .

Ejemplo 55. Preparación de 7- (7-Azido-2 , 5-dioxaheptil) -2 , , 9-trifenil-1 , 3 , 5-triazatriciclo [3.3.1.13 , 7] decano A una solución de 1,1 gramo de 2 , 4 , 9-trifenil - 1 , 3 , 5-triazatriciclo [3.3.1.13 , 7] decano-7-metanol (WO2000/037658) y 585 mg de metanosulfonato de 2- (2-azidoetoxi) etilo en 15 mi de THF anhidro se agregaron 224 mg de NaH (60% en aceite) y la solución se calentó a 70°C toda la noche. Se agregaron otros 245 mg de NaH y 600 mg de metanosulfonato de 2- (2-azidoetoxi) etilo y se continuó calentando nuevamente toda la noche. La mezcla de la reacción se enfrió, se diluyó con 25 mi de agua y se extrajo con 50 mi de diclorometano . La capa orgánica se lavó con NaCl saturado, se secó sobre sulfato de sodio, se filtró y se concentró y dio un residuo. Este material se sometió a cromatografía de columna rápida sobre gel de sílice con 10-25% de acetato de etilo en hexano. Las fracciones apropiadas se combinaron y se concentraron y dieron 1,15 gramo del producto deseado como un aceite, que no era completamente puro, pero se usó en la reacción siguiente sin nueva purificación. NMR(DMSO) muy complejo.

Ejemplo 56. Preparación de triclorhidrato de l-Amino-9-azido-2 , 2-bis (aminometil) -4 , 7-dioxanonano Una solución de 1,15 gramo del compuesto triazaadamantano del procedimiento previo en 20 mi de etanol y 4 mi de éter se enfrió con un baño de agua y hielo y se agregaron 3 mi de HCI . El producto sólido empezó a formarse inmediatamente y la reacción se dejó en reposo al frío durante 10 minutos. Se agregaron otros 30 m de éter y la reacción se refrigeró toda la noche. La mezcla de la reacción se diluyó con otros 100 mi de éter y el producto sólido se aisló mediante filtración, se lavó con más éter y se secó bajo vacío y dio 800 mg del producto como un sólido blanco.

Ejemplo 57. Preparación del iniciador de N- (2-Bromo-2-metilpropionil) -l-Amino-9-azido-2 , 2-bis [N- (2-bromo-2-metilpropionil) aminometil] -4 , 7-dioxanonano Una solución de 800 mg de la sal de sal de triclorhidrato del procedimiento previo en 25 mi de diclorometano se enfrió con un baño de hielo y agua, luego se trató con 3,5 mi de trietilamina . A esta mezcla se agregó gota a gota 1,07 mi de bromuro de 2-bromoisobutirilo y la reacción se agitó mientras se calentaba a temperatura ambiente durante 2 horas. La mezcla luego se lavó con 7 x 10 mi de 1N HC1 de NaHC03 y con 10 mi de NaCl saturado, luego se secó sobre sulfato de magnesio. La filtración y la concentración dio un residuo, que se sometió a cromatografía de columna rápida sobre gel de sílice con 20-30% de acetato de etilo en hexano. Las fracciones apropiadas se combinaron y se concentraron y dieron 630 mg del producto deseado sobre un aceite. NMR(CDCl3): d 7,76 (t, 3H, NH, J=6,3 Hz) , 3,68 (m, 4H, OCH2CH20) , 3,63 (m, 2H, N3CH2CH20) , 3,40 (t, 2H, N3CH2, J=5,0 Hz) , 3,37 (s, 2H, CCH20) , 3,19 (d, 6H, CCH2N, J=6,8 Hz) , 1,99 (s, 18H, CH3) .

Ejemplo 58. Iniciador de 6 ramas de 13-Aliloxi-2 , 5 , 8 , 11-tetraoxatridecilo A una solución de 0,9 gramo de triclorhidrato de l-amino-15-aliloxi-2 , 2-bis (aminometil) -4,7,10, 13-tetraoxapentadecano y 3,89 gramos del ácido 2 , 2-bis [ (2-bromoisobutiriloxi] metil) propiónico en 25 mi de diclorometano, junto con 530 mg de DPTS y 890 mg de DMAP, se agregaron 2,7 gramos de DCC y la reacción se agitó a temperatura ambiente toda la noche. La reacción se filtró y se concentró y el residuo se sometió a cromatografía de columna rápida sobre gel de sílice con 50-70% de acetato de etilo en hexano. Las fracciones apropiadas se combinaron y se concentraron y dieron 1,9 gramo del producto deseado como un aceite viscoso.

NMR (CDC13) : d 7,78 (t, 3H, NH, J=6,5 Hz) , 5,91 (m, 1H, CH) , 5,27 (d de q, 1H, CH2=CH, J=17,4, 1,6 Hz) , 5,18 (d de q, 1H, CH2=CH, <J=10,4, 1,4 Hz) , 4.38 (app q, 12H, CH20C=O) , 4,01 (d de t, 2H, CH-CH2, J=5,7, 1,4 Hz) , 3,61 (dos m, 16H, OCH2CH20) , 3,30 (s, 2H, CCH20) , 3,14 (d, 6H, CH2N, J=6,l Hz) , 1,92 (d, 36H, BrC(CH3)2, J=l,2 Hz) , 1,38 (s, 9H, CH3) .

Ejemplo 59. Iniciador de 6 ramas de 13- (2 , 3-Dihidroxipropil) -2,5,8, 11-tetraoxatridecilo A una mezcla de 1,0 gramo del alqueno del procedimiento previo en 10 mi de agua y 10 mi de t-butanol se agregaron 638 mg (3 eq) de ferricianuro de potasio, 268 mg (3 eq) de carbonato de potasio, 10 mg de osmato de potasio deshidratado, 12 mg de quinuclidina y 61 mg (1 eq) de metanosulfonamida y la mezcla de la reacción e agitó a temperatura ambiente toda la noche. La reacción se vertió en 50 mi de agua, luego se extrajo con 50 mi de diclorometano, seguido por otros 35 mi de diclorometano. Los elementos orgánicos combinados se secaron sobre sulfato de sodio, se filtraron y se concentraron y dieron un residuo aceitoso, que se sometió a la cromatografía de columna rápida sobre gel de sílice con 2-4% de metanol en diclorometano y las fracciones que contienen el producto se combinaron y ase concentraron y dieron 417 mg del producto deseado como un aceite viscoso. NMR (CDC13) : d 7,78 (t, 3H, NH, J=6,0 Hz) , 4,39 (app q, 12H, CH2OC=0) , 3,86 (s ancho, 1H, OH-CH) , 3,62 (m, 20H, OCH2CH20 y OHCHCH20 y OH-CH2) , 3,27 (s, 2H, CCH20) , 3,13 (s, 6H, NCH2) , 2,40 (s, 2H, OH), 1,92 (s, 36H, BrC(CH3)2)/ 1,38 (s, 9H, CH3) .

Ejemplo 60. Preparación de sal interior de fosfato de 2- (Acriloiloxietil-2 ' - (trimetilamonio) etilo Primer compuesto intermedio Una solución de 11,6 gramos de 2 -hidroxietilacrilato y 14,0 mi de trietilamina en 100 mi de acetonitrilo seco, bajo una atmósfera de nitrógeno, se enfrió a -20°C y se agregó gota a gota una solución de 14,2 gramos de 2 -cloro-2 -oxo- 1 , 3 , 2 -dioxafosfolano en 10 mi de acetonitrilo seco durante 30 minutos. La reacción se agitó en frío durante 30 minutos, luego se filtró bajo una atmósfera de nitrógeno. El precipitado se lavó con 10 mi de acetonitrilo frío y el filtrado se usó directamente en la reacción siguiente.

Sal interior de fosfato de 2 - (acriloiloxietil-2 ' - (trimetilamonio) etilo A la solución del procedimiento previo se agregaron 14,0 mi de trimetilamina (condensada usando un condensador de hielo y acetona bajo nitrógeno) , la mezcla de la reacción se selló dentro de un recipiente de presión y se agitó a 65°C durante 4 horas. La mezcla de la reacción se dejó agitar mientras se enfriaba a temperatura ambiente y cuando alcanzó 30°C, se empezó a formar un sólido. El recipiente luego se colocó en un refrigerador a 4°C toda la noche. Estrictamente bajo una atmósfera de nitrógeno, el sólido se recuperó mediante filtración, se lavó con 20 mi de acetonitrilo seco frío, luego se secó bajo una corriente de nitrógeno durante 15 minutos. El sólido luego se secó bajo alto vacío toda la noche y dio 12,4 gramos del producto como un sólido blanco. NM (CDC13) : d 6,41 (dd, 1H, .7=1,6, 17,2 Hz , vinil CH) , 6,18 (dd, 1H, J=10,6, 17,2 Hz, vinil CH) , 5,90 (dd, 1H, J=l,6, 10,4 Hz, vinil CH) , 4,35 (m, 2H) , 4,27 (m, 2H) , 4,11 (m, 2H) , 3,63 (m, 2H) , 3,22 (s, 9H, N(CH3)3).

Ejemplo 61. Preparación de éster de NHS de 4-Pentin-l-ol , NHS Una solución de 1,02 gramo de ácido 4-pentinoico y 1,20 gramo de N-hidroxisuccinimida en 20 mi de acetonitrilo seco se trató con 300 mg de DPTS, seguido por 2,8 gramos de DCC y la reacción se filtró y se concentró y dio un residuo, que se sometió a cromatografía de columna rápida sobre gel de sílice con 30% de acetato de etilo en hexano. Las fracciones que contienen el producto se combinaron y se concentraron y dieron 1,62 gramo del producto deseado como un sólido blanco. NMR (CDC13) : d.2,89 (d de d, 2H, CH2C=0, J=7,9, 6,4 Hz) , 2,85 (s, 4H, 0=CCH2CH2C=0) , 2,62 (app d de d de d, 2H, CHCCH2, J=8,6, 6,9, 2,7 Hz) , 2,06 (t, 1H, CH, J=2 , 7 Hz) .

Ejemplo 62. Preparación de N-Propargilmaleimida Una solución de 1,08 gramo de clorhidrato de propargilamina en 50 mi de bicarbonato de sodio saturado se enfrió con un baño de hielo y agua y se agregaron 2,0 gramos de N-carboetoximaleimida en porciones durante algunos minutos. La reacción se agitó en frío durante 30 minutos, luego mientras se calentaba a temperatura ambiente durante 25 minutos. La reacción luego se extrajo con 3 x 25 mi de diclorometano, que se secó sobre sulfato de sodio, se filtró y se concentró. El residuo se recogió en 10 mi de de acetato de etilo y se calentó a 50 °C durante dos horas para terminar la ciclación. La reacción se concentró y el residuo fue aquel que se sometió a cromatografía de columna rápida sobre gel de sílice con 30% de acetato de etilo en hexano. Una segunda cromatografía como la anterior dio 1,24 g del producto como un aceite amarillo muy claro. MR(CDC13): d 6,77 (s, 2H, CHC=0) , 4,30 (d, 2H, NCH2, <J=2,4 Hz) , 2,22 (t; 1H, CCH, J=2 , 5 Hz) .

Ejemplo 63. Preparación de 5-Hexin-l-al Una solución de 694 mg de 5-hexin-l-ol en 20 mi de diclorometano se trató a temperatura ambiente con 3,0 gramos de peryodinato de Dess-Martin y la solución se agitó a temperatura ambiente y durante 2 horas. La reacción se filtró y el filtrado se concentró y dio un residuo, que se sometió a cromatografía de columna rápida sobre gel de sílice con acetato de etilo en hexano. La concentración de las fracciones apropiadas dio el producto como un aceite amarillo muy claro. NMR (CDC13) : d 9,81 (t, 1H, CH=0, J=2,6 Hz) , 2,61 (t de d, 2H, CH2CH=0, J=7,l, 1,2 Hz) , 2,28 (t de d, 2H, CCH2, J=7,l, 2,6 Hz) , 1,99 (t, 1H, CCH, J=2 , 6 Hz) , 1,86 ( , 2H, CCH2CH2, J=7,0 Hz) .

Ejemplo 64. Preparación del éster de 3,6,9,12-tetraoxopentadec-14-in-l-ol del ácido bis [2 , 2- (2-bromoisobutiril) hidroximetil] propiónico Un matraz de fondo redondo de 100 mi equipado con una barra de agitación se cargó con 30 mi de acetonitrilo seco, 3,0 gramos de ácido bis [2 , 2- (2-bromoisobutiril) hidroximetil] propiónico y 1,63 gramo de 3,6,9,12- tetraoxapentadec-14-in-l-ol . A la solución se agregaron 300 mg de DPTS, seguido por 1,86 gramo (1,3 eq) de DCC y la mezcla de la reacción se dejó agitar a temperatura ambiente toda la noche. La filtración y la concentración de la mezcla de la reacción dieron un residuo, que se purificó mediante cromatografía sobre gel de sílice con 20-50% de acetato de etilo en hexano . Las fracciones apropiadas se combinaron y se concentraron y dieron 1,82 gramo del producto deseado como un aceite transparente que contiene una pequeña cantidad de sólido. XH NMR (400 MHz, CDCI3) : d = 1,35 (s, 3H, CH3CC=0) , 1,92 (s, 12H, (CH3)2CBr), 2,43 (t, J=2 , 4 , 1H, CCH) , 3,64-3,72 (m, 14H, OCH2CH20) , 4,21 (d, 2H, J=2,4, HCCCH2) , 4,30 (app q, 2H, OCH2CH2OC=0) , 4,34 (dd, 2H, CH2OC=OCBr) .

Ejemplo 65. Preparación de 3 , 6 , 9 , 12-Tetraoxapentadec-14-in-l-amina Una solución de 3,5 gramos de 3 , 6 , 9 , 12 -tetraoxapentadec- 14 -in-1-ol, 1-metanosulfonato en 50 mL de amoníaco acuoso concentrado se agitó y se calentó a 100°C en un recipiente de presión durante 2 horas. El recipiente luego se enfrió y la reacción se concentró y dio un aceite amarillo. A esto se agregaron 20 mi de etanol y la solución se concentró nuevamente y dio un aceite amarillo, que se sometió a cromatografía sobre gel de sílice con 7% de metanol en dielorómetano . Las fracciones apropiadas se combinaron y se concentraron y dieron 2,24 gramos del producto deseado como un aceite amarillo. *H NMR (400 MHz, CDC13) : d = 2,54 (t, 1H, J=2,4, CCH), 3,23 (app t, 2H, CH2NH2) , 3,66 (m, 8H, OCH2CH20) , 3,74 (m, 4H, OCH2CH20) , 3,86 (app t, 2H, CH2CH2 H2) , 4,26 (d, J=2,4, 2H, CH2CCH) .

Ejemplo 66. Preparación de 7-Aliloximetil-2 , 4, 9-trifenil-l , 3,5-triazatriciclo [3.3.1.13,7] decano Una mezcla de 50 mi de DMSO y 2,8 gramos de KOH en polvo se agitó a temperatura ambiente durante 10 minutos, luego se agregaron 4,0 gramos de 2 , 4 , 9-trifenil-1 , 3 , 5-triazatriciclo [3.3.1.13,7] decano- 7 -metanol , seguido rápidamente por 1,46 gramo (1,2 eq) de bromuro de alquilo. La mezcla de la reacción se agitó a temperatura ambiente durante 3 horas, luego se repartió entre 100 mi de éter y 100 mi de agua. La capa acuosa se extrajo con otros 3 x 50 mi de éter y los elementos orgánicos combinados se secaron sobre sulfato de sodio. La filtración y la concentración dieron una espuma sólida, que se sometió a cromatografía rápida sobre gel de sílice con 5% de acetato de etilo en hexano. Las fracciones apropiadas se combinaron y se concentraron y dieron 3,51 gramos (80%) de 1 producto deseado como una espuma amarilla que se puede triturar. XH NMR (400 Hz , CDC13) : d = 2,68 (s, 2H, NCH2 adyacente a fenilos ecuatoriales), 2,92 (s, 2H, CCH2) , 3,28 (d, L7=13,4 HZ, 2H, NCH2 entre fenilos axial y ecuatorial), 3,51 (d, J=13,4 Hz, 2H, NCH2 más cercano al fenilo axial), 3,73 (d de t, <J=1,5, 5,4 Hz, 2H, CHCH20) , 5,04 (d de q, J=l,5, 10,4 Hz, 1H, CH2=CH) , 5,07 (d de q, J=l,7, 17,2 Hz, 1H, CH2=CH) , 5,42 (s, 2H, NCH axial), 5,65 (s, 1H, NCH ecuatorial), 5,71 (m, J=5,4, 10,4, 17,2 Hz, 1H, CH2=CH) , 7,2 - 7,9 (m, 15H, fenilo) .

Ejemplo 67. Preparación de triclorhidrato de 2 , 2-Bis (aminometil) - -oxahept-6-enilamína Una solución de 3,51 gramos de 7-aliloximetil-2 , 4 , 9-trifenil-1 , 3 , 5-triazatriciclo [3.3.1.13,7] decano en 30 mi de tetrahidrofurano se trató con 30 mi de 1N HCl y la reacción se agitó a temperatura ambiente durante 30 minutos. El THF se eliminó sobre el rotoevaporador y el residuo acuoso se extrajo con 3 x 25 mi de éter. La capa acuosa se concentró hasta secarse, se agregaron 20 mi de metanol y la solución se concentró nuevamente hasta secarse. El sólido blanco resultante se colocó bajo un alto vacío toda la noche y dio 2,10 gramos (93%) del producto deseado como un sólido blanco. 1H MR (400 MHz, D20) : d = 3,34 (s, 6H, CH2NH3) , 3,76 (s, 2H, 0CH2C (CH2) 3) , 4,11 (m, 2H, CH2=CHCH2) , 5,28-5, 39 (m, 2H, CH2=CHCH2) , 5,92-6, 03 (m, CH2=CHCH2) .

Ejemplo 68. Preparación de N- (2-Bromo-2-metilisobutiril) -2 ,2-bis [N- (2-bromo-2-metilpropionil) aminometil] -4-oxahept-6-enil amina Una mezcla de 2,10 gramos de triclorhidrato de 2,2-bis (aminometil) -4-oxa-hept-6-ilamina en 250 mi de diclorometano se trató con 10 mi de trietilamina, luego se enfrió con un baño de hielo y agua. A esta solución se agregaron 5,77 gramos de bromuro de 2-bromoisobutirilo gota a gota durante algunos minutos. El baño de hielo se eliminó y la solución se agitó durante 2 horas. La mezcla de la reacción se extrajo con 100 mi de agua y la capa orgánica se secó sobre sulfato de sodio. La filtración y la concentración dieron un residuo, que se sometió a cromatografía rápida sobre gel de sílice con 2-6% de acetato de etilo en diclorometano. Las fracciones apropiadas se combinaron y se concentraron y dieron 3,66 gramos (79%) del producto deseado como un sólido blanco. E NMR (400 MHz , CDC13) : d = 1,99 (s, 18H, CH3) , 3,20 (d, 6H, J=6,8, CH2NH2) , 3,34 (s, 2H, 0CH2C (CH2) 3) , 3,99 (m, 2H, CH2=CHCH2) , 5,19-5,30 (m, 2H, CH2=CHCH2) , 5,87-5,97 (m, 1H, CH2=CHCH2) , 7,72 (app t, J=6,8, 3H, NH) .

Ejemplo 69. Preparación de N- (2-Bromo-2-metilpropionil) -2 ,2-bis [N- (2-bromo-2-metilpropionil) aminometil] -4-oxa-6 , 7-dihidroxiheptil amina Una solución de 5,39 gramos de N- (2-bromo-2-metilpropionil) -2 , 2-bis [N- (2 -bromo-2 -metilpropionil) aminometil] -4-oxahept-6-enil amina en 60 mi de t-butanol y 60 mi de agua se trató con 8,8 gramos (3 eq) de ferricianuro de potasio, 3,68 gramos (3 eq) de carbonato de potasio, 850 mg (1 eq) de metanosulfonamida, 160 mg de quinuclidina y 130 mg de osmato de potasio deshidratado y la reacción se agitó a temperatura ambiente durante 4 horas. La mezcla se repartió entre 150 mi de acetato de etilo y 150 mi de agua y la capa acuosa se extrajo con otros 2 x 30 mi de acetato de etilo. Los elementos orgánicos se secaron sobre sulfato de sodio, se filtraron y se concentraron y dieron un residuo semisólido. Esto se sometió a cromatografía rápida sobre gel de sílice con 2-4% de metanol en diclorometano y las fracciones apropiadas se combinaron y se concentraron y dieron 5,33 gramos del producto deseado como una espuma gris.

Ejemplo 70. N- (2-Bromo-2-metilpropionil) -6-amino-5 , 5-bis [N- (2-bromo-2-metilpropionil) aminometil] -3-oxahexanal A una solución de 5,33 g de N- (2 -bromo-2 -metilpropionil ) -2 , 2 -bis [N- (2-bromo-2-metilpropionil) aminometil] -4-oxa-6, 7-dihidroxihep il amina en 200 mi de THF y 50 mi de agua se agregaron 3,5 gramos de metaperyodato de sodio y la reacción se agitó a temperatura ambiente durante 3 horas, luego se concentró para eliminar la mayor parte del THF. El residuo se repartió entre 100 mi de acetato de etilo y 50 mi de agua y la capa acuosa se lavó con 25 mi de acetato de etilo. Los elementos orgánicos combinados se lavaron con 50 mi de NaCl y se secaron sobre sulfato de sodio. La filtración y la concentración dieron un residuo gris, que se sometió a cromatografía rápida sobre gel de sílice con 50% de acetato de etilo en hexano y las fracciones apropiadas se combinaron y se concentraron y dieron 3,87 gramos del producto deseado como un sólido casi blanco. NMR (400 MHz, CDC13) : d = 2,00 (s, 18H, CH3) , 3,19 (d, 6H, J=6,8, CH2 H) , 3,31 (S, 2H, OCH2C (CH2) 3 ) , 4,32 (s, 2H, CHOCH2) , 8,01 (app t, J=6,8, 3H, NH) , 9,70 (s, 1H, CHO) .

Ejemplo 71. Preparación de ácido N- (2-Bromo-2-n.etilpropior.il) - 5 , 5-bis [N- (2-bromo-2-metilpropionil) aminometil] -3-oxa-6-aminohexanoico Una solución de ácido crónico (reactivo de Jones) se preparó disolviendo 2,55 gramos de trióxido de cromo en 2,2 mi de ácido sulfúrico concentrado, enfriado con un baño de hielo y diluyendo cuidadosamente la mezcla a 10 mi con agua. Una alícuota de 7 mi de este reactivo se enfrió con un baño de hielo y agua y una solución de 3,67 gramos de N- (2 -bromo-2 -metilpropionil ) -2,2-bis [N- (2 -bromo-2 -metilpropionil) aminometil] -4 -oxa-6 -oxohexil amina en 20 mi de acetona se agregó gota a gota a durante 5 minutos. La reacción se agitó en frío durante 20 minutos, luego se repartió entre 200 mi de acetato de etilo y 200 mi de agua. La capa acuosa se extrajo con otros 25 mi de acetato de etilo y los elementos orgánicos combinados se lavaron con 25 mi de NaCl saturado y se secaron sobre sulfato de sodio. La solución se filtró y se concentró y dio un aceite oscuro espeso. Esto se sometió a cromatografía decolumna rápida sobre gel de sílice con 2% de metanol en diclorometano que contiene 0,1% de ácido acético. Las fracciones apropiadas se combinaron y se concentraron y dieron 3,58 gramos del producto deseado como una espuma. XH MR (400 MHz , CDC13) : d = 2,01 (s, 18H, CH3) , 3,21 (d, 6H, J=2,8, CH2NH) , 3,36 (s, 2H, OCH2C (CH2) 3) , 4,13=2 (s, 2H, CH2C02H) , 8,15 (app t, J=2,8, 3H, NH) .

Ejemplo 72. Preparación del éster de N-hidroxisuceinimida de N- Boc-p-alanina Una solución de 8,0 gramos de N-Boc-p-alanina y 5,0 gramos de N-hidroxisuccinimida, junto con 100 mg de DPTS, en 80 mi de acetonitrilo anhidro se trató con 10,5 gramos de DCC y la reacción se agitó a temperatura ambiente durante toda la noche. La mezcla se filtró y el precipitado se lavó con acetonitrilo. El filtrado se concentró y dio un aceite, que se sometió a cromatografía rápida sobre gel de sílice con 30-40% de acetato de etilo en hexano y dio el producto deseado como un sólido blanco. XH NMR (400 MHz, CDC13) : d = 1,45 (s, 9H, C(CH3)3), 5,93 (m, 6H, NHS, CH2COON) , 3,53 (app q, 2H, NHCH2) , 5,2 (br s, 1H, NH) .

Ejemplo 73. Preparación de 3 , 6 , 9, 12-Tetraoxa-1 -inpentadecanal A una solución de 1,0 gramo de 3, 6, 9, 12-tetraoxapentadec-14-in-l-ol y 67 mg de TEMPO en 5 mi de diclorometano se agregaron 1,52 gramo de diacetato de yodobenceno y la reacción se agitó a temperatura ambiente toda la noche. La reacción se concentró y dio un aceite amarillo, que se sometió a cromatografía rápida sobre gel de sílice con 50-100% de acetato de etilo en hexano.

Las fracciones apropiadas se combinaron y se concentraron y dieron 300 mg del producto como un aceite incoloro, transparente. ? MR (400 MHz, CDCl3) : d = 2,44 (t, 1H, J=2.4, CCH) , 3,65-3,77 (m, 12H, OCH2CH20) , 4,17 (d, J=0,8, 2H, CH2CHO) , 4,21 (d, 2H, <J=2,4, CH2CCH) , 9,74= (s, 1H, CHO) .

Ejemplo 74. Preparación del iniciador de 6 ramas de 7-Azidooxi-2 , 5-dioxaheptilo Una solución de 800 mg de triclorhidrato de l-Amino-9-azido-2 , 2-bis (aminometil) -4 , 7-dioxanonano, 3,89 g de ácido bis [2,2- (2 -bromoisobutiril) hidroximetil] ropiónico, 530 mg de DPTS y 890 mg de dimetilaminopiridina en diclorometano se trató con 2,7 g de ?,?' -diciclohexilcarbodiimida y se agitó toda la noche a temperatura ambiente. La mezcla de la reacción se filtró, se concentró y se purificó mediante cromatografía rápida sobre gel de sílice con 50% de acetato de etilo en hexano y dio 2,1 g del producto deseado. XH NMR (400 MHz, CDC13) : d = 1,38 (s, 9H, CH3) , 1,92 (s, 36H, CH3) , 3,15 (d, J=6,6 Hz, 6H, CH2NH) , 3,32 (s, 2H, OCH2C) , 3,42 (t, J=5,2 HZ, 2H, N3CH2) , 3,60 (ra, 2H, OCH2CH20) , 3,66 (m, 2H, OCH2CH20) , 3,69 (t, J=5,2 Hz, 2H, N3CH2) , 4,38 (dd, J=ll,l, 17,0 Hz, 12H, CCH20) , 7,57 (t ancho, J=6,6 Hz, H2) · Ejemplo 75. Preparación del éster de N-hidroxisuccinimidilo del ácido N- (2-Bromo-2-metilpropionil) -5 , 5-bis [N- (2-bromo-2-metilpropionil) aminometil] -3-oxa-6-aminohexanoico Una solución de 64,5 mg de N-hidroxisuccinimida, 358 mg de ácido N- (2 -Bromo-2 -metilpropionil) -5, 5-bis [N- (2 -bromo-2 -metilpropionil) aminometil] -3 -oxa- 6 -aminohexanoico y 26 mg de DPTS se trató con 300 mg de ?,?' -diciclohexilcarbodiimida y se agitó toda la noche a temperatura ambiente. La mezcla de la reacción se filtró, se concentró y se purificó mediante cromatografía rápida sobre gel de sílice con 50% de acetato de etilo en hexano y dio 270 mg del producto deseado como un polvo blanco. 1H NMR (400 MHZ, CDC13) : d = 1,99 (s, 18H, CH3) , 2,87 (s, 4H, CH2CO) , 3,17 (d, J=6,6 Hz, 6H, CH2NH) , 3,39 (s, 2H, CCH20) , 4,51 (s, 2H, OCH2CO) , 7,86 (t, J=6,6 Hz, 3H, NH) .

Ejemplo 76. Preparación de N- (3 , 7 , 10 , 13-tetraoxapentadec-14-inil) -3-metilmaleimida Una alícuota de 346 mg de 3, 6, 9, 12 -tetraoxapentadec-14-in-1-amina se agregó lentamente a 224 mg de anhídrido citracónico en polvo con agitación bajo nitrógeno. Una reacción exotérmica tuvo lugar que produjo un ácido tostado. La mezcla resultante se calentó a 120 °C durante 6 horas, luego se dejó enfriar a temperatura ambiente. El producto se aisló mediante cromatografía rápida sobre gel de sílice con 50% de acetato de etilo en hexano, que dio 160 mg de un producto puro como un aceite incoloro, transparente. H NMR (400 MHz, CDC13) : d = 2,08 (d, 3H, CH3) , 2,43 (t, 1H, J=2,4 Hz, CHCCH2) , 3,58-3,72 (m, 18H, CH2CH20) , 4,20 (d, J=2,4 Hz, 2H, CCH20) , 6,32 (q, J=l,8 Hz, 1H, CHCO) .

Ejemplo 77. Preparación de N- (3 , 7 , 10 , 13-tetraoxapentadec-14-inil) maleimida Una alícuota de 1,15 g de 3 , 6 , 9 , 12 -tetraoxapentadec- 14 -in- 1-amina se agregó lentamente a 660 mg anhídrido maleico en polvo con agitación bajo nitrógeno. La mezcla luego se calentó a 120°C durante 6 horas, luego se dejó enfriar a temperatura ambiente. El producto se aisló mediante cromatografía rápida sobre gel de sílice con 50% de acetato de etilo en hexano.

Ejemplo 78. Preparación de 7-Propargiloximetil-2 , 4 , 9-trifenil-1,3, 5-triazatriciclo [3.3.1.13 , 7] decano Una solución de 3,0 g de 2 , , 9-trifenil-1 , 3 , 5-triazatriciclo [3.3.1.13 , 7] decano-7 -metanol (WO2000/037658) y 850 mg de hidróxido de potasio en 20 mi de sulfóxido de dimetilo se trató con 1,46 g de 80% de solución de bromuro de propargilo y la reacción se agitó toda la noche a temperatura ambiente. La mezcla se repartió entre 100 mi de agua y éter dietílico y la capa acuosa se extrajo dos veces con 50 mi de éter. Los elementos orgánicos combinados se lavaron con 20 mi de agua, luego se secaron, se filtraron y se concentraron. El residuo se sometió a cromatografía rápida sobre gel de sílice en 5% de acetato de etilo en hexano y dio 0,9 g del producto deseado.

Ejemplo 79. Preparación de triclorhidrato de 2 , 2-Bis (aminometil) -4-oxahept-6-inilamina Una muestra de 900 mg del [producto adamantano de propargilo del procedimiento previo] en 10 mi de tetrahidrofurano se trató con 10 mi de 1N ácido clorhídrico acuoso y se agitó a temperatura ambiente durante 30 minutos. El tetrahidrofurano luego se eliminó mediante evaporación giratoria a temperatura ambiente y la solución acuosa resultante se extrajo con 3 x 25 mi de éter. La capa acuosa se concentró cuidadosamente, se disolvió en 20 mi de metanol y se concentró y dio 568 mg del producto deseado como un polvo marrón oscuro.

Ejemplo 80. Preparación de N- (2-Bromo-2-metilisobutiril) -2 , 2-bis [N- (2-bromo-2-metilpropionil) aminometil] -4-oxahept-6-inilamina Una muestra de 580 mg de [la propargil triamina del procedimiento previo] se suspendió en 25 mi de diclorometano con 2,5 mi de trietilamina y se agitó sobre hielo. Luego se agregó 1,43 g de bromuro de bromobutirilo gota a gota y la reacción se agitó durante 2 horas mientras se calentaba gradualmente a temperatura ambiente. La mezcla se lavó con 3 x 10 mi de 1N ácido clorhídrico, 2 x 10 mi de bicarbonato de sodio saturado y 10 mi de cloruro de sodio saturado. La fase orgánica se secó sobre sulfato de magnesio anhidro, se filtró y se concentró y los residuos se sometieron a cromatografía rápida sobre gel de sílice con 5% de acetato de etilo en diclorometano y dio 700 mg del producto deseado. lH MR (400 Hz, CDC13) : d = 1,99 (s, 18H, CH3) , 2,46 (t, 1H, J=2,4 Hz, CCH) , 3,18 (d, J=6,7 Hz, 6H, CH2NH) , 3,39 (s, 2H, CH20) , 4,18 (d, J=2,4 Hz, CHCCH20) , 7,73 (t, J=6,7 Hz, 3H, NH) .

Ejemplo 81. Preparación de l-Azido-2 ,2-bis (azidometil) - 4,7,10,13, 16-pentaoxanonadec-18-eno Una solución de 530 mg de pentaeritritol triazida en 10 mi de tetrahidrofurano se trató con 380 mg de hidruro de sodio (60% de dispersión). Cuando disminuye el burbujeo, se agregó 1,24 g de 1-metanosulfonato de 3 , 6, 9, 12-tetraoxapentadec-14-en-l-ol y la reacción se agitó toda la noche a 70-80°C. La mezcla se dejó enfriar y se agregaron algunas gotas de agua para enfriar cualquier hidruro de sodio remanente, luego la mayor parte del THF se eliminó mediante concentración. El residuo se repartió entre 50 mi cada uno de agua y diclorometano. La fase acuosa se extrajo con 25 mi de diclorometano y los elementos orgánicos combinados (100 mi) se lavaron dos veces con 25 mi de cloruro de sodio saturado. La fase orgánica se secó sobre sulfato de magnesio anhidro, se filtró y se concentró y el residuo se sometió a cromatografía rápida sobre gel de sílice con 10-50% de acetato de etilo en hexano para separar dos puntos separados estrechamente. El rendimiento final fue 260 mg de un aceite incoloro transparente. XE MR (400 MHz, CDC13) : d = 3,34 (s, 2H, CCH20) , 3,35 (s, 6H, CH2N3) , 3,59 - 3,68 (m, 16H, OCH2CH20) , 4,03 (d de t, J=l,4 5,6 Hz, 2H, CHCH20) , 5,18 (d de q, J=l,4, 10,4 Hz, 1H, CH2=CH) , 5,28 (d de q, J=l,6, 17,3 Hz, 1H, CH2=CH) , 5,92 (m, J=5,6, 10,4, 17,2 Hz, 1H, CH) .

E emplo 82. Preparación del iniciador basado en clic de 9 ramas de 2,5,8,11, 14-Pentaoxaheptadec-16-enilo A una solución desgasificada de triazida alil tetraetilenglicol (120mg, 0,28 mmol) en 3 mi de etanol absoluto se agregaron 253 µ? de una solución de PMDETA en DMF (100mg/ml) (25,3mg, 0,146 mmol) seguido por 700 mg del derivado de alquino de 3 ramas (1,1 mmol, 4 equivalentes contra mol de iniciador) disuelto en 3 mi de etanol . La mezcla se desgasificó mediante 3 ciclos de vacío y nitrógeno. Luego se agregaron 21 mg de CuBr (0,146 mmol, 0,5 equivalentes o 0,17 Cu por cada azida) a la mezcla de la reacción. La reacción se desgasificó rápidamente y se dejó avanzar toda la noche bajo nitrógeno con agitación a temperatura ambiente. La cromatografía rápida sobre gel de sílice produjo el producto deseado.

E emplo 83. Preparación del iniciador basado en clic de 9 ramas de 16 , 17-Dihidroxi-2 ,5,8,11, 14-pentaoxaheptadecilo Un matraz de fondo redondo equipado con una barra de agitación se cargó con 15 mi de agua, 15 mi de t-butanol, 456 mg de triazol de alil tetraetilenglicol del procedimiento previo, 198 mg de ferricianuro de potasio, 83 mg de carbonato de potasio, 19 mg de metanosulfonamida, 1 mg de quinuclidina y 1 mg de osmato de potasio deshidratado y se agitó toda la noche a temperatura ambiente. La mezcla de la reacción se repartió entre 100 mi de cada uno de agua y diclorometano. La capa acuosa se extrajo dos veces con 25 mi de diclorometano y las capas orgánicas se combinaron, se secaron sobre sulfato de magnesio anhidro, se filtraron y se concentraron. El residuo se sometió a cromatografía rápida de gel de sílice usando metanol en diclorometano para dar el producto deseado.

Ejemplo 84. Preparación del iniciador basado en amida de 9 ramas de 2,5,8,11, 14-Pentaoxaheptadec-16-enilo Una solución de triclorhidrato de l-amino-15-aliloxi-2 , 2 -bis (aminometil) -4, 7, 10, 13-tetraoxapentadecano en acetonitrilo, junto con 6 equivalentes de trietilamina, se dejó que reaccionara con una solución de 3 equivalentes del éster de N-hidroxisuccinimidilo del ácido N- (2 -bromo-2 -metilpropionil ) -5, 5-bis [N- (2 -bromo-2 -metilpropionil) aminometil] -3-oxa-6-aminohexanoico en acetonitrilo y la mezcla se agitó toda la noche. La mezcla de la reacción se concentró y dio un residuo, que se recogió en diclorometano y se lavó con 1N HC1 , seguido por cloruro de sodio saturado, luego se secó sobre sulfato de sodio. La filtración y la concentración dieron un residuo, que se purificó mediante cromatografía rápida sobre gel de sílice con mezclas de acetato de etilo en hexano y dio el producto deseado.

Ejemplo 85. Preparación de yodoacetamida de propargil tetraetilenglicol Se agregó anhídrido yodoacético (8,8 mmol, 3,11 g) a una solución agitada de propargil tetraetilenglicol amina (8 mmol, 1,85 g) y N, -Diisopropiletilamina (8 mmol, 1,39 g) en acetonitrilo seco (20 mi) . Después de 90 minutos, la mezcla se concentró. El residuo se disolvió en 100 mi de acetato de etilo y se lavó tres veces con 100 mi de agua seguido por 50 mi de cloruro de sodio saturado. Los compuestos orgánicos se secaron sobre sulfato de sodio anhidro y se concentró y el residuo se sometió a cromatografía rápida sobre gel de sílice con 30-40% de acetato de etilo en hexano.

Ejemplo 86. Preparación de propargil tetraetilenglicol bromoacetamida Un matraz de fondo redondo equipado con una barra de agitación se cargó con propargil tetraetilenglicol amina (8 mmol, 1,85 g) , ácido bromoacético (12 mmol, 1,67 g) , dimetilaminopiridina (9,6 mmol, 1,17 g) , 4 -toluenosulfonato de 4 -Dimetilaminopiridinio (2,4 mmol, 0,71 g) y diclorometano (20 mi). Se hizo burbujear nitrógeno a través de la mezcla agitada durante 10 minutos, luego se agregó N, N-Diciclohexilcarbodiimida (15,6 mmol, 3,22 g) . Después de agitar toda la noche a temperatura ambiente, la mezcla se filtró, se concentró y se sometió a cromatografía rápida sobre gel de sílice con 40% de acetato de etilo en hexano.

Ejemplo 87. Preparación de N- (2-Bromo-2-metilisobutiril) -2,2-bis [N- (2-bromo-2-metilpropionil) aminometil] -3-amino-l-propanol Una solución de 2,00 gramos de triclorhidrato de 2 , 2 -aminometil -3-amino-l-propanol (WO2000/037658) y 9,33 mi de trietilamina en 200 mi de diclorometano se enfrió con un baño de agua y hielo y se agregaron gota a gota 9,33 mi de bromuro de 2-bromoisobutirilo . La mezcla de la reacción se dejó agitar mientras se calentaba a temperatura ambiente durante 3 horas . La solución luego se lavó con 3 x 50 mi de 1N HCl , 3 x 50 mi de bicarbonato de sodio saturado y 50 mi de cloruro de sodio saturado. La solución luego se secó sobre sulfato de magnesio anhidro, se filtró y se concentró y dio 4,67 gramos del producto deseado como un sólido blanco. Este material es pudo purificar adicionalmente mediante cromatografía sobre gel de sílice con 30-50% de acetato de etilo en hexano. XH NMR (400 MHz, DMSO-d6) : d = 1,91 (s, 18H, CH3) , 3,05 (d, 6H, J=6,4 Hz , CH2N) , 3,21 (d, 2H, J=4,4 Hz, CH2OH) , 8,17 (t, J=6,4 Hz, 3H, NH) .

Ejemplo 88. Preparación de N-t-Butiloxicarbonil-2 ,2- [bis (2-bromo-2-metilpropioniloxi)metil] -O- (2-bromo-2-metilpropionil) -etanolamina Una solución de 3,50 gramos de N-Boc tris (hidroximetil ) aminometano (J. Fluorine Chem. 2007, 128, 179) en 100 mL de diclorometano , junto con 11 mL (5 eq) de trietilamina se enfrió con un baño de hielo y agua y 6,2 mL (3,2 eq) de bromuro de 2-bromoisobutirilo se agregó gota a gota. La reacción se agitó en frío durante 3 horas, luego se la examinó mediante tic (gel de sílice, 30% de acetato de etilo en hexano) . La reacción aún no era completa, de manera que se agregaron gota a gota 3 gramos de bromuro de 2-bromoisobutirilo. Después de agitar durante otra hora la reacción se filtró y el precipitado se lavó con una cantidad de diclorometano. Los elementos orgánicos combinados se lavaron con 50 mi de bicarbonato de sodio saturado, luego se secó sobre sulfato de sodio. La filtración y la concentración dieron un residuo, que se sometió a cromatografía rápida sobre gel de sílice con 10-30% de acetato de etilo en hexano. Las fracciones que contienen el producto se concentraron en un volumen de 50 mi y luego se agregaron otros 200 mi de hexano con enfriamiento y agitación. Durante 2 horas, mucho producto sólido se cristalizó desde la mezcla. Esto se recuperó mediante filtración y se secó con aire y dio 7,1 gramos (67%) del producto deseado como un sólido cristalino blanco. 1H R (400 MHz, CDC13) : d = 1,43 (s, 9H, Boc) , 1,95 (s, 18H, (CH3)2CBr), 4,54 (S, 6H, CH20) , 4,8 (br s, 1H, NH) .

Ejemplo 89. Preparación de trifluoroacetato de 2 ,2- [Bis (2-bromo-2-metilpropioniloxi)metil] -O- (2-bromo-2-metilpropionil) etanolamina Una solución de 6,0 gramos de N-t-butiloxicarbonil-2 , 2- [bis (2-bromo-2 -metilpropioniloxi) metil] -O- (2 -bromo-2 -metilpropionil ) -etanolamina en 40 mi de diclorometano se trató con 10 mi de ácido trifluoroacético y la reacción se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora. La reacción luego se concentró y se agregaron 20 mi de hexano. La mezcla se concentró nuevamente, luego se colocó bajo alto vacío y dio 6,14 gramos del producto deseado como un sólido blanco.

Ejemplo 90. Preparación de media amida de 2 , 2- [Bis (2-bromo-2-metilpropioniloxi) metil] -O- (2-bromo-2-metilpropionil) etanolamina con anhídrido diglicólico Una mezcla de 5,03 gramos de trifluoroacetato de 2,2-[bis(2-bromo-2-metilpropioniloxi) metil] -O- (2-bromo-2-metilpropionil ) etanolamina en 50 mi de acetonitrilo se trató con 2 , 0 mi (2 eq) de trietilamina, en cuyo momento la reacción se hizo inmediatamente homogénea. Se agregó una parte de 50 mg de DMAP, seguido por 860 mg (1 eq) de anhídrido diglicólico y la reacción se agitó a temperatura ambiente durante 3 horas. La reacción luego se concentró y el residuo se disolvió en 100 mi de diclorometano y se lavó con 2 x 50 mi de 1N HC1, seguido por 50 mi de cloruro de sodio saturado. Los elementos orgánicos se secaron sobre sulfato de sodio, se filtraron y se concentraron y dieron un residuo, que se sometió a cromatografía rápida sobre gel de sílice con 50% de acetato de etilo en hexano. Las fracciones apropiadas se combinaron y se concentraron y dieron producto deseado.

Ejemplo 91. Preparación de media amida de 2 , 2- [Bis (2-bromo-2-metilpropioniloxi)metil] -O- (2-bromo-2-metilpropionil) etanolamina con éster de NHS de anhídrido diglicólico Una solución de 2,5 gramos de media amida de 2 , 2 - [bis (2 -bromo-2 -metilpropioniloxi) metil] -O- (2-bromo-2-metilpropionil) etanolamina con anhídrido diglicólico en 30 mi de acetonitrilo anhidro, junto con 500 mg de N-hidroxisuccinimida y 85 mg de DPTS, se trató con 900 mg de DCC y la reacción se agitó a temperatura ambiente toda la noche. La mezcla luego se filtró y el filtrado se concentró y dio un residuo, que se sometió a cromatografía rápida sobre gel de sílice con 50% de acetato de etilo en hexano. Las fracciones apropiadas se combinaron y se concentraron y dieron el producto deseado .

E emplo 92. Preparación del iniciador basado en ácido diglicólico de 9 ramas de 2 , 5 , 8 , 11 , 14-Pentaoxaheptadec-16-enilo Una solución de triclorhidrato de l-amino-15-aliloxi-2 , 2-bis (aminometil) -4 , 7 , 10 , 13-tetraoxapentadecano en acetonitrilo , junto con 6 equivalentes de trietilamina, reaccionó con una solución de media amida de 2,2- [bis (2 -bromo-2-metilpropioniloxi) metil] -O- (2 -bromo-2 -metilpropionil) etanolamina con éster de NHS de anhídrido diglicólico y la reacción se agitó a temperatura ambiente toda la noche. La mezcla de la reacción luego se concentró y el residuo se disolvió en 100 mi de diclorometano y se lavó con 2 x 50 mi de 1N HCl, seguido por 50 mi de cloruro de sodio anhidro. Los elementos orgánicos se secaron sobre sulfato de sodio, se filtraron y se concentraron y dieron un residuo, que se sometió a cromatografía rápida sobre gel de sílice con acetato de etilo en hexano. Las fracciones apropiadas se combinaron y se concentraron y dieron el producto deseado .

Ejemplo 93. Preparación de 2-Metil-2-hidroximetil-4 , 7 , 10 , 13 , 16-pentaoxa-18-enilnonadecanol Una solución de 3,6 gramos de 5-hidroximetil-2 , 2 , 5-trimetil-l , 3-dioxano en 100 mi de THF anhidro se enfrió con un baño de hielo y agua y se trató con 2,7 gramos de NaH (66% en aceite) . Después de que disminuyó el burbujeo, se agregaron 7,0 gramos de metanosulfonato de 3 , 6, 9, 12-tetraoxapentadec-14-en-l-ol y la reacción se agitó a 70°C durante 2 horas. La reacción se enfrió, se agregaron 7 mi de agua cuidadosamente y la mezcla de la reacción se repartió entre 100 mi de agua y 100 mi de éter. La capa acuosa se extrajo con otros 2 x 50 mi de éter y los elementos orgánicos combinados se secaron sobre sulfato de sodio. La filtración y la concentración dieron un aceite amarillo, que se sometió a cromatografía rápida sobre gel de sílice con 10-15% de acetonitrilo en hexano y dio 5,62 gramos del producto acetonuro deseado como un aceite transparente. Una parte de 4,84 gramos de este aceite se tomó en 50 mi de metanol y se trató con 1,0 gramo de resina Dowex 50Wx8 (forma de H+) y la reacción se agitó a temperatura ambiente toda la noche. La mezcla luego se filtró y el filtrado se concentró y dio 4,30 gramos del producto deseado como un aceite transparente, casi incoloro.

Ejemplo 94. Preparación de monoéster de 2-Metil-2-hidroximetil-4 , 7 , 10 , 13 , 16-pentaoxa-18-enilnonadecanol con ácido bis 2,2-[(2-bromoisobutiril) hidroximetil] propiónico Una muestra de 2-metil-2-hidroximetil-4 , 7, 10, 13 , 16-pentaoxa-18-enilnonadecanol en acetonitrilo anhidro se trató con 1 equivalente del ácido bis 2 , 2 -[ (2 -bromoisobutiril) hidroximetil] propiónico, una cantidad catalíatica de DPTS y 1,2 equivalente de DCC y la reacción se agitó a temperatura ambiente. La filtración y la concentración dieron un aceite, que se purificó mediante cromatografía rápida sobre gel de sílice con un acetato de etilo en hexano y dio el compuesto deseado.

Ejemplo 95. Preparación del iniciador híbrido de 5 ramas de 2 , 5 , 8 , 11 , 14-Pentaoxaheptadec-16-enilo Una solución de mono éster de 2-metil-2-hidroximetil-4 , 7 , 10 , 13 , 16-pentaoxa-18-enilnonadecanol , con ácido bis 2,2- [(2-bromoisobutiril) hidroximetil] ropiónico en acetonitrilo anhidro se trató con 1 equivalente de media amida de 2 , 2 - [bis (2 -bromo-2 -metilpropioniloxi) metil] -O- (2 -bromo-2 -metilpropionil ) etanolamina con anhídrido diglicólico, una cantidad catalítica de DPTS y 1,2 equivalente de DCC y la reacción se agitó a temperatura ambiente. La filtración y la concentración dieron un aceite, que se purificó mediante cromatografía rápida sobre gel de sílice con acetato de etilo en hexano y dio el inhibidor de 5 ramas deseado.

Ejemplo 96. Preparación de iniciador de 8 ramas de maleimida protegida Un matraz de fondo redondo equipado con un a barra de agitación se cargó con el tetraol de maleimida protegida (1 mmol, 543 mg) , bis (bromo) ácido (4,5 mmol, 1,94 g) , dimetilaminopiridina (3,6 mmol, 440 mg) , 4 -4 -toluenosulfonato de dimetilaminopiridinio (0,9 mmol, 265 mg) , y diclorometano (20 mi). Se hizo burbujear nitrógeno a través de la mezcla agitada durante 10 minutos, luego se agregó N, N-diciclohexilcarbodiimida (5,85 mmol, 1,21 g) . Después de agitar toda la noche, a temperatura ambiente, la mezcla se filtró, se concentró y se sometió a cromatografía rápida sobre gel de sílice, con 40% de acetato de etilo en hexano .

E emplo 97. Preparación del iniciador de 12 ramas de maleimida protegida Un matraz de fondo redondo equipado con una barra de agitación se cargó con el tetraol de maleimida protegida (1 mmol , 543 mg) , ácido de media amida de 3 ramas (4,5 mmol, 3,14 g) , dimetilaminopiridina (3,6 mmol, 440 mg) , 4 -toluenosulfonato de 4- dimetilaminopiridinio (0,9 mmol, 265 mg) y diclorometano (20 mi). Se hizo burbujear nitrógeno a través de la mezcla agitada durante 10 minutos, luego se agregó N, N-diciclohexilcarbodiimida (5,85 mmol, 1,21 g) . Después de agitar toda la noche a temperatura ambiente, la mezcla se filtró, se concentró y se sometió a cromatografía rápida sobre gel de sílice con 40% de acetato de etilo en hexano.

Ejemplo 98. Preparación de polímeros zwiteriónicos de alto peso molecular Un ejemplo de polímero de 2 ramas sintetizado usando el iniciador de NHSM2 Un protocolo representativo para producir los polímeros hidrófilos hechos a medida de alto peso molecular del monómero zwiteriónico, 2 -metacriloiloxietil fosforilcolina (HEMA-PC) , usando un proceso de radicales libres controlados "vivos" , polimerización de radicales de transferencia de átomos (ATRP) , es el siguiente.

Se usaron los siguientes iniciadores: PMC2M1 (del Ejemplo 4) PMC2M2 (del Ejemplo NHSM2 (del Ejemplo 25) A1C2M2 (del Ejemplo 24) BA1M2 (del Ejemplo 50) AcC2M2 (del Ejemplo 9) DC1E04M2 (del Ejemplo AKC1E04M2 (del Ejemplo El iniciador y el ligando (2 , 2 ' -bipiridilo a menos que se indique de otro modo) se introdujeron en un tubo de Schlenk. Se introdujo dimetilformamida o sulfóxido de dimetilo gota a gota de manera tal que el porcentaje en peso total tanto del iniciador como del ligando no excediera 20%. En el caso de que los iniciadores o ligandos fueran aceites, o que las cantidades involucradas fueran inferiores al límite de precisión del resto, los reactivos se introdujeron como soluciones en dimetil formamida (100 mg/ml) . La solución resultante se enfrió a -78°C usando una mezcla de hielo seco/acetona, y se desgasificó bajo vacío hasta que ya no se observó ningún burbujeo. La mezcla permaneció homogénea a esta temperatura. El tubo se rellenó bajo nitrógeno y el catalizador (CuBr a menos que se indique de otro modo) , se mantuvo bajo nitrógeno, se introdujo en el tubo de Schlenck. La solución se hizo marrón oscura inmediatamente. El tubo de Schlenk se selló y se mantuvo a -78°C y la solución se purgó inmediatamente aplicando un vacío. Se tuvo cuidado de que el monómero, HEMA-PC, se mantuviera como un sólido seco en condiciones inertes en todo momento hasta que estuviera listo para el uso. Una solución de HEMA-PC se preparó nueva mezclando una cantidad definida de monómero, bajo nitrógeno, con 200 etanol desgasificado prueba. La solución monomérica se agregó gota a gota al tuvo de Schlenck y se homogeneizo mediante agitación suave. A menos que se indique de otro modo, la relación del monómero (g) /etanol (mi) fue 0,255. La temperatura se mantuvo a -78°C. se aplicó un vacío completo a la mezcla de la reacción durante por lo menos 10 a 15 minutos hasta que el burbujeo desde la solución cesó. La mezcla se mantuvo homogénea a esta temperatura, es decir sin ninguna precipitación de ningún ingrediente de la reacción (tal como el iniciador o el ligando) , por lo tanto se evitó la polimerización prematura o no deseada. El tubo se rellenó con nitrógeno y el ciclo de vacío y nitrógeno se repitió dos veces. El tubo luego se rellenó con nitrógeno y se calentó a temperatura ambiente (25 °C) . Cuando continuó la polimerización, la solución se hizo viscosa. Después de algún tiempo (definido en la tabla siguiente) , la reacción se enfrió mediante la exposición directa al aire que provocó que la mezcla se hiciera de color verde azulado y se pasó a través de una columna de sílice para eliminar el catalizador de cobre. La solución recogida se concentró mediante evaporación giratoria y la mezcla resultante se purificó mediante precipitación cuidadosa en tetrahidrofurano seguida por el lavado completo con éter dietílico, o por la diálisis contra agua. El polímero se recogió como un polvo velloso (después del secado por congelamiento si se lo sometió a diálisis contra agua) y se colocó bajo vacío a temperatura ambiente.

En la siguiente tabla se muestran datos de varias reacciones de polimerización . 22 Solvente de tnetanol/agua solvente (75/25) v/v 2Solvente de etanol/glicerol (50/50) v/v 3Monómero (g) /solvente (mi) 0,33 Monómero (g) /solvente (mi) 0,40 5Monómero (g) /solvente (mi) 0,50 El peso molecular pico (Mp) , el peso molecular en número (Mn) y la polidispersidad (PDI) se determinaron mediante difusión de luz de varios ángulos.

Ejemplo 99. Otras preparaciones de polímeros zwiteriónicos de alto peso molecular Un ejemplo de polímero de 3 ramas sintetizado usando el iniciador DC1E04N 3 Un protocolo representativo alternativo para producir polímeros hidrófilos hechos a medida, de alto peso molecular del monómero zwiteriónico, 2-metacriloiloxietil fosforilcolina (HEMA-PC) , usando un proceso de radicales libres controlados "vivos" , polimerización de radicales de transferencia de átomos (ATRP) es el siguiente.

Se usaron los siguientes iniciadores: H0C1 3 (del Ejemplo 87) El iniciador y el ligando (2 , 2 ' -bipiridilo a menos que se indique de otro modo) se introdujeron en un tubo de Schenck. Se introdujo dimetilformamida o sulfóxido de dimetilo gota a gota de manera tal que el porcentaje en peso total tanto del iniciador como del ligando no excediera 20%. En el caso de que los iniciadores o ligandos fueran aceites, o que las cantidades involucradas estuvieran por debajo del límite de precisión del resto, los reactivos se introdujeron como soluciones en dimetil formamida (100 mg/ml) . La solución resultante se enfrió a -78 °C usando una mezcla de hielo seco/acetona y se desgasificó bajo vacío hasta que no se observó nuevo burbujeo. La mezcla permaneció homogénea a esta temperatura. El tubo se rellenó bajo nitrógeno y el catalizador (CuBr a menos que se indique de otro modo) , se mantuvo bajo nitrógeno, se introdujo en el tubo de Schlenck. La solución se hizo marrón oscura inmediatamente. El tubo de Schlenck se selló y se mantuvo a -78 °C y la solución se purgó inmediatamente aplicando un vacío. Se tuvo cuidado de asegurarse de que el monómero, HEMA-PC, se mantuviera como un sólido seco en condiciones inertes en todo momento hasta que estuviera listo para usarlo. Se preparó una solución de HEMA-PC nueva mezclando una cantidad definida del monómero, mantenida bajo nitrógeno, con 200 prueba etanol desgasificado. Una solución desgasificada de CuBr2 en dimetil formamida (100 mg/ml) se agregó a la solución de HEMA-PC bajo nitrógeno en la relación de haluro/CuBr/CuBr2 de 1/0,9/1 para tiempos de reacción de hasta 24 horas y de 1/0,75/0,25 para tiempos de reacción superiores a 24 horas. La solución resultante se agregó gota a gota en un tubo de Schlenck y se homogeneizó mediante agitación leve. A menos que es indique de otro modo, la relación del monómero (g)/etanol (mi) fue 0,50. La temperatura se mantuvo a -78 °C. Se aplicó un vacío completo a la mezcla de la reacción durante por lo menos 10 a 15 minutos, hasta que cesó el burbujeo desde la solución. La mezcla se mantuvo homogénea a esta temperatura, es decir, sin ninguna precipitación de ningún ingrediente de la reacción (tal como el iniciador o el ligando) evitando de ese modo la polimerización prematura o no querida. El tubo se rellenó con nitrógeno y el ciclo de vacío-nitrógeno se repitió dos veces. El tubo luego se rellenó con nitrógeno y se calentó a temperatura ambiente (25 °C) . Cuando avanzó la polimerización, la solución se hizo viscosa. Después de algún tiempo (definido en la tabla siguiente) , la reacción se enfrió mediante la exposición directa al aire que produjo que la mezcla se hiciera de color verde azulado y se pasó a través de una columna de sílice para eliminar el catalizador de cobre. La solución recogida se concentró mediante evaporación giratoria y la mezcla resultante se purificó mediante precipitación cuidadosa en tetrahidrofurano seguida por el lavado completo con éter dietílico o por la diálisis contra agua. El polímero se recogió como un polvo velloso blanco (después del secado por congelamiento si se dializó contra agua) y se colocó bajo vacío a temperatura ambiente.

Los datos de varias reacciones de polimerización se muestran en la siguiente tabla.

Monómero (g) /solvente (mi) 0,33 La relación de haluro/CuBr/CuBr2 fue 1/0,9/0,1 para tiempos de reacción de hasta 24 horas y 1/0.75/0.25 para tiempos de reacción mayores de 24 horas.

El peso molecular pico (Mp) , el peso molecular en número (Mn) y la polidispersidad (PDI) se determinaron/obtuvieron mediante difusión de luz de varios ángulos.

Ejemplo 100. Preparación de polímeros de PEG de alto peso molecular Un protocolo representativo para producir polímeros hidrófilos hechos a medida, de alto peso molecular del monómero hidrófilo poli (etilenglicol) metil éter metacrilato, peso molecular 475 (HEMA-PEG475) , usando un proceso de radicales libres controlados "vivos", polimerización de radicales de transferencia de átomos (ATRP) , es esencialmente el mismo que el protocolo descrito en el Ejemplo 98 con las siguientes diferencias. El monómero (HEMA-PEG 475) se disolvió en 200 prueba y la solución se desgasificó usando la técnica de congelamiento-bomba-descongelamiento (3 ciclos) . La mezcla desgasificada resultante se introdujo bajo nitrógeno a -78 °C en una solución desgasificada del iniciador, ligando y Cubr. La mezcla resultante se desgasificó a -78°C, se dejó descongelar y se colocó bajo nitrógeno a temperatura ambiente .

¦Monómero (g) /solvente (mi ) 0 , 50 2PDI más alta debido a polimerización heterogénea debido al congelamiento de la mezcla a -78°C 3PDI más baja debido al agregado de cosolvente de etilenglicol (impide el congelamiento a -78°C) Ejemplo 101. Preparación de polímeros de acrilamida de alto peso molecular Un protocolo representativo para producir polímeros hidrófilos hechos a medida, de alto peso molecular, de los monómeros hidrófilos, N, N-dimetil acrilamida (DMA), acrilamida (AM) o N-isopropilacrilamida (NPAM) , usando un proceso de radicales libres controlados "vivos", polimerización de radicales de transferencia de átomos (ATRP) , es esencialmente el mismo que el protocolo descrito en el Ejemplo 99 con las siguientes diferencias. El ligando usado fue tris [2 -dimetilamino] etil] amina (Me6TREN) y 3,3 molxlO"5 se agregó en las Muestras 1 y 2 y 1,5 molxlO"5 a todas las demás muestras y el solvente fue agua. La relación de haluro/CuBr/CuBr2/Me6TREN fue 1/0,75/0,25/1 en cada caso. Después de agregar el catalizador, el recipiente se selló y se colocó a 0°C. Una solución acuosa de derivado de acrilamida, DMA, AM o NIPAM, se desgasificó usando la técnica de congelamiento-bomba-descongelamiento (3 ciclos) y se introdujo en el tubo de Schlenck que contiene el iniciador, el ligando y los catalizadores a través de una cánula bajo nitrógeno. El recipiente se selló y la reacción se dejó avanzar a 4°CX. Después de algún tiempo, la reacción se enfrió mediante la exposición directa al aire. La mezcla de la reacción de color verde azulado se pasó a través de un tapón corto de gel de sílice para eliminar el catalizador de cobre. La solución recogida se concentró mediante liofilización.

'Monómero de AM 2Monómero de DMA 3Monómero de NIPAM La relación de haluro/CuBr/CuBr2/Me6TREN fue 1/0,75/0,25/1 en cada caso.

E emplo 102. Generación de grupos funcionales aldehido a partir de precursores de diol después de la polimerización de iniciadores con funcionalidad de diol Un gran exceso de peroxidato de sodio disuelto en agua destilada se agregó a una solución de polímero con funcionalidad de diol en agua destilada (10% en peso) . La reacción se dejó avanzar a temperatura ambiente durante 90 minutos a la sombra.

La reacción se enfrió con una solución acuosa de glicerol (1,5X contra NaI04) para eliminar todos los peryodatos de sodio que no reaccionaron. La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 15 minutos y se colocó en una bolsa de diálisis (MWCO 14 a 25 kDa) y se purificó mediante diálisis a temperatura ambiente durante un día. Luego se eliminó el agua mediante liofilización y el polímero se recogió como un polvo seco. La cuantificación de la funcionalidad de aldehido se hizo uniendo el colorante fluorescente de hidrazina Cy5.5 (GE Healthcare) .

Ejemplo 103. Unión de N-propargil maleimida y 5-hexin-l-al a polímeros con funcionalidad de azido Los siguientes reactivos se unieron a polímeros con funcionalidad de azido: N-propargil maleimida (desde el Ejemplo 62) o 5-hexin-l-al (desde el Ejemplo 63) o A una solución desgasificada de polímero con funcionalidad de azido en 200 prueba etanol se agregó un exceso de derivado de alquino (1,2 equivalentes por cada grupo azido) seguido por el ligando ?,?,?' ,N" ,N" -pentametildietilenotriamina (PMDETA) que se introdujo como una solución de materia prima en DMF (100 mg/ml) . La mezcla se desgasificó mediante 3 ciclos de vacio/nitrógeno. Se agregó bromuro de cobre (I) a la reacción normalmente en una relación de 0,2 a 1 contra el grupo azido. La relación de CuBr/PMDETA fue 1/1. La reacción se desgasificó nuevamente y se agitó toda la noche a temperatura ambiente.

Se usaron los siguientes polímeros (Muestras 1, 2, 8, 9 y 10 del Ejemplo 98; Muestra 4 desde el Ejemplo 100; y Muestras 3, 5, 6 y 7 desde el Ejemplo 99) : Ejemplo 104. Conjugados de Fab' monoclonal humano recombinante a polímeros con funcionalidad de maleimida Se usaron los siguientes polímeros con uncionalidad de maleimida (desde el Ejemplo 98 después de la desprotección de acuerdo con el Ejemplo 16) : La conjugación de Fab' humano recombinante (peso molecular 50 kDa) se realizó en 10 mM de acetato de sodio a pH 5 que contiene 2 mM de EDTA con lOx exceso molar de TCEP y 5-10 veces el exceso molar de polímero con funcionalidad de maleimida. La concentración final del Fab' en la mezcla de la reacción era 1-2 mg/ml y la reacción se realizó a la sombra a temperatura ambiente durante 5 horas seguido por toda la noche a 4°C moviendo suavemente usando una tabla de balanceo. Los conjugados de Fab' - polímero resultantes se purificaron usando una cromatografía de intercambio de iones sobre una columna de MacroCap SP (MSP) de GE Healthcare usando 20 mM Tris pH 7,4 como el tampón de unión. En general, la reacción de conjugación (que contiene aproximadamente 5 mg de proteína) se diluyó 4 veces en el tampón de unión y se cargó en una columna de MSP de 2 mi mediante flujo de gravedad. La columna se lavó con por lo menos 10 volúmenes de columna (CV) del tampón de unión. La elución del conjugado se realizó eluyendo la columna con un tampón de unión que contiene 40-50 mM NaCl para por lo menos 10 CV. Las fracciones recogidas se concentraron con un concentrador Amicon Ultrafine con una membrana de corte de peso molecular de 10 kDa y el tampón se intercambió en un tampón de unión que contiene 0,5 M NaCl y también se concentró a una concentración de proteína final de por lo menos 1 mg/ml. El conjugado final era estéril filtrado con un filtro de 0,22 micrón y se almacenó a 4°C antes del uso. La concentración final de proteína se determinó usando un OD 289 nm con un coeficiente de extinción de Fab' de 1,46 (1 mg/ml de solución en una cubeta de camino de 10 mm de longitud) . La concentración de conjugado luego se calculó incluyendo el peso molecular del polímero además del Fab' .

El peso molecular del conjugado se analizó usando una columna de Shodex 806MHQ con un sistema de HPLC Waters 2695 equipado con un detector de Red de fotodiodos 2996 y un detector de difusión de luz de varios ángulos miniDA N Treos . La PDI y el Mp se calcularon usando el Software ASTRA que se asoció con el detector Wyatt ALS y los datos se presentan en la tabla precedente. Además, en todos los casos la estequiometría de los conjugados se mostró que era 1 a 1 entre Fab' y el polímero.

Ejemplo 105. Conjugación de citoquina humana recombinante a polímeros con funcionalidad de aldehido Se usaron los siguientes polímeros con funcionalidad de aldehido (de los Ejemplos 98 y 99 después de la oxidación de acuerdo con el Ejemplo 102 excepto cuando se indica de otro modo) : 1Polímeros del Ejemplo 103 (aldehido unido a través de la química de clic) 2DC1M2 iniciador (es decir, ningún separador) 3DC1E0M2 iniciador (es decir, separador de óxido de etileno) Los conjugados de 22 kDa de citoquina humana recombinante con un pH de 5,02 se realizó en 10 mM tampón de HEPES a pH 7 que contiene 40 mM de cianoborohidruro de sodio. La concentración de proteína final era 1-1,5 mg/ml en la presencia de 6-7 veces el exceso molar del polímero disuelto en el tampón de conjugación. La reacción se realizó a temperatura ambiente o 4°C toda la noche a la sombra con mezcla suave usando una tabla de balanceo.

La eficiencia de conjugación se monitoreó usando dos métodos: (i) un método semicuantitativo usando el análisis de SDS-PAGE y (ii) un método cuantitativo usando la cromatografía de exclusión de tamaños analítica (SEC) con una columna de SEC-10 ProPac, 4x300 mm de Dionex Corporation.

La purificación de los conjugados de citoquina y polímeros resultantes se realizó usando una columna de Q Sefarosa HP (QHP) de intercambio de aniones de GE Healthcare. En general, la reacción de conjugación (que contiene aproximadamente 1 mg de proteína) se diluyó por lo menos 4 veces con un tampón de lavado de QHP que contiene 20 mM de Tris pH 7,5 y se cargó sobre una columna de QHP de 2 mi mediante flujo de gravedad. La columna se lavó con por lo menos 10 volúmenes de columna (CV) de tampón de lavado. La elución del conjugado se logró eluyendo la columna con un tampón de lavado que contiene 40-50 mM NaCl durante por lo menos 5 CV. Las fracciones recogidas se concentraron con un concentrador Amicon Ultrafree con una membrana de corte de peso molecular de 10 kDa, el tampón se intercambió en lxPBS pH 7,4 y se concentró nuevamente a una concentración de proteína final de por lo menos 1 mg/ml. Los conjugados finales se filtraron estériles con un filtro de 0,22 micrón y se almacenaron 4°C antes del uso. La concentración de proteína final se determinó usando un OD 277 nm con el coeficiente de extinción de citoquina de 0,81 (1 mg/ml de solución en una cubeta de longitud de camino de 10 mm) . La concentración del conjugado luego se calculó incluyendo el peso molecular del polímero además de la proteína.

La caracterización de los conjugados de citoquina y polímero se realizó con los siguientes ensayos: (i) el peso molecular del conjugado se analizó usando una columna de Shodex 806 MQ con un sistema de HPLC aters 2695 equipado con un Detector de Red de Fotodiodos 2996 y un detector de difusión de luz de varios ángulos Wyatt miniDAWN Treos . La PDI y el Mp se calcularon usando el Software ASTRA que se asoció al detector Wyatt MALS y los datos se presentan en la tabla precedente. Además, en todos los casos la estequiometría de los conjugados se mostró que era de 1 a 1 entre la proteína y el polímero; (ii) análisis de SDS-PAGE usando el manchado de Azul de Coomassie. La presencia del conjugado de alto peso molecular y la falta de proteínas libres en condiciones de no reducción así como de reducción proporcionaron una buena indicación de que la proteína se conjugó en forma covalente a los polímeros. Además, no hubo ningún signo de asociación no covalente entre la proteína y los polímeros ni la presencia de un agregado de proteínas mediado por enlaces de disulfuro intermoleculares en las preparaciones de conjugados de proteína y polímero purificados.

Se observó una diferencia muy importante entre las Muestras 3 y 4. La Muestra 3 se construyó desde un polímero que se hizo usando el inhibidor de DC1M2 que no tiene ningún separador entre el grupo funcional final y el núcleo de iniciador. La Muestra 4 se construyó a partir de un polímero que se hizo usando el iniciador de DC1E0M2 que tiene un solo separador de óxido de etileno entre el grupo funcional de extremo y el núcleo de iniciador. La eficiencia de la conjugación para la Muestra 4 fue 5 veces más alta que para la Muestra 3 lo cual indica la importancia de la química del separador para influir en la reactividad de los grupos funcionales.

Ejemplo 106. Conjugación de proteína de varios dominios humana recombinante a polihidroxi con funcionalidad de aldehido Se usaron los siguientes polímeros con funcionalidad de aldehido (de los Ejemplos 98 y 99 después de la oxidación de acuerdo con el Ejemplo 102) : La conjugación de una proteína de varios dominios humana recombinante de 21 kDa con un pH de 4,77 se realizó en tampón de HEPES de 10 mM a pH 7 que contiene 40 mM de cianoborohidruro de sodio. La concentración de proteína final era de 1-1,5 mg/ml en la presencia de 6-7 veces el exceso molar del polímero disuelto en el tampón de conjugación. La reacción se realizó a temperatura ambiente o a 4°C toda la noche a la sombra con mezcla suave usando una tabla de balanceo.

La eficiencia de la conjugación se monitoreó usando dos métodos: (i) un método semicuantitativo usando un análisis de SDS-PAGE y (ii) un método cuantitativo usando cromatografía de exclusión de tamaño analítica (SEC) con una columna de Prozac SEC-10, 4x300 mm de Dionex Corporation.

La purificación del conjugado de proteína y polímero resultante se realizó usando una columna de Q Sefarosa HP (QHP) de intercambio de aniones de GE Healthcare. En general, la reacción de conjugación (que contiene aproximadamente 1 mg de proteína) se diluyó por lo menos 4 veces con tampón de lavado de QHP que contiene 20 mM Tris pH 7,5 y se cargó sobre una columna de QHP de 2 mi mediante flujo de gravedad. La columna se lavó con por lo menos 10 volúmenes de columna (CV) de tampón de lavado. La elución del conjugado se logró eluyendo la columna con un tampón de lavado que contiene 40-50 mM NaCl para por lo menos 5 CV. Las fracciones recogidas se concentraron con un concentrador Amicon Ultrafree con una membrana de corte de peso molecular de 10 kDa, se intercambió el tampón en lxPBS pH 7,4 y se concentró adicionalmente a una concentración de proteína final de por lo menos 1 mg/ml. Los conjugados finales fueron estériles filtrados con un filtro de 0,22 micrón y se almacenaron a 4°C antes del uso. La concentración de proteína final se determinó usando un OD 280 nm con el coeficiente de extinción de proteína de dominio de 1,08 (1 mg/ml de solución en una cubeta de longitud de camino de 10 mm) . La concentración del conjugado se calculó entonces incluyendo el peso molecular del polímero además de la proteína.

La caracterización de los conjugados de proteína y polímero se realizó con los siguientes ensayos: (i) se analizó el peso molecular del conjugado usando una columna Shodex 806MHQ con un sistema de HPLC aters 2695 equipado con un Detector de Redes de Fotodiodos 2996 y un detector de difusión de luz de varios ángulos Wyatt microDAWN Treos . La PDI y el p se calcularon usando el Software ASTRA que estuvo asociado al detector Wyatt MALS y los datos se presentan en la tabla precedente. Además, en todos los casos la estequiometría de los conjugados se mostró que era 1 a 1 entre la proteína y el polímero; (ii) análisis de SDS-PAGE usando mancha de Azul de Coomassie. La presencia del conjugado de alto peso molecular y la falta de proteína libre en condiciones sin reducción y con reducción proporcionó una buena indicación de que la proteína estaba conjugada en forma covalente a los polímeros. Además, no hubo ningún signo de asociación no covalente entre la proteína y los polímeros ni la presencia de agregado de proteína mediada por enlaces de disulfuro intermoleculares en las preparaciones de conjugados de proteína y polímero .

Ejemplo 107. Conjugación de citoquina humana recombinante y proteína de varios dominios humana recombinante a polímeros de HEMA-PEG con funcionalidad de aldehido Un polímero de HEMA-PEG475 con funcionalidad de azido de 6 ramas con un peso molecular de 312,9 kDa se elaboró de acuerdo con el procedimiento del Ejemplo 100. El grupo funcional aldehido se introdujo uniendo 5-hexin-l-al al grupo funcional azido de acuerdo con los procedimientos del Ejemplo 100. Este polímero se conjugó a citoquina recombinante de 22 kDa y la proteína de varios dominios humana recombinante de 21 kDa generalmente de acuerdo con los procedimientos de los Ejemplos 105 y 106 respectivamente con las siguientes diferencias. Después de la incubación toda la noche a temperatura ambiente en condiciones inertes en la oscuridad, las reacciones se enfriaron agregando 20 mM Tris pH 7,5 y las muestras se sometieron a cromatografía usando la cromatografía de intercambio de aniones débiles (columna Shodex DEAE-825) usando un sistema de HPLC Waters equipado con un módulo de suministro de solvente capaz de formación de gradiente y un detector de radiación ultravioleta para la detección de trazas de cromatogramas . 15µ1 de cada muestra se aplicaron a la columna a una velocidad de flujo de lml/minuto seguido por un lavado isocrático de 5 minutos en tampón A (20 mM Tris pH 7,4) seguido por un gradiente lineal de 80% tampón (tampón A que contiene 0, NaCl) durante 9 minutos. El gradiente de sal se mantuvo al 80% durnte 2 minutos antes de inclinarse hacia atrás hacia el 100% de tampón A para la regeneración de columna. En el transcurso de la separación cromatográfica, se recogieron manualmente fracciones pico de proteína, detectadas por un OD220 nm, para otro análisis mediante SDS-PAGE. Se recogieron tres picos principales. El primer pico eluyó a 1,8-3 minutos durante el lavado isocrático inicial, esta fracción es equivalente al polímero libre no conjugado debido al hecho de que el polímero que tiene carga neutra fluyó a través de la columna, el segundo pico fue la fracción de conjugado unido débilmente que eluyó temprano en el gradiente de sal; y la última fracción que eluyó más tarde en el gradiente correspondió a la proteína libre no conjugada. Las 3 fracciones se recogieron y se concentraron con Amicon Ultrafree 4 con un concentrador de 10K MWCO. Las fracciones concentradas se analizaron nuevamente con SDS-PAGE seguida por la mancha de Azul de Coomassie y por' SEC-MALS como se describe en los ejemplos citados anteriormente y los datos se muestran en la siguiente tabla: Ejemplo 108. Preparación de éster de t-butilo de N-2-Bromoisobutiril-p-alanina Una mezcla de 1,92 gramo de clorhidrato de t-butil- -alaninaen 25 mi de diclorometano se enfrió con un baño de hielo y agua y se agregaron 25 mi de 1N NaOH, seguido por 2,53 gramos de bromuro de 2 -bromoisoburilo . La reacción se agitó en frío durante 15 minutos, luego las capas se separaron y los elementos orgánicos se secaron sobre sulfato de sodio. La filtración y la concentración dieron un aceite, que se sometió a cromatografía rápida sobre gel de sílice con 40% de acetato de etilo en hexano. Las fracciones apropiadas se combinaron y se concentraron y dieron 2,78 gramos del producto deseado como un aceite transparente. ¾ NMR (400 MHz, CDC13) : d = 1,47 (s, 9H, Boc) , 1,94 (s, 6H, (CH3)2CBr), 2,48 (t, 6H, J=6, CH2C=0) , 3,50 (app q, 2H, J=G, CH2 H) .

Ejemplo 109. Preparación de éster de 2- (difenilfosfino) fenilo de N-2-Bromoisobutiril- -alanina Una solución de 2,78 gramos de éster de -butilo de N-2- bromoisobutiril- -alanina en 5 mi de ácido fórmico se agitó a temperatura ambiente toda la noche. La reacción luego se concentró y dio un aceite, que se repartió entre 50 mi de éter y 50 mi de agua. La capa orgánica se secó sobre sulfato de sodio, se filtró y se concentró y dio 1,66 gramo de un sólido blanco. Este sólido se recogió en 20 mi de acetonitrilo anhidro y se agregó 1,94 gramo de (2-hidroxifenil) difenilfosfina, seguida por 200 mg de DPTS y 1,88 gamo de DCC . La reacción se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas, en cuyo momento la reacción pareció ser completa mediante tic (gel de sílice, 50% de diclorometano en hexano) . La reacción se filtró y se concentró y dio un aceite, que se sometió a cromatografía rápida sobre gel de sílice con 10-20% de acetona en hexano y dio el producto deseado como un aceite viscoso. XH NMR (400 MHz, CDC13) : d = 1,95 (s, 6H, (CH3)2CBr) , 2,55 (t, 2H, J=6, CH2C=0) , 3,44 (app q, 2H, J=6, CH2NH) , 6,85 (m, 1H, PhH) , 7,15 (m, 2H, PhH) , 7,25-7,42 (m, 12H, PhH) .

Los compuestos de este tipo se ueden usar para introducir grupos funcionales en uniones de Staudinger "sin trazas" (J. Am. Chem. Soc . 2006, 128, 8820) con polímero de azido.

Ejemplo 110. Preparación del éster de (2-difenilfosfino) fenilo del ácido 3-Maleimidopropiónico Una solución del ácido 3 -maleimidopropiónico (J. Am. Chem. Soc. 2005, 127, 2966) , junto con 1 equivalente de 2- (hidroxifenil) difenilfosfina (Catálisis Hoy 1998, 42, 413) en acetonitrilo anhidro se trató con una cantidad catalítica de DPTS, seguido por 1,2 equivalente de DCC y la reacción se agitó a temperatura ambiente toda la noche. La reacción se filtró y el filtrado se concentró y dio un residuo, que se purificó mediante cromatografía rápida sobre gel de sílice con acetato de etilo en hexano y dio el producto deseado.

Ejemplo 111. Preparación des éster de 2- (hidroxifenil) difenilfosfino del ácido 9-Hidroxi- , 7-dioxanonanoico Una solución del éster de 2- (hidroxietil ) difenilfosfino del ácido 9-t-butildifenillsililoxi-4 , 7-dioxanonanoico en THF se trató con fluoruro de tetrabutilamonio y la reacción se agitó a temperatura ambiente. La concentración dio un residuo, que se repartió entre acetato de etilo y agua. Los elementos orgánicos se secaron sobre sulfato de sodio y se usaron en la reacción siguiente sin nueva purificación.

Ejemplo 112. Preparación de éster de 2- (hidroxifenil) difenil osf no del ácido 9-Oxo-4 , 7-dioxanonanoico Una muestra del éster de 2- (hidroxifenil ) difenilfosfino del ácido 9-hidroxi- , 7-dioxanonanoico se oxidó con peryodinano de Dess-Martin que dio el aldehido correspondiente, que se purificó mediante cromatografía de gel de sílice usando acetato de etilo en hexano .

E emplo 113. Preparación de éster de 2- (hidroxifenil) difenilfosfino de N-Boc-3-alanina Una solución de N-Boc-p-alanina en acetonitrilo anhidro, junto con 1 equivalente de 2 - (hidroxifenil) difenilfosfina se trató con una cantidad catalítica de DPTS, seguido por 1,2 equivalente de DCC y la reacción se agitó a temperatura ambiente hasta terminar. La reacción se filtró y el filtrado se concentró y dio un residuo, que se purificó mediante cromatografía rápida sobre gel de sílice con acetato de etilo en hexano y dio el producto deseado.

Ejemplo 114. Preparación de éster de 2- (hidroxifenil) difenilfosfino de N-yodoacetil-p-alanina Una solución de éster de 2 - (hidroxifenil) difenilfosfino de N-Boc-ß-alanina en diclorometano se trató con ácido trifluoroacético y al terminar la reacción se concentró y dio un residuo, que se concentró con hexano para eliminar tanto TFA como fue posible.

Este residuo se recogió en diclorometano, se trató con 6 equivalentes de trietilamina y se agregó anhídrido yodoacético. La mezcla de la reacción se lavó con agua, se secó sobre sulfato de sodio y se concentró y dio un residuo, que se sometió a cromatografía rápida con acetato de etilo en hexano y dio el producto deseado.

Ejemplo 115. Preparación de éster de mono 2- (hidroxifenil) difenilfos no del ácido pentanodioico Una solución de 2- (hidroxifenil) difenilfosfina en diclorometano se trató con 0,1 equivalente de DMAP y 2 equivalentes de trietilamina, seguido por 1,0 equivalente de anhídrido glutarico.

La reacción se calentó a reflujo suave toda la noche, luego se lavó con 1N HCl y cloruro de sodio saturado y se secó sobre sulfato de sodio. La filtración y la concentración dieron el ácido crudo, que se usó en la reacción siguiente sin nueva purificación.

Ejemplo 116. Preparación de medio éster de 2- (hudroxifenil) difenilfosfino de ácido pentanodioico , medio éster de N-hidroxisuccinimida Una solución de éster de mono 2 - (hidroxifenil ) difenilfosfino del ácido pentanodioico en acetonitrilo seco se trató con una cantidad catalítica de DPTS, seguido por 1,2 equivalente de DCC. La reacción se filtró y se concentró y dio un residuo, que se sometió a cromatografía rápida con acetato de etilo en hexano y dio el producto deseado.

Ejemplo 117. Preparación de N- (3-Hidroxi-4-carbometoxi)bencil-bis 2 ,2- [ (2-bromoisobutiril) hidroximetil] propionamida Una muestra de éster de N-hidroxisuccinimida del ácido bis 2,2- [ (2-bromoisobutiriloxi) metil] ropionicónico se dejó reaccionar con 4- (aminometil) -2-hidroxibenzoato de metilo (US 6.156.884) en la presencia de trietilamina y el producto se aisló mediante cromatografía rápida sobre gel de sílice con acetato de etilo en hexano .

Ejemplo 118. Preparación de N- (3-Hidroxi-4-hidroxiaminocarbonil) bencil-bis 2 , 2- [ (2-bromoisobutiril) hidroximetil] propionamida El producto del paso previo se trató con clorhidrato de hidroxilamina en condiciones básicas y dio el ácido hidroxámico correspondiente .

Los polímeros preparados usando este iniciador se pueden usar en reacciones de acoplamiento con reactivos de conjugación que contienen ácido fenilborónico tales como grupos ácido 3-maleimidofenilborónico (véase US 6.156.884 y las referencias de ella tales cada una de las cuales se incorpora en la presente en su totalidad) . A continuación se ilustra la estructura del formato de producto desde la reacción de conjugación entre el polímero a partir del iniciador que contiene el ácido hidroxámico y el ácido 5-maleimidofenilborónico . Este polímero ahora ya está listo para conjugarse con biomoléculas que contienen un tiol libre .

Se pueden incorporar esencialmente todos los grupos funcionales y otros ejemplos de grupos de bioconjugacion que se pueden emplear en esta estrategia además de maleimida son grupos bromoacetamida, yodoacetamida, hidrazida, ácido carboxílico, ditiopiridilo, éster de N-hidroxisuccinimidilo, imido éster, amino y tiol (véase la tabla, US 6.156.884) . donde R= Ejemplo 119. Conjugación de aptámero de Macugen a polímeros con funcionalidad de aldehido Macugen es un medicamento anti-angiogénico para el tratamiento de la degeneración macular relacionada con la edad (AMD) neovascular (húmeda) (AMD) . Es un conjugado covalente de un oligonucleótido de veintiocho nucleótidos de longitud (aptámero) que termina en un ligador de pentilamino, al cual están unidas dos unidades de monometoxi polietilenglicol (PEG) de 20 kDa a través de los dos grupos amino sobre un residuo de lisina. En la realización actual, el aptámero Macugen con grupo amino libre se uso para la conjugación a polímeros con funcionalidad de aldehido usando el protocolo descrito en el Ejemplo 105 con las siguientes diferencias. La conjugación a un aptámero con los polímeros de esta invención crea conjugados con alta estabilidad, baja viscosidad y con propiedades in vivo beneficiosas tales como un tiempo de residencia prolongado así como que sn una base para explorar el suministro de microARN y RNAi .

Se prepararon 20mg/ml de solución de materia prima de aptámero en tampón de Hepes a pH 7 y luego se mezcló con un agente de reducción de cianoborohidruro de sodio para producir una concentración final de 33mM. Esta solución luego se usó para disolver una de las siguientes series de polímeros funcionalidad de aldehido (también usados en el Ejemplo 105) La relación de exceso molar final del polímero al aptámero fue 2-2,5 veces y la concentración final del aptámero feue 4,4-8,9 mg/ml . La mezcla de la conjugación se incubó en un baño de agua a 22°C-23°C toda la noche, se analizaron muestras usando la columna de intercambio de aniones Shodex DEAE-825 conectada a un sistema de suministro de solvente aters 2695 con un 2669 PDA para el monitoreo de la longitud de onda del perfil de elución. Para analizar la reacción de conjugación, 2µ1 de la mezcla de la reacción se diluyeron lOx con 20mM Tris pH 7,5 (tampón A), luego se aplicaron a la columna y se los buscó como una velocidad de flujo de 1 ml/min seguido por un lavado isocrático de 5 minutos en el tampón A seguido por un gradiente lineal de 80% de tampón (tampón A que contiene 0.5M NaCl) durante 9 minutos. El gradiente de la sal se mantuvo al 80% durante 2 minutos antes de la inclinación hacia abajo al 100% de tampón A para la regeneración de la columna. Se detectaron tres picos principales mediante OD220nm: el primer pico se eluyó a 2,2 minutos durante el lavado isocrático inicial, esta fracción es equivalente al polímero libre sin conjugar (el polímero tiene carga neutra y permanece sin unirse a la columna) ; el segundo pico fue una fracción de conjugado unido semanalmente a 5,4 minutos que eluyó temprano en el gradiente de sal; y el último pico eluyó más tarde en el gradiente a 13,6 minutos y correspondió al aptámero libre no conjugado. Tanto el pico conjugado como el aptámero libre muestran absorbencia de 0D254nm, lo cual indica la presencia de oligonucleótido . El pico de 5,4 minutos se detectó en todas las reacciones de que contienen polímeros en las trazas de 254nm y de 220nm pero no en la reacción control donde no se agregó ningún polímero, lo cual respalda más que esto está inducido por el pico de conjugado.

Ejemplo 120. Preparación del iniciador basado en amida de 9 ramas de 2,5,8,11, 14-Pentaoxa-15 , 16-dihidroxiheptadecenilo Una solución del producto del paso previo en 15 mi de agua, 15 mi de t-butanol, 3 equivalentes de ferricianuro de potasio, 3 equivalentes de carbonato de potasio, 1 equivalente de metanesulfonamida, 10 mg de quinuclidina y 7 mg de osmato de potasio deshidratado se agitó toda la noche a temperatura ambiente. La mezcla de la reacción se repartió entre 100 mi cada uno de agua y diclorometano. La capa acuosa se extrajo dos veces con 25 mi de diclorometano y las capas orgánicas se combinaron, se secaron sobre sulfato de magnesio anhidro, se filtraron y se concentraron. El residuo se sometió a cromatografía rápida sobre gel de sílice usando metanol en diclorometano y dio el producto deseado .

Si bien la invención precedente se ha descrito con muchos detalles a modo de ejemplo con propósitos de claridad de comprensión, un experto en el arte apreciará que se pueden hacer ciertos cambios y modificaciones dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas. Además, cada referencia citada en la presente se incorpora en la presente como referencia en su totalidad en la misma medida que si cada referencia se incorporara individualmente en la presente.

Claims (29)

1. REIVINDICACIONES 1. Un polímero que comprende: por lo menos dos ramas de polímero cada una de las cuales comprende una pluralidad de monómeros cada uno se selecciona independientemente del grupo formado por acrilato, metacrilato, acrilamida, metacrilamida, estireno, vinil-piridina, vinil-pirrolidona y éster de vinilo, en donde cada monómero comprende un grupo hidrófilo; un fragmento de iniciador unido a un extremo próximo de la rama polimérica, en donde el grupo de iniciador es adecuado para la polimerización de radicales; y un grupo de extremo unido a un extremo distal de la rama, en donde por lo menos uno del fragmento de iniciador y el grupo de extremo comprende un agente funcional o un grupo de unión. 2. El polímero de la reivindicación 1, en donde dicho grupo hidrófilo comprende un grupo zwiteriónico . 3. El polímero de la reivindicación 2, en donde cada grupo zwiteriónico comprende fosforilcolina . 4. El polímero de la reivindicación 3, en donde el monómero comprende 2- (acriloiloxietil) -2 ' - (trimetilamoniometil) fosfato. 5. El polímero de la reivindicación 3, en donde el monómero comprende 2- (metacriloiloxietil) -2' - (trimetilamoniometil) fosfato (HFMA-PC) . 6. El polímero de la reivindicación 1, en donde el fragmento de iniciador está unido al extremo próximo de 2 a 100 ramas poliméricas . 7. El polímero de la reivindicación 6, en donde el polímero tiene un índice de polidispersidad menor de 2,0. 8. El polímero de la reivindicación 6, en donde el fragmento de iniciador está unido al extremo próximo de 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9 o 12 ramas poliméricas. 9. Un conjugado que com rende: por lo menos un polímero que comprende: por lo menos dos ramas de polímero cada una de las cuales comprende una pluralidad de monómeros cada uno se selecciona independientemente del grupo formado por acrilato, metacrilato, acrilamida, metacrilamida, estireno, vinil-piridina, vinil-pirrolidona y éster de vinilo, en donde cada monómero comprende un grupo hidrófilo; un fragmento de iniciador unido a un extremo próximo de la rama polimérica, en donde el grupo de iniciador es adecuado para la polimerización de radicales; y un grupo de extremo unido a un extremo distal de la rama, y por lo menos un grupo funcional que comprende un agente bioactivo o un agente de diagnóstico, unido al fragmento de iniciador o al grupo de extremo. 10. El conjugado de la reivindicación 9, en donde el agente bioactivo se selecciona del grupo formado por un fármaco, un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, un anticuerpo de dominio único, un avimer, una adnectina, diacuerpos, una vitamina, un cofactor, un polisacárido, un carbohidrato, un esteroide, un lípido, una grasa, un péptido, un polipéptido, un nucleótido, un oligonucleótido, polinucleótido y un ácido nucleico . 11. El conjugado de la reivindicación 9, en donde el agente de diagnóstico se selecciona del grupo formado por un radiomarcador, un agente de contraste, un fluoróforo y un colorante . 12. El conjugado de la reivindicación 9, en donde por lo menos dos polímeros están unidos al agente funcional. 13. El conjugado de la reivindicación 9, en donde por lo menos dos polímeros están unidos al agente funcional a través de grupos reactivos próximos sobre el agente funcional para crear una estructura pseudo-ramificada. 14. El conjugado de la reivindicación 9, en donde el conjugado comprende por lo menos dos agentes con funcionalidad unidos al polímero . 15. Un polímero de la fórmula: en donde R1 se selecciona del grupo formado por H, i -A1 , LG1 y L3-LG1 ; cada M1 y M2 se selecciona independientemente del grupo formado por acrilato, metacrilato, acrilamida, metacrilamida, estireno, vinil-piridina, vinil-pirrolidona y éster de vinilo; cada uno de G1 y G2 es independientemente un grupo hidrófilo; cada I y I' es independientemente un fragmento de iniciador, de manera tal que la combinación de I-I' sea un iniciador, I1, para la polimerización del polímero de la Fórmula I mediante polimerización de radicales; alternativamente, cada I' se selecciona independientemente del grupo formado por H, halógeno y alquilo de Ci-6; cada uno de L1, L2 y L3 es independientemente un enlace o un 1igador; cada A1 es un agente funcional; cada LG1 es un grupo de unión; los subíndices x e y1 son cada uno independientemente un número entero de 1 a 1000; cada subíndice z es independientemente un número entero de 0 a 10; y el subíndice s es un número entero de 2 a 100. El polímero de la reivindicación 16, en donde el polímero tiene la fórmula: en donde R1 se selecciona del grupo formado por H, L3-A1, LG1 y L3-LG1; cada M1 y M2 se selecciona independientemente del grupo formado por acrilato, metacrilato, acrilamida, metacrilamida, estireno, vinil-piridina, vinil-pirrolidona y éster de vinilo; cada uno de ZW y ZW1 es independientemente un grupo zwiteriónico; cada l e í' es independientemente un fragmento de iniciador, de manera tal que la combinación de I-I' sea un iniciador, I1, para la polimerización del polímero de la Fórmula I a través de polimerización de radicales; alternativamente, cada I' se selecciona independientemente del grupo formado por H, halógeno y alquilo de Ci-6; cada uno de L1, L2 y L3 es un ligador; cada A1 es un agente funcional ; cada LG1 es un grupo de unión; los subíndices x e y1 son cada uno un número entero de 1 a 1000; cada subíndice z es independientemente un número entero de 0 a 10; y subíndice s es un número entero de 2 a 100. .El polímero de la reivindicación 15, en donde cada grupo hidrófilo comprende un grupo zwiteriónico. 18. El polímero de la reivindicación 15, en donde cada grupo hidrófilo comprende fosforilcolina . 19. El polímero de la reivindicación 15, en donde el subíndice s es 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9 o 12. 20. El polímero de la reivindicación 15, en donde el polímero tiene la fórmula: .El polímero de la reivindicación 15, en donde el polímero tiene la fórmula: en donde R2 se selecciona del grupo formado por H y alquilo de Ci_6; y PC es fosforilcolina . 22. El polímero de la reivindicación 15, en donde el iniciador I1 tiene la fórmula: en donde cada I' se selecciona independientemente del grupo formado por halógeno, -SCN y -NCS; L4 y L5 son cada uno independientemente un enlace o un ligador, de manera tal que uno de L4 y L5 sea un ligador; C es un enlace o un grupo núcleo; LG2 es un grupo de unión; y el subíndice p es de 1 a 20, en donde cuando el subíndice p es 1, C es un enlace y cuando el subíndice p es de 2 a 20, C es un grupo núcleo. 23. El polímero de la reivindicación 22, en donde cada uno de los iniciadores I tiene la fórmula: en donde cada R3 y R4 se selecciona independientemente del grupo formado por H, CN y alquilo de Ci-6. 24. El polímero de la reivindicación 22, en donde cada uno de los iniciadores I1 se selecciona independientemente del grupo formado por: 370 10 15 20 25. El polímero de la reivindicación 15, que tiene las fórmulas 373 donde PC es fosforilcolina . El polímero de la reivindicación 25, en donde: R1 se selecciona del grupo formado por L3-A1, LG1 y L3-LG1; A1 se selecciona del grupo formado por un fármaco, un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, un anticuerpo de dominio único, un avimer, una adnectina, diacuerpos, una vitamina, un cofactor, un polisacárido , un carbohidrato, un esteroide, un lípido, una grasa, una proteína, un péptido, un polipéptido, un nucleótido, un oligonucleótido, un polinucleotido, un ácido nucleico, un radiomarador, un agente de contraste, un fluoróforo y un colorante; L3 es - (CH2CH2O)1-10-; y LG1 se selecciona del grupo formado por maleimida, acetal, vinilo, alilo, aldehido, -C (O) O-alquilo de 01-6, hidroxi , diol , cetal, azida, alquino, ácido carboxílico y succinimida. 27. El polímero de la reivindicación 26, en donde cada LG1 se selecciona independientemente del grupo formado por: hidroxi, carboxi, vinilo, viniloxi, alilo, aliloxi, aldehido, azida, etino, propino, propargilo, -C (O) O-alquilo de Ci-6 , 28. El polímero de la reivindicación 15, que tiene la fórmula seleccionada del grupo formado por: ?76 29. Un polímero que comprende: una rama polimérica que independientemente comprende una pluralidad de monómeros cada uno independientemente seleccionado del grupo formado por acrilato, metacrilato, acrilamida, metacrilamida, estireno, vinil-piridina, vinil -pirrolidona y éster de vinilo, en donde cada monómero comprende un grupo hidrófilo; un fragmento de iniciador unido a un extremo próximo de la rama polimérica, en donde el grupo iniciador es adecuado para la polimerización de radicales; y un grupo de extremo unido a un extremo distal de la rama polimérica, en donde por lo menos uno del fragmento de iniciador y el grupo de extremo comprende un agente funcional o un grupo de unión, y en donde el polímero tiene un peso molecular promedio pico de 50 kDa a 1.500 kDa, medido mediante difusión de luz.