CN110806447A - 百日咳杆菌气管细胞毒素的筛查方法和含量测定方法 - Google Patents

百日咳杆菌气管细胞毒素的筛查方法和含量测定方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种百日咳或百白破疫苗中百日咳杆菌气管细胞毒素的筛查方法及含量测定方法，含量检测方法包括以下步骤：(1)标准工作曲线的绘制：称取适量百日咳杆菌气管细胞毒素对照品，配制成标准工作溶液；将标准工作溶液用高效液相色谱串联质谱进行分析，即可得到对照品的色谱图，根据溶液浓度与对应色谱峰面积的关系得到标准工作曲线；样品检测：取待测样品加入同等体积乙腈，混匀后，离心，取上清液用高效液相色谱串联质谱进行分析检测，根据待测组分的响应峰面积和标准工作曲线，得出待测组分百日咳杆菌气管细胞毒素的含量。本方法具有超高灵敏度，且比欧洲药典要求的限度低1409倍。

Description

百日咳杆菌气管细胞毒素的筛查方法和含量测定方法
技术领域
本发明具体涉及一种百日咳毒素产品和百白破疫苗中百日咳杆菌气管细胞毒素的含量测定方法。属于疫苗质量评价技术领域。
背景技术
百日咳杆菌气管细胞毒素是百日咳杆菌培养上清液中的一种分子量为921的糖肽。百日咳杆菌气管细胞毒素能依附于地鼠气管上皮细胞，造成气管组织培养破坏，延长受损纤毛细胞的恢复和阻断下层新生基底细胞群的分裂和分化。百日咳杆菌气管细胞毒素可导致百日咳患者难以通过使用药物缓解临床症状。当百日咳杆菌气管细胞毒素存在时，即使百日咳杆菌不再存在，百日咳患者的咳嗽症状仍能持续数周以上。
Rosenthal和Goldman等人研究结果指出95％以上百日咳杆菌气管细胞毒素是分子量为921的糖肽。如果百日咳或百白破疫苗中存在百日咳杆菌气管细胞毒素将导致疫苗接种者出现百日咳病症，严重危害人类健康。因此，必须严格控制百日咳和百白破疫苗中百日咳杆菌气管细胞毒素的含量，以减少相关疫苗的危害事件发生。《欧洲药典》对百日咳杆菌气管细胞毒素的残留量有严格要求(每剂量疫苗中含量不高于2pmol)，但缺乏百日咳杆菌气管细胞毒素含量测定的具体方法。不仅《欧洲药典》未收录百日咳杆菌气管细胞毒素含量测定方法，《中国药典》及世界上其他国家和组织的药典均未收录百日咳杆菌气管细胞毒素含量测定的方法。可能的原因为：第一，缺乏百日咳杆菌气管毒素对照品；第二，百日咳杆菌气管细胞毒素紫外吸收较差，难以用HPLC-UV方法直接检测。柱前衍生的方法可提高百日咳杆菌气管细胞毒素的紫外响应，且在较宽范围内具有较好线性(14pmol～7000pmol)，但灵敏度仍不能满足欧洲药典对疫苗中百日咳杆菌气管细胞毒素的限量要求。此外，衍生反应效率受样品基质和衍生条件的影响较大，其重复性和准确度难以保障。液相色谱质谱法具有较高的检测灵敏度和选择性，可用于复杂样品中目标化合物的高灵敏度检测。虽然质谱技术发展至今已非常成熟，但由于没有商品化的百日咳杆菌气管细胞毒素对照品且百日咳杆菌气管细胞毒素的对照品制备非常困难，至今尚无HPLC-MS/MS(高效液相色谱-质谱联用)检测百日咳杆菌气管细胞毒素的方法报道。
发明内容
本发明为了解决因为百日咳杆菌气管细胞毒素对照品缺乏造成的百日咳杆菌气管细胞毒素检测方法难以实施的现状，提供一种HPLC-MS/MS方法检测百日咳或百白破疫苗中百日咳杆菌气管细胞毒素的方法，本方法只需在本次方法建立时使用百日咳杆菌气管细胞毒素对照品，而方法实施过程中无须百日咳杆菌气管细胞毒素对照品即可筛查样品中是否存在百日咳杆菌气管细胞毒素。
本发明所用对照品为本技术发明单位之一中国食品药品检定科学研究院制备，通过高分辨质谱全扫描模式确定其纯度，采用高分辨质谱一级、二级质谱信息后结合糖肽裂解规律确定百日咳杆菌气管细胞毒素结构。
为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：
一种百日咳或百白破疫苗中百日咳杆菌气管细胞毒素的筛查方法，步骤如下：取待测样品加入同等体积乙腈，混匀后，离心，取上清液用高效液相色谱串联质谱进行分析检测，根据样品中是否有百日咳杆菌气管细胞毒素特征离子对检出和检出离子对的离子比确定样品中是否含有百日咳杆菌气管细胞毒素。
其中，样品中是否含有百日咳杆菌气管细胞毒素的定性依据为：a)样品同时检出以下三组离子对922.3/719.3,922.3/391.1,922.3/302.1；b)922.3/719.3与922.3/391.1的离子比在10％-60％范围内，922.3/719.3与922.3/302.1的离子比在40％-90％范围内；条件a)和b)均满足时，样品中含有百日咳杆菌气管细胞毒素。
优选的，所述离心速度为14000r/min；离心时间10min。
一种百日咳或百白破疫苗中百日咳杆菌气管细胞毒素的含量测定方法，包括以下步骤：
(1)标准工作曲线的绘制：称取适量百日咳杆菌气管细胞毒素对照品，用体积比为50:50的乙腈/水溶液配制成标准工作溶液；将标准工作溶液用高效液相色谱串联质谱进行分析，即可得到对照品的色谱图，根据溶液浓度与对应色谱峰面积的关系得到标准工作曲线；
(2)样品检测：取待测样品加入同等体积乙腈，混匀后，离心，取上清液用高效液相色谱串联质谱进行分析检测，根据待测组分的响应峰面积和标准工作曲线，得出待测组分百日咳杆菌气管细胞毒素的含量。
优选的，所述离心速度为14000r/min；离心时间10min。
优选的，配制标准工作溶液的具体方法为：称取适量百日咳杆菌气管细胞毒素对照品，用体积比为50:50的乙腈/水溶液配制成浓度为1μg/L的标准母液备用；用体积比为50:50的乙腈/水溶液稀释上述母液到0.00029-1μg/L浓度范围，得到标准工作溶液，标准工作溶液浓度点分别为0.369、0.185、0.092、0.046、0.023、0.012、0.0058μg/L。
优选的，上述百日咳杆菌气管细胞毒素标对照品是从百日咳Cs菌株中分离、纯化而得，所述百日咳杆菌气管细胞毒素对照品的制备过程如下：
1)浓缩培养液：百日咳杆菌培养液在4℃下采用高速离心的方法去除大分子杂质，高速离心，取上清液过0.22μm醋酸纤维素膜，去除溶液中的大分子杂质，收集滤液，用三氟乙酸滤过液至pH为3；
2)用生物兼容C18柱纯化百日咳杆菌气管细胞毒素：用甲醇和三氟乙酸水溶液依次洗涤生物兼容C18填料；将步骤1)酸化后的滤液注入生物兼容柱中，然后加入洗涤后的生物兼容C18填料；将生物兼容柱中的溶液抽干，再用三氟乙酸水洗涤生物兼容柱，百日咳杆菌气管细胞毒素产品被生物兼容C18填料富集；再用含三氟乙酸、正丁醇和水的溶液洗脱被富集的百日咳杆菌气管细胞毒素产品，并收集馏分；减压浓缩馏分以备QMA柱纯化；
3)QMA纯化：用溶液Ⅰ浸润QMA柱10min，在用20mL溶液Ⅰ洗C18柱；接着用20mL溶液Ⅱ洗C18柱；再用20mL甲醇清洗C18柱；最后用20mL溶液Ⅰ平衡C18柱；平衡好后，将减压浓缩所得馏分注入QMA柱，再用溶液Ⅰ洗涤未结合蛋白；然后用溶液Ⅱ洗脱收集百日咳杆菌气管细胞毒素产品；
4)脱盐得百日咳杆菌气管细胞毒素对照品：用三氟乙酸酸化百日咳杆菌气管细胞毒素产品，再按步骤2)上样并收集百日咳杆菌气管细胞毒素脱盐馏分，冻干百日咳杆菌气管细胞毒素脱盐馏分，得百日咳杆菌气管细胞毒素对照品。
优选的，步骤1)所述高速离心的转数为13,200x g，离心时长为20分钟；步骤2)所述三氟乙酸水溶液为三氟乙酸：水的体积比(v/v)为1:1000；步骤2)所述三氟乙酸、正丁醇、水的体积比为1:200:800。
进一步优选的，所述溶液Ⅰ为含有10mmol/L乙酸铵的体积浓度为20％甲醇水溶液(pH5.5)。
进一步优选的，所述溶液Ⅱ为含有10mmol/L乙酸铵和1mol/L氯化钠的体积浓度为20％甲醇水溶液(pH 5.5)。
进一步优选的，百日咳杆菌气管细胞毒素对照品纯度测定方法，包括以下步骤：称取适量百日咳杆菌气管细胞毒素对照品，用乙腈：水(50:50，v/v)溶解并稀释到1μg/L，用LC-IT-TOF扫描一级谱图，以此确认百日咳杆菌气管细胞毒素对照品的纯度为98.5％(如图1)。
百日咳杆菌气管细胞毒素纯度计算方法：样品中所有峰的峰面积相加得总峰面积，百日咳杆菌气管细胞毒素的纯度＝百日咳杆菌气管细胞毒素峰面积/总峰面积x100％。
进一步优选的，百日咳杆菌气管细胞毒素结构鉴定方法，包括以下步骤：用LC-IT-TOF扫描百日咳杆菌气管细胞毒素一级(图2b)、二级质谱图(图2c)。将一级质谱图所得精确分子量(922.3826)与文献报道的百日咳杆菌气管细胞毒素结构(见图2a)对比(理论分子式和分子离子峰分别为C37H59N7O20，922.3888)。将百日咳杆菌气管细胞毒素结构导入ACD软件，将ACD预测所得二级质谱碎片与实验所得二级碎片对比，有3个以上二级碎片与预测结果匹配，例如二级碎片中丰度最高的三个片段719.3020,391.1800,302.1317，表明步骤(2)-(4)所得百日咳杆菌气管细胞毒素对照品与文献报道结构匹配。除质谱鉴定以外，还用疫苗行业常用的UV-Vis方法验证了步骤(2)-(4)所得百日咳杆菌气管细胞毒素对照品，结果验证表明步骤(2)-(4)所得化合物即为百日咳杆菌气管细胞毒素对照品。
UV-Vis测试百日咳杆菌气管细胞毒素的方法过程为：UV-Vis扫描步骤(2)-(4)所得百日咳杆菌气管细胞毒素对照品，扫描范围为190nm～300nm；百日咳杆菌气管细胞毒素在204nm有特征吸收峰。
IT-TOF测试条件如下：电离模式：ES+；雾化器流速：1.5L.min-1；接口电压：3.5kV；CDL温度：200℃；加热块问题：200℃；检测器电压：1.70kV；TOF飞行管温度：40.0(+/-0.3℃).扫描质量范围m/z：500-1500；二级能量值：50％；二级扫描范围m/z：200-1500；质量校正：三氟乙钠溶液。
本发明为首次用LC-高分辨质谱鉴定百日咳杆菌气管细胞毒素一级和二级质量信息。
优选的，百日咳或百白破疫苗中百日咳杆菌气管细胞毒素的筛查方法和含量测定方法中的色谱条件如下：
柱温：20-50℃；
流动相：A-含离子交换剂的有机溶剂水溶液；B-离子交换剂水溶液；
所述有机溶剂为与水相溶的有机溶剂，包括甲醇、乙腈和乙醇；有机溶剂：水＝60～100：0～40，v/v；
离子交换剂为质谱兼容的酸或盐，或酸和盐的混合物；所述盐为甲酸铵或乙酸铵，所述酸为甲酸、乙酸或三氟乙酸。
流动相A中所述离子交换剂在有机水溶液中的浓度为0～20mmol/L，流动相B中离子交换剂水溶液的浓度为：0～20mmol/L。
流速：0.2～0.5mL/min；
进样体积：10μL；
固定相为固定相Ⅰ、固定相Ⅱ或固定相Ⅲ。
优选的，所述固定相Ⅰ为一种亲水作用-阴阳离子交换混合模式固定相，其结构式如下：
Figure BDA0001755054950000051
其中R1为硅胶或聚苯乙烯。
所述固定相Ⅱ为生物兼容C18色谱柱；
所述固定相Ⅲ为生物兼容C8色谱柱。
由于疫苗中的百日咳杆菌气管细胞毒素需加入等体积乙腈提取，以便去除疫苗蛋白对分离检测的影响(堵塞色谱柱)，提取所得上清液为含有乙腈：水(50:50，v/v)。乙腈：水(50:50，v/v)极易造成溶剂效应，导致色谱峰变形，保留变弱等。此外，百日咳杆菌气管细胞毒素极易在普通色谱柱上残留，导致疫苗样品检测出现假阳性，典型色谱图见图3a-e。本发明为解决溶剂效应和百日咳杆菌气管细胞毒素残留的问题，采用三种特殊固定相。固定相I，生物兼容的亲水色谱柱，该色谱柱为极性共聚技术合成的酰胺修饰材料，以特殊涂层柱管填装。该色谱柱将由华普新创公司商品化，为百日咳杆菌气管细胞毒素的分析提供固定相保障。固定相II和固定相III分别为高健和密度C18和C8固定相，采用特殊封尾技术和生物惰性柱管填装。固定相II和固定相III将由岛津技迩公司商品化，为百日咳杆菌气管细胞毒素的分析提供固定相保障。固定相I、固定相II和固定相III在分析完高浓度(400ng/L)百日咳杆菌气管细胞毒素后均无残留出现(图4-图6)，可避免百日咳杆菌气管细胞毒素分析的假阳性。
优选的，百日咳或百白破疫苗中百日咳杆菌气管细胞毒素的筛查方法和含量测定方法中的质谱条件如下：
离子源：ES+模式和ES-模式；质谱仪：三重四级杆质谱仪；雾化器流速：3L/min；加热器流速：10L/min；接口温度：200℃；DL温度：230℃；加热模块温度：400℃；干燥气流速：10L/min；接口电压：3kV。
质谱检测器检测模式为多离子选择监控(MRM)，质谱检测参数见表1。
表1质谱检测参数
Figure BDA0001755054950000052
*定量离子。
本发明的有益效果：
本发明采用高效液相色谱串联质谱方法，建立了一种高选择性、高灵敏度的百日咳杆菌气管细胞毒素检测方法，用于百日咳毒素产品、百日咳疫苗、百日咳毒素中间产品和百白破疫苗中百日咳杆菌气管细胞毒素的检测和含量测定。首次采用离子对和离子比的方法检测百日咳毒素、百日咳毒素中间产品和百白破疫苗中百日咳杆菌气管细胞毒素，该方法无须百日咳杆菌气管细胞毒素对照品，解决了因为百日咳杆菌气管细胞毒素对照品缺乏而导致的百日咳杆菌气管细胞毒素定性方法难以广泛实施的问题。
本方法有以下优势：
(1)本发明方法可以实现在没有对照品的情况下通过离子对来定性，筛查样品中是否存在百日咳杆菌气管细胞毒素。如果样品中三个离子对通道均在同一时间出峰，且离子比在0-50％范围内，认为该样品中存在百日咳杆菌气管细胞毒素。
(2)本方法为首次报道从百日咳Cs菌株中分离纯化出百日咳杆菌气管细胞毒素对照品，并首次通过高分辨质谱一级、二级结构测试确定其结构；首次公开了百日咳杆菌气管细胞毒素对照品纯度测试方法；
虽然国外已有百日咳杆菌气管细胞毒素对照品纯化方法，但该方法仅用于从百日咳tohoma菌株中纯化百日咳杆菌气管细胞毒素对照品。Cs百日咳菌株与tohoma菌株不同，培养环境复杂，纯化难度高。
Tohoma菌种纯化所用的填料为普通C18，本发明中所用为生物兼容C18。生物兼容C18的残留较少，回收率更高。
(3)本方法适用样品范围广，可用于以下样品中百日咳杆菌气管细胞毒素的含量测定：百日咳毒素产品、百日咳毒素中间品和不同工艺获得的百白破样品(共纯化和组分百白破样品)。
(4)本方法弥补了百白破、百日咳产品和百日咳中间产品中百日咳杆菌气管细胞毒素检测和定量方法缺失的现状，且具有超高灵敏度高，可实现0.2ng/L的百日咳杆菌气管细胞毒素检出，比欧洲药典要求的限度低1409倍。
(5)本方法具有分离速度快，检测通量高的特点，可实现9min内完成样品检测(含4min色谱柱平衡)。
(6)质量评估的样品类型多。本发明可用于不同来源不同阶段百日咳相关产品中百日咳杆菌气管细胞毒素的含量测定，包括但不局限于百日咳毒素产品、百日咳毒素中间产品和百白破疫苗。
附图说明
图1百日咳杆菌气管细胞毒素对照品纯度测试谱图；
图2a百日咳杆菌气管细胞毒素对照品结构；
图2b百日咳杆菌气管细胞毒素一级质谱图；
图2c百日咳杆菌气管细胞毒素二级质谱图；
图3a百日咳杆菌气管细胞毒素在非生物兼容酰胺柱上的残留谱图；
图3b百日咳杆菌气管细胞毒素在非生物兼容C18柱上的残留谱图；
图3c百日咳杆菌气管细胞毒素在非生物兼容C8柱上的残留谱图；
图3d百日咳杆菌气管细胞毒素在非生物兼容C30柱上的残留谱图；
图3e百日咳杆菌气管细胞毒素在普通生物兼容酰胺柱上的残留谱图；
图4固定相I分析百日咳杆菌气管细胞毒素后无残留检出谱图；
图5固定相II分析百日咳杆菌气管细胞毒素后无残留检出谱图；
图6固定相III分析百日咳杆菌气管细胞毒素后无残留检出谱图；
图7百日咳杆菌气管细胞毒素对照品MRM色谱图；
图8百日咳毒素产品中百日咳杆菌气管细胞毒素加标回收色谱图；
图9百日咳中间产品中百日咳杆菌气管细胞毒素加标回收色谱图；
图10百白破样品中百日咳杆菌气管细胞毒素加标回收色谱图；
图11厂家1百日咳毒素产品中百日咳杆菌气管细胞毒素的含量检测；
图12厂家1百日咳毒素中间产品中百日咳杆菌气管细胞毒素的含量检测；
图13厂家2百日咳毒素产品中百日咳杆菌气管细胞毒素的含量检测；
图14厂家2百日咳毒素中间产品中百日咳杆菌气管细胞毒素的含量检测；
图15厂家3百日咳毒素产品中百日咳杆菌气管细胞毒素的含量检测；
图16厂家3百日咳毒素中间产品中百日咳杆菌气管细胞毒素的含量检测；
图17厂家4百日咳毒素产品中百日咳杆菌气管细胞毒素的含量检测；
图18厂家4百日咳毒素中间产品中百日咳杆菌气管细胞毒素的含量检测；
图19厂家5百白破疫苗中百日咳杆菌气管细胞毒素的含量检测；
图20厂家6百白破疫苗中百日咳杆菌气管细胞毒素的含量检测；
图21厂家7百白破疫苗中百日咳杆菌气管细胞毒素的含量检测；
图22厂家8百白破疫苗中百日咳杆菌气管细胞毒素的含量检测；
图23厂家9百白破疫苗中百日咳杆菌气管细胞毒素的含量检测。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明进行进一步的阐述，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。
实施例1
1、实验仪器与设备：
高压二元泵、脱气机、自动进样器、柱温箱和三重四级杆质谱仪。
2、实验试剂：
对照品百日咳杆菌气管细胞毒素为实验室纯化所得，经高分辨质谱多级表征确定其结构。
3、检测条件：
色谱柱：固定相Ⅰ，R1为硅胶；
流动相：A-含10mmol/L甲酸铵的乙腈水溶液(用甲酸调节pH到4.3)，乙腈水溶液中乙腈的体积浓度为95％；B-10mmol/L甲酸铵水溶液(用甲酸调节pH到4.3)；
具体的，流动相A中甲酸铵在乙腈水溶液中的终浓度为10mmol/L。
梯度：0-5min 80％A-20％A；柱温：30℃；流速：0.3mL/min；进样体积：10μL。
质谱条件：
离子源：ES+模式和ES-模式；质谱仪：三重四级杆质谱仪；雾化器流速：3L/min；加热器流速：10L/min；接口温度：200℃；DL温度：230℃；加热模块温度：400℃；干燥气流速：10L/min；接口电压：3kV；质谱检测器检测模式为多离子选择监控(MRM)，质谱检测参数见表1。
4、标准曲线绘制：
(1)标准母液配制：称取适量百日咳杆菌气管细胞毒素对照品(图7)，用乙腈：水(50:50，
v/v)混合液溶解，配制成浓度为1μg/L的母液备用；
(2)标准工作溶液的配制：用乙腈：水(50:50，v/v)混合液稀释上述母液到0.00029-1μg/L浓度范围，得到标准工作溶液，标准工作溶液浓度点分别为0.369、0.185、0.092、0.046、0.023、0.012、0.0058μg/L；
(3)绘制标准工作曲线：将上述标准工作溶液用高效液相色谱串联质谱进行分析，即可得到上述对照品的色谱图，根据溶液浓度与对应色谱峰面积的关系得到标准工作曲线，如表2所示；
(4)样品检测：取待测样品加入同等体积乙腈，混匀后，14000r/min离心10min，取上清液用高效液相色谱串联质谱进行分析检测，根据待测组分的响应峰面积和标准工作曲线，得出待测物种百日咳杆菌气管细胞毒素的含量。
5、样品检测：百日咳毒素产品、百日咳毒素中间产品、百白破疫苗样品适量体积，与等体积乙腈混合，10℃条件下14000r/min离心10min，取上清液分析。
6、定性检测依据：取待测样品加入同等体积乙腈，混匀后，离心，取上清液用高效液相色谱串联质谱进行分析检测，根据样品中是否有百日咳杆菌气管细胞毒素特征离子对检出和检出离子对的离子比确定样品中是否含有百日咳杆菌气管细胞毒素。
样品中是否含有百日咳杆菌气管细胞毒素的定性测定：a)样品同时检出以下三组离子对922.3/719.3,922.3/391.1,922.3/302.1；b)统计工作曲线所用百日咳杆菌气管细胞毒素各浓度点922.3/719.3与922.3/391.1的离子的相对丰度比值和922.3/719.3与922.3/302.1的离子的相对丰度比值；离子的相对丰度比值随浓度变化，但922.3/719.3与922.3/391.1的离子的相对丰度比值不超过10％-60％范围，922.3/719.3与922.3/302.1的离子的相对丰度比值不超过40％-90％范围；样品谱图中百日咳杆菌气管细胞毒素各离子对的相对丰度比值不超过上述范围，可判断样品中存在百日咳杆菌气管细胞毒素；条件a)和b)均满足时，样品中含有百日咳杆菌气管细胞毒素。以上定性依据的制定参考食品国标GBT-20766-2006。
7、线性关系和灵敏度考察：
对上述标准工作曲线进行线性回归，并对方法进行灵敏度考察，结果见表2。结果表明各对照品在各自的质量范围内线性关系良好，证明本发明方法在所选线性范围内准确度高，方法灵敏度高。
表2线性关系和灵敏度考察
Figure BDA0001755054950000091
LOD和LOQ分别是指检出限和定量限。
8、重复性和回收率考察：
重复性测定：取浓度为11.5ng/L和92.3ng/L的对照品溶液，重复进样6次，将6次所得化合物峰面积求相对标准偏差(即重复性)值如表3所示。
回收率测定：取浓度为369ng/L和18.5ng/L的对照品溶液100μL，分别加入900μL样品和1mL乙腈，混匀，10℃条件下14000r/min离心10min，取上清液分析作为加标样品(RS)。取浓度为100μL水，分别加入900μL样品和1mL乙腈，混匀，10℃条件下14000r/min离心10min，取上清液分析作为样品(S)。取浓度为369ng/L和18.5ng/L的对照品溶液100μL，分别加入900μL水和1mL乙腈，混匀，10℃条件下14000r/min离心10min，取上清液分析作为对照品(R)。分别进样分析对照样品、加标样品和样品。将所得9种化合物峰面积按如下公式计算回收率：回收率＝((对照品R+样品S峰面积)/加标样品RS峰面积)x 100％，所得结果如表4所示。代表性谱图见图8-图10。
表3重复性考察结果
Figure BDA0001755054950000101
表4回收率考察结果
Figure BDA0001755054950000102
实施例2
厂家1百日咳毒素产品中百日咳杆菌气管细胞毒素的含量检测，检测条件如下：
固定相：同实施例1中所述固定相；
流动相：A-含10mmol/L甲酸铵的乙腈水溶液(用甲酸调节pH到4.3)，乙腈水溶液中乙腈的体积浓度为95％；B-10mmol/L甲酸铵水溶液(用甲酸调节pH到4.3)；
具体的，流动相A中甲酸铵在乙腈水溶液中的终浓度为10mmol/L。
梯度：0-5min 80％A-20％A；柱温：30℃；流速：0.3mL/min；进样体积：10μL。LC-MS条件：离子源：ESI正负离子同时扫描，雾化器流速3L/min，加热器流速10L/min，接口温度200℃，DL温度230℃，加热模块温度400℃，干燥气流速10L/min，接口电压3kV；其他检测条件与实施例1相同。
厂家1百日咳毒素产品中无百日咳杆菌气管细胞毒素检出(图11)，产品符合欧洲药典要求(百日咳杆菌气管细胞毒素含量不高于2pmol每剂)。
实施例3：
厂家1百日咳毒素中间产品中百日咳杆菌气管细胞毒素的含量检测，检测条件如下：
固定相：固定相Ⅱ；
流动相：A-含10mmol/L甲酸铵的乙腈水溶液(用甲酸调节pH到4.3)，乙腈水溶液中乙腈的体积浓度为95％；B-10mmol/L甲酸铵水溶液(用甲酸调节pH到4.3)；
具体的，流动相A中甲酸铵在乙腈水溶液中的终浓度为10mmol/L。
梯度：0-5min 5％A-30％A；柱温：50℃；流速：0.3mL/min；进样体积：10μL。LC-MS条件：离子源：ESI正负离子同时扫描，雾化器流速3L/min，加热器流速10L/min，接口温度200℃，DL温度230℃，加热模块温度400℃，干燥气流速10L/min，接口电压3kV；其他检测条件与实施例1相同。
厂家1百日咳毒素产品中无百日咳杆菌气管细胞毒素检出(图12)，产品符合欧洲药典要求(百日咳杆菌气管细胞毒素含量不高于2pmol每剂)。
实施例4：
厂家2百日咳毒素产品中百日咳杆菌气管细胞毒素的含量检测，检测条件如下：
固定相：固定相Ⅱ；
流动相：A-含10mmol/L甲酸铵的乙腈水溶液(用甲酸调节pH到4.3)，乙腈水溶液中乙腈的体积浓度为95％；B-10mmol/L甲酸铵水溶液(用甲酸调节pH到4.3)；
具体的，流动相A中甲酸铵在乙腈水溶液中的终浓度为10mmol/L。
梯度：0-5min 5％A-30％A；柱温：40℃；流速：0.3mL/min；进样体积：10μL。LC-MS条件：离子源：ESI正负离子同时扫描，雾化器流速3L/min，加热器流速10L/min，接口温度200℃，DL温度230℃，加热模块温度400℃，干燥气流速10L/min，接口电压3kV；其他检测条件与实施例1相同。
厂家2百日咳毒素产品中无百日咳杆菌气管细胞毒素检出(图13)，产品符合欧洲药典要求(百日咳杆菌气管细胞毒素含量不高于2pmol每剂)。
实施例5：
厂家2百日咳毒素中间产品中百日咳杆菌气管细胞毒素的含量检测，检测条件如下：
固定相：固定相Ⅲ；
流动相：A-含10mmol/L甲酸铵的乙腈水溶液(用甲酸调节pH到4.3)，乙腈水溶液中乙腈的体积浓度为95％；B-10mmol/L甲酸铵水溶液(用甲酸调节pH到4.3)；
具体的，流动相A中甲酸铵在乙腈水溶液中的终浓度为10mmol/L。
梯度：0-5min 5％A-30％A；柱温：30℃；流速：0.3mL/min；进样体积：10μL。LC-MS条件：离子源：ESI正负离子同时扫描，雾化器流速3L/min，加热器流速10L/min，接口温度200℃，DL温度230℃，加热模块温度400℃，干燥气流速10L/min，接口电压3kV；其他检测条件与实施例1相同。
厂家2百日咳毒素中间产品中无百日咳杆菌气管细胞毒素检出(图14)，产品符合欧洲药典要求(百日咳杆菌气管细胞毒素含量不高于2pmol每剂)。
实施例5：
厂家2百日咳毒素中间产品中百日咳杆菌气管细胞毒素的含量检测，检测条件如下：
固定相：固定相Ⅰ；
流动相：A-含10mmol/L乙酸铵的乙腈水溶液(用甲酸调节pH到4.3)，乙腈水溶液中乙腈的体积浓度为95％；B-10mmol/L乙酸铵水溶液(用甲酸调节pH到4.3)；
具体的，流动相A中甲酸铵在乙腈水溶液中的终浓度为10mmol/L。
梯度：0-5min 80％A-20％A；柱温：20℃；流速：0.3mL/min；进样体积：10μL。LC-MS条件：离子源：ESI正负离子同时扫描，雾化器流速3L/min，加热器流速10L/min，接口温度200℃，DL温度230℃，加热模块温度400℃，干燥气流速10L/min，接口电压3kV；其他检测条件与实施例1相同。
厂家2百日咳毒素中间产品中无百日咳杆菌气管细胞毒素检出(图15)，产品符合欧洲药典要求(百日咳杆菌气管细胞毒素含量不高于2pmol每剂)。
实施例6：
厂家3百日咳毒素产品中百日咳杆菌气管细胞毒素的含量检测，检测条件如下：
固定相：固定相Ⅲ；
流动相：A-含2mmol三氟乙酸的乙腈水溶液，乙腈水溶液中乙腈的体积浓度为95％；B-10mmol/L乙酸铵水溶液(用甲酸调节pH到4.3)；
具体的，流动相A中甲酸铵在乙腈水溶液中的终浓度为10mmol/L。
梯度：0-5min 5％A-30％A；柱温：30℃；流速：0.3mL/min；进样体积：10μL。LC-MS条件：离子源：ESI正负离子同时扫描，雾化器流速3L/min，加热器流速10L/min，接口温度200℃，DL温度230℃，加热模块温度400℃，干燥气流速10L/min，接口电压3kV；其他检测条件与实施例1相同。
厂家3百日咳毒素产品中无百日咳杆菌气管细胞毒素检出(图16)，产品符合欧洲药典要求(百日咳杆菌气管细胞毒素含量不高于2pmol每剂)。
实施例7：
厂家3百日咳毒素中间产品中百日咳杆菌气管细胞毒素的含量检测，检测条件如下：
固定相：固定相Ⅲ；
流动相：A-含5mmol/L甲酸铵的乙腈水溶液，乙腈水溶液中乙腈的体积浓度为95％；B-5mmol/L甲酸铵水溶液(用甲酸调节pH到4.3)；
具体的，流动相A中甲酸铵在乙腈水溶液中的终浓度为10mmol/L。
梯度：0-5min 5％A-30％A；柱温：30℃；流速：0.5mL/min；进样体积：10μL。LC-MS条件：离子源：ESI正负离子同时扫描，雾化器流速3L/min，加热器流速10L/min，接口温度200℃，DL温度230℃，加热模块温度400℃，干燥气流速10L/min，接口电压3kV；其他检测条件与实施例1相同。
厂家3百日咳毒素中间产品中无百日咳杆菌气管细胞毒素检出(图17)，产品符合欧洲药典要求(百日咳杆菌气管细胞毒素含量不高于2pmol每剂)。
实施例8：
厂家4百日咳毒素中间产品中百日咳杆菌气管细胞毒素的含量检测，检测条件如下：
固定相：固定相Ⅱ；
流动相：A-含2mmol/L甲酸的乙腈水溶液，乙腈水溶液中乙腈的体积浓度为95％；B-5mmol/L甲酸铵水溶液(用甲酸调节pH到4.3)；
梯度：0-5min 5％A-30％A；柱温：30℃；流速：0.3mL/min；进样体积：10μL。LC-MS条件：离子源：ESI正负离子同时扫描，雾化器流速3L/min，加热器流速10L/min，接口温度200℃，DL温度230℃，加热模块温度400℃，干燥气流速10L/min，接口电压3kV；其他检测条件与实施例1相同。
厂家4百日咳毒素中间产品中无百日咳杆菌气管细胞毒素检出(图18)，产品符合欧洲药典要求(百日咳杆菌气管细胞毒素含量不高于2pmol每剂)。
实施例8：
厂家5百白破疫苗中间产品中百日咳杆菌气管细胞毒素的含量检测，检测条件如下：
固定相：固定相Ⅲ；
流动相：A-含2mmol/L乙酸的乙腈水溶液，乙腈水溶液中乙腈的体积浓度为95％；B-5mmol/L甲酸铵水溶液(用甲酸调节pH到4.3)；
梯度：0-5min 5％A-30％A；柱温：30℃；流速：0.4mL/min；进样体积：10μL。LC-MS条件：离子源：ESI正负离子同时扫描，雾化器流速3L/min，加热器流速10L/min，接口温度200℃，DL温度230℃，加热模块温度400℃，干燥气流速10L/min，接口电压3kV；其他检测条件与实施例1相同。
厂家5百白破疫苗中无百日咳杆菌气管细胞毒素检出(图19)，产品符合欧洲药典要求(百日咳杆菌气管细胞毒素含量不高于2pmol每剂)。
实施例9：
厂家6百白破疫苗中百日咳杆菌气管细胞毒素的含量检测，检测条件如下：
固定相：固定相Ⅲ；
流动相：A-含2mmol/L乙酸的乙腈水溶液，乙腈水溶液中乙腈的体积浓度为95％；B-5mmol/L甲酸铵水溶液(用甲酸调节pH到4.3)；
梯度：0-5min 5％A-30％A；柱温：30℃；流速：0.2mL/min；进样体积：10μL。LC-MS条件：离子源：ESI正负离子同时扫描，雾化器流速3L/min，加热器流速10L/min，接口温度200℃，DL温度230℃，加热模块温度400℃，干燥气流速10L/min，接口电压3kV；其他检测条件与实施例1相同。
厂家6百白破疫苗中无百日咳杆菌气管细胞毒素检出(图20)，产品符合欧洲药典要求(百日咳杆菌气管细胞毒素含量不高于2pmol每剂)。
实施例10：
厂家7百白破疫苗中百日咳杆菌气管细胞毒素的含量检测，检测条件如下：
固定相：固定相Ⅲ；
流动相：A-含2mmol/L乙酸的乙腈水溶液，乙腈水溶液中乙腈的体积浓度为95％；B-5mmol/L甲酸水溶液；
梯度：0-5min 5％A-30％A；柱温：30℃；流速：0.3mL/min；进样体积：10μL。LC-MS条件：离子源：ESI正负离子同时扫描，雾化器流速3L/min，加热器流速10L/min，接口温度200℃，DL温度230℃，加热模块温度400℃，干燥气流速10L/min，接口电压3kV；其他检测条件与实施例1相同。
厂家7百白破疫苗中无百日咳杆菌气管细胞毒素检出(图21)，产品符合欧洲药典要求(百日咳杆菌气管细胞毒素含量不高于2pmol每剂)。
实施例11：
厂家8百白破疫苗中百日咳杆菌气管细胞毒素的含量检测，检测条件如下：
固定相：固定相Ⅲ；
流动相：A-含3mmol/L乙酸的乙腈水溶液，乙腈水溶液中乙腈的体积浓度为95％；B-3mmol/L甲酸水溶液；
梯度：0-5min 5％A-30％A；柱温：30℃；流速：0.3mL/min；进样体积：10μL。LC-MS条件：离子源：ESI正负离子同时扫描，雾化器流速3L/min，加热器流速10L/min，接口温度200℃，DL温度230℃，加热模块温度400℃，干燥气流速10L/min，接口电压3kV；其他检测条件与实施例1相同。
厂家8百白破疫苗中无百日咳杆菌气管细胞毒素检出(图22)，产品符合欧洲药典要求(百日咳杆菌气管细胞毒素含量不高于2pmol每剂)。
实施例12：
厂家9百白破疫苗中百日咳杆菌气管细胞毒素的含量检测，检测条件如下：
固定相：固定相Ⅲ；
流动相：A-含2mmol/L乙酸的乙腈水溶液，乙腈水溶液中乙腈的体积浓度为95％；B-5mmol/L甲酸水溶液；
梯度：0-5min 5％A-30％A；柱温：30℃；流速：0.3mL/min；进样体积：10μL。LC-MS条件：离子源：ESI正负离子同时扫描，雾化器流速3L/min，加热器流速10L/min，接口温度200℃，DL温度230℃，加热模块温度400℃，干燥气流速10L/min，接口电压3kV；其他检测条件与实施例1相同。
厂家9百白破疫苗中无百日咳杆菌气管细胞毒素检出(图23)，产品符合欧洲药典要求(百日咳杆菌气管细胞毒素含量不高于2pmol每剂)。
上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。

Claims (10)

1.一种百日咳或百白破疫苗中百日咳杆菌气管细胞毒素的含量测定方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)标准工作曲线的绘制：称取适量百日咳杆菌气管细胞毒素对照品，配制成标准工作溶液；将标准工作溶液用高效液相色谱串联质谱进行分析，即可得到对照品的色谱图，根据溶液浓度与对应色谱峰面积的关系得到标准工作曲线；
(2)样品检测：取待测样品加入同等体积乙腈，混匀后，离心，取上清液用高效液相色谱串联质谱进行分析检测，根据待测组分的响应峰面积和标准工作曲线，得出待测组分百日咳杆菌气管细胞毒素的含量。
2.根据权利要求1所述的一种百日咳或百白破疫苗中百日咳杆菌气管细胞毒素的含量测定方法，其特征在于，所述百日咳杆菌气管细胞毒素标对照品是从百日咳Cs菌株中分离、纯化而得，所述百日咳杆菌气管细胞毒素标对照品的制备过程如下：
1)浓缩培养液：百日咳杆菌培养液在4℃下采用高速离心的方法去除大分子杂质，高速离心，取上清液过0.22μm醋酸纤维素膜，去除溶液中的大分子杂质，收集滤液，用三氟乙酸酸滤过液至pH为3；
2)用生物兼容C18柱纯化百日咳杆菌气管细胞毒素：用甲醇和三氟乙酸水溶液依次洗涤C18填料；将步骤1)酸化后的滤液注入生物兼容柱中，然后加入洗涤后的C18填料；将生物兼容柱中的溶液抽干，再用三氟乙酸水洗涤生物兼容柱，百日咳杆菌气管细胞毒素产品被生物兼容C18填料富集；再用含三氟乙酸、正丁醇和水的溶液洗脱被富集的百日咳杆菌气管细胞毒素产品，并收集馏分；减压浓缩馏分以备QMA柱纯化；
3)QMA纯化：用溶液Ⅰ浸润QMA柱10min，在用20mL溶液Ⅰ洗生物兼容C18柱；接着用20mL溶液Ⅱ洗生物兼容C18柱；再用20mL甲醇清洗C18柱；最后用20mL溶液Ⅰ平衡生物兼容C18柱；平衡好后，将减压浓缩所得馏分注入QMA柱，再用溶液Ⅰ洗涤未结合蛋白；然后用溶液Ⅱ洗脱收集百日咳杆菌气管细胞毒素产品；
4)脱盐得百日咳杆菌气管细胞毒素对照品：用三氟乙酸酸化百日咳杆菌气管细胞毒素产品，再按步骤2)上样并收集百日咳杆菌气管细胞毒素脱盐馏分，冻干百日咳杆菌气管细胞毒素脱盐馏分，得百日咳杆菌气管细胞毒素对照品。
3.根据权利要求2所述的一种百日咳或百白破疫苗中百日咳杆菌气管细胞毒素的含量测定方法，其特征在于，步骤1)所述高速离心的转数为13,200x g，离心时长为20分钟；步骤2)所述三氟乙酸水溶液为三氟乙酸：水的体积比为1:1000；步骤2)所述三氟乙酸、正丁醇、水的体积比为1:200:800。
4.根据权利要求2所述的一种百日咳或百白破疫苗中百日咳杆菌气管细胞毒素的含量测定方法，其特征在于，所述溶液Ⅰ为含有10mmol/L乙酸铵的体积浓度为20％甲醇水溶液；所述溶液Ⅱ为含有10mmol/L乙酸铵和1mol/L氯化钠的体积浓度为20％甲醇水溶液。
5.根据权利要求1所述的一种百日咳或百白破疫苗中百日咳杆菌气管细胞毒素的含量测定方法，其特征在于，所述百日咳杆菌气管细胞毒素对照品纯度测定的具体方法为：称取适量百日咳杆菌气管细胞毒素对照品，用乙腈：水溶解并稀释到1μg/L，用LC-IT-TOF扫描一级谱图，确认百日咳杆菌气管细胞毒素对照品的纯度；
所述百日咳杆菌气管细胞毒素纯度计算方法：样品中所有峰的峰面积相加得总峰面积，百日咳杆菌气管细胞毒素的纯度＝百日咳杆菌气管细胞毒素峰面积/总峰面积x100％。
6.根据权利要求1所述的一种百日咳或百白破疫苗中百日咳杆菌气管细胞毒素的含量测定方法，其特征在于，百日咳杆菌气管细胞毒素结构鉴定的具体方法为：用LC-IT-TOF扫描百日咳杆菌气管细胞毒素一级、二级质谱图，从一级精确分子量(922.3815)和二级碎片分子量(719.3026,391.1805,302.1323)推断百日咳杆菌气管细胞毒素结构；
所述LC-IT-TOF测试条件如下：电离模式：ES+；雾化器流速：1.5L.min-1；接口电压：3.5kV；CDL温度：200℃；加热块问题：200℃；检测器电压：1.70kV；TOF飞行管温度：40.0(+/-0.3℃)；扫描质量范围m/z：500-1500；二级能量值：50％；二级扫描范围m/z：200-1500；质量校正：三氟乙钠溶液。
7.根据权利要求1所述的一种百日咳或百白破疫苗中百日咳杆菌气管细胞毒素的含量测定方法，其特征在于，色谱条件如下：
柱温：30-50℃；
流动相：A-含离子交换剂的有机溶剂水溶液；B-离子交换剂水溶液；
流速：0.2～0.5mL/min；
进样体积：10μL；
固定相为固定相Ⅰ、固定相Ⅱ或固定相Ⅲ；
所述固定相Ⅰ为一种亲水作用-阴阳离子交换混合模式固定相，其结构式如下：
Figure FDA0001755054940000021
其中R1为硅胶或聚苯乙烯；
所述固定相Ⅱ为生物兼容C18色谱柱；
所述固定相Ⅲ为生物兼容C8色谱柱。
8.根据权利要求1所述的一种百日咳或百白破疫苗中百日咳杆菌气管细胞毒素的含量测定方法，其特征在于，质谱条件如下：
离子源：ES+模式和ES-模式；质谱仪：三重四级杆质谱仪；雾化器流速：3L/min；加热器流速：10L/min；接口温度：200℃；DL温度：230℃；加热模块温度：400℃；干燥气流速：10L/min；接口电压：3kV。
9.一种百日咳或百白破疫苗中百日咳杆菌气管细胞毒素的筛查方法，其特征在于，包括以下步骤：取待测样品加入同等体积乙腈，混匀后，离心，取上清液用高效液相色谱串联质谱进行分析检测，根据样品中是否有百日咳杆菌气管细胞毒素特征离子对检出和检出离子对的离子比确定样品中是否含有百日咳杆菌气管细胞毒素；
其中，样品中是否含有百日咳杆菌气管细胞毒素的定性依据为：a)样品同时检出以下三组离子922.3>719.3,922.3>391.1,922.3>302.1；b)922.3>719.3与922.3>391.1的离子比在10％-60％范围内，922.3>719.3与922.3>302.1的离子比在40％-90％范围内；条件a)和b)均满足时，样品中含有百日咳杆菌气管细胞毒素。
10.根据权利要求9所述的一种百日咳或百白破疫苗中百日咳杆菌气管细胞毒素的筛查方法，其特征在于，色谱条件如下：
柱温：30-50℃；
流动相：A-含离子交换剂的有机溶剂水溶液；B-离子交换剂水溶液；
流速：0.2～0.5mL/min；
进样体积：10μL；
固定相为固定相Ⅰ、固定相Ⅱ或固定相Ⅲ；
所述固定相Ⅰ为一种亲水作用-阴阳离子交换混合模式固定相，其结构式如下：
其中R1为硅胶或聚苯乙烯；
所述固定相Ⅱ为生物兼容C18色谱柱；
所述固定相Ⅲ为生物兼容C8色谱柱；
质谱条件如下：
离子源：ES+模式和ES-模式；质谱仪：三重四级杆质谱仪；雾化器流速：3L/min；
加热器流速：10L/min；接口温度：200℃；DL温度：230℃；加热模块温度：400℃；
干燥气流速：10L/min；接口电压：3kV。
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