JP2017526635A - デュアルpdgf/vegfアンタゴニスト - Google Patents
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Abstract
Description
本願は、2014年6月28日に出願された米国仮特許出願第62/018,579号明細書(あらゆる目的において全体として参照により援用される)の非仮出願である。
配列番号1は、PDGFRb−GS10−軽鎖抗VEGF−A(ベバシズマブ)のタンパク質配列である。
配列番号2は、抗VEGF−Aベバシズマブ重鎖である。
配列番号3は、PDGFRb−GG−軽鎖抗VEGF−A(ベバシズマブ)のタンパク質配列である。
配列番号4は、PDGFRβ−GS10−重鎖抗VEGF−A(ベバシズマブ)である。
配列番号5は、抗VEGF−Aベバシズマブ軽鎖である。
配列番号6は、PDGFRβ−GG−重鎖抗VEGF−A(ベバシズマブ)である。
配列番号7は、抗VEGF−A重鎖(ベバシズマブ)−GS21−PDGFRβである。
配列番号8は、TAF347の重鎖トラップ細胞外セグメント:PDGFR−βトラップ−抗VEGF−A重鎖(Q347C)のアミノ酸配列である。
配列番号9は、TAF443の重鎖トラップ細胞外セグメント:PDGFR−βトラップ−抗VEGF−A重鎖(L443C)のアミノ酸配列であり、配列番号10は、抗VEGF−Aの軽鎖のアミノ酸配列である。
配列番号11は、ヒトPDGFR−βである。
配列番号12は、ラニビズマブ軽鎖である。
配列番号13は、ラニビズマブ重鎖である。
配列番号14は、ヒトVEGFR−1である。
配列番号15は、ヒトVEGFR−2である。
配列番号16は、ヒトVEGFR−3である。
配列番号17は、ヒトIgG1定常領域である。
配列番号18は、ヒトκ軽鎖定常領域である。
配列番号19は、図7のPDGFR−GS10−抗VEGF−A軽鎖である。
配列番号20は、図8のPDGFR−GG−抗VEGF−A軽鎖である。
配列番号21は、ベバシズマブFabである。
配列番号22は、PDGFR−β−GS10−抗VEGF−A Fabである。
配列番号23は、PDGFR−β−GG−抗VEGF−A Fabである。
配列番号24は、抗VEGF−A Fab−GS21−PDGFR−βである。
配列番号25は、特定の突然変異を含むPDGFR−β−GS10−抗VEGF−A Fabである。
配列番号26は、PDGFRβ−抗VEGF−A重鎖(1a)のタンパク質配列である。
配列番号27は、PDGFR−β(D2−D3)−抗VEGF−A重鎖(1b)のタンパク質配列である。
配列番号28は、PDGFR−β(D2−D3)−抗VEGF−A Fab(2b)のタンパク質配列である。
配列番号29は、PDGFR−β(D2−D3)−6xGS−抗VEGF−A Fabのタンパク質配列である。
配列番号30は、抗VEGF−A Fab−6xGS−PDGFR−β(D2−D3)のタンパク質配列である。
配列番号31は、重鎖抗VEGF−PDGFR融合物をコードする核酸である。
配列番号32は、軽鎖抗VEGFをコードする核酸である。
GGGGS(配列番号37)、GGGS(配列番号38)、GGGES(配列番号39)、GGGGSGGGGS(配列番号40)及びGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSG)(配列番号41)。
ラニビズマブCDRは、CDRH1:GYDFTHYGMN、CDRH2:WINTYTGEPTYAADFKR、及びCDRH3:YPYYYGTSHWYFDV(配列番号42〜44)、CDRL1:SASQDISNYLN、CDRL2:FTSSLHS及びCDRL3:QQYSTVPWT(配列番号45〜47)である。ベバシズマブCDRH1はGYTFTNYGMN(配列番号48)であり、CDRH3はYPHYYGSSHWYFDV(配列番号49)である。
「新生血管障害」は、変化した調節不全の又は調節されていない血管新生によって特徴付けられる障害又は病態である。新生血管障害の例としては、新生物形質転換(例えば癌)並びに糖尿病性網膜症及び加齢黄斑変性症を含めた眼新生血管障害が挙げられる。
本発明は、PDGFアンタゴニストに連結したVEGFアンタゴニストを含むデュアルVEGF/PDGFアンタゴニストを提供する。VEGFアンタゴニストはVEGF若しくはVEGFRに対する抗体であるか、又はVEGFR細胞外トラップセグメント(即ち、少なくとも1つのVEGFRと少なくとも1つのVEGFとの結合を阻害する1つ以上のVEGFR受容体の細胞外領域由来のセグメント)である。PDGFアンタゴニストはPDGF若しくはPDGFRに対する抗体であるか、又はPDGFR細胞外トラップセグメント(即ち、少なくとも1つのPDGFRと少なくとも1つのPDGFとの結合を阻害する、1つ以上のPDGFRの細胞外領域由来のセグメント)である。アンタゴニストの少なくとも一方は抗体でなく、又は換言すれば、アンタゴニストの少なくとも一方は細胞外トラップセグメントである。好ましくは、デュアルアンタゴニストは抗体アンタゴニストと1つの細胞外トラップセグメントアンタゴニストとを含む。かかるデュアルアンタゴニストにおいて、細胞外トラップセグメントは、好ましくは、任意選択でリンカーを介して抗体重鎖のN末端に融合される。抗体軽鎖は天然抗体と同じように抗体重鎖と複合体を形成する。かかるデュアルアンタゴニストは、好ましくは、デュアルアンタゴニストにコンジュゲートした半減期延長部分を含むコンジュゲートの形態で提供される。好ましくは、コンジュゲーションには、アンタゴニストに導入されているシステイン残基が使用される。より好ましくは、システイン残基はIgG1重鎖の347位又は443位である。半減期延長部分は双性イオンポリマーであることが好ましい。最も好ましくは双性イオンポリマーはホスホリルコリン含有ポリマーである。
a.1つ以上の単量体重合部位を有する開始剤と、アミン基を有する第1のリンカーとを提供するステップであって、開始剤がトリフルオロ酢酸塩である、ステップと、
b.重合に好適な1つ以上の単量体を提供するステップであって、単量体の少なくとも1つが双性イオンである、ステップと、
c.単量体を開始剤と反応させて、各々が単量体重合部位に対応する1本以上のポリマーアームを形成し、アミン基を含む第1のリンカーを有する開始剤−ポリマーコンジュゲートを提供するステップと、
d.少なくとも第2及び第3の反応基を有する第2のリンカーを提供するステップと、
e.第2のリンカーの第2及び第3の反応基の一方を開始剤−ポリマーコンジュゲートの第1のリンカーのアミン基にカップリングして、カップリングステップで使用されなかった1つ以上の反応基を有するリンカー−開始剤−ポリマーコンジュゲートを提供するステップと、
f.1つ以上の機能性薬剤をリンカー−開始剤−ポリマー部分の未反応反応基の1つ以上にカップリングして、ポリマー−機能性薬剤コンジュゲートを提供するステップと
を有し得る。
且つR9は、
を有する活性化エステルを含む。
以下の図7A、図7Bに示す配列を有するPDGFR−βトラップ−抗VEGF−A軽鎖/抗VEGF−A重鎖を構築した。PDGFR−GS10−抗VEGF−A軽鎖アミノ酸1〜282はヒトPDGFR−β(UniProtKB/Swiss−Prot:P09619.1)の33〜314に対応し、その後にリンカー配列GGGGSGGGGS及びベバシズマブ軽鎖配列が続く。任意選択で、PDGFR−βセグメントと抗VEGFセグメントとの間にリンカーは使用しなくてもよい。或いはリンカーは、これらの2つのタンパク質の活性が最適となるような、GGGGSモチーフ×1、×2(上述のとおり)、×3、×4等であってもよい。G、GG、GGGS及びGGGES×1、×2、×3、×4等を含め、当業者に公知の他のリンカーモチーフも本発明において使用し得る。リンカーは上記の組み合わせであってもよい。図7Aの配列は配列番号19に示す。図7Bはベバシズマブ重鎖配列(配列番号2)を示す。ベバシズマブ軽鎖は、任意選択で、M4L突然変異(Kabat付番)を有する。ベバシズマブ重鎖は、任意選択で、以下の突然変異:T28D、N31H、H97Y、S100aT(Kabat付番)、L234A、L235A、G237A、Q347C及びL443C EU付番)の1つ以上を有する。
以下の図8A、図8Bに示す配列を有する別のPDGFR−βトラップ−抗VEGF−A軽鎖/抗VEGF−A重鎖を構築した。図8Aのアミノ酸1〜282はヒトPDGFR−β(UniProtKB/Swiss−Prot:P09619.1)の33〜314に対応し、その後にリンカー配列GG及びベバシズマブ軽鎖配列が続く。或いはリンカーは、これらの2つのタンパク質の活性が最適となるような、GGGGSモチーフ×1、×2、×3、×4等であってもよい。G、GG(上述のとおり)、GGGS及びGGGES×1、×2、×3、×4等を含め、他のリンカーモチーフも本発明において使用し得る。リンカーは上記の組み合わせであってもよい。図8Aのタンパク質配列は配列番号3に示す。図8Bはベバシズマブ重鎖配列(配列番号2)を示す。図8Aのベバシズマブ軽鎖は、任意選択で、M4L突然変異を有する。ベバシズマブ重鎖は、任意選択で、以下の突然変異:T28D、N31H、H97Y、S100aT(Kabat付番)、L234A、L235A、G237A、Q347C及びL443C(EU付番)の1つ以上を有する。
図9A、図9Bに示す配列を有する別のPDGFR−βトラップ−抗VEGF−A重鎖(野生型Fc)/抗VEGF−A軽鎖を構築した。図9Aのアミノ酸1〜282はヒトPDGFR−β(UniProtKB/Swiss−Prot:P09619.1)の33〜314に対応し、その後にリンカー配列GGGGSGGGGS、及び任意選択でQ347C又はL443C(EU付番)を有するベバシズマブ重鎖配列が続く。或いはリンカーは、これらの2つのタンパク質の活性が最適となるような、GGGGSモチーフ×1、×2(上述のとおり)、×3、×4等であってもよい。G、GG、GGGS及びGGGES×1、×2、×3、×4等を含め、他のリンカーモチーフも本発明において使用し得る。リンカーは上記の組み合わせであってもよい。図9Aのタンパク質配列は配列番号4に示す。図9Bのタンパク質はベバシズマブ軽鎖配列(配列番号5)である。ベバシズマブ軽鎖は、任意選択で、M4L突然変異を有する。ベバシズマブ重鎖は、任意選択で、以下の突然変異:T28D、N31H、H97Y、S100aT(Kabat付番)、L234A、L235A、G237A、Q347C及びL443C(EU付番)の1つ以上を有する。
以下の図10A、図10Bに示す配列を有する別のPDGFR−βトラップ−抗VEGF−A重鎖(野生型Fc)/抗VEGF−A軽鎖を構築した。図10Aのアミノ酸1〜282はヒトPDGFR−β(UniProtKB/Swiss−Prot:P09619.1)の33〜314に対応し、その後にリンカー配列GG、及び任意選択でQ347C又はL443Cを有するベバシズマブ重鎖配列が続く。或いはリンカーは、これらの2つのタンパク質の活性が最適となるような、GGGGSモチーフ×1、×2、×3、×4等であってもよい。G、GG(上述のとおり)、GGGS及びGGGES×1、×2、×3、×4等を含め、他のリンカーモチーフも本発明において使用し得る。リンカーは上記の組み合わせであってもよい。図10Aのタンパク質配列は配列番号6に示す。図10Bのタンパク質はベバシズマブ軽鎖配列(配列番号5)である。ベバシズマブ軽鎖は、任意選択で、M4L突然変異を有する。ベバシズマブ重鎖は、任意選択で、以下の突然変異:T28D、N31H、H97Y、S100aT(Kabat付番)、L234A、L235A、G237A、Q347C及びL443C(EU付番)の1つ以上を有する。
以下の図11A、図11Bに示す配列を有する、抗VEGF−A重鎖がPDGFR−βトラップの上流又はN末端側にあるPDGFR−βトラップ−抗VEGF−A抗体コンストラクトを構築した。図11Aのアミノ酸1〜451は、任意選択でQ347C又はL443Cを有するベバシズマブ重鎖配列に対応し、その後にリンカー配列GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGが続く。或いはリンカーは、これらの2つのタンパク質の活性が最適となるような、GGGGSモチーフ×1、×2(上述のとおり)、×3、×4等であってもよい。G、GG、GGGS及びGGGES×1、×2、×3、×4等を含め、他のリンカーモチーフも本発明において使用される。リンカーは上記の組み合わせであってもよい。リンカーの後ろには、ヒトPDGFR−β(UniProtKB/Swiss−Prot:P09619.1)のアミノ酸配列33〜314が続く。図11Aのタンパク質配列は配列番号7に示す。図11Bはベバシズマブ軽鎖配列(配列番号5)を示す。ベバシズマブ軽鎖は、任意選択で、M4L突然変異を有する。ベバシズマブ重鎖は、任意選択で、以下の突然変異:T28D、N31H、H97Y、S100aT(Kabat付番)、L234A、L235A、G237A、Q347C及びL443C(EU付番)の1つ以上を有する。
以下の図12A、図12Bに示す配列を有する別のPDGFR−βトラップ−抗VEGF−A重鎖(Q347C)/抗VEGF−A軽鎖を構築した。図12Aのアミノ酸1〜282はヒトPDGFR−β(UniProtKB/Swiss−Prot:P09619.1)の33〜314に対応する。PDGFR配列の後には、10アミノ酸リンカーGGGGSGGGGSが直ちに続く。任意選択で、PDGFR−βセグメントと抗VEGFセグメントとの間にリンカーは使用しなくてもよい。リンカーは上記の組み合わせであってもよい。リンカーのセリン残基のカルボキシル末端には、以下のアミノ酸:T28D、N31H、H97Y、S100aT(Kabat付番)、L234A、L235A、G237A及びQ347C(EU付番)を含むベバシズマブ重鎖が結合している。図12Aのタンパク質配列は配列番号8に示す。図12Bのタンパク質はラニビズマブ軽鎖(M4Lを含むベバシズマブ)(配列番号12)である。
以下の図13A、図13Bに示す配列を有する別のPDGFR−βトラップ−抗VEGF−A重鎖(L443C))/抗VEGF−A軽鎖を構築した。図13Aのアミノ酸1〜282はヒトPDGFR−β(UniProtKB/Swiss−Prot:P09619.1)の33〜314に対応する。PDGFR配列の後には、10アミノ酸リンカーGGGGSGGGGSが直ちに続く。リンカーのセリン残基のカルボキシル末端には、以下のアミノ酸:T28D、N31H、H97Y、S100aT(Kabat付番)、L234A、L235A、G237A及びL443C(EU付番)を含むベバシズマブ重鎖が結合している。TAF443軽鎖は、M4L変化(Kabat付番)を除いてベバシズマブと同じである。図13Aのタンパク質配列は配列番号9に示す。図13Bはラニビズマブ軽鎖(M4Lを含むベバシズマブ)(配列番号12)を示す。
以下の図14A、図14Bに示す配列を有するPDGFR−βトラップ−抗VEGF−A軽鎖/抗VEGF−A Fabを構築した。図14Aのアミノ酸1〜282はヒトPDGFR−β(UniProtKB/Swiss−Prot:P09619.1)の33〜314に対応し、その後にリンカー配列GGGGSGGGGS及びベバシズマブ軽鎖配列が続く。任意選択で、PDGFR−βセグメントと抗VEGFセグメントとの間にリンカーは使用しなくてもよい。或いはリンカーは、これらの2つのタンパク質の活性が最適となるような、GGGGSモチーフ×1、×2(上述のとおり)、×3、×4等であってもよい。G、GG、GGGS及びGGGES×1、×2、×3、×4等を含め、他のリンカーモチーフも本発明において使用し得る。リンカーは上記の組み合わせであってもよい。図14Aのタンパク質配列は配列番号1に示す。図14Bのタンパク質はベバシズマブFab(配列番号21)である。図14Aのベバシズマブ軽鎖は、任意選択で、M4L突然変異を有する。第2のタンパク質のベバシズマブFabは、任意選択で、以下の突然変異:T28D、N31H、H97Y、及びS100aTの1つ以上を有する。第2の鎖のベバシズマブFabは、任意選択で、半減期延長部分をコンジュゲートするためC末端に付加されたシステイン部分を有する。好ましくは、システイン部分はSGGGC又はCAAを介して付加される。或いは、SGGGC又はCAAは軽鎖のC末端に付加されてもよい。
以下の図15A、図15Bに示す配列を有するPDGFR−βトラップ−抗VEGF−A軽鎖/抗VEGF−A Fabを構築した。図15Aのアミノ酸1〜282はヒトPDGFR−β(UniProtKB/Swiss−Prot:P09619.1)の33〜314に対応し、その後にリンカー配列GG及びベバシズマブ軽鎖配列が続く。任意選択で、PDGFR−βセグメントと抗VEGFセグメントとの間にリンカーは使用しなくてもよい。或いはリンカーは、これらの2つのタンパク質の活性が最適となるような、GGGGSモチーフ×1、×2、×3、×4等であってもよい。G、GG(上記のとおり)、GGGS及びGGGES×1、×2、×3、×4等を含め、他のリンカーモチーフも本発明において使用し得る。リンカーは上記の組み合わせであってもよい。図15Aのタンパク質配列は配列番号3に示す。図15BはベバシズマブFab(配列番号21)の重鎖を示す。図15Aのベバシズマブ軽鎖は、任意選択で、M4L突然変異(Kabat付番)を有する。図15BのベバシズマブFabは、任意選択で、以下の突然変異:T28D、N31H、H97Y、及びS100aT(Kabat付番)の1つ以上を有する。図15BのベバシズマブFabは、任意選択で、半減期延長部分をコンジュゲートするためC末端に付加されたシステイン部分を有する。好ましくは、システイン部分はSGGGC又はCAAを介して付加される。或いは、SGGGC又はCAAは軽鎖のC末端に付加されてもよい。
以下の図16A、図16Bに示す配列を有する別のPDGFR−βトラップ−抗VEGF−A Fab/抗VEGF−A軽鎖を構築した。図16Aのアミノ酸1〜282はヒトPDGFR−β(UniProtKB/Swiss−Prot:P09619.1)の33〜314に対応し、その後にリンカー配列GGGGSGGGGS及びベバシズマブFab配列が続く。任意選択で、PDGFR−βセグメントと抗VEGFセグメントとの間にリンカーは使用しなくてもよい。或いはリンカーは、これらの2つのタンパク質の活性が最適となるような、GGGGSモチーフ×1、×2(上記のとおり)、×3、×4等であってもよい。G、GG、GGGS及びGGGES×1、×2、×3、×4等を含め、他のリンカーモチーフも本発明において使用し得る。リンカーは上記の組み合わせであってもよい。図16Aのタンパク質配列は配列番号22に示す。図16Bはベバシズマブ軽鎖配列(配列番号5)を示す。ベバシズマブ軽鎖は、任意選択で、M4L突然変異を有する。ベバシズマブ重鎖は、任意選択で、以下の突然変異:T28D、N31H、H97Y、及びS100aT(Kabat付番)の1つ以上を有する。重鎖は、任意選択で、半減期延長部分をコンジュゲートするためC末端に付加されたシステイン部分を有する。好ましくは、システイン部分はSGGGC又はCAAを介して付加される。或いは、SGGGC又はCAAは軽鎖のC末端に付加されてもよい。
以下の図17A、図17Bに示す配列を有する別のPDGFR−βトラップ−抗VEGF−A Fab/抗VEGF−A軽鎖を構築した。図17Aのアミノ酸1〜282はヒトPDGFR−β(UniProtKB/Swiss−Prot:P09619.1)の33〜314に対応し、その後にリンカー配列GGGGSGGGGS及びベバシズマブFab配列が続く。任意選択で、PDGFR−βセグメントと抗VEGFセグメントとの間にリンカーは使用しなくてもよい。或いはリンカーは、これらの2つのタンパク質の活性が最適となるような、GGGGSモチーフ×1、×2(上記のとおり)、×3、×4等であってもよい。G、GG、GGGS及びGGGES×1、×2、×3、×4等を含め、他のリンカーモチーフも本発明において使用し得る。リンカーは上記の組み合わせであってもよい。図17Aのタンパク質配列は配列番号23に示す。図17Bはベバシズマブ軽鎖配列(配列番号5)を示す。ベバシズマブ軽鎖は、任意選択で、M4L突然変異を有する。ベバシズマブ重鎖は、任意選択で、以下の突然変異:T28D、N31H、H97Y、及びS100aT(Kabat付番)の1つ以上を有する。ベバシズマブFab重鎖は、任意選択で、半減期延長部分をコンジュゲートするためC末端に付加されたシステイン部分を有する。好ましくは、システイン部分はSGGGC又はCAAを介して付加される。或いは、SGGGC又はCAAは軽鎖のC末端に付加されてもよい。
以下の図18A、図18Bに示す配列を有する、抗VEGF−A重鎖がPDGFR−βトラップの上流又はN末端側にあるPDGFR−βトラップ−抗VEGF−A抗体コンストラクトを構築した。図18Aのアミノ酸1〜231はベバシズマブFabに対応し、その後にリンカー配列GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGが続く。任意選択で、PDGFR−βセグメントと抗VEGFセグメントとの間にリンカーは使用しなくてもよい。或いはリンカーは、これらの2つのタンパク質の活性が最適となるような、GGGGSモチーフ×1、×2、×3、×4等であってもよい。G、GG、GGGS及びGGGES×1、×2、×3、×4等を含め、他のリンカーモチーフも本発明において使用し得る。リンカーは上記の組み合わせであってもよい。リンカーの後には、ヒトPDGFR−β(UniProtKB/Swiss−Prot:P09619.1)のアミノ酸配列33〜314が続く。図18Aのタンパク質配列は配列番号24に示す。図18Bはベバシズマブ軽鎖配列(配列番号5)を示す。ベバシズマブ軽鎖は、任意選択で、M4L突然変異を有する。ベバシズマブ重鎖は、任意選択で、以下の突然変異:T28D、N31H、H97Y、及びS100aTの1つ以上を有する。図18Aのタンパク質は、任意選択で、半減期延長部分をコンジュゲートするためC末端に付加されたシステイン部分を有する。好ましくは、システイン部分はSGGGC又はCAAを介して付加される。或いは、SGGGC又はCAAは図18Bの軽鎖のC末端に付加されてもよい。
以下の図19A、図19Bに示す配列を有する別のPDGFR−βトラップ−抗VEGF−A Fab/抗VEGF−A軽鎖を構築した。図19Aのアミノ酸1〜282はヒトPDGFR−β(UniProtKB/Swiss−Prot:P09619.1)の33〜314に対応する。PDGFR配列の後には、10アミノ酸リンカーGGGGSGGGGSが直ちに続く。任意選択で、PDGFR−βセグメントと抗VEGFセグメントとの間にリンカーは使用しなくてもよい。或いはリンカーは、これらの2つのタンパク質の活性が最適となるような、GGGGSモチーフ×1、×2(上記のとおり)、×3、×4等であってもよい。G、GG、GGGS及びGGGES×1、×2、×3、×4等を含め、他のリンカーモチーフも本発明において使用し得る。リンカーは上記の組み合わせであってもよい。リンカーのセリン残基のカルボキシル末端には、突然変異T28D、N31H、H97Y、及びS100aT(Kabat付番)を有するベバシズマブFabが結合している。図19Aのタンパク質配列は配列番号25に示す。図19Bのタンパク質はラニビズマブ軽鎖(M4Lを含むベバシズマブ)(配列番号12)である。図19Aのタンパク質は、任意選択で、半減期延長部分をコンジュゲートするためC末端に付加されたシステイン部分を有する。好ましくは、システイン部分はSGGGC又はCAAを介して付加される。或いは、SGGGC又はCAAは図19Bの軽鎖のC末端に付加されてもよい。
図20A、図20Bに示す配列を有する別のPDGFR−βトラップ−抗VEGF−A Fab/抗VEGF−A軽鎖を構築した。図20Aのアミノ酸1〜283はヒトPDGFR−β(UniProtKB/Swiss−Prot:P09619.1)の32〜314に対応し、その後にベバシズマブ重鎖が続く。図20Aのタンパク質配列は配列番号26に示す。図20Bのタンパク質はベバシズマブ軽鎖配列(配列番号5)である。この例に示すとおり、PDGFR−βセグメントと抗VEGFセグメントとの間にリンカーは使用しなくてもよい。或いはリンカーは、これらの2つのタンパク質の活性が最適となるような、GGGGSモチーフ×1、×2、×3、×4等であってもよい。G、GG、GGGS及びGGGES×1、×2、×3、×4等を含め、他のリンカーモチーフも本発明において使用し得る。リンカーは上記の組み合わせであってもよい。ベバシズマブ軽鎖は、任意選択で、M4L突然変異を有する。ベバシズマブ重鎖は、任意選択で、以下の突然変異:T28D、N31H、H97Y、S100aT(Kabat付番)、Q347C及びL443C(EU付番)の1つ以上を有する。
以下の図21A、図21Bに示す配列を有する別のPDGFR−βトラップ(D2−D3)−抗VEGF−A重鎖/抗VEGF−A軽鎖を構築した。図21Aのアミノ酸1〜190はヒトPDGFR−β(UniProtKB/Swiss−Prot:P09619.1)の125〜314に対応し、その後にベバシズマブ重鎖が続く。図21Aのタンパク質配列は配列番号27に示す。この例に示すとおり、PDGFR−βセグメントと抗VEGFセグメントとの間にリンカーは使用しなくてもよい。或いはリンカーは、これらの2つのタンパク質の活性が最適となるような、GGGGSモチーフ×1、×2、×3、×4等であってもよい。G、GG、GGGS及びGGGES×1、×2、×3、×4等を含め、他のリンカーモチーフも本発明において使用し得る。リンカーは上記の組み合わせであってもよい。図21Bはベバシズマブ軽鎖配列(配列番号5)を示す。ベバシズマブ軽鎖は、任意選択で、M4L突然変異を有する。ベバシズマブ重鎖は、任意選択で、以下の突然変異:T28D、N31H、H97Y、S100aT(Kabat付番)、Q347C及びL443C(Eu付番)の1つ以上を有する。
図22A、図22Bに示す配列を有する別のPDGFR−βトラップ(D2−D3)−抗VEGF−A Fab/抗VEGF−A軽鎖を構築した。図22Aのアミノ酸1〜190はヒトPDGFR−β(UniProtKB/Swiss−Prot:P09619.1)の125〜314に対応し、その後にベバシズマブFabが続く。この例に示すとおり、PDGFR−βセグメントと抗VEGFセグメントとの間にリンカーは使用しなくてもよい。或いはリンカーは、これらの2つのタンパク質の活性が最適となるような、GGGGSモチーフ×1、×2、×3、×4等であってもよい。GGGGSGGGGSリンカーが特に好ましい。G、GG、GGGS及びGGGES×1、×2、×3、×4等を含め、他のリンカーモチーフも本発明において使用し得る。リンカーは上記の組み合わせであってもよい。図22Aの配列は配列番号28に示す。図22Bはベバシズマブ軽鎖配列(配列番号5)を示す。ベバシズマブ軽鎖は、任意選択で、M4L突然変異を有する。ベバシズマブ重鎖は、任意選択で、以下の突然変異:T28D、N31H、H97Y、及びS100aT(Kabat付番)の1つ以上を有する。図22AのベバシズマブFabは、任意選択で、半減期延長部分をコンジュゲートするためC末端に付加されたシステイン部分を有する。好ましくは、システイン部分はSGGGC又はCAAを介して付加される。或いは、SGGGC又はCAAは図22Bの軽鎖のC末端に付加されてもよい。
以下の図23A、図23Bに示す配列を有する別のPDGFR−βトラップ(D2−D3)−6xGS−抗VEGF−A Fab/抗VEGF−A軽鎖を構築した。図23Aのアミノ酸1〜190はヒトPDGFR−β(UniProtKB/Swiss−Prot:P09619.1)の125〜314に対応し、その後にリンカーGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS及び次にベバシズマブFabが続く。任意選択で、PDGFR−βセグメントと抗VEGFセグメントとの間にリンカーは使用しなくてもよい。或いはリンカーは、これらの2つのタンパク質の活性が最適となるような、GGGGSモチーフ×1、×2、×3、×4等であってもよい。G、GG、GGGS及びGGGES×1、×2、×3、×4等を含め、当業者に公知の他のリンカーモチーフも本発明において使用し得る。リンカーは上記の組み合わせであってもよい。図23Aのタンパク質配列は配列番号29に示す。図23Bはベバシズマブ軽鎖配列(配列番号5)を示す。ベバシズマブ軽鎖は、任意選択で、M4L突然変異を有する。ベバシズマブ重鎖は、任意選択で、以下の突然変異:T28D、N31H、H97Y、及びS100aT(Kabat付番)の1つ以上を有する。ベバシズマブFab重鎖は、任意選択で、半減期延長部分をコンジュゲートするためC末端に付加されたシステイン部分を有する。好ましくは、システイン部分はSGGGC又はCAAを介して付加される。或いは、SGGGC又はCAAは軽鎖のC末端に付加されてもよい。
以下の図24A、図24Bに示す配列を有する別の抗VEGF−A Fab−6xGS−PDGFR−βトラップ(D2−D3)/抗VEGF−A軽鎖を構築した。図24Aのアミノ酸1〜190はヒトPDGFR−β(UniProtKB/Swiss−Prot:P09619.1)の125〜314に対応し、その後にリンカーGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS及び次にベバシズマブFabが続く。任意選択で、PDGFR−βセグメントと抗VEGFセグメントとの間にリンカーは使用しなくてもよい。或いはリンカーは、これらの2つのタンパク質の活性が最適となるような、GGGGSモチーフ×1、×2、×3、×4等であってもよい。G、GG、GGGS及びGGGES×1、×2、×3、×4等を含め、他のリンカーモチーフも本発明において使用し得る。リンカーは上記の組み合わせであってもよい。図24Aの配列は配列番号29に示す。図24Bはベバシズマブ軽鎖配列(配列番号5)を示す。図24Bのベバシズマブ軽鎖は、任意選択で、M4L突然変異を有する。第1のタンパク質のベバシズマブ重鎖は、任意選択で、以下の突然変異:T28D、N31H、H97Y、及びS100aT(Kabat付番)の1つ以上を有する。図24AのベバシズマブFabは、任意選択で、半減期延長部分をコンジュゲートするためC末端に付加されたシステイン部分を有する。好ましくは、システイン部分はSGGGC又はCAAを介して付加される。或いは、SGGGC又はCAAは軽鎖のC末端に付加されてもよい。
以下の図25A、図25Bに示す配列を有する別の抗VEGF−A Fab−6xGS−PDGFR−β(D2−D3)/抗VEGF−A軽鎖を構築した。図25Aのアミノ酸1〜231はベバシズマブFabに対応し、その後にリンカーGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS及び次にヒトPDGFR−β(UniProtKB/Swiss−Prot:P09619.1)の125〜314が続く。任意選択で、PDGFR−βセグメントと抗VEGFセグメントとの間にリンカーは使用しなくてもよい。或いはリンカーは、これらの2つのタンパク質の活性が最適となるような、GGGGSモチーフ×1、×2、×3、×4等であってもよい。G、GG、GGGS及びGGGES×1、×2、×3、×4等を含め、他のリンカーモチーフも本発明において使用し得る。リンカーは上記の組み合わせであってもよい。図25Aの配列は配列番号30に示す。図25Bはベバシズマブ軽鎖配列(配列番号5)を示す。ベバシズマブ軽鎖は、任意選択で、M4L突然変異を有する。ベバシズマブ重鎖は、任意選択で、以下の突然変異:T28D、N31H、H97Y、及びS100aT(Kabat付番)の1つ以上を有する。図25AのPDGFR−βは、任意選択で、半減期延長部分をコンジュゲートするためC末端に付加されたシステイン部分を有する。好ましくは、システイン部分はSGGGC又はCAAを介して付加される。或いは、SGGGC又はCAAは軽鎖のC末端に付加されてもよい。
TAF443重鎖及び軽鎖を発現プラスミドにクローニングし、CHO細胞にトランスフェクトした。細胞を適切な培地で成長させて回収した。TAF443は以下のとおり精製した。配列番号31及び32を発現するCHO細胞からの10L培養培地を5%(v/v)1.1M HEPES、0.22M EDTA、pH6.7又は10%0.55M Hepes、0.11M EDTA、5.5%Triton X−100、pH6.7で調整し、50mMトリス、150mM NaCl、pH7.5(5CV)で平衡化したMab Select Sure樹脂が充填された167/400mlプロテインAカラム(2ラン)にロードした。カラムを50mMトリス、150mM NaCl、pH7.5(2CV)、50mMトリス、0.5M CaCl2、pH7.5(5CV)、次に10mMトリス、10mM NaCl、pH7.5(3CV)で洗浄してから、150mMグリシン、40mM NaCl、pH3.5(4CV)を使用してタンパク質を溶出させた。画分をプールし、2Mグリシン、pH2.7を使用してpH3.5に調整し、次に2M HEPES、pH8.0を使用してpH7に中和した。プロテインAプールを、50mM Hepes、65mM NaCl、pH7.0(5CV)で平衡化した274ml TMAEカラムにロードした。このカラムを50mM Hepes、65mM NaCl、pH7.0(3CV)で洗浄し、次に50mMトリス、200mM NaCl、pH7.5(5CV)で溶出させた。溶出画分をプールし、PBS−CMF、pH7.2で平衡化した1150mL Sephadex G−25 Coarseカラムで緩衝液交換した。このプールをろ過し、30k MWCO VivaFlow200で>5mg/mlに濃縮した。濃縮したタンパク質を0.22umフィルタでろ過し、次にSDS−PAGE、分析的SEC、O.D.280/320、エンドトキシンLALアッセイ、プロテインA ELISA、IEF、及び凍結融解分析によって特徴付けた。
ショ糖などの賦形剤の存在下で、TAF二機能性分子をpH4.5〜7.5の範囲の標準製剤化緩衝液系列中50〜85mg/mlに濃縮した。これらの試料のアリコートを室温(RT)及び4℃で6週間にわたって保存し、時間0及びその後は後続の各週に試料を採取して、凝集した材料のパーセンテージを分析的SECによって計測した。以下の表に、TAF443の凝集に対するpHの効果を見ることができる。
TAFwt、TAF443及びTAF347のDNAコンストラクトをCHO−K1 SV SSIにトランスフェクトした:3プール/コンストラクト。細胞株のほとんどで、正常な3週間の回復が認められた。しかしながら、TAFwt及びTAF347細胞株は他の細胞株に約1週間の遅れを取った。プールの樹立後、ほとんどについては4日目及びTAFwt及びTAF347については3日目に、馴化培地試料をOctetにかけた。TAFwt及びTAF347の3日馴化培地はOctetによって約7mg/mlを示した。4日馴化培地は、TAF443について約21mg/mlを示した。プール間に僅かな差異が観察され、それらのプールを使用してプールのプールを作製し、それをタンパク質産生に進めた。
TAFのPDGFRセグメントは7個の推定グリコシル化部位を有する。このタンパク質は、SEC−MALS計測から、高度にグリコシル化しているものと思われる。
PBS、pH7.2中TAFwt、TAF443及びTAF347を熱安定性プロファイルにかけた。各タンパク質が3つのピークを有した(データは示さず)。ピークの相対位置を以下の表に示す。
熱に応じたこれらの3つのTAFタンパク質の溶液中の凝集物の割合を調べた(データは示さず)。タンパク質の各々(TAFwt、TAF347及びTAF443)の溶液は、約54℃を始点として凝集を示し始めた。タンパク質の各々についての凝集物の割合は、温度の増加に伴い急激に増加した。64℃で、TAFタンパク質の各々の略40%が凝集物を成した。凝集は最も低いTmで現れ始め、一見したところタンパク質のPDGFR部分のアンフォールディングに対応していることが注記される。
TAF443の熱安定性を、以下の表に示すとおりの様々なpHで調べた。非PBS緩衝液中では、4つの熱変性ピークが見られる。
表面プラズモン共鳴(SPR)を用いて、TAF−WT、TAF−347、TAF−443、TAF443−6A250K、及びTAF443−3A250KデュアルPDGF/VEGFアンタゴニスト変異体に対する組換えヒトPDGF−BB(PeproTech、100−14B)の結合動態を特徴付けた。初めに、製造者のプロトコルに従い、CM5カルボキシメチル化デキストランで被覆されたセンサーチップの4つ全てのフローセルに、約10,000共鳴単位(RU)の密度となるよう抗ヒトIgG抗体(GE Healthcare、BR−1008−39)を共有結合的にアミンカップリングした。各PDGF/VEGF変異体を約150RUのレベルまで捕捉した。PDGF分析のランニング及び試料緩衝液は、HBS−EP+300mM NaCl(10mM 4−(2−ヒドロキシエチル)−1−ピペラジンエタンスルホン酸(HEPES)pH7.4、300mM NaCl、3mMエチレンジアミン四酢酸(EDTA)、0.05%(v/v)Tween−20)であった。1nM〜0.125nMの濃度範囲のPDGF−BBの2倍段階希釈系列を110秒の会合について100μL/分の流量で注入し、解離は300から2700秒まで異なった。次に表面を3M MgCl2の30秒パルス、イオン再生緩衝液(0.46M KSCN、1.83M MgCl2、0.92M尿素、及び1.83Mグアニジン−HCl pH7.4、Andersson et al.,Analytical Chemistry,1999)の30秒パルスで再生し、次にHBS−EP+300mM NaClランニング緩衝液の30秒パルスで平衡化した。
TAF443システイン残基は、典型的には細胞培養培地中の化学物質によって「キャッピングされている」か、又は酸化されており、コンジュゲーションに利用することができない。これに関して、精製TAF443(OG1321)をデキャッピング(即ち還元)手順に供してキャップを除去し、遊離した(即ちCys−Cysジスルフィド結合に関与しないもの)システイン残基によるポリマーのマレイミド官能基とのコンジュゲーションを可能にする。デキャッピングはTAFタンパク質を30倍モル過剰の還元剤TCEP(3,3’,3’’−ホスファントリイルトリプロパン酸)と25℃で1時間混合することによって行われる。TCEPとの還元反応はSDS−PAGEによってモニタする。非変性TAFは約250kDa(この重量の約40kDaは炭水化物である)にシングルバンドとして泳動する。完全に変性したところで、このシングル250kDaバンドを軽鎖及び重鎖に対応するバンドに変換する。変性後、Pellion XL限外ろ過カセットを使用して、20mMトリス pH7.5、150mM NaCl、0.5mM TCEP緩衝液でUFdFによりTAFタンパク質を洗浄して、キャップを除去した。次に同じUFdFセットアップで、20mMトリス pH7.5、150mM NaClによってTCEP試薬を除去した。還元したTAFは空気(周囲酸素)を使用してリフォールディングさせ、これもアッセイとしてSDS−PAGEによって追跡した。
pH7.5トリス緩衝液中の15倍過剰のポリマーを使用してデキャッピングした後、OG1321とも称されるTAF443をポリマーOG1802(下記参照)にコンジュゲートして、図26に示すOG1448を作製した(図26は、バイオポリマーOG1802にコンジュゲートしたTAF443であるOG1448の化学構造を示す)。TAF443は、この図に示される分子の右端にあり、システイン443残基を介して5員環にコンジュゲートしている。コンジュゲーションはSDS−PAGEによってモニタし、略完了まで至らせた。コンジュゲートは陰イオン交換クロマトグラフィーによって精製し、UF/DFによって製剤化緩衝液中に緩衝液交換した。
上記に記載したとおりTAF443をOG1802とコンジュゲートした後、OG1448を以下のとおり精製した。上記に記載したとおりTAF443をOG1802とコンジュゲートした後、OG1448を以下のとおり精製した。約3:1の樹脂:コンジュゲート比に従い2×400mlのMacrocap Qカラムを充填した。このカラムを5MのNaClでフラッシュし、20mMトリス pH7.5、20mM NaCl(平衡化緩衝液)でサイホン処理によって平衡化した。コンジュゲーション反応混合物を20mMトリス pH7.5で希釈し、カラムにロードした。次にカラムを平衡化緩衝液でチェースし、20mMトリス pH7.5、50mM NaCl(Wash 1)、次に20mMトリス pH7.5、100mM NaCl(Wash 2)で洗浄した。150mM、200mM、220mM、250mM、300mM、及び500mM NaClの段階勾配として、20mMトリス pH7.5で溶出を行った。カラムのフロースルー、洗浄液、及び溶出液を全て、SDS−PAGE及びAEX分析用に清浄なボトルに回収した。コンジュゲートを含有する溶出画分をプールし、30kD MWCO及びPES膜を備えたPellicon XL TFFカセットを使用して濃縮した。次に同じTFFカセットを使用して、濃縮したプールを1×PBS pH7.4緩衝液で約100倍の緩衝液交換を行い、VIVACELL 100スピンコンセントレーターに移して、目標濃度(約30mg/ml)に達するまで更に濃縮した。ロットリリースのため、最終的なコンジュゲートを0.2μm PESシリンジフィルタでろ過した。
最終タンパク質(OG1321)又はコンジュゲート(OG1448)のエンドトキシンレベルを低減するため、タンパク質又はコンジュゲートのいずれについても、陰イオン交換の代わりに陽イオン交換を利用する精製手順を用い得る。例えば、OG1321の精製に関する上記の手順では、陰イオン交換TMAE樹脂が用いられる。TMAE樹脂の代わりに、陽イオン交換樹脂CEXを使用し得る。しかしながら、CEX残基を使用するためには、対象のタンパク質を含有する溶液のpHをタンパク質のpI未満に下げなければならない。OG1321について、プロテインAカラム後のタンパク質溶液のpHはpH3.5にまで下がる。OG1321はpH5でPoros XSカラムに結合する。次に、Porox XS(CEX)を使用してOG1321を結合し、溶出させることができる。
OG1802の第1の合成経路は以下のとおりである。初めに、図27に示す構造を有するTFA/アミン塩開始剤(化合物L)を以下のとおり合成した。
1H NMR(400MHz DMSO−d6):=1.36(s,9H,OCCH3),1.90(s,54H,CC(CH3)2Br),2.31(t,J=7.2Hz,6H,CCH2CH2NH),2.98(d,J=5.6Hz,6H,CCH2NH),3.04(q,J=6.0Hz,2H,OCH2CH2NH),3.18(s,2H,OCH2C),3.3−3.37(m,8H,CH2),3.47−3.55(m,12H,CH2),3.58(s,6H,OCH2C),3.87(s,6H,O=CCH2O),4.27(s,18H,CCH2OC=O),6.74(br t,1H,CH2NHC=O),7.69(t,J=6.8Hz,3H,CH2NHC=O),7.84(t,J=6.0Hz,3H,CH2NHC=O).
LC−MS(ES,m/z):[(M+2H−boc)/2]+(C84H136Br9N7O33+2H−Boc)/2の計算値=1196.6;実測値1196.6
1H NMR(400MHz DMSO−d6): =1.90(s,54H,CC(CH3)2Br),2.31(t,J=7.2Hz,6H,CCH2CH2NH),2.97−3.0(m,8H,CCH2NH及びOCH2CH2NH),3.17(s,2H,OCH2C),3.3(q,6H,CH2CH2NHC=O),3.4−3.59(m,20H,CH2),3.87(s,6H,O=CCH2O),4.27(s,18H,CCH2OC=O),7.69−7.84(m,9H,両方ともCH2NHC=O及びNH3+).
LC−MS(ES,m/z):[(M+2H)/2]+(C84H136Br9N7O33+2H)/2の計算値=1196.6;実測値1197.4
OG1448(及びOG1321)のその意図される標的に対する結合親和性をBiacoreアッセイで判定した。結合試験は、GLM(Proteon)及びCM4(Biacore)センサーチップを備えた、且つランニング緩衝液(10mM HEPES、150mM NaCl、0.005%Tween−20、0.2mg/ml BSA)で平衡化したBioRad Proteon XPR36及びBiacore 2000光学バイオセンサーを使用して、25℃及び37℃で実施した。OG1448、OG1321、ベバシズマブ、アフリベルセプト及び抗PDGFはアミンカップリングによってセンサー表面に固定化した。
抗VEGF活性に関するその潜在的効力の尺度として、VEGFA−165に対するTAF(OG1448及びOG1321)の結合活性を競合的結合アッセイで判定し、ここでは種々の濃度のTAFを、rhVEGFとの結合に関して固定化したrhVEGFRと競合させた。固定化したVEGFRが結合したrhVEGFA−165をELISAによって決定した(データは示さず)。
OG1448がrhPDGF−BBの存在下でrhVEGFA−165に結合することができるかどうか、即ち、TAFの受容体デコイに結合するrhPDGF−BBが、rhVEGFA−165に結合するTAFの能力を阻害するかどうかを判定するため、実施例27と同様の結合試験を、但し様々な濃度のrhPDGF−BBの存在下で実施した。
抗PDGF活性のその潜在的効力の尺度として、rhPDGF−BBに対するTAF(OG1448及びOG1321)の結合活性を競合的結合アッセイで判定し、ここでは種々の濃度のTAFをrhPDGFBBとの結合に関して固定化したPDGFRと競合させた。固定化したPDGFRに結合したrhPDGF−BBをELISAアッセイによって決定した。
OG1448がrhVEGFA−165の存在下でrhPDGF−BBに結合することができるかどうかを判定するため、PDGFに関する結合試験(実施例29のとおり)の同様の競合阻害を、rhVEGFA−165の存在下及び非存在下で実施した。
内皮細胞増殖は、血管新生、従って新生血管AMDの発病において極めて重要な段階である。OG1448が初代ヒト網膜微小血管内皮細胞に対するVEGFの増殖作用をアンタゴナイズする能力は、新生血管AMDの治療におけるその生物活性の尺度であり得る。
周皮細胞遊走及び増殖は血管新生において決定的に重要なイベントであり、従って新生血管AMDの発病において重要な役割を果たす。TAF(OG1448及びOG1321)がヒト脳周皮細胞に対するPDGFの増殖作用をアンタゴナイズする能力は、新生血管AMDの治療におけるその有効性の尺度であり得る。
内皮細胞及び周皮細胞が血管に共存し、新生血管AMDにおいて決定的に重要なイベントである血管新生の間に共に増殖及び遊走するインビボ条件を模倣するため、この複雑なモデルにおいてOG1448が血管新生を阻害する能力を判定する目的で、HRMVECとHMPとの三次元共培養を樹立した。
十分に認められている霊長類CNVモデルであるカニクイザルにおけるレーザー誘発性脈絡膜血管新生(CNV)モデルを使用して、OG1448のインビボ有効性を判定した。例えば、Nork TM,Dubielzig RR,Christian BJ,et al.2011.Prevention of experimental choroidal neovascularization and resolution of active lesions by VEGF trap in nonhuman primates.Arch Ophthalmol.129:1042−1052;Lloyd RL,Harris J,Wadhwa S,Chambers W.2008.Food and Drug Administration approval process for ophthalmic drugs in the U.S.Curr Opin Ophthalmol.19:190−194(これらは両方とも本明細書によって参照により援用される)を参照されたい。このモデルでは、ブルッフ膜破損所見のあるサル眼の黄斑部における脈絡網膜複合体にレーザー病変が設けられる。2〜3週間で脈絡膜血管新生が生じる。様々な時点で、フルオレセイン血管造影を用いて、原発病変を越えるフルオレセイン漏出を示す臨床的に関連性のある病変(グレードIV)を判定する。このCNVモデルはCNV病変の研究に広く用いられており、現在承認されているあらゆる新生血管AMD治療のベンチマークとして使用されている。このモデルでは、新生血管AMDに対する承認済みの抗VEGF剤は全て、臨床的に関連性のあるグレードIV病変からの漏出の阻害に有効である。この試験はCovance、Madison、WIで行われた。
雄性ニュージーランド赤白F1交雑有色ウサギを使用して、125I−OG1448を用いた組織分布及び薬物動態試験を実施した。要約すれば、この試験は、ウサギにおいてOG1448の16.1日の硝子体半減期を示し、これはアフリベルセプトについて報告されている半減期(4.5日)の約3倍及びラニビズマブの半減期(2.9日)の5倍(Bakri SJ,Snyder MR,Reid JM et al.2007.Pharmacokinetics of Intravitreal Ranibizumab [Lucentis].Ophthalmology 114:2179−2182)であり、血漿曝露は僅か(硝子体曝露の約0.2%)で、血漿中半減期は6.5日であった(アフリベルセプトは6.5日と報告されている)(Struble C,Koehler−Stec E,Zimmer E,and Tu W.2008.Pharmacokinetics and ocular tissue penetration of VEGF Trap after intravitreal injections in rabbits.EVER;Portorz,Slovenia)。
OG1448に関する2つのパイロット非GLP単回投与眼及び全身忍容性試験をCovanceで実施した:(i)有色ウサギにおける単回投与57日間硝子体内又は静脈内忍容性試験及び(ii)カニクイザルにおける硝子体内(58日間試験)又は静脈内(28日間試験)投与後の単回投与忍容性試験。
本試験のこの部分の目的は、カニクイザルにおける硝子体内投与又は静脈内投与後のOG1448の忍容性を判定することであった。
OG1786は、OG1802の合成において前駆体として使用されるポリマー合成用の9アーム開始剤である。各アームの末端は、ATRP下で重合を開始させることが可能な2−ブロモイソ酪酸塩である。OG1786は、図30に示されるとおり、トリフルオロ酢酸(TFA)の塩である。OG1786は以下のとおり調製される。初めに、OG1550をTFA(トリフルオロ酢酸)と反応させて、図31に示すとおりのOG1546を生成する。
化合物OG1802をTAF443のスルフヒドリル基にコンジュゲートしてOG1448を作製する。ポリマーOG1801は、初めに開始剤OG1786から作られる。OG1801はアミン官能基を有し、これはポリマー合成中の安定性が(マレイミドと比べて)高い。ポリマーOG1801の合成には改良型のATRPを使用し、ここではCu(II)に金属銅を加えることによってインサイチュで銅種(Cu(I))を生成させる。この反応に必要な出発物質及び試薬は、単量体(HEMA−PC)OG47のバッチ入力、並びに目標分子量(MW)に基づき計算する。
反応に必要な出発物質及び試薬は、OG1801のバッチ入力に基づき計算する。リンカーは3−マレイミドプロピオン酸、NHSエステルである。30mlの0.5Mリン酸ナトリウム(WFI中、pH8)を50gのポリマー溶液(約150mg/mL)に添加した。1分間撹拌させておいた。pHはpH試験紙によるときに8.0であった。204.8mgのリンカーを秤量し、DMF 4.1mL中に溶解して50mg/mLのストック溶液とした。激しく撹拌しながらポリマー溶液にリンカー溶液を毎分815uLで滴下して添加した。5分間かけて4095uLのリンカー溶液を添加した。室温で30分間反応させた。最終pHが5に達するように20mLの5%酢酸で反応をクエンチした。1L真空フィルタ(0.2um)を使用してこの溶液をろ過した。
1.7mM KH2PO4;5mM Na2HPO4;150mM NaClを使用して滅菌注射用水中にOG1448の27.2mg/ml及び44.5mg/ml溶液を調製した。容積に応じてMillipore Pellicon XL TFFカートリッジ(カタログ番号PXB030A50、EMD Millipore)、30kD MWCO又はVIVACELL 100スピンコンセントレーター(カタログ番号VC1022、Sartorius)、30kD MWCOにより、OG1448コンジュゲートを濃縮した。上記に記載する有効性実験用のサルにおいて30ゲージ(G)の1/2インチ針で27.2mg/mlのTAF溶液を硝子体内注射した。OG1448を針に押し通すのに、過度の圧力は不要であった。実験室で易注入性について44.5mg/ml溶液を試験し、これも過度の圧力なしに女性の操作者が針に押し通すことが可能であった。
PBS中44.5mg/ml、pH7.4のOG1448基準ロットR5606(上記に記載したとおり)を使用して、進行中の安定性試験を実施した。この試験には3つの温度を選択した:室温(RT)、4℃及び−20℃。試料抜き取り頻度は、0、14、28、91、181及び362日である。試料は、未反応の及び捕捉されたタンパク質、並びに可能性のある凝集について、SDS−PAGE及び分析的AE−HPLCによって判定した。AE−HPLCによるとき、OG1448は3つ全ての温度で最長6ヵ月まで、時点0のレベルと同程度である5%未満のタンパク質不純物を示すことが観察された(データは示さず)。この試験は進行中である。
HEA−PCポリマーを以下に記載するとおり合成した。HEA−PC(2−(アクリロイルオキシ)エチル−2−(トリメチルアンモニウム)エチルホスフェート)(これは、上記に記載したメタクリレートHEMA−PCとは対照的に、アクリレートである)は、以下の構造を有する。
ポリマーOG1801にマレイミド官能基を付加してOG1802を形成した後(上記参照)、エルマンアッセイを用いて試料中の官能性マレイミド(即ちコンジュゲート可能)の量を決定する。チオールは、中性及びアルカリpHの水中でエルマン試薬(DTNB)をTNB−、次にTNB2−に変換し、これにより黄色が発色する(412nmで計測)。システインで標準曲線を作成する。マレイミドはチオールと反応するため、このアッセイは実際には残ったチオール(システイン)を計測する。(元のチオール−マレイミドポリマーを加えた後に残ったチオール)/(元のチオール)として阻害を計算し、パーセンテージで表す。
配列番号1
1 LVVTPPGPEL VLNVSSTFVL TCSGSAPVVW ERMSQEPPQE MAKAQDGTFS SVLTLTNLTG LDTGEYFCTH NDSRGLETDE
81 RKRLYIFVPD PTVGFLPNDA EELFIFLTEI TEITIPCRVT DPQLVVTLHE KKGDVALPVP YDHQRGFSGI FEDRSYICKT
161 TIGDREVDSD AYYVYRLQVS SINVSVNAVQ TVVRQGENIT LMCIVIGNEV VNFEWTYPRK ESGRLVEPVT DFLLDMPYHI
241 RSILHIPSAE LEDSGTYTCN VTESVNDHQD EKAINITVVE SGGGGGSGGG GSDIQMTQSP SSLSASVGDR VTITCSASQD
321 ISNYLNWYQQ KPGKAPKVLI YFTSSLHSGV PSRFSGSGSG TDFTLTISSL QPEDFATYYC QQYSTVPWTF GQGTKVEIKR
401 TVAAPSVFIF PPSDEQLKSG TASVVCLLNN FYPREAKVQW KVDNALQSGN SQESVTEQDS KDSTYSLSST LTLSKADYEK
481 HKVYACEVTH QGLSSPVTKS FNRGEC
配列番号2
1 EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGYTFT NYGMNWVRQA PGKGLEWVGW INTYTGEPTY AADFKRRFTF SLDTSKSTAY
81 LQMNSLRAED TAVYYCAKYP HYYGSSHWYF DVWGQGTLVT VSSASTKGPS VFPLAPSSKS TSGGTAALGC LVKDYFPEPV
161 TVSWNSGALT SGVHTFPAVL QSSGLYSLSS VVTVPSSSLG TQTYICNVNH KPSNTKVDKK VEPKSCDKTH TCPPCPAPEL
241 LGGPSVFLFP PKPKDTLMIS RTPEVTCVVV DVSHEDPEVK FNWYVDGVEV HNAKTKPREE QYNSTYRVVS VLTVLHQDWL
321 NGKEYKCKVS NKALPAPIEK TISKAKGQPR EPQVYTLPPS REEMTKNQVS LTCLVKGFYP SDIAVEWESN GQPENNYKTT
401 PPVLDSDGSF FLYSKLTVDK SRWQQGNVFS CSVMHEALHN HYTQKSLSLS PGK
配列番号3
1 LVVTPPGPEL VLNVSSTFVL TCSGSAPVVW ERMSQEPPQE MAKAQDGTFS SVLTLTNLTG LDTGEYFCTH NDSRGLETDE
81 RKRLYIFVPD PTVGFLPNDA EELFIFLTEI TEITIPCRVT DPQLVVTLHE KKGDVALPVP YDHQRGFSGI FEDRSYICKT
161 TIGDREVDSD AYYVYRLQVS SINVSVNAVQ TVVRQGENIT LMCIVIGNEV VNFEWTYPRK ESGRLVEPVT DFLLDMPYHI
241 RSILHIPSAE LEDSGTYTCN VTESVNDHQD EKAINITVVE SGGGDIQMTQ SPSSLSASVG DRVTITCSAS QDISNYLNWY
321 QQKPGKAPKV LIYFTSSLHS GVPSRFSGSG SGTDFTLTIS SLQPEDFATY YCQQYSTVPW TFGQGTKVEI KRTVAAPSVF
401 IFPPSDEQLK SGTASVVCLL NNFYPREAKV QWKVDNALQS GNSQESVTEQ DSKDSTYSLS STLTLSKADY EKHKVYACEV
481 THQGLSSPVT KSFNRGEC
配列番号4
1 LVVTPPGPEL VLNVSSTFVL TCSGSAPVVW ERMSQEPPQE MAKAQDGTFS SVLTLTNLTG LDTGEYFCTH NDSRGLETDE
81 RKRLYIFVPD PTVGFLPNDA EELFIFLTEI TEITIPCRVT DPQLVVTLHE KKGDVALPVP YDHQRGFSGI FEDRSYICKT
161 TIGDREVDSD AYYVYRLQVS SINVSVNAVQ TVVRQGENIT LMCIVIGNEV VNFEWTYPRK ESGRLVEPVT DFLLDMPYHI
241 RSILHIPSAE LEDSGTYTCN VTESVNDHQD EKAINITVVE SGGGGGSGGG GSEVQLVESG GGLVQPGGSL RLSCAASGYT
321 FTNYGMNWVR QAPGKGLEWV GWINTYTGEP TYAADFKRRF TFSLDTSKST AYLQMNSLRA EDTAVYYCAK YPHYYGSSHW
401 YFDVWGQGTL VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KSTSGGTAAL GCLVKDYFPE PVTVSWNSGA LTSGVHTFPA VLQSSGLYSL
481 SSVVTVPSSS LGTQTYICNV NHKPSNTKVD KKVEPKSCDK THTCPPCPAP ELLGGPSVFL FPPKPKDTLM ISRTPEVTCV
561 VVDVSHEDPE VKFNWYVDGV EVHNAKTKPR EEQYNSTYRV VSVLTVLHQD WLNGKEYKCK VSNKALPAPI EKTISKAKGQ
641 PREPQVYTLP PSREEMTKNQ VSLTCLVKGF YPSDIAVEWE SNGQPENNYK TTPPVLDSDG SFFLYSKLTV DKSRWQQGNV
721 FSCSVMHEAL HNHYTQKSLS LSPGK
配列番号5
1 DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCSASQDIS NYLNWYQQKP GKAPKVLIYF TSSLHSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP
81 EDFATYYCQQ YSTVPWTFGQ GTKVEIKRTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV DNALQSGNSQ
161 ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG LSSPVTKSFN RGEC
配列番号6
1 LVVTPPGPEL VLNVSSTFVL TCSGSAPVVW ERMSQEPPQE MAKAQDGTFS SVLTLTNLTG LDTGEYFCTH NDSRGLETDE
81 RKRLYIFVPD PTVGFLPNDA EELFIFLTEI TEITIPCRVT DPQLVVTLHE KKGDVALPVP YDHQRGFSGI FEDRSYICKT
161 TIGDREVDSD AYYVYRLQVS SINVSVNAVQ TVVRQGENIT LMCIVIGNEV VNFEWTYPRK ESGRLVEPVT DFLLDMPYHI
241 RSILHIPSAE LEDSGTYTCN VTESVNDHQD EKAINITVVE SGGGEVQLVE SGGGLVQPGG SLRLSCAASG YTFTNYGMNW
321 VRQAPGKGLE WVGWINTYTG EPTYAADFKR RFTFSLDTSK STAYLQMNSL RAEDTAVYYC AKYPHYYGSS HWYFDVWGQG
401 TLVTVSSAST KGPSVFPLAP SSKSTSGGTA ALGCLVKDYF PEPVTVSWNS GALTSGVHTF PAVLQSSGLY SLSSVVTVPS
481 SSLGTQTYIC NVNHKPSNTK VDKKVEPKSC DKTHTCPPCP APELLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED
561 PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT
641 LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE
721 ALHNHYTQKS LSLSPGK
配列番号7
1 EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGYTFT NYGMNWVRQA PGKGLEWVGW INTYTGEPTY AADFKRRFTF SLDTSKSTAY
81 LQMNSLRAED TAVYYCAKYP HYYGSSHWYF DVWGQGTLVT VSSASTKGPS VFPLAPSSKS TSGGTAALGC LVKDYFPEPV
161 TVSWNSGALT SGVHTFPAVL QSSGLYSLSS VVTVPSSSLG TQTYICNVNH KPSNTKVDKK VEPKSCDKTH TCPPCPAPEL
241 LGGPSVFLFP PKPKDTLMIS RTPEVTCVVV DVSHEDPEVK FNWYVDGVEV HNAKTKPREE QYNSTYRVVS VLTVLHQDWL
321 NGKEYKCKVS NKALPAPIEK TISKAKGQPR EPQVYTLPPS REEMTKNQVS LTCLVKGFYP SDIAVEWESN GQPENNYKTT
401 PPVLDSDGSF FLYSKLTVDK SRWQQGNVFS CSVMHEALHN HYTQKSLSLS PGGGGGSGGG GSGGGGSGGG GSGLVVTPPG
481 PELVLNVSST FVLTCSGSAP VVWERMSQEP PQEMAKAQDG TFSSVLTLTN LTGLDTGEYF CTHNDSRGLE TDERKRLYIF
561 VPDPTVGFLP NDAEELFIFL TEITEITIPC RVTDPQLVVT LHEKKGDVAL PVPYDHQRGF SGIFEDRSYI CKTTIGDREV
641 DSDAYYVYRL QVSSINVSVN AVQTVVRQGE NITLMCIVIG NEVVNFEWTY PRKESGRLVE PVTDFLLDMP YHIRSILHIP
721 SAELEDSGTY TCNVTESVND HQDEKAINIT VVESG
配列番号8
1 LVVTPPGPEL VLNVSSTFVL TCSGSAPVVW ERMSQEPPQE MAKAQDGTFS SVLTLTNLTG LDTGEYFCTH NDSRGLETDE
81 RKRLYIFVPD PTVGFLPNDA EELFIFLTEI TEITIPCRVT DPQLVVTLHE KKGDVALPVP YDHQRGFSGI FEDRSYICKT
161 TIGDREVDSD AYYVYRLQVS SINVSVNAVQ TVVRQGENIT LMCIVIGNEV VNFEWTYPRK ESGRLVEPVT DFLLDMPYHI
241 RSILHIPSAE LEDSGTYTCN VTESVNDHQD EKAINITVVE SGGGGGSGGG GSEVQLVESG GGLVQPGGSL RLSCAASGYD
321 FTHYGMNWVR QAPGKGLEWV GWINTYTGEP TYAADFKRRF TFSLDTSKST AYLQMNSLRA EDTAVYYCAK YPYYYGTSHW
401 YFDVWGQGTL VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KSTSGGTAAL GCLVKDYFPE PVTVSWNSGA LTSGVHTFPA VLQSSGLYSL
481 SSVVTVPSSS LGTQTYICNV NHKPSNTKVD KKVEPKSCDK THTCPPCPAP EAAGAPSVFL FPPKPKDTLM ISRTPEVTCV
561 VVDVSHEDPE VKFNWYVDGV EVHNAKTKPR EEQYNSTYRV VSVLTVLHQD WLNGKEYKCK VSNKALPAPI EKTISKAKGQ
641 PREPCVYTLP PSREEMTKNQ VSLTCLVKGF YPSDIAVEWE SNGQPENNYK TTPPVLDSDG SFFLYSKLTV DKSRWQQGNV
721 FSCSVMHEAL HNHYTQKSLS LSPGK
配列番号9
1 LVVTPPGPEL VLNVSSTFVL TCSGSAPVVW ERMSQEPPQE MAKAQDGTFS SVLTLTNLTG LDTGEYFCTH NDSRGLETDE
81 RKRLYIFVPD PTVGFLPNDA EELFIFLTEI TEITIPCRVT DPQLVVTLHE KKGDVALPVP YDHQRGFSGI FEDRSYICKT
161 TIGDREVDSD AYYVYRLQVS SINVSVNAVQ TVVRQGENIT LMCIVIGNEV VNFEWTYPRK ESGRLVEPVT DFLLDMPYHI
241 RSILHIPSAE LEDSGTYTCN VTESVNDHQD EKAINITVVE SGGGGGSGGG GSEVQLVESG GGLVQPGGSL RLSCAASGYD
321 FTHYGMNWVR QAPGKGLEWV GWINTYTGEP TYAADFKRRF TFSLDTSKST AYLQMNSLRA EDTAVYYCAK YPYYYGTSHW
401 YFDVWGQGTL VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KSTSGGTAAL GCLVKDYFPE PVTVSWNSGA LTSGVHTFPA VLQSSGLYSL
481 SSVVTVPSSS LGTQTYICNV NHKPSNTKVD KKVEPKSCDK THTCPPCPAP EAAGAPSVFL FPPKPKDTLM ISRTPEVTCV
561 VVDVSHEDPE VKFNWYVDGV EVHNAKTKPR EEQYNSTYRV VSVLTVLHQD WLNGKEYKCK VSNKALPAPI EKTISKAKGQ
641 PREPQVYTLP PSREEMTKNQ VSLTCLVKGF YPSDIAVEWE SNGQPENNYK TTPPVLDSDG SFFLYSKLTV DKSRWQQGNV
721 FSCSVMHEAL HNHYTQKSLS CSPGK
配列番号10
1 DIQLTQSPSS LSASVGDRVT ITCSASQDIS NYLNWYQQKP GKAPKVLIYF TSSLHSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP
81 EDFATYYCQQ YSTVPWTFGQ GTKVEIKRTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV DNALQSGNSQ
161 ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG LSSPVTKSFN RGEC
配列番号11
1 MRLPGAMPAL ALKGELLLLS LLLLLEPQIS QGLVVTPPGP ELVLNVSSTF VLTCSGSAPV VWERMSQEPP QEMAKAQDGT
81 FSSVLTLTNL TGLDTGEYFC THNDSRGLET DERKRLYIFV PDPTVGFLPN DAEELFIFLT EITEITIPCR VTDPQLVVTL
161 HEKKGDVALP VPYDHQRGFS GIFEDRSYIC KTTIGDREVD SDAYYVYRLQ VSSINVSVNA VQTVVRQGEN ITLMCIVIGN
241 EVVNFEWTYP RKESGRLVEP VTDFLLDMPY HIRSILHIPS AELEDSGTYT CNVTESVNDH QDEKAINITV VESGYVRLLG
321 EVGTLQFAEL HRSRTLQVVF EAYPPPTVLW FKDNRTLGDS SAGEIALSTR NVSETRYVSE LTLVRVKVAE AGHYTMRAFH
401 EDAEVQLSFQ LQINVPVRVL ELSESHPDSG EQTVRCRGRG MPQPNIIWSA CRDLKRCPRE LPPTLLGNSS EEESQLETNV
481 TYWEEEQEFE VVSTLRLQHV DRPLSVRCTL RNAVGQDTQE VIVVPHSLPF KVVVISAILA LVVLTIISLI ILIMLWQKKP
561 RYEIRWKVIE SVSSDGHEYI YVDPMQLPYD STWELPRDQL VLGRTLGSGA FGQVVEATAH GLSHSQATMK VAVKMLKSTA
641 RSSEKQALMS ELKIMSHLGP HLNVVNLLGA CTKGGPIYII TEYCRYGDLV DYLHRNKHTF LQHHSDKRRP PSAELYSNAL
721 PVGLPLPSHV SLTGESDGGY MDMSKDESVD YVPMLDMKGD VKYADIESSN YMAPYDNYVP SAPERTCRAT LINESPVLSY
801 MDLVGFSYQV ANGMEFLASK NCVHRDLAAR NVLICEGKLV KICDFGLARD IMRDSNYISK GSTFLPLKWM APESIFNSLY
881 TTLSDVWSFG ILLWEIFTLG GTPYPELPMN EQFYNAIKRG YRMAQPAHAS DEIYEIMQKC WEEKFEIRPP FSQLVLLLER
961 LLGEGYKKKY QQVDEEFLRS DHPAILRSQA RLPGFHGLRS PLDTSSVLYT AVQPNEGDND YIIPLPDPKP EVADEGPLEG
1041 SPSLASSTLN EVNTSSTISC DSPLEPQDEP EPEPQLELQV EPEPELEQLP DSGCPAPRAE AEDSFL
配列番号12
1 DIQLTQSPSS LSASVGDRVT ITCSASQDIS NYLNWYQQKP GKAPKVLIYF TSSLHSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP
81 EDFATYYCQQ YSTVPWTFGQ GTKVEIKRTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV DNALQSGNSQ
161 ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG LSSPVTKSFN RGEC
配列番号13
1 EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGYDFT HYGMNWVRQA PGKGLEWVGW INTYTGEPTY AADFKRRFTF SLDTSKSTAY
81 LQMNSLRAED TAVYYCAKYP YYYGTSHWYF DVWGQGTLVT VSSASTKGPS VFPLAPSSKS TSGGTAALGC LVKDYFPEPV
161 TVSWNSGALT SGVHTFPAVL QSSGLYSLSS VVTVPSSSLG TQTYICNVNH KPSNTKVDKK VEPKSCDKTH L
配列番号14
1 MVSYWDTGVL LCALLSCLLL TGSSSGSKLK DPELSLKGTQ HIMQAGQTLH LQCRGEAAHK WSLPEMVSKE SERLSITKSA
81 CGRNGKQFCS TLTLNTAQAN HTGFYSCKYL AVPTSKKKET ESAIYIFISD TGRPFVEMYS EIPEIIHMTE GRELVIPCRV
161 TSPNITVTLK KFPLDTLIPD GKRIIWDSRK GFIISNATYK EIGLLTCEAT VNGHLYKTNY LTHRQTNTII DVQISTPRPV
241 KLLRGHTLVL NCTATTPLNT RVQMTWSYPD EKNKRASVRR RIDQSNSHAN IFYSVLTIDK MQNKDKGLYT CRVRSGPSFK
321 SVNTSVHIYD KAFITVKHRK QQVLETVAGK RSYRLSMKVK AFPSPEVVWL KDGLPATEKS ARYLTRGYSL IIKDVTEEDA
401 GNYTILLSIK QSNVFKNLTA TLIVNVKPQI YEKAVSSFPD PALYPLGSRQ ILTCTAYGIP QPTIKWFWHP CNHNHSEARC
481 DFCSNNEESF ILDADSNMGN RIESITQRMA IIEGKNKMAS TLVVADSRIS GIYICIASNK VGTVGRNISF YITDVPNGFH
561 VNLEKMPTEG EDLKLSCTVN KFLYRDVTWI LLRTVNNRTM HYSISKQKMA ITKEHSITLN LTIMNVSLQD SGTYACRARN
641 VYTGEEILQK KEITIRDQEA PYLLRNLSDH TVAISSSTTL DCHANGVPEP QITWFKNNHK IQQEPGIILG PGSSTLFIER
721 VTEEDEGVYH CKATNQKGSV ESSAYLTVQG TSDKSNLELI TLTCTCVAAT LFWLLLTLFI RKMKRSSSEI KTDYLSIIMD
801 PDEVPLDEQC ERLPYDASKW EFARERLKLG KSLGRGAFGK VVQASAFGIK KSPTCRTVAV KMLKEGATAS EYKALMTELK
881 ILTHIGHHLN VVNLLGACTK QGGPLMVIVE YCKYGNLSNY LKSKRDLFFL NKDAALHMEP KKEKMEPGLE QGKKPRLDSV
961 TSSESFASSG FQEDKSLSDV EEEEDSDGFY KEPITMEDLI SYSFQVARGM EFLSSRKCIH RDLAARNILL SENNVVKICD
1041 FGLARDIYKN PDYVRKGDTR LPLKWMAPES IFDKIYSTKS DVWSYGVLLW EIFSLGGSPY PGVQMDEDFC SRLREGMRMR
1121 APEYSTPEIY QIMLDCWHRD PKERPRFAEL VEKLGDLLQA NVQQDGKDYI PINAILTGNS GFTYSTPAFS EDFFKESISA
1201 PKFNSGSSDD VRYVNAFKFM SLERIKTFEE LLPNATSMFD DYQGDSSTLL ASPMLKRFTW TDSKPKASLK IDLRVTSKSK
1281 ESGLSDVSRP SFCHSSCGHV SEGKRRFTYD HAELERKIAC CSPPPDYNSV VLYSTPPI
配列番号15
1 MQSKVLLAVA LWLCVETRAA SVGLPSVSLD LPRLSIQKDI LTIKANTTLQ ITCRGQRDLD WLWPNNQSGS EQRVEVTECS
81 DGLFCKTLTI PKVIGNDTGA YKCFYRETDL ASVIYVYVQD YRSPFIASVS DQHGVVYITE NKNKTVVIPC LGSISNLNVS
161 LCARYPEKRF VPDGNRISWD SKKGFTIPSY MISYAGMVFC EAKINDESYQ SIMYIVVVVG YRIYDVVLSP SHGIELSVGE
241 KLVLNCTART ELNVGIDFNW EYPSSKHQHK KLVNRDLKTQ SGSEMKKFLS TLTIDGVTRS DQGLYTCAAS SGLMTKKNST
321 FVRVHEKPFV AFGSGMESLV EATVGERVRI PAKYLGYPPP EIKWYKNGIP LESNHTIKAG HVLTIMEVSE RDTGNYTVIL
401 TNPISKEKQS HVVSLVVYVP PQIGEKSLIS PVDSYQYGTT QTLTCTVYAI PPPHHIHWYW QLEEECANEP SQAVSVTNPY
481 PCEEWRSVED FQGGNKIEVN KNQFALIEGK NKTVSTLVIQ AANVSALYKC EAVNKVGRGE RVISFHVTRG PEITLQPDMQ
561 PTEQESVSLW CTADRSTFEN LTWYKLGPQP LPIHVGELPT PVCKNLDTLW KLNATMFSNS TNDILIMELK NASLQDQGDY
641 VCLAQDRKTK KRHCVVRQLT VLERVAPTIT GNLENQTTSI GESIEVSCTA SGNPPPQIMW FKDNETLVED SGIVLKDGNR
721 NLTIRRVRKE DEGLYTCQAC SVLGCAKVEA FFIIEGAQEK TNLEIIILVG TAVIAMFFWL LLVIILRTVK RANGGELKTG
801 YLSIVMDPDE LPLDEHCERL PYDASKWEFP RDRLKLGKPL GRGAFGQVIE ADAFGIDKTA TCRTVAVKML KEGATHSEHR
881 ALMSELKILI HIGHHLNVVN LLGACTKPGG PLMVIVEFCK FGNLSTYLRS KRNEFVPYKT KGARFRQGKD YVGAIPVDLK
961 RRLDSITSSQ SSASSGFVEE KSLSDVEEEE APEDLYKDFL TLEHLICYSF QVAKGMEFLA SRKCIHRDLA ARNILLSEKN
1041 VVKICDFGLA RDIYKDPDYV RKGDARLPLK WMAPETIFDR VYTIQSDVWS FGVLLWEIFS LGASPYPGVK IDEEFCRRLK
1121 EGTRMRAPDY TTPEMYQTML DCWHGEPSQR PTFSELVEHL GNLLQANAQQ DGKDYIVLPI SETLSMEEDS GLSLPTSPVS
1201 CMEEEEVCDP KFHYDNTAGI SQYLQNSKRK SRPVSVKTFE DIPLEEPEVK VIPDDNQTDS GMVLASEELK TLEDRTKLSP
1281 SFGGMVPSKS RESVASEGSN QTSGYQSGYH SDDTDTTVYS SEEAELLKLI EIGVQTGSTA QILQPDSGTT LSSPPV
配列番号16
1 MQRGAALCLR LWLCLGLLDG LVSGYSMTPP TLNITEESHV IDTGDSLSIS CRGQHPLEWA WPGAQEAPAT GDKDSEDTGV
81 VRDCEGTDAR PYCKVLLLHE VHANDTGSYV CYYKYIKARI EGTTAASSYV FVRDFEQPFI NKPDTLLVNR KDAMWVPCLV
161 SIPGLNVTLR SQSSVLWPDG QEVVWDDRRG MLVSTPLLHD ALYLQCETTW GDQDFLSNPF LVHITGNELY DIQLLPRKSL
241 ELLVGEKLVL NCTVWAEFNS GVTFDWDYPG KQAERGKWVP ERRSQQTHTE LSSILTIHNV SQHDLGSYVC KANNGIQRFR
321 ESTEVIVHEN PFISVEWLKG PILEATAGDE LVKLPVKLAA YPPPEFQWYK DGKALSGRHS PHALVLKEVT EASTGTYTLA
401 LWNSAAGLRR NISLELVVNV PPQIHEKEAS SPSIYSRHSR QALTCTAYGV PLPLSIQWHW RPWTPCKMFA QRSLRRRQQQ
481 DLMPQCRDWR AVTTQDAVNP IESLDTWTEF VEGKNKTVSK LVIQNANVSA MYKCVVSNKV GQDERLIYFY VTTIPDGFTI
561 ESKPSEELLE GQPVLLSCQA DSYKYEHLRW YRLNLSTLHD AHGNPLLLDC KNVHLFATPL AASLEEVAPG ARHATLSLSI
641 PRVAPEHEGH YVCEVQDRRS HDKHCHKKYL SVQALEAPRL TQNLTDLLVN VSDSLEMQCL VAGAHAPSIV WYKDERLLEE
721 KSGVDLADSN QKLSIQRVRE EDAGRYLCSV CNAKGCVNSS ASVAVEGSED KGSMEIVILV GTGVIAVFFW VLLLLIFCNM
801 RRPAHADIKT GYLSIIMDPG EVPLEEQCEY LSYDASQWEF PRERLHLGRV LGYGAFGKVV EASAFGIHKG SSCDTVAVKM
881 LKEGATASEH RALMSELKIL IHIGNHLNVV NLLGACTKPQ GPLMVIVEFC KYGNLSNFLR AKRDAFSPCA EKSPEQRGRF
961 RAMVELARLD RRRPGSSDRV LFARFSKTEG GARRASPDQE AEDLWLSPLT MEDLVCYSFQ VARGMEFLAS RKCIHRDLAA
1041 RNILLSESDV VKICDFGLAR DIYKDPDYVR KGSARLPLKW MAPESIFDKV YTTQSDVWSF GVLLWEIFSL GASPYPGVQI
1121 NEEFCQRLRD GTRMRAPELA TPAIRRIMLN CWSGDPKARP AFSELVEILG DLLQGRGLQE EEEVCMAPRS SQSSEEGSFS
1201 QVSTMALHIA QADAEDSPPS LQRHSLAARY YNWVSFPGCL ARGAETRGSS RMKTFEEFPM TPTTYKGSVD NQTDSGMVLA
1281 SEEFEQIESR HRQESGFSCK GPGQNVAVTR AHPDSQGRRR RPERGARGGQ VFYNSEYGEL SEPSEEDHCS PSARVTFFTD
1361 NSY
配列番号17
1 ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT
81 YICNVNHKPS NTKVDKKVEP KSCDKTHTCP PCPAPELLGG PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVVVDVS HEDPEVKFNW
161 YVDGVEVHNA KTKPREEQYN STYRVVSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSRDE
241 LTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW QQGNVFSCSV MHEALHNHYT
321 QKSLSLSPGK
配列番号18
1 TVAAPSVFIF PPSDEQLKSG TASVVCLLNN FYPREAKVQW KVDNALQSGN SQESVTEQDS KDSTYSLSST LTLSKADYEK
81 HKVYACEVTH QGLSSPVTKS FNRGEC
配列番号19
1 LVVTPPGPEL VLNVSSTFVL TCSGSAPVVW ERMSQEPPQE MAKAQDGTFS SVLTLTNLTG LDTGEYFCTH NDSRGLETDE
81 RKRLYIFVPD PTVGFLPNDA EELFIFLTEI TEITIPCRVT DPQLVVTLHE KKGDVALPVP YDHQRGFSGI FEDRSYICKT
161 TIGDREVDSD AYYVYRLQVS SINVSVNAVQ TVVRQGENIT LMCIVIGNEV VNFEWTYPRK ESGRLVEPVT DFLLDMPYHI
241 RSILHIPSAE LEDSGTYTCN VTESVNDHQD EKAINITVVE SGGGGGSGGG GSDIQMTQSP SSLSASVGDR VTITCSASQD
321 ISNYLNWYQQ KPGKAPKVLI YFTSSLHSGV PSRFSGSGSG TDFTLTISSL QPEDFATYYC QQYSTVPWTF GQGTKVEIKR
401 TVAAPSVFIF PPSDEQLKSG TASVVCLLNN FYPREAKVQW KVDNALQSGN SQESVTEQDS KDSTYSLSST LTLSKADYEK
481 HKVYACEVTH QGLSSPVTKS FNRGEC
配列番号21
1 EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGYTFT NYGMNWVRQA PGKGLEWVGW INTYTGEPTY AADFKRRFTF SLDTSKSTAY
81 LQMNSLRAED TAVYYCAKYP HYYGSSHWYF DVWGQGTLVT VSSASTKGPS VFPLAPSSKS TSGGTAALGC LVKDYFPEPV
161 TVSWNSGALT SGVHTFPAVL QSSGLYSLSS VVTVPSSSLG TQTYICNVNH KPSNTKVDKK VEPKSCDKTH T
配列番号22
1 LVVTPPGPEL VLNVSSTFVL TCSGSAPVVW ERMSQEPPQE MAKAQDGTFS SVLTLTNLTG LDTGEYFCTH NDSRGLETDE
81 RKRLYIFVPD PTVGFLPNDA EELFIFLTEI TEITIPCRVT DPQLVVTLHE KKGDVALPVP YDHQRGFSGI FEDRSYICKT
161 TIGDREVDSD AYYVYRLQVS SINVSVNAVQ TVVRQGENIT LMCIVIGNEV VNFEWTYPRK ESGRLVEPVT DFLLDMPYHI
241 RSILHIPSAE LEDSGTYTCN VTESVNDHQD EKAINITVVE SGGGGGSGGG GSEVQLVESG GGLVQPGGSL RLSCAASGYT
321 FTNYGMNWVR QAPGKGLEWV GWINTYTGEP TYAADFKRRF TFSLDTSKST AYLQMNSLRA EDTAVYYCAK YPHYYGSSHW
401 YFDVWGQGTL VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KSTSGGTAAL GCLVKDYFPE PVTVSWNSGA LTSGVHTFPA VLQSSGLYSL
481 SSVVTVPSSS LGTQTYICNV NHKPSNTKVD KKVEPKSCDK THT
配列番号23
1 LVVTPPGPEL VLNVSSTFVL TCSGSAPVVW ERMSQEPPQE MAKAQDGTFS SVLTLTNLTG LDTGEYFCTH NDSRGLETDE
81 RKRLYIFVPD PTVGFLPNDA EELFIFLTEI TEITIPCRVT DPQLVVTLHE KKGDVALPVP YDHQRGFSGI FEDRSYICKT
161 TIGDREVDSD AYYVYRLQVS SINVSVNAVQ TVVRQGENIT LMCIVIGNEV VNFEWTYPRK ESGRLVEPVT DFLLDMPYHI
241 RSILHIPSAE LEDSGTYTCN VTESVNDHQD EKAINITVVE SGGGEVQLVE SGGGLVQPGG SLRLSCAASG YTFTNYGMNW
321 VRQAPGKGLE WVGWINTYTG EPTYAADFKR RFTFSLDTSK STAYLQMNSL RAEDTAVYYC AKYPHYYGSS HWYFDVWGQG
401 TLVTVSSAST KGPSVFPLAP SSKSTSGGTA ALGCLVKDYF PEPVTVSWNS GALTSGVHTF PAVLQSSGLY SLSSVVTVPS
481 SSLGTQTYIC NVNHKPSNTK VDKKVEPKSC DKTHT
配列番号24
1 EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGYTFT NYGMNWVRQA PGKGLEWVGW INTYTGEPTY AADFKRRFTF SLDTSKSTAY
81 LQMNSLRAED TAVYYCAKYP HYYGSSHWYF DVWGQGTLVT VSSASTKGPS VFPLAPSSKS TSGGTAALGC LVKDYFPEPV
161 TVSWNSGALT SGVHTFPAVL QSSGLYSLSS VVTVPSSSLG TQTYICNVNH KPSNTKVDKK VEPKSCDKTH TGGGGGSGGG
241 GSGGGGSGGG GSGLVVTPPG PELVLNVSST FVLTCSGSAP VVWERMSQEP PQEMAKAQDG TFSSVLTLTN LTGLDTGEYF
321 CTHNDSRGLE TDERKRLYIF VPDPTVGFLP NDAEELFIFL TEITEITIPC RVTDPQLVVT LHEKKGDVAL PVPYDHQRGF
401 SGIFEDRSYI CKTTIGDREV DSDAYYVYRL QVSSINVSVN AVQTVVRQGE NITLMCIVIG NEVVNFEWTY PRKESGRLVE
481 PVTDFLLDMP YHIRSILHIP SAELEDSGTY TCNVTESVND HQDEKAINIT VVESG
配列番号25
1 LVVTPPGPEL VLNVSSTFVL TCSGSAPVVW ERMSQEPPQE MAKAQDGTFS SVLTLTNLTG LDTGEYFCTH NDSRGLETDE
81 RKRLYIFVPD PTVGFLPNDA EELFIFLTEI TEITIPCRVT DPQLVVTLHE KKGDVALPVP YDHQRGFSGI FEDRSYICKT
161 TIGDREVDSD AYYVYRLQVS SINVSVNAVQ TVVRQGENIT LMCIVIGNEV VNFEWTYPRK ESGRLVEPVT DFLLDMPYHI
241 RSILHIPSAE LEDSGTYTCN VTESVNDHQD EKAINITVVE SGGGGGSGGG GSEVQLVESG GGLVQPGGSL RLSCAASGYD
321 FTHYGMNWVR QAPGKGLEWV GWINTYTGEP TYAADFKRRF TFSLDTSKST AYLQMNSLRA EDTAVYYCAK YPYYYGTSHW
401 YFDVWGQGTL VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KSTSGGTAAL GCLVKDYFPE PVTVSWNSGA LTSGVHTFPA VLQSSGLYSL
481 SSVVTVPSSS LGTQTYICNV NHKPSNTKVD KKVEPKSCDK THL
配列番号26
1 LVVTPPGPE LVLNVSSTFV LTCSGSAPVV WERMSQEPPQ EMAKAQDGTF SSVLTLTNLT GLDTGEYFCT HNDSRGLETD
80 ERKRLYIFVP DPTVGFLPND AEELFIFLTE ITEITIPCRV TDPQLVVTLH EKKGDVALPV PYDHQRGFSG IFEDRSYICK
160 TTIGDREVDS DAYYVYRLQV SSINVSVNAV QTVVRQGENI TLMCIVIGNE VVNFEWTYPR KESGRLVEPV TDFLLDMPYH
240 IRSILHIPSA ELEDSGTYTC NVTESVNDHQ DEKAINITVV ESGEVQLVES GGGLVQPGGS LRLSCAASGY TFTNYGMNWV
320 RQAPGKGLEW VGWINTYTGE PTYAADFKRR FTFSLDTSKS TAYLQMNSLR AEDTAVYYCA KYPHYYGSSH WYFDVWGQGT
400 LVTVSSASTK GPSVFPLAPS SKSTSGGTAA LGCLVKDYFP EPVTVSWNSG ALTSGVHTFP AVLQSSGLYS LSSVVTVPSS
480 SLGTQTYICN VNHKPSNTKV DKKVEPKSCD KTHTCPPCPA PELLGGPSVF LFPPKPKDTL MISRTPEVTC VVVDVSHEDP
560 EVKFNWYVDG VEVHNAKTKP REEQYNSTYR VVSVLTVLHQ DWLNGKEYKC KVSNKALPAP IEKTISKAKG QPREPQVYTL
640 PPSREEMTKN QVSLTCLVKG FYPSDIAVEW ESNGQPENNY KTTPPVLDSD GSFFLYSKLT VDKSRWQQGN VFSCSVMHEA
720 LHNHYTQKSL SLSPGK
配列番号27
1 VGFLPNDAEE LFIFLTEITE ITIPCRVTDP QLVVTLHEKK GDVALPVPYD HQRGFSGIFE DRSYICKTTI GDREVDSDAY
81 YVYRLQVSSI NVSVNAVQTV VRQGENITLM CIVIGNEVVN FEWTYPRKES GRLVEPVTDF LLDMPYHIRS ILHIPSAELE
161 DSGTYTCNVT ESVNDHQDEK AINITVVESG EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGYTFT NYGMNWVRQA PGKGLEWVGW
241 INTYTGEPTY AADFKRRFTF SLDTSKSTAY LQMNSLRAED TAVYYCAKYP HYYGSSHWYF DVWGQGTLVT VSSASTKGPS
321 VFPLAPSSKS TSGGTAALGC LVKDYFPEPV TVSWNSGALT SGVHTFPAVL QSSGLYSLSS VVTVPSSSLG TQTYICNVNH
401 KPSNTKVDKK VEPKSCDKTH TCPPCPAPEL LGGPSVFLFP PKPKDTLMIS RTPEVTCVVV DVSHEDPEVK FNWYVDGVEV
481 HNAKTKPREE QYNSTYRVVS VLTVLHQDWL NGKEYKCKVS NKALPAPIEK TISKAKGQPR EPQVYTLPPS REEMTKNQVS
561 LTCLVKGFYP SDIAVEWESN GQPENNYKTT PPVLDSDGSF FLYSKLTVDK SRWQQGNVFS CSVMHEALHN HYTQKSLSLS
641 PGK
配列番号28
1 VGFLPNDAEE LFIFLTEITE ITIPCRVTDP QLVVTLHEKK GDVALPVPYD HQRGFSGIFE DRSYICKTTI GDREVDSDAY
81 YVYRLQVSSI NVSVNAVQTV VRQGENITLM CIVIGNEVVN FEWTYPRKES GRLVEPVTDF LLDMPYHIRS ILHIPSAELE
161 DSGTYTCNVT ESVNDHQDEK AINITVVESG EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGYTFT NYGMNWVRQA PGKGLEWVGW
241 INTYTGEPTY AADFKRRFTF SLDTSKSTAY LQMNSLRAED TAVYYCAKYP HYYGSSHWYF DVWGQGTLVT VSSASTKGPS
321 VFPLAPSSKS TSGGTAALGC LVKDYFPEPV TVSWNSGALT SGVHTFPAVL QSSGLYSLSS VVTVPSSSLG TQTYICNVNH
401 KPSNTKVDKK VEPKSCDKTH T
配列番号29
1 VGFLPNDAEE LFIFLTEITE ITIPCRVTDP QLVVTLHEKK GDVALPVPYD HQRGFSGIFE DRSYICKTTI GDREVDSDAY
81 YVYRLQVSSI NVSVNAVQTV VRQGENITLM CIVIGNEVVN FEWTYPRKES GRLVEPVTDF LLDMPYHIRS ILHIPSAELE
161 DSGTYTCNVT ESVNDHQDEK AINITVVESG GGGSGGGGSG GGGSGGGGSG GGGSGGGGSE VQLVESGGGL VQPGGSLRLS
241 CAASGYTFTN YGMNWVRQAP GKGLEWVGWI NTYTGEPTYA ADFKRRFTFS LDTSKSTAYL QMNSLRAEDT AVYYCAKYPH
321 YYGSSHWYFD VWGQGTLVTV SSASTKGPSV FPLAPSSKST SGGTAALGCL VKDYFPEPVT VSWNSGALTS GVHTFPAVLQ
401 SSGLYSLSSV VTVPSSSLGT QTYICNVNHK PSNTKVDKKV EPKSCDKTHT
配列番号30
1 EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGYTFT NYGMNWVRQA PGKGLEWVGW INTYTGEPTY AADFKRRFTF SLDTSKSTAY
81 LQMNSLRAED TAVYYCAKYP HYYGSSHWYF DVWGQGTLVT VSSASTKGPS VFPLAPSSKS TSGGTAALGC LVKDYFPEPV
161 TVSWNSGALT SGVHTFPAVL QSSGLYSLSS VVTVPSSSLG TQTYICNVNH KPSNTKVDKK VEPKSCDKTH TGGGSGGGGS
241 GGGGSGGGGS GGGGSGGGGS VGFLPNDAEE LFIFLTEITE ITIPCRVTDP QLVVTLHEKK GDVALPVPYD HQRGFSGIFE
321 DRSYICKTTI GDREVDSDAY YVYRLQVSSI NVSVNAVQTV VRQGENITLM CIVIGNEVVN FEWTYPRKES GRLVEPVTDF
401 LLDMPYHIRS ILHIPSAELE DSGTYTCNVT ESVNDHQDEK AINITVVESG
配列番号31 重鎖抗VEGF−PDGFR融合物をコードする核酸
GACGGATCGGGAGATCTCCCGATCCCCTATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGTATCTGCTCCCTGCTTGTGTGTTGGAGGTCGCTGAGTAGTGCGCGAGCAAAATTTAAGCTACAACAAGGCAAGGCTTGACCGACAATTGCATGAAGAATCTGCTTAGGGTTAGGCGTTTTGCGCTGCTTCGCGATGTACGGGCCAGATATACGCGTTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCTCTGGCTAACTAGAGAACCCACTGCTTACTGGCTTATCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCCAAGCTGGCTAGCGTTTAAACTTAAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCCACTAGTCCAGTGTGGTGGAATTCTGCAGATATCCAGCACAGTGGCGGCCGCCatgaaagctgtggtgctggccgtggctctggtcttcctgacagggagccaggctctggtcgtcacacccccggggccagagcttgtcctcaatgtctccagcaccttcgttctgacctgctcgggttcagctccggtggtgtgggaacggatgtcccaggagcccccacaggaaatggccaaggcccaggatggcaccttctccagcgtgctcacactgaccaacctcactgggctagacacgggagaatacttttgcacccacaatgactcccgtggactggagaccgatgagcggaaacggctctacatctttgtgccagatcccaccgtgggcttcctccctaatgatgccgaggaactattcatctttctcacggaaataactgagatcaccattccatgccgagtaacagacccacagctggtggtgacactgcacgagaagaaaggggacgttgcactgcctgtcccctatgatcaccaacgtggcttttctggtatctttgaggacagaagctacatctgcaaaaccaccattggggacagggaggtggattctgatgcctactatgtctacagactccaggtgtcatccatcaacgtctctgtgaacgcagtgcagactgtggtccgccagggtgagaacatcaccctcatgtgcattgtgatcgggaatgaggtggtcaacttcgagtggacatacccccgcaaagaaagtgggcggctggtggagccggtgactgacttcctcttggatatgccttaccacatccgctccatcctgcacatccccagtgccgagttagaagactcggggacctacacctgcaatgtgacggagagtgtgaatgaccatcaggatgaaaaggccatcaacatcaccgtggttgagagcggcggtggtggcggctccggtggaggcggaagcgaggtgcagctggtggaatccggcggaggcctggtccagcctggcggatccctgagactgtcctgtgccgcctccggctacgacttcacccattacggcatgaactgggtccgacaggcccctggcaagggcctggaatgggtcggatggatcaacacctacaccggcgagcccacctacgccgccgacttcaagcggcggttcaccttctccctggacacctccaagtccaccgcctacctgcagatgaactccctgcgggccgaggacaccgccgtgtactactgcgccaagtacccctactactacggcacctcccactggtacttcgacgtgtggggccagggcaccctggtcaccgtgtcctccgcctctaccaagggcccctccgtgttccctctggccccctccagcaagtccacctctggcggcaccgccgctctgggctgcctggtcaaggactacttccccgagcccgtgaccgtgtcctggaactctggcgccctgacctccggcgtgcacacctttccagccgtgctgcagtcctccggcctgtactccctgtcctccgtcgtgaccgtgccctccagctctctgggcacccagacctacatctgcaacgtgaaccacaagccctccaacaccaaggtggacaagaaggtggaacccaagtcctgcgacaagacccacacctgtcccccctgccctgcccctgaagcagccggtgcacccagcgtgttcctgttccccccaaagcccaaggacaccctgatgatctcccggacccccgaagtgacctgcgtggtggtggacgtgtcccacgaggaccctgaagtgaagttcaattggtacgtggacggcgtggaagtgcacaatgccaagaccaagcccagagaggaacagtacaactccacctaccgggtggtgtccgtgctgaccgtgctgcatcaggactggctgaacggcaaagagtacaagtgcaaggtctccaacaaggccctgcctgcccccatcgaaaagaccatctccaaggccaagggccagccccgcgagcctcaggtgtacacactgccacccagccgggaagagatgaccaagaaccaggtctccctgacctgtctggtcaagggcttctacccctccgatatcgccgtcgaatgggagtccaacggccagcccgagaacaactacaagaccaccccccctgtgctggactccgacggctcattcttcctgtactccaagctgaccgtggacaagtcccggtggcagcagggcaacgtgttctcctgctccgtgatgcacgaggccctgcacaaccactacacccagaagtccctgtcctgcagccccggcaagtgataaTCTAGAGGGCCCGTTTAAACCCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGCTTCTGAGGCGGAAAGAACCAGCTGGGGCTCTAGGGGGTATCCCCACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTAATTCTGTGGAATGTGTGTCAGTTAGGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCAGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCTGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAAAGCTCCCGGGAGCTTGTATATCCATTTTCGGATCTGATCAAGAGACAGGATGAGGATCGTTTCGCATGATTGAACAAGATGGATTGCACGCAGGTTCTCCGGCCGCTTGGGTGGAGAGGCTATTCGGCTATGACTGGGCACAACAGACAATCGGCTGCTCTGATGCCGCCGTGTTCCGGCTGTCAGCGCAGGGGCGCCCGGTTCTTTTTGTCAAGACCGACCTGTCCGGTGCCCTGAATGAACTGCAGGACGAGGCAGCGCGGCTATCGTGGCTGGCCACGACGGGCGTTCCTTGCGCAGCTGTGCTCGACGTTGTCACTGAAGCGGGAAGGGACTGGCTGCTATTGGGCGAAGTGCCGGGGCAGGATCTCCTGTCATCTCACCTTGCTCCTGCCGAGAAAGTATCCATCATGGCTGATGCAATGCGGCGGCTGCATACGCTTGATCCGGCTACCTGCCCATTCGACCACCAAGCGAAACATCGCATCGAGCGAGCACGTACTCGGATGGAAGCCGGTCTTGTCGATCAGGATGATCTGGACGAAGAGCATCAGGGGCTCGCGCCAGCCGAACTGTTCGCCAGGCTCAAGGCGCGCATGCCCGACGGCGAGGATCTCGTCGTGACCCATGGCGATGCCTGCTTGCCGAATATCATGGTGGAAAATGGCCGCTTTTCTGGATTCATCGACTGTGGCCGGCTGGGTGTGGCGGACCGCTATCAGGACATAGCGTTGGCTACCCGTGATATTGCTGAAGAGCTTGGCGGCGAATGGGCTGACCGCTTCCTCGTGCTTTACGGTATCGCCGCTCCCGATTCGCAGCGCATCGCCTTCTATCGCCTTCTTGACGAGTTCTTCTGAGCGGGACTCTGGGGTTCGAAATGACCGACCAAGCGACGCCCAACCTGCCATCACGAGATTTCGATTCCACCGCCGCCTTCTATGAAAGGTTGGGCTTCGGAATCGTTTTCCGGGACGCCGGCTGGATGATCCTCCAGCGCGGGGATCTCATGCTGGAGTTCTTCGCCCACCCCAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTGTATACCGTCGACCTCTAGCTAGAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTC
配列番号32:抗VEGF軽鎖をコードする軽鎖
GACGGATCGGGAGATCTCCCGATCCCCTATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGTATCTGCTCCCTGCTTGTGTGTTGGAGGTCGCTGAGTAGTGCGCGAGCAAAATTTAAGCTACAACAAGGCAAGGCTTGACCGACAATTGCATGAAGAATCTGCTTAGGGTTAGGCGTTTTGCGCTGCTTCGCGATGTACGGGCCAGATATACGCGTTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCTCTGGCTAACTAGAGAACCCACTGCTTACTGGCTTATCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCCAAGCTGGCTAGCGTTTAAACTTAAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCCACTAGTCCAGTGTGGTGGAATTCTGCAGATATCCAGCACAGTGGCGGCCGCCatgggatggagctgtatcatcctcttcttggtggcaacagctacaggcgtgcactccgacatccagctgacccagtccccctccagcctgtccgcctctgtgggcgacagagtgaccatcacctgttccgccagccaggacatctccaactacctgaactggtatcagcagaagcccggcaaggcccccaaggtgctgatctacttcacctcctccctgcactccggcgtgccctccagattctccggctctggctccggcaccgactttaccctgaccatctccagcctgcagcccgaggacttcgccacctactactgccagcagtactccaccgtgccctggaccttcggccagggcaccaaggtggaaatcaagcggaccgtggccgctccctccgtgttcatcttcccaccctccgacgagcagctgaagtccggaaccgcctccgtcgtgtgcctgctgaacaacttctacccccgcgaggccaaggtgcagtggaaggtggacaacgccctgcagagcggcaactcccaggaatccgtcaccgagcaggactccaaggacagcacctactccctgtccagcaccctgaccctgtccaaggccgactacgagaagcacaaggtgtacgcctgcgaagtgacccaccagggcctcagctccccagtgaccaagtccttcaaccggggcgagtgctagtaaTCTAGAGGGCCCGTTTAAACCCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGCTTCTGAGGCGGAAAGAACCAGCTGGGGCTCTAGGGGGTATCCCCACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTAATTCTGTGGAATGTGTGTCAGTTAGGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCAGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCTGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAAAGCTCCCGGGAGCTTGTATATCCATTTTCGGATCTGATCAAGAGACAGGATGAGGATCGTTTCGCATGATTGAACAAGATGGATTGCACGCAGGTTCTCCGGCCGCTTGGGTGGAGAGGCTATTCGGCTATGACTGGGCACAACAGACAATCGGCTGCTCTGATGCCGCCGTGTTCCGGCTGTCAGCGCAGGGGCGCCCGGTTCTTTTTGTCAAGACCGACCTGTCCGGTGCCCTGAATGAACTGCAGGACGAGGCAGCGCGGCTATCGTGGCTGGCCACGACGGGCGTTCCTTGCGCAGCTGTGCTCGACGTTGTCACTGAAGCGGGAAGGGACTGGCTGCTATTGGGCGAAGTGCCGGGGCAGGATCTCCTGTCATCTCACCTTGCTCCTGCCGAGAAAGTATCCATCATGGCTGATGCAATGCGGCGGCTGCATACGCTTGATCCGGCTACCTGCCCATTCGACCACCAAGCGAAACATCGCATCGAGCGAGCACGTACTCGGATGGAAGCCGGTCTTGTCGATCAGGATGATCTGGACGAAGAGCATCAGGGGCTCGCGCCAGCCGAACTGTTCGCCAGGCTCAAGGCGCGCATGCCCGACGGCGAGGATCTCGTCGTGACCCATGGCGATGCCTGCTTGCCGAATATCATGGTGGAAAATGGCCGCTTTTCTGGATTCATCGACTGTGGCCGGCTGGGTGTGGCGGACCGCTATCAGGACATAGCGTTGGCTACCCGTGATATTGCTGAAGAGCTTGGCGGCGAATGGGCTGACCGCTTCCTCGTGCTTTACGGTATCGCCGCTCCCGATTCGCAGCGCATCGCCTTCTATCGCCTTCTTGACGAGTTCTTCTGAGCGGGACTCTGGGGTTCGAAATGACCGACCAAGCGACGCCCAACCTGCCATCACGAGATTTCGATTCCACCGCCGCCTTCTATGAAAGGTTGGGCTTCGGAATCGTTTTCCGGGACGCCGGCTGGATGATCCTCCAGCGCGGGGATCTCATGCTGGAGTTCTTCGCCCACCCCAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTGTATACCGTCGACCTCTAGCTAGAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCA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Claims (145)
- PDGFアンタゴニストに連結したVEGFアンタゴニストを含むデュアルVEGF/PDGFアンタゴニストであって、前記VEGFアンタゴニストが(a)VEGF若しくはVEGFRに対する抗体であるか、又は(b)VEGFR細胞外トラップセグメントであり、且つ前記PDGFアンタゴニストが(a)PDGF若しくはPDGFRに対する抗体であるか、又は(b)PDGFR細胞外トラップセグメントであり、但し、前記VEGF及びPDGFアンタゴニストが両方とも抗体であることはない、デュアルVEGF/PDGFアンタゴニスト。
- 前記VEGFアンタゴニストが重鎖と軽鎖とを含む抗体であり、且つ前記PDGFアンタゴニストが前記PDGFR細胞外トラップセグメントであり、及び前記抗体の前記重鎖が前記PDGFR細胞外トラップセグメントのC末端にリンカーを介して融合し、且つ前記軽鎖が前記重鎖と複合体を形成する、請求項1に記載のデュアルアンタゴニスト。
- 前記抗体がFab断片である、請求項1又は2に記載のデュアルアンタゴニスト。
- 前記抗体がインタクトな抗体である、請求項1に記載のデュアルアンタゴニスト。
- 前記PDGFアンタゴニストがPDGFR−α又はPDGFR−β受容体の細胞外トラップセグメントであり、且つ前記VEGFアンタゴニストがVEGFに対する抗体としてである、請求項1に記載のデュアルアンタゴニスト。
- 前記PDGFR細胞外トラップセグメントがPDGFR−βのドメインD1〜D5の1つ以上を含む、請求項1〜5のいずれか一項に記載のデュアルVEGF/PDGFアンタゴニスト。
- 前記PDGFR細胞外トラップセグメントがPDGFR−βのドメインD1〜D3を含む、請求項6に記載のデュアルVEGF/PDGFアンタゴニスト。
- 前記PDGFR細胞外トラップセグメントが配列番号11のアミノ酸33〜314を含む、請求項7に記載のデュアルVEGF/PDGFアンタゴニスト。
- 前記VEGFアンタゴニストが抗VEGF抗体を含む、請求項5〜8のいずれか一項に記載のデュアルVEGF/PDGFアンタゴニスト。
- 前記抗VEGF抗体が抗VEGF−A抗体である、請求項9に記載のデュアルVEGF/PDGFアンタゴニスト。
- 前記PDGFR細胞外トラップセグメントが前記重鎖又は軽鎖のC末端に位置する、請求項6〜10のいずれか一項に記載のデュアルVEGF/PDGFアンタゴニスト。
- 前記PDGFR細胞外トラップセグメントが前記重鎖又は軽鎖のN末端に位置する、請求項6〜10のいずれか一項に記載のデュアルVEGF/PDGFアンタゴニスト。
- 前記PDGFRトラップと前記抗VEGF抗体重鎖との間に位置するリンカーを更に含む、請求項12に記載のデュアルVEGF/PDGFアンタゴニスト。
- 前記リンカーが、GGGGSGGGGS、GG、又はGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGである、請求項13に記載のデュアルVEGF/PDGFアンタゴニスト。
- 前記リンカーがGGGGSGGGGSである、請求項14に記載のデュアルVEGF/PDGFアンタゴニスト。
- 前記抗VEGF抗体重鎖が、CDRH1:GYDFTHYGMN、CDRH2:WINTYTGEPTYAADFKR、及びCDRH3:YPYYYGTSHWYFDVを含む、請求項15に記載のデュアルVEGF/PDGFアンタゴニスト。
- 前記抗VEGF軽鎖が、CDRL1:SASQDISNYLN、CDRL2:FTSSLHS及びCDRL3:QQYSTVPWTを含む、請求項16に記載のデュアルVEGF/PDGFアンタゴニスト。
- 抗VEGF重鎖アイソタイプが、CH1、ヒンジ、CH2及びCH3ドメインを含むIgG1であり、且つ軽鎖アイソタイプがκである、請求項17に記載のデュアルVEGF/PDGFアンタゴニスト。
- IgG1定常ドメインが配列番号17に示す配列を有し、且つ軽鎖定常領域が配列番号18に示す配列を有する、請求項18に記載のデュアルVEGF/PDGFアンタゴニスト。
- 前記IgG1定常ドメインが、エフェクター機能を低減する1つ以上の突然変異を有する、請求項19に記載のデュアルVEGF/PDGFアンタゴニスト。
- 前記突然変異が、以下のアミノ酸位置(EU付番):E233、L234、L235、G236、G237、A327、A330、及びP331の1つ以上に対するものである、請求項20に記載のデュアルVEGF/PDGFアンタゴニスト。
- 前記突然変異が、E233P、L234V、L234A、L235A、G237A、A327G、A330S及びP331S(EU付番)からなる群から選択される、請求項20に記載のデュアルVEGF/PDGFアンタゴニスト。
- 以下の突然変異:L234A、L235A及びG237Aを有する、請求項22に記載のデュアルVEGF/PDGFアンタゴニスト。
- 前記重鎖が、組換えDNA技術によって付加されたシステイン残基を更に含む、請求項23に記載のデュアルVEGF/PDGFアンタゴニスト。
- 前記システイン残基が、(EU付番)Q347C及びL443Cからなる群から選択される、請求項24に記載のデュアルVEGF/PDGFアンタゴニスト。
- 前記システイン残基がL443Cである、請求項25に記載のデュアルVEGF/PDGFアンタゴニスト。
- 前記細胞外トラップセグメントとの重鎖トラップ融合物が配列番号9のアミノ酸配列を有し、且つ前記軽鎖が配列番号10のアミノ酸配列を有する、請求項26に記載のデュアルVEGF/PDGFアンタゴニスト。
- 前記PDGFRトラップがPDGFR−βのドメインD1〜D5の1つ以上を含む、請求項3に記載のデュアルVEGF/PDGFアンタゴニスト。
- 前記PDGFRトラップがPDGFR−βのドメインD1〜D3を含む、請求項28に記載のデュアルVEGF/PDGFアンタゴニスト。
- 前記PDGFRトラップが配列番号11のアミノ酸33〜314を含む、請求項29に記載のデュアルVEGF/PDGFアンタゴニスト。
- 前記VEGFアンタゴニストが抗VEGF抗体を含む、請求項30に記載のデュアルVEGF/PDGFアンタゴニスト。
- 前記抗VEGF Fab断片が抗VEGF−A Fab断片を含む、請求項31に記載のデュアルVEGF/PDGFアンタゴニスト。
- 前記PDGFRトラップが前記Fab重鎖又は軽鎖のC末端に位置する、請求項32に記載のデュアルVEGF/PDGFアンタゴニスト。
- 前記PDGFRトラップが前記Fab重鎖又は軽鎖のN末端に位置する、請求項33に記載のデュアルVEGF/PDGFアンタゴニスト。
- 前記トラップ細胞外セグメントとの重鎖融合物が抗VEGF−A Fab断片重鎖を含み、且つ前記軽鎖が抗VEGF−A軽鎖を含む、請求項34に記載のデュアルVEGF/PDGFアンタゴニスト。
- 前記PDGFRトラップと前記抗VEGF Fab断片重鎖との間に位置するリンカーを更に含む、請求項35に記載のデュアルVEGF/PDGFアンタゴニスト。
- 前記リンカーが、GGGGSGGGGS、GG、及びGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGからなる群から選択される、請求項36に記載のデュアルVEGF/PDGFアンタゴニスト。
- 前記リンカーがGGGGSGGGGSである、請求項37に記載のデュアルVEGF/PDGFアンタゴニスト。
- 前記抗VEGF Fab断片重鎖が、CDRH1:GYDFTHYGMN、CDRH2:WINTYTGEPTYAADFKR、及びCDRH3:YPYYYGTSHWYFDVを含む、請求項38に記載のデュアルVEGF/PDGFアンタゴニスト。
- 前記抗VEGF軽鎖が、CDRL1:SASQDISNYLN、CDRL2:FTSSLHS及びCDRL3:QQYSTVPWTを含む、請求項39に記載のデュアルVEGF/PDGFアンタゴニスト。
- 抗VEGF重鎖アイソタイプが、CH1ドメインを含むIgG1であり、且つ軽鎖アイソタイプがκである、請求項40に記載のデュアルVEGF/PDGFアンタゴニスト。
- 半減期延長部分を更に含む、請求項1〜41のいずれか一項に記載のデュアルVEGF/PDGFアンタゴニスト。
- 前記半減期延長部分がポリマーである、請求項42に記載のデュアルVEGF/PDGFアンタゴニスト。
- 前記ポリマーが、PEG及び双性イオンポリマーからなる群から選択される、請求項43に記載のデュアルVEGF/PDGFアンタゴニスト。
- 前記ポリマーが双性イオンポリマーを含む、請求項44に記載のデュアルVEGF/PDGFアンタゴニスト。
- 前記双性イオンポリマーが、ホスホリルコリンを含む単量体を含む、請求項45に記載のデュアルVEGF/PDGFアンタゴニスト。
- 前記単量体が2−(アクリロイルオキシエチル)−2’−(トリメチルアンモニウムエチル)ホスフェートを含む、請求項46に記載のデュアルVEGF/PDGFアンタゴニスト。
- 前記単量体が2−(メタクリロイルオキシエチル)−2’−(トリメチルアンモニウムエチル)ホスフェート(HEMA−PC)を含む、請求項46に記載のデュアルVEGF/PDGFアンタゴニスト。
- 前記ポリマーが3本以上のアームを有する、請求項48に記載のデュアルVEGF/PDGFアンタゴニスト。
- 前記ポリマーが、3、4、5、6、7、8、9、10、11又は12本のアームを有する、請求項49に記載のデュアルVEGF/PDGFアンタゴニスト。
- 前記ポリマーが、3、6又は9本のアームを有する、請求項50に記載のデュアルVEGF/PDGFアンタゴニスト。
- 前記ポリマーが9本のアームを有する、請求項51に記載のデュアルVEGF/PDGFアンタゴニスト。
- コンジュゲートのポリマー部分が300,000〜1,750,000Daのピーク分子量を有する、請求項49に記載のデュアルVEGF/PDGFアンタゴニスト。
- 前記コンジュゲートの前記ポリマー部分が500,000〜1,000,000Daのピーク分子量を有する、請求項53に記載のデュアルVEGF/PDGFアンタゴニスト。
- 前記コンジュゲートの前記ポリマー部分が600,000〜800,000Daのピーク分子量を有する、請求項54に記載のデュアルVEGF/PDGFアンタゴニスト。
- 前記ポリマーが9本のアームを有する、請求項55に記載のデュアルVEGF/PDGFアンタゴニスト。
- 前記ポリマーに共有結合的に結合している、請求項43〜56のいずれか一項に記載のデュアルVEGF/PDGFアンタゴニスト。
- 前記ポリマーが、アミノ基、ヒドロキシル基、スルフヒドリル基及びカルボキシル基からなる群から選択される部分に共有結合的に結合している、請求項57に記載のデュアルVEGF/PDGFアンタゴニスト。
- 前記ポリマーがスルフヒドリル基に共有結合的に結合している、請求項58に記載のデュアルVEGF/PDGFアンタゴニスト。
- 前記スルフヒドリル基が、天然に存在するシステイン残基のものである、請求項59に記載のデュアルVEGF/PDGFアンタゴニスト。
- 前記スルフヒドリル基が、組換えDNA技術によって付加されたシステイン残基のものである、請求項59に記載のデュアルVEGF/PDGFアンタゴニスト。
- 前記ポリマーが配列番号9の731位で前記システイン残基に共有結合的に結合している、請求項61に記載のデュアルVEGF/PDGFアンタゴニスト。
- 前記VEGFアンタゴニストが、VEGFR−1、VEGFR−2及びVEGFR−3の1つ以上の細胞外セグメントを含むVEGFR細胞外トラップセグメントを含み、且つ前記PDGFアンタゴニストが抗PDGF抗体である、請求項1に記載のデュアルVEGF/PDGFアンタゴニスト。
- VEGFRの前記細胞外セグメントがドメインD1〜D7の1つ以上を含む、請求項63に記載のデュアルVEGF/PDGFアンタゴニスト。
- 前記細胞外セグメントがVEGFR−1由来のD2及びVEGFR−2由来のD3を含む、請求項63に記載のデュアルVEGF/PDGFアンタゴニスト。
- 前記D2が前記D3のN末端側にあり、且つ前記ドメイン間にリンカーを更に含む、請求項65に記載のデュアルVEGF/PDGFアンタゴニスト。
- 前記PDGFアンタゴニストがインタクトな抗体である、請求項63に記載のデュアルVEGF/PDGFアンタゴニスト。
- 前記PDGFアンタゴニストがFab断片である、請求項63に記載のデュアルVEGF/PDGFアンタゴニスト。
- 前記抗PDGFR抗体が、ヒト化2A1E2、HuM4Ts.22、ヒト化1B3、ヒト化2C5、抗PDGF−BB、抗PDGF−DD、抗PDGF−BB又は抗PDGF−ABである、請求項67に記載のデュアルVEGF/PDGFアンタゴニスト。
- 重鎖がIgG1であり、且つ軽鎖がκである、請求項69に記載のデュアルVEGF/PDGFアンタゴニストタンパク質。
- 前記重鎖が、Q347C又はL443Cからなる群から選択されるシステインを有する、請求項70に記載のデュアルVEGF/PDGFアンタゴニスト。
- 前記システインにコンジュゲートした半減期延長部分を更に含む、請求項71に記載のデュアルVEGF/PDGFアンタゴニスト。
- 前記半減期延長部分が双性イオンポリマーを含み、前記ポリマーが1つ以上の単量体単位を含み、少なくとも1つの単量体単位が双性イオン基を含む、請求項72に記載のデュアルVEGF/PDGFアンタゴニストタンパク質。
- 前記双性イオン基がホスホリルコリンを含む、請求項73に記載のデュアルVEGF/PDGFアンタゴニスト。
- 前記単量体が2−(アクリロイルオキシエチル)−2’−(トリメチルアンモニウムエチル)ホスフェートを含む、請求項74に記載のデュアルVEGF/PDGFアンタゴニスト。
- 前記単量体が2−(メタクリロイルオキシエチル)−2’−(トリメチルアンモニウムエチル)ホスフェート(HEMA−PC)を含む、請求項74に記載のデュアルVEGF/PDGFアンタゴニスト。
- 前記ポリマーが3本以上のアームを有する、請求項76に記載のデュアルVEGF/PDGFアンタゴニスト。
- 前記ポリマーが、3、4、5、6、7、8、9、10、11又は12本のアームを有する、請求項77に記載のデュアルVEGF/PDGFアンタゴニスト。
- 前記ポリマーが、3、6又は9本のアームを有する、請求項78に記載のデュアルVEGF/PDGFアンタゴニスト。
- 前記ポリマーが9本のアームを有する、請求項79に記載のデュアルVEGF/PDGFアンタゴニスト。
- コンジュゲートのポリマー部分が300,000〜1,750,000Daのピーク分子量を有する、請求項80に記載のデュアルVEGF/PDGFアンタゴニスト。
- 前記コンジュゲートの前記ポリマー部分が500,000〜1,000,000Daのピーク分子量を有する、請求項81に記載のデュアルVEGF/PDGFアンタゴニスト。
- 前記コンジュゲートの前記ポリマー部分が600,000〜800,000Daのピーク分子量を有する、請求項82に記載のデュアルVEGF/PDGFアンタゴニスト。
- 前記PDGFアンタゴニストが、PDGFR−α及びPDGFR−βからなる群から選択されるPDGFRの1つ以上の細胞外セグメントを含むPDGF細胞外トラップセグメントであり、且つ前記VEGFアンタゴニストが、VEGFR−1、VEGFR−2及びVEGFR−3からなる群から選択されるVEGFRの1つ以上の細胞外セグメントを含むVEGF細胞外トラップセグメントである、請求項1に記載のデュアルVEGF/PDGFアンタゴニスト。
- VEGFRの前記細胞外トラップセグメントがドメインD1〜D7の1つ以上を含む、請求項84に記載のデュアルVEGF/PDGFアンタゴニスト。
- 前記細胞外トラップセグメントがVEGFR−1由来のD2及びVEGFR−2由来のD3を含む、請求項85に記載のデュアルVEGF/PDGFアンタゴニスト。
- 前記D2が前記D3のN末端側にあり、且つ前記ドメイン間にリンカーを更に含む、請求項86に記載のデュアルVEGF/PDGFアンタゴニスト。
- 前記PDGFRトラップがPDGFR−βのドメインD1〜D5の1つ以上を含む、請求項84に記載のデュアルVEGF/PDGFアンタゴニスト。
- 前記PDGFRトラップがPDGFR−βのドメインD1〜D3を含む、請求項88に記載のデュアルVEGF/PDGFアンタゴニスト。
- 前記PDGFRトラップが配列番号11のアミノ酸33〜314を含む、請求項89に記載のデュアルVEGF/PDGFアンタゴニスト。
- 前記VEGFアンタゴニストと前記PDGFアンタゴニストとの間にリンカー配列を更に含む、請求項90に記載のデュアルVEGF/PDGFアンタゴニスト。
- 半減期延長部分を更に含む、請求項84〜91のいずれか一項に記載のデュアルVEGF/PDGFアンタゴニスト。
- 前記半減期延長部分が、PEG及び双性イオンポリマーからなる群から選択されるポリマーを含む、請求項92に記載のデュアルVEGF/PDGFアンタゴニスト。
- 前記半減期延長部分が双性イオンポリマーを含む、請求項93に記載のデュアルVEGF/PDGFアンタゴニスト。
- 前記双性イオンポリマーが、ホスホリルコリンを含む単量体を含む、請求項94に記載のデュアルVEGF/PDGFアンタゴニスト。
- 前記単量体が2−(アクリロイルオキシエチル)−2’−(トリメチルアンモニウムエチル)ホスフェートを含む、請求項95に記載のデュアルVEGF/PDGFアンタゴニスト。
- 前記単量体が2−(メタクリロイルオキシエチル)−2’−(トリメチルアンモニウムエチル)ホスフェート(HEMA−PC)を含む、請求項95に記載のデュアルVEGF/PDGFアンタゴニスト。
- 前記ポリマーが3本以上のアームを有する、請求項97に記載のデュアルVEGF/PDGFアンタゴニスト。
- 前記ポリマーが、3、4、5、6、7、8、9、10、11又は12本のアームを有する、請求項98に記載のデュアルVEGF/PDGFアンタゴニスト。
- 前記ポリマーが、3、6又は9本のアームを有する、請求項99に記載のデュアルVEGF/PDGFアンタゴニスト。
- 前記ポリマーが9本のアームを有する、請求項100に記載のデュアルVEGF/PDGFアンタゴニスト。
- コンジュゲートのポリマー部分が300,000〜1,750,000Daのピーク分子量を有する、請求項99に記載のデュアルVEGF/PDGFアンタゴニスト。
- 前記コンジュゲートの前記ポリマー部分が500,000〜1,000,000Daのピーク分子量を有する、請求項102に記載のデュアルVEGF/PDGFアンタゴニスト。
- 前記コンジュゲートの前記ポリマー部分が600,000〜800,000Daのピーク分子量を有する、請求項103に記載のデュアルVEGF/PDGFアンタゴニスト。
- 前記ポリマーが9本のアームを有する、請求項104に記載のデュアルVEGF/PDGFアンタゴニスト。
- 前記細胞外トラップセグメントが、PDGF−AA、PDGF−BB、PDGF−AB、PDGF−CC及びPDGF−DDの1つ以上に結合する、請求項5に記載のデュアルVEGF/PDGFアンタゴニスト。
- 前記細胞外トラップが、PDGF−AB、PDGF−BB及びPDGF−DDに結合する、請求項107に記載のデュアルVEGF/PDGFアンタゴニスト。
- 前記細胞外トラップが、PDGFR−αα、PDGFR−αβ、及びPDGFR−ββ受容体のいずれか1つに対するPDGF−AB、PDGF−BB及びPDGF−DDの結合を阻害する、請求項108に記載のデュアルVEGF/PDGFアンタゴニスト。
- デュアルVEGF/PDGFアンタゴニストを精製する方法であって、
前記デュアルVEGF/PDGFアンタゴニストを、前記デュアルVEGF/PDGFアンタゴニストに結合するアフィニティークロマトグラフィー残基と接触させるステップと、
アフィニティークロマトグラフィー樹脂から前記デュアルVEGF/PDGFアンタゴニストを溶出させて、前記デュアルVEGF/PDGFアンタゴニストを含むアフィニティークロマトグラフィー溶出液を形成するステップと、
前記アフィニティークロマトグラフィー溶出液を、前記デュアルVEGF/PDGFアンタゴニストと結合するイオン交換樹脂と接触させるステップと、
前記イオン交換樹脂から前記デュアルVEGF/PDGFアンタゴニストを溶出させるステップと
を含む方法。 - 前記イオン交換樹脂が陰イオン交換樹脂である、請求項110に記載の方法。
- 前記イオン交換樹脂が陽イオン交換樹脂である、請求項110に記載の方法。
- 前記アフィニティークロマトグラフィー樹脂がプロテインAカラムである、請求項110、111又は112のいずれか一項に記載の方法。
- 薬学的に許容可能な賦形剤と、少なくとも1つのデュアルVEGF/PDGFアンタゴニストとを含む液体医薬組成物であって、0.2EU/ml未満を有する液体医薬組成物。
- 0.1EU/ml未満を有する、請求項114に記載の液体医薬組成物。
- 0.05EU/ml未満を有する、請求項115に記載の液体医薬組成物。
- 前記ポリマーが、約100kDa〜1500kDaのMwによって計測される分子量を有する、請求項48に記載のデュアルVEGF/PDGFアンタゴニスト。
- 前記ポリマーが、1個以上のポリマー開始部位を有するATRPに好適な開始剤から作られる、請求項116に記載のデュアルVEGF/PDGFアンタゴニスト。
- 前記開始剤が3個以上のポリマー開始部位を有する、請求項117に記載のデュアルVEGF/PDGFアンタゴニスト。
- 前記開始剤が、3、4、5、6、7、8、9、10、11又は12個のポリマー開始部位を有する、請求項118に記載のデュアルVEGF/PDGFアンタゴニスト。
- 前記開始剤が、3、6又は9個のポリマー開始部位を有する、請求項119に記載のデュアルVEGF/PDGFアンタゴニスト。
- 前記開始剤が9個のポリマー開始部位を有する、請求項120に記載のデュアルVEGF/PDGFアンタゴニスト。
- 前記開始剤がOG1786である、請求項121に記載のデュアルVEGF/PDGFアンタゴニスト。
- 前記ポリマーが、約500kDa〜1000kDaのMwによって計測される分子量を有する、請求項116に記載のデュアルVEGF/PDGFアンタゴニスト。
- 前記ポリマーが、1個以上のポリマー開始部位を有するATRPに好適な開始剤から作られる、請求項123に記載のデュアルVEGF/PDGFアンタゴニスト。
- 前記開始剤が3個以上のポリマー開始部位を有する、請求項124に記載のデュアルVEGF/PDGFアンタゴニスト。
- 前記開始剤が、3、4、5、6、7、8、9、10、11又は12個のポリマー開始部位を有する、請求項125に記載のデュアルVEGF/PDGFアンタゴニスト。
- 前記開始剤が、3、6又は9個のポリマー開始部位を有する、請求項126に記載のデュアルVEGF/PDGFアンタゴニスト。
- 前記開始剤が9個のポリマー開始部位を有する、請求項127に記載のデュアルVEGF/PDGFアンタゴニスト。
- 前記開始剤がOG1786である、請求項128に記載のデュアルVEGF/PDGFアンタゴニスト。
- 前記ポリマーが、約600kDa〜約900kDaのMwによって計測される分子量を有する、請求項125に記載のデュアルVEGF/PDGFアンタゴニスト。
- 前記ポリマーが、1個以上のポリマー開始部位を有するATRPに好適な開始剤から作られる、請求項130に記載のデュアルVEGF/PDGFアンタゴニスト。
- 前記開始剤が3個以上のポリマー開始部位を有する、請求項131に記載のデュアルVEGF/PDGFアンタゴニスト。
- 前記開始剤が、3、4、5、6、7、8、9、10、11又は12個のポリマー開始部位を有する、請求項132に記載のデュアルVEGF/PDGFアンタゴニスト。
- 前記開始剤が、3、6又は9個のポリマー開始部位を有する、請求項133に記載のデュアルVEGF/PDGFアンタゴニスト。
- 前記開始剤が9個のポリマー開始部位を有する、請求項134に記載のデュアルVEGF/PDGFアンタゴニスト。
- 前記開始剤がOG1786である、請求項135に記載のデュアルVEGF/PDGFアンタゴニスト。
- 前記ポリマーが、750kDa±15%のMwによって計測される分子量を有する、請求項116に記載のデュアルVEGF/PDGFアンタゴニスト。
- 前記ポリマーが、1個以上のポリマー開始部位を有するATRPに好適な開始剤から作られる、請求項137に記載のデュアルVEGF/PDGFアンタゴニスト。
- 前記開始剤が3個以上のポリマー開始部位を有する、請求項140に記載のデュアルVEGF/PDGFアンタゴニスト。
- 前記開始剤が、3、4、5、6、7、8、9、10、11又は12個のポリマー開始部位を有する、請求項139に記載のデュアルVEGF/PDGFアンタゴニスト。
- 前記開始剤が、3、6又は9個のポリマー開始部位を有する、請求項140に記載のデュアルVEGF/PDGFアンタゴニスト。
- 前記開始剤が9個のポリマー開始部位を有する、請求項141に記載のデュアルVEGF/PDGFアンタゴニスト。
- 前記開始剤がOG1786である、請求項142に記載のデュアルVEGF/PDGFアンタゴニスト。
- 疾患の治療又は予防のための、請求項1〜108又は116〜143のいずれか一項に記載のデュアルVEGF/PDGFアンタゴニスト。
- 新生血管障害、任意選択で湿潤型加齢黄斑変性症などの眼新生血管障害の治療又は予防のための、請求項1〜108又は116〜144のいずれか一項に記載のデュアルVEGF/PDGFアンタゴニスト。
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