JP7373514B2 - デュアルvegf/pdgfアンタゴニスト - Google Patents
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Description
本願は、2014年6月28日に出願された米国仮特許出願第62/018,579号明細書(あらゆる目的において全体として参照により援用される)の非仮出願である。
disease.Nature Med 9(6):653-660。
7.Vascular endothelial growth factor increases microvascular permeability via a Ca(2+)-dependent pathway.Am J Physiol.273:H687-H694;Roberts WG and Palade GE.1995.Increased microvascular permeability and endothelial fenestration induced by vascular endothelial growth factor.J Cell
Sci.108:2369-2379。
macular degeneration in clinical settings.Retina 32:1480-1485。網膜下線維化形成は、黄斑系の永久的な機能不全を引き起こし得る。それは、光受容体、網膜色素上皮及び脈絡膜血管の破壊を引き起こす。Ishikawa K,Ram K,Hinton DR.2015.Molecular mechanisms of subretinal fibrosis in age-related macular degeneration.Eye Res.xxx:1-7。抗VEGF療法は概して視力を安定化させ、又は改善するが、瘢痕形成は治療後の視力低下の原因の1つとして特定されている。Cohen SY,Oubraham H,Uzzan J,et al.2012.Causes of
unsuccessful ranibizumab treatment in exudative age-related macular degeneration in clinical settings.Retina 32:1480-1485。
let-Derived Growth Factor B Signaling Enhances the Efficacy of Anti-Vascular Endothelial Growth Factor Therapy in Multiple Models of Ocular Neovascularization.American J Path.168(6):2036-2053。
285(20):15500-15510。しかし、FovistaはPDGF-DDと相互作用しない。当該技術分野においては、より広域の抗PDGF療法薬が必要とされている。
EGF若しくはVEGFRに対する抗体であるか、又は(b)VEGFR細胞外トラップセグメントであり、且つPDGFアンタゴニストは(a)PDGF若しくはPDGFRに対する抗体であるか、又は(b)PDGFR細胞外トラップセグメントであり、但し、VEGF及びPDGFアンタゴニストが両方とも抗体であることはない。任意選択で、VEGFアンタゴニストは重鎖と軽鎖とを含む抗体であり、且つPDGFアンタゴニストはPDGFR細胞外トラップセグメントであり、及び抗体の重鎖はリンカーを介してPDGFR細胞外トラップセグメントのC末端に融合し、且つ軽鎖は重鎖と複合体を形成する。任意選択で、抗体はFab断片である。任意選択で、抗体はインタクトな抗体である。任意選択で、PDGFアンタゴニストはPDGFR-α又はPDGFR-β受容体の細胞外トラップセグメントであり、且つVEGFアンタゴニストはVEGFに対する抗体である。任意選択で、PDGFR細胞外トラップセグメントはPDGFR-βのドメインD1~D5の1つ以上を含む。任意選択で、PDGFR細胞外トラップセグメントはPDGFR-βのドメインD1~D3を含む。任意選択で、PDGFR細胞外トラップセグメントは配列番号11のアミノ酸33~314を含む。任意選択で、VEGFアンタゴニストは抗VEGF抗体を含む。任意選択で、抗VEGF抗体は抗VEGF-A抗体である。任意選択で、PDGFR細胞外トラップセグメントは重鎖又は軽鎖のC末端に位置する。任意選択で、PDGFR細胞外トラップセグメントは重鎖又は軽鎖のN末端に位置する。
4を含む。
を有し、このシステインは、Q347C又はL443Cからなる群から選択される。任意選択で、デュアルVEGF/PDGFアンタゴニストは、システインにコンジュゲートした半減期延長部分を更に含む。任意選択で、デュアルVEGF/PDGFアンタゴニストタンパク質は、双性イオンポリマーであって、1つ以上の単量体単位を含む双性ポリマーを含む半減期延長部分を有し、この少なくとも1つの単量体単位は、ホスホリルコリンなどの双性イオン基を含む。任意選択で、単量体は2-(アクリロイルオキシエチル)-2’-(トリメチルアンモニウムエチル)ホスフェートを含む。任意選択で、単量体は2-(メタクリロイルオキシエチル)-2’-(トリメチルアンモニウムエチル)ホスフェート(HEMA-PC)を含む。任意選択で、ポリマーは3本以上のアームを有する。任意選択で、ポリマーは、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11又は12本のアームを有する。任意選択で、ポリマーは、3、6又は9本のアームを有する。任意選択で、ポリマーは9本のアームを有する。任意選択で、コンジュゲートのポリマー部分は300,000~1,750,000Daのピーク分子量を有する。任意選択で、コンジュゲートのポリマー部分は500,000~1,000,000Daのピーク分子量を有する。任意選択で、コンジュゲートのポリマー部分は600,000~800,000Daのピーク分子量を有する。
配列番号1は、PDGFRb-GS10-軽鎖抗VEGF-A(ベバシズマブ)のタンパク質配列である。
配列番号2は、抗VEGF-Aベバシズマブ重鎖である。
配列番号3は、PDGFRb-GG-軽鎖抗VEGF-A(ベバシズマブ)のタンパク質配列である。
配列番号4は、PDGFRβ-GS10-重鎖抗VEGF-A(ベバシズマブ)である。
配列番号5は、抗VEGF-Aベバシズマブ軽鎖である。
配列番号6は、PDGFRβ-GG-重鎖抗VEGF-A(ベバシズマブ)である。
配列番号7は、抗VEGF-A重鎖(ベバシズマブ)-GS21-PDGFRβである。
配列番号8は、TAF347の重鎖トラップ細胞外セグメント:PDGFR-βトラップ-抗VEGF-A重鎖(Q347C)のアミノ酸配列である。
配列番号9は、TAF443の重鎖トラップ細胞外セグメント:PDGFR-βトラップ-抗VEGF-A重鎖(L443C)のアミノ酸配列であり、配列番号10は、抗VEGF-Aの軽鎖のアミノ酸配列である。
配列番号11は、ヒトPDGFR-βである。
配列番号12は、ラニビズマブ軽鎖である。
配列番号13は、ラニビズマブ重鎖である。
配列番号14は、ヒトVEGFR-1である。
配列番号15は、ヒトVEGFR-2である。
配列番号16は、ヒトVEGFR-3である。
配列番号17は、ヒトIgG1定常領域である。
配列番号18は、ヒトκ軽鎖定常領域である。
配列番号19は、図7のPDGFR-GS10-抗VEGF-A軽鎖である。
配列番号20は、図8のPDGFR-GG-抗VEGF-A軽鎖である。
配列番号21は、ベバシズマブFabである。
配列番号22は、PDGFR-β-GS10-抗VEGF-A Fabである。
配列番号23は、PDGFR-β-GG-抗VEGF-A Fabである。
配列番号24は、抗VEGF-A Fab-GS21-PDGFR-βである。
配列番号25は、特定の突然変異を含むPDGFR-β-GS10-抗VEGF-A Fabである。
配列番号26は、PDGFRβ-抗VEGF-A重鎖(1a)のタンパク質配列である。
配列番号27は、PDGFR-β(D2-D3)-抗VEGF-A重鎖(1b)のタンパク質配列である。
配列番号28は、PDGFR-β(D2-D3)-抗VEGF-A Fab(2b)のタンパク質配列である。
配列番号29は、PDGFR-β(D2-D3)-6xGS-抗VEGF-A Fabのタンパク質配列である。
配列番号30は、抗VEGF-A Fab-6xGS-PDGFR-β(D2-D3)のタンパク質配列である。
配列番号31は、重鎖抗VEGF-PDGFR融合物をコードする核酸である。
配列番号32は、軽鎖抗VEGFをコードする核酸である。
GGGGS(配列番号37)、GGGS(配列番号38)、GGGES(配列番号39)、GGGGSGGGGS(配列番号40)及びGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSG)(配列番号41)。
ラニビズマブCDRは、CDRH1:GYDFTHYGMN、CDRH2:WINTYTGEPTYAADFKR、及びCDRH3:YPYYYGTSHWYFDV(配列番号42~44)、CDRL1:SASQDISNYLN、CDRL2:FTSSLHS及びCDRL3:QQYSTVPWT(配列番号45~47)である。ベバシズマブCDRH1はGYTFTNYGMN(配列番号48)であり、CDRH3はYPHYYGSSHWYFDV(配列番号49)である。
「新生血管障害」は、変化した調節不全の又は調節されていない血管新生によって特徴付けられる障害又は病態である。新生血管障害の例としては、新生物形質転換(例えば癌)並びに糖尿病性網膜症及び加齢黄斑変性症を含めた眼新生血管障害が挙げられる。
膜変性症、ブドウ膜炎、炎症性網膜疾患、及び増殖性硝子体網膜症が挙げられる。
タンパク質が発現して分泌されると、シグナル配列は切断される。重鎖及び軽鎖可変領域の対が抗体の結合領域を定義する。軽鎖及び重鎖のカルボキシ末端部分はそれぞれ軽鎖及び重鎖定常領域を定義する。重鎖定常領域はエフェクター機能に主として関与する。IgG抗体では、重鎖定常領域は、CH1、ヒンジ、CH2、及びCH3領域に分けられる。CH1領域はジスルフィド結合及び非共有結合によって軽鎖定常領域に結合する。ヒンジ領域は、抗体の結合領域とエフェクター領域との間に柔軟性を提供し、また、四量体サブユニットにおける2つの重鎖定常領域間の分子間ジスルフィド結合部位も提供する。CH2及びCH3領域は、エフェクター機能及びFcR結合の主要な部位である。
て占有される位置の数を、2つの領域のアラインメントした位置の総数で除し(ギャップはカウントしない)、100を乗じてパーセンテージに変換したものである。他の配列の配列同一性は、デフォルトのギャップパラメータを使用した、Wisconsin Geneticsソフトウェアパッケージリリース7.0、Genetics Computer Group、575 Science Dr.、Madison、WIのBESTFIT、FASTA、及びTFASTAなどのアルゴリズムを使用して配列をアラインメントすることによるか、又は検査と最良のアラインメント(即ち、比較ウィンドウで最も高い配列類似性パーセンテージが得られるもの)とによって決定し得る。配列同一性パーセンテージは、比較ウィンドウにわたって2つの最適にアラインメントされた配列を比較して、両方の配列に同一の残基が現れる位置の数を決定することによりマッチ位置の数を求め、そのマッチ位置の数を比較ウィンドウ内の位置の総数(即ち、ウィンドウサイズ)で除して、その結果に100を乗じて配列同一性パーセンテージを求めることによって計算される。
、ヒト化重鎖は、完全に又は実質的にドナー抗体重鎖由来の少なくとも1つ、2つ及び通常3つの全てのCDRと、存在する場合に、実質的にヒト重鎖可変領域フレームワーク及び定常領域配列由来の重鎖可変領域フレームワーク配列及び重鎖定常領域とを有する。同様に、ヒト化軽鎖は、完全に又は実質的にドナー抗体軽鎖由来の少なくとも1つ、2つ及び通常3つの全てのCDRと、存在する場合に、実質的にヒト軽鎖可変領域フレームワーク及び定常領域配列由来の軽鎖可変領域フレームワーク配列及び軽鎖定常領域とを有する。ナノボディ及びdAbを除き、ヒト化抗体はヒト化重鎖とヒト化軽鎖とを含む。ヒト化抗体のCDRは、それぞれのCDR間で(Kabatにより定義されるとおりの)対応する残基の少なくとも85%、90%、95%又は100%が同一であるとき、実質的に非ヒト抗体の対応するCDR由来である。抗体鎖の可変領域フレームワーク配列又は抗体鎖の定常領域は、Kabatによって定義される対応する残基の少なくとも85、90、95又は100%が同一であるとき、それぞれ実質的にヒト可変領域フレームワーク配列又はヒト定常領域由来である。
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antibody(CC49):Contributions of individual CDRs to antigen binding and immunogenicity.Mol Immunol.36:1079-1091;Tamura M,Milenic DE,Iwahashi M,et al.2000.Structural correlates of an anticarcinoma antibody:Identification of specificity-determining regions(SDRs)and development of a
minimally immunogenic antibody variant by retention of SDRs only.J Immunol.164:1432-1441)。
munogenicity of antibody variable domains while preserving their ligand-binding properties.Mol Immunol.28:489-98)はヒト抗体配列の対応する位置の残基で置き換えられているヒト化抗体の一種である。その結果、CDRが完全に又は実質的に非ヒト抗体由来であり、且つ非ヒト抗体の可変領域フレームワークが置換によってよりヒト様となるように作られた抗体となる。ヒト抗体はヒトから単離することができ、又はその他にヒト免疫グロブリン遺伝子の(例えば、トランスジェニックマウスにおける、インビトロでの、又はファージディスプレイによる)発現から得ることができる。ヒト抗体の作製方法としては、Oestberg L,Pursch E.1983.Human x(mouse x human)hybridomas stably producing human antibodies.Hybridoma
2:361-367;Oestberg、米国特許第4,634,664号明細書;及びEnglemanら、米国特許第4,634,666号明細書のトリオーマ法、ヒト免疫グロブリン遺伝子を含むトランスジェニックマウスの使用(例えば、Lonbergら、国際公開第93/12227号パンフレット(1993);米国特許第5,877,397号明細書、米国特許第5,874,299号明細書、米国特許第5,814,318号明細書、米国特許第5,789,650号明細書、米国特許第5,770,429号明細書、米国特許第5,661,016号明細書、米国特許第5,633,425号明細書、米国特許第5,625,126号明細書、米国特許第5,569,825号明細書、米国特許第5,545,806号明細書、Nature 148,1547-1553(1994)、Nature Biotechnology 14,826(1996)、Kucherlapati、国際公開第91/10741号パンフレット(1991)を参照されたい)、及びファージディスプレイ法(例えば、Dowerら、国際公開第91/17271号パンフレット及びMcCaffertyら、国際公開第92/01047号パンフレット、米国特許第5,877,218号明細書、米国特許第5,871,907号明細書、米国特許第5,858,657号明細書、米国特許第5,837,242号明細書、米国特許第5,733,743号明細書及び米国特許第5,565,332号明細書を参照されたい)が挙げられる。
とを形成し得る。遊離基捕捉剤I’は、典型的にはハロゲンであるが、またニトリルなどの有機部分であってもよい。本発明の一部の実施形態において、開始剤は、ATRPによる重合部位として1つ以上の2-ブロモイソ酪酸基を含有する。
法も用いることができる。本発明の好ましい実施形態において、分子量はSEC-MALS(サイズ排除クロマトグラフィー-多角度光散乱)によって計測される。本発明のポリマー試薬は、典型的には多分散性であり(即ち、ポリマーの数平均分子量と重量平均分子量とが等しくない)、好ましくは、例えばSEC-MALS計測から導き出されるPDI値によって判断するとき、例えば約1.5未満といった低い多分散性値を有する。他の実施形態において、多分散性(PDI)は、より好ましくは約1.4~約1.2の範囲、更により好ましくは約1.15未満、及び更により好ましくは約1.10未満、なおも更により好ましくは約1.05未満、及び最も好ましくは約1.03未満である。
キレン、ヘテロアルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、シクロアルケニル、及びヘテロシクロアルケニルと称されるものを含む)の置換基は、0~(2m’+1)(式中、m’は、かかる基の炭素原子総数である)の範囲の数の、-OR’、=O、=NR’、=N-OR’、-NR’R’’、-SR’、-ハロゲン、-SiR’R’’R’’’、-OC(O)R’、-C(O)R’、-CO2R’、-CONR’R’’、-OC(O)NR’R’’、-NR’’C(O)R’、-NR’-C(O)NR’’R’’’、-NR’’C(O)2R’、-NH-C(NH2)=NH、-NR’C(NH2)=NH、-NH-C(NH2)=NR’、-S(O)R’、-S(O)2R’、-S(O)2NR’R’’、-CN及び-NO2から選択される種々の基であり得る。R’、R’’及びR’’’は各々独立して、水素、非置換(C1~C8)アルキル及びヘテロアルキル、非置換アリール、1~3個のハロゲンで置換されたアリール、非置換アルキル、アルコキシ又はチオアルコキシ基、又はアリール-(C1~C4)アルキル基を指す。R’及びR’’が同じ窒素原子に結合しているとき、それらは窒素原子と一緒になって5、6、又は7員環を形成し得る。例えば、-NR’R’’は、1-ピロリジニル及び4-モルホリニルを含むことが意図される。用語「アルキル」は、ハロアルキル(例えば、-CF3及び-CH2CF3)及びアシル(例えば、-C(O)CH3、-C(O)CF3、-C(O)CH2OCH3等)などの基であり、それらを含む。好ましくは、置換アルキル及びヘテロアルキル基は、1~4個の置換基、より好ましくは1、2又は3個の置換基を有する。例外はパーハロアルキル基(例えば、ペンタフルオロエチルなど)であり、これらも好ましく、本発明によって企図される。
基を形成してもよい。
ともできる。
、-CH(Ph)2、ペルフルオロ(C1~C4)アルコキシ、及びペルフルオロ(C1~C4)アルキル(0から芳香環系の空いている価の総数までの範囲の数;且つ式中、R’、R’’及びR’’’は、水素、(C1~C8)アルキル及びヘテロアルキル、非置換アリール及びヘテロアリール、(非置換アリール)-(C1~C4)アルキル、及び(非置換アリール)オキシ-(C1~C4)アルキルから独立して選択される)。
キレンの同じ原子に連結することも、又は異なる原子に連結することもできる。
テイン、L-グルタミン、L-グルタミン酸、L-グリシン、L-ヒスチジン、L-イソロイシン、L-ロイシン、L-リジン、L-メチオニン、L-フェニルアラニン、L-プロリン、L-セリン、L-スレオニン、L-トリプトファン、L-チロシン、及び/又はL-バリンである。タンパク質に見られる「天然に存在しないアミノ酸」は、天然に存在するアミノ酸として記載されるもの以外の任意のアミノ酸である。天然に存在しないアミノ酸には、限定なしに、天然に存在するアミノ酸のD異性体、並びに天然に存在するアミノ酸のD及びL異性体の混合物が含まれる。他のアミノ酸、例えば、N-α-メチルアミノ酸(例えばサルコシン)、4-ヒドロキシプロリン、デスモシン、イソデスモシン、5-ヒドロキシリジン、ε-N-メチルリジン、3-メチルヒスチジンは、天然に存在するタンパク質に見られるものの、概してmRNAのリボソーム翻訳以外の手段によって導入されるため、本開示の目的上、タンパク質に見られる天然に存在しないアミノ酸と見なす。
本発明は、PDGFアンタゴニストに連結したVEGFアンタゴニストを含むデュアルVEGF/PDGFアンタゴニストを提供する。VEGFアンタゴニストはVEGF若しくはVEGFRに対する抗体であるか、又はVEGFR細胞外トラップセグメント(即ち、少なくとも1つのVEGFRと少なくとも1つのVEGFとの結合を阻害する1つ以上
のVEGFR受容体の細胞外領域由来のセグメント)である。PDGFアンタゴニストはPDGF若しくはPDGFRに対する抗体であるか、又はPDGFR細胞外トラップセグメント(即ち、少なくとも1つのPDGFRと少なくとも1つのPDGFとの結合を阻害する、1つ以上のPDGFRの細胞外領域由来のセグメント)である。アンタゴニストの少なくとも一方は抗体でなく、又は換言すれば、アンタゴニストの少なくとも一方は細胞外トラップセグメントである。好ましくは、デュアルアンタゴニストは抗体アンタゴニストと1つの細胞外トラップセグメントアンタゴニストとを含む。かかるデュアルアンタゴニストにおいて、細胞外トラップセグメントは、好ましくは、任意選択でリンカーを介して抗体重鎖のN末端に融合される。抗体軽鎖は天然抗体と同じように抗体重鎖と複合体を形成する。かかるデュアルアンタゴニストは、好ましくは、デュアルアンタゴニストにコンジュゲートした半減期延長部分を含むコンジュゲートの形態で提供される。好ましくは、コンジュゲーションには、アンタゴニストに導入されているシステイン残基が使用される。より好ましくは、システイン残基はIgG1重鎖の347位又は443位である。半減期延長部分は双性イオンポリマーであることが好ましい。最も好ましくは双性イオンポリマーはホスホリルコリン含有ポリマーである。
cancer.Curr Opin Genet Dev.15:102-111を参照されたい。
al.2006.MARINA study group.Ranibizumab for neovascular age-related macular degeneration.N Engl J Med 355(14):1419-1431;Regillo CD,Brown DM,Abraham P,et al.2008.Randomized,double-masked,sham0controlloed trial of ranibizumab for neovacular age-related macular degeneration:PIER study year 1.Am J Ophthalmol.145:239-248。代わりに、抗VEGF療法薬の有効性又は治療利益の大半は、その抗透過特性に起因する。Zebrowski BK,Yano S,Liu W,et al.1999.Vascular endothelial growth factor levels and induction of permeability in malignant
pleural effusions.Clin Cancer Res 5:3364-3368。
of scar in the comparison of age-related macular degeneration in clinical settings.Retina 32:1480-1485。網膜下線維化形成は、黄斑系の永久的な機能不全を引き起こし得る。それは、光受容体、網膜色素上皮及び脈絡膜血管の破壊を引き起こす。Ishikawa K,Ram K,Hinton DR.2015.Molecular mechanisms of subretinal fibrosis in age-related macular degeneration.Eye Res.Mar 13、2015 Epub 1-7。抗VEGF療法は概して視
力を安定化させ、又は改善するが、治療後の視力低下の原因の1つとして瘢痕形成が特定されている。Cohen SY,Oubraham H,Uzzan J,et al.2012.Causes of unsuccessful ranibizumab treatment in exudative age-related macular degeneration in clinical settings.Retina 32:1480-1485。
D,Wang Z,Sarkar FH,et al.2008.Platelet-Derived Growth Factor-D Overexpression Contributes to Epithelial-Mesenchymal Transition of PC3 Prostate Cancer Cells.Stem Cells 26:1425-1435。PDGF-DDは眼で高発現する。Ray
S,Gao C,Wyatt K,et al.2005.Platelet-derived Frowth Factor D,Tissue-specific Expression in the Eye,and a Key Role in Control of Lens Epithelial Cell Proliferation.J Biol Chem.280:8494-8502。Kumar et al.(2010)は、病理的血管新生の間にPDGF-DD発現が上方制御されたこと、及びPDGF-DDシグナル伝達の阻害が脈絡膜及び網膜血管新生を低下させたことを見出した。
及ぼす増殖因子クラスの任意のメンバーを意味する。用語「PDGF」は、概して、反応性細胞型上の血小板由来増殖因子細胞表面受容体(即ち、PDGFR)の結合及び活性化を介してDNA合成及び有糸分裂誘発を誘導する増殖因子クラスのメンバーを指す。PDGFは、例えば:指向性の細胞遊走(走化性)及び細胞活性化;ホスホリパーゼ活性化;ホスファチジルイノシトール代謝回転及びプロスタグランジン代謝の増加;反応性細胞によるコラーゲン及びコラゲナーゼ合成の両方の刺激;マトリックス合成、サイトカイン産生、及びリポタンパク質取り込みを含めた細胞の代謝活性の改変;間接的に、PDGF受容体を欠く細胞における増殖反応の誘導;線維化及び強力な血管収縮活性を含めた、特定の生物学的効果を生じさせる。用語「PDGF」は、「PDGF」ポリペプチド及びその対応する「PDGF」コード遺伝子又は核酸の両方を含むことが意図される。
AM.2010.Platelet-Derived Growth Factor(PDGF)/PDGF Receptors(PDGFR)Axis as Target for Antitumor and Antiangiogenic Therapy.Pharmaceut.3:572-599。
];HuM4Ts.22[米国特許第5,882,644号明細書];又は1B3若しくは2C5[米国特許第7,740,850号明細書])、並びに抗PDGF BB、抗PDGF-DD、抗PDGF-BB及び抗PDGF-ABなどの抗PDGF抗体を含め、抗体もPDGFR-βのアンタゴニストとして使用することができる。
placental growth factor contributes to angiogenesis and plasma extravasation in
pathological conditions.Nat Med.7(5);575-583。VEGF-C及び-Dは、主として成人のリンパ管内皮細胞上に見られるVEGFR-3に高親和性で結合する。VEGF-C及び-Dは、リンパ管新生に関して役割を果たすと考えられている。
体VEGFRに結合するその能力、及び結果として起こる細胞応答、例えば血管新生及び細胞増殖を含めたVEGFの活性を部分的に又は完全に低減又は阻害する薬剤である。VEGFアンタゴニストには、VEGF又はVEGFR又はVEGFR細胞外トラップセグメントに特異的に結合する抗体が含まれる。
bevacizumab,an anti-VEGF antibody for treating cancer.Nat Rev Drug Discov.3(5):391-400を参照されたい。ベバシズマブは、特定の癌の治療用に承認されている。ベバシズマブ(DrugBank DB00112)の重鎖及び軽鎖のタンパク質配列を以下の図5に示し、CDRには下線を引く(配列番号2及び5も参照されたい)。
第3Ig様ドメインとからなる。Papadopoulos N,et al.2012.Binding and neutralization of vascular endothelial growth factor(VEGF)and related ligands by VEGF Trap,ranibizumab and bevacizumab.Angiogenesis 15:171-185。理論的には、アフリベルセプトはVEGF-Aのみならず、VEGF-B及びPGFにも結合し、それによってVEGFR-1とのそれらの相互作用をアンタゴナイズする。
インを有することが好ましい。また、軽鎖アイソタイプがκであることも好ましい。好ましいIgG1配列の定常領域を配列番号17に示す。軽鎖定常領域の配列は、好ましくは配列番号18に示される。
BB、PDGF-AB、PDGF-CC及びPDGF-DDの1つ以上に結合しているデュアルVEGF/PDGFアンタゴニストが提供される。好ましくは、細胞外トラップはPDGF-AB、PDGF-BB及びPDGF-DDと結合する。更により好ましくは、細胞外トラップは、PDGF-AB、PDGF-BB及びPDGF-DDが、PDGFR-αα、PDGFR-αβ、及びPDGFR-ββ受容体のいずれか1つに結合するのを阻害する。
た、VEGFR-1、VEGFR-2又はVEGFR-3などの、VEGFRの1つ以上の細胞外セグメントを含有するVEGFRトラップと、融合に含まれない抗PDGF抗体又はFab断片重鎖若しくは軽鎖とを有するデュアルVEGF/PDGFアンタゴニストである。
オン基はホスホリルコリンである。単量体は、好ましくは2-(アクリロイルオキシエチル)-2’-(トリメチルアンモニウムエチル)ホスフェートである。より好ましくは、単量体は2-(メタクリロイルオキシエチル)-2’-(トリメチルアンモニウムエチル)ホスフェート(HEMA-PC)である。
はレトロウイルスなどのウイルス系に由来するベクター、限定なしに、CMV、SV40、EF-1、UbC、RSV、ADV、BPV、及びβ-アクチンなどのプロモーターを使用する。
位で形成され、ここで少なくとも1つの単量体単位が双性イオン基を有する。好ましくは、双性イオン基はホスホリルコリンである。
a.1つ以上の単量体重合部位を有する開始剤と、アミン基を有する第1のリンカーとを提供するステップであって、開始剤がトリフルオロ酢酸塩である、ステップと、
b.重合に好適な1つ以上の単量体を提供するステップであって、単量体の少なくとも1
つが双性イオンである、ステップと、
c.単量体を開始剤と反応させて、各々が単量体重合部位に対応する1本以上のポリマーアームを形成し、アミン基を含む第1のリンカーを有する開始剤-ポリマーコンジュゲートを提供するステップと、
d.少なくとも第2及び第3の反応基を有する第2のリンカーを提供するステップと、
e.第2のリンカーの第2及び第3の反応基の一方を開始剤-ポリマーコンジュゲートの第1のリンカーのアミン基にカップリングして、カップリングステップで使用されなかった1つ以上の反応基を有するリンカー-開始剤-ポリマーコンジュゲートを提供するステップと、
f.1つ以上の機能性薬剤をリンカー-開始剤-ポリマー部分の未反応反応基の1つ以上にカップリングして、ポリマー-機能性薬剤コンジュゲートを提供するステップとを有し得る。
且つR9は、
を有する活性化エステルを含む。
水、緩衝生理食塩水(リン酸緩衝生理食塩水など)、デキストロース、リポソーム、水、グリセロール、エタノール及びそれらの組み合わせを挙げることができる。
Pearson,editors,Taylor&Francis(March 2006)などの文献に記載されるものを含め、種々の方法によって、例えば硝子体内への化合物の徐放を可能にする器具及び/又はデポーとして硝子体内に送達することができる。一例において、器具は、化合物を長時間放出するミニポンプ及び/又はマトリックス及び/又は受動拡散システム及び/又はカプセル化細胞の形態であってもよい(Intraocular Drug Delivery,Jaffe,Ashton,and Pearson,editors,Taylor&Francis(March 2006)。
的な手法が必要である。点眼薬及び軟膏はほとんど眼の裏側に浸透せず、血液眼関門が全身投与された薬物の眼組織への浸透を妨げる。従って、通常、AMD及びCNVなどの網膜疾患の治療に選択される薬物送達方法は、直接的な硝子体内注射である。硝子体内注射は、通常、患者の状態、並びに送達される薬物の特性及び半減期に応じた間隔を置いて繰り返される。
浸透圧を有することを意味する。等張性製剤は、概して、約250~400mOsmの浸透圧を有することになる。等張性は、例えば、蒸気圧型又は氷冷型浸透圧計を使用して計測することができる。
体扁平部硝子体切除術が挙げられる。痛みを伴う失明した眼を取り除くため、眼球摘出が要求されることもある。例えば、Christy NE,Sommer A.1979.Antibiotic prophylaxis of postoperative endophthalmitis.Ann Ophthalmol 11(8):1261-1265を参照されたい。
after Intravitreal Injections Med Inflam.928123。
元の試料中のエンドトキシン量を推定することができる。
以下の図7A、図7Bに示す配列を有するPDGFR-βトラップ-抗VEGF-A軽鎖/抗VEGF-A重鎖を構築した。PDGFR-GS10-抗VEGF-A軽鎖アミノ
酸1~282はヒトPDGFR-β(UniProtKB/Swiss-Prot:P09619.1)の33~314に対応し、その後にリンカー配列GGGGSGGGGS及びベバシズマブ軽鎖配列が続く。任意選択で、PDGFR-βセグメントと抗VEGFセグメントとの間にリンカーは使用しなくてもよい。或いはリンカーは、これらの2つのタンパク質の活性が最適となるような、GGGGSモチーフ×1、×2(上述のとおり)、×3、×4等であってもよい。G、GG、GGGS及びGGGES×1、×2、×3、×4等を含め、当業者に公知の他のリンカーモチーフも本発明において使用し得る。リンカーは上記の組み合わせであってもよい。図7Aの配列は配列番号19に示す。図7Bはベバシズマブ重鎖配列(配列番号2)を示す。ベバシズマブ軽鎖は、任意選択で、M4L突然変異(Kabat付番)を有する。ベバシズマブ重鎖は、任意選択で、以下の突然変異:T28D、N31H、H97Y、S100aT(Kabat付番)、L234A、L235A、G237A、Q347C及びL443C EU付番)の1つ以上を有する。
以下の図8A、図8Bに示す配列を有する別のPDGFR-βトラップ-抗VEGF-A軽鎖/抗VEGF-A重鎖を構築した。図8Aのアミノ酸1~282はヒトPDGFR-β(UniProtKB/Swiss-Prot:P09619.1)の33~314に対応し、その後にリンカー配列GG及びベバシズマブ軽鎖配列が続く。或いはリンカーは、これらの2つのタンパク質の活性が最適となるような、GGGGSモチーフ×1、×2、×3、×4等であってもよい。G、GG(上述のとおり)、GGGS及びGGGES×1、×2、×3、×4等を含め、他のリンカーモチーフも本発明において使用し得る。リンカーは上記の組み合わせであってもよい。図8Aのタンパク質配列は配列番号3に示す。図8Bはベバシズマブ重鎖配列(配列番号2)を示す。図8Aのベバシズマブ軽鎖は、任意選択で、M4L突然変異を有する。ベバシズマブ重鎖は、任意選択で、以下の突然変異:T28D、N31H、H97Y、S100aT(Kabat付番)、L234A、L235A、G237A、Q347C及びL443C(EU付番)の1つ以上を有する。
図9A、図9Bに示す配列を有する別のPDGFR-βトラップ-抗VEGF-A重鎖(野生型Fc)/抗VEGF-A軽鎖を構築した。図9Aのアミノ酸1~282はヒトPDGFR-β(UniProtKB/Swiss-Prot:P09619.1)の33~314に対応し、その後にリンカー配列GGGGSGGGGS、及び任意選択でQ347C又はL443C(EU付番)を有するベバシズマブ重鎖配列が続く。或いはリンカーは、これらの2つのタンパク質の活性が最適となるような、GGGGSモチーフ×1、×2(上述のとおり)、×3、×4等であってもよい。G、GG、GGGS及びGGGES×1、×2、×3、×4等を含め、他のリンカーモチーフも本発明において使用し得る。リンカーは上記の組み合わせであってもよい。図9Aのタンパク質配列は配列番号4に示す。図9Bのタンパク質はベバシズマブ軽鎖配列(配列番号5)である。ベバシズマブ軽鎖は、任意選択で、M4L突然変異を有する。ベバシズマブ重鎖は、任意選択で、以下の突然変異:T28D、N31H、H97Y、S100aT(Kabat付番)、L234A、L235A、G237A、Q347C及びL443C(EU付番)の1つ以上を有する。
以下の図10A、図10Bに示す配列を有する別のPDGFR-βトラップ-抗VEGF-A重鎖(野生型Fc)/抗VEGF-A軽鎖を構築した。図10Aのアミノ酸1~282はヒトPDGFR-β(UniProtKB/Swiss-Prot:P09619
.1)の33~314に対応し、その後にリンカー配列GG、及び任意選択でQ347C又はL443Cを有するベバシズマブ重鎖配列が続く。或いはリンカーは、これらの2つのタンパク質の活性が最適となるような、GGGGSモチーフ×1、×2、×3、×4等であってもよい。G、GG(上述のとおり)、GGGS及びGGGES×1、×2、×3、×4等を含め、他のリンカーモチーフも本発明において使用し得る。リンカーは上記の組み合わせであってもよい。図10Aのタンパク質配列は配列番号6に示す。図10Bのタンパク質はベバシズマブ軽鎖配列(配列番号5)である。ベバシズマブ軽鎖は、任意選択で、M4L突然変異を有する。ベバシズマブ重鎖は、任意選択で、以下の突然変異:T28D、N31H、H97Y、S100aT(Kabat付番)、L234A、L235A、G237A、Q347C及びL443C(EU付番)の1つ以上を有する。
以下の図11A、図11Bに示す配列を有する、抗VEGF-A重鎖がPDGFR-βトラップの上流又はN末端側にあるPDGFR-βトラップ-抗VEGF-A抗体コンストラクトを構築した。図11Aのアミノ酸1~451は、任意選択でQ347C又はL443Cを有するベバシズマブ重鎖配列に対応し、その後にリンカー配列GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGが続く。或いはリンカーは、これらの2つのタンパク質の活性が最適となるような、GGGGSモチーフ×1、×2(上述のとおり)、×3、×4等であってもよい。G、GG、GGGS及びGGGES×1、×2、×3、×4等を含め、他のリンカーモチーフも本発明において使用される。リンカーは上記の組み合わせであってもよい。リンカーの後ろには、ヒトPDGFR-β(UniProtKB/Swiss-Prot:P09619.1)のアミノ酸配列33~314が続く。図11Aのタンパク質配列は配列番号7に示す。図11Bはベバシズマブ軽鎖配列(配列番号5)を示す。ベバシズマブ軽鎖は、任意選択で、M4L突然変異を有する。ベバシズマブ重鎖は、任意選択で、以下の突然変異:T28D、N31H、H97Y、S100aT(Kabat付番)、L234A、L235A、G237A、Q347C及びL443C(EU付番)の1つ以上を有する。
以下の図12A、図12Bに示す配列を有する別のPDGFR-βトラップ-抗VEGF-A重鎖(Q347C)/抗VEGF-A軽鎖を構築した。図12Aのアミノ酸1~282はヒトPDGFR-β(UniProtKB/Swiss-Prot:P09619.1)の33~314に対応する。PDGFR配列の後には、10アミノ酸リンカーGGGGSGGGGSが直ちに続く。任意選択で、PDGFR-βセグメントと抗VEGFセグメントとの間にリンカーは使用しなくてもよい。リンカーは上記の組み合わせであってもよい。リンカーのセリン残基のカルボキシル末端には、以下のアミノ酸:T28D、N31H、H97Y、S100aT(Kabat付番)、L234A、L235A、G237A及びQ347C(EU付番)を含むベバシズマブ重鎖が結合している。図12Aのタンパク質配列は配列番号8に示す。図12Bのタンパク質はラニビズマブ軽鎖(M4Lを含むベバシズマブ)(配列番号12)である。
以下の図13A、図13Bに示す配列を有する別のPDGFR-βトラップ-抗VEGF-A重鎖(L443C))/抗VEGF-A軽鎖を構築した。図13Aのアミノ酸1~282はヒトPDGFR-β(UniProtKB/Swiss-Prot:P09619.1)の33~314に対応する。PDGFR配列の後には、10アミノ酸リンカーGGGGSGGGGSが直ちに続く。リンカーのセリン残基のカルボキシル末端には、以下
のアミノ酸:T28D、N31H、H97Y、S100aT(Kabat付番)、L234A、L235A、G237A及びL443C(EU付番)を含むベバシズマブ重鎖が結合している。TAF443軽鎖は、M4L変化(Kabat付番)を除いてベバシズマブと同じである。図13Aのタンパク質配列は配列番号9に示す。図13Bはラニビズマブ軽鎖(M4Lを含むベバシズマブ)(配列番号12)を示す。
以下の図14A、図14Bに示す配列を有するPDGFR-βトラップ-抗VEGF-A軽鎖/抗VEGF-A Fabを構築した。図14Aのアミノ酸1~282はヒトPDGFR-β(UniProtKB/Swiss-Prot:P09619.1)の33~314に対応し、その後にリンカー配列GGGGSGGGGS及びベバシズマブ軽鎖配列が続く。任意選択で、PDGFR-βセグメントと抗VEGFセグメントとの間にリンカーは使用しなくてもよい。或いはリンカーは、これらの2つのタンパク質の活性が最適となるような、GGGGSモチーフ×1、×2(上述のとおり)、×3、×4等であってもよい。G、GG、GGGS及びGGGES×1、×2、×3、×4等を含め、他のリンカーモチーフも本発明において使用し得る。リンカーは上記の組み合わせであってもよい。図14Aのタンパク質配列は配列番号1に示す。図14Bのタンパク質はベバシズマブFab(配列番号21)である。図14Aのベバシズマブ軽鎖は、任意選択で、M4L突然変異を有する。第2のタンパク質のベバシズマブFabは、任意選択で、以下の突然変異:T28D、N31H、H97Y、及びS100aTの1つ以上を有する。第2の鎖のベバシズマブFabは、任意選択で、半減期延長部分をコンジュゲートするためC末端に付加されたシステイン部分を有する。好ましくは、システイン部分はSGGGC又はCAAを介して付加される。或いは、SGGGC又はCAAは軽鎖のC末端に付加されてもよい。
以下の図15A、図15Bに示す配列を有するPDGFR-βトラップ-抗VEGF-A軽鎖/抗VEGF-A Fabを構築した。図15Aのアミノ酸1~282はヒトPDGFR-β(UniProtKB/Swiss-Prot:P09619.1)の33~314に対応し、その後にリンカー配列GG及びベバシズマブ軽鎖配列が続く。任意選択で、PDGFR-βセグメントと抗VEGFセグメントとの間にリンカーは使用しなくてもよい。或いはリンカーは、これらの2つのタンパク質の活性が最適となるような、GGGGSモチーフ×1、×2、×3、×4等であってもよい。G、GG(上記のとおり)、GGGS及びGGGES×1、×2、×3、×4等を含め、他のリンカーモチーフも本発明において使用し得る。リンカーは上記の組み合わせであってもよい。図15Aのタンパク質配列は配列番号3に示す。図15BはベバシズマブFab(配列番号21)の重鎖を示す。図15Aのベバシズマブ軽鎖は、任意選択で、M4L突然変異(Kabat付番)を有する。図15BのベバシズマブFabは、任意選択で、以下の突然変異:T28D、N31H、H97Y、及びS100aT(Kabat付番)の1つ以上を有する。図15BのベバシズマブFabは、任意選択で、半減期延長部分をコンジュゲートするためC末端に付加されたシステイン部分を有する。好ましくは、システイン部分はSGGGC又はCAAを介して付加される。或いは、SGGGC又はCAAは軽鎖のC末端に付加されてもよい。
以下の図16A、図16Bに示す配列を有する別のPDGFR-βトラップ-抗VEGF-A Fab/抗VEGF-A軽鎖を構築した。図16Aのアミノ酸1~282はヒト
PDGFR-β(UniProtKB/Swiss-Prot:P09619.1)の33~314に対応し、その後にリンカー配列GGGGSGGGGS及びベバシズマブFab配列が続く。任意選択で、PDGFR-βセグメントと抗VEGFセグメントとの間にリンカーは使用しなくてもよい。或いはリンカーは、これらの2つのタンパク質の活性が最適となるような、GGGGSモチーフ×1、×2(上記のとおり)、×3、×4等であってもよい。G、GG、GGGS及びGGGES×1、×2、×3、×4等を含め、他のリンカーモチーフも本発明において使用し得る。リンカーは上記の組み合わせであってもよい。図16Aのタンパク質配列は配列番号22に示す。図16Bはベバシズマブ軽鎖配列(配列番号5)を示す。ベバシズマブ軽鎖は、任意選択で、M4L突然変異を有する。ベバシズマブ重鎖は、任意選択で、以下の突然変異:T28D、N31H、H97Y、及びS100aT(Kabat付番)の1つ以上を有する。重鎖は、任意選択で、半減期延長部分をコンジュゲートするためC末端に付加されたシステイン部分を有する。好ましくは、システイン部分はSGGGC又はCAAを介して付加される。或いは、SGGGC又はCAAは軽鎖のC末端に付加されてもよい。
以下の図17A、図17Bに示す配列を有する別のPDGFR-βトラップ-抗VEGF-A Fab/抗VEGF-A軽鎖を構築した。図17Aのアミノ酸1~282はヒトPDGFR-β(UniProtKB/Swiss-Prot:P09619.1)の33~314に対応し、その後にリンカー配列GGGGSGGGGS及びベバシズマブFab配列が続く。任意選択で、PDGFR-βセグメントと抗VEGFセグメントとの間にリンカーは使用しなくてもよい。或いはリンカーは、これらの2つのタンパク質の活性が最適となるような、GGGGSモチーフ×1、×2(上記のとおり)、×3、×4等であってもよい。G、GG、GGGS及びGGGES×1、×2、×3、×4等を含め、他のリンカーモチーフも本発明において使用し得る。リンカーは上記の組み合わせであってもよい。図17Aのタンパク質配列は配列番号23に示す。図17Bはベバシズマブ軽鎖配列(配列番号5)を示す。ベバシズマブ軽鎖は、任意選択で、M4L突然変異を有する。ベバシズマブ重鎖は、任意選択で、以下の突然変異:T28D、N31H、H97Y、及びS100aT(Kabat付番)の1つ以上を有する。ベバシズマブFab重鎖は、任意選択で、半減期延長部分をコンジュゲートするためC末端に付加されたシステイン部分を有する。好ましくは、システイン部分はSGGGC又はCAAを介して付加される。或いは、SGGGC又はCAAは軽鎖のC末端に付加されてもよい。
以下の図18A、図18Bに示す配列を有する、抗VEGF-A重鎖がPDGFR-βトラップの上流又はN末端側にあるPDGFR-βトラップ-抗VEGF-A抗体コンストラクトを構築した。図18Aのアミノ酸1~231はベバシズマブFabに対応し、その後にリンカー配列GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGが続く。任意選択で、PDGFR-βセグメントと抗VEGFセグメントとの間にリンカーは使用しなくてもよい。或いはリンカーは、これらの2つのタンパク質の活性が最適となるような、GGGGSモチーフ×1、×2、×3、×4等であってもよい。G、GG、GGGS及びGGGES×1、×2、×3、×4等を含め、他のリンカーモチーフも本発明において使用し得る。リンカーは上記の組み合わせであってもよい。リンカーの後には、ヒトPDGFR-β(UniProtKB/Swiss-Prot:P09619.1)のアミノ酸配列33~314が続く。図18Aのタンパク質配列は配列番号24に示す。図18Bはベバシズマブ軽鎖配列(配列番号5)を示す。ベバシズマブ軽鎖は、任意選択で、M4L突然変異を有する。ベバシズマブ重鎖は、任意選択で、以下の突然変異:T28D、N31H、H97Y、及びS100aTの1つ以上を有する。図18Aのタンパク質は、任意選択で、
半減期延長部分をコンジュゲートするためC末端に付加されたシステイン部分を有する。好ましくは、システイン部分はSGGGC又はCAAを介して付加される。或いは、SGGGC又はCAAは図18Bの軽鎖のC末端に付加されてもよい。
以下の図19A、図19Bに示す配列を有する別のPDGFR-βトラップ-抗VEGF-A Fab/抗VEGF-A軽鎖を構築した。図19Aのアミノ酸1~282はヒトPDGFR-β(UniProtKB/Swiss-Prot:P09619.1)の33~314に対応する。PDGFR配列の後には、10アミノ酸リンカーGGGGSGGGGSが直ちに続く。任意選択で、PDGFR-βセグメントと抗VEGFセグメントとの間にリンカーは使用しなくてもよい。或いはリンカーは、これらの2つのタンパク質の活性が最適となるような、GGGGSモチーフ×1、×2(上記のとおり)、×3、×4等であってもよい。G、GG、GGGS及びGGGES×1、×2、×3、×4等を含め、他のリンカーモチーフも本発明において使用し得る。リンカーは上記の組み合わせであってもよい。リンカーのセリン残基のカルボキシル末端には、突然変異T28D、N31H、H97Y、及びS100aT(Kabat付番)を有するベバシズマブFabが結合している。図19Aのタンパク質配列は配列番号25に示す。図19Bのタンパク質はラニビズマブ軽鎖(M4Lを含むベバシズマブ)(配列番号12)である。図19Aのタンパク質は、任意選択で、半減期延長部分をコンジュゲートするためC末端に付加されたシステイン部分を有する。好ましくは、システイン部分はSGGGC又はCAAを介して付加される。或いは、SGGGC又はCAAは図19Bの軽鎖のC末端に付加されてもよい。
図20A、図20Bに示す配列を有する別のPDGFR-βトラップ-抗VEGF-A
Fab/抗VEGF-A軽鎖を構築した。図20Aのアミノ酸1~283はヒトPDGFR-β(UniProtKB/Swiss-Prot:P09619.1)の32~314に対応し、その後にベバシズマブ重鎖が続く。図20Aのタンパク質配列は配列番号26に示す。図20Bのタンパク質はベバシズマブ軽鎖配列(配列番号5)である。この例に示すとおり、PDGFR-βセグメントと抗VEGFセグメントとの間にリンカーは使用しなくてもよい。或いはリンカーは、これらの2つのタンパク質の活性が最適となるような、GGGGSモチーフ×1、×2、×3、×4等であってもよい。G、GG、GGGS及びGGGES×1、×2、×3、×4等を含め、他のリンカーモチーフも本発明において使用し得る。リンカーは上記の組み合わせであってもよい。ベバシズマブ軽鎖は、任意選択で、M4L突然変異を有する。ベバシズマブ重鎖は、任意選択で、以下の突然変異:T28D、N31H、H97Y、S100aT(Kabat付番)、Q347C及びL443C(EU付番)の1つ以上を有する。
以下の図21A、図21Bに示す配列を有する別のPDGFR-βトラップ(D2-D3)-抗VEGF-A重鎖/抗VEGF-A軽鎖を構築した。図21Aのアミノ酸1~190はヒトPDGFR-β(UniProtKB/Swiss-Prot:P09619.1)の125~314に対応し、その後にベバシズマブ重鎖が続く。図21Aのタンパク質配列は配列番号27に示す。この例に示すとおり、PDGFR-βセグメントと抗VEGFセグメントとの間にリンカーは使用しなくてもよい。或いはリンカーは、これらの2つのタンパク質の活性が最適となるような、GGGGSモチーフ×1、×2、×3、×4等であってもよい。G、GG、GGGS及びGGGES×1、×2、×3、×4等を含
め、他のリンカーモチーフも本発明において使用し得る。リンカーは上記の組み合わせであってもよい。図21Bはベバシズマブ軽鎖配列(配列番号5)を示す。ベバシズマブ軽鎖は、任意選択で、M4L突然変異を有する。ベバシズマブ重鎖は、任意選択で、以下の突然変異:T28D、N31H、H97Y、S100aT(Kabat付番)、Q347C及びL443C(Eu付番)の1つ以上を有する。
図22A、図22Bに示す配列を有する別のPDGFR-βトラップ(D2-D3)-抗VEGF-A Fab/抗VEGF-A軽鎖を構築した。図22Aのアミノ酸1~190はヒトPDGFR-β(UniProtKB/Swiss-Prot:P09619.1)の125~314に対応し、その後にベバシズマブFabが続く。この例に示すとおり、PDGFR-βセグメントと抗VEGFセグメントとの間にリンカーは使用しなくてもよい。或いはリンカーは、これらの2つのタンパク質の活性が最適となるような、GGGGSモチーフ×1、×2、×3、×4等であってもよい。GGGGSGGGGSリンカーが特に好ましい。G、GG、GGGS及びGGGES×1、×2、×3、×4等を含め、他のリンカーモチーフも本発明において使用し得る。リンカーは上記の組み合わせであってもよい。図22Aの配列は配列番号28に示す。図22Bはベバシズマブ軽鎖配列(配列番号5)を示す。ベバシズマブ軽鎖は、任意選択で、M4L突然変異を有する。ベバシズマブ重鎖は、任意選択で、以下の突然変異:T28D、N31H、H97Y、及びS100aT(Kabat付番)の1つ以上を有する。図22AのベバシズマブFabは、任意選択で、半減期延長部分をコンジュゲートするためC末端に付加されたシステイン部分を有する。好ましくは、システイン部分はSGGGC又はCAAを介して付加される。或いは、SGGGC又はCAAは図22Bの軽鎖のC末端に付加されてもよい。
以下の図23A、図23Bに示す配列を有する別のPDGFR-βトラップ(D2-D3)-6xGS-抗VEGF-A Fab/抗VEGF-A軽鎖を構築した。図23Aのアミノ酸1~190はヒトPDGFR-β(UniProtKB/Swiss-Prot:P09619.1)の125~314に対応し、その後にリンカーGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS及び次にベバシズマブFabが続く。任意選択で、PDGFR-βセグメントと抗VEGFセグメントとの間にリンカーは使用しなくてもよい。或いはリンカーは、これらの2つのタンパク質の活性が最適となるような、GGGGSモチーフ×1、×2、×3、×4等であってもよい。G、GG、GGGS及びGGGES×1、×2、×3、×4等を含め、当業者に公知の他のリンカーモチーフも本発明において使用し得る。リンカーは上記の組み合わせであってもよい。図23Aのタンパク質配列は配列番号29に示す。図23Bはベバシズマブ軽鎖配列(配列番号5)を示す。ベバシズマブ軽鎖は、任意選択で、M4L突然変異を有する。ベバシズマブ重鎖は、任意選択で、以下の突然変異:T28D、N31H、H97Y、及びS100aT(Kabat付番)の1つ以上を有する。ベバシズマブFab重鎖は、任意選択で、半減期延長部分をコンジュゲートするためC末端に付加されたシステイン部分を有する。好ましくは、システイン部分はSGGGC又はCAAを介して付加される。或いは、SGGGC又はCAAは軽鎖のC末端に付加されてもよい。
以下の図24A、図24Bに示す配列を有する別の抗VEGF-A Fab-6xGS-PDGFR-βトラップ(D2-D3)/抗VEGF-A軽鎖を構築した。図24Aのアミノ酸1~190はヒトPDGFR-β(UniProtKB/Swiss-Prot
:P09619.1)の125~314に対応し、その後にリンカーGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS及び次にベバシズマブFabが続く。任意選択で、PDGFR-βセグメントと抗VEGFセグメントとの間にリンカーは使用しなくてもよい。或いはリンカーは、これらの2つのタンパク質の活性が最適となるような、GGGGSモチーフ×1、×2、×3、×4等であってもよい。G、GG、GGGS及びGGGES×1、×2、×3、×4等を含め、他のリンカーモチーフも本発明において使用し得る。リンカーは上記の組み合わせであってもよい。図24Aの配列は配列番号29に示す。図24Bはベバシズマブ軽鎖配列(配列番号5)を示す。図24Bのベバシズマブ軽鎖は、任意選択で、M4L突然変異を有する。第1のタンパク質のベバシズマブ重鎖は、任意選択で、以下の突然変異:T28D、N31H、H97Y、及びS100aT(Kabat付番)の1つ以上を有する。図24AのベバシズマブFabは、任意選択で、半減期延長部分をコンジュゲートするためC末端に付加されたシステイン部分を有する。好ましくは、システイン部分はSGGGC又はCAAを介して付加される。或いは、SGGGC又はCAAは軽鎖のC末端に付加されてもよい。
以下の図25A、図25Bに示す配列を有する別の抗VEGF-A Fab-6xGS-PDGFR-β(D2-D3)/抗VEGF-A軽鎖を構築した。図25Aのアミノ酸1~231はベバシズマブFabに対応し、その後にリンカーGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS及び次にヒトPDGFR-β(UniProtKB/Swiss-Prot:P09619.1)の125~314が続く。任意選択で、PDGFR-βセグメントと抗VEGFセグメントとの間にリンカーは使用しなくてもよい。或いはリンカーは、これらの2つのタンパク質の活性が最適となるような、GGGGSモチーフ×1、×2、×3、×4等であってもよい。G、GG、GGGS及びGGGES×1、×2、×3、×4等を含め、他のリンカーモチーフも本発明において使用し得る。リンカーは上記の組み合わせであってもよい。図25Aの配列は配列番号30に示す。図25Bはベバシズマブ軽鎖配列(配列番号5)を示す。ベバシズマブ軽鎖は、任意選択で、M4L突然変異を有する。ベバシズマブ重鎖は、任意選択で、以下の突然変異:T28D、N31H、H97Y、及びS100aT(Kabat付番)の1つ以上を有する。図25AのPDGFR-βは、任意選択で、半減期延長部分をコンジュゲートするためC末端に付加されたシステイン部分を有する。好ましくは、システイン部分はSGGGC又はCAAを介して付加される。或いは、SGGGC又はCAAは軽鎖のC末端に付加されてもよい。
TAF443重鎖及び軽鎖を発現プラスミドにクローニングし、CHO細胞にトランスフェクトした。細胞を適切な培地で成長させて回収した。TAF443は以下のとおり精製した。配列番号31及び32を発現するCHO細胞からの10L培養培地を5%(v/v)1.1M HEPES、0.22M EDTA、pH6.7又は10%0.55M Hepes、0.11M EDTA、5.5%Triton X-100、pH6.7で調整し、50mMトリス、150mM NaCl、pH7.5(5CV)で平衡化したMab Select Sure樹脂が充填された167/400mlプロテインAカラム(2ラン)にロードした。カラムを50mMトリス、150mM NaCl、pH7.5(2CV)、50mMトリス、0.5M CaCl2、pH7.5(5CV)、次に10mMトリス、10mM NaCl、pH7.5(3CV)で洗浄してから、150mMグリシン、40mM NaCl、pH3.5(4CV)を使用してタンパク質を溶出させた。画分をプールし、2Mグリシン、pH2.7を使用してpH3.5に調整し、次に2M
HEPES、pH8.0を使用してpH7に中和した。プロテインAプールを、50mM Hepes、65mM NaCl、pH7.0(5CV)で平衡化した274ml
TMAEカラムにロードした。このカラムを50mM Hepes、65mM NaCl、pH7.0(3CV)で洗浄し、次に50mMトリス、200mM NaCl、pH7.5(5CV)で溶出させた。溶出画分をプールし、PBS-CMF、pH7.2で平衡化した1150mL Sephadex G-25 Coarseカラムで緩衝液交換した。このプールをろ過し、30k MWCO VivaFlow200で>5mg/mlに濃縮した。濃縮したタンパク質を0.22umフィルタでろ過し、次にSDS-PAGE、分析的SEC、O.D.280/320、エンドトキシンLALアッセイ、プロテインA ELISA、IEF、及び凍結融解分析によって特徴付けた。
ショ糖などの賦形剤の存在下で、TAF二機能性分子をpH4.5~7.5の範囲の標準製剤化緩衝液系列中50~85mg/mlに濃縮した。これらの試料のアリコートを室温(RT)及び4℃で6週間にわたって保存し、時間0及びその後は後続の各週に試料を採取して、凝集した材料のパーセンテージを分析的SECによって計測した。以下の表に、TAF443の凝集に対するpHの効果を見ることができる。
TAFwt、TAF443及びTAF347のDNAコンストラクトをCHO-K1 SV SSIにトランスフェクトした:3プール/コンストラクト。細胞株のほとんどで、正常な3週間の回復が認められた。しかしながら、TAFwt及びTAF347細胞株は他の細胞株に約1週間の遅れを取った。プールの樹立後、ほとんどについては4日目及びTAFwt及びTAF347については3日目に、馴化培地試料をOctetにかけた。TAFwt及びTAF347の3日馴化培地はOctetによって約7mg/mlを示した。4日馴化培地は、TAF443について約21mg/mlを示した。プール間に僅かな差異が観察され、それらのプールを使用してプールのプールを作製し、それをタンパク質産生に進めた。
TAFのPDGFRセグメントは7個の推定グリコシル化部位を有する。このタンパク質は、SEC-MALS計測から、高度にグリコシル化しているものと思われる。
PBS、pH7.2中TAFwt、TAF443及びTAF347を熱安定性プロファ
イルにかけた。各タンパク質が3つのピークを有した(データは示さず)。ピークの相対位置を以下の表に示す。
熱に応じたこれらの3つのTAFタンパク質の溶液中の凝集物の割合を調べた(データは示さず)。タンパク質の各々(TAFwt、TAF347及びTAF443)の溶液は、約54℃を始点として凝集を示し始めた。タンパク質の各々についての凝集物の割合は、温度の増加に伴い急激に増加した。64℃で、TAFタンパク質の各々の略40%が凝集物を成した。凝集は最も低いTmで現れ始め、一見したところタンパク質のPDGFR部分のアンフォールディングに対応していることが注記される。
TAF443の熱安定性を、以下の表に示すとおりの様々なpHで調べた。非PBS緩衝液中では、4つの熱変性ピークが見られる。
表面プラズモン共鳴(SPR)を用いて、TAF-WT、TAF-347、TAF-443、TAF443-6A250K、及びTAF443-3A250KデュアルPDGF/VEGFアンタゴニスト変異体に対する組換えヒトPDGF-BB(PeproTech、100-14B)の結合動態を特徴付けた。初めに、製造者のプロトコルに従い、CM5カルボキシメチル化デキストランで被覆されたセンサーチップの4つ全てのフローセルに、約10,000共鳴単位(RU)の密度となるよう抗ヒトIgG抗体(GE Healthcare、BR-1008-39)を共有結合的にアミンカップリングした。各PDGF/VEGF変異体を約150RUのレベルまで捕捉した。PDGF分析のランニング及び試料緩衝液は、HBS-EP+300mM NaCl(10mM 4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸(HEPES)pH7.4、300mM NaCl、3mMエチレンジアミン四酢酸(EDTA)、0.05%(v/v)Tween-20)であった。1nM~0.125nMの濃度範囲のPDGF-BBの2倍段階希釈系列を110秒の会合について100μL/分の流量で注入し、解離は300から2700秒まで異なった。次に表面を3M MgCl2の30秒パルス、イオン再生緩衝液(0.46M KSCN、1.83M MgCl2、0.92M尿素、及び1.83Mグアニジン-HCl pH7.4、Andersson et al.,Analytical Chemistry,1999)の30秒パルスで再生し、次にHBS-EP+300mM NaClランニング緩衝液の30秒パルスで平衡化した。
MgCl2の30秒パルス、イオン再生緩衝液(0.46M KSCN、1.83M MgCl2、0.92M尿素、及び1.83Mグアニジン-HCl pH7.4、Andersson et al.,Analytical Chemistry,1999)の30秒パルスで再生し、次にHBS-EP+150mM NaClランニング緩衝液の30秒パルスで平衡化した。
TAF443システイン残基は、典型的には細胞培養培地中の化学物質によって「キャッピングされている」か、又は酸化されており、コンジュゲーションに利用することができない。これに関して、精製TAF443(OG1321)をデキャッピング(即ち還元)手順に供してキャップを除去し、遊離した(即ちCys-Cysジスルフィド結合に関与しないもの)システイン残基によるポリマーのマレイミド官能基とのコンジュゲーションを可能にする。デキャッピングはTAFタンパク質を30倍モル過剰の還元剤TCEP(3,3’,3’’-ホスファントリイルトリプロパン酸)と25℃で1時間混合することによって行われる。TCEPとの還元反応はSDS-PAGEによってモニタする。非変性TAFは約250kDa(この重量の約40kDaは炭水化物である)にシングルバンドとして泳動する。完全に変性したところで、このシングル250kDaバンドを軽鎖及び重鎖に対応するバンドに変換する。変性後、Pellion XL限外ろ過カセットを使用して、20mMトリス pH7.5、150mM NaCl、0.5mM TCEP緩衝液でUFdFによりTAFタンパク質を洗浄して、キャップを除去した。次に同じUFdFセットアップで、20mMトリス pH7.5、150mM NaClによってTCEP試薬を除去した。還元したTAFは空気(周囲酸素)を使用してリフォールディングさせ、これもアッセイとしてSDS-PAGEによって追跡した。
pH7.5トリス緩衝液中の15倍過剰のポリマーを使用してデキャッピングした後、OG1321とも称されるTAF443をポリマーOG1802(下記参照)にコンジュゲートして、図26に示すOG1448を作製した(図26は、バイオポリマーOG1802にコンジュゲートしたTAF443であるOG1448の化学構造を示す)。TAF443は、この図に示される分子の右端にあり、システイン443残基を介して5員環にコンジュゲートしている。コンジュゲーションはSDS-PAGEによってモニタし、略完了まで至らせた。コンジュゲートは陰イオン交換クロマトグラフィーによって精製し、UF/DFによって製剤化緩衝液中に緩衝液交換した。
イミドとの反応に利用できない。ステップB:次に還元したTAFをOG1802にコンジュゲートする。ステップC:次にコンジュゲートしたTAF(OG1448)をクロマトグラフィーによって非コンジュゲートTAF及びポリマーと分離する。これらの3つの概略ステップは、以下の表にある7つの細かいステップに分けられる。
上記に記載したとおりTAF443をOG1802とコンジュゲートした後、OG1448を以下のとおり精製した。上記に記載したとおりTAF443をOG1802とコンジュゲートした後、OG1448を以下のとおり精製した。約3:1の樹脂:コンジュゲート比に従い2×400mlのMacrocap Qカラムを充填した。このカラムを5MのNaClでフラッシュし、20mMトリス pH7.5、20mM NaCl(平衡化緩衝液)でサイホン処理によって平衡化した。コンジュゲーション反応混合物を20mMトリス pH7.5で希釈し、カラムにロードした。次にカラムを平衡化緩衝液でチェースし、20mMトリス pH7.5、50mM NaCl(Wash 1)、次に20mMトリス pH7.5、100mM NaCl(Wash 2)で洗浄した。150mM、200mM、220mM、250mM、300mM、及び500mM NaClの段階勾配として、20mMトリス pH7.5で溶出を行った。カラムのフロースルー、洗浄液、及び溶出液を全て、SDS-PAGE及びAEX分析用に清浄なボトルに回収した。コンジュゲートを含有する溶出画分をプールし、30kD MWCO及びPES膜を備えたPellicon XL TFFカセットを使用して濃縮した。次に同じTFFカセットを使用して、濃縮したプールを1×PBS pH7.4緩衝液で約100倍の緩衝液交換を行い、VIVACELL 100スピンコンセントレーターに移して、目標濃度(約30mg/ml)に達するまで更に濃縮した。ロットリリースのため、最終的なコンジュゲートを0.2μm PESシリンジフィルタでろ過した。
最終タンパク質(OG1321)又はコンジュゲート(OG1448)のエンドトキシンレベルを低減するため、タンパク質又はコンジュゲートのいずれについても、陰イオン交換の代わりに陽イオン交換を利用する精製手順を用い得る。例えば、OG1321の精製に関する上記の手順では、陰イオン交換TMAE樹脂が用いられる。TMAE樹脂の代わりに、陽イオン交換樹脂CEXを使用し得る。しかしながら、CEX残基を使用するためには、対象のタンパク質を含有する溶液のpHをタンパク質のpI未満に下げなければならない。OG1321について、プロテインAカラム後のタンパク質溶液のpHはpH3.5にまで下がる。OG1321はpH5でPoros XSカラムに結合する。次に、Porox XS(CEX)を使用してOG1321を結合し、溶出させることができる。
OG1802の第1の合成経路は以下のとおりである。初めに、図27に示す構造を有するTFA/アミン塩開始剤(化合物L)を以下のとおり合成した。
1H NMR(400MHz DMSO-d6):=1.36(s,9H,OCCH3),1.90(s,54H,CC(CH3)2Br),2.31(t,J=7.2Hz,6H,CCH2CH2NH),2.98(d,J=5.6Hz,6H,CCH2NH),3.04(q,J=6.0Hz,2H,OCH2CH2NH),3.18(s,2H,OCH2C),3.3-3.37(m,8H,CH2),3.47-3.55(m,12H,CH2),3.58(s,6H,OCH2C),3.87(s,6H,O=CCH2O),4.27(s,18H,CCH2OC=O),6.74(br t,1H,CH2NHC=O),7.69(t,J=6.8Hz,3H,CH2NHC=O),7.84(t,J=6.0Hz,3H,CH2NHC=O).
LC-MS(ES,m/z):[(M+2H-boc)/2]+(C84H136Br9N7O33+2H-Boc)/2の計算値=1196.6;実測値1196.6
ロ酢酸(5mL)とを添加した。この反応物を室温で30分間撹拌した。反応物を真空下で濃縮した。反応物をジクロロメタン(10mL)を使用して希釈し、真空下で濃縮した。アセトニトリル(10mL)を使用して残渣を溶解し、シリンジフィルタ(Acrodisc CR25、PN 4225T)でろ過して、調製用HPLCカラムにロードし、水中60%アセトニトリル(0.1%トリフルオロ酢酸含有)~最大98%アセトニトリル(0.1%トリフルオロ酢酸含有)で溶出させた。産物を含有するチューブをプールし、真空下で濃縮し、凍結して凍結乾燥器に置いた。これにより、990mg(0.4mmol、2ステップで50%)の化合物Lが白色粉末として得られた。
1H NMR(400MHz DMSO-d6): =1.90(s,54H,CC(CH3)2Br),2.31(t,J=7.2Hz,6H,CCH2CH2NH),2.97-3.0(m,8H,CCH2NH及びOCH2CH2NH),3.17(s,2H,OCH2C),3.3(q,6H,CH2CH2NHC=O),3.4-3.59(m,20H,CH2),3.87(s,6H,O=CCH2O),4.27(s,18H,CCH2OC=O),7.69-7.84(m,9H,両方ともCH2NHC=O及びNH3+).
LC-MS(ES,m/z):[(M+2H)/2]+(C84H136Br9N7O33+2H)/2の計算値=1196.6;実測値1197.4
ルにポリマーR3707(Lを開始剤として使用して作られる750kDaポリマー、515mg)を入れ、エタノール(4.0mL)を使用して40分間の撹拌後に溶解させた。これに、アセトニトリル(22uL)中4-メチルモルホリンの1%溶液を添加した。別個のバイアルにおいて、アセトニトリル(1.0mL)中にMal-PEG4-PFP(1.97mg)を溶解させて、この溶液を室温で約2分間かけてポリマー溶液に添加し、得られた溶液を一晩撹拌した。この反応物を0.1%トリフルオロ酢酸水溶液(2mL)(pH約5)、続いて水(約12mL)で希釈し、シリンジフィルタ(Acrodisc Supor、PN 4612)でろ過し、3つのAmicon遠心膜透析管(30,000mwco)に均等に入れた。この管を希釈し、水(各約5mL)と混合し、遠心機(rpm 3200)に25分間置いた。分析のためろ液を取り出す一方で、保持液を希釈し、水(約10mL/管)と混合する。この遠心手順を更に5回繰り返した後、保持液を取り出してバイアルに入れる。Amicon膜管を水(各管2×約2mL)でリンスし、これを保持液と合わせた。保持溶液をシリンジフィルタ(Acrodisc Supor、PN 4612)でろ過し、凍結して凍結乾燥器に置いた。これにより485mgが白色粉末として得られた。
OG1448(及びOG1321)のその意図される標的に対する結合親和性をBiacoreアッセイで判定した。結合試験は、GLM(Proteon)及びCM4(Biacore)センサーチップを備えた、且つランニング緩衝液(10mM HEPES、150mM NaCl、0.005%Tween-20、0.2mg/ml BSA)で平衡化したBioRad Proteon XPR36及びBiacore 2000光学バイオセンサーを使用して、25℃及び37℃で実施した。OG1448、OG1321、ベバシズマブ、アフリベルセプト及び抗PDGFはアミンカップリングによってセンサー表面に固定化した。
抗VEGF活性に関するその潜在的効力の尺度として、VEGFA-165に対するTAF(OG1448及びOG1321)の結合活性を競合的結合アッセイで判定し、ここでは種々の濃度のTAFを、rhVEGFとの結合に関して固定化したrhVEGFRと競合させた。固定化したVEGFRが結合したrhVEGFA-165をELISAによって決定した(データは示さず)。
OG1448がrhPDGF-BBの存在下でrhVEGFA-165に結合することができるかどうか、即ち、TAFの受容体デコイに結合するrhPDGF-BBが、rhVEGFA-165に結合するTAFの能力を阻害するかどうかを判定するため、実施例27と同様の結合試験を、但し様々な濃度のrhPDGF-BBの存在下で実施した。
抗PDGF活性のその潜在的効力の尺度として、rhPDGF-BBに対するTAF(OG1448及びOG1321)の結合活性を競合的結合アッセイで判定し、ここでは種々の濃度のTAFをrhPDGFBBとの結合に関して固定化したPDGFRと競合させた。固定化したPDGFRに結合したrhPDGF-BBをELISAアッセイによって決定した。
OG1448がrhVEGFA-165の存在下でrhPDGF-BBに結合することができるかどうかを判定するため、PDGFに関する結合試験(実施例29のとおり)の同様の競合阻害を、rhVEGFA-165の存在下及び非存在下で実施した。
内皮細胞増殖は、血管新生、従って新生血管AMDの発病において極めて重要な段階である。OG1448が初代ヒト網膜微小血管内皮細胞に対するVEGFの増殖作用をアンタゴナイズする能力は、新生血管AMDの治療におけるその生物活性の尺度であり得る。
周皮細胞遊走及び増殖は血管新生において決定的に重要なイベントであり、従って新生血管AMDの発病において重要な役割を果たす。TAF(OG1448及びOG1321)がヒト脳周皮細胞に対するPDGFの増殖作用をアンタゴナイズする能力は、新生血管
AMDの治療におけるその有効性の尺度であり得る。
内皮細胞及び周皮細胞が血管に共存し、新生血管AMDにおいて決定的に重要なイベントである血管新生の間に共に増殖及び遊走するインビボ条件を模倣するため、この複雑なモデルにおいてOG1448が血管新生を阻害する能力を判定する目的で、HRMVECとHMPとの三次元共培養を樹立した。
十分に認められている霊長類CNVモデルであるカニクイザルにおけるレーザー誘発性脈絡膜血管新生(CNV)モデルを使用して、OG1448のインビボ有効性を判定した。例えば、Nork TM,Dubielzig RR,Christian BJ,et al.2011.Prevention of experimental choroidal neovascularization and resolution
of active lesions by VEGF trap in nonhuman primates.Arch Ophthalmol.129:1042-1052;Lloyd RL,Harris J,Wadhwa S,Chambers W.2008.Food and Drug Administration approval process for ophthalmic drugs in the U.S.Curr Opin Ophthalmol.19:190-194(これらは両方とも本明細書によって参照により援用される)を参照されたい。このモデルでは、ブルッフ膜破損所見のあるサル眼の黄斑部における脈絡網膜複合体にレーザー病変が設けられる。2~3週間で脈絡膜血管新生が生じる。様々な時点で、フルオレセイン血管造影を用いて、原発病変を越えるフルオレセイン漏出を示す臨床的に関連性のある病変(グレードIV)を判定する。このCNVモデルはCNV病変の研究に広く用いられており、現在承認されているあらゆる新生血管AMD治療のベンチマークとして使用されている。このモデルでは、新生血管AMDに対する承認済みの抗VEGF剤は全て、臨床的に関連性のあるグレードIV病変からの漏出の阻害に有効である。この試験はCovance、Ma
dison、WIで行われた。
n J(2006)The R Package geepack for Generalized Estimating Equations Journal of Statistical Software 15,2,pp1-11)、介入レジメンにおいてOG1448に対する用量依存的反応が観察された。0.5mg/眼では、媒体対照と比較したグレードIV病変のパーセント変化率の差が示すとおり、効果は顕著であった(0.5mg治療群7対PBS注射プラセボ群5;p=0.019、GEE)。2.4mg/眼のOG1448(ベバシズマブ又はアフリベルセプトの治療用量内のモル当量の用量)では、43日目に、PBS対照群のCNVの27%の低下と比較して、グレードIV病変のパーセント変化率の75%の低下(2.4mg治療群9対PBS注射プラセボ群5;p=0.0007、GEE)が観察された。サルCNVモデルにおける様々な実験からのデータを図41に示す。
雄性ニュージーランド赤白F1交雑有色ウサギを使用して、125I-OG1448を用いた組織分布及び薬物動態試験を実施した。要約すれば、この試験は、ウサギにおいてOG1448の16.1日の硝子体半減期を示し、これはアフリベルセプトについて報告されている半減期(4.5日)の約3倍及びラニビズマブの半減期(2.9日)の5倍(Bakri SJ,Snyder MR,Reid JM et al.2007.Pharmacokinetics of Intravitreal Ranibizumab [Lucentis].Ophthalmology 114:2179-2182)であり、血漿曝露は僅か(硝子体曝露の約0.2%)で、血漿中半減期は6.5日であった(アフリベルセプトは6.5日と報告されている)(Struble C,Koehler-Stec E,Zimmer E,and Tu W.2008.Pharmacokinetics and ocular tissue penetration
of VEGF Trap after intravitreal injections in rabbits.EVER;Portorz,Slovenia)。
OG1448に関する2つのパイロット非GLP単回投与眼及び全身忍容性試験をCovanceで実施した:(i)有色ウサギにおける単回投与57日間硝子体内又は静脈内忍容性試験及び(ii)カニクイザルにおける硝子体内(58日間試験)又は静脈内(28日間試験)投与後の単回投与忍容性試験。
本試験のこの部分の目的は、カニクイザルにおける硝子体内投与又は静脈内投与後のOG1448の忍容性を判定することであった。
OG1786は、OG1802の合成において前駆体として使用されるポリマー合成用の9アーム開始剤である。各アームの末端は、ATRP下で重合を開始させることが可能な2-ブロモイソ酪酸塩である。OG1786は、図30に示されるとおり、トリフルオロ酢酸(TFA)の塩である。OG1786は以下のとおり調製される。初めに、OG1550をTFA(トリフルオロ酢酸)と反応させて、図31に示すとおりのOG1546を生成する。
これは15mlの0.5M クエン酸及び100ml水の混合物であった)で洗浄し、水相はAQ2(pH約3)であった。有機相を水/飽和塩化ナトリウム(100ml/25ml)で洗浄し、水相はAQ3(pH約3)であった。最後に有機相を飽和塩化ナトリウム(100ml)で洗浄し、水相はAQ4であった。いずれのAQ画分も、有意な生成物を含有しなかった(データは提供せず)。有機相により、LCMSで生成物が確認された。生成物を硫酸ナトリウム(80g)で乾燥させて、ろ過し、酢酸イソプロピル(75ml)でリンスし、ロータリーエバポレータで濃縮すると、黄褐色の油(33.2g)となった。この粗生成物を窒素下で一晩保存した。
ml)及びT3P溶液(上記参照)(7.9ml)を入れた。この溶液を室温で30分間撹拌し、次に氷水浴中で冷却し、アセトニトリル(70ml)中OG1405(上記からの粗油、34.5g)の溶液を添加した。この混合物を室温に加温した。20分後、反応物を氷水浴中で冷却し、水(5ml)でクエンチした。次にこの混合物を、容積が半分になるまでロータリーエバポレータを使用して真空下で濃縮した。LCMS用に試料を採取した。
化合物OG1802をTAF443のスルフヒドリル基にコンジュゲートしてOG1448を作製する。ポリマーOG1801は、初めに開始剤OG1786から作られる。OG1801はアミン官能基を有し、これはポリマー合成中の安定性が(マレイミドと比べて)高い。ポリマーOG1801の合成には改良型のATRPを使用し、ここではCu(II)に金属銅を加えることによってインサイチュで銅種(Cu(I))を生成させる。この反応に必要な出発物質及び試薬は、単量体(HEMA-PC)OG47のバッチ入力、並びに目標分子量(MW)に基づき計算する。
料を採取し、アルゴン下でフラスコに開始剤溶液を添加した。時間と共に反応液が暗褐色になり、濃厚になり始めた。この系を密封し、2日間反応を生じさせておいた。
反応に必要な出発物質及び試薬は、OG1801のバッチ入力に基づき計算する。リンカーは3-マレイミドプロピオン酸、NHSエステルである。30mlの0.5Mリン酸ナトリウム(WFI中、pH8)を50gのポリマー溶液(約150mg/mL)に添加した。1分間撹拌させておいた。pHはpH試験紙によるときに8.0であった。204.8mgのリンカーを秤量し、DMF 4.1mL中に溶解して50mg/mLのストック溶液とした。激しく撹拌しながらポリマー溶液にリンカー溶液を毎分815uLで滴下して添加した。5分間かけて4095uLのリンカー溶液を添加した。室温で30分間反応させた。最終pHが5に達するように20mLの5%酢酸で反応をクエンチした。1L真空フィルタ(0.2um)を使用してこの溶液をろ過した。
1.7mM KH2PO4;5mM Na2HPO4;150mM NaClを使用して滅菌注射用水中にOG1448の27.2mg/ml及び44.5mg/ml溶液を調製した。容積に応じてMillipore Pellicon XL TFFカートリッジ(カタログ番号PXB030A50、EMD Millipore)、30kD MWCO又はVIVACELL 100スピンコンセントレーター(カタログ番号VC1022、Sartorius)、30kD MWCOにより、OG1448コンジュゲートを濃縮した。上記に記載する有効性実験用のサルにおいて30ゲージ(G)の1/2インチ針で27.2mg/mlのTAF溶液を硝子体内注射した。OG1448を針に押し通すのに、過度の圧力は不要であった。実験室で易注入性について44.5mg/ml溶液を試験し、これも過度の圧力なしに女性の操作者が針に押し通すことが可能であった。
PBS中44.5mg/ml、pH7.4のOG1448基準ロットR5606(上記に記載したとおり)を使用して、進行中の安定性試験を実施した。この試験には3つの温度を選択した:室温(RT)、4℃及び-20℃。試料抜き取り頻度は、0、14、28、91、181及び362日である。試料は、未反応の及び捕捉されたタンパク質、並びに可能性のある凝集について、SDS-PAGE及び分析的AE-HPLCによって判定した。AE-HPLCによるとき、OG1448は3つ全ての温度で最長6ヵ月まで、時点0のレベルと同程度である5%未満のタンパク質不純物を示すことが観察された(データは示さず)。この試験は進行中である。
HEA-PCポリマーを以下に記載するとおり合成した。HEA-PC(2-(アクリロイルオキシ)エチル-2-(トリメチルアンモニウム)エチルホスフェート)(これは、上記に記載したメタクリレートHEMA-PCとは対照的に、アクリレートである)は、以下の構造を有する。
を補充する。-78℃の反応器内にあるこの溶液にメタノール中HEA-PCのストック溶液(0.461gのHEA-PCを秤量し、それを0.5mLのメタノールに溶解させる)を添加する。バイアルを200μlのメタノールでリンスし、それを-78℃の反応器内に加え、次に、0.5mLの蒸留水、次に更なる200μlの水を添加する。気泡が見えなくなり、一切の不均一性が消える(固体粒子が溶解又は消失する)まで、完全に脱気する。4psiのアルゴンを補充し、反応を室温で1時間進行させる。反応物は既に粘稠性であった。この反応を約1時間進行させた。メタノール中ビピリンジン(bipyrindine)溶液(0.5uL中5mg)を添加した。更に2~3mlのメタノールを添加し、触媒を4℃で一晩酸化させた。1H NMRによって決定した変換率は94%と推定された。
Sによって決定した。Mnは215kDaであり、Mp:250kDa、PDIは1.17である。変換率は1H NMRによって94%と推定された。上記でHEMA-PC及びHEA-PCについて考察したとおり、Am-PCポリマーにマレイミド官能基を付加することができる。上記に記載したとおり、マレイミド官能化Am-PCポリマーはTAF443などのタンパク質にコンジュゲートすることができる。
ポリマーOG1801にマレイミド官能基を付加してOG1802を形成した後(上記参照)、エルマンアッセイを用いて試料中の官能性マレイミド(即ちコンジュゲート可能)の量を決定する。チオールは、中性及びアルカリpHの水中でエルマン試薬(DTNB)をTNB-、次にTNB2-に変換し、これにより黄色が発色する(412nmで計測)。システインで標準曲線を作成する。マレイミドはチオールと反応するため、このアッセイは実際には残ったチオール(システイン)を計測する。(元のチオール-マレイミドポリマーを加えた後に残ったチオール)/(元のチオール)として阻害を計算し、パーセンテージで表す。
配列番号1
1 LVVTPPGPEL VLNVSSTFVL TCSGSAPVVW ERMSQEPPQE MAKAQDGTFS SVLTLTNLTG LDTGEYFCTH NDSRGLETDE
81 RKRLYIFVPD PTVGFLPNDA EELFIFLTEI TEITIPCRVT DPQLVVTLHE KKGDVALPVP YDHQRGFSGI FEDRSYICKT
161 TIGDREVDSD AYYVYRLQVS SINVSVNAVQ TVVRQGENIT LMCIVIGNEV VNFEWTYPRK ESGRLVEPVT DFLLDMPYHI
241 RSILHIPSAE LEDSGTYTCN VTESVNDHQD EKAINITVVE SGGGGGSGGG GSDIQMTQSP SSLSASVGDR VTITCSASQD
321 ISNYLNWYQQ KPGKAPKVLI YFTSSLHSGV PSRFSGSGSG TDFTLTISSL QPEDFATYYC QQYSTVPWTF GQGTKVEIKR
401 TVAAPSVFIF PPSDEQLKSG TASVVCLLNN FYPREAKVQW KVDNALQSGN SQESVTEQDS KDSTY
SLSST LTLSKADYEK
481 HKVYACEVTH QGLSSPVTKS FNRGEC
配列番号2
1 EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGYTFT NYGMNWVRQA PGKGLEWVGW INTYTGEPTY AADFKRRFTF SLDTSKSTAY
81 LQMNSLRAED TAVYYCAKYP HYYGSSHWYF DVWGQGTLVT VSSASTKGPS VFPLAPSSKS TSGGTAALGC LVKDYFPEPV
161 TVSWNSGALT SGVHTFPAVL QSSGLYSLSS VVTVPSSSLG TQTYICNVNH KPSNTKVDKK VEPKSCDKTH TCPPCPAPEL
241 LGGPSVFLFP PKPKDTLMIS RTPEVTCVVV DVSHEDPEVK FNWYVDGVEV HNAKTKPREE QYNSTYRVVS VLTVLHQDWL
321 NGKEYKCKVS NKALPAPIEK TISKAKGQPR EPQVYTLPPS REEMTKNQVS LTCLVKGFYP SDIAVEWESN GQPENNYKTT
401 PPVLDSDGSF FLYSKLTVDK SRWQQGNVFS CSVMHEALHN HYTQKSLSLS PGK
配列番号3
1 LVVTPPGPEL VLNVSSTFVL TCSGSAPVVW ERMSQEPPQE MAKAQDGTFS SVLTLTNLTG LDTGEYFCTH NDSRGLETDE
81 RKRLYIFVPD PTVGFLPNDA EELFIFLTEI TEITIPCRVT DPQLVVTLHE KKGDVALPVP YDHQRGFSGI FEDRSYICKT
161 TIGDREVDSD AYYVYRLQVS SINVSVNAVQ TVVRQGENIT LMCIVIGNEV VNFEWTYPRK ESGRLVEPVT DFLLDMPYHI
241 RSILHIPSAE LEDSGTYTCN VTESVNDHQD EKAINITVVE SGGGDIQMTQ SPSSLSASVG DRVTITCSAS QDISNYLNWY
321 QQKPGKAPKV LIYFTSSLHS GVPSRFSGSG SGTDFTLTIS SLQPEDFATY YCQQYSTVPW TFGQGTKVEI KRTVAAPSVF
401 IFPPSDEQLK SGTASVVCLL NNFYPREAKV QWKVDNALQS GNSQESVTEQ DSKDSTYSLS STLTLSKADY EKHKVYACEV
481 THQGLSSPVT KSFNRGEC
配列番号4
1 LVVTPPGPEL VLNVSSTFVL TCSGSAPVVW ERMSQEPPQE MAKAQDGTFS SVLTLTNLTG LDTGEYFCTH NDSRGLETDE
81 RKRLYIFVPD PTVGFLPNDA EELFIFLTEI TEITIPCRVT DPQLVVTLHE KKGDVALPVP YDHQRGFSGI FEDRSYICKT
161 TIGDREVDSD AYYVYRLQVS SINVSVNAVQ TVVRQGENIT LMCIVIGNEV VNFEWTYPRK ESGRLVEPVT DFLLDMPYHI
241 RSILHIPSAE LEDSGTYTCN VTESVNDHQD EKAINITVVE SGGGGGSGGG GSEVQLVESG GGLVQPGGSL RLSCAASGYT
321 FTNYGMNWVR QAPGKGLEWV GWINTYTGEP TYAADFKRRF TFSLDTSKST AYLQMNSLRA EDTAVYYCAK YPHYYGSSHW
401 YFDVWGQGTL VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KSTSGGTAAL GCLVKDYFPE PVTVSWNSGA LTSGVHTFPA VLQSSGLYSL
481 SSVVTVPSSS LGTQTYICNV NHKPSNTKVD KKVEPKSCDK THTCPPCPAP ELLGGPSVFL FPPKPKDTLM ISRTPEVTCV
561 VVDVSHEDPE VKFNWYVDGV EVHNAKTKPR EEQYNSTYRV VSVLTVLHQD WLNGKEYKCK VSNKALPAPI EKTISKAKGQ
641 PREPQVYTLP PSREEMTKNQ VSLTCLVKGF YPSDIAVEWE SNGQPENNYK TTPPVLDSDG SFFLYSKLTV DKSRWQQGNV
721 FSCSVMHEAL HNHYTQKSLS LSPGK
配列番号5
1 DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCSASQDIS NYLNWYQQKP GKAPKVLIYF TSSLHSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP
81 EDFATYYCQQ YSTVPWTFGQ GTKVEIKRTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV DNALQSGNSQ
161 ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG LSSPVTKSFN RGEC
配列番号6
1 LVVTPPGPEL VLNVSSTFVL TCSGSAPVVW ERMSQEPPQE MAKAQDGTFS SVLTLTNLTG LDTGEYFCTH NDSRGLETDE
81 RKRLYIFVPD PTVGFLPNDA EELFIFLTEI TEITIPCRVT DPQLVVTLHE KKGDVALPVP YDHQRGFSGI FEDRSYICKT
161 TIGDREVDSD AYYVYRLQVS SINVSVNAVQ TVVRQGENIT LMCIVIGNEV VNFEWTYPRK ESGRLVEPVT DFLLDMPYHI
241 RSILHIPSAE LEDSGTYTCN VTESVNDHQD EKAINITVVE SGGGEVQLVE SGGGLVQPGG SLRLSCAASG YTFTNYGMNW
321 VRQAPGKGLE WVGWINTYTG EPTYAADFKR RFTFSLDTSK STAYLQMNSL RAEDTAVYYC AKYPHYYGSS HWYFDVWGQG
401 TLVTVSSAST KGPSVFPLAP SSKSTSGGTA ALGCLVKDYF PEPVTVSWNS GALTSGVHTF PAVLQSSGLY SLSSVVTVPS
481 SSLGTQTYIC NVNHKPSNTK VDKKVEPKSC DKTHTCPPCP APELLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED
561 PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT
641 LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE
721 ALHNHYTQKS LSLSPGK
配列番号7
1 EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGYTFT NYGMNWVRQA PGKGLEWVGW INTYTGEPTY AADFKRRFTF SLDTSKSTAY
81 LQMNSLRAED TAVYYCAKYP HYYGSSHWYF DVWGQGTLVT VSSASTKGPS VFPLAPSSKS TSGGTAALGC LVKDYFPEPV
161 TVSWNSGALT SGVHTFPAVL QSSGLYSLSS VVTVPSSSLG TQTYICNVNH KPSNTKVDKK VEPKSCDKTH TCPPCPAPEL
241 LGGPSVFLFP PKPKDTLMIS RTPEVTCVVV DVSHEDPEVK FNWYVDGVEV HNAKTKPREE QYNSTYRVVS VLTVLHQDWL
321 NGKEYKCKVS NKALPAPIEK TISKAKGQPR EPQVYTLPPS REEMTKNQVS LTCLVKGFYP SDIAVEWESN GQPENNYKTT
401 PPVLDSDGSF FLYSKLTVDK SRWQQGNVFS CSVMHEALHN HYTQKSLSLS PGGGGGSGGG GSGGGGSGGG GSGLVVTPPG
481 PELVLNVSST FVLTCSGSAP VVWERMSQEP PQEMAKAQDG TFSSVLTLTN LTGLDTGEYF CTHNDSRGLE TDERKRLYIF
561 VPDPTVGFLP NDAEELFIFL TEITEITIPC RVTDPQLVVT LHEKKGDVAL PVPYDHQRGF SGIFEDRSYI CKTTIGDREV
641 DSDAYYVYRL QVSSINVSVN AVQTVVRQGE NITLMCIVIG NEVVNFEWTY PRKESGRLVE PVTDFLLDMP YHIRSILHIP
721 SAELEDSGTY TCNVTESVND HQDEKAINIT VVESG
配列番号8
1 LVVTPPGPEL VLNVSSTFVL TCSGSAPVVW ERMSQEPPQE MAKAQDGTFS SVLTLTNLTG LDTGEYFCTH NDSRGLETDE
81 RKRLYIFVPD PTVGFLPNDA EELFIFLTEI TEITIPCRVT DPQLVVTLHE KKGDVALPVP YDHQRGFSGI FEDRSYICKT
161 TIGDREVDSD AYYVYRLQVS SINVSVNAVQ TVVRQGENIT LMCIVIGNEV VNFEWTYPRK ESGRLVEPVT DFLLDMPYHI
241 RSILHIPSAE LEDSGTYTCN VTESVNDHQD EKAINITVVE SGGGGGSGGG GSEVQLVESG GGLVQPGGSL RLSCAASGYD
321 FTHYGMNWVR QAPGKGLEWV GWINTYTGEP TYAADFKRRF TFSLDTSKST AYLQMNSLRA EDTAVYYCAK YPYYYGTSHW
401 YFDVWGQGTL VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KSTSGGTAAL GCLVKDYFPE PVTVSWNSGA LTSGVHTFPA VLQSSGLYSL
481 SSVVTVPSSS LGTQTYICNV NHKPSNTKVD KKVEPKSCDK THTCPPCPAP EAAGAPSVFL FPPKPKDTLM ISRTPEVTCV
561 VVDVSHEDPE VKFNWYVDGV EVHNAKTKPR EEQYNSTYRV VSVLTVLHQD WLNGKEYKCK VSNKALPAPI EKTISKAKGQ
641 PREPCVYTLP PSREEMTKNQ VSLTCLVKGF YPSDIAVEWE SNGQPENNYK TTPPVLDSDG SFFLYSKLTV DKSRWQQGNV
721 FSCSVMHEAL HNHYTQKSLS LSPGK
配列番号9
1 LVVTPPGPEL VLNVSSTFVL TCSGSAPVVW ERMSQEPPQE MAKAQDGTFS SVLTLTNLTG LDTGEYFCTH NDSRGLETDE
81 RKRLYIFVPD PTVGFLPNDA EELFIFLTEI TEITIPCRVT DPQLVVTLHE KKGDVALPVP YDHQRGFSGI FEDRSYICKT
161 TIGDREVDSD AYYVYRLQVS SINVSVNAVQ TVVRQGENIT LMCIVIGNEV VNFEWTYPRK ESGRLVEPVT DFLLDMPYHI
241 RSILHIPSAE LEDSGTYTCN VTESVNDHQD EKAINITVVE SGGGGGSGGG GSEVQLVESG GGLVQPGGSL RLSCAASGYD
321 FTHYGMNWVR QAPGKGLEWV GWINTYTGEP TYAADFKRRF TFSLDTSKST AYLQMNSLRA EDTAVYYCAK YPYYYGTSHW
401 YFDVWGQGTL VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KSTSGGTAAL GCLVKDYFPE PVTVSWNSGA LTSGVHTFPA VLQSSGLYSL
481 SSVVTVPSSS LGTQTYICNV NHKPSNTKVD KKVEPKSCDK THTCPPCPAP EAAGAPSVFL FPPKPKDTLM ISRTPEVTCV
561 VVDVSHEDPE VKFNWYVDGV EVHNAKTKPR EEQYNSTYRV VSVLTVLHQD WLNGKEYKCK VSNKALPAPI EKTISKAKGQ
641 PREPQVYTLP PSREEMTKNQ VSLTCLVKGF YPSDIAVEWE SNGQPENNYK TTPPVLDSDG SFFLYSKLTV DKSRWQQGNV
721 FSCSVMHEAL HNHYTQKSLS CSPGK
配列番号10
1 DIQLTQSPSS LSASVGDRVT ITCSASQDIS NYLNWYQQKP GKAPKVLIYF TSSLHSGVPS RFSGSGSGTD
FTLTISSLQP
81 EDFATYYCQQ YSTVPWTFGQ GTKVEIKRTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV
DNALQSGNSQ
161 ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG LSSPVTKSFN RGEC
配列番号11
1 MRLPGAMPAL ALKGELLLLS LLLLLEPQIS QGLVVTPPGP ELVLNVSSTF VLTCSGSAPV VWERMSQEPP QEMAKAQDGT
81 FSSVLTLTNL TGLDTGEYFC THNDSRGLET DERKRLYIFV PDPTVGFLPN DAEELFIFLT EITEITIPCR VTDPQLVVTL
161 HEKKGDVALP VPYDHQRGFS GIFEDRSYIC KTTIGDREVD SDAYYVYRLQ VSSINVSVNA VQTVVRQGEN ITLMCIVIGN
241 EVVNFEWTYP RKESGRLVEP VTDFLLDMPY HIRSILHIPS AELEDSGTYT CNVTESVNDH QDEKAINITV VESGYVRLLG
321 EVGTLQFAEL HRSRTLQVVF EAYPPPTVLW FKDNRTLGDS SAGEIALSTR NVSETRYVSE LTLVRVKVAE AGHYTMRAFH
401 EDAEVQLSFQ LQINVPVRVL ELSESHPDSG EQTVRCRGRG MPQPNIIWSA CRDLKRCPRE LPPTLLGNSS EEESQLETNV
481 TYWEEEQEFE VVSTLRLQHV DRPLSVRCTL RNAVGQDTQE VIVVPHSLPF KVVVISAILA LVVLTIISLI ILIMLWQKKP
561 RYEIRWKVIE SVSSDGHEYI YVDPMQLPYD STWELPRDQL VLGRTLGSGA FGQVVEATAH GLSHSQATMK VAVKMLKSTA
641 RSSEKQALMS ELKIMSHLGP HLNVVNLLGA CTKGGPIYII TEYCRYGDLV DYLHRNKHTF LQHHSDKRRP PSAELYSNAL
721 PVGLPLPSHV SLTGESDGGY MDMSKDESVD YVPMLDMKGD VKYADIESSN YMAPYDNYVP SAPERTCRAT LINESPVLSY
801 MDLVGFSYQV ANGMEFLASK NCVHRDLAAR NVLICEGKLV KICDFGLARD IMRDSNYISK GSTFLPLKWM APESIFNSLY
881 TTLSDVWSFG ILLWEIFTLG GTPYPELPMN EQFYNAIKRG YRMAQPAHAS DEIYEIMQKC WEEKFEIRPP FSQLVLLLER
961 LLGEGYKKKY QQVDEEFLRS DHPAILRSQA RLPGFHGLRS PLDTSSVLYT AVQPNEGDND YIIPLPDPKP EVADEGPLEG
1041 SPSLASSTLN EVNTSSTISC DSPLEPQDEP EPEPQLELQV EPEPELEQLP DSGCPAPRAE AEDSFL
配列番号12
1 DIQLTQSPSS LSASVGDRVT ITCSASQDIS NYLNWYQQKP GKAPKVLIYF TSSLHSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP
81 EDFATYYCQQ YSTVPWTFGQ GTKVEIKRTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV DNALQSGNSQ
161 ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG LSSPVTKSFN RGEC
配列番号13
1 EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGYDFT HYGMNWVRQA PGKGLEWVGW INTYTGEPTY AADFKRRFTF SLDTSKSTAY
81 LQMNSLRAED TAVYYCAKYP YYYGTSHWYF DVWGQGTLVT VSSASTKGPS VFPLAPSSKS TSGGTAALGC LVKDYFPEPV
161 TVSWNSGALT SGVHTFPAVL QSSGLYSLSS VVTVPSSSLG TQTYICNVNH KPSNTKVDKK VEPKSCDKTH L
配列番号14
1 MVSYWDTGVL LCALLSCLLL TGSSSGSKLK DPELSLKGTQ HIMQAGQTLH LQCRGEAAHK WSLPEMVSKE SERLSITKSA
81 CGRNGKQFCS TLTLNTAQAN HTGFYSCKYL AVPTSKKKET ESAIYIFISD TGRPFVEMYS EIPEIIHMTE GRELVIPCRV
161 TSPNITVTLK KFPLDTLIPD GKRIIWDSRK GFIISNATYK EIGLLTCEAT VNGHLYKTNY LTHRQTNTII DVQISTPRPV
241 KLLRGHTLVL NCTATTPLNT RVQMTWSYPD EKNKRASVRR RIDQSNSHAN IFYSVLTIDK MQNKDKGLYT CRVRSGPSFK
321 SVNTSVHIYD KAFITVKHRK QQVLETVAGK RSYRLSMKVK AFPSPEVVWL KDGLPATEKS ARYLTRGYSL IIKDVTEEDA
401 GNYTILLSIK QSNVFKNLTA TLIVNVKPQI YEKAVSSFPD PALYPLGSRQ ILTCTAYGIP QPTIKWFWHP CNHNHSEARC
481 DFCSNNEESF ILDADSNMGN RIESITQRMA IIEGKNKMAS TLVVADSRIS GIYICIASNK VGTVGRNISF YITDVPNGFH
561 VNLEKMPTEG EDLKLSCTVN KFLYRDVTWI LLRTVNNRTM HYSISKQKMA ITKEHSITLN LTIMNVSLQD SGTYACRARN
641 VYTGEEILQK KEITIRDQEA PYLLRNLSDH TVAISSSTTL DCHANGVPEP QITWFKNNHK IQQEPGIILG PGSSTLFIER
721 VTEEDEGVYH CKATNQKGSV ESSAYLTVQG TSDKSNLELI TLTCTCVAAT LFWLLLTLFI RKMKRSSSEI KTDYLSIIMD
801 PDEVPLDEQC ERLPYDASKW EFARERLKLG KSLGRGAFGK VVQASAFGIK KSPTCRTVAV KMLKEGATAS EYKALMTELK
881 ILTHIGHHLN VVNLLGACTK QGGPLMVIVE YCKYGNLSNY LKSKRDLFFL NKDAALHMEP KKEKMEPGLE QGKKPRLDSV
961 TSSESFASSG FQEDKSLSDV EEEEDSDGFY KEPITMEDLI SYSFQVARGM EFLSSRKCIH RDLAARNILL SENNVVKICD
1041 FGLARDIYKN PDYVRKGDTR LPLKWMAPES IFDKIYSTKS DVWSYGVLLW EIFSLGGSPY PGVQMDEDFC SRLREGMRMR
1121 APEYSTPEIY QIMLDCWHRD PKERPRFAEL VEKLGDLLQA NVQQDGKDYI PINAILTGNS GFTYSTPAFS EDFFKESISA
1201 PKFNSGSSDD VRYVNAFKFM SLERIKTFEE LLPNATSMFD DYQGDSSTLL ASPMLKRFTW TDSKPKASLK IDLRVTSKSK
1281 ESGLSDVSRP SFCHSSCGHV SEGKRRFTYD HAELERKIAC CSPPPDYNSV VLYSTPPI
配列番号15
1 MQSKVLLAVA LWLCVETRAA SVGLPSVSLD LPRLSIQKDI LTIKANTTLQ ITCRGQRDLD WLWPNNQSGS EQRVEVTECS
81 DGLFCKTLTI PKVIGNDTGA YKCFYRETDL ASVIYVYVQD YRSPFIASVS DQHGVVYITE NKNKTVVIPC LGSISNLNVS
161 LCARYPEKRF VPDGNRISWD SKKGFTIPSY MISYAGMVFC EAKINDESYQ SIMYIVVVVG YRIYDVVLSP SHGIELSVGE
241 KLVLNCTART ELNVGIDFNW EYPSSKHQHK KLVNRDLKTQ SGSEMKKFLS TLTIDGVTRS DQGLYTCAAS SGLMTKKNST
321 FVRVHEKPFV AFGSGMESLV EATVGERVRI PAKYLGYPPP EIKWYKNGIP LESNHTIKAG HVLTIMEVSE RDTGNYTVIL
401 TNPISKEKQS HVVSLVVYVP PQIGEKSLIS PVDSYQYGTT QTLTCTVYAI PPPHHIHWYW QLEEECANEP SQAVSVTNPY
481 PCEEWRSVED FQGGNKIEVN KNQFALIEGK NKTVSTLVIQ AANVSALYKC EAVNKVGRGE RVISFHVTRG PEITLQPDMQ
561 PTEQESVSLW CTADRSTFEN LTWYKLGPQP LPIHVGELPT PVCKNLDTLW KLNATMFSNS TNDILIMELK NASLQDQGDY
641 VCLAQDRKTK KRHCVVRQLT VLERVAPTIT GNLENQTTSI GESIEVSCTA SGNPPPQIMW FKDNETLVED SGIVLKDGNR
721 NLTIRRVRKE DEGLYTCQAC SVLGCAKVEA FFIIEGAQEK TNLEIIILVG TAVIAMFFWL LLVII
LRTVK RANGGELKTG
801 YLSIVMDPDE LPLDEHCERL PYDASKWEFP RDRLKLGKPL GRGAFGQVIE ADAFGIDKTA TCRTVAVKML KEGATHSEHR
881 ALMSELKILI HIGHHLNVVN LLGACTKPGG PLMVIVEFCK FGNLSTYLRS KRNEFVPYKT KGARFRQGKD YVGAIPVDLK
961 RRLDSITSSQ SSASSGFVEE KSLSDVEEEE APEDLYKDFL TLEHLICYSF QVAKGMEFLA SRKCIHRDLA ARNILLSEKN
1041 VVKICDFGLA RDIYKDPDYV RKGDARLPLK WMAPETIFDR VYTIQSDVWS FGVLLWEIFS LGASPYPGVK IDEEFCRRLK
1121 EGTRMRAPDY TTPEMYQTML DCWHGEPSQR PTFSELVEHL GNLLQANAQQ DGKDYIVLPI SETLSMEEDS GLSLPTSPVS
1201 CMEEEEVCDP KFHYDNTAGI SQYLQNSKRK SRPVSVKTFE DIPLEEPEVK VIPDDNQTDS GMVLASEELK TLEDRTKLSP
1281 SFGGMVPSKS RESVASEGSN QTSGYQSGYH SDDTDTTVYS SEEAELLKLI EIGVQTGSTA QILQPDSGTT LSSPPV
配列番号16
1 MQRGAALCLR LWLCLGLLDG LVSGYSMTPP TLNITEESHV IDTGDSLSIS CRGQHPLEWA WPGAQEAPAT GDKDSEDTGV
81 VRDCEGTDAR PYCKVLLLHE VHANDTGSYV CYYKYIKARI EGTTAASSYV FVRDFEQPFI NKPDTLLVNR KDAMWVPCLV
161 SIPGLNVTLR SQSSVLWPDG QEVVWDDRRG MLVSTPLLHD ALYLQCETTW GDQDFLSNPF LVHITGNELY DIQLLPRKSL
241 ELLVGEKLVL NCTVWAEFNS GVTFDWDYPG KQAERGKWVP ERRSQQTHTE LSSILTIHNV SQHDLGSYVC KANNGIQRFR
321 ESTEVIVHEN PFISVEWLKG PILEATAGDE LVKLPVKLAA YPPPEFQWYK DGKALSGRHS PHALVLKEVT EASTGTYTLA
401 LWNSAAGLRR NISLELVVNV PPQIHEKEAS SPSIYSRHSR QALTCTAYGV PLPLSIQWHW RPWTPCKMFA QRSLRRRQQQ
481 DLMPQCRDWR AVTTQDAVNP IESLDTWTEF VEGKNKTVSK LVIQNANVSA MYKCVVSNKV GQDERLIYFY VTTIPDGFTI
561 ESKPSEELLE GQPVLLSCQA DSYKYEHLRW YRLNLSTLHD AHGNPLLLDC KNVHLFATPL AASLEEVAPG ARHATLSLSI
641 PRVAPEHEGH YVCEVQDRRS HDKHCHKKYL SVQALEAPRL TQNLTDLLVN VSDSLEMQCL VAGAHAPSIV WYKDERLLEE
721 KSGVDLADSN QKLSIQRVRE EDAGRYLCSV CNAKGCVNSS ASVAVEGSED KGSMEIVILV GTGVIAVFFW VLLLLIFCNM
801 RRPAHADIKT GYLSIIMDPG EVPLEEQCEY LSYDASQWEF PRERLHLGRV LGYGAFGKVV EASAFGIHKG SSCDTVAVKM
881 LKEGATASEH RALMSELKIL IHIGNHLNVV NLLGACTKPQ GPLMVIVEFC KYGNLSNFLR AKRDAFSPCA EKSPEQRGRF
961 RAMVELARLD RRRPGSSDRV LFARFSKTEG GARRASPDQE AEDLWLSPLT MEDLVCYSFQ VARGMEFLAS RKCIHRDLAA
1041 RNILLSESDV VKICDFGLAR DIYKDPDYVR KGSARLPLKW MAPESIFDKV YTTQSDVWSF GVLLWEIFSL GASPYPGVQI
1121 NEEFCQRLRD GTRMRAPELA TPAIRRIMLN CWSGDPKARP AFSELVEILG DLLQGRGLQE EEEVCMAPRS SQSSEEGSFS
1201 QVSTMALHIA QADAEDSPPS LQRHSLAARY YNWVSFPGCL ARGAETRGSS RMKTFEEFPM TPTTYKGSVD NQTDSGMVLA
1281 SEEFEQIESR HRQESGFSCK GPGQNVAVTR AHPDSQGRRR RPERGARGGQ VFYNSEYGEL SEPSE
EDHCS PSARVTFFTD
1361 NSY
配列番号17
1 ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT
81 YICNVNHKPS NTKVDKKVEP KSCDKTHTCP PCPAPELLGG PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVVVDVS HEDPEVKFNW
161 YVDGVEVHNA KTKPREEQYN STYRVVSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSRDE
241 LTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW QQGNVFSCSV MHEALHNHYT
321 QKSLSLSPGK
配列番号18
1 TVAAPSVFIF PPSDEQLKSG TASVVCLLNN FYPREAKVQW KVDNALQSGN SQESVTEQDS KDSTYSLSST LTLSKADYEK
81 HKVYACEVTH QGLSSPVTKS FNRGEC
配列番号19
1 LVVTPPGPEL VLNVSSTFVL TCSGSAPVVW ERMSQEPPQE MAKAQDGTFS SVLTLTNLTG LDTGEYFCTH NDSRGLETDE
81 RKRLYIFVPD PTVGFLPNDA EELFIFLTEI TEITIPCRVT DPQLVVTLHE KKGDVALPVP YDHQRGFSGI FEDRSYICKT
161 TIGDREVDSD AYYVYRLQVS SINVSVNAVQ TVVRQGENIT LMCIVIGNEV VNFEWTYPRK ESGRLVEPVT DFLLDMPYHI
241 RSILHIPSAE LEDSGTYTCN VTESVNDHQD EKAINITVVE SGGGGGSGGG GSDIQMTQSP SSLSASVGDR VTITCSASQD
321 ISNYLNWYQQ KPGKAPKVLI YFTSSLHSGV PSRFSGSGSG TDFTLTISSL QPEDFATYYC QQYSTVPWTF GQGTKVEIKR
401 TVAAPSVFIF PPSDEQLKSG TASVVCLLNN FYPREAKVQW KVDNALQSGN SQESVTEQDS KDSTYSLSST LTLSKADYEK
481 HKVYACEVTH QGLSSPVTKS FNRGEC
配列番号21
1 EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGYTFT NYGMNWVRQA PGKGLEWVGW INTYTGEPTY AADFKRRFTF SLDTSKSTAY
81 LQMNSLRAED TAVYYCAKYP HYYGSSHWYF DVWGQGTLVT VSSASTKGPS VFPLAPSSKS TSGGTAALGC LVKDYFPEPV
161 TVSWNSGALT SGVHTFPAVL QSSGLYSLSS VVTVPSSSLG TQTYICNVNH KPSNTKVDKK VEPKSCDKTH T
配列番号22
1 LVVTPPGPEL VLNVSSTFVL TCSGSAPVVW ERMSQEPPQE MAKAQDGTFS SVLTLTNLTG LDTGEYFCTH NDSRGLETDE
81 RKRLYIFVPD PTVGFLPNDA EELFIFLTEI TEITIPCRVT DPQLVVTLHE KKGDVALPVP YDHQRGFSGI FEDRSYICKT
161 TIGDREVDSD AYYVYRLQVS SINVSVNAVQ TVVRQGENIT LMCIVIGNEV VNFEWTYPRK ESGRLVEPVT DFLLDMPYHI
241 RSILHIPSAE LEDSGTYTCN VTESVNDHQD EKAINITVVE SGGGGGSGGG GSEVQLVESG GGLVQ
PGGSL RLSCAASGYT
321 FTNYGMNWVR QAPGKGLEWV GWINTYTGEP TYAADFKRRF TFSLDTSKST AYLQMNSLRA EDTAVYYCAK YPHYYGSSHW
401 YFDVWGQGTL VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KSTSGGTAAL GCLVKDYFPE PVTVSWNSGA LTSGVHTFPA VLQSSGLYSL
481 SSVVTVPSSS LGTQTYICNV NHKPSNTKVD KKVEPKSCDK THT
配列番号23
1 LVVTPPGPEL VLNVSSTFVL TCSGSAPVVW ERMSQEPPQE MAKAQDGTFS SVLTLTNLTG LDTGEYFCTH NDSRGLETDE
81 RKRLYIFVPD PTVGFLPNDA EELFIFLTEI TEITIPCRVT DPQLVVTLHE KKGDVALPVP YDHQRGFSGI FEDRSYICKT
161 TIGDREVDSD AYYVYRLQVS SINVSVNAVQ TVVRQGENIT LMCIVIGNEV VNFEWTYPRK ESGRLVEPVT DFLLDMPYHI
241 RSILHIPSAE LEDSGTYTCN VTESVNDHQD EKAINITVVE SGGGEVQLVE SGGGLVQPGG SLRLSCAASG YTFTNYGMNW
321 VRQAPGKGLE WVGWINTYTG EPTYAADFKR RFTFSLDTSK STAYLQMNSL RAEDTAVYYC AKYPHYYGSS HWYFDVWGQG
401 TLVTVSSAST KGPSVFPLAP SSKSTSGGTA ALGCLVKDYF PEPVTVSWNS GALTSGVHTF PAVLQSSGLY SLSSVVTVPS
481 SSLGTQTYIC NVNHKPSNTK VDKKVEPKSC DKTHT
配列番号24
1 EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGYTFT NYGMNWVRQA PGKGLEWVGW INTYTGEPTY AADFKRRFTF SLDTSKSTAY
81 LQMNSLRAED TAVYYCAKYP HYYGSSHWYF DVWGQGTLVT VSSASTKGPS VFPLAPSSKS TSGGTAALGC LVKDYFPEPV
161 TVSWNSGALT SGVHTFPAVL QSSGLYSLSS VVTVPSSSLG TQTYICNVNH KPSNTKVDKK VEPKSCDKTH TGGGGGSGGG
241 GSGGGGSGGG GSGLVVTPPG PELVLNVSST FVLTCSGSAP VVWERMSQEP PQEMAKAQDG TFSSVLTLTN LTGLDTGEYF
321 CTHNDSRGLE TDERKRLYIF VPDPTVGFLP NDAEELFIFL TEITEITIPC RVTDPQLVVT LHEKKGDVAL PVPYDHQRGF
401 SGIFEDRSYI CKTTIGDREV DSDAYYVYRL QVSSINVSVN AVQTVVRQGE NITLMCIVIG NEVVNFEWTY PRKESGRLVE
481 PVTDFLLDMP YHIRSILHIP SAELEDSGTY TCNVTESVND HQDEKAINIT VVESG
配列番号25
1 LVVTPPGPEL VLNVSSTFVL TCSGSAPVVW ERMSQEPPQE MAKAQDGTFS SVLTLTNLTG LDTGEYFCTH NDSRGLETDE
81 RKRLYIFVPD PTVGFLPNDA EELFIFLTEI TEITIPCRVT DPQLVVTLHE KKGDVALPVP YDHQRGFSGI FEDRSYICKT
161 TIGDREVDSD AYYVYRLQVS SINVSVNAVQ TVVRQGENIT LMCIVIGNEV VNFEWTYPRK ESGRLVEPVT DFLLDMPYHI
241 RSILHIPSAE LEDSGTYTCN VTESVNDHQD EKAINITVVE SGGGGGSGGG GSEVQLVESG GGLVQPGGSL RLSCAASGYD
321 FTHYGMNWVR QAPGKGLEWV GWINTYTGEP TYAADFKRRF TFSLDTSKST AYLQMNSLRA EDTAVYYCAK YPYYYGTSHW
401 YFDVWGQGTL VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KSTSGGTAAL GCLVKDYFPE PVTVSWNSGA LTSGVHTFPA VLQSSGLYSL
481 SSVVTVPSSS LGTQTYICNV NHKPSNTKVD KKVEPKSCDK THL
配列番号26
1 LVVTPPGPE LVLNVSSTFV LTCSGSAPVV WERMSQEPPQ EMAKAQDGTF SSVLTLTNLT GLDTGEYFCT HNDSRGLETD
80 ERKRLYIFVP DPTVGFLPND AEELFIFLTE ITEITIPCRV TDPQLVVTLH EKKGDVALPV PYDHQRGFSG IFEDRSYICK
160 TTIGDREVDS DAYYVYRLQV SSINVSVNAV QTVVRQGENI TLMCIVIGNE VVNFEWTYPR KESGRLVEPV TDFLLDMPYH
240 IRSILHIPSA ELEDSGTYTC NVTESVNDHQ DEKAINITVV ESGEVQLVES GGGLVQPGGS LRLSCAASGY TFTNYGMNWV
320 RQAPGKGLEW VGWINTYTGE PTYAADFKRR FTFSLDTSKS TAYLQMNSLR AEDTAVYYCA KYPHYYGSSH WYFDVWGQGT
400 LVTVSSASTK GPSVFPLAPS SKSTSGGTAA LGCLVKDYFP EPVTVSWNSG ALTSGVHTFP AVLQSSGLYS LSSVVTVPSS
480 SLGTQTYICN VNHKPSNTKV DKKVEPKSCD KTHTCPPCPA PELLGGPSVF LFPPKPKDTL MISRTPEVTC VVVDVSHEDP
560 EVKFNWYVDG VEVHNAKTKP REEQYNSTYR VVSVLTVLHQ DWLNGKEYKC KVSNKALPAP IEKTISKAKG QPREPQVYTL
640 PPSREEMTKN QVSLTCLVKG FYPSDIAVEW ESNGQPENNY KTTPPVLDSD GSFFLYSKLT VDKSRWQQGN VFSCSVMHEA
720 LHNHYTQKSL SLSPGK
配列番号27
1 VGFLPNDAEE LFIFLTEITE ITIPCRVTDP QLVVTLHEKK GDVALPVPYD HQRGFSGIFE DRSYICKTTI GDREVDSDAY
81 YVYRLQVSSI NVSVNAVQTV VRQGENITLM CIVIGNEVVN FEWTYPRKES GRLVEPVTDF LLDMPYHIRS ILHIPSAELE
161 DSGTYTCNVT ESVNDHQDEK AINITVVESG EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGYTFT NYGMNWVRQA PGKGLEWVGW
241 INTYTGEPTY AADFKRRFTF SLDTSKSTAY LQMNSLRAED TAVYYCAKYP HYYGSSHWYF DVWGQGTLVT VSSASTKGPS
321 VFPLAPSSKS TSGGTAALGC LVKDYFPEPV TVSWNSGALT SGVHTFPAVL QSSGLYSLSS VVTVPSSSLG TQTYICNVNH
401 KPSNTKVDKK VEPKSCDKTH TCPPCPAPEL LGGPSVFLFP PKPKDTLMIS RTPEVTCVVV DVSHEDPEVK FNWYVDGVEV
481 HNAKTKPREE QYNSTYRVVS VLTVLHQDWL NGKEYKCKVS NKALPAPIEK TISKAKGQPR EPQVYTLPPS REEMTKNQVS
561 LTCLVKGFYP SDIAVEWESN GQPENNYKTT PPVLDSDGSF FLYSKLTVDK SRWQQGNVFS CSVMHEALHN HYTQKSLSLS
641 PGK
配列番号28
1 VGFLPNDAEE LFIFLTEITE ITIPCRVTDP QLVVTLHEKK GDVALPVPYD HQRGFSGIFE DRSYICKTTI GDREVDSDAY
81 YVYRLQVSSI NVSVNAVQTV VRQGENITLM CIVIGNEVVN FEWTYPRKES GRLVEPVTDF LLDMPYHIRS ILHIPSAELE
161 DSGTYTCNVT ESVNDHQDEK AINITVVESG EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGYTFT NYGMNWVRQA PGKGLEWVGW
241 INTYTGEPTY AADFKRRFTF SLDTSKSTAY LQMNSLRAED TAVYYCAKYP HYYGSSHWYF DVWGQ
GTLVT VSSASTKGPS
321 VFPLAPSSKS TSGGTAALGC LVKDYFPEPV TVSWNSGALT SGVHTFPAVL QSSGLYSLSS VVTVPSSSLG TQTYICNVNH
401 KPSNTKVDKK VEPKSCDKTH T
配列番号29
1 VGFLPNDAEE LFIFLTEITE ITIPCRVTDP QLVVTLHEKK GDVALPVPYD HQRGFSGIFE DRSYICKTTI GDREVDSDAY
81 YVYRLQVSSI NVSVNAVQTV VRQGENITLM CIVIGNEVVN FEWTYPRKES GRLVEPVTDF LLDMPYHIRS ILHIPSAELE
161 DSGTYTCNVT ESVNDHQDEK AINITVVESG GGGSGGGGSG GGGSGGGGSG GGGSGGGGSE VQLVESGGGL VQPGGSLRLS
241 CAASGYTFTN YGMNWVRQAP GKGLEWVGWI NTYTGEPTYA ADFKRRFTFS LDTSKSTAYL QMNSLRAEDT AVYYCAKYPH
321 YYGSSHWYFD VWGQGTLVTV SSASTKGPSV FPLAPSSKST SGGTAALGCL VKDYFPEPVT VSWNSGALTS GVHTFPAVLQ
401 SSGLYSLSSV VTVPSSSLGT QTYICNVNHK PSNTKVDKKV EPKSCDKTHT
配列番号30
1 EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGYTFT NYGMNWVRQA PGKGLEWVGW INTYTGEPTY AADFKRRFTF SLDTSKSTAY
81 LQMNSLRAED TAVYYCAKYP HYYGSSHWYF DVWGQGTLVT VSSASTKGPS VFPLAPSSKS TSGGTAALGC LVKDYFPEPV
161 TVSWNSGALT SGVHTFPAVL QSSGLYSLSS VVTVPSSSLG TQTYICNVNH KPSNTKVDKK VEPKSCDKTH TGGGSGGGGS
241 GGGGSGGGGS GGGGSGGGGS VGFLPNDAEE LFIFLTEITE ITIPCRVTDP QLVVTLHEKK GDVALPVPYD HQRGFSGIFE
321 DRSYICKTTI GDREVDSDAY YVYRLQVSSI NVSVNAVQTV VRQGENITLM CIVIGNEVVN FEWTYPRKES GRLVEPVTDF
401 LLDMPYHIRS ILHIPSAELE DSGTYTCNVT ESVNDHQDEK AINITVVESG
配列番号31 重鎖抗VEGF-PDGFR融合物をコードする核酸
GACGGATCGGGAGATCTCCCGATCCCCTATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGTATCTGCTCCCTGCTTGTGTGTTGGAGGTCGCTGAGTAGTGCGCGAGCAAAATTTAAGCTACAACAAGGCAAGGCTTGACCGACAATTGCATGAAGAATCTGCTTAGGGTTAGGCGTTTTGCGCTGCTTCGCGATGTACGGGCCAGATATACGCGTTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCTCTGGCTAACTAGAGAACCCACTGCTTACTGGCTTATCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCCAAGCTGGCTAGCGTTTAAACTTAAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCCACTAGTCCAGTGTGGTGGAATTCTGCAGATATCCAGCACAGTGGCGGCCGCCatgaaagctgtggtgctggccgtggctctggtcttcctgacagggagccaggctctggtcgtcacacccccggggccagagcttgtcctcaatgtctccagcaccttcgttctgacctgctcgggttcagctccggtggtgtgggaacggatgtcccaggagcccccacaggaaatggccaaggcccaggatggcaccttctccagcgtgctcacactgaccaacctcactgggctagacacgggagaatacttttgcacccacaatgactcccgtggactggagaccgatgagcggaaacggctctacatctttgtgccagatcccaccgtgggcttcctccctaatgatgccgaggaactattcatctttctcacggaaataactgagatcaccattccatgccgagtaacagacccacagctggtggtgacactgcacgagaagaaagggg
acgttgcactgcctgtcccctatgatcaccaacgtggcttttctggtatctttgaggacagaagctacatctgcaaaaccaccattggggacagggaggtggattctgatgcctactatgtctacagactccaggtgtcatccatcaacgtctctgtgaacgcagtgcagactgtggtccgccagggtgagaacatcaccctcatgtgcattgtgatcgggaatgaggtggtcaacttcgagtggacatacccccgcaaagaaagtgggcggctggtggagccggtgactgacttcctcttggatatgccttaccacatccgctccatcctgcacatccccagtgccgagttagaagactcggggacctacacctgcaatgtgacggagagtgtgaatgaccatcaggatgaaaaggccatcaacatcaccgtggttgagagcggcggtggtggcggctccggtggaggcggaagcgaggtgcagctggtggaatccggcggaggcctggtccagcctggcggatccctgagactgtcctgtgccgcctccggctacgacttcacccattacggcatgaactgggtccgacaggcccctggcaagggcctggaatgggtcggatggatcaacacctacaccggcgagcccacctacgccgccgacttcaagcggcggttcaccttctccctggacacctccaagtccaccgcctacctgcagatgaactccctgcgggccgaggacaccgccgtgtactactgcgccaagtacccctactactacggcacctcccactggtacttcgacgtgtggggccagggcaccctggtcaccgtgtcctccgcctctaccaagggcccctccgtgttccctctggccccctccagcaagtccacctctggcggcaccgccgctctgggctgcctggtcaaggactacttccccgagcccgtgaccgtgtcctggaactctggcgccctgacctccggcgtgcacacctttccagccgtgctgcagtcctccggcctgtactccctgtcctccgtcgtgaccgtgccctccagctctctgggcacccagacctacatctgcaacgtgaaccacaagccctccaacaccaaggtggacaagaaggtggaacccaagtcctgcgacaagacccacacctgtcccccctgccctgcccctgaagcagccggtgcacccagcgtgttcctgttccccccaaagcccaaggacaccctgatgatctcccggacccccgaagtgacctgcgtggtggtggacgtgtcccacgaggaccctgaagtgaagttcaattggtacgtggacggcgtggaagtgcacaatgccaagaccaagcccagagaggaacagtacaactccacctaccgggtggtgtccgtgctgaccgtgctgcatcaggactggctgaacggcaaagagtacaagtgcaaggtctccaacaaggccctgcctgcccccatcgaaaagaccatctccaaggccaagggccagccccgcgagcctcaggtgtacacactgccacccagccgggaagagatgaccaagaaccaggtctccctgacctgtctggtcaagggcttctacccctccgatatcgccgtcgaatgggagtccaacggccagcccgagaacaactacaagaccaccccccctgtgctggactccgacggctcattcttcctgtactccaagctgaccgtggacaagtcccggtggcagcagggcaacgtgttctcctgctccgtgatgcacgaggccctgcacaaccactacacccagaagtccctgtcctgcagccccggcaagtgataaTCTAGAGGGCCCGTTTAAACCCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGCTTCTGAGGCGGAAAGAACCAGCTGGGGCTCTAGGGGGTATCCCCACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTAATTCTGTGGAATGTGTGTCAGTTAGGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCAGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCTGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAAAGCTCCCGGGAGCTTGTATATCCATTTTCGGATCTGATCAAGAGACAGGATGAGGATCGTTTCGCATGATTGAACAAGATGGATTGCACGCAGGTTCTCCGGCCGCTTGGGTGGAGAGGCTATTCGGCTATGACTGGGCACAACAGACAATCGGCTGCTCTGATGCCGCCGTGTTCCGGCTGTCAGCGCAGGGGCGCCCGGTTCTTTTTGTCAAGACCGACCTGTCCGGTGCCCTGAATGAACTGCAGGACGAGGCAGCGCGGCTATCGTGGCTGGCCACGACGGGCGTTCCTTGCGCAGCTGTGCTCGACGTTGTCACTGAAGCGGGAAGGGACTGGCTGCTATTGGGCGAAGTGCCGGGGCAGGATCTCCTGTCATCTCACCTTGCTCCTGCCGAGAAAGTATCCATCATGGCTGATGCAATGCGGCGGCTGCATACGCTTGATCCGGCTACCTGCCCATTCGACCACCAAGCGAAACATCGCATCGAGCGAGCACGTACTCGGATGGAAGCCGGTCTTGTCGATCAGGATGATCTGGACGAAGAGCATCAGGGGCTCGCGCCAGCCGAACTGTTCGCCAGGCTCAAGGCGCGCATGCCCGACGGCGAGGATCTCGTCGTGACCCATGGCGATGCCTGCTTGCCGAATATCATGGTGGAAAATGGCCGCTTTTCTGGATTCATCGACTGTGGCCGGCTGGGTGTGGCGGACCGCTATCAGGACATAGCGTTGGCTACCCGTGATATTGCTGAAGAGCTTGGCGGCGAATGGGCTGACCGCTTCCTCGTGCTTTACGGTATCGCCGCTCCCGATTCGCAGCGCATCGCCTTCTATCGCCTTCTTGACGAGTTCTTCTGAGCGGGACTCTGGGGTTCGAAATGACCGACCAAGCGACGCCCAACCTGCCATCACGAGATTTCGATTCCACCGCCGCCTTCTATGAAAGGTTGGGCTTCGGAATCGTTTTCCGGGACGCCGGCTGGATGATCCTCCAGCGCGGGGATCTCATGCTGGAGTTCTTCGCCCACCCCAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCA
TCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTGTATACCGTCGACCTCTAGCTAGAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTC
配列番号32:抗VEGF軽鎖をコードする軽鎖
GACGGATCGGGAGATCTCCCGATCCCCTATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGTATCTGCTCCCTGCTTGTGTGTTGGAGGTCGCTGAGTAGTGCGCGAGCAAAATTTAAGCTACAACAAGGCAAGGCTTGACCGACAATTGCATGAAGAATCTGCTTAGGGTTAGGCGTTTTGCGCTGCTTCGCGATGTACGGGCCAGATATACGCGTTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCTCTGGCTAACTAGAGAACCCACTGCTTACTGGCTTATCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCCAAGCTGGCTAGCGTTTAAACTTAAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCCACTAGTCCAGTGTGGTGGAATTCTGCAGATATCCAGCACAGTGGCGGCCGCCatgggatggagctgtatcatcctcttcttggtggcaacagctacaggcgtgcactccgacatccagctgacccagtccccctccagcctgtccgcctctgtgggcgacagagtgaccatcacctgttccgccagccaggacatctccaactacctgaactggtatcagcagaagcccggcaaggcccccaaggtgctgatctacttcacctcctccctgcactccggcgtgccctccagattctccggctctggctccggcaccgactttaccctgaccatctccagcctgcagcccgaggacttcgccacctactactgccagcagtactccaccgtgccctggaccttcggccagggcaccaaggtggaaatcaagcggaccgtggccgctccctccgtgttcatcttcccaccctccgacgagcagctgaagtccggaaccgcctccgtcgtgtgcctgctgaacaacttctacccccgcgaggccaaggtgcagtggaaggtggacaacgccctgcagagcggcaactcc
caggaatccgtcaccgagcaggactccaaggacagcacctactccctgtccagcaccctgaccctgtccaaggccgactacgagaagcacaaggtgtacgcctgcgaagtgacccaccagggcctcagctccccagtgaccaagtccttcaaccggggcgagtgctagtaaTCTAGAGGGCCCGTTTAAACCCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGCTTCTGAGGCGGAAAGAACCAGCTGGGGCTCTAGGGGGTATCCCCACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTAATTCTGTGGAATGTGTGTCAGTTAGGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCAGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCTGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAAAGCTCCCGGGAGCTTGTATATCCATTTTCGGATCTGATCAAGAGACAGGATGAGGATCGTTTCGCATGATTGAACAAGATGGATTGCACGCAGGTTCTCCGGCCGCTTGGGTGGAGAGGCTATTCGGCTATGACTGGGCACAACAGACAATCGGCTGCTCTGATGCCGCCGTGTTCCGGCTGTCAGCGCAGGGGCGCCCGGTTCTTTTTGTCAAGACCGACCTGTCCGGTGCCCTGAATGAACTGCAGGACGAGGCAGCGCGGCTATCGTGGCTGGCCACGACGGGCGTTCCTTGCGCAGCTGTGCTCGACGTTGTCACTGAAGCGGGAAGGGACTGGCTGCTATTGGGCGAAGTGCCGGGGCAGGATCTCCTGTCATCTCACCTTGCTCCTGCCGAGAAAGTATCCATCATGGCTGATGCAATGCGGCGGCTGCATACGCTTGATCCGGCTACCTGCCCATTCGACCACCAAGCGAAACATCGCATCGAGCGAGCACGTACTCGGATGGAAGCCGGTCTTGTCGATCAGGATGATCTGGACGAAGAGCATCAGGGGCTCGCGCCAGCCGAACTGTTCGCCAGGCTCAAGGCGCGCATGCCCGACGGCGAGGATCTCGTCGTGACCCATGGCGATGCCTGCTTGCCGAATATCATGGTGGAAAATGGCCGCTTTTCTGGATTCATCGACTGTGGCCGGCTGGGTGTGGCGGACCGCTATCAGGACATAGCGTTGGCTACCCGTGATATTGCTGAAGAGCTTGGCGGCGAATGGGCTGACCGCTTCCTCGTGCTTTACGGTATCGCCGCTCCCGATTCGCAGCGCATCGCCTTCTATCGCCTTCTTGACGAGTTCTTCTGAGCGGGACTCTGGGGTTCGAAATGACCGACCAAGCGACGCCCAACCTGCCATCACGAGATTTCGATTCCACCGCCGCCTTCTATGAAAGGTTGGGCTTCGGAATCGTTTTCCGGGACGCCGGCTGGATGATCCTCCAGCGCGGGGATCTCATGCTGGAGTTCTTCGCCCACCCCAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTGTATACCGTCGACCTCTAGCTAGAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGA
GTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTC
Claims (14)
- PDGFアンタゴニストに連結したVEGFアンタゴニストを含むデュアルVEGF/PDGFアンタゴニストであって、前記VEGFアンタゴニストが、重鎖と軽鎖とを含む抗VEGF-A抗体であり、且つ前記PDGFアンタゴニストがPDGFR細胞外トラップセグメントであり、前記PDGFR細胞外トラップセグメントはヒトPDGFR-βのドメインD1~D3を含み、前記抗体の重鎖のN末端が前記PDGFR細胞外トラップセグメントのC末端に第1リンカーを介して融合し、且つ前記軽鎖が前記重鎖と複合体を形成する、デュアルVEGF/PDGFアンタゴニスト。
- a)前記抗体がFab断片である、又は、
b)前記抗体がインタクトな抗体である、請求項1に記載のデュアルアンタゴニスト。 - a)前記PDGFR細胞外トラップセグメントが、PDGF-BB、PDGF-AB、PDGF-CC、及びPDGF-DDの1つ以上に結合し、又は
b)前記PDGFR細胞外トラップが、PDFGR-αβ及びPDFGR-ββ受容体のいずれか1つに対するPDGF-AB、PDGF-BB、PDGF-CC、PDGF-DDの結合を阻害し、又は
c)前記PDGFR細胞外トラップセグメントが配列番号11のアミノ酸33~314を含む、請求項1に記載のデュアルVEGF/PDGFアンタゴニスト。 - 前記第1リンカーが、
a)アミノ酸配列GG、若しくは配列番号40か配列番号41のアミノ酸配列、又は、
b)アミノ酸配列GGGGSGGGGS、若しくはアミノ酸配列GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSG、又は、
c)アミノ酸配列GGGGSGGGGSを有する、請求項1に記載のデュアルVEGF/PDGFアンタゴニスト。 - a)前記抗VEGF-A抗体は、
CDRH1:GYDFTHYGMN、CDRH2:WINTYTGEPTYAADFKR、及びCDRH3:YPYYYGTSHWYFDV、且つ、
CDRL1:SASQDISNYLN、CDRL2:FTSSLHS、及びCDRL3:QQYSTVPWT、を含む、並びに/又は、
b)前記重鎖アイソタイプがCH1、ヒンジ、CH2、及びCH3ドメインを含むIgG1であり、且つ軽鎖アイソタイプはκである、並びに/又は、
c)前記重鎖アイソタイプがIgG1であり、IgG1定常ドメインは配列番号17に示す配列を有し、且つ前記軽鎖定常領域は配列番号18に示す配列を有する、並びに/又は
d)前記重鎖がIgG1であり、定常ドメインを含み、前記定常ドメインはエフェクター機能を低減させる1つ以上の突然変異を有し、前記1つ以上の突然変異が、
i)E233P、L234V、L234A、L235A、G237A、A327G、A330S及びP331S(EU付番)からなる群から選択される、若しくは、
ii)以下のアミノ酸位置(EU付番):E233、L234、L235、G236、G237、A327、A330、及びP331の1つ以上にある、並びに/又は、
e)前記重鎖がシステイン残基を更に含み、
i)前記システイン残基が非天然システイン残基である、又は、
ii)前記システイン残基が(EU付番)Q347C及びL443Cからなる群から選択される、又は、
iii)前記システイン残基がL443Cである、又は、
iv)前記細胞外トラップセグメントと融合した前記重鎖が配列番号9のアミノ酸配列を有し、且つ前記軽鎖が配列番号10のアミノ酸配列を有する、
請求項1、3、4のいずれかに記載のデュアルVEGF/PDGFアンタゴニスト。 - 前記抗体の前記重鎖のFc領域に共有結合的に結合しているポリマーからなる半減期延長部分を更に含む、請求項1から5のいずれかに記載のデュアルVEGF/PDGFアンタゴニスト。
- a)前記ポリマーが3本以上のアームを有する分岐ポリマー、又は、
b)前記ポリマーが500,000~1,000,000Daのピーク分子量を有する、又は、
c)前記ポリマーが双性イオンポリマーである、又は、
d)前記ポリマーが、ホスホリルコリンを含む単量体を有する双性イオンポリマーである、又は、
e)前記ポリマーが、2-(アクリロイルオキシエチル)-2’-(トリメチルアンモニウムエチル)ホスフェートを含む単量体を有する双性イオンポリマーである、又は、
f)前記ポリマーが、2-(メタクリロイルオキシエチル)-2’-(トリメチルアンモニウムエチル)ホスフェート(HEMA-PC)を含む単量体を有する双性イオンポリマーである、又は、
g)前記ポリマーが9本のアームを有する分岐ポリマー、又は、
h)前記ポリマーが、9個のポリマー開始部位を有する開始剤と合成され、当該開始剤はOG1786を選択可能である、又は、
i)前記ポリマーが300,000~1,750,000Daのピーク分子量を有する、又は、
j)前記ポリマーが600,000~800,000Daのピーク分子量を有する、又は、
k)前記ポリマーが600,000~800,000Daのピーク分子量を有し、前記ポリマーは9本のアームを有する分岐ポリマーである、又は、
l)前記ポリマーが、アミノ基、ヒドロキシル基、スルフヒドリル基及びカルボキシル基からなる群から選択される部分に共有結合的に結合している、又は、
m)前記ポリマーがスルフヒドリル基に共有結合的に結合している、又は、
n)前記ポリマーが、PEG及び双性イオンポリマーからなる群から選択される、又は、
o)前記ポリマーが、3、4、5、6、7、8、9、10、11又は12本のアームを有する、又は、
p)前記細胞外トラップセグメントと結合した前記重鎖が、配列番号9のアミノ酸配列を有し、前記ポリマーが配列番号9の741位でシステイン残基に共有結合的に結合している、又は、
q)前記ポリマーが、約100kDa~1500kDaのMwによって計測される分子量を有し、又は、
r)前記ポリマーが、約100kDa~1500kDaのMwによって計測される分子量を有すると共に、前記ポリマーが、1個以上のポリマー開始部位、例えば、3、4、5、6、7、8、9、10、11、又は12個のポリマー開始部位、を有するATRPに好適な開始剤から作られる、
請求項6に記載のデュアルVEGF/PDGFアンタゴニスト。 - 前記スルフヒドリル基が天然に存在するシステイン残基に由来する、又は
前記スルフヒドリル基が非天然システイン残基に由来する、請求項7に記載のデュアルVEGF/PDGFアンタゴニスト。 - デュアルVEGF/PDGFアンタゴニストを精製する方法であって、
請求項1から8のいずれかに記載のデュアルVEGF/PDGFアンタゴニストを、前記デュアルVEGF/PDGFアンタゴニストに結合するアフィニティークロマトグラフィー残基と接触させるステップと、
アフィニティークロマトグラフィー樹脂から前記デュアルVEGF/PDGFアンタゴニストを溶出させて、前記デュアルVEGF/PDGFアンタゴニストを含むアフィニティークロマトグラフィー溶出液を形成するステップと、
前記アフィニティークロマトグラフィー溶出液を、前記デュアルVEGF/PDGFアンタゴニストと結合するイオン交換樹脂と接触させるステップと、
前記イオン交換樹脂から前記デュアルVEGF/PDGFアンタゴニストを溶出させるステップと
を含む方法。 - a)前記イオン交換樹脂が陰イオン交換樹脂である、又は、
b)前記イオン交換樹脂が陽イオン交換樹脂である、又は、
c)前記アフィニティークロマトグラフィー樹脂がプロテインAカラムである、請求項9に記載の方法。 - 薬学的に許容可能な賦形剤と、請求項1から8のいずれかに記載のデュアルVEGF/PDGFアンタゴニストとを含む液体医薬組成物であって、0.2EU/ml未満を有する液体医薬組成物。
- a)前記組成物が0.1EU/ml未満を有する、又は、
b)前記組成物が0.05EU/ml未満を有する、請求項11に記載の液体医薬組成物。 - 疾患の治療又は予防のための、請求項1から8のいずれかに記載のデュアルVEGF/PDGFアンタゴニストであって、前記疾患が新生血管障害である、デュアルVEGF/PDGFアンタゴニスト。
- a)前記新生血管障害が網膜下線維症である、又は、
b)前記新生血管障害が眼新生血管障害である、又は、
c)前記新生血管障害が前記眼新生血管障害であり、該眼新生血管障害は湿潤型加齢黄斑変性症である、請求項13に記載のデュアルVEGF/PDGFアンタゴニスト。
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