CN111983067B - 一种注射用拉氧头孢钠聚合物的检测方法及在线鉴定的检测方法 - Google Patents
一种注射用拉氧头孢钠聚合物的检测方法及在线鉴定的检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
一种注射用拉氧头孢钠聚合物分离测定的在线检测方法，采用一维液相色谱条件对目标物进行分离测定，二维液相色谱条件下捕捉目标物，依次进入IT‑TOF，利用质谱信息鉴定目标物结构。
Description
技术领域
本发明涉及一种注射用拉氧头孢钠聚合物的检测方法及在线鉴定的检测方法，该方法适用于对注射用拉氧头孢钠中的聚合物含量进行分离测定以及进行在线检测。
背景技术
拉氧头孢钠属于半合成的氧头孢烯类新型抗菌药，20世纪80年代由日本盐野义制药研究所研发，对多种格兰阴性菌有良好抗菌作用。氧头孢钠是β-内酰胺类抗菌药物，该类药物较易引发速发型过敏反应。不良反应有皮肤损害、过敏性休克、乙醛蓄积综合征、消化道出血等。经研究，引发的速发型过敏反应并非药物本身所致，而是与药物中存在的聚合物有关，聚合物又分为二聚物、三聚物、…、多聚体，其中致敏作用最强的是二聚物，因此应该对聚合物，尤其是二聚物进行严格控制。
目前，β-内酰胺类抗菌药聚合物的分析，多采用葡聚糖凝胶G-10测定，但该方法存在分离差、柱效低、分析时间长，不能在线检测等问题；而且无法更好的控制聚合物含量，尤其是二聚物的含量。
发明内容
针对上述问题，发明人设计了一种注射用拉氧头孢钠聚合物的检测方法及在线鉴定的检测方法，该方法该在不改变原流动相条件的基础上，实现了液质联用分析目标杂质，可在准确推定检出杂质结构的同时，又能实现既定色谱条件下色谱图中各杂质的准确定位。
一种注射用拉氧头孢钠聚合物的检测方法，其特征在于：
提供试品溶液：称取适量注射用拉氧头孢钠，加纯化水溶解并稀释制成1mg/ml的溶液；
取上述试品溶液10μl，注入液相色谱仪，采用如下的一维色谱条件，并记录色谱图；
一维色谱条件，包括：
流动相：pH7.0的磷酸盐缓冲液，所述缓冲溶液中具有：0.005mol/L[磷酸氢二钠溶液-0.005mol/L磷酸二氢钠溶液(61∶39)]-乙腈(95∶5)，
色谱柱：7.8mm×300mm，5μm，
填料：亲水球状硅胶，
检测波长：254nm，
流速：1.0ml/min；
在上述一维色谱条件下，将试品溶液中的二聚物和多聚体与主成分拉氧头孢完全分离，按照loop环组分收集表程序把二聚物和多聚体分别收集在不同的loop环中；
Loop环组分收集表：
更进一步地，所述loop环的数量为至少两个。
提供一种注射用拉氧头孢钠聚合物在线鉴定的检测方法，其特征在于：
提供试品溶液：来自loop环中的待测物质，该待测物是上述的分别收集在不同loop环中的二聚物和多聚体；
进样方式：loop环组分注入+切换
二维色谱条件：流动相：乙腈-水(20∶80)，
色谱柱：2.0mm×75mm，5μm，
填料：ODS，
检测波长：254nm，
流速：1.0ml/min；
使用具有如上所述的二维色谱条件的二维色谱流动相把loop环中的待测物，分别带入到质谱中，在质谱中进行鉴定分析；
二维色谱梯度洗脱时间，1.0分后阀切换流路进质谱：
质谱条件：
离子源：ESI正离子模式检测，接口电压：4.5kV，
扫描范围：一级质谱：m/z 100～1500，自动多级：m/z 50～1000，
雾化气：氮气1.5L/min，
干燥气：氮气10L/min，
碰撞气：氩气，
脱溶剂管温度：200℃，
加热模块温度：200℃，
检测器电压：1.5kV，
校准方法：自动调谐优化电压，外标法校准质量数；
通过质谱图中碎片峰的质荷比，来判定是二聚物还是多聚体，其中对于最大碎片峰的质荷比，多聚体的大于二聚物的。
更进一步地，将loop环中的二聚物和多聚体，注入质谱仪，初步判定，二聚物和多聚体的归属，结果如下：多聚体最大碎片峰质荷比m/z＝1124.588，二聚物最大碎片峰质荷比m/z＝917.637。
说明书附图
图1：2D-LC-IT-TOF的系统流路图。
图2：供试品色谱图。
图3多聚体二级液相色谱图和质谱图。
图4二聚物二级液相色谱图和质谱图。
图5拉氧头孢二级液相色谱图和质谱图。
图6拉氧头孢聚合断裂推断图。
具体实施方式
本发明采用Cef-SEC/2D-LC-IT-TOF/MS鉴定注射用拉氧头孢钠中的聚合物，1stD分析的主要目的是确定目标杂质的保留时间，以便于捕集到loop环中，用于二维脱盐分析。LC 2ndD是将目标杂质切换到loop环中，经过2D LC分析，得到UV色谱图、MS色谱图和质谱图。系统流路图见图1。该方法采用的色谱柱及流动相都较常用，操作简单、分析时间短、灵敏度高、重现性好，克服了传统聚合物检测方法的缺点，专属性更高，可以将一聚、二聚、三聚等聚合物分离出来，更好的保证了临床用药的安全性和有效性。
仪器与试药：
离子阱飞行时间二维质谱仪(日本岛津公司，IT-TOF)；乙腈为色谱纯(Fisherchemical)；其余试剂均为分析纯。
拉氧头孢对照品(来源：中检院；批号：130590-201702；按C20H20N6O9S计，含量为84.3％。)；注射用拉氧头孢钠(企业A三批样品(规格：0.25g，批号：1801161，1801172，1802048)，企业B三批样品(规格：0.25g，批号：1801202，1801106，1701148)。
实施例1：
一种注射用拉氧头孢钠聚合物的检测方法，其特征在于：
提供试品溶液：称取注射用拉氧头孢钠适量，加纯化水溶解并稀释制成1mg/ml的溶液；
取上述试品溶液10μl，注入液相色谱仪，采用如下的一维色谱条件，并记录色谱图；
一维色谱<LC 1stD>条件，包括：
色谱条件：色谱柱：Cef-SEC(7.8mm×300mm，5μm，
Sepax公司)，
流动相：pH7.0的磷酸盐缓冲液，所述缓冲溶液中具有：0.005mol/L[磷酸氢二钠溶液-0.005mol/L磷酸二氢钠溶液(61∶39)]-乙腈(95∶5)，
色谱柱：7.8mm×300mm，5μm，
填料：亲水球状硅胶，
检测波长：254nm，
流速：1.0ml/min；
在上述一维色谱条件下，将试品溶液中的二聚物和多聚体与主成分拉氧头孢完全分离，按照loop环组分收集表程序分别把待测物质收集在loop环中；loop环至少为2个，可以为2-6个。
Loop环组分收集表：
按上述的<LC 1stD>色谱条件进行分析，记录色谱图。供试品图谱见图2，图2中a为多聚体，b为二聚物，c为拉氧头孢。按照分子排阻色谱法的分离特性，出峰顺序是按照分子量由大到小排列。拉氧头孢主峰前的杂质一般为聚合物峰，但是不排除存在分子量大于拉氧头孢的开环物等其他杂质。主峰后为分子量小于拉氧头孢的小分子杂质峰。结果可见，多聚体和二聚物等杂质均呈单一色谱峰，与拉氧头孢峰均有良好的分离度。
实施例2：
二维色谱<LC 2ndD>条件
试品溶液：来自loop环中的待测物质，该待测物是实施例1中收集在loop环中的物质；
色谱柱：Shim-pack XR-ODS II(2.0mm×75mm，5μm.岛津公司。)，
进样方式：loop环组分注入+切换
二维色谱条件：流动相：乙腈-水(20∶80)，
色谱柱：2.0mm×75mm，5μm，
填料：ODS，
检测波长：254nm，
流速：1.0ml/min；
使用具有如上所述的二维色谱条件的二维色谱流动相把loop环中的待测物，分别带入到质谱中，在质谱中进行鉴定分析；
二维色谱梯度洗脱时间，1.0分后阀切换流路进质谱：
质谱条件：
离子源：ESI正离子模式检测，接口电压：4.5kV，
扫描范围：一级质谱：m/z 100～1500，自动多级：m/z 50～1000，
雾化气：氮气1.5L/min，
干燥气：氮气10L/min，
碰撞气：氩气，
脱溶剂管温度：200℃，
加热模块温度：200℃，
检测器电压：1.5kV，
校准方法：自动调谐优化电压，外标法校准质量数；
通过质谱图中碎片峰的质荷，比来判定是二聚物还是多聚体，其中对于最大碎片峰的质荷比，多聚体的大于二聚物的。
聚合物2D-IT-TOF/MS的结构鉴定：根据体积排阻色谱的分离原理，大分子物质先被洗脱出来，初步判定色谱峰a是多聚体，色谱峰b是二聚物。图3至图5分别是多聚体、二聚物和拉氧头孢的二维液相色谱图和一级二级质谱图，从图3和图4中可以发现多聚体最大碎片峰质荷比m/z＝1124.588，二聚物最大碎片峰质荷比m/z＝917.637，佐证了色谱峰a和b分别是多聚体和二聚物。
多聚体和二聚物的二级质谱图碎片峰基本一致，分别是488.698，506.732，524.762和492.672，510.711。推断是两个拉氧头孢在图6中1号和2号位置同时断裂后聚合而成，聚合机制有待进一步分析确证。
拉氧头孢对照品线性关系：精密称取拉氧头孢对照品11.77mg，置100ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备液。精密量取5ml，分别置10、25、50、100、200和250ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀。分别精密量取10μl，按上述<LC 1stD>色谱条件进行分析。以拉氧头孢对照品的浓度为横坐标，拉氧头孢峰面积为纵坐标，线性回归方程为：y＝16.969x+3.3312，γ＝1.0000，表明拉氧头孢在0.002～0.06mg/ml浓度范围内呈良好的线性关系。
精密度和重复性试验：取上述拉氧头孢对照品溶液(0.01mg/ml)，按上述<LC 1stD>色谱条件，重复进样5次，拉氧头孢峰面积RSD为0.6％。精密称取注射用拉氧头孢钠25mg(企业A，批号：1801161)，置25ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，平行操作6份，测定聚合物含量，多聚体和二聚物平均含量分别为：0.12％和0.40％，RSD分别为0.3％和0.1％。
稳定性试验：取上述拉氧头孢对照品溶液(0.01mg/ml)，室温下放置0、1、2、3h进样，3h峰面积RD为2.3％，2h峰面积RSD为0.05％，该样品在2h内稳定性良好，在4℃条件下放置8h峰面积为3168.5516，RD为0.04％，说明8h内稳定性良好。因此，建议样品溶解后常温下2h内测定，4℃条件下8h内测定。
定量限与检出限：拉氧头孢对照品溶液(0.01mg/ml)逐级稀释，以S/N＝3计，检出限为2pg。以S/N＝10计，定量限为8.3pg。
样品测定：取本品5支，内容物混匀，精密称取含拉氧头孢钠25mg，置25ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，作为试品溶液。精密称取拉氧头孢对照品10mg，置100ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀；再精密量取5ml，置50ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。精密量取试品溶液与对照品溶液各10μl，按上述<LC 1stD>色谱条件分别注入液相色谱仪，记录色谱图。按外标法以峰面积计算，含拉氧头孢聚合物等杂质以拉氧头孢计。规定限度多聚体不得过0.3％，二聚物不得过0.5％。测定结果见表1。
表1聚合物测定结果
本发明采用亲水球状硅胶为填充剂的色谱柱，聚合物和主峰可以达到完全分离，且聚合物又被分离出多聚体和二聚物。对多聚体和二聚物分别设定限度，进行控制可更好的控制药品质量。
聚合物测定中HPLC流动相中有大比例的磷酸盐缓冲液，与质谱检测的要求不匹配，若重新建立适合LC/MS检测的色谱系统，虽可对聚合物的结构进行推定，但却无法直观的确认色谱峰的归属，因此本实验采用2D-LC-IT-TOF/MS法，该方法基于共用一组馏分收集环的二维液相质谱联用系统建立，其中1stD-LC使用含有磷酸盐缓冲液的液相条件进行分析，通过时间程序控制自动对分离过程中的目标杂质进行捕集，1stD-LC分析结束后，批处理自动执行2ndD-LC分析。此时捕集在收集环中的杂质组分分批一次通过适合质谱分析的流动相注入2ndD-LC色谱柱中，对目标峰快速分析的同时完成流动相转换，即脱盐的过程，确保联用的质谱仪可以获得稳定可靠的信号。该方法在不改变原流动相条件的基础上，实现了液质联用分析目标杂质，可在准确推定检出杂质结构的同时，又能实现既定色谱条件下色谱图中各杂质的准确定位。
针对于本发明技术方案所做的任何形式上的变通和/或改变都将落入本发明的保护范围之内。
Claims (2)
1.一种注射用拉氧头孢钠聚合物的检测方法及在线鉴定的检测方法，其特征在于：
所述检测方法为：
提供试品溶液：称取适量注射用拉氧头孢钠，加纯化水溶解并稀释制成1mg/ml的溶液；取上述试品溶液10μl，注入液相色谱仪，采用如下的一维色谱条件，并记录色谱图；
一维色谱条件，包括：
流动相：pH7.0的磷酸盐缓冲液，缓冲溶液中具有：（0.005mol/L磷酸氢二钠溶液-0.005mol/L-磷酸二氢钠溶液体积比为61∶39）-乙腈体积比为95∶5，
色谱柱：7.8mm×300mm，5μm，
填料：亲水球状硅胶，
检测波长：254nm，
流速：1.0ml/min；
在上述一维色谱条件下，将试品溶液中的二聚物和多聚体与主成分拉氧头孢完全分离，按照loop环组分收集表程序把二聚物和多聚体分别收集在不同的loop环中；
Loop环组分收集表：
所述loop环的数量为至少两个；
所述在线鉴定的检测方法为：
提供试品溶液：来自loop环中的待测物质，该待测物是所述检测方法中分别收集在不同loop环中的二聚物和多聚体；
进样方式：loop环组分注入+切换：
二维色谱条件：
流动相：乙腈-水体积比为20∶80，
色谱柱：2.0mm×75mm，5μm，
填料：ODS，
检测波长：254nm，
流速：1.0ml/min；
使用具有如上所述的二维色谱条件的二维色谱流动相把loop环中的待测物，分别带入到质谱中，在质谱中进行鉴定分析；
二维色谱梯度洗脱时间，1.0分后阀切换流路进质谱：
质谱条件：
离子源：ESI正离子模式检测，接口电压：4.5kV，
扫描范围：一级质谱：m/z 100～1500，自动多级：m/z 50～1000，
雾化气：氮气1.5L/min，
干燥气：氮气10L/min，
碰撞气：氩气，
脱溶剂管温度：200℃，
加热模块温度：200℃，
检测器电压：1.5kV，
校准方法：自动调谐优化电压，外标法校准质量数；
通过质谱图中碎片峰的质荷比，来判定是二聚物还是多聚体，其中对于最大碎片峰的质荷比，多聚体的大于二聚物的。
2.根据权利要求1所述的一种注射用拉氧头孢钠聚合物的检测方法及在线鉴定的检测方法，其特征在于：将loop环中的二聚物和多聚体，注入质谱仪，初步判定，二聚物和多聚体的归属，结果如下：多聚体最大碎片峰质荷比m/z＝1124.588，二聚物最大碎片峰质荷比m/z＝917.637。
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