CN104450747B

CN104450747B - 用于治疗Leber遗传性视神经病变的重组腺相关病毒‑NADH脱氢酶亚单位4基因全长以及药剂

Info

Publication number: CN104450747B
Application number: CN201410491726.XA
Authority: CN
Inventors: 李斌
Original assignee: Wuhan Niufusi Biological Technology Co Ltd
Current assignee: Wuhan Niufusi Biological Technology Co. Ltd.
Priority date: 2014-09-23
Filing date: 2014-09-23
Publication date: 2018-02-09
Anticipated expiration: 2034-09-23
Also published as: CN104450747A

Abstract

本发明公开了一种用于治疗Leber遗传性视神经病变的重组腺相关病毒‑NADH脱氢酶亚单位4基因全长以及药剂，该基因全长，核苷酸序列SEQ ID NO：1所示，其中，该核苷酸序列全长为3824bp，其由CAG启动子序列、带Cox10的线粒体定位序列的ND4的编码序列和长度为625bp的UTR。将药剂注入眼玻璃体腔中，用于治疗Leber遗传性视神经病变，本发明的药剂注射到玻璃体腔，能够在玻璃体腔内保持活力，并高效转染到视神经细胞，该蛋白N前端的信号肽，定向引导该蛋白进入线粒体，成熟的ND4蛋白进入线粒体发挥作用。因此，药物能有效地治疗Leber遗传性视神经病变。

Description

用于治疗Leber遗传性视神经病变的重组腺相关病毒-NADH脱氢酶亚单位4基因全长以及药剂

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体地指一种用于治疗Leber遗传性视神经病变的重组腺相关病毒-NADH脱氢酶亚单位4基因全长以及药剂。

背景技术

Leber遗传性视神经病变(Leber’s hereditary optic neuropathy，LHON)是由于线粒体基因突变所致的疾病，Leber遗传性视神经病变是世界公认的青少年致盲眼病之一，本病好发于青中年男性，临床表现为双眼同时或先后急性或亚急性无痛性视力减退，同时可伴有中心视野缺损及色觉障碍。

学者已确认有20多个线粒体突变位点导致LHON的发生，包括11778位点、14484位点、3460位点、3490位点等等。其中111778位点突变最常见，占我国LHON的89.2％，且预后最差，很多患者双眼视力在0.1一下，11778位点突变会导致ND4蛋白功能受损，ND4蛋白功能下降可以降低电子流动效率影响酶的活性从而减少视神经细胞ATP的产生，细胞逐渐凋亡，从而导致患者发生LHON。LHON目前尚无方法治疗，随着基因治疗的发展，LHON的基因治疗成为可能，我们前期研究了腺相关病毒-NADH脱氢酶亚单位4(AAV2-ND4)。将ND4导入视神经，代替因为突变而导致受损的ND4蛋白，治疗LHON。但在实践中我们发现：前期研究的这个AAV2-ND4转染效率较低，达不到治疗的目的：由于AAV2-ND4需要注射到眼睛的玻璃体腔内，转染到视神经，但眼睛的玻璃体腔注射量有限，最多能够注射0.1ml,剂量非常小，导致转染到视神经的正常ND4非常少，如果增加AAV-ND4的浓度，会引起机体的免疫反应，反复给药也会因为免疫反应而没有作用。因此最佳办法是提高AAV2-ND4的转染效率。

发明内容

本发明所要解决的技术问题就是提供一种用于治疗Leber遗传性视神经病变的重组NADH脱氢酶亚单位4基因全长以及药剂。

为解决上述技术问题，本发明提供的一种用于治疗Leber遗传性视神经病变的重组NADH脱氢酶亚单位4基因全长，核苷酸序列SEQ ID NO：1所示，其中，该核苷酸序列全长为3824bp，其由CAG启动子序列、带Cox10的线粒体定位序列的ND4的编码序列和长度为625bp的UTR。

本发明还提供了一种含有重组NADH脱氢酶亚单位4基因的腺相关病毒载体，该载体命名为AAV2-CAG-ND4。

其Cox10和长度为625bp的UTR目的是保证AAV2导入的ND4蛋白进入到线粒体内发挥正常的生理作用，在ND4的前后增加两个序列分别是线粒体靶向序列，将它设计在ND4序列的前面，其作用是引导AAV2转染到细胞核的翻译成的ND4蛋白进入线粒体。NO：4是非编码序列，设计在ND4蛋白的后面，其作用是稳定线粒体靶向序列和ND4的表达。此前的非编码序列都是1400个碱基，不便于包装到AAV2，我们将这个序列缩短到625个碱基，既能保证ND4的稳定性，又能提高AAV2-ND4的包装效率，提高出毒率。能够在视网膜视神经节细胞高效表达ND4蛋白。其目的是保证ND4蛋白在视神经高效表达，达到治疗Leber遗传性视神经病变作用。

使用CAG启动子代替普通的CMV启动子，提高了AAV2-CAG-ND4在玻璃体腔的转染效率，达到注射小剂量能治疗Leber遗传性视神经病变的效果，符合眼玻璃体腔注射小量，高效的要求。

其中，NADH脱氢酶亚单位4基因(ND4)序列，以汉人的线粒体基因序列为基础，其在Genebank的序列号是AY963573.2。我们对这个序列进行修改，使新的基因序列在细胞核里编码的ND4蛋白序列与AY963573.2在线粒体内编码的ND4蛋白完全相同。其核苷酸序列SEQID NO：2所示。修改方法如下：

atg cta aaa cta atc gtc cca aca att atg tta cta cca ctg aca tgg ctttcc aaa aaa cac atg att tgg atc aac aca acc acc cac agc cta att att agc atcatc ccc cta cta ttt ttt aac caa atc aac aac aac cta ttt agc tgt tcc cca accttt tcc tcc gac ccc cta aca acc ccc ctc cta atg cta act acc tgg ctc cta cccctc aca atc atg gca

其中注有下划线的碱基为修改的碱基，这样能够保证新的基因序列在细胞核里翻译的ND4蛋白序列与AY963573.2在线粒体内编码的ND4蛋白完全相同

本发明么还提供了一种用于重组NADH脱氢酶亚单位4基因全长的引物对，所述引物对为：

正向引物1F：5’-ATCTCCGCACACTCTCTCCTCA-3’，

反向引物1R：5’-GAGGAAAACCCGGTAATGATGTC-3’。

本发明还提供了一种重组NADH脱氢酶亚单位4基因的获得方法，其特征在于：以具有重组NADH脱氢酶亚单位4基因的腺相关病毒载体全基因组DNA为模板，采用以下引物对：

正向引物1F：5’-ATCTCCGCACACTCTCTCCTCA-3’

反向引物1R：5’-GAGGAAAACCCGGTAATGATGTC-3’

进行PCR扩增，其所获得的重组NADH脱氢酶亚单位4基因为SEQ IDNO.1。

本发明还提供了一种含有重组NADH脱氢酶亚单位4基因的腺相关病毒载体在制备用于治疗Leber遗传性视神经病变的药剂中的应用，其特征在于：将含有命名为AAV2-CAG-ND4载体的药剂注入眼玻璃体腔中，用于治疗Leber遗传性视神经病变

所述药剂中，AAV2-CAG-ND4含量：有效量控制在每一毫升药剂中含有1011的AAV2-CAG-ND4，其中，所述药剂还包括辅料，其中，α,α-海藻糖二水合物含量为0.5～1.5％、盐酸组氨酸一水合物含量为0.05～0.2％；聚山梨醇酯20含量为0.5～2％。

本发明的有益效果在于：

本发明解决了四个难题：

1)本发明中AAV2-CAG-ND4能有效的转染到线粒体，且细胞核里编码的ND4氨基酸序列与线粒体里的ND4氨基酸序列完全相同，得到正常的ND4蛋白；

2)本发明中编码的ND4蛋白能进入到线粒体里发挥作用；用于治疗Leber遗传性视神经病变

3)含有AAV2-CAG-ND4载体注入眼玻璃体腔中，CAG启动子的有效提高ND4表达量；提高治疗效果。

4)本发明的药剂中的辅料，提供了一个适应玻璃体腔的微环境，有效保证药剂在玻璃体腔中不降低药效。

5)本发明的药剂(含有AAV2-CAG-ND4)注射到玻璃体腔，能够在玻璃体腔内保持活力，并高效转染到视神经细胞，该蛋白N前端的信号肽，定向引导该蛋白进入线粒体，成熟的ND4蛋白进入线粒体发挥作用。因此，通过构建AAV2-CAG-ND4，制备玻璃体腔注射的药物，用于治疗Leber遗传性视神经病变，能有效地治疗Leber遗传性视神经病变。

附图说明

图1为重组腺相关病毒中的ND4目的基因；

图2为ND4蛋白电泳图；

图3为PCR检测重组腺相关病毒中的ND4目的基因；

图3中，M：Maker，1：目的片段，2：阳性对照，3：阴性对照；

图4为AAV2-CAG-ND4的滴度测定结果；

图5为细胞转染AAV2-CAG-ND4荧光照相的结果；

图5中，A为AAV2-ND4组，B为AAV2-CAG-ND4组；

图6为视网膜免疫荧光的结果显示图；

图6中，A，B,C,D为AAV2-CAG-ND4组，E,F,G,H为AAV2-ND4组；其中A为细胞核染色，B为线粒体染色，C为ND4染色,D为合成图，E为细胞核染色，F为线粒体染色，G为ND4染色,H为合成图。

图7为Western blot检测ND4蛋白在鼠视网膜的表达。

图8为Western blot检测含有辅料的AAV2-CAG-ND4与普通的AAV2-CAG-ND4在鼠视网膜的ND4蛋白表达比较

具体实施方式

为了更好地解释本发明，以下结合具体实施例进一步阐明本发明的主要内容，但本发明的内容不仅仅局限于以下实施例。

实施例1：

一、试验材料

表1

二、实验步骤

本发明重组人的NADH脱氢酶亚单位4(ND4)的基因全长序列是根据genbank数据库提供的ND4基因序列和cox10基因序列进行重新设计而成。本发明的基因序列分三部分设计而成(图1)。第一部分包括CAG启动子，第二部分为带cox10的线粒体定位序列的ND4的编码序列。第三部分为cox10的3’非编码区(Untranslated Regions UTR)。我们缩减3’非编码区长625bp。

重组人NADH脱氢酶亚单位4基因的重组应用腺相关病毒载体的构建方法，其步骤包括：

(一)含有人NADH脱氢酶亚单位4基因重组腺相关病毒载体的构建

将权利要求1所述重组人NADH脱氢酶亚单位4基因SEQ ID NO：1加Kpn I和Sal I两个酶切位点或者将以该新基因设计引物用PCR扩增的产物与pSNaV质粒载体，分别进行KpnI和Sal I双酶切，回收酶切产物，T4DNA Ligase连接过夜，连接产物转化感受态细胞得到重组pSNaV/ND4，电泳可见ND4表达(图2)。

(二)AAV2-CAG-ND4重组腺相关病毒包被

1)转染前一天，将293T细胞接种于225cm²细胞培养瓶中，接种密度3.0×10⁷个/mL细胞，培养基为DMEM+10％牛血清，置37℃含5％CO₂的培养箱中培养过夜。

2)转染当天换液，用新鲜的含10％牛血清的DMEM培养基继续培养。待细胞生长至80～90％时，弃去培养基，用PlasmidTrans II(VGTC)转染试剂盒进行转染。具体步骤为：

(a)每个转染瓶取pAdHelper、pAAV-r2c5、pSNaV-ND4质粒按要求比例与DMEM+PlasmidTrans II(VGTC)(转染试剂)在1.5mL无菌Ep管中混匀，编号为A试剂，室温静止10～15min；

(b)将A试剂同30mL DMEM+10％牛血清混合均匀，编号为B试剂；

(c)将B试剂均匀加入细胞培养瓶中，37℃含5％的CO₂的培养箱中继续培养；

(d)转染16h后，换DMEM+10％牛血清完全培养基；

3)转染48h后，收取细胞。

4)将收取细胞用PBS重悬，并反复冻融3次。

(三)AAV2-CAG-ND4病毒的纯化与浓缩

采用氯仿处理-PEG/NaCl沉淀-氯仿抽提三步来分离、浓缩和纯化AAV2-ND4病毒。总回收率＝终产物的病毒颗粒数/起始物的病毒颗粒数。灌制SDS-PAGE分离胶和积层胶,分离胶浓度为10％。

(四)AAV2-CAG-ND4的目的基因的PCR鉴定

1)取10uL重组AAV2-ND4载体病毒样品，煮沸5min，冰浴，取1uL作为模板，

所述特异性引物为：

正向引物1F：5’-ATCTCCGCACACTCTCTCCTCA-3’

反向引物1R：5’-GAGGAAAACCCGGTAATGATGTC-3’

反应体系：

PCR扩增程序：

2)PCR产物回收

对PCR产物电泳检测(图3)，得到一个大小约2800bp左右的目的条带。对目的条带回收，具体的回收步骤依照TIANGEN公司的凝胶回收试剂盒说明书。

3)扩增产物的连接与转化反应

连接反应使用TaKaRa公司的pMD18-T Vector

混匀后瞬时离心，将管壁上的液滴收集到管底，16℃连接12小时。

连接产物转化：

A取连接产物5.0μL加入100μL DH-5α中，冰浴30min。

B 42℃热激30秒，立即放回冰浴中。2min后加入800μL LB液体培养基(无抗生素)，

C 37℃，200rpm，摇动培养1h。

D取200μL转化菌均匀涂布于含50ug/mL氨苄青霉素的LB固体培养基上，37℃培养16h，观察平板上细菌的生长情况。

4)重组子的筛选及鉴定

蓝白斑筛选：取37℃培养后的LB平板，出现蓝斑和白斑，其中白色为重组克隆。挑取白色的菌落加入到含有Amp 100mg/L的LB液体培养基中，37℃，200rpm培养8h。培养好后取菌液,提取质粒，质粒提取步骤参照Biomiga说明书，使用EcoRⅠ和HindⅢ酶切鉴定。

5)菌液保存及cDNA片段测序

吸取1mL经过鉴定的菌液与灭菌后的的甘油1∶3比例混匀,于-72℃保存，菌液测序在华大基因完成，将测序得到的序列与重组人NADH脱氢酶亚单位4基因比对分析，成功得到序列正确的重组腺相关病毒质粒pSNaV/AAV2-CAG-ND4。

(五)、AAV2-CAG-ND4的滴度测定

用地高辛标记的H1探针点杂交方法检测病毒液中AAV2-CAG-ND4的物理滴度。将质粒pSNAV-ND4准确定量，用稀释缓冲液以一系列稀释度稀释后点到尼龙膜上；待测的病毒液AAV2-CAG-ND4样品用DNase I和RNase于37℃消化1h。提取AAV2-CAG-ND4病毒基因组,沸水浴5min变性之后置于冰浴中。用试剂盒提供的稀释缓冲液以一定比列做系列稀释后点膜。预杂交、杂交、洗膜、显色按Boehringer Mannheim公司试剂盒说明书进行。通过计算pSNAV-ND4的拷贝数、再乘以与其杂交信号强度一致的病毒液样品的稀释倍数而得出AAV2-CAG-ND4的物理滴度(图4)，其基因组滴度为4.0×10¹¹vg/mL。

实施例2：AAV2-CAG-ND4重组腺相关病毒对Leber遗传性视神经病变的效果实验

1.体外实验观察AAV-CAG-ND4的表达

体外培养293细胞，分两组，分别转染AAV2-ND4和AAV2-CAG-ND4，免疫荧光观察ND4的表达，结果显示AAV2-CAG-ND4组的ND4表达高于AAV2-ND4组，差异有显著性(P＝0.001；图5)。

2.鼠眼玻璃体腔注射

取24只小鼠分为两组，分为实验组和对照组分别用0.1％的AAV2-ND4和0.1％AAV2-CAG-ND4在距角膜缘外穿刺睫状体平坦部进入玻璃体腔内，进行玻璃体腔注射。

3、裂隙灯、眼压、眼底照相检查

两组鼠分别于术后1、3、7、30天进行裂隙灯，眼压的检查。所有小鼠均无明显异常，无结膜充血、分泌物，无眼内炎，眼压均无升高。术后一个月的眼底照相显示，所有小鼠的视网膜血管和视神经均无明显并发症或损害。表明正规标准的玻璃体腔注射不会发生明显的炎症反应或其他并发症。

4、ND4的免疫荧光检测

玻璃体腔注射30天后，视网膜抗ND4的免疫荧光结果显示，实验组(A)和对照组(B)的荧光强度分别为92.5±5.8和30.4±4.6。表明实验组视网膜上ND4的表达明显比对照组提高(P＝0.003；图6)

5、Western blot检测ND4蛋白的表达

蛋白质印迹实验组和对照组分别为0.27±0.05和0.11±0.01，表明实验组视网膜上ND4的表达明显比对照组提高(P＝0.001；图7)。

6、real-time PCR检测ND4的表达

首先用NCBI的保守结构域分析软件分析ND4的保守结构，确保所设计引物的扩增片段位于非保守区；然后根据荧光定量PCR的引物设计原则，用primer premier 5设计引物：

鼠-actin-S：CGAGATCGTGCGGGACAT

鼠-actin-A：CAGGAAGGAGGGCTGGAAC

H-ND4-S：ctgcctacgacaaacagac

H-ND4-A：agtgcgttcgtagtttgag

6.1提取RNA、反转录

利用TRIZOL试剂盒提取小鼠的总RNA并反转录合成cDNA模板。

6.2荧光定量PCR的反应体系和反应程序

在Real-time PCR Detection System仪器上进行荧光定量PCR。在0.2mL的PCR反应管中加入SYBR Green mix12.5μL、ddH₂O 8μL、一对引物各1μL，cDNA样品2.5μL，总体系25μL。每个样品既要用于扩增目的基因又要扩增内参基因鼠-actin，各个基因的扩增都做三个重复。实际加样时，为减小误差，各PCR反应管中共有的试剂可加在一起然后分装。加样完毕，进行荧光定量PCR。

按照95℃预变性1s，94℃变性15s，55℃退火15s，72℃延伸45s，共40个循环的反应程序进行扩增，并于每个循环的延伸阶段采集荧光信号。反应结束后做94℃～55℃的融解曲线分析。

采用2-△△CT相对定量方法(Livak et al.2001)研究基因表达量的差异，该方法无需制作标准曲线，以看家基因鼠-actin为内参基因，仪器自带的分析软件即可自动生成表达数值，实验组和对照组分别为0.64±0.10和0.27±0.03，表明实验组视网膜上ND4的表达明显比对照组提高(P＝0.003)。

7、Western blot比较含有辅料的AAV-CAG-ND4药剂与普通的AAV-CAG-ND4注射到鼠玻璃体腔后，ND4蛋白的表达

药剂组成：水、主药(AAV-CAG-ND4)、副药(α,α-海藻糖二水合物、盐酸组氨酸一水合物含量、聚山梨醇酯20)

蛋白质印迹含有辅料的AAV-CAG-ND4组和普通的AAV-CAG-ND4组分别为0.77±0.09和0.38±0.05，表明含有辅料的AAV-CAG-ND4视网膜上ND4的表达明显提高(P＝0.001；图8)。

免疫荧光、实时定量PCR和Western blot的结果证明ND4能被稳定地表达在小鼠的视网膜上。ND4的荧光染色结果在视网膜神经节细胞中，表明AAV-CAG-ND4能到达病人眼中病变的区域,并能高效表达。因为LHON的病变主要发生在视盘周围的的视网膜神经节细胞，AAV-CAG-ND4组的视网膜切片显示转导能被稳定地表达在视盘周围的视网膜上，转染效率远远高于我们原先构建的AAV-ND4，能够达到临床治疗的要求。

其它未详细说明的部分均为现有技术。尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims

1.一种用于治疗Leber遗传性视神经病变的重组NADH脱氢酶亚单位4基因全长，核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示，其中，该核苷酸序列全长为3824bp，其由CAG启动子序列、带Cox10的线粒体定位序列的ND4的编码序列和长度为625bp的UTR构成。

2.含有权利要求1所述重组NADH脱氢酶亚单位4基因全长的腺相关病毒载体，该载体命名为AAV2-CAG-ND4。

3.一种权利要求1所述重组NADH脱氢酶亚单位4基因全长的获得方法，其特征在于：以具有重组NADH脱氢酶亚单位4基因的腺相关病毒载体全基因组DNA为模板，采用以下引物对：

正向引物1F:5’-ATCTCCGCACACTCTCTCCTCA-3’

反向引物1R:5’-GAGGAAAACCCGGTAATGATGTC-3’

进行PCR扩增，其所获得的重组NADH脱氢酶亚单位4基因全长为SEQ ID NO.1。

4.一种权利要求2所述的载体在制备用于治疗Leber遗传性视神经病变的药剂中的应用，其特征在于：将含有AAV2-CAG-ND4的药剂注入眼玻璃体腔中，用于治疗Leber遗传性视神经病变；所述药剂中，AAV2-CAG-ND4含量：有效量控制在每一毫升药剂中含有10¹¹vg的AAV2-CAG-ND4，其中，所述药剂还包括辅料，其中，α,α-海藻糖二水合物含量为0.5～1.5％、盐酸组氨酸一水合物含量为0.05～0.2％；聚山梨醇酯20含量为0.5～2％。