CN115873110A

CN115873110A - 抑制scube2，一种新颖vegfr2辅助受体，抑制肿瘤血管发生

Info

Publication number: CN115873110A
Application number: CN202211362051.XA
Authority: CN
Inventors: 杨瑞彬; 林育婵
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2016-04-14
Filing date: 2017-04-10
Publication date: 2023-03-31
Also published as: TWI729393B; US11066466B2; TW202142565A; JP6938536B2; EP3442566A4; TW201932492A; TWI669312B; US11866489B2; EP3442566A1; TW202306987A; TW201802118A; CN109069602A; US20210292401A1; US20190127454A1; WO2017180530A1; JP2019511545A; TWI786619B; CN109069602B

Abstract

本发明揭示抑制SCUBE2，一种新颖VEGFR2辅助受体，抑制肿瘤血管发生。具体地，本申请涉及分离的抗SCUBE2(含有信号肽‑补体蛋白质C1r/C1s、Uegf:及Bmp1(CUB)‑表皮生长因子(EGF)域的蛋白质2)抗体或其结合片段。该抗SCUBE2抗体包含特异性结合于位于SCUBE2(SEQ ID NO：66)内的标靶域的抗原结合区且呈现抑制血管内皮生长因子(VEGF)诱导的血管发生的特性。该抗SCUBE2抗体或其结合片段应用于在有此需要的个体中治疗与VEGF诱导的血管发生相关的疾病，或者治疗肿瘤或抑制肿瘤血管发生和癌细胞生长。

Description

抑制SCUBE2，一种新颖VEGFR2辅助受体，抑制肿瘤血管发生

本申请是申请号为201780023573.8(国际申请号为：PCT/US2017/026855)，申请日为2017年4月10日，发明名称为“抑制SCUBE2，一种新颖VEGFR2辅助受体，抑制肿瘤血管发生”的发明专利申请的分案申请。

技术领域

本发明主要涉及抗生成血管疗法，更具体而言，涉及用于抗生成血管疗法的抗SCUBE2抗体。

背景技术

血管内皮生长因子(VEGF)是血管发生的主要调节者；其结合至内皮细胞(EC)表面上的其受体VEGFR2(受体酪氨酸激酶，RTK)且触发二聚化及转磷酸化，以活化信号级联放大，包括EC迁移、增殖及管腔生成(tubulogenesis)所需要的p44/42丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)及AKT。这些VEGF反应可进一步受到少数VEGFR2辅助受体(co-receptor)(诸如神经毡蛋白、类肝素硫酸蛋白聚糖类、CD44及CD146)促进。然而，其他可能存在的调控VEGF诱导的血管发生的VEGFR2辅助受体仍待发现。

SCUBE2为最初由从人类EC鉴别出的三个不同基因(SCUBE1、2及3)组成的小的演化保守基因家族的第二个成员。该基因编码～1,000个氨基酸多肽，以具有5个蛋白质区域的模块形式构成：NH₂端信号肽(signal peptide)、9个连续重复的EGF样基序、间隔区域(spacer region)、3个富含半胱氨酸(cysteine-rich；CR)的重复区域及1个在COOH端的CUB区域。这些SCUBE蛋白可藉由两个不同的膜锚定机制(即，静电及凝集素-聚糖相互作用(electrostatic and lectin-glycan interactions))经由其间隔区域及CR重复区域结合于细胞表面上作为周边膜蛋白质(peripheral membrane protein)，且为多种生长因子的辅助受体。除在正常内皮中表达以外，SCUBE2亦在低氧肿瘤微血管中高表达。然而，SCUBE2是否可作为VEGFR2的辅助受体及其在VEGF诱导的血管发生中扮演的角色仍待探究。

发明内容

在一个方面中，本发明涉及分离的抗SCUBE2抗体或其结合片段，其包含特异性结合于位于SCUBE2(SEQ ID NO：66)内的标靶域的抗原结合区，且呈现抑制VEGF诱导的血管发生的特性。该标靶域选自由以下组成的群：SCUBE2(SEQ ID NO：66)的a.a.位置175至323范围内的EGF样基序(EGF-like motifs)4至6，或a.a.位置441至659范围内的间隔区域(spacer region)，或a.a.位置668至725范围内的第一富含半胱氨酸基序(cys-richmotif)。

在一个实施方式中，本发明的分离的抗SCUBE2抗体或其结合片段呈现抑制肿瘤血管发生及VEGF诱导的内皮细胞增殖及毛细管形成的特性。

在另一个实施方式中，本发明的分离的抗SCUBE2抗体或其结合片段包含重链可变域(V_H)及轻链可变域(V_L)，其中：

(a)V_H包含SEQ ID NO：17的氨基酸序列，且V_L包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列；或

(b)V_H包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列，且V_L包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列；或

(c)V_H包含SEQ ID NO：33的氨基酸序列，且V_L包含SEQ ID NO：34的氨基酸序列；或

(d)V_H包含SEQ ID NO：49的氨基酸序列，且V_L包含SEQ ID NO：50的氨基酸序列。

在另一个实施方式中，本发明的抗SCUBE2抗体的V_H及V_L各自包含如下互补决定区(CDR)1、CDR2、CDR3：

(i)V_H包含含有SEQ ID NO：19的氨基酸序列的CDR1、含有SEQ ID NO：20的氨基酸序列的CDR2及含有SEQ ID NO：21的氨基酸序列的CDR3；且V_L包含含有SEQ ID NO：22的氨基酸序列的CDR1、含有SEQ ID NO：23的氨基酸序列的CDR2及含有SEQ ID NO：24的氨基酸序列的CDR3；或

(ii)V_H包含含有SEQ ID NO：3的氨基酸序列的CDR1、含有SEQ ID NO：4的氨基酸序列的CDR2及含有SEQ ID NO：5的氨基酸序列的CDR3；且V_L包含含有SEQ ID NO：6的氨基酸序列的CDR1、含有SEQ ID NO：7的氨基酸序列的CDR2及含有SEQ ID NO：8的氨基酸序列的CDR3；或

(iii)V_H包含含有SEQ ID NO：35的氨基酸序列的CDR1、含有SEQ ID NO：36的氨基酸序列的CDR2及含有SEQ ID NO：37的氨基酸序列的CDR3；且V_L包含含有SEQ ID NO：38的氨基酸序列的CDR1、含有SEQ ID NO：39的氨基酸序列的CDR2及含有SEQ ID NO：40的氨基酸序列的CDR3；或

(iv)V_H包含含有SEQ ID NO：51的氨基酸序列的CDR1、含有SEQ ID NO：52的氨基酸序列的CDR2及含有SEQ ID NO：53的氨基酸序列的CDR3；且V_L包含含有SEQ ID NO：54的氨基酸序列的CDR1、含有SEQ ID NO：55的氨基酸序列的CDR2及含有SEQ ID NO：56的氨基酸序列的CDR3。

在另一个实施方式中，本发明的分离的抗SCUBE2抗体或其结合片段是单克隆抗体，是人源化的，是融合蛋白质，或选自由以下组成的群：Fv片段、片段抗原结合(Fab)片段、F(ab')₂片段、Fab'片段、Fd'片段、及Fd片段及单链抗体可变片段(scFv)。

在另一个实施方式中，本发明的分离的抗SCUBE2抗体或结合片段囊封于脂质体内。

在另一个方面中，本发明涉及一种医药组合物，其包含：(i)治疗有效量的本发明的分离的抗SCUBE2抗体或其结合片段；及(ii)治疗有效量的特异性抗VEGF的VEGF抗体。

在一个实施方式中，医药组合物中的抗SCUBE2抗体的V_H及V_L包含如下氨基酸序列：(i)V_H包含SEQ ID NO：17的氨基酸序列，且V_L包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列，或(ii)V_H包含含有SEQ ID NO：19的氨基酸序列的CDR1、含有SEQ ID NO：20的氨基酸序列的CDR2及含有SEQ ID NO：21的氨基酸序列的CDR3；且V_L包含含有SEQ ID NO：22的氨基酸序列的CDR1、含有SEQ IDNO：23的氨基酸序列的CDR2及含有SEQ ID NO：24的氨基酸序列的CDR3。

在另一个实施方式中，医药组合物中的抗SCUBE2抗体可为单克隆抗体、嵌合抗体或人源化抗体。

在另一个实施方式中，本发明的分离的抗SCUBE2抗体或其结合片段对由人类血管内皮细胞上表达的SCUBE2或小鼠血管内皮细胞上表达的SCUBE2共用的交叉反应表位皆有特异性结合亲和力。

在另一个方面中，本发明涉及分离的抗SCUBE2抗体或其结合片段在制造用于在有此需要的个体中治疗与VEGF诱导的血管发生相关的疾病的药物中的用途。在一个实施方式中，与VEGF诱导的血管发生相关的疾病选自以下组成的群的至少一者：肿瘤、新生血管性眼部病变、持续增生性玻璃体症候群、糖尿病性视网膜病、早产儿视网膜病、脉络膜新生血管形成、子宫内膜异位、子宫出血、卵巢囊肿及卵巢过度刺激。在另一个实施方式中，本发明的用途与特异性抗VEGF的VEGF抗体的用途组合，用于制造用于在有此需要的个体中治疗与VEGF诱导的血管发生相关的疾病的药物。

另外在另一个方面中，本发明涉及分离的抗SCUBE2抗体或其结合片段在制造用于在有此需要的个体中治疗肿瘤或抑制肿瘤血管发生及癌细胞生长的药物中的用途。或者，本发明涉及分离的抗SCUBE2抗体或其结合片段，其用于在有此需要的个体中治疗与VEGF诱导的血管发生相关的疾病，或者治疗肿瘤或抑制肿瘤血管发生及癌细胞生长。本发明的抗SCUBE2抗体或其结合片段可与抗VEGF抗体(诸如贝伐单抗(bevacizumab))组合使用，用于在有此需要的个体中治疗与VEGF诱导的血管发生相关的疾病，或用于治疗肿瘤或抑制肿瘤血管发生及癌细胞生长。

本发明亦涉及用于在有此需要的个体中治疗与VEGF诱导的血管发生相关的疾病，或用于治疗肿瘤或抑制肿瘤血管发生及癌细胞生长的方法。该方法包含向有此需要的个体施用治疗有效量的本发明的抗SCUBE2抗体或其结合片段。该方法可进一步包含向有此需要的个体施用治疗有效量的抗VEGF抗体。

通过结合以下附图对优选实施例的以下描述，这些和其他方面将变得显而易见，但是在不脱离本公开的新颖概念的精神和范围的情况下，可以作出变化和修改。

附图说明本发明的一个或多个实施方式，且与书面描述一并解释本发明的原理。在任何可能之处，将贯穿各图式使用相同附图标记来指代实施方式的相同或相似组件。

附图说明

图1展示SCUBE2表达于人类脐静脉内皮细胞(human umbilical veinendothelial cells；HUVEC)的细胞表面，且调节血管内皮生长因子(VEGF)诱导的HUVEC增殖及管腔生成。A及B，SCUBE2免疫荧光染色(呈绿色)及流式细胞仪测量结果。箭头标示SCUBE2表达于EC膜上。细胞核以DAPI染色，呈蓝色。C，亚汇合(subconfluent)(增殖)及汇合(非增殖)HUVEC中SCUBE2蛋白质表达的蛋白印迹分析。D至F，SCUBE2过度表达增强VEGF诱导的HUVEC增殖及管腔生成。在用空慢病毒或编码FLAG标记的SCUBE2的重组慢病毒转导的HUVEC中表达的外源SCUBE2(D)。SCUBE2过度表达对于VEGF诱导的HUVEC细胞生长的作用(E)。数据是来自3个独立实验的平均值±SD且表示相对于未受刺激的细胞增加的百分比。**，P<0.01。SCUBE2过度表达对VEGF诱导的管腔生成作用的活体外MATRIGEL^TM血管发生分析(F)。代表性影像标示于上方且藉由计数每一区域的管腔总数进行量化。数据是来自3个独立实验计算的平均值±SD，**，P<0.01。G-I，SCUBE2基因敲减(knockdown)降低VEGF诱导的HUVEC增殖及管腔生成。在HUVEC中藉由两个独立的SCUBE2靶向shRNA慢病毒(SCUBE1-shRNA#1及#2)下调SCUBE2表达(G)。荧光素酶shRNA慢病毒为阴性对照(对照shRNA)。SCUBE2基因敲减对VEGF诱导的(H)HUVEC细胞生长及(I)管腔生成的影响。数据是来自3个独立实验的平均值±SD且表示相对于未受刺激的细胞增加的百分比。**，P<0.01。SCUBE2基因敲减对VEGF诱导的管腔生成作用的体外MATRIGEL^TM血管发生分析。代表性影像标示于上方且藉由计数每一区域的管腔的总数进行量化(I)。数据是来自3个独立实验计算的平均值±SD，**，P<0.01。

图2展示HUVEC中低氧介导的HIF-1α诱导的SCUBE2的上调。A及B，响应低氧，SCUBE2于HUVEC中表达上调。HUVEC在常氧或低氧(1％)下培养12hr。SCUBE2的mRNA及蛋白质表达量藉由定量RT-PCR(A)及蛋白印迹(B)分析进行验证。数据是来自3个独立实验的平均值±SD。**，与常氧相比P<0.01。C，含有天然(WT)或突变(M1、M2及M3)HIF-1α结合位点的SCUBE2启动子报导基因构筑体示意图。SCUBE2基因的启动子的位置(-1500～+1)以横线标示。HIF-1α结合位点以菱形标记，且突变位点以“×”标记。用于ChIP分析的引物及扩增子区亦标记于图中(上部图)。D，HIF-1α反式活化SCUBE2启动子驱动的荧光素酶活性。短暂转染至HUVEC的SCUBE2 WT或突变启动子构筑体的活性的量化图。荧光素酶活性以Renilla荧光素酶活性(pRL-TK)标准化以控制转染效率。E，在低氧情况下HIF-1α直接结合于SCUBE2启动子。采用用于扩增238-bp片段的特异性引物通过PCR分析的HIF-1α蛋白质体内结合于HUVEC中SCUBE2的启动子的ChIP分析。缺少细胞溶胞物(-)为阴性对照。数据为3个独立实验的平均值±SD。**，P<0.01。

图3展示Scube2 EC-KO小鼠中的成体血管发生的衰减。A至D，MATRIGEL^TM嵌入分析。在注射后7天自对照及EC-KO小鼠移出的含有生理食盐水(-)或VEGF(+)的MATRIGEL^TM嵌入物的代表性图片(A)。来自对照及EC-KO小鼠的补充生理食盐水(-)及VEGF(+)的MATRIGEL^TM嵌入物的血红素含量(B)。数据为平均值±SD(n＝5)。**，P<0.01。对照组及EC-KO小鼠移出的含有生理食盐水(-)或VEGF(+)的MATRIGEL^TM嵌入物切片的抗CD31染色(C)。比例尺＝40μm。以IMAGEJ^TM定量抗CD31阳性判定MATRIGEL^TM嵌入物的血管形成量(D)。数据为平均值±SD(n＝5)。**，P<0.01。E至H，后肢局部缺血诱导的新生血管生成。在小鼠中右股动脉结扎前后的后肢血液流动的代表性激光多普勒(Doppler)影像(A)及量化值(B)。在对照及EC-KO小鼠中股动脉结扎之后21天的小腿血管的抗CD31免疫染色的代表性影像(C)及量化(D)。比例尺＝100μm。数据是平均值±SD(n＝6)。**，P<0.01，相比于对照。

图4展示SCUBE2调整HUVEC中的VEGFR2磷酸化及下游信号传导。A及B，SCUBE2基因敲减会降低HUVEC中的VEGF信号传导。在HUVEC中对照及SCUBE2 shRNA基因敲减的情况下，VEGFR2在Tyr1059处、p44/42丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)在Thr202/Tyr204处及AKT在Ser473处的VEGF诱导的磷酸化的HUVEC中VEGF信号的蛋白印迹分析(A)及量化(B)。数据由3个独立实验的平均值±SD。*，P<0.05；**，P<0.01，相比于对照。C及D，对组照及SCUBE2过度表达的EC中，VEGFR2 Tyr1059、p44/42MAPK Thr202/Tyr204及AKT Ser473的VEGF诱导的磷酸化的EC中VEGF信号传导的蛋白印迹分析(C)及量化值(D)。数据由3个独立实验的平均值±SD。*，P<0.05；**，P<0.01，相比于载体。

图5展示EC-KO小鼠肺EC(MLEC)中的VEGF反应及信号传导的衰减。A及B，EC-KOMLEC的VEGF诱发的管腔生成(A)及增殖(B)。数据为3个独立实验的平均值±SD。**，P<0.01，相较于对照组。C及D，在对照组及EC-KO MLEC中，VEGF诱导的VEGFR2 Tyr1059、p44/42MAPKThr202/Tyr204及AKT Ser473的磷酸化的MLEC中的VEGF信号传导的蛋白印迹分析(C)及量化(D)。数据为3个独立实验的平均值±SD。*，P<0.05；**，P<0.01，相较于对照组。E，显微照片展示来自对照组及EC-KO小鼠的胶原嵌入的胸主动脉环培养5天后的血管发生反应。比例尺＝1mm。F，微血管出芽数目及长度的量化图。藉由量化生长微血管的数目(左)及藉由测量由新生成的微血管占据的总长度(右)测定各别主动脉环的血管发生反应。

图6展示SCUBE2在肿瘤内皮细胞(EC)中高度表达。小鼠(乳房、肺、黑素瘤)(A)及人类(前列腺、肉瘤、膀胱)(B)癌瘤中SCUBE2的富集EC表达(由红色箭头指示的棕色)的免疫组织化学染色结果图。使用转殖基因小鼠乳腺肿瘤病毒多瘤病毒中等T(mouse mammarytumor virus polyoma middle T；MMTV-PyMT)动物模式获得源自肺转移灶的自发性小鼠乳腺肿瘤。另外，两个异种移植肿瘤是藉由皮下注射同基因型黑素瘤(B16F10)或刘易斯肺癌瘤(Lewis lung carcinoma，LLC)细胞而产生。内皮细胞免疫反应性于黑素瘤肿瘤中显为红色(而非棕色)，这是因为黑素瘤细胞的黑色素背景。人类正常及肿瘤组织购自商业的组织微数组切片。

图7展示缺少内皮细胞Scube2抑制EC-KO小鼠中的肿瘤血管发生及肿瘤生长。A至D，对照组及EC-KO小鼠皮下注射B16F10黑素瘤细胞或刘易斯肺癌瘤(LLC)肿瘤细胞。在植入后16天B16F10(A)及LLC(B)肿瘤的代表性照片及在指定时间测量的肿瘤生长速率(C及D)。比例尺＝10mm。E至H，EC-KO小鼠中肿瘤微血管分布减少。肿瘤切片的抗CD31染色显示EC-KO小鼠中EC及血管结构的数目减少(E及F)。在植入肿瘤细胞之后16天肿瘤血管生成的量化图(G及H)。比例尺＝40μm。数据是平均值±SD(n＝6)。**，P<0.01。

图8展示EC-KO肿瘤缺乏氧气及营养物质且因此呈现细胞凋亡。来自对照或EC-KO小鼠的B16F10或LLC肿瘤切片的H&E染色(A)、TUNEL测定(C)及Ki-67染色(E)。肿瘤坏死(B)、肿瘤细胞凋亡(D)及增殖(F)的量化图。比例尺＝100μm。数据是平均值±SD(n＝6)。**，P<0.01。

图9展示缺少内皮细胞Scube2阻碍EC-KO小鼠中的肿瘤血管发生及肿瘤生长。A及B，对照组及EC-KO小鼠皮下注射MLTC睾丸间质肿瘤细胞。在植入后60天MLTC睾丸间质肿瘤的代表性照片(A)及在指定时间测量的肿瘤生长速率(B)。比例尺＝10mm。C及D，肿瘤切片的抗CD31染色显示EC-KO小鼠中EC及血管结构的数目减少(C)。在植入肿瘤细胞16天后肿瘤血管形成的量化图(D)。比例尺＝40μm。数据为平均值±SD(n＝6)。**，P<0.01。

图10展示内皮细胞剔除Scube2对视网膜血管发育结果的影响。A，来自对照组及EC-KO幼鼠的全标本包埋P5视网膜用泛内皮(pan-endothelial)标记物CD31染色。白色圆形虚线为对照组血管发生(左)而橙色圆形虚线为EC-KO血管发生(右)。B，血管发生的高倍率放大图(100×)。黄点标记丝状伪足。C及D，藉由测量距视神经的径向距离(C)及丝状伪足的数目(D)(相对于对照的百分比)所得的视网膜血管发生量化图。数据为平均值±SD(各组n＝5)。**，P<0.01。

图11展示内皮细胞中缺失SCUBE2减少氧诱导的视网膜病变(OIR)。A，OIR动物模式的示意图。新生小鼠在出生后第7天(P)至P12时暴露于75％氧气，且在P12至P18时返回至室内空气且于P18时观察病理性新血管生成。B及C，在P18时分别自OIR暴露或年龄匹配的常氧对照小鼠视网膜分离总RNA(n＝3)，且随后藉由Q-PCR或RT-PCR分析血管发生标记基因(B)或SCUBE基因家族(C)的mRNA表达量。D，于暴露OIR模式后对照组或EC-KO小鼠的视网膜血管的全标本包埋分析。p18时(自75％氧气移除之后6天)的中心无血管区域或新生血管区域的大小分别以红色或蓝色标示。E及F，与经历OIR模式的对照(n＝5)相比，EC-KO小鼠(n＝5)中相对于整个视网膜大小的新生血管区域(E)或中心无血管区域(F)的大小(以％表现)明显减少。**，P<0.01。

图12展示抗SCUBE2 mAb及抗血管发生效果。A，抗SCUBE2 mAb克隆及其靶向域。B，藉由活体外管腔生成分析评估抗SCUBE2 mAb抑制血管发生能力。展示具有特异性及抗血管发生效应的抗SCUBE2 mAb的汇总。h，人类；m，小鼠；z，斑马鱼。

图13展示抗SCUBE2 mAb SP.B1抑制HUVEC中VEGF诱导的反应及信号传导。A及B，抗SCUBE2 mAb SP.B1的特性。SP.B1mAb藉由蛋白印迹分析及流式细胞分析技术能识别表达于HEK-293T细胞中的人类及小鼠SCUBE2(非1及3)蛋白质(A)，及SCUBE2在HUVEC细胞表面的上表达(B)。C-I，SP.B1mAb阻断VEGF刺激的细胞反应及VEGF诱导的VEGFR2磷酸化及MAPK/Akt活化。添加SP.B1而非对照IgG抑制VEGF诱导的HUVEC增殖(C)及血管发生(D及E)且与剂量呈现正相关。在有SP.B1或对照组IgG的情形下，HUVEC中经由VEGF诱导的磷酸化及总VEGFR2、MAPK及Akt(F)，及量化图(G-I)。数据为3个独立实验的平均值±SD(G-I)。**，P<0.01。

图14展示结合抗SCUBE2 mAb SP.B1及抗VEGF贝伐单抗

对治疗肺癌肿瘤生长及血管发生具有累加抗肿瘤作用。A，在注射LLC肺癌细胞后各处理组中随时间点测量的平均肿瘤体积(n＝6)。箭头标示抗体处理的时间点。B，各处理的异种移植小鼠中的代表性LLC肺癌瘤。比例尺＝1cm。C，切除肿瘤且称量(n＝6/组)。(D及E)肿瘤的微血管密度。D及E，以IMAGEJ^TM量化的肺癌瘤切片的代表性抗CD31免疫染色(D)及量化的肿瘤血管生成(E)。比例尺＝40μm。*，P<0.05；**，P<0.01。

图15展示结合抗SCUBE2 mAb SP.B1及抗VEGF贝伐单抗

对治疗胰腺导管癌瘤生长及血管发生具有累加抗肿瘤作用。A，在注射PANC-1胰腺导管肿瘤细胞后各处理组随时间点测量的平均肿瘤体积(n＝6)。箭头标示抗体处理的时间点。B，各处理的异种移植小鼠中的代表性PANC-1胰脏癌瘤。比例尺＝1cm。C，切除肿瘤且称量(n＝6/组)。(D及E)肿瘤的微血管密度。D及E，以IMAGEJ^TM量化的胰腺导管癌瘤切片的代表性抗CD31免疫染色(D)及量化的肿瘤血管生成(E)。比例尺＝40μm。*，P<0.05；**，P<0.01。

图16A至图16E展示结合抗SCUBE2 mAb SP.B1及抗VEGF贝伐单抗治疗对结肠直肠腺癌生长及血管发生具有累加抗肿瘤作用。图16A，在注射LS174T结肠癌细胞后各处理组随时间点测量的平均肿瘤体积(n＝6)。箭头标示抗体处理的时间点。图16B，各处理的异种移植小鼠中的代表性LS 174T结肠直肠腺癌瘤。比例尺＝1cm。图16C，切除肿瘤且称量(n＝6/组)。(图16D及图16E)肿瘤的微血管密度。图16D及图16E，以IMAGEJ^TM量化的结肠直肠腺癌瘤切片的代表性抗CD31免疫染色(图16D)及量化的肿瘤血管生成(图16E)。比例尺＝40μm。*，P<0.05；**，P<0.01。

具体实施方式

本发明更特定描述于以下实例中，该等实例意欲仅为说明性目的，因为本领域技术人员将清楚其中的许多修改及变化。现详细地描述本发明的各种实施例。参看附图，在整个附图中类似编号指示类似组件。如在本说明书及之后的整个权利要求书中所用，除非上下文另外明确指示，否则“一(a/an)”及“该”的含义包括复数个参考物。另外，如在本说明书及之后的整个权利要求书中所用，除非上下文另外明确指示，否则“在……中”的含义包括“在……中”及“在……上”。此外，为方便读者阅读，本说明书中可使用标题或子标题，其应不影响本发明的范围。另外，本说明书中所用的一些术语更特定地定义于下文。

定义

除非另外定义，否则本文中所用的所有技术及科学术语具有与本发明所属领域的本领域一般技术人员通常所理解相同的含义。在有矛盾的情况下，将以本文件(包括定义)为准。

出于说明书及权利要求书的目的，本文的术语“抗体片段”或“其片段”用以意谓完整抗体分子的部分或片段，其中片段保有抗原结合功能；亦即，F(ab')₂、Fab'、Fab、Fv、单链Fv(“scFv”)、Fd'及Fd片段。用于自mAb生成各种片段的方法为本领域技术人员所熟知。

术语“对由人类血管内皮细胞上表达的SCUBE2及鼠类血管内皮细胞上表达的SCUBE2共有的交叉反应性表位的特异性结合亲和力或结合特异性”(或“对人类SCUBE2与鼠类SCUBE2之间的交叉反应性表位的结合特异性”)在本文中用以意谓抗SCUBE2抗体结合存在于人类SCUBE2与鼠类SCUBE2上的交叉反应性表位的特性，其中(a)该表位在表达SCUBE2的血管内皮细胞的表面上是可接近的；(b)与存在于鼠类内皮细胞上的SCUBE2表位的结合大于由同型对照免疫球蛋白呈现的结合，且“大于”可定量地测量，因为抗SCUBE2mAb的结合减去一个标准偏差必须大于同型对照免疫球蛋白的结合加上1个标准偏差，如将在以下实例中更加显而易见；且(c)抗SCUBE2抗体对鼠类内皮细胞上表达的SCUBE2的结合比抗SCUBE2抗体对人类内皮细胞上表达的SCUBE2的结合时低至少两倍，如在免疫反应性的标准测定中所检测。

辅助受体是除主要受体以外结合信号传导分子的细胞表面受体，以便促进配体识别且起始生物过程。

人类SCUBE2 cDNA的核苷酸序列(SEQ ID NO：65)；人类SCUBE2的氨基酸序列(SEQID NO：66)。

缩写：EC，内皮细胞；；EC-KO小鼠，EC特异性Scube2基因敲除小鼠；LLC，刘易斯肺癌瘤；AP，碱性磷酸酶；HIF，低氧诱导性因子；HUVEC，人类脐静脉内皮细胞；KO，基因敲除；MAPK，丝裂原激活蛋白激酶；MLEC，小鼠肺内皮细胞；RTK，受体酪氨酸激酶；SCUBE2，含有信号肽-补体蛋白质C1r/C1 s、Uegf及Bmp1(CUB)-表皮生长因子(EGF)域的蛋白质2；shRNA，短发夹RNA；VEGF，血管内皮生长因子；VEGFR2，血管内皮生长因子受体2。

效用/适应症

(1)病理性肿瘤血管发生；及

(2)新生血管性眼部疾病

SCUBE2是在正常及肿瘤血管内皮细胞(EC)中表达的周边膜蛋白质；然而，其在血管发生中的作用仍未充分被探究。我们发现SCUBE2作为VEGFR2的辅助受体及其在VEGF诱导的血管发生中的作用。SCUBE2藉由低氧诱导性因子(HIF-1α)对低氧条件起反应而表达量增加且与人类EC中的VEGFR2相互作用，在人类EC中SCUBE2为VEGFR2的辅助受体而有助于VEGF结合且增强VEGF下游信号传导，因此促进VEGF诱导的血管发生及肿瘤血管发生。此SCUBE2及VEGFR2相互作用及其增强的信号传导可受到内皮细胞Scube2基因去活化、SCUBE2 shRNA介导的基因敲减以及活体外及活体内的SCUBE2mAb中和。内皮细胞Scube2基因敲除(EC-KO小鼠)不影响血管发育，但在MATRIGEL^TM植入物中显示VEGF诱导的血管生成减少，及在诱导后肢局部缺血后减弱的血液流动复原。SCUBE2是VEGFR2的新颖辅助受体，其藉由细调VEGFR2介导的信号传导(尤其在藉由局部缺血或在低氧条件下诱导的产后血管发生期间)来影响VEGF诱导的管腔生成及EC增殖。于肿瘤EC中靶向此SCUBE2功能作为经由抑制肿瘤血管发生的潜在抗肿瘤模式。

我们发现SCUBE2为VEGFR2的辅助受体以强化VEGF与VEGFR2的结合且增强其信号，包括VEGFR2磷酸化及p44/42丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)/Akt活化，因此促进EC中的细胞增殖及管腔生成。在小鼠中内皮细胞去除Scube2的情况下，生理性血管发生正常，实验肿瘤中的病理性血管发生则发生改变，显示抑制肿瘤及减少微血管密度。为模拟肿瘤的血管发生环境，分离Scube2缺陷的EC且藉由VEGF活体外繁殖。突变体EC展示明显减少的VEGF结合、增殖及对VEGF的出芽反应以及下游信号活化。此外，抗SCUBE2及抗VEGF单克隆抗体对异种移植肺肿瘤具有累加的抑制作用。总之，我们的发现确定SCUBE2在肿瘤EC中是VEGF反应的关键调节因子，且表明抗SCUBE2策略在组合抗血管发生癌症疗法中具有极大的潜力。

实施例

不意欲限制本发明的范围，在下文中提供根据本发明的实施例的例示性仪器、设备、方法及其相关结果。应注意，为方便读者阅读，实例中可使用标题或子标题，其决不应限制本发明的范围。此外，在本文中提出且揭示某些理论；然而，不论其是正确或错误的，其绝不应限制本发明的范围，只要本发明是根据本发明实施即可，而不需考虑任何特定理论或操作流程。

材料及方法

抗体及试剂。抗SCUBE2、抗HIF-1α及抗磷酸基-酪氨酸多克隆抗体来自GeneTex(Irvine，CA)。抗磷酸基-VEGFR2(Thr1059)、抗磷酸基-MAPK p44/p42(Thr202/Tyr204)、抗MAPK p44/p42、抗磷酸基-AKT(Ser473)、抗AKT及抗EGFR抗体来自Cell SignalingTechnology(Danvers，MA)。抗VEGFR2及抗VEGF抗体分别来自Thermo Scientific(Rockford，IL)及Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz，CA)。抗CD31、抗磷酸基-丝氨酸/苏氨酸、抗VEGFR1及抗神经毡蛋白-1抗体来自Abcam(Cambridge，MA)。抗Ki67及抗β-肌动蛋白抗体分别来自DAKO Cytomatation(Glostrup,Denmark)及NOVUS Biologicals(Littleton，CO)。重组VEGF₁₆₅蛋白质来自R&D Systems(Minneapolis，MN)。

抗SCUBE2单克隆抗体的生成。如下生成抗SCUBE2特异性抗体。用来自生产自HEK-293T细胞的经纯化的重组SCUBE2间隔子区(氨基酸445至667)免疫接种的BALB/c小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞(SP2/O)融合以产生杂交瘤。杂交瘤细胞株如先前所描述进行制备及亚克隆(Hadas等人“Production of monoclonal antibodies.The effect of hybridomaconcentration on the yield of antibody-producing clones”J Immunol Methods1987；96:3-6)。对SCUBE2(非SCUBE1及3)呈阳性的杂交瘤细胞株如所描述进行鉴别(Tu等人“Localization and characterization of a novel protein SCUBE1 in humanplatelets”Cardiovasc Res.2006；71:486-95；Cheng等人“SCUBE2 suppresses breasttumor cell proliferation and confers a favorable prognosis in invasive breastcancer”Cancer Res.2009；69:3634-41)。

条件性Scube2^Flox/Flox及内皮特异性Scube2基因敲除(EC-KO)小鼠的产生。如所描述生成含有两个被覆盖外显子2至21的65kb基因组序列分开的loxP位点的条件性Scube2^Flox等位基因。为产生内皮特异性的条件性KO小鼠，将在Tie2启动子²控制下表达Cre重组酶且针对Scube2异型接合的转殖基因小鼠(Tie2-Cre；Scube2^+/-)与Scube2^Flox/Flox动物杂交以获得实验Tie2-Cre；Scube2^Flox/+(对照)及Tie2-Cre；Scube2^Flox/-(EC-KO)小鼠。雄性小鼠主要用于在各基因型组(如指定n＝5或大于5)。所有动物实验均经由台湾地区“中央研究院”动物管理学会及使用机构核准。

肿瘤异种移植。藉由在对照组及EC-KO小鼠的侧腹上皮下注射1×10⁶个黑素瘤细胞(B16F10)或刘易斯肺癌瘤细胞(LLC)而产生异种移植肿瘤。肿瘤大小是藉由使用数字测径规一周两次测量且藉由长度×宽度×高度×0.5236计算(以mm³为单位)。在肿瘤生长16天之后，将肿瘤固定且包埋于石蜡中用于组织切片。哌莫硝唑(Pimonidazole)及APO-BRDU^TM(TUNEL)细胞凋亡试剂是根据制造商说明书使用。来自LLC及B16F10肿瘤的组织血管及增殖分别是藉由使用CD31及Ki-67抗体观测。

MATRIGEL^TM血管发生测定。血管发生模型是基于在对照或EC-KO小鼠中使用MARTIGEL^TM植入物。将0.5ml量的生长因子减少的MARTIGEL^TM(具有或不具有100ng/mlVEGF)注入小鼠侧腹。注射由26G针头快速完成，以确保注射器的内容物呈单个塞递送。一周之后，采集塞且在RIPA溶胞缓冲液中均质化。在藉由离心移除残渣之后，藉由使用都氏试剂(Drabkin's regent)(Sigma-Aldrich)测量血红素浓度。或者，将塞固定于4％多聚甲醛中隔夜、包埋于石蜡中、切片，且用抗CD31抗体染色。

后肢局部缺血模型。如先前所描述³执行后肢局部缺血模型。简言之，露出对照组及EC-KO小鼠(8周)的股动脉，与股神经及静脉分离，且在两个相隔5mm的位置结扎，一个位置正好接近腹股沟韧带，且第二个位置远离第一位置且接近腘动脉。藉由间断4-0缝合线闭合皮肤。小鼠在手术前后的不同时间予以麻醉，使用Moor红外激光多普勒影像仪观测激光多普勒流动成像。在近端股动脉结扎之后3周，使用麻醉小鼠采集小腿肌肉且以CD31染色。

主动脉环出芽测定。基本上如标准程序来制备小鼠主动脉环出芽测定。主动脉采集自小鼠。用镊子及解剖刀移除所有额外的脂肪、组织及分支血管。将主动脉移至含有OPTI-MEM培养基的培养皿，且主动脉切割大约0.5mm厚的环状。将主动脉环嵌入1mg/ml I型胶原中且随后使其在37℃/5％ CO₂下孵育1h。添加补充有2.5％ FBS及30ng/ml VEGF的OPTI-MEM培养基且包围主动脉环。在第5天计算微血管出芽的数目及长度。

免疫组织化学。组织切片(5μm厚)用二甲苯脱蜡、在梯度浓度的乙醇中复水、用3％H₂O₂处理20min、以PBS洗涤、阻断溶液(补充有2％ BSA及2％正常山羊血清的PBST)作用1h，且在室温下与一级抗体孵育隔夜。藉由使用过氧化酶结合的抗体及稳定3,3'-二胺基联苯胺(DAB)过氧化酶底物检测抗体结合。使用苏木精(Hematoxylin)进行对比染色。

初代小鼠肺EC(MLEC)分离、表征及培养。如所描述⁶由对照组及EC-KO小鼠的肺组织分离初代MLEC。各小鼠(6周龄)首先接受100μl的肝素(140U/ml)肌内注射，随后10min之后，将小鼠麻醉，且使胸腔暴露。经由右心室注射低温M199培养基以自肺冲洗掉血液。随后将1ml量的胶原酶A(1mg/ml)经由气管快速滴注进入肺中。移除肺且与5ml胶原酶A在37℃下一起孵育30min。细胞悬浮液藉由70μm过滤器过滤，随后在1000rpm下离心5min。使细胞沉淀再悬浮于生长培养基(补充有20％胎牛血清、50μg/ml EC生长因子、100μg/ml肝素、2mM谷氨酰胺、100单位/毫升的青霉素及100μg/ml链霉素的M199培养基)中且培养于涂布明胶的组织培养皿中持续2天。使用胰蛋白酶移除细胞且细胞悬浮液用于抗CD31-PE抗体染色及FACS分选。

HUVEC中的低氧处理及慢病毒SCUBE2过度表达/基因敲减。HUVEC购自生物资源收集及研究中心(Bioresource Collection and Research Center，台湾)且根据供货商的建议进行培养。针对低氧处理，藉由在以95％ N₂/5％ CO₂的混合物充气的CO₂培育箱中孵育而使HUVEC暴露于低氧(1％ O₂)。HUVEC藉由自我失活型慢病毒转导系统用全长SCUBE2表达载体或空载体改造。我们使用由RNAi Consortium产生的基于载体的发夹RNA(shRNA)使HUVEC中的内源性SCUBE2基因敲减。

染色质免疫沉淀(ChIP)。ChIP分析如在EZ-MAGNACHIP^TMG试剂盒使用说明书描述。简言之，HUVEC(1×10⁷个细胞)藉由使用1％甲醛交联，在500μl溶胞缓冲液中溶解且超音波震荡处理成大约500bp片段。ChIP使用抗HIF-1α或IgG的抗体。对照组DNA或免疫沉淀DNA取2μl的DNA模板组成的50μl反应体积中用引物(表1)扩增。PCR涉及使用Taq聚合酶：94℃持续30sec，63.5℃持续30sec，72℃持续40sec，进行35个循环，随后72℃下持续5min。在1.5％琼脂糖凝胶上分离来自各PCR反应的10μl样品。

荧光素酶报导基因测定。使用NUCLEOFECTOR^TM根据制造商的说明书，以4.5μgSCUBE2启动子荧光素酶报导基因质粒(WT、M1、M2及M3)及内部对照(0.45μg pRL-TKRenilla荧光素酶质粒)短暂转染HUVEC。再培养细胞2天，采集且制备，用于双荧光素酶报导基因测定系统的报导基因测定。

EC增殖测定。如所描述藉由溴化3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑鎓(MTT)分析来确定SCUBE2对EC增殖的作用。简言之，EC经胰蛋白酶处理且于100μl完全培养基中以2000个细胞/孔培养于96孔细胞培养盘上。次日，用VEGF(100ng/ml)或对照培养基刺激细胞4天，并检测细胞数目。

EC管腔生成测定。将EC(3×10³个细胞/孔)接种于具有VEGF(100ng/ml)的15孔μ-Slide血管发生盘中的MATRIGEL^TM上。16小时之后，藉由计数在每孔的3个随机区域中的血管来确定管腔化。

VEGF碱性磷酸酶(AP)结合测定。基本上如文献描述进行AP标记的VEGF蛋白质的生成及结合实验。AP-VEGF嵌合配体藉由使用PCR藉由以下引物扩增VEGF cDNA的部分来构筑：CCG CTC GAG GCA CCC ATG GCA GAA GGA(SEQ ID NO：67)及GCT CTA GAT TAT CAC CGCCTC GGC TTG TCA CA(SEQ ID NO：68)。随后将498bp的扩增片段克隆到APtag-5的XhoI及XbaI限制位点中。AP-VEGF融合蛋白质及对照AP蛋白质是藉由短暂转染至HEK-293T细胞中来生成。收集经转染的HEK-293T细胞的上清液、浓缩且储存。将过度表达VEGFR2单独或连同SCUBE2一起过度表达的HEK-293T细胞与EC在上清液中下孵育4h，且于4℃以PBS洗涤3次。随后细胞于冰上在溶胞缓冲液(25mM Hepes，pH7.6、150mM NaCl、5mM EDTA、10μg/ml抑肽酶、5μg/ml亮抑酶肽、10％甘油及1％ Triton X-100)中溶解5min。细胞溶解物藉由在4℃下以10,000xg离心20min取上清液。AP活性使用磷酸对硝苯酯底物检测。

拉下实验(Pull-down assay)。使用活体外转录/翻译方法生成Myc标记的VE-钙黏素-FL、D1及D2蛋白质(Myc.VE-钙黏素-FL、-D1、-D2)。使用谷胱甘肽-SEPHAROSE^TM珠粒自细菌溶解物的可溶部分结合重组GST标记的SCUBE2-CUB蛋白质(GST.SCUBE2-CUB)。FLAG标记的SCUBE2-FL、EGF、间隔区域、CR及CUB蛋白质(FLAG.SCUBE2-FL、-EGF、-间隔子、-CR、-CUB)藉由HEK-293T细胞过度表达生成。重组VEGF₁₆₅蛋白质购自R&D Systems。关于SCUBE2及VEGF₁₆₅相互作用分析，重组VEGF₁₆₅蛋白质与结合至抗FLAG M2抗体-琼脂糖珠粒或对照珠粒的FLAG.SCUBE2-FL、EGF、间隔子、CR及CUB蛋白质在0.5ml结合缓冲液[40mM HEPES(pH7.5)，100mM KCl，0.1％NONIDET^TMP-40及20mM 2-巯基乙醇]中混合。在4℃下孵育4h之后，充分洗涤珠粒，且藉由免疫印迹法使用抗VEGF抗体来观测相互作用的蛋白质。关于SCUBE2及VEGFR2相互作用测定，GST标记的SCUBE2-CUB蛋白质与Myc.VEGFR2-FL、-D1、-D2蛋白质在0.5ml结合缓冲液中混合。在4℃下孵育4h之后，在轻微摇动下使蛋白质溶液与谷胱甘肽-SEPHAROSE^TM一起孵育2h。以结合缓冲液洗涤三次之后，藉由免疫印迹法使用抗Myc抗体来观测沉淀的结合蛋白。

共焦免疫荧光显微分析。将内皮细胞固定于4％甲醛中，以2％胎牛血清作用1h，且与鸡抗SCUBE2及小鼠抗VEGFR2抗体一起孵育1h。以PBS洗涤3次且用ALEXA

488标记的抗小鼠IgG抗体及Alexa Fluor 594标记的抗鸡IgY抗体染色1h，随后用PBS洗涤3次，且藉由使用具有DAPI的VECTAS

封固剂封固。在室温下在共焦显微镜下撷取荧光影像。

RNA提取、cDNA合成及RT-PCR

藉由

方法由经培养细胞制备总RNA。取5μg RNA，使用SUPERSCRIPT^TMII逆转录酶进行第一股cDNA合成。第一股cDNA反应物的十分之一作为模板用于各PCR。PCR产物以1％琼脂糖凝胶上分析。引物列于表1中。

免疫沉淀及蛋白印迹分析

Myc标记的VEGFR2表达构筑体单独及与编码指定的FLAG标记的SCUBE2蛋白质的一系列表达质粒组合转染于HEK-293T细胞中。转染之后两天，用PBS洗涤细胞一次，于冰上在细胞溶解缓冲液(25mM Hepes，pH7.6、150mM NaCl、5mM EDTA、10μg/ml抑肽酶、5μg/ml亮抑酶肽、10％甘油及1％

X-100)中作用5min。细胞溶解物藉由在4℃下以10,000xg离心20min后取上清液。样品与1μg的指定抗体及20μl的50％(v/v)蛋白A琼脂糖在轻微摇动下一起孵育2h。在以缓冲液洗涤3次后，沉淀的复合物藉由沸腾加热溶解于样品缓冲液，以SDS-PAGE分离，且转移至PVDF膜，以含有0.1％明胶及0.05％

20的磷酸盐缓冲盐水(pH 7.5)反应且用指定抗体进行印迹分析。在2次洗涤之后，将印迹与过氧化酶结合的山羊抗小鼠IgG一起孵育1h。在洗涤膜之后，藉由使用VISGLOW^TM化学发光受质、HRP系统(Visual Protein)观测。

统计分析。数据呈现为平均值±SD且藉由双尾成对t检定进行分析。P<0.05视为在统计上具有显著差异。

表1列举用于RT-PCR(SEQ ID NO：69-82；85-86)；ChIP(SEQ ID NO：83-84)；Q-PCR(SEQ ID NO：87-94)；基因分型(SEQ ID NO：95-102)的引物序列及SEQ ID NO：。

表1

^*SCUBE1至3及GAPDH是人类基因；Scube1至3及Gapdh是小鼠基因。

结果

SCUBE2表达于人类EC中且调节VEGF诱导的EC增殖及管形成

我们藉由免疫染色(图1A)、流式细胞测量术(图1B)及蛋白印迹分析(图1C)首先确认SCUBE2蛋白质表达于HUVEC中。共焦免疫荧光染色及流式细胞分析揭示SCUBE2表达于EC细胞膜上(图1A及1B)。另外，SCUBE2于增殖性亚汇合EC中表达量高于生长停滞的汇合EC(图1C)。

我们随后藉由SCUBE2在人类EC中的过度表达及基因敲减来研究SCUBE2在调节VEGF反应中的潜在作用。以重组慢病毒在HUVEC中表达全长FLAG标记的SCUBE2或两个独立的靶向SCUBE2的短发夹RNA(shRNA 1号及2号)，SCUBE2的过度表达及基因敲减藉由RT-PCR或蛋白印迹分析验证(图1D及1G)。SCUBE2过度表达明显增加(图1E及1F)而SCUBE2基因敲减(图1H及1I)明显减少VEGF诱导的EC生长及MATRIGEL^TM上的毛细管样网状结构形成。总之，此等数据支持SCUBE2在HUVEC中具有调节VEGF诱导的增殖及管腔生成的能力。

HUVEC中SCUBE2藉由HIF-1α的上调

因为低氧诱导的藉由HIF-1α造成的VEGF表达对于产后的新血管生成至为关键，故而我们随后研究内皮细胞SCUBE2是否亦藉由类似机制增加其表达量。HUVEC暴露于低氧12h之后，SCUBE2(而非SCUBE1或SCUBE3)的表达在mRNA及蛋白质两个层面皆显著增加，其表达量与HIF-1α呈现正相关(图2A及2B)。此外，ChIP分析及启动子突变分析确认于低氧状况下内源性HIF-1α可与SCUBE2启动子的HIF结合区域(A/GCTGA)相互作用促使HUVEC中的SCUBE2表达增加(图2C-2E)。

EC特异性Scube2基因敲除(EC-KO)小鼠的产生

为进一步研究内皮细胞Scube2对活体内VEGF反应的作用，我们藉由使带有Scube2的条件性“Floxed”等位基因[侧接编码9个EGF样重复单元、间隔子区、3个富含半胱氨酸的基序及具有loxP的CUB域的外显子]的小鼠与在血管生成素受体(Tie2)启动子控制下表达噬菌体重组酶Cre(其为泛内皮表达)的转基因小鼠杂交，特异性敲除EC中的Scube2。雄性Tie2-Cre；Scube2^+/-与雌性Scube2^Flox/Flox小鼠交配以获得Tie2-Cre；Scube2^Flox/+(命名为“对照组”)及Tie2-Cre；Scube2^Flox/-(命名为EC-KO)小鼠。

为测定Scube2^Flox等位基因的内皮特异性重组效率，自对照组及EC-KO小鼠分离初代MLEC。流式细胞分析揭示此细胞群高度富含EC，这是因为大约95％的此等细胞皆表达CD31。另外，mRNA与蛋白质分析显示Scube2特异性的于小鼠内皮细胞中移除，而不影响EC-KO MLEC中的Scube1及Scube3表达量。同样地，成年小鼠肺的免疫染色验证EC-KO小鼠中完全去除内皮细胞(而非支气管上皮细胞)Scube2表达。因此，在成年EC-KO小鼠的内皮细胞中有效剔除Scube2。

对照组和EC-KO小鼠以预期的孟德尔(Mendelian)比率恢复并显示正常的体重增加模式，因此血管发生和血管生成足以进行正常发育。我们在对照组及EC-KO小鼠之间未观测到总体健康状况及行为的明显差异。EC-KO雌性能正常繁殖且幼崽正常，这表明再生性血管发生足以使得群落增殖。总之，此等数据表明内皮细胞Scube2基因敲除不影响生理性血管发生。

Scube2 EC-KO小鼠中对外源性VEGF及成体血管发生的反应减弱

为探究内皮细胞Scube2在活体内VEGF刺激的血管发生中的潜在功能，我们使用MATRIGEL^TM塞测定，其中与VEGF(+)或生理食盐水(-)混合的MATRIGEL^TM皮下投与至年龄及性别匹配的EC-KO及对照小鼠，7天后回收(图3)。在肉眼检查上，含有来自对照小鼠的VEGF的MATRIGEL^TM塞是淡红棕色的(图3A)。然而，含有来自EC-KO小鼠的VEGF的塞比对照组的塞淡(图3A)。同样地，就EC-KO小鼠来说，含VEGF的MATRIGEL^TM塞中的总血红素含量(一种无破损血管形成的量度，与新形成的毛细管网状结构的量相关)降低约50％(图3B)。为确保此血红素差异是由减小的微血管分布密度所致，藉由用抗CD31抗体(内皮的标记物)免疫染色来量化塞中的血管增殖(图3C及3D)。与植入MATRIGEL^TM的对照小鼠相比，经植入EC-KO小鼠显示血管生成减少，即使在含生理食盐水的塞中亦如此(图3C)。此外，在EC-KO中含VEGF塞的微血管密度比对照小鼠低50％(图3D)，且未见大血管(图3C)，这表明VEGF诱导的成体血管发生反应在体内受内皮细胞Scube2调节。

为进一步评估内皮细胞Scube2的促血管发生作用，我们使用第二种成体新血管生成动物模式(亦即，后肢局部缺血)：在对照组及EC-KO小鼠中结扎总股动脉，且分别藉由激光多普勒成像及CD31免疫染色随时间点监测血液流动以及血管发生。激光多普勒分析揭示与未结扎对侧肢体相比，手术后的对照组及EC-KO动物的结扎肢体中血液流动的减少程度类似(图3E及3F)，表示在两种品系中手术后局部缺血情况相同。在对照组小鼠中，血液流动在手术后21天复原至近乎基线水平。然而，在EC-KO动物中血液流动复原明显减弱(图3E及3F)。同样地，腓肠肌(小腿)肌肉的组织学显示在21天时EC-KO中经由结扎诱发的抗CD31阳性毛细管密度低于对照小鼠(图3G及3H)。因此，在经由股动脉结扎诱发的局部缺血后，Scube2于内皮细胞功能性血管发生上扮演不可或缺的角色。

SCUBE2在HUVEC中与VEGFR2共定位且增强VEGF与VEGFR2的结合

由于SCUBE2可在活体外及活体内调节VEGF反应(图1及3)且SCUBE蛋白质可作为信号传导受体丝氨酸/苏氨酸激酶或RTK的辅助受体，因此我们分析SCUBE2是否在HUVEC中与VEGFR2共定位并相互作用。共焦显微镜及共免疫沉淀实验显示在HUVEC中VEGF增强SCUBE2与VEGFR2的结合，在VEGF刺激之后10min达到高峰值。在以SCUBE2及VEGFR2表达质粒转染的HEK-293T细胞中进一步详细描述这个结果，显示SCUBE2的CUB结构区域可与VEGFR2相互作用。另外，此SCUBE2-VEGFR2相互作用具有特异性，这是因为抗SCUBE2免疫沉淀并未降低其他RTK(诸如VEGFR1及EGFR)或另一种VEGFR2辅助受体神经毡蛋白-1。最重要的是，除结合于VEGFR2以外，SCUBE2可经由其EGF样重复结构区域直接与VEGF-A₁₆₅结合。我们已进行额外共免疫沉淀实验来验证SCUBE1或SCUBE3是否亦可结合于VEGF或VEGFR2。不同于特异性结合于VEGF的SCUBE2，SCUBE1及SCUBE3无法与VEGF相互作用，表明SCUBE1或SCUBE3不能作为VEGF的辅助受体(参见Lin等人“Endothelial SCUBE2 Interacts With VEGFR2 and RegulatesVEGF-Induced Angiogenesis”Arterioscler Thromb Vasc Biol.2017；37:144-155)。

为评估SCUBE2实际上是否能够增强VEGF与VEGFR2的结合，如所描述的我们首先生成功能性碱性磷酸酶(AP)-VEGF融合蛋白质。如与对照AP蛋白质相较，于HUVEC中AP-VEGF蛋白质有能力结合于内源性VEGFR2上。有趣的是，如与相对应对照HUVEC相较，SCUBE2过度表达会增加而SCUBE2基因敲减或基因敲除会减少AP-VEGF结合。同样地，史卡查(Scatchard)分析显示在HEK-293T细胞中，在VEGFR2与SCUBE2共表达的情况下，VEGF与VEGFR2的结合亲和力较仅VEGFR2的情况下的约增加3倍(K_d＝0.21nM相对于0.58nM)。总之，此等数据表明SCUBE2作为VEGFR2的辅助受体且增强VEGF与VEGFR2的结合。

SCUBE2调整HUVEC中的VEGFR2磷酸化及下游信号传导

我们接着研究SCUBE2是否有助于HUVEC中的VEGF活化信号传导。为此，我们使用作为刺激剂的VEGF及SCUBE2 shRNA基因敲减或SCUBE2过度表达来评估SCUBE2对VEGF诱导的信号传导的功能。VEGF可诱导的VEGFR2Tyr1059磷酸化、p44/42MAPK信号级联及AKT活化。然而，SCUBE2 shRNA基因敲减会减少(图4A至B)而SCUBE2过度表达(图4C至D)会增强VEGF诱导的VEGFR2磷酸化、p44/42MAPK信号级联及AKT活化。我们的数据强烈指示作为VEGFR2辅助受体，SCUBE2在HUVEC中有能力调节VEGF诱导的VEGFR2下游信号传导。我们已判定HUVEC中VEGF处理后SCUBE2的磷酸化状况。在VEGF刺激之后，抗SCUBE2免疫沉淀物分别使用抗磷酸酪氨酸(p-Tyr)或抗磷丝氨酸/苏氨酸(p-Ser/Thr)泛特异性抗体进行印迹分析。在以VEGF处理长达30min后，SCUBE2似乎未磷酸化。然而，需要额外磷酸基蛋白质组分析来验证SCUBE2是否在VEGF刺激之后磷酸化。

Scube2调整初代鼠类肺EC(MLEC)中的VEGF信号传导

与我们的HUVEC中的基因敲减实验(图1G-1I)类似，如与对照MLEC相比，在EC-KOMLEC中VEGF诱导的细胞增殖及管腔生成明显减弱(图5A至B)。我们进一步评估内皮细胞Scube2基因缺失对VEGF诱导的信号传导的作用。我们以50ng/ml VEGF刺激对照及EC-KOMLEC历时0、10、20及30min。与HUVEC中的SCUBE2 shRNA基因敲减一致，EC-KO中藉由VEGFR2、p44/42MAPK及AKT的磷酸化测定的VEGF信号传导明显低于对照MLEC(图5C至D)。

Scube2 EC-KO小鼠的主动脉环微血管发生能力降低

我们使用离体主动脉环分析进一步研究SCUBE2在血管发生中的功能，其中我们比较源于对照组及EC-KO小鼠的主动脉环的血管发生能力。将自对照组及EC-KO小鼠分离的主动脉环以PBS或VEGF处理，且藉由量化生长的血管数目及测量新形成血管的总长度来测定各个别主动脉环的血管发生反应。第5天时，对VEGF(30ng/ml)产生反应的管状结构(出芽)数目及出芽的长度的定量结果显示，与对照组主动脉环相较EC-KO中的两个参数皆明显降低(图5E至5F)。因此，此等结果进一步确认活体外分析结果，证明SCUBE2于VEGFR2相关的血管发生中的重要性。

EC-KO小鼠中肿瘤生长降低

SCUBE2在肿瘤内皮细胞中高度表达。图6显示免疫组织化学染色的结果，说明乳房、肺、黑素瘤(A)及前列腺、肉瘤及膀胱癌瘤(B)中SCUBE2大量表达于EC(箭头)。内皮细胞Scube2于成体血管发生扮演重要角色(图3)，我们随后研究Scube2的内皮细胞失活(EC-KO)对病理性肿瘤血管发生及肿瘤生长的影响。对照组及EC-KO小鼠皮下注射同基因型黑素瘤(B16F10)或刘易斯肺癌瘤(LLC)细胞。EC-KO的肿瘤的生长与尺寸均低于对照小鼠(图7A至D)。与剔除内皮细胞Scube2的成体血管发生一致，EC-KO中的微血管密度(藉由抗CD31染色所见)明显低于对照组肿瘤(图7E至H)，显示内皮细胞Scube2于促进肿瘤血管发生及生长中发挥重要功能。重要的是，非肿瘤成体皮肤中的血管密度和对照组与EC-KO动物并无差异(数据未示出)。

EC-KO小鼠中观测到的血管发生缺陷暗示肿瘤细胞可能缺乏营养物质及氧且因而经历细胞凋亡及坏死。与此概念相符，苏木精(hematoxylin)及曙红(eosin)染色揭示EC-KO肿瘤中坏死组织，但在对照组肿瘤中的坏死区域小得多(图8A至B)。此外，如与对照组肿瘤相较，末端脱氧核苷酸转移酶dUTP切口末端标记(TUNEL)分析及Ki-67免疫染色在EC-KO肿瘤中显示细胞凋亡增加且肿瘤细胞增殖明显降低(图8C-F)。此外，这些结果显示内皮细胞Scube2对于血管发生以维持肿瘤细胞存活为不可或缺的。

图9展示缺失内皮细胞Scube2阻碍EC-KO小鼠中的肿瘤血管发生及肿瘤生长。显示植入MLTC睾丸间质肿瘤后60天的代表性照片及在指定时间点测量的肿瘤生长速率(A及B)。EC-KO小鼠显示肿瘤血管分布下降。肿瘤切片的抗CD31染色结果显示EC-KO小鼠中EC及血管结构的数目减少(C)。在植入肿瘤细胞后60天肿瘤血管生成的量化图(D)。

EC-KO小鼠中视网膜血管生长减少

图10展示内皮细胞剔除Scube2对视网膜血管分布的发育生长的作用。

EC-KO小鼠减轻由氧诱导的视网膜病变

图11展示内皮细胞中缺失SCUBE2减少氧诱导的视网膜病变(OIR)。

抗SCUBE2抗体

SCUBE2具有至少5个相异的结构区域(图12A)：NH₂端信号肽序列、9个重复的EGF样重复区域(E)、间隔区域、3个富含半胱氨酸的基序(CR)及一个COOH端的CUB区域。各区域的氨基酸为(1)SP：a.a.1-37；(2)EGF样重复区域：a.a.49-442；(3)间隔区域：a.a.443-669；(4)CR：a.a.70-803；及(5)CUB：a.a.838-947。SCUBE2蛋白质(a.a.38至a.a.1028)能分泌至细胞外介质。

生成抗SCUBE2抗体。图12A显示各抗SCUBE2 mAb克隆的特异性靶向域。EGF-C3识别EGF样重复区域4-6(a.a.175-323)，而SP-A1(a.a.441-659)、B1(a.a.441-659)及B2(a.a.441-659)结合SCUBE2的间隔区域。CR-#5克隆检测SCUBE2的第1个富含半胱氨酸的基序(a.a.668-725)。EGF-C3克隆藉由以含有SCUBE2的EGF样重复区域的重组蛋白免疫接种而获得，且SP-A1、B1及B2藉由用含有SCUBE2的间隔区域的重组蛋白免疫接种而获得。同样地，CR-#5克隆藉由含有第1个富含半胱氨酸的重组蛋白免疫接种而获得。

此等抗体在活体外管腔生成分析中与内皮细胞一起孵育显示具抑制血管发生的特性(图12B)。表2至6显示SCUBE2mAb的CDR序列。展示V_H与V_L域的互补决定区1至3(CDR1至3)及构架区1至4(FW1至4)。

新生血管性眼部疾病的治疗

在氧诱导的视网膜病变的小鼠模式中于玻璃体内注射SCUBE2抗体，观察对视网膜新血管生成的影响。我们的初步数据藉由活体外内皮细胞管形成测定显示此等SCUBE2抗体可抑制血管发生。举例而言，SP.B1克隆能够抑制经由VEGF刺激的内皮细胞增殖及毛细管形成(图13C至E)。

抗SCUBE2(SP.B1)及抗VEGF(贝伐单抗)抗体协同地抑制肺、胰脏及结肠直肠癌生长

由于我们的结果表明膜相关的SCUBE2在肿瘤血管发生中发挥关键作用，因此我们评估评估以中和mAb来抑制SCUBE2是否可做为用于治疗实体肿瘤的潜在药剂。产生对SCUBE2具有特异性的mAb(克隆SP.B1)；该mAb未与SCUBE1或3交叉反应(图13A至B)，这显示没有显著的脱靶效应。SCUBE2具有促血管发生活性，我们首先评估HUVEC中此mAb对VEGF刺激的反应的活体外作用。孵育SP.B1 mAb而非对照IgG能阻断VEGF诱导的信号传导，包括VEGFR2磷酸化及p44/42MAPK/Akt活化(图13F至I)。此mAb的功能活性是藉由抑制经由VEGF刺激的EC增殖及毛细管形成的能力予以验证(图13C-E)。

此外，我们建立具有肺癌瘤LLC细胞的肿瘤模式，其不表达SCUBE2或VEGFR2。与SP.B1mAb一起孵育不影响细胞生长(数据未示出)，因此SP.B1mAb并不靶向实际的肿瘤细胞，因此，任何减少的肿瘤生长均归因于抗血管发生作用。由于SCUBE2作为VEGFR2的辅助受体且贝伐单抗可抑制肿瘤血管发生，因此我们亦研究用SP.B1及贝伐单抗

合并治疗是否可对抑制肺肿瘤生长具有累加效应。当肺肿瘤达到50mm³时开始治疗性注射。如与小鼠或人类IgG治疗相比，于SP.B1、贝伐单抗及合并治疗(SP.B1+贝伐单抗)后LLC生长明显受抑制(图14A至C)。此外，与SP.B1(29％)或贝伐单抗(40％)单独治疗相较，SP.B1+贝伐单抗对肿瘤生长具有更大抑制作用(56％)(图14C)，因此这2种药剂对于肿瘤血管发生可能针对不同路径起作用。另外，免疫组织化学分析结果显示SP.B1与贝伐单抗治疗显著减小微血管密度(图14D至E)。重要的是，分别与仅SP.B1及贝伐单抗治疗相比，在SP.B1+贝伐单抗的情况下血管数目少了49％及31％。用SP.B1及贝伐单抗合并治疗在临床上具有靶向肿瘤血管发生的潜力。

图15展示合并抗SCUBE2 SP.B1及抗VEGF贝伐单抗

治疗对胰腺导管癌瘤生长及血管发生具有累加的抗肿瘤作用。图16A至图16E展示合并抗SCUBE2 SP.B1及抗VEGF贝伐单抗治疗对结肠直肠腺癌生长及血管发生具有累加的抗肿瘤效果。

表2

表3

表4

表5

表6

总之，我们展示SCUBE2(而非SCUBE1或3)在HUVEC中于低氧下受到HIF-1α调控增加其表达量。SCUBE2的此独特的低氧诱导作用可在后肢局部缺血之后调节血液流动复原实验中观察到。SCUBE2调节血管发生不受限于VEGF的作用。需要其他研究来理清SCUBE2是否参与经由音猬因子(sonic hedgehog)或VE钙黏素信号传导介导的产后血管发生。在此，我们的数据揭示SCUBE2作为新颖VEGFR2辅助受体，其藉由细调节VEGFR2介导的信号传导来调节EC的VEGF诱导的管形成及细胞增殖。SCUBE2可能在各种血管发生相关疾病(诸如动脉粥样硬化、糖尿病性视网膜病及老年性黄斑变性)的发病机制中具有临床重要性。除SCUBE2在正常器官EC中的表达以外，SCUBE2亦高度表达于大量类型的人类癌瘤及异种移植肿瘤的EC中(我们的未公开的数据)。尽管需要其他研究来验证内皮细胞SCUBE2是否涉及肿瘤血管发生，但由于SCUBE2失活的抗血管发生作用，故SCUBE2可应用于癌症疗法的有潜力的目标分子。内皮细胞SCUBE2的药理学阻断为一种可应用于血管发生相关疾病的新颖治疗策略。特征为异常或过度血管发生或由其导致的疾病的实例列于表7中。

表7

本发明的例示性实施例的前述描述仅出于说明及描述的目的而呈现，且不意欲为穷举的或将本发明限制于所揭示的精确形式。根据以上教示，许多修改及变化均是可能的。在本发明的描述中引用及论述一些参考文献，其可包括专利、专利申请案及各种公开案。提供此类参考文献的引用及/或论述仅阐明本发明的描述且不承认任何此类参考文献是本文所述的本发明的“先前技术”。本说明书中引用及论述的所有参考文献均以全文引用的方式并入本文中且其引用程度就如同已个别地将各参考文献以引用的方式并入一般。

Claims

1.一种分离的抗SCUBE2单克隆抗体或抗原结合片段，其包含特异性结合于位于序列为SEQ ID NO：66的SCUBE2内的标靶域的抗原结合区且呈现抑制VEGF诱导的血管发生的特性，其中该标靶域位于SEQ ID NO：66的氨基酸残基位置175至323范围内的EGF样基序4至6，或氨基酸残基位置441至659范围内的间隔区域，或氨基酸残基位置668至725范围内的第一富含半胱氨酸基序，所述的分离的抗SCUBE2单克隆抗体或抗原结合片段包含重链可变域(V_H)及轻链可变域(V_L)，该V_H包含互补决定区V_H CDR1、V_H CDR2以及V_H CDR3，且该V_L包含互补决定区V_L CDR1、V_L CDR2以及V_L CDR3，其中：

(i)该V_H CDR1、V_H CDR2以及V_H CDR3分别为SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：52及SEQ ID NO：53的氨基酸序列；且该V_L CDR1、V_L CDR2以及V_L CDR3分别为SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：55及SEQ ID NO：56的氨基酸序列；或

(ii)该V_H包含含有SEQ ID NO：3的氨基酸序列的CDR1、含有SEQ ID NO：4的氨基酸序列的CDR2及含有SEQ ID NO：5的氨基酸序列的CDR3；且该V_L包含含有SEQ ID NO：6的氨基酸序列的CDR1、含有SEQ ID NO：7的氨基酸序列的CDR2及含有SEQ ID NO：8的氨基酸序列的CDR3；或

(iii)该V_H包含含有SEQ ID NO：35的氨基酸序列的CDR1、含有SEQ ID NO：36的氨基酸序列的CDR2及含有SEQ ID NO：37的氨基酸序列的CDR3；且该V_L包含含有SEQ ID NO：38的氨基酸序列的CDR1、含有SEQ ID NO：39的氨基酸序列的CDR2及含有SEQ ID NO：40的氨基酸序列的CDR3。

2.如权利要求1所述的分离的抗SCUBE2单克隆抗体或抗原结合片段，其中：

(a)该V_H包含SEQ ID NO：49的氨基酸序列，且该V_L包含SEQ ID NO：50的氨基酸序列；或

(b)该V_H包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列，且该V_L包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列；或

(c)该V_H包含SEQ ID NO：33的氨基酸序列，且该V_L包含SEQ ID NO：34的氨基酸序列。

3.如权利要求1所述的分离的抗SCUBE2单克隆抗体或抗原结合片段，其是人源化的。

4.如权利要求1所述的分离的抗SCUBE2单克隆抗体或抗原结合片段，其选自由以下组成的群：Fv片段、抗原结合(Fab)片段、F(ab')₂片段、Fab'片段、Fd'片段及Fd片段及单链抗体可变片段(scFv)。

5.如权利要求1所述的分离的抗SCUBE2单克隆抗体或抗原结合片段，其囊封于脂质体内。

6.一种融合蛋白质，其包含如权利要求1或2所述的分离的抗SCUBE2单克隆抗体或抗原结合片段。

7.一种医药组合物，其包含：

(i)如权利要求1至5中任一项所述的分离的抗SCUBE2单克隆抗体或抗原结合片段或如权利要求6所述的融合蛋白质；及

(ii)贝伐单抗(bevacizumab)。

8.如权利要求7所述的医药组合物，其中该抗SCUBE2单克隆抗体是嵌合抗体。

9.如权利要求7所述的医药组合物，其中该抗SCUBE2单克隆抗体是人源化抗体。

10.如权利要求1至5中任一项所述的分离的抗SCUBE2单克隆抗体或抗原结合片段在制造用于在有需要的个体中治疗与VEGF诱导的血管发生相关的黑素瘤、肺、胰脏、结肠直肠癌及新生血管性眼部疾病的药物中的用途。

11.如权利要求10所述的用途，其中该新生血管性眼部疾病为视网膜病变。

12.如权利要求7至9任一项所述的医药组合物在制造用于在有需要的个体中治疗与VEGF诱导的血管发生相关的黑素瘤、肺、胰脏、结肠直肠癌及新生血管性眼部疾病的药物中的用途。

13.如权利要求12所述的用途，其中该新生血管性眼部疾病为视网膜病变。