CN106519147B - 微纳米材料、其表面用亲水物质共价修饰的产物及制备方法 - Google Patents

微纳米材料、其表面用亲水物质共价修饰的产物及制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种微纳米材料、其表面用亲水物质共价修饰的产物及制备方法；微纳米材料表面含羧基或潜在羧基并转变成活泼酯；表面用亲水物质共价修饰的产物，由表面活泼酯与含脂肪族伯胺或/和脂肪族仲胺的亲水化合物或/和亲水聚合物为修试剂成酰胺键共价修饰而得；制备时，用含羧基或/和潜在羧基单体在聚合材料表面生成足够多羧基或/和潜在羧基并转变成活泼酯，再与带脂肪族伯胺和/或仲胺、潜在兼性离子基团、亲水连接臂且体积适中的修饰剂成酰胺键获得共价修饰层；在共价修饰产物表面重复生成活泼酯后与亲水修饰剂成酰胺键的过程实现多层共价修饰，用中等体积亲水修饰剂高效覆盖微纳米材料表面而显著降低修饰产物对生物分子非特异吸附。

Description

微纳米材料、其表面用亲水物质共价修饰的产物及制备方法
技术领域
本发明涉及一种微纳米材料、表面用亲水物质共价修饰的产物及制备方法；本质属于生物医用微纳米材料及其表面修饰改性技术。
背景技术
本发明将分子量小于500道尔顿物质称为化合物，分子量不小于500道尔顿称为聚合物。
用亲水化合物/聚合物对微纳米材料表面进行修饰可降低其非特异吸附而增强应用，如用聚乙二醇即PEG、兼性离子物质、亲水天然生物高聚物(肝素和白蛋白等)进行修饰。天然生物高聚物易对其它生物分子发生非特异吸附，对疏水小分子仍有很强非特异吸附。相反，PEG及两性离子化合物修饰后能显著降低非特异吸附、自身化学惰性，故更有吸引力。PEG链足够长时修饰效果才显著，否则需有非常高修饰度；PEG链本身的柔性限制了修饰度；当复合材料表面PEG密度过大时，PEG链对蛋白质和疏水小分子物质仍有非特异性吸附。所以，单用PEG进行修饰的实际效果不足。
两性离子又称兼性离子，指有等量正负电荷的官能团。微纳米材料表面覆盖的兼性离子修饰剂能显著降低非特异吸附；有大量分子间离子对的混合物，也有很强水合能力而非特异吸附弱。但现有兼性离子修试剂体积小，修饰覆盖度小而修饰效果弱。所以，需优化用兼性离子修饰的方案。
设计修饰方案首先需确定共价化学反应。在温和条件下，羧基很容易高收率活化成活泼酯，再与脂肪族伯胺及脂肪族仲胺反应成酰胺的速度快而且收率高。在微纳米材料表面生成高密度羧基并转变成活泼酯后与带脂肪族伯胺和/或脂肪族仲胺的修饰剂成酰胺键，就是适用的共价修饰反应。
设计修饰方案还需确定修饰剂结构及共价修饰反应条件。含脂肪族伯胺和/或脂肪族仲胺的两性离子化合物作为修饰剂不溶于常见有机溶剂而易溶于水溶液；此类修饰剂需在碱性水溶液中与微纳米材料表面活泼酯进行修饰反应，否则氨基反应活性低而使修饰度不足，但活泼酯在碱性水溶液中快速水解而无法保障修饰度。弱酸性条件下活泼酯较稳定，但胺基电离而与活泼酯反应太慢，活泼酯缓慢水解也无法保障修饰度。活泼酯在惰性有机溶剂中与脂肪族伯胺及脂肪族仲胺即使室温下也反应很快且收率高，但兼性离子化合物在这类惰性有机溶剂中难溶解。非离子化合物在惰性有机溶剂中溶解度通常较高。设计亲水非离子化合物且含脂肪族伯胺和/或脂肪族仲胺和通过简单反应生成兼性离子的基团即潜在兼性离子基团的物质作为修饰剂；在惰性有机溶剂中，此类亲水修饰剂与微纳米微纳米材料表面活泼酯成酰胺，再原位衍生高收率生成兼性离子基团，就能获得在微纳米材料表面的高密度兼性离子修饰层；这可能是在微纳米材料表面生成兼性离子对修饰层的必要策略。
1,3-丙基磺内酯能与非酰胺的脂肪族伯胺、脂肪族仲胺及脂肪族叔胺反应生成共价连接磺酸。脂肪族伯胺和脂肪族仲胺能连接的磺酸基团数目不确定，其修饰后不为电中性，容易造成因强静电作用产生的对带电物质的非特异吸附。针对材料的修饰反应为非均相反应，无法通过控制1,3-丙基磺内酯的用量生成均匀的中性兼性离子修饰层。但三烷基取代叔胺只能连接一个磺酸，刚好生成兼性离子，是理想的潜在兼性离子基团。因此，用含三烷基取代叔胺的中性潜兼性离子修饰剂，在惰性有机溶剂中与微纳米材料表面活泼酯反应，再用1,3-丙基磺内酯将三烷基取代叔胺原位转变成兼性离子对，可能是用兼性离子对微纳米材料表面进行共价修饰降低非特异吸附的唯一方案。
亲水修饰剂对微纳米材料表面覆盖度尽可能高才能显著降低修饰后微纳米材料表面的非特异吸附，这就要求用尽可能大体积的修饰剂并有足够高修饰度；但大体积修饰剂的空间位阻会降低其与微纳米材料表面活泼酯的反应活性而降低修饰度。在修试剂和微纳米材料表面之间插入连接臂，有利于提高修饰剂对微纳米材料表面的覆盖度，同时降低修饰反应的位阻。用体积较小的潜兼性离子物质或/和短PEG链交替进行的共价修饰，有利于在每步修饰反应中保障修饰度；用体积适中的亲水修饰剂进行多层共价修饰，相当于原位逐步增加修饰剂的体积而增加修饰剂对微纳米材料表面的覆盖度，是避免大体积修饰剂位阻效应而保障修饰度的必要方式。在修试剂和微纳米材料间直接或间接插入连接臂有利于提高覆盖度和修饰度。对微纳米材料表面的修饰为非均相反应，其重复性低，需尽可能减少修饰反应次数。使用带短链柔性亲水连接臂的中性潜兼性离子亲水修饰剂(直接插入连接臂)，或者对每次修饰后所得活泼酯进行延伸而间接提供连接臂，更有利于提高修饰剂覆盖度。
为保障每层修饰反应之后的再修饰步骤有足够高修饰度，每步修饰反应所用修饰剂中须有足够羧基，但这些羧基之间的静电排斥会降低此类修饰剂本身同微纳米材料表面活泼酯的反应活性和修饰度。使用通过简单反应能转变成羧基的中性基团作为潜在羧基，可避免羧基之间的静电排斥对修饰反应的阻碍而保障修饰度。使用含大量中性潜在羧基的单体进行聚合制备微纳米材料后，也有利于在表面衍生出更多可反应的活泼酯，是制备本发明所述待修饰微纳米材料的一个重要策略。显然，使用中性亲水且含有潜在羧基、潜在兼性离子基团、亲水柔性连接臂的修饰剂，及聚合制备微纳米材料时使用含有中性潜在羧基官能团的单体，就成为一个必要的综合优化的共价修饰方案。
应用中，要保留微纳米材料表面固定生物分子活性最好能位点选择性固定生物分子。在免疫分析中，抗体常固定在微纳米材料表面或与微纳米材料形成共价加合物。天然抗体有多对远离抗原结合位点的非必须二硫键。对表面无巯基及二硫键的信号分子/物质，通过对抗体二硫键位点选择性共价修饰进行标记，有利于保留加合物中二者的活性且提高加合物收率。所以，本发明还采用蛋白二硫键选择性共价修饰官能团，实现用表面无巯基及二硫键的蛋白对抗体的标记，及用表面无巯基及二硫键蛋白/聚合物/小分子与抗体的不对称交联，以提高所得加合物中抗体的活性。
所以，本发明的核心是一个系统优化的综合性方案，目的是获得表面亲水且固定化生物分子有尽可能高活性的微纳米材料，其技术要点包括(1)待修饰微纳米材料制备过程的优化：用特殊有机单体进行聚合，在所得微纳米材料表面生成尽可能多脂肪族羧基或/和潜在羧基官能团并都尽可能转变成活泼酯，(2)修试剂结构的优化：用亲水且体积适中，还含脂肪族伯胺和/或仲胺、潜在兼性离子基团、柔性亲水连接臂的物质为修饰剂，(3)修饰反应过程的优化：在惰性有机溶剂中与微纳米材料表面活泼酯高收率形成酰胺键，提高对材料表面的修饰度，(4)修试剂覆盖度的优化：重复进行共价修饰获得多层共价修饰层而提高修饰剂对材料表面的覆盖度，避免大体积亲水修试剂的位阻降低了修饰度而降低覆盖度，(5)用亲水修试剂多层共价修饰过程中为官能团提供柔性连接臂，在共价修饰后微纳米材料表面生成特定官能团更有利于保留固定化大分子的生物活性。所述多种策略的系统优化和整合，才高效降低修饰产物的非特异吸附且提高固定化大分子的活性。
发明内容
本发明目的是提供表面含羧基、潜在羧基、活泼酯、阳离子、阴离子、中性亲水官能团、金属离子螯合官能团或蛋白二硫键选择性修饰官能团之一或其混合物的待修饰微纳米材料及其制备方法、其表面用亲水物质共价修饰的产物及制备方法；在制备待修饰微纳米材料时用含羧基或/和潜在羧基的特殊有机单体以便后续在所得微纳米材料表面生成足够多羧基对应的活泼酯用于共价修饰；用带脂肪族伯胺和/或脂肪族仲胺、潜在兼性离子基团、柔性连接臂且体积适中的亲水修饰剂，与微纳米材料表面活泼酯形成酰胺键得共价修饰层，及通过重复进行共价修饰获得多层共价修饰产物，以提高修饰剂对材料表面的覆盖度、降低产物的非特异吸附且同时提供带柔性臂的表面官能团。
本发明的微纳米材料所述微纳米材料表面含以下官能团：羧基、潜在羧基、活泼酯、阳离子、阴离子、中性亲水官能团、金属离子螯合官能团或蛋白二硫键选择性修饰官能团之一或上述官能团的混合物；所述待修饰微纳米材料表面的这些官能团直接来自通过聚合反应制备微纳米材料时所用有机单体，或对来自聚合反应所用有机单体的羧基和/或潜在羧基进行衍生化转变而间接生成。
本发明还公开了一种所述微纳米材料的制备方法，所述微纳米材料用有机单体聚合反应制成；聚合反应所用所用有机单体直接在微纳米材料表面提供羧基、潜在羧基、活泼酯、阳离子、阴离子、中性亲水官能团、金属离子螯合官能团或蛋白二硫键选择性修饰官能团之一或其混合物，或由聚合所用有机单体在表面直接提供羧基或潜在羧基再进行衍生化转化而间接提供上述官能团。
进一步，所述微纳米材料，包括有机聚合物微纳米材料、有机聚合物-无机微纳米颗粒复合微纳米材料和有机聚合物-有机微纳米颗粒复合微纳米材料；制备所述复合微纳米材料时所用微纳米颗粒包括磁纳米粒、量子点、上转发光颗粒、有机聚合物颗粒、有机-无机复合颗粒之一或它们的混合物；
制备所述微纳米材料时，聚合反应使用了共价结构中既含有聚合所需官能团还含羧基、潜在羧基、活泼酯、阳离子、阴离子、中性亲水官能团、金属离子螯合官能团或蛋白二硫键选择性修饰官能团之一或其混合物的特殊有机单体，且这些特殊有机单体占所用单体总摩尔量的比例不少于1％；
制备所述微纳米材料颗粒时，用油包水或水包油微乳体系将所用单体分散到微乳中再进行聚合，或将聚合物材料大体积颗粒/膜片用机械方法破碎得所需微纳米材料颗粒；用微乳体系分散后再聚合时，所用特殊有机单体只要在聚合反应相的溶解度满足要求，适合单用或以任意比例混用。
本发明还公开了一种所述微纳米材料表面用亲水物质共价修饰的产物，包括单层及多层共价修饰产物；将所述微纳米材料表面的羧基和潜在羧基转变成活泼酯，与含脂肪族伯胺或/和脂肪族仲胺的亲水化合物和/或聚合物为修饰剂成酰胺键进行共价修饰得单层共价修饰产物；在亲水物质共价修饰产物的表面重复再生所述活泼酯，以含脂肪族伯胺或/和脂肪族仲胺的亲水化合物和/或亲水聚合物为修饰剂，通过重复形成酰胺键进行共价修饰获得多层共价修饰产物。
进一步，所述共价修饰的产物表面最终得到羧基、潜在羧基、阳离子、阴离子、中性亲水官能团、活泼酯、金属离子螯合官能团或蛋白二硫键选择性修饰官能团之一或其混合物。
本发明还公开了一种所述微纳米材料表面用亲水物质共价修饰产物的制备方法，包括下列步骤：
a.以表面具有羧基或/和潜在羧基的微纳米材料为待修饰微纳米材料，将待修饰微纳米材料表面的羧基和潜在羧基转变成羧基的活泼酯；
b.对经过步骤a获得表面活泼酯的微纳米材料，用含脂肪族伯胺或/和脂肪族仲胺的亲水化合物和/或亲水聚合物为修饰剂，通过形成酰胺键实现共价修饰。
进一步，步骤b包括：
b1对获得表面活泼酯的微纳米材料，用含脂肪族伯胺或/和脂肪族仲胺的亲水化合物和/或亲水聚合物为修饰剂，通过形成酰胺键进行共价修饰；
b2对经过步骤b1共价修饰的微纳米材料，将其表面的羧基再转变成活泼酯，或将其表面潜在羧基转变成羧基后再进一步衍生成活泼酯，或将潜在羧基直接转变成活泼酯；
b3根据所需的共价修饰层数，重复步骤b1和b2。
进一步，c.经过步骤b3进行最后一次共价修饰后，在微纳米材料表面得到羧基、潜在羧基、阳离子、阴离子、中性亲水官能团、活泼酯、金属离子螯合官能团或蛋白二硫键选择性修饰官能团之一或其混合物。
进一步，步骤a中，活泼酯来自待修饰微纳米材料表面的羧基或/和潜在羧基，其生成方式包括：将所述待修饰微纳米材料表面羧基直接转变成活泼酯，或将所述待修饰微纳米材料表面潜在羧基转变成羧基再转变成活泼酯，或将所述待修饰微纳米材料表面潜在羧基转变成脂肪族羟基和/或脂肪族胺基再用CDI或TPG转变成活泼酯，或将所述待修饰微纳米材料表面潜在羧基直接转变成活泼酯；将此类表面活泼酯与长直链氨基酸反应重新获得羧基，或与含多个脂肪族伯胺的线性多胺反应转变成脂肪族胺基，再用于与含潜在羧基和活泼酯物质反应重新获得潜在羧基或与环状酸酐反应重新获得羧基，从而在羧基或潜在羧基与待修饰微纳米材料间插入连接臂，再将衍生所得表面羧基或潜在羧基转变成活泼酯；
步骤b中，所用修饰剂包括A类修饰剂和B类修饰剂，且二者分子量都不超过3000道尔顿；
所述A类修饰剂为亲水且含脂肪族伯胺或/和脂肪族仲胺的化合物或聚合物，且都含N,N-二甲基取代脂肪族叔胺、N,N-二乙基取代脂肪族叔胺和N,N-二正丙基取代脂肪族叔胺这三种叔胺官能团之一或多种；所述A类修饰剂分为A1亚类修饰剂和A2亚类修饰剂；A1亚类修饰剂为每分子含脂肪族伯胺和/或脂肪族仲胺不少于2个及N,N-二烷基取代的脂肪族叔胺官能团不少于1个；A2亚类修饰剂仅含1个脂肪族伯胺或脂肪族仲胺，但含N,N-二烷基取代的脂肪族叔胺官能团不少于1个；
A1亚类修饰剂和A2亚类修饰剂在步骤b中的使用方式为：单用A1亚类修饰剂，或用A1亚类修饰剂与A2亚类修饰剂的任意比例混合物；进行修饰时，来自修饰剂的脂肪族伯胺及脂肪族仲胺摩尔量之和比微纳米材料表面活泼酯摩尔量多10％以上；除非结束修饰即进行最后一层共价修饰，A2亚类修饰剂在步骤b中不单独使用；
所述B类修饰剂为亲水且含脂肪族伯胺或/和脂肪族仲胺的化合物或聚合物，但都不含N,N-二甲基取代脂肪族叔胺、N,N-二乙基取代脂肪族叔胺和N,N-二正丙基取代的脂肪族叔胺这三种叔胺官能团中任一种，并分成B1亚类修饰剂、B2亚类修饰剂、B3亚类修饰剂和B4亚类修饰剂；
B1亚类修饰剂为线性结构，一端为脂肪族伯胺或脂肪族仲胺，另一端为羧基，或既非脂肪族胺基也非脂肪族羟基的潜在羧基；B2亚类修饰剂为线性结构，且两端为脂肪族伯胺和/或脂肪族仲胺；B3亚类修饰剂为线性结构，一端为脂肪族伯胺或脂肪族仲胺，另一端为甲氧基或乙氧基；B4亚类修饰剂为非线性结构，含至少2个脂肪族伯胺和/或脂肪族仲胺；
B1亚类修饰剂、B2亚类修饰剂、B3亚类修饰剂和B4亚类修饰剂在步骤b中使用方式为：单用B1亚类修饰剂、B2亚类修饰剂或B4亚类修饰剂之一或三者的任意比例混合物，来自修饰剂的脂肪族伯胺及脂肪族仲胺摩尔量之和比微纳米材料表面活泼酯摩尔量多10％以上；B3亚类修饰剂调节来自B1亚类修饰剂、B2亚类修饰剂或B4亚类修饰剂的脂肪族伯胺及脂肪族仲胺的摩尔量占比；除非结束修饰即进行最后一层共价修饰，B3亚类修饰剂在步骤b中不单独使用；
A类修饰剂和B类修饰剂在步骤b中混合使用方式为：二者以任意比例混合使用；来自修饰剂的脂肪族伯胺及脂肪族仲胺摩尔量之和比微纳米材料表面活泼酯摩尔量多10％以上；除非结束修饰，在步骤b中不使用仅由A2亚类修饰剂和B3亚类修饰剂组成的任意比例混合物。
进一步，所述A类修饰剂还包括A3亚类、A4亚类、A5亚类和A6亚类修饰剂；
所述A3亚类修饰剂含有局部的兼性离子对结构，且含有不少于2个能与活泼酯反应的脂肪族伯胺和/或脂肪族仲胺，或仅1个能与活泼酯反应脂肪族伯胺或仲胺但还有至少1个羧基或潜在羧基；
所述A4亚类修饰剂含有局部的兼性离子对结构，但仅含1个能与活泼酯反应的脂肪族伯胺或脂肪族仲胺，且不含适合用于后续再进行下一层共价修饰所需的羧基或潜在羧基；除非结束修饰即进行最后一层共价修饰，A4亚类修饰剂不单独用于步骤b，也不仅仅与A2亚类修饰剂和B3亚类修饰剂组成任意比例混合物用于步骤b；
所述A5亚类修饰剂为阴离子亚类修饰剂，A6亚类修饰剂为阳离子亚类修饰剂；A5亚类修饰剂有单或多个磺酸和/或磷酸阴离子，且A5亚类修饰剂中同时含1个脂肪族伯胺或脂肪族伯胺者为A5-1，含多个脂肪族伯胺和/或脂肪族仲胺者为A5-2；A6亚类修饰剂有单或多个季胺或叔胺阳离子，且A6亚类修饰剂中同时含1个脂肪族伯胺或脂肪族仲胺者为A6-1，含多个脂肪族伯胺和/或脂肪族仲胺者为A6-2；A5亚类和A6亚类修饰剂配对用于共价修饰得离子对修饰层；
在步骤b中使用A3亚类修饰剂的方式为：A3亚类修饰剂单用，或与A1亚类、A2亚类、A4亚类、B1亚类、B2亚类和B3亚类修饰剂之一或全部任意比例混用；除非结束修饰，混合物修饰剂中A1亚类、A3亚类、B1亚类和B2亚类修饰剂摩尔量之和所占比例需大于10％；
在步骤b中使用A4亚类修饰剂的方式为：A4亚类修饰剂与A1亚类修饰剂、A3亚类修饰剂、B1亚类修饰剂、B2亚类修饰剂和B4亚类修饰剂之一或全部以任意比例混用；除非结束修饰，混合修饰剂中，A1亚类、A3亚类、B1亚类、B2亚类和B4亚类修饰剂摩尔量之和所占比例需大于10％；
在步骤b中使用A5亚类和A6亚类修饰剂的方式为：A5亚类修饰剂和A6亚类修饰剂混合使用且混合物中来自A5亚类修饰剂磺酸或/和磷酸阴离子和来自A6亚类修饰剂季胺及叔胺阳离子等量；
步骤b1中，用任意所述修饰剂及其任意比例混合物时，如微纳米材料表面活泼酯来自CDI或TPG衍生物，在惰性有机溶剂或中性水溶液或二者混合溶剂中悬浮反应10分钟以上进行修饰；否则，在惰性有机溶剂中悬浮反应10分钟以上进行修饰；
步骤b1中，除非单用A2亚类修饰剂或B3亚类修饰剂或这两亚类修饰剂的任意比例混合物，在惰性有机溶剂中，用卤代乙酸活泼酯、N-溴乙酰-6-氨基己酸活泼酯、O-Ts羟乙酸活泼酯、缩水甘油-丁二酸单酯对应的活泼酯、N-三氟乙酰甘氨酸活泼酯、4-丁醛酸的活泼酯、S-乙酰巯基乙酸活泼酯之一或任意比例混合物，与修饰后材料表面脂肪族伯胺及仲胺反应封闭表面的胺基并同步得到潜在羧基；这些带来潜在羧基的活泼酯摩尔用量比微纳米材料表面可反应脂肪族胺基多10％以上，在表面生成卤代烃、Ts酯、环氧基、三氟乙酰胺基、醛基及乙酰保护巯基为潜在羧基；
步骤b2中，当前一步的共价修饰过程使用了A1亚类修饰剂或/和A2亚类修饰剂时：用卤代乙酸活泼酯、N-溴乙酰-6-氨基己酸活泼酯、O-Ts羟乙酸活泼酯、缩水甘油-丁二酸单酯对应的活泼酯、N-三氟乙酰甘氨酸活泼酯、4-丁醛酸的活泼酯、S-乙酰巯基乙酸活泼酯之一或任意比例混合物封闭材料表面剩余的脂肪族伯胺及脂肪族仲胺后，在惰性有机溶剂中用比修饰后材料表面的二烷基取代叔胺摩尔量过量10％以上的1,3-丙基磺内酯将表面来自A1亚类修饰剂和A2亚类修饰剂的烷基叔胺转变成季胺与磺酸相邻的兼性离子修饰层；再将共价修饰产物表面的羧基和潜在羧基转成活泼酯；
步骤b2中，当前一步的共价修饰过程未使用了A1或A2亚类修饰剂时：用卤代乙酸活泼酯、N-溴乙酰-6-氨基己酸活泼酯、O-Ts羟乙酸活泼酯、缩水甘油-丁二酸单酯的活泼酯、N-三氟乙酰甘氨酸活泼酯、4-丁醛酸的活泼酯、S-乙酰巯基乙酸活泼酯之一或任意比例混合物封闭修饰产物表面剩余脂肪族伯胺及脂肪族仲胺得潜在羧基；再将共价修饰产物表面的羧基和潜在羧基转变成活泼酯；
步骤b2中，将共价修饰产物表面的活泼酯，再与长直链氨基酸反应重新获得羧基，或再与含多个脂肪族伯胺的线性多胺反应重新获得脂肪族胺基，用于再与含潜在羧基和活泼酯的物质反应重新获得潜在羧基或与环状酸酐反应重新获得潜在羧基，在表面羧基或潜在羧基与共价修饰产物间插入连接臂，再将衍生转化所得共价修饰产物表面的羧基或潜在羧基转变成活泼酯；
步骤c中，前一次共价修饰过程中：单用一端为脂肪族胺基而另一端为羧基B1亚类修饰剂，直接获得表层羧基；单用B2亚类修饰剂、B4亚类修饰剂之一或任意比例混合物时，在惰性有机溶剂中，用卤代乙酸活泼酯、N-溴乙酰-6-氨基己酸活泼酯、O-Ts羟乙酸活泼酯、缩水甘油-丁二酸单酯对应的活泼酯、N-三氟乙酰甘氨酸活泼酯、4-丁醛酸的活泼酯、S-乙酰巯基乙酸活泼酯、二硫键选择性修饰基团对应物质的活泼酯之一或任意比例混合物，与修饰后材料表面的脂肪族伯胺及脂肪族仲胺反应且活泼酯摩尔用量比微纳米材料表面可反应胺基多10％以上，生成对应的卤代烃、Ts酯、环氧基、三氟乙酰胺基、醛基、保护巯基、二硫键选择性修饰官能团之一或上述表面官能团的混合物；
步骤c中，前一次共价修饰过程中：单独使用A2亚类修饰剂得到烷基取代叔胺的阳离子表面官能团，如再用过量1,3-丙基磺内酯将表面A2亚类修饰剂的烷基叔胺转变成季胺与磺酸相邻的兼性离子，则得到兼性离子表面官能团；单独使用B3亚类修饰剂则得到中性且惰性亲水表面官能团；
步骤c中，将共价修饰产物表面的羧基或潜在羧基转变成活泼酯，再与长直链氨基酸反应重新获得羧基，或再与含多个脂肪族伯胺的线性多胺反应重新获得脂肪族胺基，用于与含潜在羧基和活泼酯的物质反应重新获得潜在羧基或与环状酸酐反应重新获得羧基或与含其它官能团的活泼酯反应获得其它形式表面官能团，从而在最终所得表面官能团与共价修饰产物间插入连接臂。
进一步，所述蛋白二硫键选择性修饰官能团含有能与巯基发生Michael加成和/或亲核取代反应的两个活泼官能团且二者间隔不超过10个共价键，还含有与其它成分以生成酰胺键相连所需的羧基；
与巯基发生Michael加成反应的活泼基团为丙烯酰基、乙烯砜基即R1-CH＝CH-SO2-R2，此类活泼基团单独发挥作用则属于潜在羧基；其反应中心是丙烯酰基中羰基的β位、砜基的β位烯烃碳原子；
与巯基发生亲核取代反应活泼基团，为羰基、砜基、烯烃、芳环α位饱和碳原子上含氯、溴、碘、三氟乙酸酯、对甲苯磺酸酯之一或多种的烃基，及与蛋白巯基发生Michael加成后衍生出上述烃基的基团，此类活泼基团单独发挥作用则属于潜在羧基；氯、溴、碘、三氟乙酸酯、对甲苯磺酸酯为亲核取代反应的离去基团X，亲核取代的反应中心是对应羰基、砜基、烯烃、芳环的α位饱和碳原子；
蛋白二硫键选择性修饰官能团中，连接两个巯基反应中心的片段不含碳碳单键相连的环和三烷基取代基，五元环、六元环作为共价连接片段时将两个与蛋白巯基反应活泼基团同时连接到环上；
蛋白二硫键选择性修饰官能团所含用于共价连接微纳米材料的羧基，转变成活泼酯、酸酐或酰氯后与微纳米材料表面伯胺和仲胺反应，获得位于微纳米材料表面的蛋白二硫键选择性修饰官能团；
上述蛋白二硫键选择性修饰官能团应用时，先用三烷基磷将目标蛋白表面的二硫键还原为两个空间相邻的游离巯基，再与微纳米材料表面蛋白二硫键选择性修饰官能团中两个空间相邻的蛋白巯基反应官能团同时反应，从而针对该蛋白二硫键实现位点选择性共价相连/固定化；
上述蛋白二硫键选择性修饰官能团的应用还有如下特征：将蛋白二硫键选择性修饰官能团所含羧基与表面不含巯基及二硫键的聚合物/小分子的胺基共价连接，获得针对表面含二硫键蛋白的选择性修饰或标记试剂；用三烷基磷还原蛋白表面二硫键为两个相邻的游离巯基后，与前述选择性修饰/标记试剂中蛋白二硫键选择性修饰官能团的两个活泼基团同时反应，实现共价相连或标记。
本发明的有益效果：本发明在制备微纳米材料时用含羧基或/和潜在羧基的特殊有机单体以便最终在待修饰微纳米材料表面生成足够多活泼酯；用带脂肪族伯胺和/或仲胺、潜在兼性离子基团、柔性亲水连接臂且体积适中的修饰剂降低反应位阻；修饰剂在惰性有机溶剂中与微纳米材料表面活泼酯成酰胺键得高密度共价修饰层，以便保障修饰反应收率；通过重复进行多层共价修饰提高修饰剂对材料表面的覆盖度而降低产物的非特异吸附，避免直接使用大体积修试剂时因位阻达不到预期修饰度；在多层共价修饰时为每层修饰及表面官能团提供连接臂以增加所固定生物分子活性。上述有益效果的累积，最终使得所述微纳米材料表面用亲水物质共价修饰的产物有很强亲水性，对蛋白质、核酸及小分子物质的非特异性吸附显著低于微纳米材料本身，且适合保留所固定生物分子活性。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明作进一步描述。
图1.A1-1类修饰剂的制备
图2.A2-3类修饰剂的制备
图3.A3-1类修饰剂的制备
图4.A4-3类修饰剂的制备
图5.A6-2类修饰剂的制备
图6.MSP表面羧基化及羧基活化流程
图7.兼性离子和PEG交替两层修饰流程
图8.单用兼性离子两层修饰的过程
具体实施方式
适用于本发明的物质及其性质特征如下：
1、环状酸酐指环丁二酸酐、环戊二酸酐及聚马来酸酐；卤代烃指位于羰基α-位饱和脂肪族伯碳原子上的氯、溴或碘；Ts表示对甲苯磺酰，Ts酯指Ts与伯醇或仲醇的酯；Boc指叔丁氧羰基；
2、二环己基碳二亚胺称DCC，N-羟基琥珀酰亚胺称NHS，N-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠盐称SNHS；1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐称EDC；N,N’-羰基二咪唑称CDI，三光气称TPG；羧基与对硝基苯酚、NHS或SNHS的酯，羟基和氨基用过量CDI生成的羰基咪唑、羟基和氨基用过量TPG生成的碳酸酯，羧酸用CDI或TPG生成的混合酸酐，是本发明所述羧基活化形式并统称活泼酯；
3、与羧基活泼酯、环状酸酐、环氧基、Ts酯、卤代烃、醛基、硫酯都不反应的有机溶剂称惰性有机溶剂，其代表为四氢呋喃、二氧六环、二甲基甲酰胺和二甲亚砜；
4、线性多胺指用乙基或正丙基连接的现状多胺，包括二乙烯三胺、三乙烯四胺、四乙烯五胺、五乙烯六胺，及二正丙烯三胺、三正丙烯四胺、四正丙烯五胺、五正丙烯六胺；
5、聚乙烯亚胺缩写PEI，其跟随的数字表示平均分子量，乙二胺封端的PEI用NH2-PEI表示；末端基团为氨基的树枝状大分子Dendrimer用Dendrimer-NH2表示；
6、聚乙二醇缩写PEG，其跟随数字表示平均分子量，为直链线状且两个末端为羟基；一端为氨基而另一端为羟基的PEG用PEG-NH2表示、一端为氨基另一端为羧基的PEG用NH2-PEG-COOH表示、两端为羧基的聚乙二醇用COOH-PEG-COOH表示；
7、分支状PEG指用线性多胺、多羟基化合物、Dendrimer-NH2、具有多个氨基的氨基酸、具有多个羟基的多羟基酸、具有多个游离巯基的化合物，以酰胺、羧酸酯键或硫醚键连接而形成的有多个线性伸展PEG链的结构，并用n-PEG表示；
潜在羧基的性质说明：
潜在羧基指温和条件下(不超过70℃)经不多于三步反应能生成羧基或羧基活泼酯的基团，包括：脂肪族伯醇、脂肪族仲醇、脂肪族伯胺及脂肪族仲胺，及上述脂肪族伯醇/仲醇及伯胺/仲胺用三氟乙酰、叔丁氧羰基、邻苯二甲酸酐保护的形式；羰基C原子α-位为氯、溴、碘之一取代的卤代烃基团；O-Ts羟乙酰胺或羟乙酸酯及类似对甲苯磺酸酯；环氧基，如来自缩水甘油的衍生物；醛基、磺基保护的巯基、乙酰基保护的巯基；活泼酯本身也是潜在羧基，因其与氨基酸反应或弱碱水解就能生成羧基；蛋白二硫键选择性修饰官能团中每个巯基反应单独发挥作用时也是潜在羧基，其与巯基乙酸反应转变成羧基；所述潜在羧基转变成脂肪族羧基或直接转变成活泼酯的方法如下：
1、脂肪族的伯胺、仲胺、伯醇或仲醇为潜在羧基：在惰性有机溶剂与环状酸酐在70℃下反应0.5小时以上得羧基，与过量CDI或TPG在70℃下反应30分钟以上直接得活泼酯；
2、卤代烃、Ts酯和环氧基为潜在羧基：与一端为氨基另一端为羧基的线状氨基酸如甘氨酸、3-丙氨酸、6-氨基己酸，或一端为巯基另一端为羧基的线状巯基羧酸如巯基乙酸和3-巯基丙酸，在70℃以下反应30分钟以上转变成脂肪族羧基；
3、三氟乙酰保护脂肪族的伯胺、仲胺、伯醇或仲醇为潜在羧基：在惰性有机溶剂和水的混合溶剂或水溶液中用0.1M以上氢氧化钠或氢氧化钾在70℃下水解30分钟以上暴露羟基或氨基，再按羟基或氨基对应转变方法转变成脂肪族羧基或直接转变成其活泼酯；
4、Boc保护的脂肪族的伯胺、仲胺、伯醇或仲醇为潜在羧基：在惰性有机溶剂和水的混合溶剂或水溶液中用乙酸、三氟乙酸、盐酸之一或其几种酸混合物脱去叔丁氧羰基暴露羟基或氨基，再按羟基或氨基对应转变方法转变成脂肪族羧基或直接转变成其活泼酯；
5、邻苯二甲酸酐保护的脂肪族的伯胺或仲胺为潜在羧基：在惰性有机溶剂和水的混合溶剂中用肼水解暴露氨基，再按氨基的羧基化方法转变成脂肪族羧基或直接转变成其活泼酯；
6、醛基为潜在羧基：与甘氨酸或6-氨基己酸反应后用NaBH4还原转变成对应的羧基，或用NaBH4还原得到羟基再按羟基对应方法得到脂肪族羧基或直接转变成其活泼酯，或者与巯基乙酸反应后用NaBH4还原得到硫醚连接的脂肪族羧基；
7、磺酸保护的巯基、S-乙酰保护的巯基作为潜在羧基：磺酸保护巯基的羧基化方法是用NaBH4还原成巯基，再加卤代乙酸、O-Ts乙酸或缩水甘油与丁二酸酐的单酯反应得羧基；S-乙酰保护巯基的羧基化方法是用羟胺释放乙酰基得游离巯基，再如前述将巯基转变成脂肪族羧基；
8、在本发明所述用亲水物质对微纳米材料表面进行多层共价修饰方法中，要求所用潜在羧基转变成羧基的方法与微纳米材料兼容，即在将微纳米材料表面的潜在羧基转变成羧基或直接转变成其活泼酯后，微纳米材料的基本物理化学性质保留，也就是仅能在温和条件下转变成羧基或其活泼酯。
本发明公开了一种所述待修饰微纳米材料，其表面含羧基、潜在羧基、活泼酯、阳离子、阴离子、中性亲水官能团、金属离子螯合官能团或蛋白二硫键选择性修饰官能团之一或其混合物；这些官能团直接来自制备微纳米材料时聚合反应体系所用特殊有机单体，或由来自特殊有机单体的羧基或/和潜在羧基进行衍生化转变而生成；这些特殊有机单体指既含聚合所需官能团，还含羧基、潜在羧基、活泼酯、阳离子、阴离子、中性亲水官能团、金属离子螯合官能团或蛋白二硫键选择性修饰官能团之一或其混合物的有机单体；用含羧基或/和潜在羧基的特殊有机单体制备所述微纳米材料直接获得羧基或/和潜在羧基，再按如下方式进行衍生化可转化成其它官能团，包括：将羧基或/和潜在羧基转变成活泼酯；该活泼酯与Nα,Nα-二羧甲基赖氨酸反应得金属离子螯合官能团、与N,N-二甲基乙二胺反应得阳离子官能团、与牛磺酸反应得阴离子官能团、与乙醇胺反应得羟基而将此羟基与对甲苯磺酰氯反应得Ts酯；该活泼酯与线性多胺反应获得脂肪族胺基，再用于与蛋白二硫键选择性修饰官能团的活泼酯反应得蛋白二硫键选择性修饰官能团，与缩水甘油-丁二酸单酯对应的活泼酯、与4-丁醛酸的活泼酯、与S-乙酰巯基乙酸活泼酯反应得到对应官能团；该活泼酯与长直链氨基酸反应得羧基；这种衍生化转化方式实际上在表面官能团与微纳米材料间插入了连接臂。
本发明还公开了一种所述待修饰微纳米材料的制备方法，所述微纳米材料通过有机单体聚合反应制成，且表面含直接或间接来自聚合所用有机单体的羧基、潜在羧基、活泼酯、阳离子、阴离子、中性亲水官能团、金属离子螯合官能团或蛋白二硫键选择性修饰官能团之一或其混合物；当然，也包括或对微纳米材料表面所含羧基或/和潜在羧基进行衍生化转变而间接生成所需要的其它形式官能团，属于从本发明的技术方案可推导出的结构，属于与本发明技术方案的等同策略。
本实施例中，所述待修饰微纳米材料，包括有机聚合物微纳米材料、有机聚合物-无机微纳米颗粒复合微纳米材料或有机聚合物-有机微纳米颗粒复合微纳米材料；制备所述复合微纳米材料时所用微纳米颗粒包括磁纳米粒、量子点、上转发光颗粒、有机聚合物微纳米颗粒、有机-无机复合微纳米颗粒之一或它们的任意比例混合物；
制备所述待修饰微纳米材料时，聚合反应体系使用了特殊有机单体；用含羧基、潜在羧基、阳离子、阴离子、中性亲水官能团、金属离子螯合官能团或蛋白二硫键选择性修饰官能团之一或其混合物的物质与含有聚合所需官能团的对称酸酐和/或活泼酯反应所得产物，或用不含羧基和潜在羧基但含有脂肪族伯胺和/或仲胺的物质与含聚合所需官能团的环状酸酐和/或含聚合所需官能团和潜在羧基官能团的活泼酯反应所得产物，都是候选的特殊有机单体；在聚合反应体系中，所述特殊有机单体占所用单体总摩尔量的比例不少于1％；用本发明所述含有脂肪族羧基或/和潜在羧基官能团的A类修饰剂和B类修饰剂，同带有聚合反应所需官能团的对称酸酐、活泼酯或酰氯反应，所得酰胺连接产物是本发明所述特殊有机单体的代表之一；用本发明所述不含脂肪族羧基和潜在羧基官能团的A类修饰剂和B类修饰剂，同带有聚合反应所需官能团的环状酸酐反应，所得酰胺连接产物也是本发明所述特殊有机单体的代表之一；
制备所述待修饰微纳米材料时，用油包水或水包油微乳体系将所用单体分散到微乳中再进行聚合，或将聚合物材料大体积颗粒/膜片用机械方法破碎得所需微纳米材料；用微乳体系分散后再聚合时，所用特殊有机单体适合单用或以任意比例混用，但要求来自这类特殊有机单体及聚合所需交联剂的聚合反应官能团在分散相的总浓度大于0.10mol/L。
本发明还公开了一种所述待修饰微纳米材料表面用亲水物质共价修饰的产物，包括单层及多层共价修饰产物；以表面具有羧基或/和潜在羧基的微纳米材料表面为待修饰微纳米材料，将此待修饰微纳米材料表面的羧基和潜在羧基转变成活泼酯，再与含脂肪族伯胺或/和脂肪族仲胺的亲水化合物和/或聚合物为修饰剂通过成酰胺键进行共价修饰得单层共价修饰产物；在亲水物质共价修饰产物表面重复再生所述活泼酯，以含脂肪族伯胺或/和脂肪族仲胺的亲水化合物和/或亲水聚合物为修饰剂重复形成酰胺键得多层共价修饰产物；这种共价修饰过程的目的在于降低材料表面的非特异吸附，通过多层修饰同时提供固定生物分子所需柔性臂；所述修饰过程有较强适应性，可据需要确定所需共价修饰的层数及最后一步所用修饰剂以得到所需的表面官能团。
本实施例中，所述共价修饰产物表面最终得到羧基、潜在羧基、活泼酯、阳离子、阴离子、中性亲水官能团、金属离子螯合官能团、蛋白二硫键选择性修饰官能团之一或它们的混合物；这些官能团用于所述共价修饰产物与其它物质形成共价加合物或可逆复合物。。
本发明还公开了一种所述微纳米材料表面用亲水物质共价修饰产物的制备方法，包括下列步骤：
a.在所述微纳米材料表面生成羧基活泼酯，即以表面具有羧基或/和潜在羧基的微纳米材料为待修饰微纳米材料，将其表面的羧基或/和潜在羧基转变成活泼酯；所述微纳米材料，指至少有一个维度的大小不超过100μm的有机聚合物、有机聚合物与有机或无机微纳米材料的复合物，并有两种形状；一种为颗粒且粒径小于100μm，可为球状和近似球状；另一种为厚度小于100μm的薄膜但不限制这种薄膜的面积大小，包括游离的薄膜或附着在其它各种形状固体表面的薄膜；
b.对经过步骤a获得表面活泼酯的微纳米材料，与含脂肪族伯胺或/和脂肪族仲胺的亲水化合物或亲水聚合物为修饰剂成酰胺键，实现共价修饰；
所述修饰过程中，一般将微纳米材料表面潜在羧基转变成脂肪族羧基，干燥后在惰性有机溶剂中用DCC和NHS反应生成活泼酯、CDI或TPG直接转变成活泼酯，或在pH 5.0～8.0的无机缓冲液或无脂肪族伯胺和仲胺的有机缓冲液中用EDC加NHS或SNHS将材料表面羧基转变成活泼酯；将微纳米材料表面氨基或羟基类潜在羧基，或通过水解获得的羟基或氨基，用CDI或TPG在惰性有机溶剂中直接转变成其活泼酯；
当然，如材料表面的羧基及潜在羧基已转变成活泼酯，则直接使用于后续的修饰；
实现本发明的过程，必然需分离微纳米材料；所述微纳米材料的颗粒适用离心或超滤分离，据颗粒密度和体积确定分离所需离心力、据颗粒体积确定所用超滤膜截留分子量；对于薄膜，面积大或所附着固体的体积大则用机械操作分离，面积太小或所附着固体的体积太小则用离心或超滤方式分离；对各种形状的磁性材料，还适合用外部磁力进行分离即磁分离。
本实施例中，步骤b包括：
b1对表面为活泼酯的微纳米材料，用含脂肪族伯胺或/和脂肪族仲胺的亲水化合物或亲水聚合物为修饰剂成酰胺键，进行共价修饰；
b2对经过步骤b1共价修饰的微纳米材料，将其表面所含羧基及潜在羧基衍生转变成活泼酯，或将潜在羧基直接转变成活泼酯；本发明中，步骤b1所用含脂肪族伯胺或/和脂肪族仲胺修试剂与材料表面活泼酯在摄氏-20到+40度间反应，通过形成酰胺键对微纳米材料表面进行共价修饰并再生羧基或其活泼酯：含脂肪族伯胺或/和脂肪族仲胺的亲水化合物或亲水聚合物为修饰剂，且分子量小于500道尔顿物质称为化合物，分子量不小于500道尔顿为聚合物；
b3根据所需的共价修饰层数，重复步骤b1和b2；步骤b3则为多层修饰过程，重复b1和b2即可，只是需将表层重复生成活泼酯；依次选用所需亲水修试剂重复进行上述多层共价修饰的过程，增加所选修饰剂的共价修饰层数，直到获得所需的多层共价修饰以降低表面的非特异吸附。
本实施例中，还包括下列步骤：
c.经过步骤b3实现最后一次共价修饰后，在微纳米材料表面得到羧基、潜在羧基、阳离子、阴离子、中性亲水官能团、活泼酯、螯合金属离子官能团、蛋白二硫键选择性修饰官能团之一或多种；螯合金属离子官能团为螯合金属离子Ni2+及Cu2+官能团；达到需要的修饰层数时，由此结束共价修饰：按最后一次修饰的需要在材料表面生成所需官能团；当然，按前述步骤进行了第一层修饰后，不对表面的潜在羧基进行羧基化而直接用前述步骤所述方法结束共价修饰，则得到单层修饰产物。
步骤c中，当得到蛋白二硫键选择性修饰官能团时，该官能团应该具有以下特征：
所述蛋白二硫键选择性修饰官能团含有能与巯基发生Michael加成和/或亲核取代反应的两个活泼官能团且二者间隔不超过10个共价键，还含有与其它成分以生成酰胺键相连所需的羧基；
与巯基发生Michael加成反应的活泼基团为丙烯酰基、乙烯砜基即R1-CH＝CH-SO2-R2，此类活泼基团单独发挥作用则属于潜在羧基；其反应中心是丙烯酰基中羰基的β位、砜基的β位烯烃碳原子；
与巯基发生亲核取代反应活泼基团，为羰基、砜基、烯烃、芳环α位饱和碳原子上含氯、溴、碘、三氟乙酸酯、对甲苯磺酸酯之一或多种的烃基，及与蛋白巯基发生Michael加成后衍生出上述烃基的基团，此类活泼基团单独发挥作用则属于潜在羧基；氯、溴、碘、三氟乙酸酯、对甲苯磺酸酯为亲核取代反应的离去基团X，亲核取代的反应中心是对应羰基、砜基、烯烃、芳环的α位饱和碳原子；
蛋白二硫键选择性修饰官能团中，连接两个巯基反应中心的片段不含碳碳单键相连的环和三烷基取代基，五元环、六元环作为共价连接片段时将两个与蛋白巯基反应活泼基团同时连接到环上；
蛋白二硫键选择性修饰官能团所含用于共价连接微纳米材料的羧基，转变成活泼酯、酸酐或酰氯后与微纳米材料表面伯胺和仲胺反应，获得位于微纳米材料表面的蛋白二硫键选择性修饰官能团；
上述蛋白二硫键选择性修饰官能团应用时，先用三烷基磷将目标蛋白表面的二硫键还原为两个空间相邻的游离巯基，再与微纳米材料表面蛋白二硫键选择性修饰官能团中两个空间相邻的蛋白巯基反应官能团同时反应，从而针对该蛋白二硫键实现位点选择性共价相连/固定化；
上述蛋白二硫键选择性修饰官能团的应用还有如下特征：将蛋白二硫键选择性修饰官能团所含羧基与表面不含巯基及二硫键的聚合物/小分子的胺基共价连接，获得针对表面含二硫键蛋白的选择性修饰或标记试剂；用三烷基磷还原蛋白表面二硫键为两个相邻的游离巯基后，与前述选择性修饰/标记试剂中蛋白二硫键选择性修饰官能团的两个活泼基团同时反应，实现共价相连或标记。
本实施例中，
步骤a中，活泼酯来自微纳米材料表面的羧基或/和潜在羧基，其生成方式包括：将所述微纳米材料表面羧基直接转变成活泼酯，或将微纳米材料表面潜在羧基转变成脂肪族羧基再转变成活泼酯，或将微纳米材料表面潜在羧基转变成脂肪族羟基和/或脂肪族胺基再用CDI或TPG转变成活泼酯，或者将微纳米材料表面潜在羧基直接转变成活泼酯；将此类表面活泼酯与长直链氨基酸反应重新获得羧基，或与含多个脂肪族伯胺的线性多胺反应转变成脂肪族胺基，再用于与含潜在羧基和活泼酯物质反应重新获得潜在羧基或与环状酸酐反应重新获得羧基，从而在羧基或潜在羧基与待修饰微纳米材料间插入连接臂，再将衍生所得表面羧基或潜在羧基转变成活泼酯；
步骤b中，所用修饰剂包括A类修饰剂和B类修饰剂，且两类修试剂都不超过3000道尔顿；
所述A类修饰剂为亲水且含脂肪族伯胺或/和脂肪族仲胺的化合物或聚合物，且都含N,N-二甲基取代脂肪族叔胺、N,N-二乙基取代脂肪族叔胺和N,N-二正丙基取代脂肪族叔胺之一或多种；所述A类修饰剂分为A1亚类修饰剂和A2亚类修饰剂；A1亚类修饰剂为每分子含脂肪族伯胺和/或脂肪族仲胺不少于2个及N,N-二烷基取代的脂肪族叔胺不少于1个；A2亚类修饰剂仅含1个脂肪族伯胺或脂肪族仲胺，但N,N-二烷基取代的脂肪族叔胺不少于1个；
A1亚类修饰剂和A2亚类修饰剂在步骤b中的使用方式为：采用A1亚类修饰剂，或A1亚类修饰剂与A2亚类修饰剂的任意比例混合物；进行修饰时，来自修饰剂的脂肪族伯胺及脂肪族仲胺摩尔量之和比微纳米材料表面活泼酯摩尔量多10％以上；除非结束修饰即进行最后一层修饰，A2亚类修饰剂在步骤b中不单独使用；
所述B类修饰剂为亲水且含脂肪族伯胺或/和脂肪族仲胺的化合物或聚合物，但都不含N,N-二甲基取代脂肪族叔胺、N,N-二乙基取代脂肪族叔胺和N,N-二正丙基取代的脂肪族叔胺中任一种，并分成B1亚类修饰剂、B2亚类修饰剂、B3亚类修饰剂和B4亚类修饰剂；
B1亚类修饰剂为线性结构，一端为脂肪族伯胺或脂肪族仲胺，另一端为脂肪族羧基，或既非胺基也非羟基的潜在羧基；B2亚类修饰剂为线性结构，且两端为脂肪族伯胺和/或脂肪族仲胺；B3亚类修饰剂为线性结构，一端为脂肪族伯胺或脂肪族仲胺，另一端为甲氧基或乙氧基；B4亚类修饰剂为非线性结构，含至少2个脂肪族伯胺和/或脂肪族仲胺及不定数量叔胺或酰胺；B类修试剂包括末端基团为脂肪族伯胺的树枝状分子Dendrimer、甲壳胺、聚马来酸酐与过量多胺化合物或聚合物以酰胺键相连的衍生物、聚乙烯亚胺、乙二胺封端的聚乙烯亚胺、聚丙烯亚胺、丙二胺封端的聚丙烯亚胺、等电点在4.0以上的蛋白质；
B1亚类修饰剂、B2亚类修饰剂、B3亚类修饰剂和B4亚类修饰剂在步骤b中使用方式为：采用B1亚类修饰剂、B2亚类修饰剂或B4亚类修饰剂或三者的任意比例混合物，来自修饰剂的脂肪族伯胺及脂肪族仲胺摩尔量之和比微纳米材料表面活泼酯摩尔量多10％以上；B3亚类修饰剂调节来自B1亚类修饰剂、B2亚类修饰剂或B4亚类修饰剂的胺基摩尔量；除非结束修饰即进行最后一层修饰，B3亚类修饰剂在步骤b中不单独使用；
比如：最后一次修饰单用一端为脂肪族羧基的B1亚类修饰剂，直接获得羧基官能团；最后一次修饰单用A2亚类修饰剂，直接获得来自修饰剂的叔胺作为弱阳离子官能团；最后一次修饰单用B3亚类修饰剂，直接获得来自修饰剂的中性亲水表面；
最后一次修饰时，只要不是单用一端为羧基的B1亚类修饰剂、A2亚类修饰剂和B3亚类修饰剂之一或三者的任意比例混合物作为修饰剂，在材料表面直接得到伯胺、仲胺官能团成为水溶液中弱阳离子；此类伯胺、仲胺用环状酸酐再修饰得到羧基，或在惰性有机溶剂中用卤代乙酸活泼酯、N-溴乙酰-6-氨基己酸活泼酯、O-Ts羟乙酸活泼酯、缩水甘油-丁二酸单酯的活泼酯、N-三氟乙酰甘氨酸活泼酯、4-丁醛酸活泼酯、S-乙酰巯基乙酸活泼酯之一或任意比例混合物修饰得到对应潜在羧基；
最后一次修饰时，只要不是单用一端为羧基的B1亚类修饰剂、A2亚类修饰剂和B3亚类修饰剂之一或三者的任意比例混合物作为修饰剂，先用卤代乙酸活泼酯、N-溴乙酰-6-氨基己酸活泼酯、O-Ts羟乙酸活泼酯、环氧丙醇与丁二酸酐反应产物的活泼酯、N-三氟乙酰甘氨酸活泼酯、4-丁醛酸的活泼酯、S-乙酰巯基乙酸活泼酯之一或任意比例混合物封闭剩余胺基，再加1,3-丙基磺内酯修饰，获得兼性离子对和来自封闭剩余氨基所用活泼酯的潜在羧基，并进一步转变成所需官能团；
最后一次修饰时，只要不是单用一端为羧基的B1亚类修饰剂、B3亚类修饰剂之一或二者的任意比例混合物作为修饰剂，用三氟甲磺酸甲/乙/正丙酯或碘甲烷或它们的任意比例混合物在惰性有机溶剂中修饰表面的伯胺、仲胺和叔胺，得强阳离子官能团；
最后一次修饰时，只要不是单用一端为羧基的B1亚类、A2或B3亚类修饰剂之一或三者的任意比例混合物作为修饰剂，将表面剩余脂肪族伯胺/仲胺用CDI活化氨基为羰基咪唑或用TPG活化为混合酸酐，再用N,N-双羧甲基赖氨酸或N-羧甲基甘氨酸修饰，得螯合金属离子Ni2+及Cu2+官能团；结束修饰并用所需方法在微纳米材料表面生成脂肪族羧基后，用DCC加NHS、SNHS或对硝基苯酚之一生成活泼酯，在中性不含伯胺及仲胺的缓冲液中加N,N-双羧甲基赖氨酸或N-羧甲基甘氨酸修饰，得螯合金属离子Ni2+及Cu2+官能团；
A类修饰剂和B类修饰剂在步骤b中混合使用方式为：二者以任意比例混合使用；来自修饰剂的脂肪族伯胺及脂肪族仲胺摩尔量之和比微纳米材料表面活泼酯摩尔量多10％以上；除非结束修饰即进行最后一层修饰，在步骤b中不使用仅由A2亚类修饰剂和B3亚类修饰剂组成的任意比例混合物。
A1亚类修饰剂和A2亚类修饰剂的代表结构示意图如下：
B1亚类修饰剂、B2亚类修饰剂、B3亚类修饰剂的代表结构示意图如下：
本实施例中，所述A类修饰剂还包括A3亚类修饰剂、A4亚类修饰剂、A5亚类修饰剂和A6亚类修饰剂；
所述A3亚类修饰剂含有局部兼性离子对结构，且含有不少于2个能与活泼酯反应的脂肪族伯胺和/或仲胺，或仅1个能与活泼酯反应脂肪族伯胺或仲胺但有至少1个羧基或潜在羧基；
所述A4亚类修饰剂含有局部的兼性离子对结构，但仅含1个能与活泼酯反应脂肪族伯胺或族仲胺，且不含羧基或潜在羧基；除非结束修饰即进行最后一层修饰，A4亚类修饰剂不单独用于步骤b；
将A1亚类修饰剂的脂肪族伯胺及脂肪族仲胺用Boc保护，叔胺基与1,3-丙基磺内酯反应成兼性离子，再脱去Boc保护，即得到A3亚类修饰剂；A3亚类修饰剂的代表结构示意图如下：
将A2亚类修饰剂的脂肪族伯胺及脂肪族仲胺用Boc保护，叔胺基与1,3-丙基磺内酯反应成兼性离子，再脱去Boc保护，即得到A4亚类修饰剂；A4亚类修饰剂的代表结构示意图如下：
所述A5亚类修饰剂为阴离子亚类修饰剂，A6亚类修饰剂为阳离子亚类修饰剂；A5亚类修饰剂有单或多个磺酸和/或磷酸阴离子，且A5亚类修饰剂中同时含1个脂肪族伯胺者为A5-1，含多个脂肪族伯胺者为A5-2；A6亚类修饰剂有单或多个季胺或叔胺阳离子，且A6亚类修饰剂中同时含1个脂肪族伯胺者为A6-1，含多个脂肪族伯胺者为A6-2；A5亚类修饰剂和A6亚类修饰剂配对用于共价修饰得离子对修饰层；A5亚类修饰剂的代表结构示意图如下：
A6亚类修饰剂的代表结构示意图如下：
在步骤b中使用A3亚类修饰剂的方式为：A3亚类修饰剂单用，或与A1亚类修饰剂、A2亚类修饰剂、A4亚类修饰剂、B1亚类修饰剂、B2亚类修饰剂和B3亚类修饰剂之一或全部任意比例混用；混合物修饰剂中A1亚类、A3亚类、B1亚类和B2亚类修饰剂摩尔量之和所占比例需大于10％；
仅在最后一次修饰时A4亚类修饰剂适合单用并获得兼性离子修饰表面；
在步骤b中使用A4亚类修饰剂的方式为：A4亚类修饰剂与A1亚类修饰剂、A3亚类修饰剂、B1亚类修饰剂、B2亚类修饰剂和B4亚类修饰剂之一或全部以任意比例混用；混合修饰剂中，A1亚类、A3亚类、B1亚类、B2亚类和B4亚类修饰剂摩尔量之和所占比例需大于10％；
在步骤b中使用A5亚类修饰剂和A6亚类修饰剂的方式为：A5亚类修饰剂和A6亚类修饰剂混合使用且混合物中来自A5亚类修饰剂磺酸或/和磷酸阴离子和来自A6亚类修饰剂季胺及叔胺阳离子等量；如未用A5-2和A6-2亚类修饰剂，则加摩尔比10％以上A3或B3亚类修饰剂；
进行修饰时，表面为活泼酯的微纳米材料悬浮在pH 6.0左右水溶液中，加修饰剂混合物室温下反应10分钟以上；或将修饰剂在惰性有机溶剂中悬浮状态与复合材料表面活泼酯反应10分钟以上；或将表面为羧基的复合材料用EDC在pH 6.0左右水溶液中悬浮活化羧基后，除去多余的活化剂，加入修饰剂混合物悬浮反应10分钟以上；将潜在羧基转变成羧基或其活泼酯、或者结束共价修饰。
本实施例中，步骤b1中，用任意所述修饰剂及其任意比例混合物时，如微纳米材料表面活泼酯来自CDI或TPG衍生物，在惰性有机溶剂或中性水溶液或二者混合溶剂中悬浮反应10分钟以上进行修饰；否则，在惰性有机溶剂中悬浮反应10分钟以上进行修饰；离心或超滤分离修饰后微纳米材料；
步骤b1中，除非单用A2亚类修饰剂或B3亚类修饰剂或这两亚类修饰剂的任意比例混合物，在惰性有机溶剂中，用卤代乙酸活泼酯、N-溴乙酰-6-氨基己酸活泼酯、O-Ts羟乙酸活泼酯、缩水甘油-丁二酸单酯对应的活泼酯、N-三氟乙酰甘氨酸活泼酯、4-丁醛酸的活泼酯、S-乙酰巯基乙酸活泼酯之一或任意比例混合物，与修饰后材料表面伯胺及仲胺反应得潜在羧基；活泼酯摩尔用量比微纳米材料表面可反应胺基多10％以上，生成卤代烃、Ts酯、环氧基或三氟乙酰氨基为潜在羧基；分离出修饰后微纳米材料；
步骤b2中，当前一步的共价修饰过程使用了A1亚类修饰剂或/和A2亚类修饰剂时：在惰性有机溶剂中，用卤代乙酸活泼酯、N-溴乙酰-6-氨基己酸活泼酯、O-Ts羟乙酸活泼酯、缩水甘油-丁二酸单酯对应的活泼酯、N-三氟乙酰甘氨酸活泼酯、4-丁醛酸的活泼酯、S-乙酰巯基乙酸活泼酯之一或任意比例混合物封闭材料表面剩余的脂肪族伯按及脂肪族仲胺后，在惰性有机溶剂中用比修饰后材料表面的二烷基取代叔胺摩尔量过量20％以上的1,3-丙基磺内酯将表面来自A1亚类修饰剂和A2亚类修饰剂的烷基叔胺转变成季胺与磺酸相邻的兼性离子修饰层；离心、超滤或机械操作分离修饰后微纳米材料；将材料表面的潜在羧基官能团转成脂肪族羧基后活化用于下一层的共价修饰；
步骤b2中，当前一步的共价修饰过程未使用了A1或A2亚类修饰剂时：在惰性有机溶剂中，用卤代乙酸活泼酯、N-溴乙酰-6-氨基己酸活泼酯、O-Ts羟乙酸活泼酯、缩水甘油-丁二酸单酯对应的活泼酯、N-三氟乙酰甘氨酸活泼酯、4-丁醛酸的活泼酯、S-乙酰巯基乙酸活泼酯之一或任意比例混合物封闭材料表面剩余的脂肪族伯胺及脂肪族仲胺后，再将材料表面潜在羧基转成脂肪族羧基再活化；或用CDI或TPG得取代甲酸酰基咪唑或混合酸酐为活泼酯；
步骤c中，前一次共价修饰过程中：单用一端为脂肪族胺基而另一端为脂肪族羧基B1亚类修饰剂，直接获得表层脂肪族羧基；单用B2亚类修饰剂、B4亚类修饰剂之一或任意比例混合物时，在惰性有机溶剂中，用卤代乙酸活泼酯、N-溴乙酰-6-氨基己酸活泼酯、O-Ts羟乙酸活泼酯、缩水甘油-丁二酸单酯对应的活泼酯、N-三氟乙酰甘氨酸、4-丁醛酸的活泼酯、S-乙酰巯基乙酸活泼酯之一或任意比例混合物，与修饰后材料表面的脂肪族伯胺及脂肪族仲胺反应；活泼酯摩尔用量比微纳米材料表面可反应胺基度10％以上，生成对应的卤代烃、Ts酯、环氧基、三氟乙酰氨基、醛基、保护巯基之一或混合的表面官能团；
步骤c中，前一次共价修饰过程中：单独使用A2亚类修饰剂得到烷基取代叔胺的表面官能团，如再用过量1,3-丙基磺内酯将表面A2亚类修饰剂的烷基叔胺转变成季胺与磺酸相邻的兼性离子，则得到兼性离子为表面官能团；单独使用B3亚类修饰剂则得到中性亲水表面官能团。
本实施例中，在进行步骤a之前，制备所述微纳米材料的聚合反应和所用单体特征如下：
Ⅰ.用微乳系统，经自由基聚合反应制备所述微纳米材料，有如下特征：
用油包水即W/O微乳时，特殊有机单体及交联剂包括但不限于丙烯酸、肉桂酸钠、N-丙烯酰乙醇胺、N-羟甲基丙烯酰胺、N-丙烯酰丝氨酸、N-丙烯酰谷氨酸、N,N-双丙烯酰赖氨酸，及所述各类亲水修饰剂与丙烯酸活泼酯、马来酸酐、烯丙基溴、丙烯醇Ts酯、N-马来酰乙醇胺的活泼酯、N-溴乙酰-N’-马来酰乙二胺的活泼酯反应的衍生物；这些特殊有机单体适合单用或多种任意比例混用，但要求聚合体系来自特殊有机单体及交联剂的可聚合双键总浓度在0.1mol/L以上；当这些特殊有机单体及交联剂溶解度不足时，在其共价结构中引入兼性离子，以满足对其在分散相中溶解度的要求；
用水包油即O/W微乳时，特殊有机单体及交联剂包括但不限于苯丙烯醇、肉桂酸、苯丙烯胺、N-亚油酰丝氨酸、N,N-双亚油酰赖氨酸、N-亚油酰乙醇胺、N,N’-双丙烯酰辛二胺、3-正辛酰氧基-肉桂酸、3-亚油酰氧基-肉桂酸、N,N’-双肉桂酰-1,8-辛二胺；这些特殊有机单体及交联剂单用或多种任意比例混用，聚合体系来自特殊有机单体及交联剂的可聚合双键浓度在0.1mol/L以上；在所述特殊有机单体及交联剂的共价结构中引入长脂链增加其脂溶性，以满足对其在分散相中溶解度的要求；
用过氧化物裂解启动聚合时，将单体、交联剂及启动剂并在需要时加微纳米颗粒在对应溶剂中按所选比例混合，分散到微乳体系，再将催化剂的溶液分散到微乳系统的单体相中，升温加速聚合反应；用偶氮类启动剂时，操作类似于用过氧化物启动剂，或将聚合所需所有物质在摄氏30度以下充分混匀再分散到微乳系统中，然后升高温度启动聚合反应；
Ⅱ.用微乳系统，经亲核取代反应制备所述微纳米材料，有如下特征：
交联剂分成提供多个亲核基团和多个离去基团两类；聚合时适合单用一类或同用两类交联剂；环氧氯丙烷适合既作为单体又适合作为交联剂；
用W/O微乳时，特殊有机单体及交联剂包括但不限于提供亲核基团的赖氨酸、鸟氨酸、及所述各类含多个脂肪族伯胺和/或仲胺的修饰剂；提供离去基团的特殊有机单体及交联剂包括N,N-双溴乙酰赖氨酸、N,N-双溴乙酰鸟氨酸，及所述各类含多个脂肪族伯胺和/或仲胺的修饰剂与过量卤代乙酸活泼酯或O-Ts羟乙酸活泼酯、缩水甘油与丁二酸酐单酯的活泼酯反应衍生物；特殊有机单体及交联剂中引入兼性离子增加水溶性，以满足对其在分散相的溶解度要求；这些特殊有机单体在聚合体系单用或多种任意比例混用，但要求聚合体系来自特殊有机单体及交联剂的聚合反应官能团总浓度在0.1mol/L以上；代表性特殊有机单体及交联剂的结构示意图如下：
用O/W微乳时，单体及交联剂包括但不限于4-羟基-1,8-辛二胺、N,N’-双溴乙酰-4-羟基-1,8-辛二胺、环氧氯丙烷、甘油酸双对甲苯磺酸酯；所需单体及交联剂引入长脂链增加其脂溶性；聚合反应时单体适合单用或多种任意比例混用；代表性特殊有机单体及交联剂代表的结构示意图如下：
聚合时，将单体、交联剂按所选比例混合并在需要时加微纳米颗粒，分散到微乳体系；W/O微乳中加弱碱如NaCO3水溶液、O/W微乳中加三正丁胺有机碱分散到微乳体系，室温聚合1小时以上，得所述微纳米材料；
Ⅲ.用微乳系统，经酰胺缩聚、异氰酸酯或异硫氰酸酯聚合，有如下特征：
用W/O微乳的酰胺缩聚反应，特殊有机单体及交联剂包括但不限于丝氨酸、1,4-二氨基-2-丁醇、1,4-二氨基-2-丁酸、谷氨酸、天冬氨酸、赖氨酸、鸟氨酸、多聚马来酸酐；此类特殊有机单体中潜在羧基官能团与亲水修饰剂中潜在羧基官能团相同，且在水中溶解度易于满足要求；所选特殊有机单体混匀后分散到W/O的微水相，再加EDC水溶液促进成酰胺缩聚得所述微纳米材料；
用O/W微乳的酰胺缩聚反应，特殊有机单体及交联剂包括但不限于4-羟基-1,8-辛二酸、4-羟基-1,8-辛二胺、N-硬脂酰赖氨酸、N-硬脂酰谷氨酸，它们在油相的溶解度都能满足对聚合反应官能团总浓度要求；所述特殊有机单体及交联剂中潜在羧基官能团包括烷基伯醇三氟乙酸酯、脂肪族羧酸对硝基苯酚酯；所选单体混匀后，加DCC脱水成酰胺缩聚得所述微纳米材料；
用O/W微乳和多异氰酸酯单体进行聚合反应时，1,7-二羟基-4-(N-溴乙酰)-庚胺、三羟甲基-(6-(N-溴乙酰)-胺基己酰)-胺基甲烷为多羟基单体代表，1,4-苯二异氰酸酯为含多异氰酸酯单体的代表；三氟乙酸酯、脂肪酸对硝基苯酚酯适合作为特殊有机单体中的潜在羧基官能团；除多异氰酸酯外的特殊有机单体先混匀，加多异氰酸酯启动反应，得所述微纳米材料；
用O/W微乳和多异硫氰酸酯单体进行聚合反应时，1,8-辛二胺、4-羟基-1,8-辛二胺、1,7-庚二胺为多氨基单体，1,4-苯二异硫氰酸酯为含多异硫氰酸酯单体的代表；三氟乙酸酯、脂肪酸对硝基苯酚酯适合作为特殊单体中的潜在羧基官能团；除多异硫氰酸酯外的单体先混匀，加多异硫氰酸酯启动反应，得所述微纳米材料；
Ⅳ.制备所述微纳米薄膜时，将所用单体混合物转移到内陷式容器或有所需形状固体的表面，再按用制备微纳米颗粒类似的方式启动和加速聚合反应。
本发明中，通过聚合反应制备所述微纳米材料时，适用的聚合反应和单体还有如下特征：
(一)制备复合微纳米材料时所加微纳米核芯，包括磁纳米粒、量子点、上转发光颗粒、金属纳米颗粒、不溶于水或烃类溶剂的有机荧光颗粒，或上述颗粒的混合物；这些微纳米核芯与所用聚合反应相容，即聚合后微纳米核芯所需性质保留；这类聚合反应所用单体还有如下特征：
(1)除自由基聚合以外，其余聚合反应所用单体都含不少于2个参与聚合反应的官能团；
(2)聚合反应体系含所述特殊有机单体在所用单体总量中的摩尔比不少于1％，且每种特殊有机单体在对应分散相中的溶解度都大于0.010mmol/L；
(二)制备适用所述多层共价修饰方法的微纳米薄膜时，用制备微纳米颗粒相同的单体及配比，将待聚合混合物铺开到内部下陷的固体表面或容器内成薄层，再启动聚合反应。
本实施例中，结束修饰后在微纳米材料表面生成蛋白二硫键选择性修饰官能团，将表面含二硫键的蛋白用三烷基磷在中性条件下还原二硫键为两个相邻游离巯基，与蛋白二硫键选择性修饰官能团中两个相邻活泼基团反应，实现针对蛋白表面二硫键的位点选择性固定化；
所用蛋白二硫键选择性修饰官能团结构的代表如下：
(1)蛋白二硫键选择性修饰官能团所需两个活泼基团间有线性短连接片段：相间≤10个键
蛋白二硫键选择性修饰官能团：两活泼基团间有线性短连接片段，n+l不大于7；m不限
(2)蛋白二硫键选择性修饰官能团所需两个活泼基团间有柔性环连接片段：相间≤10个键
蛋白二硫键选择性修饰官能团：两活泼基团间有柔性环连接片段
(3)蛋白二硫键选择性修饰官能团所需两个活泼基团间有芳环连接片段：相间≤10个键
蛋白二硫键选择性修饰官能团：两活泼基团间有芳环连接片段
另外，所用蛋白二硫键选择性修饰官能团中的羧基，与表面不含巯基及二硫键但有特定活性的小分子或大分子聚合物的胺基共价连接，用作表面含有二硫键蛋白选择性修试剂/标记试剂；应用中，用三烷基磷在中性条件下还原蛋白二硫键为游离巯基，针对该蛋白表面二硫键的位点选择性修饰、标记或共价结合；所述表面不含巯基及二硫键的大分子聚合物包括蛋白、核酸、肽核酸、多糖。
以下用磁性微米颗粒为微纳米材料，演示本发明实施例及本发明应用所产生的有益效果：
JSR-MSP-COOH由日本捷时雅上海公司提供的粒径1.5μm羧基磁珠；Bangs-MSP-COOH由Bangs Laboratories Inc提供的粒径1.0μm的羧基磁珠；Dynal-MSP-COOH由Thermo-Fisher提供的粒径1.0μm的羧基磁珠。实施本发明的代表性实施过程如下。
方法1.MSP的制备
为便于证实本发明所述修饰方案的有效性，选用W/O微乳体系制备磁微粒(MSP)为所述微纳米材料的代表。在W/O微乳体系制备磁流体、微乳体系和MSP的操作细节，详见中国发明专利的审定授权说明书(中国发明专利，ZL 201210046309.5.授权日期2014-09-24)。
用N-羟甲基丙烯酰胺为单体、甲叉双丙烯酰胺为交联剂、过硫酸钾为启动剂、四甲基乙二胺为催化剂。MSP制备过程操作参照此ZL 201210046309.5所述，反相微乳水相自由基聚合包被磁流体得MSP，N-羟甲基丙烯酰胺在水相浓度为0.4kg/L；表面羟基为潜在羧基。详见实施例7。所得MSP对200mg水溶性蛋白/每g磁珠进行非特异吸附(见方法2)，以绿脓杆菌芳香硫酸酯酶(PAAS)为探针非特异吸附达到28％，以大肠杆菌碱性磷酸酶(ECAP)为探针非特异吸附达到56％。
方法2.测定MSP对水溶性蛋白的非特异吸附
ECAP来自北京北川飞虹生物科技有限公司。绿脓杆菌芳香硫酸酯酶(PAAS)按GenBank记录号GI:879288全合成编码序列，插入pET24a质粒，在N端加入6His标签，大肠杆菌表达；Ni2+-NTA(北京北川飞虹生物科技有限公司)纯化(委托重庆泽恒生物科技有限公司完成)。测定这两种酶均用1.0mol/L的Tris-HCl缓冲液，pH 10.0；室温反应；ECAP底物为10.0mM的4-硝基苯基磷酸酯；PAAS底物为5.0mM的4-硝基苯基硫酸酯；测定产物在405nm吸收。每分钟生成1微摩尔产物酶量为一个单位。ECAP和PAAS比活性为1200kU/g和25kU/g。
用System 1000Stand磁分离架(Promega,Madison,WI,USA)分离MSP。测定非特异吸附时，用1.50ml的Ependorf管，酶5.0μg与25μg MSP在pH 8.0 20mM Tris-HCl缓冲液中吸附反应30min，反应体系共0.20ml；磁分离MSP并用上述缓冲液温和洗涤两次。将MSP适当稀释，取20μl稀释样转移到1.50ml的Ependorf管中，磁分离去上清液，加入1.0ml含有所述终浓度的显色底物，持续温和震荡，室温22℃反应30min；磁分离1.0min去MSP，取190μl迅速加入新鲜配制的10M的NaOH溶液10μl终止反应；用96孔板和Biotek ELX 800酶标仪测定吸收。以反应30min的产物吸收增加值表示酶活性。
方法3.MSP对疏水小分子的非特异吸附
测定小分子化合物非特异性吸附以4-硝基-1-萘酚苯甲酸酯为模型(其LogP为+3.97且便于用反相HPLC-UV测定)。用4-硝基-1-萘酚和苯甲酰氯反应制备4-硝基-1-萘酚苯甲酸酯；合成产物经硅胶柱纯化后，用反相HPLC在240nm没有可检测杂质。在pH 7.4的10.0mM磷酸钠缓冲液中测定25g MSP对16和64M的4-硝基-1-萘酚苯甲酸酯的非特异吸附。
操作见文献(Facile one-step coating approach to magnetic submicronparticles with poly(ethylene glycol)coats and abundant accessible carboxylgroups.Int J NanoMed,2013,8:791-807)。吸附反应30min，磁分离MSP；缓冲液洗涤一次；用四氢呋喃溶解。用Agilent-1100HPLC系统测定4-硝基-1-萘酚苯甲酸酯；伊利特ODS2C18柱(4.6×250mm,5μm)，90％甲醇和水混合物流动相，0.8ml/min，进样量20μL且柱温恒定在25℃；检测波长335nm。
方法4.磁微粒表面羧基活泼酯的测定
1-萘替乙二胺为探针；其水溶液用其在325nm吸收系数5.0(mM)-1.cm-1标定浓度。在惰性有机溶剂中用DCC和NHS，或在pH 6.0的HEPS缓冲液中用EDC加NHS，将复合材料表面的羧基活化成活泼酯。取0.10mg活化的MSP，磁分离去溶剂，加入用相同溶剂溶解0.10mM的1-萘替乙二胺溶液0.40ml；室温旋摇反应4小时；上清液稀释20倍，测定1-萘替乙二胺量荧光信号(激发330nm，发射430nm)，用减少的探针量计算固定化在MSP表面的1-萘替乙二胺量。用活化羧基所用溶剂测定未活化的MSP非特异吸附的1-萘替乙二胺量。扣除1-萘替乙二胺非特异吸附，按照1:1摩尔比换算成MSP表面的活泼酯量。
实施例1.代表性A1-1类修饰剂的制备
1-1.N,N-二甲甘氨酸活泼酯合成：在四氢呋喃(THF)中，饱和二甲甘氨酸(DMG)加NHS和DCC(三者摩尔比1:1:1)，室温搅拌反应过夜；滤去沉淀，上清减压浓缩20倍，加乙醚，析出沉淀；再溶于最少量的热THF，加乙醚析出沉淀。得N,N-二甲甘氨酸活泼酯(DMG-CO-NHS)。
1-2.五乙烯六胺双Boc保护伯胺合成：五乙烯六胺饱和溶于二甲基甲酰胺(DMF)，加两倍摩尔量的焦碳酸双叔丁醇酯(Boc-O-Boc)，室温搅拌反应60min；加乙醚析出沉淀；重新溶解于最小量的DMF，加乙醚析出沉淀；得主要是两端伯胺被双Boc保护五乙烯六胺。
1-3.双Boc保护五乙烯六胺和N,N-二甲甘氨酸活泼酯反应：在DMF中溶解双Boc保护五乙烯六胺到饱和，加入饱和溶解于THF的N,N-二甲甘氨酸活泼酯(1:4.1)；室温搅拌反应120min；加乙醚析出沉淀；沉淀溶解于最少量的热DMF，冷却到室温，再加乙醚析出沉淀；得1,16-双Boc-4,7,10,13-四-(N,N-二甲甘氨酰)-五乙烯六胺。
1-4.修饰剂A1-1的制备：1,16-双Boc-4,7,10,13-四-(N,N-二甲甘氨酰)-五乙烯六胺，用含1.0M HCl的HAc溶解，室温搅拌反应2.0小时；加10M的NaOH溶液到有大量沉淀析出。沉淀溶于最小量的1.0M的HCl溶液，加10M的NaOH溶液到有大量沉淀析出。重复用酸溶解后碱沉淀析出共三次；得目标修饰剂A1-1。反应路线见附图1。
实施例2.代表性A2-3类修饰剂的制备
2-1.N-Boc保护氨基酸活泼酯合成：氨基位于末端的6碳以内直链氨基酸(甘氨酸、3-氨基丙酸、4-氨基丁酸、5-氨基戊酸、6-氨基己酸之一)饱和溶于室温下的水中，加入饱和溶解于THF的两倍摩尔量焦碳酸双叔丁醇酯(Boc-O-Boc)，室温搅拌反应2.0小时；加入异丙醇到析出大量沉淀；重新溶解到最少量的DMF，加乙醚析出沉淀；重复两次，得到N-Boc保护氨基酸。最后饱和溶解在DMF中的N-Boc保护氨基酸，加DCC和NHS(摩尔比1:1:1)；室温搅拌反应过夜。滤去沉淀，上清加乙醚，析出沉淀；再溶于最少量的热DMF，加乙醚析出沉淀。重复溶解于DMF和乙醚析出共三次，得到N-Boc保护氨基酸活泼酯。
2-2.N-Boc氨基酰-Tris合成：将三羟甲基氨基甲烷饱和溶解于水中，加盐酸调节pH到5.8～6.5。滴加饱和溶解在DMF中的N-Boc保护氨基酸活泼酯，室温搅拌反应过夜；加盐酸调节pH到5.0；用氯仿抽提水溶液多次合并有机层；干燥，抽干氯仿；重新饱和溶解于室温下的大量水中，氯仿多次抽提，合并有机层；干燥，抽干溶剂，得N-(N’-Boc-氨基酰)-三羟甲基氨基甲烷。
2-3.N-(N’-Boc-氨基酰)-三羟甲基氨基甲烷与N,N-二甲甘氨酸活泼酯反应：将N-(N’-Boc-氨基酰)-三羟甲基氨基甲烷饱和溶解于THF，干燥后，加入三倍摩尔量的NaH；室温隔绝潮气和空气搅拌2小时；滴加饱和溶解在THF中的N,N-二甲甘氨酸活泼酯，室温反应过夜。减压浓缩，加乙醚析出沉淀；再溶解在最少量的THF中，加乙醚析出沉淀。重复溶解于THF和乙醚析出沉淀三次。得N-(N’-Boc-氨基酰)-三-(O-(N,N-二甲甘氨酰))-三羟甲基氨基甲烷。
2-4.修饰剂A2-3制备：N-(N’-Boc-氨基酰)-三-(O-(N,N-二甲甘氨酰))-三羟甲基氨基甲烷溶于含1.0M HCl的乙酸溶液；室温搅拌反应3小时；加入10M冷NaOH溶液直到析出大量沉淀。将沉淀溶于10mM的HCl溶液；再加10M冷NaOH溶液直到析出大量沉淀。重复酸溶解碱析出沉淀共三次，得到修饰剂A2-3。反应路线见附图2。
实施例3.代表性A3-1类修饰剂的制备
3-1.1,16-双Boc-4,7,10,13-四-(N,N-二甲甘氨酰)-五乙烯六胺与1,3-丙基磺内酯反应：在应用实施例1的步骤1-3所得1,16-双Boc-4,7,10,13-四-(N,N-二甲甘氨酰)-五乙烯六胺饱和溶解在DMF中，加入四倍摩尔量的1,3-丙基磺内酯；50℃反应5.0小时；加THF，收集析出的沉淀。用THF反复洗涤沉淀，得Boc-保护的修饰剂A3-1。
3-2.修饰剂A3-1制备：上步的沉淀溶解于含1.0M HCl的乙酸溶液；室温搅拌反应2.0小时；减压蒸馏浓缩；加入丙酮析出沉淀；溶于水后用丙酮沉淀析出三次，得修饰剂A3-1。
3-3.反应路线见附图3。
实施例4.代表性A4-3类修饰剂的制备
4-1.N-(N’-Boc-氨基酰)-三-(O-(N,N-二甲甘氨酰))-三羟甲基氨基甲烷与1,3-丙基磺内酯反应：在应用实施例2的步骤2-3所得N-(N’-Boc-氨基酰)-O-(N,N-二甲甘氨酰)-三羟甲基氨基甲烷饱和溶解在DMF中，加入三倍摩尔量的1,3-丙基磺内酯；50℃反应5.0小时；加THF，收集析出的沉淀。溶于水，加THF析出沉淀；重复三次，得N-Boc保护的A4-3修饰剂。
4-2.修饰剂A4-3制备：上步的沉淀溶解于含1.0M的HCl的乙酸；室温搅拌反应2.0小时；加压蒸馏浓缩；加入丙酮析出沉淀；用丙酮洗涤，再溶于水后用丙酮沉淀析出。重复溶解和析出三次；得到目标产物。反应路线见附图4。
实施例5.代表性A6-2类修饰剂的制备
5-1.1,7-N,N-二甲胺基-二乙基三胺与N-Boc保护氨基酸活泼酯的反应：1,7-N,N-二甲胺基-二乙基三胺饱和溶解在DMF中，加入应用实施例2中的2-1所制备的N-Boc保护氨基酸活泼酯的THF饱和溶液(摩尔比1:1)；室温搅拌反应2.0小时；加乙醚析出沉淀；重复溶解在最少量的DMF中用乙醚析出，共四次。得4-(N’-Boc-氨基酰)-1,7-N,N-二甲胺基-二乙基三胺。
5-2.修饰剂A6-2制备：4-(N’-Boc-氨基酰)-1,7-N,N-二甲胺基-二乙基三胺溶解于含1.0M的HCl的乙酸；室温搅拌反应2.0小时；加压蒸馏浓缩；加THF析出沉淀。溶解于最少量的DMF中，加THF析出沉淀；重复三次。得修饰剂A6-2。反应路线见附图5。
实施例6.代表性B1-1、B2-1和B3-1类修饰剂的制备
6-1聚乙二醇800(PEG-800)两端甘氨酸酯化：参照应用实施例2中2-1制备N-Boc甘氨酸活泼酯；PEG800溶于THF，加NaH隔绝潮气和空气搅拌2.0小时；加入THF饱和溶解的N-Boc甘氨酸酸活泼酯(过量10倍)；室温搅拌反应过夜；加乙醚析出沉淀；溶解于最少量的THF，再加乙醚析出沉淀。重复三次；得到PEG800-双(N-Boc-甘氨酸)酯。
6-2.PEG-800-双甘氨酸酯：PEG800-双(N-Boc-甘氨酸)酯溶解于含1.0M HCl的乙酸溶液；室温搅拌反应2.0小时；加压蒸馏浓缩；加乙醚析出沉淀。溶解于最少量的THF，加乙醚析出沉淀；重复三次得到PEG-800-双甘氨酸酯。此即修饰剂B2-1。
6-3.修饰剂B1-1：修饰剂B2-1(PEG-800-双甘氨酸酯)溶于THF，回流状态下滴加0.50摩尔比的丁二酸酐的稀THF溶液，反应6小时；加乙醚析出沉淀；重新溶解于最小量的THF，加乙醚析出沉淀，重复三次得到修饰剂B1-1。
6-4.修饰剂B3-1：PEG-800-单甲醚，用领苯二甲酸酐保护甘氨酸的酰氯酯化，水合肼脱保护，得到B3-1。
实施例7.MSP的制备：待修饰的MSP
7-1.磁流体的制备：用PEG800的双丁二酸单酯分散磁流体；制备分散剂及磁流体完全参照文献(Int J NanoMed,2013,8:791-807)。
7-2.W/O微乳体系的自由基聚合反应：将PEG-800-双-马来酸单酯分散的磁流体共0.70ml用2.5ml水悬浮，与用4.0ml水溶解的N-羟甲基丙烯酰胺共1.5g混匀，再加入甲叉双丙烯酰胺饱和水溶液1.0ml，混匀作为水相共约9ml；将12g AOT溶于500ml正庚烷，超声除氧并通氮气，机械搅拌混匀为油相；将前述水相与油相混合，室温下恒速2000rpm持续机械搅拌20分钟后加入1.0ml过硫酸铵饱和水溶液，继续搅拌5分钟；将5μl催化剂N,N’-四甲基乙二胺稀释到1.0ml后加入上述体系，37℃恒速2000rpm搅拌反应8h。停止搅拌，自然冷却并使得所得亚微米磁珠沉降；用磁分离器压积和分离，甲醇:丙酮(1:9)每次80ml洗涤3次，四氢呋喃洗涤每次80ml洗涤3次，再用每次100ml双蒸水洗涤3次后悬浮于水中备用，用磁分离器压积后产物总体积约1.0ml，质量约0.10g，以下均以此换算MSP的用量；产物粒径0.58μm，缩写为MSP。
实施例8.MSP表面的羧基化、羧基的活化
8-1.MSP表面的潜在羧基的羧基化：在水中磁力压积0.50ml的MSP，THF悬浮，Na2SO4干燥过夜；加1.2g丁二酸酐，回流反应8小时；磁分离得MSP-COOH；THF洗涤。流程见附图6。
8-2.参照方法2和方法3，测定对水溶性蛋白和疏水小分子的非特异吸附(表1)。
8.3.MSP-COOH活化生成表面活泼酯：将材料干燥，10ml THF悬浮，加0.5g NHS和1.0g DCC；室温旋摇过夜，得MSP活泼酯(MSP-CO-NHS)；流程见附图6。其活泼酯含量约为0.25mmole/g。
实施例9.MSP的修饰方案1：兼性离子和PEG交替两层修饰
9-1.用修饰剂A1-2修饰：在THF中磁力压积MSP-CO-NHS共0.10ml，加修饰剂A1-2共0.6g；室温旋摇反应6小时；磁分离、THF洗涤并悬浮，加溴乙酸活泼酯0.40g，室温旋摇6小时；THF洗涤；加1,3-丙基磺内酯0.50g，室温旋摇反应6小时；THF洗涤；加巯基乙酸的THF溶液1.0ml，室温旋摇6小时；THF洗涤；得兼性离子修饰羧基MSP(MSP-ZW-COOH)。
9-2.MSP-ZW-COOH活化：将所得材料悬浮在THF中，加0.15g NHS和0.30g DCC，室温旋摇反应6小时；THF洗涤，得兼性离子修饰MSP活泼酯(MSP-ZW-CO-NHS)。
9-3.B1-1修饰剂(PEG800-氨基酸)：将步骤9-1所得用MSP-ZW-CO-NHS悬浮在THF中，加应用实施例6的步骤6-3所制备来自PEG800的修饰剂B1-1共1.5g，室温旋摇反应6小时；磁分离，THF洗涤；水洗涤得两层修饰羧基MSP(MSP-ZW-PEG-COOH)。流程见附图7。
9-4.参照方法2和方法3，测定对水溶性蛋白和疏水小分子的非特异吸附(表1)。
实施例10.MSP的修饰方案2：单用兼性离子两层修饰
10-1.修饰剂A1-2即单-(N,N-二甲基-二乙基三胺进行双层修饰：在THF中磁力压积的MSP-CO-NHS共0.10ml，加入修饰剂A1-2共0.6g；室温旋摇反应6小时；磁分离，THF洗涤；悬浮在THF中，加溴乙酸活泼酯0.40g，室温旋摇反应6小时；磁分离并用THF洗涤；加1,3-丙基磺内酯0.50g，室温旋摇反应6小时；磁分离，THF洗涤；加巯基乙酸1.0ml，室温旋摇反应6小时；磁分离，THF洗涤；得兼性离子修饰羧基MSP(MSP-ZW-COOH)。
10-2.MSP-ZW-COOH活化：所得材料悬浮在THF中，加0.15g NHS和0.3g DCC，室温旋摇反应6小时；磁分离，THF洗涤，得到兼性离子修饰MSP活泼酯(MSP-ZW-CO-NHS)。
10-3.MSP-ZW-CO-NHS再修饰：所得MSP-ZW-CO-NHS加0.6g修饰剂A1-2，重复步骤10-1，得到双层修饰羧基MSP产物(MSP-ZW-ZW-COOH)。修饰全流程见附图8。
10-4.参照方法2和方法3，测定对水溶性蛋白和疏水小分子的非特异吸附(表1)。
实施例11.MSP的修饰方案3：单用B1型修饰剂实现两层修饰
11-1.用B1-1修饰剂(PEG800-氨基酸)修饰：在THF中磁力压积的MSP-CO-NHS共0.10ml，加入修饰剂B1-1共1.5g；室温旋摇反应6小时；磁分离并用THF洗涤得到PEG修饰羧基MSP(MSP-PEG-COOH)；此第一层修饰过程与应用实施例9的步骤9-1相同。
11-2.MSP-PEG-COOH活化：所得材料悬浮在THF中，加0.15g NHS和0.3g DCC，室温旋摇反应6小时；磁分离，THF洗涤，得到PEG修饰MSP活泼酯(MSP-PEG-CO-NHS)。
11-3.用B1-1修饰剂再修饰：所得MSP-PEG-CO-NHS加B1-1修饰剂1.5g，参照步骤11-1，得到双层PEG修饰的羧基MSP(MSP-PEG-PEG-COOH)。
11-4.参照方法2和方法3，测定对水溶性蛋白和疏水小分子的非特异吸附(表1)。
实施例12.MSP的修饰方案4：用本身为兼性离子的修饰剂进行修饰
12-1.用修饰剂A3-1进行第一层修饰：在THF中磁力压积的MSP-CO-NHS共0.10ml，加修饰剂A3-1共2.6g，悬浮状态室温旋摇反应12小时；磁分离，THF洗涤；加1.2g丁二酸酐在THF中旋摇反应过夜；得到直接用兼性离子修饰的羧基MSP(MSP-DZW-COOH)。
12-3.羧基活化和第二层修饰：所得材料加0.15g NHS和0.30g DCC，室温THF旋摇6小时；磁分离，THF洗涤；加A3-1修饰剂2.6g，旋摇反应6小时；磁分离，THF洗涤；加1.2g丁二酸酐，THF旋摇反应过夜；得羧基修饰产物为MSP-DZW-DZW-COOH。
12-4.参照方法2和方法3，测定对水溶性蛋白和疏水小分子的非特异吸附(表1)。
实施例13.MSP的修饰方案5：用离子对修饰剂实现单层共修饰；
13-1.用修饰剂A5-1a和A6-1a进行两层修饰：修饰剂A5-1a和A6-1a等摩尔混合，再加20％摩尔比的修饰剂B1-1，得三元混合物修饰剂；在THF中磁力压积MSP-CO-NHS共0.10ml，加三元混合物修饰剂2.8g，室温旋摇反应6小时；磁分离，THF洗涤得羧基离子对修饰产物为MSP(ZW-PEG)-COOH。
13-3.按方法2和方法3，测定对水溶性蛋白(200mg/g MSP)和疏水小分子的非特异吸附(表1)。
实施例14.MSP的表征：
14-1用25ug磁珠加含25ng的ECAP的MES缓冲液pH 6.5共0.10ml进行吸附；磁分离吸附的ECAP并测定结合的ECAP的活性，表明本发明所述修饰过程显著降低非特异吸附(表2)；经过修饰后的微米磁珠其表面对ECAP的非特异吸附很低，与现有商品化微米磁珠的非特异吸附能力相当，尤其非特异吸附甚至显著优于Bangs Laboratories Inc提供的商品化微米磁珠。
14-2用ECAP免疫大白兔得抗血清；用30％硫酸铵沉淀抗血清中的球蛋白，用20mM且pH 6.5MES缓冲液溶解后对该MES缓冲液透析过夜；所得球蛋白用此MES缓冲液平衡后过DEAE-Cellulose柱，收集未结合球蛋白为多抗。取所述羧基磁珠各0.50mg，与前述MES缓冲液溶解50g/L的EDC和50g/L的NHS各0.050ml混匀，室温振摇活化羧基30min；去活化试剂后，各加前述MES缓冲液溶解的多抗0.15mg，室温振摇反应60min(固定比例都低于10％)；磁分离结合多抗并用前述MES缓冲液洗涤磁珠；取固定多抗磁珠各1.0ug，加100ng用pH 7.4的20mM Tris-HCl缓冲液溶解的ECAP(结合率都低于6％)，室温振摇吸附30min；磁力分离结合ECAP，用前述Tris-HCl缓冲液洗涤2次；加用1.0M Tris-HCl pH 10.0溶解的4-硝基苯基磷酸酯溶液0.20ml，室温振摇反应20min；加5.0M NaOH溶液0.050ml终止反应，去磁珠；取上清测定405nm吸收；以结合和游离ECAP比活性相同计算结合ECAP量。MSP-ZW-PEG-COOH固定多抗对大分子抗原ECAP结合活性显著高于商品化羧基磁珠(表3)；固定化多抗的活性提高，应该与修饰带来柔性连接臂降低位阻有关。
14-3取MSP-ZW-PEG-COOH共0.01g，在二甲基甲酰胺即DMF中用DCC和NHS得到其活泼酯；用DMF洗涤，加1mol乙二胺DMF溶液4℃快速振摇反应30min，再室温快速振摇反应30min，DMF洗涤得到表面为带连接臂氨基MSP。取将2-溴甲基丙烯酸即BMAR共0.10g，用DCC和NHS转变成活泼酯，再与前述带连接臂氨基的MSP反应，磁分离并用DMF洗涤；最后用pH7.4的20mM Tris-HCl缓冲液反复洗涤，得表面为蛋白二硫键选择性修饰的磁珠MSP-ZW-PEG-CO-NH-BMAR。
14-4用20mM且pH 6.5MES缓冲液溶解多抗0.15mg共0.10ml，加20mM且pH 6.5MES缓冲液溶解三羧乙基磷溶液0.010ml到终浓度为1.0mM；室温振摇反应30min。与0.50mg表面为蛋白二硫键选择性修饰的MSP混匀，室温振摇反应60min；磁分离，用pH 7.4的20mM Tris-HCl缓冲液洗涤，参照14-2测定对抗原ECAP的分离量(表3)；可见其分离量能达到对应羧基MSP活化固定化多抗的1.8倍，达到Dynal-MSP-COOH固定多抗的4倍。
表1. 4-硝基-1-萘酚苯甲酸酯(NNPB)、ECAP和PAAS的结合率(n＝2，CV<12％)
非特异吸附探针 16μM NNPB 64μM NNPB ECAP PAAS
MSP 10％ 16％ 56％ 28％
MSP-ZW-PEG-COOH 4％ 5％ <0.5％ <1％
MSP-ZW-ZW-COOH 1％ 1％ 3％ 3％
MSP-PEG-PEG-COOH 12％ 10％ <1％ <1％
MSP-DZW-DZW-COOH <1％ <1％ <0.5％ 2％
MSP-(ZW-PEG)-COOH 3％ 3％ 1％ 1％
表1表明，本发明所述修饰方法能降低微米磁性材料表面对蛋白和疏水小分子的非特异吸附。
表2 测定25μg羧基磁珠对25ng ECAP的非特异性吸附
表3 在不同磁珠表面固定抗ECAP多抗对抗原ECAP分离效力的比较
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案和有益效果而非限制；本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术原理，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (8)

1.一种微纳米材料表面用亲水物质共价修饰产物的制备方法，其特征在于：所述微纳米材料表面含以下官能团：羧基、潜在羧基、活泼酯、阳离子、阴离子、中性亲水官能团、金属离子螯合官能团或蛋白二硫键选择性修饰官能团之一或上述官能团的混合物；所述待修饰微纳米材料表面的这些官能团直接来自通过聚合反应制备微纳米材料时所用有机单体，或对来自聚合反应所用有机单体的羧基和/或潜在羧基进行衍生化转变而间接生成；
共价修饰产物包括单层及多层共价修饰产物；将所述微纳米材料表面的羧基和潜在羧基转变成活泼酯，与含脂肪族伯胺或/和脂肪族仲胺的亲水化合物和/或聚合物为修饰剂成酰胺键进行共价修饰得单层共价修饰产物；在亲水物质共价修饰产物的表面重复再生所述活泼酯，以含脂肪族伯胺或/和脂肪族仲胺的亲水化合物和/或亲水聚合物为修饰剂，通过重复形成酰胺键进行共价修饰获得多层共价修饰产物；
共价修饰产物的制备方法包括下列步骤：
a.以表面具有羧基或/和潜在羧基的微纳米材料为待修饰微纳米材料，将待修饰微纳米材料表面的羧基和潜在羧基转变成羧基的活泼酯；
步骤a中，活泼酯来自待修饰微纳米材料表面的羧基或/和潜在羧基，其生成方式包括：将所述待修饰微纳米材料表面羧基直接转变成活泼酯，或将所述待修饰微纳米材料表面潜在羧基转变成羧基再转变成活泼酯，或将所述待修饰微纳米材料表面潜在羧基转变成脂肪族羟基和/或脂肪族胺基再用CDI或TPG转变成活泼酯，或将所述待修饰微纳米材料表面潜在羧基直接转变成活泼酯；将此类表面活泼酯与长直链氨基酸反应重新获得羧基，或与含多个脂肪族伯胺的线性多胺反应转变成脂肪族胺基，再用于与含潜在羧基和活泼酯物质反应重新获得潜在羧基或与环状酸酐反应重新获得羧基，从而在羧基或潜在羧基与待修饰微纳米材料间插入连接臂，再将衍生所得表面羧基或潜在羧基转变成活泼酯；
b.对经过步骤a获得表面活泼酯的微纳米材料，用含脂肪族伯胺或/和脂肪族仲胺的亲水化合物和/或亲水聚合物为修饰剂，通过形成酰胺键实现共价修饰；
步骤b中，所用修饰剂包括A类修饰剂和B类修饰剂，且两类修试剂分子量都不超过3000道尔顿；
所述A类修饰剂为亲水且含脂肪族伯胺或/和脂肪族仲胺的化合物或聚合物，且都含N,N-二甲基取代脂肪族叔胺、N,N-二乙基取代脂肪族叔胺和N,N-二正丙基取代脂肪族叔胺这三种叔胺官能团之一或多种；所述A类修饰剂分为A1亚类修饰剂和A2亚类修饰剂；A1亚类修饰剂为每分子含脂肪族伯胺和/或脂肪族仲胺不少于2个及N,N-二烷基取代的脂肪族叔胺官能团不少于1个；A2亚类修饰剂仅含1个脂肪族伯胺或脂肪族仲胺，但含N,N-二烷基取代的脂肪族叔胺官能团不少于1个；
A1亚类修饰剂和A2亚类修饰剂在步骤b中的使用方式为：单用A1亚类修饰剂，或用A1亚类修饰剂与A2亚类修饰剂的任意比例混合物；进行修饰时，来自修饰剂的脂肪族伯胺及脂肪族仲胺摩尔量之和比微纳米材料表面活泼酯摩尔量多10％以上；除非结束修饰即进行最后一层共价修饰，A2亚类修饰剂在步骤b中不单独使用；
所述B类修饰剂为亲水且含脂肪族伯胺或/和脂肪族仲胺的化合物或聚合物，但都不含N,N-二甲基取代脂肪族叔胺、N,N-二乙基取代脂肪族叔胺和N,N-二正丙基取代的脂肪族叔胺这三种叔胺官能团中任一种，并分成B1亚类修饰剂、B2亚类修饰剂、B3亚类修饰剂和B4亚类修饰剂；
B1亚类修饰剂为线性结构，一端为脂肪族伯胺或脂肪族仲胺，另一端为羧基，或既非脂肪族胺基也非脂肪族羟基的潜在羧基；B2亚类修饰剂为线性结构，且两端为脂肪族伯胺和/或脂肪族仲胺；B3亚类修饰剂为线性结构，一端为脂肪族伯胺或脂肪族仲胺，另一端为甲氧基或乙氧基；B4亚类修饰剂为非线性结构，含至少2个脂肪族伯胺和/或脂肪族仲胺；
B1亚类修饰剂、B2亚类修饰剂、B3亚类修饰剂和B4亚类修饰剂在步骤b中使用方式为：单用B1亚类修饰剂、B2亚类修饰剂或B4亚类修饰剂之一或三者的任意比例混合物，来自修饰剂的脂肪族伯胺及脂肪族仲胺摩尔量之和比微纳米材料表面活泼酯摩尔量多10％以上；B3亚类修饰剂调节来自B1亚类修饰剂、B2亚类修饰剂或B4亚类修饰剂的脂肪族伯胺及脂肪族仲胺的摩尔量占比；除非结束修饰即进行最后一层共价修饰，B3亚类修饰剂在步骤b中不单独使用；
A类修饰剂和B类修饰剂在步骤b中混合使用方式为：二者以任意比例混合使用；来自修饰剂的脂肪族伯胺及脂肪族仲胺摩尔量之和比微纳米材料表面活泼酯摩尔量多10％以上；除非结束修饰即进行最后一层共价修饰，在步骤b中不使用仅由A2亚类修饰剂和B3亚类修饰剂组成的任意比例混合物。
2.根据权利要求1所述微纳米材料表面用亲水物质共价修饰产物的制备方法，其特征在于：所述微纳米材料用有机单体聚合反应制成；聚合反应所用所用有机单体直接在微纳米材料表面提供羧基、潜在羧基、活泼酯、阳离子、阴离子、中性亲水官能团、金属离子螯合官能团或蛋白二硫键选择性修饰官能团之一或其混合物，或由聚合所用有机单体在表面直接提供羧基或潜在羧基再进行衍生化转化而间接提供上述官能团。
3.根据权利要求2所述的微纳米材料表面用亲水物质共价修饰产物的制备方法，其特征在于：所述微纳米材料，包括有机聚合物微纳米材料、有机聚合物-无机微纳米颗粒复合微纳米材料和有机聚合物-有机微纳米颗粒复合微纳米材料；制备所述复合微纳米材料时所用微纳米颗粒包括磁纳米粒、量子点、上转发光颗粒、有机聚合物颗粒、有机-无机复合颗粒之一或它们的混合物；
制备所述微纳米材料时，聚合反应使用了共价结构中既含有聚合所需官能团还含羧基、潜在羧基、活泼酯、阳离子、阴离子、中性亲水官能团、金属离子螯合官能团或蛋白二硫键选择性修饰官能团之一或其混合物的特殊有机单体，且这些特殊有机单体占所用单体总摩尔量的比例不少于1％；
制备所述微纳米材料颗粒时，用油包水或水包油微乳体系将所用单体分散到微乳中再进行聚合，或将聚合物材料大体积颗粒/膜片用机械方法破碎得所需微纳米材料颗粒；用微乳体系分散后再聚合时，所用特殊有机单体只要在聚合反应相的溶解度满足要求，适合单用或以任意比例混用。
4.根据权利要求1所述的微纳米材料表面用亲水物质共价修饰产物的制备方法，其特征在于：所述共价修饰的产物表面最终得到羧基、潜在羧基、阳离子、阴离子、中性亲水官能团、活泼酯、金属离子螯合官能团或蛋白二硫键选择性修饰官能团之一或其混合物。
5.根据权利要求1所述的微纳米材料表面用亲水物质共价修饰产物的制备方法，其特征在于：步骤b包括：
b1对获得表面活泼酯的微纳米材料，用含脂肪族伯胺或/和脂肪族仲胺的亲水化合物和/或亲水聚合物为修饰剂，通过形成酰胺键进行共价修饰；
b2对经过步骤b1共价修饰的微纳米材料，将其表面的羧基再转变成活泼酯，或将其表面潜在羧基转变成羧基后再进一步衍生成活泼酯，或将潜在羧基直接转变成活泼酯；
b3根据所需的共价修饰层数，重复步骤b1和b2。
6.根据权利要求5所述的微纳米材料表面用亲水物质共价修饰产物的制备方法，其特征在于：还包括下列步骤：
c.经过步骤b3进行最后一次共价修饰后，在微纳米材料表面得到羧基、潜在羧基、阳离子、阴离子、中性亲水官能团、活泼酯、金属离子螯合官能团或蛋白二硫键选择性修饰官能团之一或其混合物。
7.根据权利要求1所述的微纳米材料表面用亲水物质共价修饰产物的制备方法，其特征在于：所述A类修饰剂还包括A3亚类修饰剂、A4亚类修饰剂、A5亚类修饰剂和A6亚类修饰剂；
所述A3亚类修饰剂含有局部的兼性离子对结构，且含有不少于2个能与活泼酯反应的脂肪族伯胺和/或脂肪族仲胺，或仅1个能与活泼酯反应脂肪族伯胺或仲胺但还有至少1个羧基或潜在羧基；
所述A4亚类修饰剂含有局部的兼性离子对结构，但仅含1个能与活泼酯反应的脂肪族伯胺或脂肪族仲胺，且不含适合用于后续再进行下一层共价修饰所需的羧基或潜在羧基；除非结束修饰即进行最后一层共价修饰，A4亚类修饰剂不单独用于步骤b，也不仅仅与A2亚类修饰剂和B3亚类修饰剂组成任意比例混合物用于步骤b；
所述A5亚类修饰剂为阴离子亚类修饰剂，A6亚类修饰剂为阳离子亚类修饰剂；A5亚类修饰剂有单或多个磺酸和/或磷酸阴离子，且A5亚类修饰剂中同时含1个脂肪族伯胺或脂肪族伯胺者为A5-1，含多个脂肪族伯胺和/或脂肪族仲胺者为A5-2；A6亚类修饰剂有单或多个季胺或叔胺阳离子，且A6亚类修饰剂中同时含1个脂肪族伯胺或脂肪族仲胺者为A6-1，含多个脂肪族伯胺和/或脂肪族仲胺者为A6-2；A5亚类修饰剂和A6亚类修饰剂配对用于表面为活泼酯微纳米材料共价修饰得离子对修饰层；
在步骤b中使用A3亚类修饰剂的方式为：A3亚类修饰剂单用，或与A1亚类修饰剂、A2亚类修饰剂、A4亚类修饰剂、B1亚类修饰剂、B2亚类修饰剂和B3亚类修饰剂之一或全部任意比例混用；除非结束修饰，混合物修饰剂中A1亚类、A3亚类、B1亚类和B2亚类修饰剂摩尔量之和所占比例需大于10％；
在步骤b中使用A4亚类修饰剂的方式为：A4亚类修饰剂与A1亚类修饰剂、A3亚类修饰剂、B1亚类修饰剂、B2亚类修饰剂和B4亚类修饰剂之一或全部以任意比例混用；除非结束修饰，混合修饰剂中，A1亚类、A3亚类、B1亚类、B2亚类和B4亚类修饰剂摩尔量之和所占比例需大于10％；
在步骤b中使用A5亚类修饰剂和A6亚类修饰剂的方式为：A5亚类修饰剂和A6亚类修饰剂混合使用且混合物中来自A5亚类修饰剂磺酸或/和磷酸阴离子和来自A6亚类修饰剂季胺及叔胺阳离子等量；
步骤b1中，用任意所述修饰剂及其任意比例混合物时，如微纳米材料表面活泼酯来自CDI或TPG衍生物，在惰性有机溶剂或中性水溶液或二者混合溶剂中悬浮反应10分钟以上进行修饰；否则，在惰性有机溶剂中悬浮反应10分钟以上进行修饰；
步骤b1中，除非单用A2亚类修饰剂或B3亚类修饰剂或这两亚类修饰剂的任意比例混合物，在惰性有机溶剂中，用卤代乙酸活泼酯、N-溴乙酰-6-氨基己酸活泼酯、O-Ts羟乙酸活泼酯、缩水甘油-丁二酸单酯对应的活泼酯、N-三氟乙酰甘氨酸活泼酯、4-丁醛酸的活泼酯、S-乙酰巯基乙酸活泼酯之一或任意比例混合物，与修饰后材料表面脂肪族伯胺及仲胺反应封闭表面的胺基并同步得到潜在羧基；这些带来潜在羧基的活泼酯摩尔用量比微纳米材料表面可反应脂肪族胺基多10％以上，在表面生成卤代烃、Ts酯、环氧基、三氟乙酰胺基、醛基及乙酰保护巯基为潜在羧基；
步骤b2中，当前一步的共价修饰过程使用了A1亚类修饰剂或/和A2亚类修饰剂时：用卤代乙酸活泼酯、N-溴乙酰-6-氨基己酸活泼酯、O-Ts羟乙酸活泼酯、缩水甘油-丁二酸单酯对应的活泼酯、N-三氟乙酰甘氨酸活泼酯、4-丁醛酸的活泼酯、S-乙酰巯基乙酸活泼酯之一或任意比例混合物封闭材料表面剩余的脂肪族伯胺及脂肪族仲胺后，在惰性有机溶剂中用比修饰后材料表面的二烷基取代叔胺摩尔量过量10％以上的1,3-丙基磺内酯将表面来自A1亚类修饰剂和A2亚类修饰剂的烷基叔胺转变成季胺与磺酸相邻的兼性离子修饰层；再将共价修饰产物表面的羧基和潜在羧基转成活泼酯；
步骤b2中，当前一步的共价修饰过程未使用了A1或A2亚类修饰剂时：用卤代乙酸活泼酯、N-溴乙酰-6-氨基己酸活泼酯、O-Ts羟乙酸活泼酯、缩水甘油-丁二酸单酯的活泼酯、N-三氟乙酰甘氨酸活泼酯、4-丁醛酸的活泼酯、S-乙酰巯基乙酸活泼酯之一或任意比例混合物封闭共价修饰产物表面剩余的脂肪族伯胺及脂肪族仲胺得潜在羧基；再将共价修饰产物表面的羧基和潜在羧基转变成活泼酯；
步骤b2中，将共价修饰产物表面的活泼酯，再与长直链氨基酸反应重新获得羧基，或再与含多个脂肪族伯胺的线性多胺反应重新获得脂肪族胺基，用于再与含潜在羧基和活泼酯的物质反应重新获得潜在羧基或与环状酸酐反应重新获得潜在羧基，在表面羧基或潜在羧基与共价修饰产物间插入连接臂，再将衍生转化所得共价修饰产物表面的羧基或潜在羧基转变成活泼酯；
步骤c中，前一次共价修饰过程中：单用一端为脂肪族胺基而另一端为羧基B1亚类修饰剂，直接获得表层羧基；单用B2亚类修饰剂、B4亚类修饰剂之一或任意比例混合物时，在惰性有机溶剂中，用卤代乙酸活泼酯、N-溴乙酰-6-氨基己酸活泼酯、O-Ts羟乙酸活泼酯、缩水甘油-丁二酸单酯对应的活泼酯、N-三氟乙酰甘氨酸活泼酯、4-丁醛酸的活泼酯、S-乙酰巯基乙酸活泼酯、二硫键选择性修饰基团对应物质的活泼酯之一或任意比例混合物，与修饰后材料表面的脂肪族伯胺及脂肪族仲胺反应且活泼酯摩尔用量比微纳米材料表面可反应胺基多10％以上，生成对应的卤代烃、Ts酯、环氧基、三氟乙酰胺基、醛基、保护巯基、二硫键选择性修饰官能团之一或上述表面官能团的混合物；
步骤c中，前一次共价修饰过程中：单独使用A2亚类修饰剂得到烷基取代叔胺的阳离子表面官能团，如再用过量1,3-丙基磺内酯将表面A2亚类修饰剂的烷基叔胺转变成季胺与磺酸相邻的兼性离子，则得到兼性离子表面官能团；单独使用B3亚类修饰剂则得到中性且惰性亲水表面官能团；
步骤c中，将共价修饰产物表面的羧基或潜在羧基转变成活泼酯，再与长直链氨基酸反应重新获得羧基，或再与含多个脂肪族伯胺的线性多胺反应重新获得脂肪族胺基，用于与含潜在羧基和活泼酯的物质反应重新获得潜在羧基或与环状酸酐反应重新获得羧基或与含其它官能团的活泼酯反应获得其它形式表面官能团，从而在最终所得表面官能团与共价修饰产物间插入连接臂。
8.据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：步骤c中，蛋白二硫键选择性修饰官能团具有以下特征：
所述蛋白二硫键选择性修饰官能团含有能与巯基发生Michael加成和/或亲核取代反应的两个活泼官能团且二者间隔不超过10个共价键，还含有与其它成分以生成酰胺键相连所需的羧基；
与巯基发生Michael加成反应的活泼基团为丙烯酰基、乙烯砜基即R1-CH＝CH-SO2-R2，此类活泼基团单独发挥作用则属于潜在羧基；其反应中心是丙烯酰基中羰基的β位、砜基的β位烯烃碳原子；
与巯基发生亲核取代反应的活泼基团，为羰基、砜基、烯烃、芳环α位饱和碳原子上含氯、溴、碘、三氟乙酸酯、对甲苯磺酸酯之一或多种的烃基，及与蛋白巯基发生Michael加成后衍生出上述烃基的基团，此类活泼基团单独发挥作用则属于潜在羧基；氯、溴、碘、三氟乙酸酯、对甲苯磺酸酯为亲核取代反应的离去基团X，亲核取代的反应中心是对应羰基、砜基、烯烃、芳环的α位饱和碳原子；
蛋白二硫键选择性修饰官能团中，连接两个巯基反应中心的片段不含碳碳单键相连的环和三烷基取代基，五元环、六元环作为共价连接片段时将两个与蛋白巯基反应活泼基团同时连接到环上；
蛋白二硫键选择性修饰官能团所含用于共价连接微纳米材料的羧基，转变成活泼酯、酸酐或酰氯后与微纳米材料表面伯胺和仲胺反应，获得位于微纳米材料表面的蛋白二硫键选择性修饰官能团；
上述蛋白二硫键选择性修饰官能团应用时，先用三烷基磷将目标蛋白表面的二硫键还原为两个空间相邻的游离巯基，再与微纳米材料表面蛋白二硫键选择性修饰官能团中两个空间相邻的蛋白巯基反应官能团同时反应，从而针对该蛋白二硫键实现位点选择性共价相连/固定化；
上述蛋白二硫键选择性修饰官能团的应用还有如下特征：将蛋白二硫键选择性修饰官能团所含羧基与表面不含巯基及二硫键的聚合物/小分子的胺基共价连接，获得针对表面含二硫键蛋白的选择性修饰或标记试剂；用三烷基磷还原蛋白表面二硫键为两个相邻的游离巯基后，与前述选择性修饰/标记试剂中蛋白二硫键选择性修饰官能团的两个活泼基团同时反应，实现共价相连或标记。
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