BR112021002566A2 - sequência gênica da gtpase tipo dineína mitocondrial tipo ii humana recombinante e seus usos - Google Patents

Abstract

Uma sequência gênica da GTPase tipo dineína mitocondrial tipo II humana recombinante com uma sequência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO: 1 e seus usos. Um ácido nucleico de fusão que compreende um ácido nucleico que codifica GTPase tipo dineína mitocondrial tipo II humana. Um vetor de expressão recombinante que compreende o ácido nucleico ou um ácido nucleico de fusão. Um transformante por meio do qual o ácido nucleico ou o ácido nucleico de fusão é introduzido em um hospedeiro. Um modelo de ADOA de mamífero não humano baseado na inativação do gene da GTPase tipo dineína mitocondrial tipo II, que pode melhorar efetivamente as manifestações patológicas de ADOA usando um vetor de expressão recombinante que codifica a GTPase tipo dineína mitocondrial tipo II humana. O nível de expressão do ácido nucleico que codifica a GTPase tipo dineína mitocondrial tipo II humana é mais alto, portanto, mais GTPase tipo dineína mitocondrial tipo II humana pode ser obtida na mitocôndria, que pode tratar melhor doenças oculares como ADOA.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para “SEQUÊN-

CIA GÊNICA DA GTPASE TIPO DINEÍNA MITOCONDRIAL TIPO II HUMANA RECOMBINANTE E SEUS USOS”. Campo

[0001] A invenção se refere ao campo das preparações biológicas, particularmente à sequência gênica de GTPase tipo dineína mitocon- drial tipo II humana recombinante e usos desta. Fundamentos

[0002] A atrofia óptica autossômica dominante (ADOA) é a forma mais comum de neuropatia óptica hereditária primária, com uma razão de incidência de cerca de 1:12.000 a 1:50.000 e sua aparição é insidiosa na infância. Suas características clínicas são manifestadas por perda gradual leve a moderada da visão, deficiências na visão de cores, de- feitos no campo visual central e palidez do disco óptico temporal. Pri- meiramente, os feixes vasculares papilares são lesionados, seguido pela atrofia ascendente dos nervos ópticos e da perda das bainhas de mielina dos nervos ópticos.

[0003] A ADOA é causada por mutações em genes que codificam proteínas e loci da membrana mitocondrial interna e estudiosos estran- geiros determinaram que esses genes são principalmente OPA1-OPA8; entre eles, foi inicialmente confirmado que cerca de 75% dos pacientes com ADOA estão relacionados a mutações heterozigóticas e dominan- tes carregadas por OPA1, nas quais as mutações de sítio nos exons 740 e 2794 são as mais comuns. As proteínas OPA1 localizam-se nas membranas mitocondriais internas, controlam o metabolismo energético e a apoptose, mantêm a integridade das cristas e do mtDNA e têm ati- vidades de GTPase. A patogênese da ADOA reside no fato de que o OPA1 mutante codifica uma variedade de formas truncadas de proteí- nas que geralmente carecem de domínios GTPase completos, o que é equivalente à deleção de um alelo, o que reduzirá muito a quantidade de OPA1, resultando em uma chamada insuficiência de haplótipo, as- sim, as funções mitocondriais são prejudicadas. Mitocôndrias fragmen- tadas não podem suprir ATP normalmente para as células do nervo óp- tico e as células RGC gradualmente passam por apoptose, o que leva à ocorrência de ADOA em pacientes.

[0004] Atualmente, não há meios de tratamento para ADOA e ela é uma das neuropatias ópticas hereditárias reconhecidas pelo mundo. Com o desenvolvimento da terapia gênica, a terapia gênica de ADOA tornou-se possível e as dificuldades nisso são as várias formas de spli- cing do exon OPA1 e várias formas de mutações, que causam uma va- riedade de tipos e formas de mutação de proteínas patogênicas, resul- tando em ser impossível usar uma certa droga gênica para tratar todos os pacientes.

[0005] Em estudos estrangeiros, as pessoas estudaram a patogê- nese de ADOA causada por mutações OPA1, analisaram as várias for- mas de transcrição de OPA1 e produtos gênicos e exploraram os me- lhores métodos de purificação para proteínas OPA1 recombinantes. Além disso, históricos médicos familiares foram investigados e analisa- dos para buscar como triar, identificar e diagnosticar se um OPA1 defei- tuoso é carregado. Ademais, o diagnóstico genético prognóstico e o tra- tamento de ADOA causado por mutações OPA1 também eram espera- dos. No entanto, não há atualmente nenhum relato de recombinação de genes de qualquer tipo de GTPases tipo dineína mitocondrial humana usando vetores de vírus adeno-associados, bem como da produção e dos usos destes.

[0006] Portanto, há uma necessidade urgente neste campo de de- senvolver um sistema de expressão e método de preparação para uma GTPase tipo dineína mitocondrial humana que tenha bons efeitos tera- pêuticos. Resumo

[0007] A finalidade da presente invenção é fornecer um sistema de expressão para uma GTPase tipo dineína mitocondrial humana que te- nha bons efeitos terapêuticos e um método de preparação deste.

[0008] A finalidade da presente invenção é fornecer uma sequência de ácido nucleico otimizada para codificar uma GTPase tipo dineína mi- tocondrial humana, um vetor e um método de preparação destes.

[0009] O primeiro aspecto da presente invenção fornece uma se- quência de nucleotídeos que codifica uma GTPase tipo dineína mito- condrial tipo II humana e a sequência de nucleotídeos é selecionada do grupo que consiste em: (a) uma sequência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO: 1; e (b) uma sequência de nucleotídeos que é ≥95%, preferencialmente ≥98% e, mais preferencialmente, ≥99% idêntica à sequência de nucleo- tídeos mostrada em SEQ ID NO: 1.

[0010] Em outra modalidade preferencial, a sequência de nucleotí- deos inclui uma sequência de DNA, uma sequência de cDNA ou uma sequência de mRNA.

[0011] Em outra modalidade preferencial, a sequência de nucleotí- deos inclui uma sequência de fita simples e uma sequência de fita dupla.

[0012] Em outra modalidade preferencial, a sequência de nucleotí- deos inclui uma sequência de nucleotídeos que é completamente com- plementar à SEQ ID NO: 1.

[0013] Em outra modalidade preferencial, a sequência de nucleotí- deos é mostrada em SEQ ID NO: 1, em que as posições 1-288 são a sequência de codificação de MIS; as posições 289-2772 são as sequências de codificação de um domínio GTPase, um domínio dineína central e um domínio efetor GTPase; e as posições 2773-2775 são um códon de parada.

[0014] Em outra modalidade preferencial, a sequência de SEQ ID NO: 1 compreende: sequência de codificação MIS como mostrado nas posições 1-288 em SEQ ID NO: 1; e a sequência de codificação do do- mínio GTPase, do domínio dineína central e do domínio efetor GTPase como mostrado nas posições 289-2772 em SEQ ID NO: 1.

[0015] Em outra modalidade preferencial, a sequência de SEQ ID NO: 2 compreende: sequência de codificação MIS como mostrado nas posições 1-288 em SEQ ID NO: 2; e a sequência de codificação do do- mínio GTPase, do domínio dineína central e do domínio efetor GTPase como mostrado nas posições 289-2772 em SEQ ID NO: 2. A presente invenção também fornece a sequência de nucleotídeos (posições 1-288 em SEQ ID No: 1 ou 2) que codifica separadamente a MIS e as sequên- cias de nucleotídeos (posições 289-2772 ou 289-2775 em SEQ ID No: 1 ou 2) que codificam separadamente o domínio GTPase, o domínio dineína central e o domínio efetor GTPase.

[0016] O segundo aspecto da presente invenção fornece um ácido nucleico de fusão que compreende a sequência de nucleotídeos como descrito no primeiro aspecto da presente invenção.

[0017] Em outra modalidade preferencial, o ácido nucleico de fusão compreende adicionalmente uma sequência selecionada do grupo que consiste em uma sequência UTR, uma sequência promotora ou uma combinação destas.

[0018] Em outra modalidade preferencial, a sequência UTR inclui uma 3'-UTR e/ou uma 5'-UTR.

[0019] Em outra modalidade preferencial, a sequência UTR contém uma sequência poliA para estabilizar a estrutura.

[0020] Em outra modalidade preferencial, o ácido nucleico de fusão tem uma estrutura de fórmula I a partir da extremidade 5' até a extremi- dade 3': Z1-Z2-Z3 (I) em que cada "-" é independentemente uma ligação ou uma sequência de ligante de nucleotídeos; Z1 é nulo ou uma sequência 5'-UTR; Z2 é a sequência de nucleotídeos como descrito no primeiro aspecto da presente invenção; e Z3 é uma sequência 3'-UTR.

[0021] Em outra modalidade preferencial, o Z1 é uma sequência 5'- UTR.

[0022] Em outra modalidade preferencial, o comprimento de cada sequência de ligante de nucleotídeos é de 1-30 nt, preferencialmente 1- 15 nt e mais preferencialmente 3-6 nt.

[0023] Em outra modalidade preferencial, a sequência de ligante de nucleotídeos é derivada a partir de uma sequência de ligante de nucle- otídeos formada por digestão por meio de uma endonuclease de restri- ção.

[0024] O terceiro aspecto da presente invenção fornece um vetor que contém a sequência de nucleotídeos de acordo com o primeiro as- pecto da presente invenção ou o ácido nucleico de fusão de acordo com o segundo aspecto da presente invenção.

[0025] Em outra modalidade preferencial, o vetor compreende um ou mais promotores, que estão operacionalmente ligados à sequência de ácido nucleico, um potencializador, um sinal de terminação de trans- crição, uma sequência de poliadenilação, uma origem de replicação, um marcador selecionável, um sítio de restrição de ácido nucleico e/ou um sítio de recombinação homóloga.

[0026] Em outra modalidade preferencial, o vetor é selecionado do grupo que consiste em um plasmídeo e um vetor viral.

[0027] Em outra modalidade preferencial, o vetor é selecionado do grupo que consiste em um vetor de lentivírus, um vetor de adenovírus, um vetor de vírus adeno-associado ou uma combinação destes. Prefe- rencialmente, o vetor é um vetor AAV.

[0028] Em outra modalidade preferencial, os serotipos do vetor AAV são selecionados entre AAV2, AAV5, AAV7, AAV8 ou uma combinação destes.

[0029] Em outra modalidade preferencial, o vetor inclui um vírus de DNA e um vetor retroviral.

[0030] Em outra modalidade preferencial, o vetor é um vetor AAV que contém ou está inserido com a sequência de nucleotídeos descrita no primeiro aspecto da presente invenção ou o ácido nucleico de fusão descrito no segundo aspecto da presente invenção; preferencialmente, o vetor é um vetor AAV plasmídeo pSNaV.

[0031] Em outra modalidade preferencial, o vetor é usado para ex- pressar a GTPase tipo dineína mitocondrial tipo II humana recombi- nante.

[0032] O quarto aspecto da presente invenção fornece uma célula hospedeira, a referida célula hospedeira contém o vetor descrito no ter- ceiro aspecto da presente invenção ou a célula hospedeira tem a se- quência de nucleotídeos descrita no primeiro aspecto da presente in- venção ou o ácido nucleico de fusão descrito no segundo aspecto da presente invenção que é integrado de forma exógena em seu cromos- somo.

[0033] Em outra modalidade preferencial, a célula hospedeira é uma célula de mamífero e o mamífero inclui um mamífero humano e um não humano.

[0034] Em outra modalidade preferencial, a célula hospedeira é se- lecionada do grupo que consiste em uma célula 293T, uma célula fotor- receptora (incluindo uma célula cone e/ou uma célula bastonete), outras células visuais (como uma célula bipolar), uma célula do nervo (óptico) ou uma combinação destas.

[0035] Em outra modalidade preferencial, a célula hospedeira é se- lecionada do grupo que consiste em uma célula bastonete, uma célula cone, uma célula bipolar on, uma célula bipolar off, uma célula horizon- tal, uma célula ganglionar, uma célula amácrina ou uma combinação destas. Preferencialmente, a célula hospedeira é uma célula ganglionar (da retina).

[0036] O quinto aspecto da presente invenção fornece o uso do ve- tor descrito no terceiro aspecto da presente invenção na preparação de uma preparação ou composição para restaurar a visão e/ou tratar doen- ças oculares em um indivíduo.

[0037] Em outra modalidade preferencial, a doença ocular é retino- patia.

[0038] Em outra modalidade preferencial, a preparação ou a com- posição é usada para tratar neuropatia óptica hereditária, preferencial- mente atrofia óptica autossômica dominante (ADOA).

[0039] Em outra modalidade preferencial, a preparação ou a com- posição é usada para tratar apoptose das células ganglionares da retina.

[0040] O sexto aspecto da presente invenção fornece uma prepara- ção farmacêutica que contém (a) o vetor descrito no terceiro aspecto da presente invenção e (b) um carreador ou excipiente farmaceuticamente aceitável.

[0041] Em outra modalidade preferencial, a forma de dosagem da preparação farmacêutica é selecionada do grupo que consiste em uma preparação liofilizada, uma preparação líquida ou uma combinação des- tas.

[0042] Em outra modalidade preferencial, o vetor é selecionado do grupo que consiste em um vetor de lentivírus, um vetor de adenovírus, um vetor de vírus adeno-associado ou uma combinação destes. Prefe- rencialmente, o vetor é um vetor AAV.

[0043] Em outra modalidade preferencial, o conteúdo do vetor na preparação farmacêutica é de 1 x 109-1 x 1016, preferencialmente 1 x

101-1 x 1013 vírus/mL e mais preferencialmente 2 x 1011-1 x 1012 ví- rus/mL.

[0044] Em outra modalidade preferencial, a preparação farmacêu- tica é usada para tratar doenças oculares, preferencialmente para tratar apoptose de células ganglionares da retina.

[0045] Em outra modalidade preferencial, a preparação farmacêu- tica é usada para tratar neuropatia óptica hereditária, preferencialmente atrofia óptica autossômica dominante (ADOA).

[0046] Em outra modalidade preferencial, a preparação farmacêu- tica pode aumentar significativamente a expressão e/ou atividade da GTPase tipo dineína mitocondrial no globo ocular.

[0047] O sétimo aspecto da presente invenção fornece um método para aumentar a expressão e/ou atividade de uma GTPase tipo dineína mitocondrial por um longo tempo, em que o método compreende intro- duzir o vetor descrito no terceiro aspecto da presente invenção e/ou ad- ministrar a preparação farmacêutica descrita no sexto aspecto da pre- sente invenção.

[0048] Em outra modalidade preferencial, o método pode aumentar efetivamente o conteúdo de ATP produzido em uma célula e/ou inibir a apoptose mitocondrial.

[0049] Em outra modalidade preferencial, o método pode continua- mente regular para cima a expressão e/ou atividade de GTPases.

[0050] O oitavo aspecto da presente invenção fornece um método de tratamento, que compreende administrar o vetor descrito no terceiro aspecto da presente invenção a um indivíduo que necessita deste.

[0051] Em outra modalidade preferencial, o vetor é selecionado do grupo que consiste em um vetor de lentivírus, um vetor de adenovírus, um vetor de vírus adeno-associado ou uma combinação destes. Prefe- rencialmente, o vetor é um vetor AAV.

[0052] Em outra modalidade preferencial, o vetor é introduzido no olho de um indivíduo que necessita deste.

[0053] Em outra modalidade preferencial, o indivíduo que necessita deste inclui um mamífero humano e um não humano.

[0054] Em outra modalidade preferencial, o método de tratamento é um método para tratar doenças oculares.

[0055] Em outra modalidade preferencial, a doença ocular é neuro- patia óptica hereditária, preferencialmente atrofia óptica autossômica dominante (ADOA).

[0056] O método de tratamento pode aumentar efetivamente a ex- pressão e/ou atividade da GTPase tipo dineína mitocondrial no globo ocular.

[0057] O método de tratamento pode aumentar efetivamente a ex- pressão e/ou atividade da GTPase tipo dineína mitocondrial no globo ocular por até 6 meses, preferencialmente até 3 meses.

[0058] O método de tratamento pode aumentar efetivamente o con- teúdo de ATP da retina e/ou inibir apoptose mitocondrial.

[0059] O nono aspecto da presente invenção fornece um método para preparar uma GTPase tipo dineína mitocondrial tipo II humana re- combinante, que compreende cultivar a célula hospedeira descrita no quarto aspecto da presente invenção, obtendo assim a GTPase tipo di- neína mitocondrial tipo II humana recombinante.

[0060] O décimo aspecto da presente invenção fornece um modelo celular de ADOA (atrofia óptica autossômica dominante) em que a ex- pressão ou viabilidade do gene OPA1 é diminuída.

[0061] Em outra modalidade preferencial, a célula inclui uma célula ganglionar da retina (RGC).

[0062] Em outra modalidade preferencial, o gene OPA1 não é ex- presso ou está completamente inativo.

[0063] O décimo primeiro aspecto da presente invenção fornece um método para preparar um modelo celular de ADOA (atrofia óptica autos- sômica dominante), que compreende fornecer uma célula e realizar uma mutação pontual no gene OPA1 nas células para obter as células que têm a mutação pontual do gene OPA1; e obter células monoclonais que tenham uma mutação pontual positiva através de triagem.

[0064] Em outra modalidade preferencial, a mutação pontual do gene OPA1 refere-se a uma mutação pontual Q (glutamina) 285Stop.

[0065] Em outra modalidade preferencial, a célula inclui uma célula RGC.

[0066] O décimo segundo aspecto da presente invenção fornece um modelo de mamífero não humano de ADOA (atrofia óptica autossô- mica dominante) em que a expressão e/ou viabilidade do gene OPA1 em células GRC é reduzida.

[0067] Em outra modalidade preferencial, o gene OPA1 tem uma mutação pontual, especificamente, uma mutação pontual Q (glutamina) 285 Stop.

[0068] O décimo terceiro aspecto da presente invenção fornece um método para preparar um modelo de mamífero não humano de ADOA (atrofia óptica autossômica dominante), que compreende as seguintes etapas: (a) fornecer uma célula de mamífero não humano, realizando uma mu- tação pontual no gene OPA1 nas células, obtendo assim as células que têm a mutação pontual do gene OPA1; (b) preparar um modelo animal que tenha a mutação pontual do gene OPA1 usando as células que têm a mutação pontual do gene OPA1 obtido na etapa (a).

[0069] Em outra modalidade preferencial, a mutação pontual do gene OPA1 é heterozigótica ou homozigótica.

[0070] Em outra modalidade preferencial, o sítio de glutamina na posição 285 da proteína OPA1 é mutado para terminação de transcri- ção.

[0071] Em outra modalidade preferencial, o mamífero não humano é um roedor ou um primata, preferencialmente incluindo um camun- dongo, um rato, um coelho e um macaco.

[0072] Em outra modalidade preferencial, a etapa (b) inclui a etapa de: (b1) preparar um modelo animal que obteve uma mutação pontual qui- mérica do gene OPA1 e então obter um modelo animal que tenha mu- tação pontual homozigótica ou heterozigótica do gene OPA1 através de cruzamento;

[0073] Em outra modalidade preferencial, o método compreende: (1) construir um plasmídeo recombinante que tenha uma mutação de Q (glutamina) na posição 285 de OPA1 em uma mutação pontual de pa- rada (isto é, Q285 Stop) usando tecnologia CRISPR-CAS9 e substi- tuindo por uma sequência de DNA que tenha um marcador selecionável para mutação homóloga para obter uma célula-tronco embrionária mo- noclonal que tenha uma mutação pontual positiva Q285 Stop de OPA1; (2) preparar e obter camundongos quiméricos usando o clone de célu- las-tronco embrionárias de camundongo que tenham mutação pontual OPA1 obtidas na etapa (1); (3) permitir que os camundongos quiméricos obtidos na etapa (2) se acasalem com camundongos de tipo selvagem normais e procriem e triar camundongos heterozigóticos da prole que obtiveram mutação pontual OPA1, isto é, o modelo de camundongo que tem mutação pon- tual Q285 Stop de OPA1.

[0074] Em outra modalidade preferencial, permite-se que os camun- dongos heterozigóticos passem por acasalamento e procriação e os ca- mundongos homozigóticos que obtiveram mutação pontual OPA1 são triados de sua prole.

[0075] Deve ser entendido que todas as várias características téc- nicas descritas acima e as várias características técnicas especifica- mente descritas doravante (tais como exemplos) podem ser combina- das umas com as outras dentro do escopo da presente invenção, de modo a formar soluções técnicas novas ou preferenciais. Devido a limi- tações de espaço, elas não serão repetidas aqui. Descrição das Figuras

[0076] A Fig. 1 mostra a comparação de sequências de quadro de leitura aberta entre a sequência de nucleotídeos otimizada e a sequên- cia gênica original da GTPase tipo dineína mitocondrial tipo II humana. A homologia entre as duas sequências é de 72,25% (2005/2775), entre as quais as bases idênticas são indicadas por "|", a linha superior é a sequência de nucleotídeos de quadro de leitura aberta otimizada e a linha inferior é a sequência gênica original da GTPase tipo dineína mi- tocondrial tipo II humana (sequência de codificação selvagem não oti- mizada).

[0077] A Fig. 2 mostra o diagrama esquemático da estrutura da pro- teína do transcrito da isoforma 2 de OPA1.

[0078] A Fig. 3 mostra o clone correto com uma banda alvo de cerca de 3000 bp triada dos clones recombinantes, M: marcador de proteína; pista 1: clone recombinante correto da isoforma 2 de rAAV2/2-hOPA1; pista 2: controle positivo; pista 3: controle negativo.

[0079] A Fig. 4 mostra o diagrama esquemático da estrutura do plasmídeo de vírus adeno-associado recombinante pSNaV/rAAV2/2- hOPA1.

[0080] A Fig. 5 mostra os resultados da coloração Coomassie Brilli- ant Blue para detectar a pureza da isoforma 2 de rAAV2/2-hOPA1 por electroforese SDS-PAGE. Entre eles, pista 1: marcador de proteína; pista 2: isoforma 2 de rAAV2/2-hOPA1.

[0081] A Fig. 6 mostra as fotografias de fundo de olho de coelho sob lente de vitrectomia, em que A é o grupo injetado com rAAV2/2-ZsGreen (grupo controle) e B é o grupo injetado com a isoforma 2 de hOPA1 otimizada para rAAV2/2 (grupo experimental A).

[0082] A Fig. 7 mostra a detecção de imunofluorescência de fatias do globo ocular de coelho, em que o grupo experimental A é o grupo injetado com a isoforma 2 de hOPA1 otimizada para rAAV2/2 e o grupo experimental B é o grupo injetado com a isoforma 2 de hOPA1 original de rAAV2/2.

[0083] A Fig. 8 mostra as fotografias de OCT do olho de coelho sob lentes de vitrectomia. Entre eles, A é o grupo injetado com rAAV2/2- ZsGreen (grupo controle), e B é o grupo injetado com a isoforma 2 de hOPA1 otimizada para rAAV2/2 (grupo experimental A).

[0084] A Fig. 9 mostra a retina em uma fatia HE do globo ocular de coelho observada em um microscópio. Entre eles, A é o grupo injetado com rAAV2/2-ZsGreen (grupo controle), e B é o grupo injetado com a isoforma 2 de hOPA1 otimizada para rAAV2/2 (grupo experimental A).

[0085] A Fig. 10 mostra os resultados de detecção por PCR fluores- cente em tempo real para as quantidades de expressão relativa de pro- teínas hOPA1 na retina de globos oculares de coelhos injetados com diferentes plasmídeos; o grupo experimental A é o grupo injetado com a isoforma 2 de hOPA1 otimizada para rAAV2/2, o grupo experimental B é o grupo injetado com a isoforma 2 de hOPA1 original de rAAV2/2 e o grupo controle é o grupo injetado com rAAV2/2-ZsGreen.

[0086] A Fig. 11 mostra os resultados de detecção por western blot de proteínas hOPA1 na retina de globos oculares de coelhos injetados com diferentes plasmídeos; o grupo experimental A é o grupo injetado com a isoforma 2 de hOPA1 otimizada para rAAV2/2, o grupo experi- mental B é o grupo injetado com a isoforma 2 de hOPA1 original de rAAV2/2 e o grupo controle é o grupo injetado com rAAV2/2-ZsGreen.

[0087] A Fig. 12 mostra a construção de camundongos modelo de

ADOA (atrofia óptica autossômica dominante).

[0088] A Fig. 13 mostra a identificação do genótipo de camundon- gos modelo de mutação pontual de ADOA (atrofia óptica autossômica dominante).

[0089] A Fig. 14 mostra as mudanças de conteúdo de ATP na retina de camundongos após a administração detectada por cromatografia lí- quida de alta eficiência (HPLC).

[0090] A Fig. 15 mostra a morfologia de mitocôndrias observada por microscópio eletrônico de transmissão (TEM). Descrição Detalhada

[0091] Após uma pesquisa extensa e aprofundada, os inventores realizaram um projeto de otimização direcionada na sequência de codi- ficação gênica de GTPase tipo dineína mitocondrial tipo II humana re- combinante (OPA1), de modo a obter uma sequência de nucleotídeos (SEQ ID NO: 1) que é particularmente adequada para ser transcrita de forma eficiente e expressar de forma eficiente a proteína OPA1 em cé- lulas de mamíferos (como humanos) e construir um vetor de expressão recombinante para a GTPase tipo dineína mitocondrial tipo II humana recombinante. Os resultados experimentais mostram que, em compara- ção com a sequência de codificação não otimizada, a sequência de co- dificação de OPA1 especialmente otimizada (SEQ ID NO: 1) melhorou ligeiramente a eficiência de transcrição e a quantidade de expressão desta foi significativamente aumentada em mais de 5 vezes, o que é muito adequado para ser expresso em células de mamíferos (especial- mente humanos) e pode tratar de forma eficaz ADOA e outras doenças oculares. A presente invenção é conseguida pelos inventores nessa base. Definições

[0092] Certos termos são primeiramente definidos a fim de tornar esta divulgação mais facilmente compreensível. Como usado neste pe- dido, cada um dos seguintes termos deve ter os significados dados a seguir, a menos que expressamente declarado de outra forma neste do- cumento. Outras definições são declaradas no decorrer do pedido.

[0093] O termo "cerca de" pode se referir a um valor ou composição dentro de uma faixa de erro aceitável de um valor ou composição em particular determinados por uma pessoa com competência comum na técnica, que dependerá parcialmente de como o valor ou composição é medido ou determinado. Por exemplo, como usado neste documento, a expressão "cerca de 100" inclui todos os valores entre 99 e 101 (por exemplo, 99,1, 99,2, 99,3, 99,4 etc.).

[0094] Tal como usado neste documento, os termos "compreen- dendo" ou "incluindo (contendo)" podem ser abertos, semifechados e fechados. Em outras palavras, os termos também incluem "consistindo essencialmente em" ou "consistindo em".

[0095] A identidade da sequência é determinada comparando duas sequências alinhadas ao longo de uma janela de comparação predeter- minada (que pode ser 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ou 100% do comprimento da sequência de nucleotídeos ou proteína de referência) e determinando o número de posições onde os resíduos idênticos apa- recem. Geralmente, isso é expresso como uma porcentagem. A medi- ção de identidade de sequência de sequências de nucleotídeos é um método bem conhecido pelos versados na técnica.

[0096] Tal como usado neste documento, os termos "indivíduo" e "indivíduo que necessita deste" referem-se a quaisquer mamíferos ou não mamíferos. Os mamíferos incluem, mas não estão limitados a, se- res humanos, vertebrados, tais como roedores, primatas não humanos, bovinos, cavalos, cachorros, gatos, porcos, ovelhas e cabras. OPA1 (atrofia óptica 1)

[0097] Tal como usado neste documento, os termos "GTPase tipo dineína mitocondrial tipo II humana (recombinante)", "proteína de atrofia óptica 1", "(proteína) OPA1", "(proteína) hOPA1", "polipeptídeo", "poli- peptídeo da presente invenção” e “proteína da presente invenção” têm os mesmos significados e podem ser usados de forma intercambiável neste documento. OPA1 é uma proteína de transmembrana com ativi- dade de GTPase localizada na membrana mitocondrial interna; e essa proteína compreende uma região de transmembrana de terminal N que tem uma sequência de importação mitocondrial (MIS), uma região de transmembrana (TR) e uma região hidrofóbica (HR), um domínio GTPase, um domínio dineína central e um terminal C que tem um do- mínio efetor de GTPase (GED). A função do polipeptídeo de MIS de OPA1 é guiar a proteína GTP para dentro da mitocôndria.

[0098] A ADOA é causada por mutações em genes que codificam proteínas e loci da membrana mitocondrial interna e estudiosos estran- geiros determinaram que esses genes são principalmente OPA1-OPA8; entre eles, foi inicialmente confirmado que cerca de 75% dos pacientes com ADOA estão relacionados a mutações heterozigóticas e dominan- tes carregadas por OPA1, nas quais as mutações de sítio nos exons 740 e 2794 são as mais comuns. As proteínas OPA1 localizam-se nas membranas mitocondriais internas, controlam o metabolismo energético e a apoptose, mantêm a integridade das cristas e do mtDNA e têm ati- vidades de GTPase. A patogênese da ADOA reside no fato de que o OPA1 mutante codifica uma variedade de formas truncadas de proteí- nas que geralmente carecem de domínios GTPase completos, o que é equivalente à deleção de um alelo, o que reduzirá muito a quantidade de OPA1, resultando em uma chamada insuficiência de haplótipo, as- sim, as funções mitocondriais são prejudicadas. Mitocôndrias fragmen- tadas não podem suprir ATP normalmente para as células do nervo óp- tico e as células RGC gradualmente passam por apoptose, o que leva à ocorrência de ADOA em pacientes.

Vírus adeno-associado

[0099] O vírus adeno-associado (AAV), também conhecido como Vírus Adeno-Associado, pertence ao Dependovírus em Parvoviridae. É o tipo mais simples de vírus defeituoso de DNA de fita simples encon- trado até agora e requer um vírus auxiliar (geralmente adenovírus) para participar de sua replicação. Ele codifica os genes cap e rep nas repeti- ções invertidas (ITR) em ambas as extremidades. As ITRs desempe- nham um papel decisivo na replicação e no empacotamento de vírus. O gene cap codifica a proteína do cápside viral e o gene rep está envolvido na replicação e integração de vírus. Os AAVs podem infectar uma vari- edade de células.

[0100] O vetor de vírus adeno-associado recombinante (rAAV) é de- rivado de vírus adeno-associado de tipo selvagem não patogênico. De- vido à sua boa segurança, ampla gama de células hospedeiras (células em divisão e não divisão), baixa imunogenicidade, capacidade de ex- pressão de longo prazo de genes exógenos in vivo e outras caracterís- ticas, o rAAV é considerado como um dos vetores de transferência gê- nica mais promissores e tem sido amplamente usado em terapia gênica e pesquisa de vacinas em todo o mundo. Após mais de 10 anos de pes- quisa, as características biológicas do vírus adeno-associado recombi- nante foram profundamente compreendidas e muitos dados foram acu- mulados, especialmente nos aspectos de seus efeitos de aplicação em várias células, tecidos e experimentos in vivo. Na pesquisa médica, o rAAV tem sido usado na pesquisa de terapia gênica para várias doenças (incluindo experimentos in vivo e in vitro). Ao mesmo tempo, como um vetor de transferência gênica característico, também é amplamente usado na pesquisa de função de gene, construção de modelo de doença e preparação de camundongos de inativação gênica e outros aspectos.

[0101] Em uma modalidade preferencial da presente invenção, o vetor é um vetor AAV recombinante. Os AAVs são vírus de DNA relati- vamente pequenos que podem se integrar ao genoma das células que são infectadas por eles de uma maneira estável e em específica do sítio. Eles são capazes de infectar uma vasta gama de células sem qualquer efeito no crescimento, morfologia ou diferenciação das células e eles não parecem estar envolvidos em patologia humana. O genoma de AAV foi clonado, sequenciado e caracterizado. O AAV contém aproximada- mente 4.700 bases e uma região de repetição terminal invertida (ITR) de aproximadamente 145 bases em cada extremidade, essa região serve como origem de replicação do vírus. O resto do genoma é dividido em duas regiões importantes com funções de encapsidação: uma parte esquerda do genoma, que contém o gene rep envolvido em replicação viral e expressão gênica viral; e a parte direita do genoma, que contém o gene cap que codifica a proteína do cápside viral.

[0102] Os vetores AAV podem ser preparados usando métodos pa- drão na técnica. Os vírus adeno-associados de qualquer serotipo são adequados. Métodos para purificar vetores podem ser encontrados, por exemplo, nas Patentes U.S. Nº 6.566.118, 6.989.264 e 6.995.006, cujas divulgações são incorporadas a este documento por referência em sua totalidade. A preparação de vetores híbridos é descrita, por exemplo, no pedido PCT Nº PCT/US2005/027091, cuja divulgação é incorporada a este documento por referência em sua totalidade. Os usos de vetores derivados de AAV para transferir genes in vitro e in vivo foram descritos (vide, por exemplo, Publicação de Pedido de Patente Internacional Nº WO91/18088 e WO93/09239; Patentes U.S. Nº 4.797.368, 6.596.535 e

5.139.941 e Patente Europeia Nº 0.488.528, todas as quais são incor- poradas a este documento por referência na sua totalidade). Essas pu- blicações de patentes descreveram vários construtos derivados de AAV nos quais os genes rep e/ou cap são deletados e substituídos pelo gene de interesse e os usos desses construtos para transportar o gene de interesse in vitro (entrando em células cultivadas) ou in vivo (entrando diretamente nos organismos). AAVs recombinantes deficientes em re- plicação podem ser preparados co-transferindo os seguintes plasmí- deos em uma linha celular infectada com um vírus auxiliar humano (tal como adenovírus): plasmídeos que contêm a sequência de ácido nu- cleico de interesse flanqueada por duas regiões de repetição terminal invertida de AAV (ITR) e plasmídeos que carregam genes de encapsi- dação de AAV (genes rep e cap). Os recombinantes AAV resultantes são então purificados por técnicas padrão.

[0103] Em algumas modalidades, os vetores recombinantes são submetidos a encapsidação em partículas virais (por exemplo, inclu- indo, mas não se limitando a, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, AAV14, AAV15 e AAV16). Portanto, a presente divulgação inclui partículas virais recom- binantes (chamadas de recombinantes porque elas contêm polinucleo- tídeos recombinantes) contendo qualquer um dos vetores descritos neste documento. Os métodos de produção de tais partículas são co- nhecidos na técnica e descritos na Patente U.S. Nº 6.596.535. Sequência de codificação de ácido nucleico

[0104] O problema técnico a ser resolvido pela presente invenção é superar os defeitos técnicos de baixa quantidade de expressão e efeitos terapêuticos fracos da GTPase tipo dineína mitocondrial tipo II humana recombinante no estado da técnica. A finalidade da presente invenção é fornecer uma sequência gênica otimizada de GTPase tipo dineína mi- tocondrial tipo II humana recombinante. Um gene GTPase tipo dineína mitocondrial tipo II humana recombinante tem uma sequência de nucle- otídeos CDS otimizada como mostrado em SEQ ID NO: 1 e um tamanho de 2.775 bp, que começa com o códon ATG e codifica 924 aminoácidos, em que 1 a 288 bp é a sequência de codificação de MIS de OPA1, que codifica uma cadeia peptídica de 96 aminoácidos que serve para guiar a proteína GTP para entrar na mitocôndria para exercer suas funções fisiológicas; 289 a 2.772 bp codificam uma cadeia peptídica de 828 ami- noácidos que serve como uma proteína funcional GTP; e os últimos 3 bp são um códon de parada. Estudos concluíram que a sequência gê- nica de OPA1 otimizada (SEQ ID NO: 1) da presente invenção torna a eficiência de expressão da proteína OPA1 superior e há mais proteínas OPA1 que desempenham papéis fisiológicos nas células ganglionares ópticas do paciente.

[0105] A sequência de nucleotídeos do ácido nucleico que codifica a GTPase tipo dineína mitocondrial tipo II humana recombinante da pre- sente invenção é mostrada em SEQ ID NO: 1. Em outra modalidade preferencial, a sequência de nucleotídeos é ≥95%, preferencialmente ≥98%, mais preferencialmente ≥99% idêntica à sequência de nucleotí- deos mostrada em SEQ ID NO: 1. Na presente invenção, o ácido nu- cleico que codifica a GTPase tipo dineína mitocondrial tipo II humana recombinante também é chamado de gene otimizado para OPA1 ou ácido nucleico otimizado para OPA1.

[0106] Os polinucleotídeos da presente invenção podem estar na forma de DNA ou RNA. Em outra modalidade preferencial, o nucleotídeo é DNA. As formas de DNA incluem cDNA, DNA genômico ou DNA sin- tético. O DNA pode ser de fita simples ou fita dupla. O DNA pode ser uma fita de codificação ou uma fita de não codificação. A sequência de nucleotídeos da presente invenção codifica a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 3. O peptídeo sinal de MIS de OPA1 direciona a proteína para entrar na mitocôndria e, após ser hidrolisada por uma protease, a proteína isoforma 2 de OPA1 madura entra na mitocôndria para desempenhar um papel.

[0107] A sequência de ácido nucleico pode ser um DNA, um RNA, um cDNA ou um PNA.

A sequência de ácido nucleico pode ser genô- mica, recombinante ou sintética.

A sequência de ácido nucleico pode ser isolada ou purificada.

A sequência de ácido nucleico pode ser de cadeia simples ou de cadeia dupla.

Preferencialmente, a sequência de ácido nucleico codificará uma proteína fotossensível como descrito neste documento.

As sequências de ácido nucleico podem ser deriva- das por clonagem, por exemplo, usando técnicas de clonagem molecu- lar padrão incluindo digestão de restrição, ligação e electroforese em gel, como descrito em, por exemplo, Sambrook et al.

Molecular Cloning: A laboratory manual (Clonagem Molecular: Um manual laboratorial), Cold Spring Harbour Laboratory Press.

A sequência de ácido nucleico pode ser isolada, por exemplo, isolada usando tecnologia de PCR.

Iso- lamento significa a separação de uma sequência de ácido nucleico de quaisquer impurezas e de outras sequências de ácido nucleico e/ou pro- teínas que naturalmente se associam com as sequências de ácido nu- cleico em sua fonte.

Preferencialmente, também estará livre de um ma- terial celular, meio de cultura ou outras substâncias químicas dos pro- cessos de purificação/produção.

A sequência de ácido nucleico pode ser sintética, por exemplo, produzida por síntese química direta.

A se- quência de ácido nucleico pode ser fornecida como um ácido nucleico nu ou pode ser fornecida em um complexo com uma proteína ou um lipídeo.

[0108] A sequência de nucleotídeos completa da presente invenção ou seus fragmentos podem geralmente ser obtidos por um método de amplificação por PCR, um método de recombinação ou um método de síntese artificial. Para um método de amplificação por PCR, os primers podem ser projetados de acordo com uma sequência de nucleotídeos relevante publicada, especialmente a sequência de quadro de leitura aberta, e uma biblioteca de cDNA disponível comercialmente ou uma biblioteca de cDNA preparada por um método convencional conhecido pelos versados na técnica podem ser usadas como um padrão; e uma sequência relevante é obtida por amplificação. Quando a sequência é relativamente longa, frequentemente é necessário realizar duas ou mais amplificações por PCR e, então, unir os fragmentos amplificados indivi- duais na ordem correta. Atualmente, a sequência de DNA que codifica o polipeptídeo (ou um fragmento ou derivado deste) da presente inven- ção pode ser obtida completamente através de síntese química. A se- quência de DNA pode então ser introduzida em várias moléculas de DNA existentes (ou tal como vetores) e células conhecidas na técnica.

[0109] A presente invenção também se refere a um vetor que con- tém o polinucleotídeo da presente invenção e uma célula hospedeira produzida por engenharia genética usando o vetor ou a sequência de codificação de polipeptídeo da presente invenção. O polinucleotídeo, vetor ou célula hospedeira mencionados acima podem ser isolados.

[0110] Como usado neste documento, "isolado" se refere à separa- ção de uma substância de seu ambiente original (se for uma substância natural, o ambiente original se refere ao ambiente natural). Por exemplo, um polinucleotídeo e um polipeptídeo em um estado natural em células vivas não são separados e purificados, mas o mesmo polinucleotídeo ou polipeptídeo é separado e purificado quando é separado de outras substâncias que coexistem no estado natural.

[0111] Em uma modalidade preferencial da presente invenção, a sequência de nucleotídeos é mostrada em SEQ ID NO: 1.

[0112] Uma vez que uma sequência relevante é obtida, o método de recombinação pode ser usado para obter a sequência relevante em larga escala. Isso é geralmente feito clonando-a em um vetor, então transferindo-a para uma célula e, então, isolando a sequência relevante das células hospedeiras proliferadas por métodos convencionais.

[0113] Além disso, a sequência relevante também pode ser sinteti- zada usando métodos de síntese artificial, especialmente quando o comprimento de fragmento é curto. Geralmente, um fragmento que tem uma sequência muito longa pode ser obtido sintetizando primeiro vários fragmentos pequenos e, então, ligando-os.

[0114] O método de amplificação de DNA/RNA usando tecnologia de PCR é preferencialmente usado para obter o gene da presente in- venção. Os primers usados para PCR podem ser apropriadamente se- lecionados de acordo com a informação de sequência da presente in- venção divulgada neste documento e podem ser sintetizados por méto- dos convencionais. Os fragmentos de DNA/RNA amplificados podem ser separados e purificados por métodos convencionais, tais como elec- troforese em gel.

[0115] A presente invenção também se refere a um vetor que con- tém o polinucleotídeo da presente invenção, uma célula hospedeira pro- duzida por engenharia genética usando o vetor ou sequência de codifi- cação de proteína da presente invenção e um método para expressar proteína OPA1 usando a célula hospedeira através de tecnologia re- combinante.

[0116] As células hospedeiras (tais como células de mamíferos) que expressam a proteína OPA1 da presente invenção podem ser obtidas usando a sequência de polinucleotídeos da presente invenção através de tecnologia de DNA recombinante convencional. Em geral, a seguinte etapa é incluída: transduzir o polinucleotídeo descrito no primeiro as- pecto da presente invenção ou o vetor descrito no terceiro aspecto da presente invenção em uma célula hospedeira.

[0117] Métodos bem conhecidos pelos versados na técnica podem ser usados para construir o vetor de expressão que contém a sequência de DNA que codifica o polipeptídeo da presente invenção e sinais de controle de transcrição/tradução apropriados. Esses métodos incluem tecnologia de DNA recombinante in vitro, tecnologia de síntese de DNA e tecnologia de recombinação in vivo. A sequência de DNA pode ser ligada efetivamente a um promotor apropriado no vetor de expressão para dirigir a síntese de mRNA. O vetor de expressão também compre- ende um sítio de ligação de ribossomo para a iniciação de tradução e um terminador de transcrição.

[0118] Além disso, o vetor de expressão contém preferencialmente um ou mais genes marcadores selecionáveis para fornecer traços feno- típicos para selecionar células hospedeiras transformadas, tais como di- hidrofolato redutase para cultura de células eucarióticas, resistência à neomicina e proteína Fluorescente verde (GFP) ou resistência à tetraci- clina ou ampicilina para E. coli.

[0119] O vetor que contém a sequência de DNA apropriada descrita acima e um promotor apropriado ou sequência de controle podem ser usados para transformar uma célula hospedeira apropriada de modo que ela possa expressar um polipeptídeo.

[0120] A célula hospedeira pode ser uma célula procariótica, uma célula eucariótica inferior ou uma célula eucariótica superior, como uma célula de mamífero (incluindo mamíferos humanos e não humanos). Exemplos representativos são células animais, tais como células CHO, NSO, COS7 ou 293. Em uma modalidade preferencial da presente in- venção, uma célula 293T, uma célula fotorreceptora (incluindo uma cé- lula cone e/ou uma célula bastonete), outras células visuais (como uma célula bipolar) e uma célula nervosa são selecionadas como a célula hospedeira. Em outra modalidade preferencial, a célula hospedeira é selecionada do grupo que consiste em uma célula bastonete, uma célula cone, uma célula bipolar on, uma célula bipolar off, uma célula horizon- tal, uma célula ganglionar, uma célula amácrina ou uma combinação destas.

[0121] A transformação da célula hospedeira usando DNA recombi- nante pode ser realizada por técnicas convencionais bem conhecidas pelos versados na técnica. Quando o hospedeiro é um procarionte tal como Escherichia coli, uma célula competente que é capaz de absorver DNA pode ser colhida após a fase de crescimento exponencial e tratada pelo método CaCl2, em que as etapas relevantes usadas são bem co- nhecidas na técnica. Outro método é usar MgCl2. Se necessário, a trans- formação também pode ser realizada por eletroporação. Quando o hos- pedeiro é um eucariota, os seguintes métodos de transfecção de DNA podem ser selecionados: o método de co-precipitação com fosfato de cálcio e os métodos mecânicos convencionais, tais como microinjeção, eletroporação, empacotamento de lipossomas etc.

[0122] Os transformantes obtidos podem ser cultivados por méto- dos convencionais para expressar a proteína codificada pelo gene da presente invenção. Dependendo da célula hospedeira usada, o meio usado na cultura pode ser selecionado de vários meios de cultura con- vencionais. A cultura é realizada nas condições adequadas para o cres- cimento da célula hospedeira. Quando a célula hospedeira cresce até uma densidade celular apropriada, um método adequado (tal como con- versão de temperatura ou indução química) é usado para induzir o pro- motor selecionado e a célula é adicionalmente cultivada por um período de tempo.

[0123] No método acima, o polipeptídeo pode ser expresso na cé-

lula ou na membrana celular ou secretado para fora da célula. Se ne- cessário, a proteína pode ser separada e purificada através de vários métodos de separação usando suas propriedades físicas, químicas e outras propriedades. Esses métodos são bem conhecidos por aqueles versados na técnica. Exemplos desses métodos incluem, mas não es- tão limitados a: tratamento de renaturação convencional, tratamento com agente de precipitação de proteína (método de relargagem), cen- trifugação, quebra de células por meio de osmose, ultra-tratamento, ul- tra-centrifugação, cromatografia de peneira molecular (filtração em gel), cromatografia de adsorção, cromatografia de troca iônica, cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) e várias outras técnicas de cromato- grafia líquida e as combinações desses métodos. Otimização de sequência

[0124] Na presente invenção, uma sequência de codificação otimi- zada de GTPase tipo dineína mitocondrial tipo II humana recombinante que é particularmente adequada para expressão em células de mamí- feros é fornecida e a sequência de codificação é mostrada em SEQ ID NO: 1.

[0125] Tal como usado neste documento, a "sequência de codifica- ção de OPA1 otimizada" e o "gene de codificação de OPA1 otimizado" referem-se a uma sequência de nucleotídeos para codificar a GTPase tipo dineína mitocondrial tipo II humana recombinante e a sequência de nucleotídeos codifica a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 3.

[0126] Na presente invenção, a sequência de codificação de DNA selvagem (sequência de codificação de DNA não otimizada) da GTPase tipo dineína mitocondrial tipo II humana recombinante é mostrada em SEQ ID NO: 2. A quantidade de expressão da sequência de codificação de DNA selvagem não otimizada é muito baixa. Homo sapiens selvagem: isoforma 2 de OPA1 CDS 2775 bp

[0127] A presente invenção otimizou os fragmentos de sequência que afetam a expressão gênica e a localização de proteínas, em que as otimizações desses fragmentos de sequência incluem, mas não estão limitados a, viés de uso de códon; eliminar estruturas secundárias que não são condutivas à expressão (tal como estrutura em grampo); e al- terar o conteúdo de GC, o conteúdo do dinucleotídeo CpG, a estrutura secundária de mRNA, sítios de splice críptico, sítios de poliadenilação precoce, entrada de ribossomo interno e sítios de ligação, ilhas CpG negativas, regiões instáveis de RNA, sequências de repetição (sequên- cias de repetição direta, sequências de repetição invertida etc.) e sítios de restrição que podem afetar a clonagem.

Uma sequência de codifica- ção de DNA especialmente otimizada, como mostrado em SEQ ID NO: 1, é finalmente obtida através de análise e triagem experimental.

Essa sequência é especialmente otimizada, o nível de transcrição desta é, pois, ligeiramente aumentado e a quantidade de expressão desta é sig-

nificativamente aumentada. A similaridade entre a sequência de codifi- cação especialmente otimizada mostrada em SEQ ID NO: 1 e a sequên- cia de codificação selvagem mostrada em SEQ ID NO: 2 é de 72,25% (2005/2775), como mostrado na Figura 1. Homo sapiens otimizado: isoforma 2 de OPA1 CDS 2775bp Ácido nucleico de fusão

[0128] A presente invenção também fornece um ácido nucleico de fusão que compreende a sequência de ácido nucleico que codifica a GTPase tipo dineína mitocondrial tipo II humana recombinante descrita no primeiro aspecto da presente invenção.

[0129] Tal como usado neste documento, "ácido nucleico de fusão" refere-se a um ácido nucleico formado ligando duas ou mais sequências de nucleotídeos de fontes diferentes ou um ácido nucleico formado li- gando duas ou mais sequências de nucleotídeos da mesma fonte, mas não ligantes umas às outras em suas posições naturais.

[0130] Em outra modalidade preferencial, o ácido nucleico de fusão compreende adicionalmente uma sequência selecionada do grupo que consiste em uma sequência UTR, uma sequência promotora ou uma combinação destas.

[0131] Preferencialmente, o ácido nucleico de fusão tem uma se- quência UTR operacionalmente ligada ao ácido nucleico que codifica GTPase tipo dineína mitocondrial tipo II humana recombinante.

[0132] Em outra modalidade preferencial, a sequência UTR inclui uma 3'-UTR e/ou uma 5'-UTR.

[0133] Em outra modalidade preferencial, a sequência UTR contém uma sequência poliA para estabilizar a estrutura.

[0134] Em outra modalidade preferencial, o ácido nucleico de fusão tem uma estrutura de fórmula I a partir da extremidade 5' até a extremi- dade 3': Z1-Z2-Z3 (I) em que cada "-" é independentemente uma ligação ou uma sequência de ligante de nucleotídeos; Z1 é uma sequência 5'-UTR; Z2 é a sequência de nucleotídeos como descrito no primeiro aspecto da presente invenção; e Z3 é uma sequência 3'-UTR. Vetor de expressão e célula hospedeira

[0135] A presente invenção também fornece um vetor de expressão para a proteína OPA1, que contém a sequência de codificação OPA1 otimizada da presente invenção.

[0136] Com a informação de sequência fornecida, um versado na técnica pode usar técnicas de clonagem disponíveis para gerar sequên- cias de ácido nucleico ou vetores adequados para transdução em célu- las.

[0137] Preferencialmente, a sequência de ácido nucleico que codi- fica a proteína OPA1 é fornecida como um vetor, preferencialmente um vetor de expressão. Preferencialmente, pode ser fornecido como um ve- tor de terapia gênica, preferencialmente adequado para transdução e expressão em células alvo da retina. O vetor pode ser viral ou não viral (por exemplo, um plasmídeo). Os vetores virais incluem aqueles deriva- dos dos seguintes vírus: adenovírus, vírus adeno-associado (AAV), in- cluindo formas mutantes, retrovírus, lentivírus, vírus do herpes, vírus va- ccinia, MMLV, GaLV, vírus da imunodeficiência símia (SIV), HIV, poxví- rus e SV40. Preferencialmente, os vetores virais são defeituosos na re- plicação, embora seja considerado que eles podem ser deficientes na replicação, eles são capazes de replicação ou replicação condicional. Os vetores virais podem geralmente manter um estado extracromossô- mico sem se integrar ao genoma das células da retina alvo. O vetor viral preferencial para introduzir a sequência de ácido nucleico que codifica proteína OPA1 em células alvo da retina é vetor AAV, tal como um vírus adeno-associado auto-complementar (scAAV). O direcionamento sele- tivo pode ser alcançado usando um serotipo AAV específico (serotipo 2 de AAV para serotipo 12 de AAV) ou uma versão modificada de qual- quer um desses serotipos (incluindo vetores AAV 4YF e AAV 7m8).

[0138] O vetor viral pode ser modificado para deletar quaisquer se- quências desnecessárias. Por exemplo, como para AAV, o vírus pode ser modificado para deletar todo ou parte do gene IX, genes E1a e/ou E1b. Para AAV de tipo selvagem, se não houver vírus auxiliar, como adenovírus, sua eficiência de replicação é muito baixa. Para um vírus adeno-associado recombinante, preferencialmente, o gene de replica- ção e o gene de cápside são fornecidos em trans (em um plasmídeo pRep/Cap) e apenas o 2ITR do genoma de AAV é retido e empacotado nos vírions, enquanto os genes de adenovírus necessários são forneci- dos por um adenovírus ou outro plasmídeo. Modificações semelhantes também podem ser feitas em um vetor lentiviral.

[0139] Um vetor viral tem a capacidade de entrar em uma célula. No entanto, um vetor não viral, como um plasmídeo, pode ser complexado com um agente para facilitar a absorção do vetor viral por uma célula alvo. Tais agentes incluem agentes policatiônicos. Opcionalmente, um sistema de entrega, tal como um sistema de entrega baseado em lipos- soma, pode ser usado. O vetor para uso na presente invenção é prefe- rencialmente adequado para uso in vivo ou in vitro e é preferencialmente adequado para uso em seres humanos.

[0140] O vetor conterá preferencialmente uma ou mais sequências reguladoras para dirigir a expressão da sequência de ácido nucleico em células alvo da retina. A sequência reguladora pode incluir um promotor, um potencializador, um sinal de terminação de transcrição, uma sequên- cia de poliadenilação, uma origem de replicação, um sítio de restrição de ácido nucleico e um sítio de recombinação homóloga operacional- mente ligado à sequência de ácido nucleico. O vetor também pode in- cluir um marcador selecionável, por exemplo, para determinar a expres- são do vetor em um sistema de crescimento (por exemplo, uma célula bacteriana) ou em células alvo da retina.

[0141] "Operacionalmente ligado" significa que uma sequência de ácido nucleico está funcionalmente relacionada à sequência à qual está operacionalmente ligada, de modo que elas estejam ligadas de tal forma que afetem a expressão ou funções uma da outra. Por exemplo, uma sequência de ácido nucleico operacionalmente ligada a um promotor terá um padrão de expressão afetado pelo promotor.

[0142] O promotor medeia a expressão da sequência de ácido nu- cleico à qual está ligado. O promotor pode ser constitutivo ou induzível. Um promotor pode direcionar a expressão ubíqua em células da retina internas ou a expressão específica de neurônio. No último caso, o pro- motor pode direcionar expressão específica do tipo de célula, por exem- plo, as células ganglionares ópticas. Os promotores adequados serão conhecidos pelos versados na técnica. Por exemplo, um promotor ade- quado pode ser selecionado do grupo que consiste em: L7, thy-1, reco- verina, calbindina, CMV humano, GAD-67, β-actina de frango, hSyn, Grm6 e proteína de fusão SV40 potencializadora de Grm6. O direciona- mento pode ser alcançado usando um promotor específico de célula, tal como Grm6-SV40 para direcionamento seletivo para as células do nervo óptico. O promotor Grm6 é uma fusão da sequência potencializadora de pares de 200 bases do gene Grm6 e do promotor eucariótico SV40 e o gene Grm6 codifica mGluR6, um receptor metabotrópico de glutamato específico para células do nervo óptico. Fontes preferenciais do gene Grm6 são camundongos e seres humanos. A expressão ubíqua pode ser alcançada usando um promotor pan-neuronal, exemplos do qual são conhecidos e estão disponíveis na técnica. Um tal exemplo é CAG. O promotor CAG é uma fusão do potencializador precoce de CMV e do promotor de β-actina de frango.

[0143] Um exemplo de um promotor adequado é a sequência pro- motora de citomegalovírus (CMV) imediata-precoce. A sequência pro- motora é uma sequência promotora constitutiva forte capaz de conduzir a expressão de alto nível de qualquer sequência de polinucleotídeos à qual está operacionalmente ligada. Outro exemplo de um promotor ade- quado é fator de crescimento de prolongamento 1α (EF-1α). No entanto, outras sequências promotoras constitutivas também podem ser usadas, incluindo, mas não se limitando a, promotor precoce de vírus símio 40 (SV40), vírus do tumor mamário de camundongo (MMTV), promotor da repetição terminal longa (LTR) do vírus da imunodeficiência humana (HIV), promotor MoMuLV, promotor do vírus da leucemia aviária, pro- motor imediato-precoce do vírus Epstein-Barr, promotor do vírus do sar- coma de Rous e promotor de genes humanos, tal como, mas não limi- tados a, promotor de actina, o promotor de miosina, o promotor heme e promotor da creatina quinase. Adicionalmente, a presente invenção não deve ser limitada às aplicações de promotores constitutivos. Promotores induzíveis também são considerados parte da invenção. O uso de um promotor induzível fornece um interruptor molecular que pode ligar a expressão de uma sequência de polinucleotídeos operacionalmente li- gada a um promotor induzível quando uma tal expressão é desejada ou desligar a expressão quando a expressão não é desejada. Exemplos de promotores induzíveis incluem, mas não estão limitados a, promotores de metalotioneína, promotores de glucocorticoides, promotores de pro- gesterona e promotores de tetraciclina.

[0144] Muitos vetores de expressão podem ser usados para expres- sar proteína OPA1 em células de mamíferos (preferencialmente células humanas, mais preferencialmente células do nervo óptico humano ou células fotorreceptoras). O vírus adeno-associado é preferencialmente usado como o vetor de expressão na presente invenção.

[0145] A presente invenção também fornece um método para cons- truir um vetor de vírus adeno-associado para a aplicação recombinante do gene da GTPase tipo dineína mitocondrial tipo II humana recombi- nante, cujo método pode rapidamente e facilmente construir um vetor de vírus adeno-associado recombinante que carrega o gene de GTPase tipo dineína mitocondrial tipo II humana recombinante, que é empaco- tado para obter um vetor de vírus adeno-associado com deficiência de replicação.

[0146] A presente invenção também fornece uma célula hospedeira para expressar a proteína OPA1. Preferencialmente, a célula hospe- deira é uma célula de mamífero (preferencialmente uma célula humana, mais preferencialmente uma célula do nervo óptico humano ou uma cé- lula fotorreceptora) que aumenta a quantidade de expressão da proteína OPA1. Preparações e composições

[0147] A presente invenção fornece uma preparação ou uma com- posição que contém (a) o vetor de acordo com o terceiro aspecto da presente invenção e (b) um carreador ou excipiente farmaceuticamente aceitável.

[0148] Em outra modalidade preferencial, a preparação farmacêu- tica é usada para tratar doenças oculares.

[0149] Em outra modalidade preferencial, a preparação farmacêu- tica é usada para tratar neuropatia óptica hereditária, preferencialmente atrofia óptica autossômica dominante (ADOA).

[0150] Um "ingrediente ativo" na composição farmacêutica descrita na presente invenção refere-se ao vetor da presente invenção, tal como um vetor viral (incluindo um vetor de vírus adeno-associado). Os "ingre- dientes ativos", preparações e/ou composições descritos na presente invenção podem ser usados para tratar doenças oculares. "Quantidade segura e efetiva" significa que a quantidade do ingrediente ativo pode obviamente melhorar as condições ou sintomas patogênicos sem pro- duzir efeitos colaterais graves. "Carreador ou excipiente farmaceutica- mente aceitável" significa um ou mais preenchedores sólidos ou líquidos compatíveis ou substâncias em gel que são adequados para uso hu- mano e, além do mais, devem ter pureza suficiente e toxicidade sufici- entemente baixa. "Compatibilidade" significa neste documento que os componentes individuais na composição podem ser incorporados com os ingredientes ativos da presente invenção e incorporados uns com os outros sem obviamente reduzir os efeitos medicamentais dos ingredien- tes ativos.

[0151] A composição pode ser um líquido ou um sólido, como um pó, gel ou pasta. Preferencialmente, a composição é líquida, preferen- cialmente líquida para injeção. Excipientes adequados serão conheci- dos pelos versados na técnica.

[0152] Na presente invenção, o carreador pode ser administrado ao olho por administração sub-retiniana ou administração intravítrea. Em qualquer modo de administração, o carreador é preferencialmente for- necido como líquido para injeção. Preferencialmente, o líquido para in- jeção é fornecido como uma cápsula ou uma seringa.

[0153] Os exemplos do carreador farmaceuticamente aceitável in- cluem celulose e derivados desta (tais como carboximetilcelulose de só- dio, etilcelulose de sódio, acetato de celulose e similares), gelatina, talco, lubrificante sólido (tal como ácido esteárico, estearato de magné- sio), sulfato de cálcio, um óleo vegetal (tal como óleo de soja, óleo de gergelim, óleo de amendoim, azeite de oliva e similares), polióis (tais como propilenoglicol, glicerina, manitol, sorbitol e similares), um agente emulsionante (tal como Tween®), um agente umectante (tal como lau- rilsulfato de sódio), um corante, um agente aromatizante, um agente es- tabilizante, um antioxidante, um conservante, água apirogênica e simi- lares.

[0154] A composição pode incluir uma solução aquosa ou não aquosa estéril fisiologicamente aceitável, uma dispersão, uma suspen- são ou uma emulsão e um pó estéril para reconstituição em solução estéril ou dispersão para injeção. Os carreadores, diluentes, solventes ou excipientes aquosos e não aquosos adequados incluem água, eta- nol, polióis e misturas adequadas destes.

[0155] O ácido nucleico ou ácido nucleico de fusão que codifica OPA1 fornecido pela presente invenção pode produzir proteína OPA1 ou proteína de fusão OPA1 in vitro ou in vivo e a proteína de fusão ou a preparação que contém a proteína de fusão pode ser usada para pre- parar uma droga para tratar atrofia óptica autossômica dominante (ADOA).

[0156] O ácido nucleico otimizado que codifica GTPase tipo dineína mitocondrial tipo II humana recombinante tem uma quantidade de ex- pressão superior, traduzindo assim mais proteína OPA1 e a sequência

MIS na proteína OPA1 otimizada pode fazer com precisão a proteína funcional GTP entrar nas mitocôndrias e, portanto, há mais GTPase sendo transfectada em mitocôndrias. Um medicamento que contém o ácido nucleico da presente invenção é injetado na cavidade vítrea do olho de um coelho e o medicamento mantém a atividade na cavidade vítrea e o ácido nucleico é transfectado para células do nervo óptico. Em comparação com o estado da técnica, o ácido nucleico otimizado que codifica OPA1 expressa mais proteína OPA1, o que pode tratar melhor a atrofia óptica autossômica dominante (ADOA).

[0157] Em comparação com o estado da técnica, a presente inven- ção tem principalmente as seguintes vantagens:

1. A sequência de codificação do gene da GTPase tipo dineína mitocon- drial tipo II humana recombinante (OPA1) da presente invenção foi es- pecialmente otimizada, incluindo a otimização da sequência de codifica- ção de MIS e a sequência de codificação do domínio GTPase em OPA1. Em comparação com a sequência de codificação de DNA não otimizada de OPA1, a quantidade de expressão é significativamente aumentada e mais proteína OPA1 é transfectada em mitocôndrias. A sequência oti- mizada garante que a proteína OPA1 seja expressa em uma quantidade significativamente aumentada e tenha alta atividade biológica.

2. O gene que codifica OPA1 otimizada (SEQ ID NO: 1) ou o ácido nu- cleico de fusão na presente invenção podem tratar efetivamente a atro- fia óptica autossômica dominante (ADOA) com boa segurança.

3. A presente invenção fornece um modelo de mamífero não humano de ADOA com base na inativação do gene da GTPase tipo dineína mi- tocondrial tipo II humana recombinante, cujo modelo exibe as manifes- tações patológicas semelhantes à atrofia óptica autossômica dominante (ADOA), incluindo conteúdo reduzido de ATP da retina e mudanças apo- ptóticas de mitocôndria e podem ser usados para a pesquisa experi- mental, avaliação ou triagem de drogas para atrofia óptica autossômica dominante (ADOA).

4. O vírus adeno-associado recombinante rAAV2-hOPA1 fornecido pela presente invenção tem efeitos de melhoria significativos e eficientes so- bre as condições patológicas dos camundongos modelo de mutação pontual de ADOA (atrofia óptica autossômica dominante) e pode forne- cer efeitos de melhoria contínua; e pode reverter completamente e efe- tivamente os impactos da doença nos camundongos modelo 3 meses após uma única administração.

[0158] A presente invenção é adicionalmente ilustrada em conexão com exemplos em particular como se segue. Deve ser entendido que esses exemplos são meramente ilustrativos da presente invenção e não se destinam a limitar o escopo da presente invenção. Os métodos ex- perimentais com condições específicas não especificadas nos seguin- tes exemplos estão, em geral, de acordo com as condições convencio- nais, tais como as condições descritas em Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Clonagem Molecular: Um Manual Labo- ratorial) (Nova York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) ou condições recomendadas pelo fabricante. Todas as porcentagens e par- tes são calculadas em peso, a menos que indicado de outra forma. Exemplo 1 Construção de vetor de vírus adeno-associado recombinante para o gene da GTPase tipo dineína mitocondrial tipo II humana recom- binante e seu empacotamento de vírus e métodos de purificação

1. Construção de vetor de vírus adeno-associado recombinante que contém o gene da GTPase tipo dineína mitocondrial tipo II humana 1) Construção de vetor

[0159] Dois sítios de digestão de restrição Kpn I e Sal I foram adici- onados ao gene especialmente otimizado de GTPase tipo dineína mito- condrial tipo II humana recombinante (SEQ ID NO: 1); alternativamente, os primers foram projetados de acordo com esse novo gene para am- plificar o gene por PCR para dar um produto e o produto e um vetor de plasmídeo pSNaV foram respectivamente submetidos a digestão dupla com Kpn I e Sal I; e os produtos digeridos foram recuperados e ligados durante a noite com T4 DNA Ligase e os produtos de ligação foram transformados em células competentes para obter isoforma 2 de pSNaV/rAAV2/2-hOPA1 recombinante (Fig. 2). 2) Triagem e identificação de recombinantes

[0160] Em placas LB após serem cultivadas a 37 °C, placas azuis e placas brancas apareceram e as placas brancas eram os clones recom- binantes. As colônias brancas foram selecionadas e adicionadas a um meio líquido LB que continha 100 mg/L de Amp e cultivadas a 37 °C a 200 rpm por 8h. Plasmídeos foram extraídos da suspensão bacteriana cultivada, com as etapas de extração de plasmídeo que se referem às instruções de Biomiga. 1 μL de plasmídeo foi tomado como o padrão e os primers específicos foram: 1F: 5'-ATGTGGCGACTACGTCG-3' (SEQ ID NO: 4); 1R: 5'-TTATTTCTCCTGATGAAGAG-3' (SEQ ID NO: 5); Procedimentos para amplificação por PCR 1 2 Procedimentos Temperatura Tempo Temperatura Tempo Pré-desnaturação 95 °C 3 min 95 °C 3 min Desnaturação 94 °C 30 s 94 °C 30 s Anelamento 60 °C 30 s 58 °C 35 s Duração 72 °C 60 s 72 °C 60 s Duração de reparo 72 °C 8 min 72 °C 8 min Número de ciclos 25 C 25 C

[0161] O produto da PCR foi detectado por electroforese e o resul- tado foi mostrado na Fig. 3. Uma banda de interesse com um tamanho de cerca de 3.000 bp foi obtida. Os resultados da identificação mostra- ram que o clone continha o gene de interesse. 3) Preservação da suspensão bacteriana, amplificação por PCR e se- quenciamento do fragmento desta

[0162] 1 mL da suspensão bacteriana identificada foi pipetado e misturado com glicerol esterilizado em uma razão de 1:3 e armazenado a -80°C; a suspensão bacteriana foi submetida a sequenciamento; a se- quência obtida por sequenciamento foi alinhada com o gene da GTPase tipo dineína mitocondrial humana recombinante tipo II e um plasmídeo de vírus adeno-associado recombinante pSNaV/rAAV2/2-hOPA1 com a sequência correta foi obtido com sucesso (Fig. 4).

2. envolvimento de vírus adeno-associado recombinante da isoforma 2 de rAAV2/2-hOPA1 1) No dia anterior à transfecção, células 293T foram inoculadas em um frasco de cultura de células de 225 cm2 com uma densidade de semea- dura de 3,0 x 107 células/mL, em que o meio era DMEM + 10% de soro bovino e cultivadas em uma incubadora contendo 5% de CO 2 a 37 °C durante a noite. 2) O meio foi mudado no dia da transfecção e a cultura continuou com um meio DMEM fresco contendo 10% de soro bovino. O meio de cultura foi descartado quando as células cresceram até 80-90% e a transfecção foi realizada usando o kit de transfecção PlasmidTrans II (VGTC). As etapas específicas foram as seguintes: (a) os plasmídeos pAd-auxiliar, pAAV-r2c5 e pSNaV-hOPA1 foram tira- dos de cada frasco de transfecção e misturados com DMEM+Plas- midTrans II (VGTC) (reagente de transfecção) de acordo com as pro- porções necessárias em um tubo Ep estéril de 1,5 mL, numerado como reagente A, e, então, o reagente A foi mantido imóvel à temperatura ambiente por 10-15 min; (b) o reagente A foi misturado com 30 mL de DMEM + 10% de soro bovino, numerado como reagente B; (c) o reagente B foi adicionado uniformemente a um frasco de cultura de células e a cultura foi continuada em uma incubadora contendo 5% de CO2 a 37 °C;

(d) o meio completo (DMEM + 10% de soro bovino) foi adicionado para mudança 16 h após a transfecção. 3) as células foram coletadas 48 h após a transfecção. 4) as células coletadas foram suspensas em PBS e congeladas e des- congeladas repetidamente 3 vezes.

3. Purificação e concentração do vírus de isoforma 2 de rAAV2/2-hOPA1

[0163] Três etapas de tratamento com clorofórmio - precipitação PEG/NaCl - extração com clorofórmio foram usadas para separar, con- centrar e purificar o vírus rAAV2/2-hOPA1. Taxa de recuperação total = número de partículas de vírus no produto final/número de partículas de vírus no material inicial.

4. Verificação da pureza e título dos vírus

[0164] O gel de separação SDS-PAGE e o gel de empilhamento fo- ram carregados, em que a concentração do gel de separação é de 10%. 15 μg de amostras foram respectivamente adicionados a cada poço de amostra. Após a electroforese, o gel foi colorido com Coomassie Brilliant Blue e descolorido com uma solução de descoloração correspondente até bandas claras com plano de fundo baixo aparecerem (Fig. 5).

[0165] Os resultados foram mostrados na Fig. 5, VP1/VP2/VP3 = 1:1:10, as bandas estavam claras e a razão estava normal, não havia banda de impureza e a pureza estava acima de 99%.

[0166] Quanto à determinação do título da isoforma 2 de rAAV2/2- hOPA1, um método de PCR quantitativa por fluorescência foi empre- gado para determinar o título físico da isoforma 2 de rAAV2/2-hOPA1.

[0167] Materiais experimentais: SYBRII (takara); primers para o fra- gmento de interesse (20 μM); plasmídeo de interesse para vírus de em- pacotamento (concentração conhecida); vírus a ser determinado; tubo de oito tiras de PCR (Bio-red).

[0168] Método experimental: padrão 1 μl, SYBRII 7 μl, primer 1 0,25 μl e primer 2 0,25 μl foram tirados e água livre de nuclease foi adicionada até 14 μl.

[0169] Condições de reação por PCR: pré-desnaturação: 95 °C 10 min; ciclos: 95°C 15 s, 60°C 1 min.

[0170] Finalmente, foi determinado que o título do genoma era de 1 x 1012 vg/mL. Exemplo 2: experimento sobre os efeitos do vírus adeno-associado re- combinante rAAV2/2-hOPA1 em ADOA (atrofia óptica autossômica do- minante)

1. Injeção na cavidade vítrea de olho de coelho

[0171] Vinte e quatro coelhos foram divididos em 3 grupos, incluindo um grupo experimental A, um grupo experimental B e um grupo controle. 50 μl de 1 X 1012 vg/mL isoforma 2 de hOPA1 otimizada para rAAV2/2, isoforma 2 de hOPA1 original de rAAV2/2 e rAAV-ZsGreen foram res- pectivamente extraídos e injetados na cavidade vítrea por punção da parte plana do corpo ciliar a 3 mm longe do limbo corneano.

2. Lâmpada de fenda, pressão intraocular, exames de fotografia de fundo de olho

[0172] Dois grupos de coelhos passaram por exames de lâmpada de fenda e pressão intraocular, respectivamente, no dia 1, dia 3, dia 7 e dia 30 após a operação. Nenhum coelho apresentou anormalidades ób- vias, nenhuma congestão e secreção conjuntival, nenhuma endoftalmite e nenhum aumento na pressão intraocular, como mostrado nas fotogra- fias de fundo de olho um mês após a operação.

[0173] Os resultados foram mostrados na Fig. 6: nenhum coelho teve complicações óbvias ou danos aos vasos sanguíneos da retina nem aos nervos ópticos, indicando que uma injeção padrão normal na cavidade vítrea não causará reações inflamatórias óbvias ou outras complicações.

3. Fotografia de fluorescência de retina

[0174] Trinta dias após a injeção da cavidade vítrea, a fotografia de fluorescência da retina do grupo ZsGreen (grupo controle) mostrou que GFP foi expresso com sucesso na retina, indicando que rAAV foi usado como um vetor para carregar GFP para transfectar no corpo vítreo do olho do coelho, o que demonstrou que o gene recombinante da isoforma 2 de rAAV2/2-hOPA1 pode ser expresso na retina.

4. Detecção de imunofluorescência de hOPA1

[0175] Trinta dias após a injeção na cavidade vítrea, os globos ocu- lares dos grupos experimentais A e B e do grupo controle foram remo- vidos e transformados em seções de parafina. Os cortes de parafina foram colocados em um forno a 65 °C para secar por 2 h, submetidos à desparafinização até serem colocados em água e enxaguados com PBS três vezes por 5 min cada. As seções foram colocadas em solução tam- pão de EDTA para passarem por reparo de micro-ondas, seguido por desligamento da energia após fervura em fogo médio, repousando 10 min em intervalo e colocando as seções em fogo baixo até ferver. Após o arrefecimento natural, as seções foram lavadas com PBS 3 vezes por 5 min cada. Os cortes foram colocados em solução de peróxido de hi- drogênio a 3% e incubados à temperatura ambiente por 10 min. As se- ções foram lavadas com PBS 3 vezes por 5 min cada e bloqueadas com 5% BSA por 20 min após a secagem por centrifugação. A solução de BSA foi removida, seguida pela adição de 50 μl de anticorpo primário diluído a cada seção para cobrir o tecido e repousar durante a noite a 4 °C. Então, as seções foram lavadas com PBS três vezes por 5 min cada. A solução de PBS foi removida, 50 μl-100 μl de anticorpos secundários fluorescentes das espécies correspondentes foram adicionados a cada seção e as seções foram incubadas longe da luz à temperatura ambi- ente por 50 min-1 h. As seções foram lavadas com PBS longe da luz por 3 vezes, 5 min cada vez. A solução de PBS foi removida. 50-100 μl de DAPI foram adicionados a cada seção para colorir os núcleos longe da luz por 5 min. As seções foram lavadas com PBS por 3 vezes, 5 min cada vez. Depois que as seções foram ligeiramente secas, as seções foram montadas com um meio de montagem anti-fluorescência e arma- zenadas longe da luz a 4 °C prontas para fotografar.

[0176] Os resultados da imunofluorescência anti-hOPA1 de retina foram mostrados na Fig. 7 e a intensidade de fluorescência do grupo experimental A foi significativamente superior à do grupo experimental B, com uma diferença significativa e um aumento de mais de uma vez. Foi demonstrado que a quantidade de expressão de hOPA1 na retina do grupo experimental A foi significativamente superior à do grupo con- trole e no grupo experimental B.

5. Detecção de OCT

[0177] Os resultados mostraram que a espessura da camada de fi- bras do nervo da retina do grupo experimental A e do grupo experimen- tal B foi de 67,55 μm e 66,00 μm, respectivamente, sem nenhuma dife- rença significativa (P > 0,05, Fig. 8).

6. Detecção de HE

[0178] Os resultados de HE mostraram que o número de células ganglionares da retina nos grupos experimentais e no grupo controle era substancialmente o mesmo e as estruturas estavam completas, in- dicando que o gene recombinante rAAV-hOPA1 é seguro e não causa danos à retina (Fig. 9).

7. PCR em tempo real para detectar a expressão de hOPA1

[0179] Primeiramente, um software de análise de domínio conser- vado do NCBI foi usado para analisar a estrutura conservada de hOPA1 para garantir que os fragmentos amplificados com os primers projetados estivessem localizados na região não conservada; e, então, os primers foram projetados usando o Primer premier 5 de acordo com os princí- pios de projeto de primer de PCR quantitativa fluorescente: Actina F de coelho: Actina R de coelho:

hOPA1-F original: hOPA1-R original: hOPA1-F otimizada: hOPA1-R otimizada: 1) Extração de RNA e transcrição reversa

[0180] Um kit TRIZOL foi usado para extrair RNA total da retina de coelho em diferentes grupos experimentais e a transcrição reversa foi realizada para produzir um padrão de cDNA. 2) Sistema de reação de PCR quantitativa de fluorescência e procedi- mento de reação

[0181] A PCR quantitativa fluorescente foi realizada no Sistema de Detecção de PCR em Tempo Real. 12,5 μL de mistura SYBR Green, 8 μL de ddH2O, 1 μL de cada um de um par de primers, 2,5 μL de amostra de cDNA foram adicionados a um tubo de reação de PCR de 0,2 mL e o sistema total foi de 25 μL. Cada amostra foi usada para a amplificação do gene de interesse e do gene de referência interna actina de coelho, e a amplificação de cada gene foi feita em três repetições. Ao adicionar amostras de fato, a fim de reduzir o erro, os reagentes que eram comuns em cada tubo de reação de PCR podem ser adicionados juntos e então aliquotados. A PCR quantitativa fluorescente foi realizada após comple- tar a adição de amostra.

[0182] A amplificação foi realizada de acordo com os seguintes pro- cedimentos de reação: total de 40 ciclos de pré-desnaturação a 95°C por 1 s, desnaturação a 94°C por 15 s, anelamento a 55°C por 15 s e extensão a 72°C por 45 s e os sinais de fluorescência foram coletados durante a etapa de extensão de cada ciclo. A curva de desnaturação a 94°C-55°C foi analisada após a reação ser completada.

[0183] O método quantitativo relativo 2-ΔΔCT (Livak et al., 2001) foi usado para estudar a diferença na quantidade de expressão gênica. Esse método não precisou fazer uma curva padrão; o gene de limpeza actina de coelho foi usado como gene de referência interna e o software de análise que acompanha o instrumento pode gerar automaticamente os valores de expressão.

[0184] Os resultados foram mostrados na Fig. 10, a quantidade de expressão relativa de mRNA do gene hOPA1 no grupo experimental A e no grupo experimental B foram ambas superiores à quantidade de ex- pressão relativa do gene hOPA1 no grupo controle e o nível de expres- são relativa de mRNA no grupo experimental A é ligeiramente superior ao do grupo experimental B.

8. Western blot para detectar a expressão da proteína hOPA1

[0185] As retinas de globos oculares de coelhos em diferentes gru- pos experimentais foram removidas, uma solução de lise RIPA de volu- mes correspondentes foi adicionada de acordo com 100 μL/50 mg de tecidos, seguida por homogeneização com um homogeneizador e cen- trifugação para coletar o sobrenadante. Após a concentração de prote- ína ter sido determinada pelo método BCA, os volumes de carrega- mento da amostra dos grupos experimentais e do grupo controle foram calculados de acordo com a proteína total de 50 μg e electroforese em gel SDS-PAGE e Western blot foram realizados. O desenvolvimento de ECL foi realizado após incubação com um anticorpo.

[0186] Os resultados foram mostrados na Fig. 11, o nível de expres- são relativa de hOPA1 no grupo experimental A (1,13) por Western blot foi significativamente superior ao do grupo experimental B (0,19) e no grupo controle (0,05) com uma diferença significativa P > 0,05, indi- cando que o nível de expressão de hOPA1 em retina no grupo experi- mental A foi significativamente aumentado, que foi cerca de 5 vezes e 22 vezes superior ao do grupo experimental B e do grupo controle, res- pectivamente. Exemplo 3: experimento sobre os efeitos do vírus adeno-associado re-

combinante rAAV2-hOPA1 em ADOA (atrofia óptica autossômica domi- nante)

1. Injeção na cavidade vítrea de olho de camundongos

[0187] A camundongos C57BL/6J de tipo selvagem foram adminis- trados por meio da cavidade vítrea e os camundongos foram agrupados aleatoriamente, 2 camundongos/gaiola, administrados com rAAV2/2- OPA1 a uma concentração de 2E11vg / ml e um volume de 1 μL por meio de injeção subvítrea. Os camundongos foram divididos em um grupo de 7 dias, um grupo de 15 dias, um grupo de 20 dias, um grupo de 30 dias, um grupo de 45 dias, um grupo de 60 dias e um grupo de 90 dias após a administração. Os camundongos de diferentes grupos foram sacrificados quando a data especificada foi atingida, amostras de globo ocular foram obtidas e a detecção e análise relevantes foram realizadas.

2. PCR em tempo real para detectar a expressão de hOPA1

[0188] Como os métodos e etapas descritos no Exemplo 2, extração de RNA total, determinação da concentração de RNA e identificação por electroforese, transcrição reversa e identificação por PCR em tempo real foram realizadas, em que as sequências de primer usadas foram: Primer F: Primer R:

[0189] Condições de reação usadas: a amplificação foi realizada de acordo com os procedimentos de reação de 40 ciclos de pré-desnatura- ção a 95°C por 3 min, desnaturação a 95°C por 10 s, anelamento a 60°C por 15 s e extensão a 72°C por 25 s e sinais de fluorescência foram coletados durante a etapa de extensão de cada ciclo. A curva de des- naturação a 95 °C-60 °C foi analisada após a reação ter sido comple- tada.

[0190] O método quantitativo relativo 2-ΔΔCT (Livak et al., 2001) foi usado para estudar a diferença na quantidade de expressão gênica.

Esse método não precisou fazer uma curva padrão; o gene de limpeza actina foi usado como o gene de referência interna e o software de aná- lise que acompanha o instrumento pode gerar automaticamente os va- lores de expressão.

[0191] Os resultados foram mostrados na Fig. 11: após injeção usando vírus rAAV2-OPA1 nas cavidades vítreas dos olhos dos camun- dongos, todos os genes de interesse no dia 7, dia 15, dia 20, dia 30, dia 45, dia 60 e dia 90 detectados por RT-PCR foram superiores ao nível antes da administração e a quantidade de expressão aproximadamente do dia 20 ao dia 30 foi a mais alta. Exemplo 4: Construção e identificação de camundongos modelo de ADOA (atrofia óptica autossômica dominante)

1. Tecnologia CRISPR/Cas9 foi utilizada para realizar mutação pontual OPA1 Q285Stop de camundongo e o exon mutado era o exon8 (região de GTPase altamente conservada (exons 8-16)). Um alvo que termina com NGG foi projetado no sítio de mutação e clivado com a ação de CRISPR/Cas9. Um doador de cerca de 120 bp foi construído in vitro e o doador exógeno foi inserido no sítio de clivagem por recombinação ho- móloga. O projeto de RNA-guia, a estrutura OPA1 e a estratégia de pro- jeto foram mostrados na Fig. 12.

[0192] Entre eles estavam: região de codificação (maiúsculas), re- gião de não codificação (preto) e região de íntron (minúscula);

2. Construção de camundongos modelo de ADOA (atrofia óptica autos- sômica dominante) (1) uma tecnologia CRISPR-CAS9 foi usada para construir um plasmí- deo recombinante que tem mutação pontual OPA1 Q285Stop, seguido por substituição com uma sequência de DNA que tem um marcador se- lecionável para mutação homóloga para obter uma célula-tronco embri- onária monoclonal que tem uma mutação pontual Q285Stop OPA1 po- sitiva; (2) camundongos quiméricos foram preparados usando o clone de cé- lulas-tronco embrionárias de camundongo que tinham uma mutação pontual OPA1 obtido na etapa (1); (3) permitiu-se que os camundongos quiméricos obtidos na etapa (2) acasalassem com camundongos normais de tipo selvagem e, então, procriassem e a prole foi triada por camundongos heterozigóticos que tivessem a mutação pontual OPA1; (4) um camundongo homozigótico que tem mutação pontual OPA1 Q (glutamina) 285Stop foi obtido através do acasalamento mútuo dos he-

terozigóticos obtidos na etapa (3), obtendo assim um modelo de camun- dongo de mutação pontual OPA1 Q (glutamina) 285Stop.

3. Identificação de camundongos modelo de mutação pontual de ADOA (atrofia óptica autossômica dominante)

3.1 Extração de DNA genômico (1) Digestão: um dedo do pé de camundongo de 0,5 cm foi cortado de um camundongo dentro de uma semana após o nascimento e adicio- nado a um tubo EP de 1,5 ml e submetido a uma ligeira centrifugação, seguido por adição de 500 μl de solução de lise (formulação: 100 mM Tris pH 8,0, 5 mM EDTA pH 8,0, SDS 0,5%, NaCl 1,17 g/100 ml), 0,5 μl de proteinase K (concentração: 20 mg/ml, dissolvido em 20 mM Tris pH 7,4 e CaCl2 1 mM, tampão de glicerol a 50%, armazenado a -20 °C), misturando uniformemente e digerindo em banho-maria a 55 °C durante a noite; (2) Extração de DNA por meio de precipitação com isopropanol: 1) O tubo de centrífuga foi tirado da chaleira de banho-maria e deixado em repouso à temperatura ambiente por 10-15 min para baixar a tem- peratura da amostra à temperatura ambiente e o tubo de centrífuga foi invertido para misturar uniformemente. A centrifugação foi realizada a

13.000 rpm à temperatura ambiente por 15 min. 2) 400 μl de sobrenadante foram pipetados em outro novo tubo de cen- trífuga. Um volume igual de isopropanol foi adicionado e o tubo foi ime- diatamente virado de cabeça para baixo gentilmente para misturar com- pletamente; quando um precipitado floculento branco apareceu, a cen- trifugação foi realizada a 12.000 rpm à temperatura ambiente por 10 min e o sobrenadante foi descartado. 3) 700 μl de etanol 75% gelado foram adicionados ao tubo de centrífuga para enxaguar o produto e o tubo foi virado de cabeça para baixo gen- tilmente para misturar uniformemente. A centrifugação foi realizada a

12.000 rpm à temperatura ambiente por 5 min e todo o sobrenadante foi descartado. 4) O tubo de centrífuga foi virado de cabeça para baixo sobre um papel absorvente para absorver o etanol. Após a secagem ao ar, o DNA foi dissolvido em 50 μl de ddH2O estéril, a dissolução foi permitida a 55 °C por 2 h (se não fosse usado imediatamente, armazenado a -20 ° C). 5) A concentração de DNA foi determinada e 100-200 ng de DNA foram tirados e usados como padrão de PCR.

3.2 Primers e reação de PCR

[0193] Um par de primers foi sintetizado de modo a obter um pro- duto de amplificação de ácido nucleico (comprimento de 530 pb) con- tendo o sítio Q285 através de amplificação por PCR.

3.3 Resultados de identificação

[0194] O DNA total dos camundongos foi extraído e os produtos da PCR foram sequenciados.

[0195] Os resultados foram mostrados na Fig. 13, que mostrou que a base C na posição 285 sofreu mutação em T, indicando que o camun- dongo mutante pontual foi preparado com sucesso. Exemplo 5: Experiência de Melhoria de camundongos modelo de muta- ção pontual de ADOA (atrofia óptica autossômica dominante) com vírus adeno-associado recombinante rAAV2-hOPA1

1. Método

[0196] Camundongos mutantes OPA1 de 2 camundongos/gaiola fo- ram tirados e divididos em 3 grupos. A concentração de rAAV-OPA1 foi de 2E11vg/ml e o volume de administração foi de 1 μL e os camundon- gos foram injetados por via subvítrea. Os camundongos em diferentes grupos foram sacrificados após um mês e três meses para obter amos- tras de globo ocular. O grupo mutante OPA foi injetado por via subvítrea com 1 μL de PBS e os camundongos selvagens de 2 camundongos/gai- ola foram tomados e foram injetados por via subvítrea com 1 μL de PBS como grupo controle. Detecção e análise foram realizadas para as mu- danças de conteúdo de ATP e observação da morfologia mitocondrial.

2. Mudanças de conteúdo de ATP na retina de camundongos após a administração por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC).

2.1 A retina de camundongos do tipo selvagem e camundongos mutan- tes OPA1 após a administração foi tirada e lavada uma vez com PBS pré-arrefecido e colocada em nitrogênio líquido

2.2 Extração de ATP (1) Moagem de nitrogênio líquido (2) 1 ml de fenol-TE gelado (que contém DTT), 200 μl de clorofórmio e 150 μl de água ultrapura foram adicionados, seguido por agitação e mis- tura uniformemente a 4°C por 20 s e realização de centrifugação a

10.000 g por 10 min (3) 200 μl de fase aquosa foram tirados, filtrados com membrana de filtro de 0,22 μm e carregados em uma máquina para detectar ATP por HPLC (4) A concentração de proteína foi determinada usando o método BCA

2.3 Método de análise cromatográfica

[0197] Coluna cromatográfica: Sepax GP-C18, (4,6 mm x 250 mm, 5 μm)

[0198] Fase móvel A: KH2PO4 15 mM, KCL 15 mM e KOH 0,1 M usados para ajustar o pH a 6,0

[0199] Fase móvel B: 85% da fase móvel A misturada com 15% de acetonitrila

[0200] Volume de carregamento: 20 μl

[0201] Comprimento de onda de detecção: 254 nm

[0202] Condições de eluição do gradiente: Tempo (min) Fase móvel A (%) Fase móvel B (%) Taxa de fluxo 0 100 0 0,54 ml/min 0,28 97 3 0,54 ml/min 9,72 91 9 0,54 ml/min

13,89 0 100 0,54 ml/min 19,44 0 100 0,54 ml/min 33 100 0 0,54 ml/min 44 100 0 0,54 ml/min

[0203] Os resultados foram mostrados na Fig. 14: a detecção de HPLC concluiu que o conteúdo de ATP nos camundongos mutantes OPA1 no grupo controle foi diminuído, enquanto no grupo experimental, em que os vírus rAAV2-OPA1 foram injetados nas cavidades vítreas dos globos oculares dos camundongos, o conteúdo aumentou para um nível normal após a administração, indicando que o conteúdo de ATP pode ser restaurado após a administração de OPA1.

[0204] Pode ser visto a partir da Fig. 14 que após 1 mês de admi- nistração e 3 meses de administração, o conteúdo de ATP nos globos oculares dos camundongos aumentou com o tempo; o conteúdo de ATP nos globos oculares dos camundongos mutantes OPA1 até 3 meses após a administração era equivalente ao conteúdo de ATP nos globos oculares dos camundongos do tipo selvagem, sugerindo que o uso de vírus rAAV2-OPA1 reverteu efetivamente a ocorrência da doença.

3. Observação da morfologia das mitocôndrias por microscópio eletrô- nico de transmissão (TEM)

[0205] Após os globos oculares do camundongo terem sido tirados, eles foram respectivamente imersos em glutaraldeído 2,5%, fixados du- rante a noite, lavados com solução tampão de fosfato 0,1 mol/L 3 vezes por 15 min de cada vez, fixados com ácido ósmico por 2 h e lavados com solução de tampão de fosfato 0,1 mol/L 3 vezes por 15 min de cada vez e desidratação gradiente foi realizada usando etanol (50%, 70%, 80%, 90%, 100%), seguido por transição para usar acetona pura e de- sidratação com acetona pura duas vezes. Cada etapa durou 15 minutos. A penetração do gradiente foi realizada usando 812 resina:acetona com as proporções de 3:1, 3:2 e 3:3 com cada etapa durando 40 minutos, seguida por incorporação com um agente de incorporação puro a 45 °C durante a noite, polimerizando a 60 °C, secção, coloração e observação no microscópio eletrônico de transmissão.

[0206] Os resultados foram apresentados na Fig. 15, a microscopia eletrônica de TEM observou o desaparecimento de cristas mitocondriais em camundongos mutantes OPA1, indicando a ocorrência de apoptose. A recuperação das cristas mitocondriais em camundongos mutantes OPA1 foi observada 1 mês após a administração e recuperação signifi- cativa foi observada após 3 meses, sugerindo que o uso do vírus rAAV2- OPA1 reverteu de efetivamente a ocorrência da doença. Discussão

[0207] Com o rápido desenvolvimento da terapia gênica no trata- mento de doenças oculares, a cura da ADOA não será difícil. Uma vez que os olhos humanos e os olhos de coelho são semelhantes em ana- tomia e volume, a presente invenção usou olho de coelho como um mo- delo para injeção na cavidade vítrea da isoforma 2 de rAAV2/2-hOPA1. Esse experimento estudou a dosagem da injeção, nível de segurança e complicações pós-operatórias e forneceu referências importantes para ensaios clínicos futuros. Todos os coelhos foram submetidos a exames de lâmpada de fenda e pressão intraocular e não apresentavam anor- malidades óbvias, nem congestão e secreções conjuntivais, nem endof- talmite, nem aumento da pressão intraocular. Fotografias de fundo de olho tiradas um mês após a operação mostraram que nenhum coelho teve complicações óbvias ou danos aos vasos sanguíneos da retina e nervos ópticos, sugerindo que esse experimento era seguro.

[0208] Os resultados de imunofluorescência, PCR quantitativa em tempo real e Western blot podem demonstrar que hOPA1 pode ser ex- pressa de forma estável na retina dos coelhos. Uma vez que as lesões de ADOA podem causar a apoptose de células ganglionares da retina ao redor do disco óptico, uma expressão de fluorescência estável na retina ao redor do disco óptico pode ser detectada nas seções da retina no grupo rAAV-ZsGreen. Os resultados da coloração fluorescente de hOPA1 podem demonstrar que pode atingir as células ganglionares da retina, indicando que a isoforma 2 de rAAV2/2-hOPA1 pode atingir a área doente no olho do paciente. Os resultados de fotografia do fundo de olho e OCT mostraram que uma única injeção na cavidade vítrea de 5 x 1010 vg/mL isoforma 2 de rAAV2/2-hOPA1 era segura e não tinha toxicidade da retina e poderia ser usada em ensaios clínicos futuros.

[0209] Todos os documentos referidos na presente invenção são incorporados por referência no presente pedido como se cada docu- mento fosse individualmente incorporado por referência. Além disso, deve ser entendido que após ler os ensinamentos da presente invenção descritos acima, um versado na técnica pode fazer várias mudanças ou modificações à presente invenção e essas formas equivalentes também se enquadram no escopo como definido pelas reivindicações anexadas do presente pedido.

Claims (20)

REIVINDICAÇÕES

1. Sequência de nucleotídeos, caracterizada pelo fato de que a sequência de nucleotídeos codifica uma GTPase tipo dineína mitocon- drial tipo II humana e a sequência de nucleotídeos inclui uma ou mais sequências de nucleotídeos selecionadas do grupo que consiste em: (a) uma sequência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO: 1; (b) uma sequência de nucleotídeos sendo ≥95%, preferenci- almente ≥98% e, mais preferencialmente ≥99% idêntica à sequência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO: 1; (c) uma sequência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO: 2; e (d) uma sequência de nucleotídeos sendo ≥95%, preferenci- almente ≥98% e, mais preferencialmente, ≥99% idêntica à sequência de nucleotídeos mostrada na SEQ ID NO: 2.

2. Sequência de nucleotídeos, de acordo com a reivindica- ção 1, caracterizada pelo fato de que a sequência de nucleotídeos é mostrada na SEQ ID No: 1.

3. Ácido nucleico de fusão, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico de fusão compreende a sequência de nucleotídeos, de acordo com a reivindicação 1.

4. Ácido nucleico de fusão, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico de fusão tem uma es- trutura da fórmula I da extremidade 5' à extremidade 3': Z1-Z2-Z3 (I) em que cada "-" é independentemente uma ligação ou uma sequên- cia ligante de nucleotídeo; Z1 é nulo ou uma sequência 5'-UTR;

Z2 é a sequência de nucleotídeos de acordo com a reivindi- cação 1; e Z3 é uma sequência 3'-UTR.

5. Vetor, caracterizado pelo fato de que o vetor compreende a sequência de nucleotídeos, de acordo com a reivindicação 1, ou o ácido nucleico de fusão, de acordo com a reivindicação 3.

6. Vetor, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o vetor é selecionado entre um plasmídeo ou um vetor viral, selecionado, preferencialmente, entre um vetor lentiviral, um vetor de adenovírus, um vetor de vírus adeno-associado ou uma combinação destes.

7. Vetor, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o vetor é um vetor AAV e o sorotipo é selecionado entre AAV2, AAV5, AAV7, AAV8 ou uma combinação destes.

8. Vetor, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o vetor é um vetor AAV no qual a sequência de nucleotídeos ou o ácido nucleico de fusão é inserido.

9. Vetor, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o vetor é selecionado entre um vetor de vírus de DNA ou um vetor retroviral.

10. Célula hospedeira, caracterizada pelo fato de que a cé- lula hospedeira compreende o vetor, de acordo com a reivindicação 5, ou a sequência de nucleotídeos exógena, de acordo com a reivindica- ção 1, ou o ácido nucleico de fusão, de acordo com a reivindicação 3, o qual está integrado no cromossomo da célula hospedeira.

11. Célula hospedeira, de acordo com a reivindicação 10, ca- racterizada pelo fato de que a célula hospedeira é selecionada do grupo que consiste em uma célula 293T, uma célula fotorreceptora (incluindo uma célula cone e/ou uma célula bastonete), outras células visuais

(como uma célula bipolar), uma célula do nervo (óptico) ou uma combi- nação destas.

12. Uso do vetor, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações de 5 a 9, caracterizado pelo fato de que o vetor é usado para preparar uma preparação ou uma composição para restaurar a visão e/ou tratar as doenças oculares em um sujeito.

13. Preparação farmacêutica, caracterizada pelo fato de que a preparação compreende (a) o vetor, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 5 a 9, e (b) um carreador ou excipiente farmaceutica- mente aceitável.

14. Preparação farmacêutica, de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que a forma de dosagem da preparação farmacêutica é selecionada do grupo que consiste em uma preparação liofilizada, uma preparação líquida ou uma combinação destas.

15. Preparação farmacêutica, de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que o teor do vetor (a) na preparação farmacêutica é 1 x 109-1 x 1016 vírus/mL, preferencialmente 1 x 1011-1 x 1013 vírus/mL e, mais preferencialmente, 2 x 1011-1 x 1012 vírus/mL.

16. Uso da preparação farmacêutica, de acordo com a rei- vindicação 13, caracterizada pelo fato de que a preparação farmacêu- tica é usada para o tratamento de doenças oculares, preferencialmente para o tratamento de apoptose de células ganglionares da retina.

17. Uso da preparação farmacêutica, de acordo com a rei- vindicação 13, caracterizado pelo fato de que a preparação farmacêu- tica é usada para o tratamento de neuropatia óptica hereditária, prefe- rencialmente atrofia óptica autossômica dominante (Autosomal Domi- nant Optic Atrophy, ADOA).

18. Método para aumentar a expressão e/ou atividade de uma GTPase tipo dineína mitocondrial por um longo período, caracteri- zado pelo fato de que o método compreende introduzir o vetor, de acordo com as reivindicações de 5 a 9, e/ou administrar a preparação farmacêutica, de acordo com as reivindicações de 13 a 15.

19. Método de tratamento, caracterizado pelo fato de que o método compreende administrar o vetor, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 5 a 9, a um sujeito em necessidade.

20. Método para preparação de uma GTPase tipo dineína mitocondrial tipo II humana recombinante, caracterizado pelo fato de que o método compreende cultivar a célula hospedeira, de acordo com a reivindicação 10, obtendo, assim, a GTPase tipo dineína mitocondrial tipo II humana recombinante.