CN110857440A

CN110857440A - 重组人ⅱ型线粒体动力蛋白样gtp酶基因序列及其应用

Info

Publication number: CN110857440A
Application number: CN201810968173.0A
Authority: CN
Inventors: 李斌
Original assignee: Wuhan Niufusi Biological Technology Co Ltd
Current assignee: Wuhan Niufusi Biological Technology Co Ltd
Priority date: 2018-08-23
Filing date: 2018-08-23
Publication date: 2020-03-03
Anticipated expiration: 2038-08-23
Also published as: CN110857440B; WO2020038473A1; CA3110153A1; JP7285022B2; AU2019323501B2; EP3851535A4; US20210180086A1; EP3851535A1; AU2019323501A1; US11459584B2; MX2021002135A; KR102612148B1; BR112021002566A2; SG11202101236WA; JP2021533801A; KR20210049131A

Abstract

本发明公开了重组人Ⅱ型线粒体动力蛋白样GTP酶基因序列及其应用，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。还公开了一种融合核酸，其包含所述的编码人Ⅱ型线粒体动力蛋白样GTP酶的核酸。进一步公开了一种重组表达载体，其包含上述核酸或融合核酸。还公开了一种转化体，其在宿主中导入上述核酸或融合核酸。本发明所述的编码人Ⅱ型线粒体动力蛋白样GTP酶的核酸表达量更高，因此可在线粒体中获得更多的人Ⅱ型线粒体动力蛋白样GTP酶，能较好地治疗ADOA等眼部疾病。

Description

重组人Ⅱ型线粒体动力蛋白样GTP酶基因序列及其应用

技术领域

本发明涉及生物制剂领域，尤其涉及重组人Ⅱ型线粒体动力蛋白样GTP酶基因序列及其应用。

背景技术

常染色体显性视神经萎缩ADOA(autosomal dominant optic atrophy)是原发性遗传性视神经病变的最常见形式，发病比例约为1:12 000至1:50 000，并在幼年时期隐匿发病。其临床特征表现为轻度至中度逐渐丧失视力，色觉缺陷，中心视野缺损和颞视盘苍白。起初是乳头状血管束的损伤，其次是视神经的上升萎缩和视神经髓鞘的丧失。

ADOA由编码内线粒体膜蛋白和基因座的基因突变引起，国外学者已确定这类基因主要为OPA1-OPA8，其中已初步确认75﹪左右的ADOA患者与OPA1携带的杂合与显性突变有关，其中外显子740、2794位点突变最常见。OPA1蛋白定位于线粒体内膜，控制能量代谢和凋亡，维持嵴和mtDNA完整性，具有GTP酶活。ADOA的发病机制是：突变的OPA1 编码形成多种截短形式蛋白，这些蛋白通常缺乏完整的GTP酶结构域，等同于缺失一个等位基因，将使OPA1的量大幅下降，出现所谓的单倍体不足，从而使线粒体功能出现障碍。碎片化的线粒体的无法为视神经细胞正常供应ATP，RGC细胞逐渐凋亡，从而导致患者发生ADOA。

ADOA目前尚无方法治疗，是世界公认的遗传性视神经病变之一。随着基因治疗的发展，ADOA的基因治疗成为可能，其中的难点在于OPA1外显子剪接的多种形式以及其突变的多种形式，这就造成多样的致病蛋白类型及突变形式，无法用某一种基因药物治疗所有患者。

国外的研究中已有人对OPA1突变导致ADOA的发病机制进行过研究，分析了OPA1转录和基因产物的多种形式，探索了用于重组OPA1蛋白的更优良纯化方式，并通过家族病史的调查分析寻求如何筛选、鉴定及诊断是否携带缺陷性OPA1，同时还展望了OPA1突变导致的ADOA的预前基因诊断及治疗。但目前尚未出现任何类型的人线粒体动力蛋白样GTP 酶基因的重组应用腺相关病毒载体的报道及生产应用。

因此，本领域亟需开发一种治疗效果好的人线粒体动力蛋白样GTP酶的表达体系及制备方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种治疗效果好的人线粒体动力蛋白样GTP酶的表达体系及制备方法。

本发明的目的是提供一种编码人线粒体动力蛋白样GTP酶的优化核酸序列、载体及制备方法。

本发明的第一方面，提供了一种所述核苷酸序列编码人Ⅱ型线粒体动力蛋白样GTP 酶，且所述核苷酸序列选自下组：

(a)所述核苷酸序列如SEQ ID NO.:1所示；和

(b)所述核苷酸序列与SEQ ID NO.:1所示的核苷酸序列有≥95％相同性，优选地≥ 98％，更优选地≥99％。

在另一优选例中，所述核苷酸序列包括DNA序列、cDNA序列、或mRNA序列。

在另一优选例中，所述核苷酸序列包括单链序列和双链序列。

在另一优选例中，所述核苷酸序列包括与SEQ ID NO.:1完全互补的核苷酸序列。

在另一优选例中，所述核苷酸序列如SEQ ID NO.:1所示，其中

第1-288位为MIS的编码序列；

第289-2772位为GTP酶结构域、中枢动力蛋白结构域和GTPase效应结构域的编码序列；

第2773-2775位为终止密码子。

本发明的第二方面，提供了一种融合核酸，所述融合核酸包含如本发明第一方面所述的核苷酸序列。

在另一优选例中，所述融合核酸还包含选自下组的序列：UTR序列、启动子序列、或其组合。

在另一优选例中，所述UTR序列包括3’-UTR和/或5’-UTR。

在另一优选例中，所述UTR序列中含有稳定结构的ployA序列。

在另一优选例中，所述融合核酸从5’端-3’端具有式I结构：

Z1-Z2-Z3 (I)

式中，

各“-”独立地为键或核苷酸连接序列；

Z1为无、或5’-UTR序列；

Z2为如本发明第一方面所述的核苷酸序列；和

Z3为3’-UTR序列。

在另一优选例中，所述的Z1为5’-UTR序列。

在另一优选例中，各个核苷酸连接序列的长度为1-30nt，较佳地1-15nt，更佳地3-6nt。

在另一优选例中，所述的核苷酸连接序列来源于限制性内切酶酶切形成的核苷酸接头序列。

本发明的第三方面，提供了一种载体，所述载体含有如本发明第一方面所述的核苷酸序列或本发明第二方面所述的融合核酸。

在另一优选例中，所述载体包含一个或多个启动子，所述启动子可操作地与所述核酸序列、增强子、转录终止信号、多腺苷酸化序列、复制起点、选择性标记、核酸限制性位点、和/或同源重组位点连接。

在另一优选例中，所述的载体选自下组：质粒、病毒载体。

在另一优选例中，所述的载体选自下组：慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、或其组合。较佳地，所述载体为AAV载体。

在另一优选例中，所述AAV载体的血清型选自：AAV2、AAV5、AAV7、AAV8、或其组合。

在另一优选例中，所述的载体包括DNA病毒、逆转录病毒载体。

在另一优选例中，所述载体为含有或插入有如本发明第一方面所述的核苷酸序列或本发明第二方面所述的融合核酸的AAV载体；较佳地为AAV载体质粒pSNaV。

在另一优选例中，所述载体用于表达重组人Ⅱ型线粒体动力蛋白样GTP酶。

本发明的第四方面，提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞含有本发明第三方面所述的载体，或其染色体中整合有外源的如本发明第一方面所述的核苷酸序列或本发明第二方面所述的融合核酸。

在另一优选例中，所述宿主细胞为哺乳动物细胞，所述哺乳动物包括人和非人哺乳动物。

在另一优选例中，所述宿主细胞选自下组：293T细胞、感光细胞(包括锥状细胞和/或杆状细胞)、其他视觉细胞(如双节细胞)、(视)神经细胞、或其组合。

在另一优选例中，所述宿主细胞选自下组：视杆细胞、视锥细胞、给光双极细胞、撤光双极细胞、水平细胞、神经节细胞、无长突细胞、或其组合。较佳地，所述宿主细胞为(视网膜)神经节细胞。

本发明的第五方面，提供了如本发明第三方面所述的载体的用途，用于制备一制剂或组合物，所述制剂或组合物用于恢复受试者视力和/或治疗眼部疾病。

在另一优选例中，所述眼部疾病为视网膜病变。

在另一优选例中，所述制剂或组合物用于治疗遗传性视神经病变，较佳地为常染色体显性视神经萎缩(ADOA)。

在另一优选例中，所述制剂或组合物用于治疗视网膜神经节细胞凋亡。

本发明的第六方面，提供了一种药物制剂，所述的制剂含有(a)本发明第三方面所述的载体，以及(b)药学上可接受的载体或赋形剂。

在另一优选例中，所述药物制剂的剂型选自下组：冻干制剂、液体制剂、或其组合。

在另一优选例中，所述药物制剂中载体的含量为1×10⁹-1×10¹⁶，较佳地1×10¹²-1×10¹³个病毒/毫升。

在另一优选例中，所述药物制剂用于治疗眼部疾病，较佳地治疗视网膜神经节细胞凋亡。

在另一优选例中，所述药物制剂用于治疗遗传性视神经病变，较佳地为常染色体显性视神经萎缩(ADOA)。

本发明的第七方面，提供了一种治疗方法，所述方法包括将本发明第三方面所述的载体施用于需要的对象。

在另一优选例中，将所述载体引入到需要的对象的眼睛内。

在另一优选例中，所述需要的对象包括人和非人哺乳动物。

在另一优选例中，所述治疗方法为治疗眼部疾病的方法。

在另一优选例中，所述眼部疾病为遗传性视神经病变，较佳地为常染色体显性视神经萎缩(ADOA)。

本发明的第八方面，提供了一种重组人Ⅱ型线粒体动力蛋白样GTP酶的制备方法，包括步骤：培养本发明第四方面所述的宿主细胞，从而得到重组人Ⅱ型线粒体动力蛋白样GTP酶。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了优化核苷酸序列与原人Ⅱ型线粒体动力蛋白样GTP酶基因序列的开放阅读框序列比较。两者的同源性为72.25％(2005/2775)，其中一致的用“|”表示，上行为优化开放阅读框核苷酸序列，下行为原人Ⅱ型线粒体动力蛋白样GTP酶基因序列(未优化的野生编码序列)。

图2显示了OPA1 isforms 2转录本的蛋白结构示意图。

图3显示了从重组克隆中筛选出目的条带为3000bp左右的正确克隆，M:蛋白marker；泳道1：正确的rAAV2/2-hOPA1 isoform 2重组克隆；泳道2：阳性对照；泳道3：阴性对照。

图4显示了重组腺相关病毒质粒pSNaV/rAAV2/2-hOPA1的结构示意图。

图5显示了SDS-PAGE电泳检测rAAV2/2-hOPA1 isoform 2纯度的考马斯亮蓝染色结果。其中，泳道1:蛋白marker；泳道2：rAAV2/2-hOPA1 isoform 2。

图6显示了兔眼玻切镜下眼底拍照，其中A为注射rAAV2/2-ZsGreen组(对照组)，B为注射rAAV2/2-优化hOPA1 isoform 2组(实验组A)。

图7显示了兔眼球切片免疫荧光检测，实验组A为注射rAAV2/2-优化hOPA1isoform 2组，实验B组为注射rAAV2/2-原hOPA1 isoform 2组。

图8显示了兔眼玻切镜下OCT拍照。其中A为注射rAAV2/2-ZsGreen组(对照组)，B为注射rAAV2/2-优化hOPA1 isoform 2组(实验组A)。

图9显示了显微镜下观察到的兔眼球HE切片内的视网膜。其中A为注射 rAAV2/2-ZsGreen组(对照组)，B为注射rAAV2/2-优化hOPA1 isoform 2组(实验组A)。

图10显示了注射不同质粒的家兔眼球视网膜的hOPA1蛋白的实时荧光PCR相对表达量的检测结果，实验组A为注射rAAV2/2-优化hOPA1 isoform 2组，实验B组为注射rAAV2/2-原hOPA1 isoform 2组，对照组为注射rAAV2/2-ZsGreen组。

图11显示了注射不同质粒的家兔眼球视网膜的hOPA1蛋白的western blot检测结果，实验组A为注射rAAV2/2-优化hOPA1 isoform 2组，实验B组为注射rAAV2/2-原hOPA1isoform 2组，对照组为注射rAAV2/2-ZsGreen组。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，对重组人Ⅱ型线粒体动力蛋白样GTP酶(OPA1)基因编码序列进行了针对性优化设计，从而获得了一种特别适合在哺乳动物(如人)细胞中高效转录和高效表达OPA1蛋白的核苷酸序列(SEQ ID NO.:1)，并构建了重组人Ⅱ型线粒体动力蛋白样GTP酶的重组表达载体。实验结果表明，相对于未优化的编码序列，经过特殊优化后的OPA1编码序列(SEQ ID NO.:1)转录效率略有提高，并且表达量显著提高了5倍以上，非常适合在哺乳动物(尤其是人)细胞内表达，能有效治疗ADOA等眼部疾病。在此基础上，发明人完成了本发明。

术语

为了可以更容易地理解本公开，首先定义某些术语。如本申请中所使用的，除非本文另有明确规定，否则以下术语中的每一个应具有下面给出的含义。在整个申请中阐述了其它定义。

术语“约”可以是指在本领域普通技术人员确定的特定值或组成的可接受误差范围内的值或组成，其将部分地取决于如何测量或测定值或组成。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。

如本文所用，术语“含有”或“包括(包含)”可以是开放式、半封闭式和封闭式的。换言之，所述术语也包括“基本上由…构成”、或“由…构成”。

序列同一性通过沿着预定的比较窗(其可以是参考核苷酸序列或蛋白的长度的50％、 60％、70％、80％、90％、95％或100％)比较两个对齐的序列，并且确定出现相同的残基的位置的数目来确定。通常地，这表示为百分比。核苷酸序列的序列同一性的测量是本领域技术人员熟知的方法。

如本文使用的，术语“受试者”、“需要的对象”指任何哺乳动物或非哺乳动物。哺乳动物包括但不限于人类、脊椎动物诸如啮齿类、非人类灵长类、牛、马、狗、猫、猪、绵羊、山羊。

OPA1(optic atrophy 1)

如本文所用，术语“(重组)人Ⅱ型线粒体动力蛋白样GTP酶”、“视神经萎缩症蛋白1”、“OPA1(蛋白)”、“hOPA1(蛋白)”、“多肽”、“本发明多肽”和“本发明蛋白”具有相同的意义，在本文可互换使用。OPA1是位于线粒体内膜具有GTPase活性的跨膜蛋白，该蛋白包括N-末端跨膜区具有线粒体膜插入序列(mitochondrial import sequence, MIS)、跨膜区域(TR)和疏水区域(HR)，GTPase结构域，中枢动力蛋白结构域和C-末端具有GTPase效应结构域(GTPase effector domain,GED)。OPA1的MIS多肽的功能是引导 GTP蛋白进入到线粒体中。

腺相关病毒

腺相关病毒(adeno-associated virus，AAV),也称腺伴随病毒,属于微小病毒科依赖病毒属,是目前发现的一类结构最简单的单链DNA缺陷型病毒，需要辅助病毒(通常为腺病毒)参与复制。它编码两个末端的反向重复序列(ITR)中的cap和rep基因。ITRs对于病毒的复制和包装具有决定性作用。cap基因编码病毒衣壳蛋白，rep基因参与病毒的复制和整合。AAV能感染多种细胞。

重组腺相关病毒载体(rAAV)源于非致病的野生型腺相关病毒，由于其安全性好、宿主细胞范围广(分裂和非分裂细胞)、免疫源性低，在体内表达外源基因时间长等特点，被视为最有前途的基因转移载体之一，在世界范围内的基因治疗和疫苗研究中得到广泛应用。经过10余年的研究，重组腺相关病毒的生物学特性己被深入了解，尤其是其在各种细胞、组织和体内实验中的应用效果方面已经积累了许多资料。在医学研究中，rAAV被用于多种疾病的基因治疗的研究(包括体内、体外实验)；同时作为一种有特点的基因转移载体，还广泛用于基因功能研究、构建疾病模型、制备基因敲除鼠等方面。

在本发明一个优选的实施例中，载体为重组AAV载体。AAV是相对较小的DNA病毒，其可以稳定和位点特异性方式整合到它们所感染的细胞的基因组中。它们能够感染一大系列的细胞而不对细胞生长、形态或分化产生任何影响，并且它们似乎并不涉及人体病理学。AAV基因组己被克隆、测序及表征。AAV含有大约4700碱基并在每个末端包含约145个碱基的反向末端重复序列(ITR)区域，其作为病毒的复制起点。该基因组的其余被分成两个带有衣壳化功能的重要区域：包含涉及病毒复制和病毒基因表达的rep基因的基因组左边部分；以及包含编码病毒衣壳蛋白的cap基因的基因组右边部分。

AAV载体可采用本领域的标准方法制备。任何血清型的腺相关病毒均是合适的。用于纯化载体的方法可见于例如美国专利No.6566118、6989264和6995006，它们的公开内容整体以引用方式并入本文。杂合载体的制备在例如PCT申请No.PCT/US2005/027091中有所描述，该申请的公开内容整体以引用方式并入本文。用于体外和体内转运基因的衍生自AAV的载体的使用己有描述(参见例如国际专利申请公布No.WO91/18088和 WO93/09239；美国专利No.4,797,368、6,596,535和5,139,941，以及欧洲专利No.0488528，它们均整体以引用方式并入本文)。这些专利公布描述了其中rep和/或cap基因缺失并被所关注的基因替换的各种来源于AAV的构建体，以及这些构建体在体外(进入培养的细胞中)或体内(直接进入生物体)转运所关注的基因的用途。复制缺陷重组AAV可通过将以下质粒共转染进被人类辅助病毒(例如腺病毒)感染的细胞系而制备：所含的所关注核酸序列的侧翼为两个AAV反向末端重复序列(ITR)区域的质粒，和携带AAV衣壳化基因(rep和cap 基因)的质粒。然后通过标准技术纯化所产生的AAV重组体。

在一些实施方案中，重组载体被衣壳化到病毒粒子(例如包括但不限于AAV1、AAV2、 AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、 AAV15和AAV16的AAV病毒粒子)中。因此，本公开包括含有本文所述的任何载体的重组病毒粒子(因其包含重组多核苷酸而为重组的)。产生这样的粒子的方法是本领域己知的，并在美国专利No.6,596,535中有所描述。

核酸编码序列

本发明的要解决的技术问题是克服现有技术中重组人Ⅱ型线粒体动力蛋白样GTP酶表达量不高、治疗效果不佳的技术缺陷。本发明的目的是提供一种重组人Ⅱ型线粒体动力蛋白样GTP酶优化基因序列。重组人Ⅱ型线粒体动力蛋白样GTP酶基因，其优化CDS核苷酸序列SEQ ID NO：1所示，其大小为2775bp，起始于密码子ATG，编码924个氨基酸，其中1到288bp是OPA1-MIS的编码序列，编码96个氨基酸的肽链，其功能是引导GTP 蛋白进入到线粒体中，发挥其生理功能；289到2772bp，编码828个氨基酸的肽链，是 GTP功能蛋白，最后3bp为终止密码子。经研究发现，本发明优化的OPA1基因序列(SEQ ID NO.:1)，使OPA1蛋白表达效率更高，有更多的OPA1蛋白在患者视神经节细胞发挥生理作用。

本发明所述的编码人Ⅱ型线粒体动力蛋白样GTP酶的核酸，其核苷酸序列如SEQID NO.:1所示。在另一优选例中，所述核苷酸序列与SEQ ID NO.:1所示的核苷酸序列有≥95％相同性，优选地≥98％，更优选地≥99％。在本发明中，所述编码人Ⅱ型线粒体动力蛋白样GTP酶的核酸又称作OPA1优化基因或OPA1优化核酸。

本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。在另一优选例中，所述核苷酸为DNA。 DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。本发明所述的核苷酸序列编码SEQ ID NO.:3所示的氨基酸序列。OPA1-MIS信号肽，定向引导该蛋白进入线粒体，被蛋白酶水解后，成熟的OPA1 isoform2蛋白进入线粒体发挥作用。

MWRLRRAAVACEVCQSLVKHSSGIKGSLPLQKLHLVSRSIYHSHHPTLKLQRPQLRTSFQQFSSLTNLPLRKL KFSPIKYGYQPRRNFWPARLATRLLKLRYLILGSAVGGGYTAKKTFDQWKDMIPDLSEYKWIVPDIVWEIDEYIDFG SPEETAFRATDRGSESDKHFRKVSDKEKIDQLQEELLHTQLKYQRILERLEKENKELRKLVLQKDDKGIHHRKLKKS LIDMYSEVLDVLSDYDASYNTQDHLPRVVVVGDQSAGKTSVLEMIAQARIFPRGSGEMMTRSPVKVTLSEGPHHVAL FKDSSREFDLTKEEDLAALRHEIELRMRKNVKEGCTVSPETISLNVKGPGLQRMVLVDLPGVINTVTSGMAPDTKET IFSISKAYMQNPNAIILCIQDGSVDAERSIVTDLVSQMDPHGRRTIFVLTKVDLAEKNVASPSRIQQIIEGKLFPMK ALGYFAVVTGKGNSSESIEAIREYEEEFFQNSKLLKTSMLKAHQVTTRNLSLAVSDCFWKMVRESVEQQADSFKATR FNLETEWKNNYPRLRELDRNELFEKAKNEILDEVISLSQVTPKHWEEILQQSLWERVSTHVIENIYLPAAQTMNSGT FNTTVDIKLKQWTDKQLPNKAVEVAWETLQEEFSRFMTEPKGKEHDDIFDKLKEAVKEESIKRHKWNDFAEDSLRVI QHNALEDRSISDKQQWDAAIYFMEEALQARLKDTENAIENMVGPDWKKRWLYWKNRTQEQCVHNETKNELEKMLKCN EEHPAYLASDEITTVRKNLESRGVEVDPSLIKDTWHQVYRRHFLKTALNHCNLCRRGFYYYQRHFVDSELECNDVVL FWRIQRMLAITANTLRQQLTNTEVRRLEKNVKEVLEDFAEDGEKKIKLLTGKRVQLAEDLKKVREIQEKLDAFIEAL HQEK(SEQ ID NO.:3)

核酸序列可以是DNA、RNA、cDNA或PNA。核酸序列可以是基因组的、重组的或合成的。核酸序列可以是分离的或纯化的。核酸序列可以是单链或双链的。优选地，核酸序列将编码如本文描述的光敏蛋白。核酸序列可以通过克隆衍生，例如使用包括限制性酶切、连接、凝胶电泳的标准的分子克隆技术，例如在Sambrook等Molecular Cloning:Alaboratory manual,Cold Spring Harbour Laboratory Press)中描述的。核酸序列可是分离的，例如使用PCR技术分离的。分离意指从任何杂质和从被自然地发现与其来源中的核酸序列缔合的其他核酸序列和/或蛋白中分离核酸序列。优选地，其还将不含细胞材料、培养基或来自纯化/生产过程的其他化学物质。核酸序列可以是合成的，例如通过直接的化学合成产生。核酸序列可以作为裸露的核酸被提供，或可与蛋白或脂质复合提供。

本发明的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据已公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明多肽(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或多肽编码序列经基因工程产生的宿主细胞。上述多核苷酸、载体或宿主细胞可以是分离的。

如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。

在本发明较佳的实施方式中，所述核苷酸序列如SEQ ID NO.:1所示。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法被优选用于获得本发明的基因。用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术利用所述宿主细胞表达OPA1蛋白的方法。

通过常规的重组DNA技术，可利用本发明的多核苷酸序列获得表达本发明OPA1蛋白的宿主细胞(如哺乳动物细胞)。一般来说包括步骤：将本发明第一方面所述的多核苷酸或本发明第三方面所述的载体转导入宿主细胞内。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含本发明多肽的编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。

包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达多肽。

宿主细胞可以是原核细胞，或是低等真核细胞，或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞 (包括人和非人哺乳动物)。代表性例子有：CHO、NS0、COS7、或293细胞的动物细胞等。在本发明的一个优选实施方式中，选择293T细胞、感光细胞(包括锥状细胞和/或杆状细胞)、其他视觉细胞(如双节细胞)、神经细胞为宿主细胞。在另一优选例中，所述宿主细胞选自下组：视杆细胞、视锥细胞、给光双极细胞、撤光双极细胞、水平细胞、神经节细胞、无长突细胞、或其组合。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl₂。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的蛋白质。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导) 诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在上面的方法中的多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

序列优化

在本发明中，提供了优化的、特别适合在哺乳动物细胞中表达的重组人Ⅱ型线粒体动力蛋白样GTP酶的编码序列，所述编码序列如SEQ ID NO.:1所示。

如本文所用，所述“优化的OPA1编码序列”、“优化OPA1编码基因”均指一种用于编码重组人Ⅱ型线粒体动力蛋白样GTP酶的核苷酸序列，所述的核苷酸序列编码SEQ ID NO.:3所示的氨基酸序列。

在本发明中，所述重组人Ⅱ型线粒体动力蛋白样GTP酶的野生DNA编码序列(未优化的DNA编码序列)如SEQ ID NO.:2所示。所述未优化的野生DNA编码序列的表达量很低。

野生Homo sapiens:OPA1 isoform2 CDS 2775bp

ATGTGGCGACTACGTCGGGCCGCTGTGGCCTGTGAGGTCTGCCAGTCTTTAGTGAAACACAGCTCTGGAATAA AAGGAAGTTTACCACTACAAAAACTACATCTGGTTTCACGAAGCATTTATCATTCACATCATCCTACCTTAAAGCTT CAACGACCCCAATTAAGGACATCCTTTCAGCAGTTCTCTTCTCTGACAAACCTTCCTTTACGTAAACTGAAATTCTC TCCAATTAAATATGGCTACCAGCCTCGCAGGAATTTTTGGCCAGCAAGATTAGCTACGAGACTCTTAAAACTTCGCT ATCTCATACTAGGATCGGCTGTTGGGGGTGGCTACACAGCCAAAAAGACTTTTGATCAGTGGAAAGATATGATACCG GACCTTAGTGAATATAAATGGATTGTGCCTGACATTGTGTGGGAAATTGATGAGTATATCGATTTTGGTTCTCCGGA AGAAACGGCGTTTAGAGCAACAGATCGTGGATCTGAAAGTGACAAGCATTTTAGAAAGGTGTCAGACAAAGAGAAAA TTGACCAACTTCAGGAAGAACTTCTGCACACTCAGTTGAAGTATCAGAGAATCTTGGAACGATTAGAAAAGGAGAAC AAAGAATTGAGAAAATTAGTATTGCAGAAAGATGACAAAGGCATTCATCATAGAAAGCTTAAGAAATCTTTGATTGA CATGTATTCTGAAGTTCTTGATGTTCTCTCTGATTATGATGCCAGTTATAATACGCAAGATCATCTGCCACGGGTTG TTGTGGTTGGAGATCAGAGTGCTGGAAAGACTAGTGTGTTGGAAATGATTGCCCAAGCTCGAATATTCCCAAGAGGA TCTGGGGAGATGATGACACGTTCTCCAGTTAAGGTGACTCTGAGTGAAGGTCCTCACCATGTGGCCCTATTTAAAGA TAGTTCTCGGGAGTTTGATCTTACCAAAGAAGAAGATCTTGCAGCATTAAGACATGAAATAGAACTTCGAATGAGGA AAAATGTGAAAGAAGGCTGTACCGTTAGCCCTGAGACCATATCCTTAAATGTAAAAGGCCCTGGACTACAGAGGATG GTGCTTGTTGACTTACCAGGTGTGATTAATACTGTGACATCAGGCATGGCTCCTGACACAAAGGAAACTATTTTCAG TATCAGCAAAGCTTACATGCAGAATCCTAATGCCATCATACTGTGTATTCAAGATGGATCTGTGGATGCTGAACGCA GTATTGTTACAGACTTGGTCAGTCAAATGGACCCTCATGGAAGGAGAACCATATTCGTTTTGACCAAAGTAGACCTG GCAGAGAAAAATGTAGCCAGTCCAAGCAGGATTCAGCAGATAATTGAAGGAAAGCTCTTCCCAATGAAAGCTTTAGG TTATTTTGCTGTTGTAACAGGAAAAGGGAACAGCTCTGAAAGCATTGAAGCTATAAGAGAATATGAAGAAGAGTTTT TTCAGAATTCAAAGCTCCTAAAGACAAGCATGCTAAAGGCACACCAAGTGACTACAAGAAATTTAAGCCTTGCAGTA TCAGACTGCTTTTGGAAAATGGTACGAGAGTCTGTTGAACAACAGGCTGATAGTTTCAAAGCAACACGTTTTAACCT TGAAACTGAATGGAAGAATAACTATCCTCGCCTGCGGGAACTTGACCGGAATGAACTATTTGAAAAAGCTAAAAATG AAATCCTTGATGAAGTTATCAGTCTGAGCCAGGTTACACCAAAACATTGGGAGGAAATCCTTCAACAATCTTTGTGG GAAAGAGTATCAACTCATGTGATTGAAAACATCTACCTTCCAGCTGCGCAGACCATGAATTCAGGAACTTTTAACAC CACAGTGGATATCAAGCTTAAACAGTGGACTGATAAACAACTTCCTAATAAAGCAGTAGAGGTTGCTTGGGAGACCC TACAAGAAGAATTTTCCCGCTTTATGACAGAACCGAAAGGGAAAGAGCATGATGACATATTTGATAAACTTAAAGAG GCTGTTAAGGAAGAAAGTATTAAACGACACAAGTGGAATGACTTTGCGGAGGACAGCTTGAGGGTTATTCAACACAA TGCTTTGGAAGACCGATCCATATCTGATAAACAGCAATGGGATGCAGCTATTTATTTTATGGAAGAGGCTCTGCAGG CTCGTCTCAAGGATACTGAAAATGCAATTGAAAACATGGTGGGTCCAGACTGGAAAAAGAGGTGGTTATACTGGAAG AATCGGACCCAAGAACAGTGTGTTCACAATGAAACCAAGAATGAATTGGAGAAGATGTTGAAATGTAATGAGGAGCA CCCAGCTTATCTTGCAAGTGATGAAATAACCACAGTCCGGAAGAACCTTGAATCCCGAGGAGTAGAAGTAGATCCAA GCTTGATTAAGGATACTTGGCATCAAGTTTATAGAAGACATTTTTTAAAAACAGCTCTAAACCATTGTAACCTTTGT CGAAGAGGTTTTTATTACTACCAAAGGCATTTTGTAGATTCTGAGTTGGAATGCAATGATGTGGTCTTGTTTTGGCG TATACAGCGCATGCTTGCTATCACCGCAAATACTTTAAGGCAACAACTTACAAATACTGAAGTTAGGCGATTAGAGA AAAATGTTAAAGAGGTATTGGAAGATTTTGCTGAAGATGGTGAGAAGAAGATTAAATTGCTTACTGGTAAACGCGTT CAACTGGCGGAAGACCTCAAGAAAGTTAGAGAAATTCAAGAAAAACTTGATGCTTTCATTGAAGCTCTTCATCAGGAGAAATAA(SEQ ID NO.:2)

本发明优化了影响基因表达和蛋白定位的序列片段，这些序列片段包括但不限于，密码子使用偏好性，消除不利于表达的二级结构(如发夹结构)，改变GC含量，CpG二核苷酸含量，mRNA的二级结构，隐蔽剪接位点，早期多聚腺苷化位点，内部核糖体进入位点和结合位点，负CpG岛，RNA不稳定区，重复序列(直接重复、反向重复等)和可能影响克隆的限制性位点。通过分析和试验筛选，最终得到如SEQ ID NO.:1所示的特别优化的 DNA编码序列。此序列是经过特殊优化，转录水平略有提高，表达量显著提高。特别优化后的SEQ ID NO.:1所示的编码序列与SEQ ID NO.:2所示的野生编码序列相似度为 72.25％(2005/2775)，如图1所示。

优化Homo sapiens:OPA1 isoform2 CDS 2775bp

ATGTGGCGCCTGCGCCGCGCCGCCGTGGCCTGCGAGGTGTGCCAGAGCCTGGTGAAGCACAGCAGCGGCATCA AGGGCAGCCTGCCCCTGCAGAAGCTGCACCTGGTGAGCCGCAGCATCTACCACAGCCACCACCCCACCCTGAAGCTG CAGCGCCCCCAGCTGCGCACCAGCTTCCAGCAGTTCAGCAGCCTGACCAACCTGCCCCTGCGCAAGCTGAAGTTCAG CCCCATCAAGTACGGCTACCAGCCCCGCCGCAACTTCTGGCCCGCCCGCCTGGCCACCCGCCTGCTGAAGCTGCGCT ACCTGATCCTGGGCAGCGCCGTGGGCGGCGGCTACACCGCCAAGAAGACCTTCGACCAGTGGAAGGACATGATCCCC GACCTGAGCGAGTACAAGTGGATCGTGCCCGACATCGTGTGGGAGATCGACGAGTACATCGACTTCGGCAGCCCCGA GGAGACCGCCTTCCGCGCCACCGACCGCGGCAGCGAGAGCGACAAGCACTTCCGCAAGGTGAGCGACAAGGAGAAGA TCGACCAGCTGCAGGAGGAGCTGCTGCACACCCAGCTGAAGTACCAGCGCATCCTGGAGCGCCTGGAGAAGGAGAAC AAGGAGCTGCGCAAGCTGGTGCTGCAGAAGGACGACAAGGGCATCCACCACCGCAAGCTGAAGAAGAGCCTGATCGA CATGTACAGCGAGGTGCTGGACGTGCTGAGCGACTACGACGCCAGCTACAACACCCAGGACCACCTGCCCCGCGTGG TGGTGGTGGGCGACCAGAGCGCCGGCAAGACCAGCGTGCTGGAGATGATCGCCCAGGCCCGCATCTTCCCCCGCGGC AGCGGCGAGATGATGACCCGCAGCCCCGTGAAGGTGACCCTGAGCGAGGGCCCCCACCACGTGGCCCTGTTCAAGGA CAGCAGCCGCGAGTTCGACCTGACCAAGGAGGAGGACCTGGCCGCCCTGCGCCACGAGATCGAGCTGCGCATGCGCA AGAACGTGAAGGAGGGCTGCACCGTGAGCCCCGAGACCATCAGCCTGAACGTGAAGGGCCCCGGCCTGCAGCGCATG GTGCTGGTGGACCTGCCCGGCGTGATCAACACCGTGACCAGCGGCATGGCCCCCGACACCAAGGAGACCATCTTCAG CATCAGCAAGGCCTACATGCAGAACCCCAACGCCATCATCCTGTGCATCCAGGACGGCAGCGTGGACGCCGAGCGCA GCATCGTGACCGACCTGGTGAGCCAGATGGACCCCCACGGCCGCCGCACCATCTTCGTGCTGACCAAGGTGGACCTG GCCGAGAAGAACGTGGCCAGCCCCAGCCGCATCCAGCAGATCATCGAGGGCAAGCTGTTCCCCATGAAGGCCCTGGG CTACTTCGCCGTGGTGACCGGCAAGGGCAACAGCAGCGAGAGCATCGAGGCCATCCGCGAGTACGAGGAGGAGTTCT TCCAGAACAGCAAGCTGCTGAAGACCAGCATGCTGAAGGCCCACCAGGTGACCACCCGCAACCTGAGCCTGGCCGTG AGCGACTGCTTCTGGAAGATGGTGCGCGAGAGCGTGGAGCAGCAGGCCGACAGCTTCAAGGCCACCCGCTTCAACCT GGAGACCGAGTGGAAGAACAACTACCCCCGCCTGCGCGAGCTGGACCGCAACGAGCTGTTCGAGAAGGCCAAGAACG AGATCCTGGACGAGGTGATCAGCCTGAGCCAGGTGACCCCCAAGCACTGGGAGGAGATCCTGCAGCAGAGCCTGTGG GAGCGCGTGAGCACCCACGTGATCGAGAACATCTACCTGCCCGCCGCCCAGACCATGAACAGCGGCACCTTCAACAC CACCGTGGACATCAAGCTGAAGCAGTGGACCGACAAGCAGCTGCCCAACAAGGCCGTGGAGGTGGCCTGGGAGACCC TGCAGGAGGAGTTCAGCCGCTTCATGACCGAGCCCAAGGGCAAGGAGCACGACGACATCTTCGACAAGCTGAAGGAG GCCGTGAAGGAGGAGAGCATCAAGCGCCACAAGTGGAACGACTTCGCCGAGGACAGCCTGCGCGTGATCCAGCACAA CGCCCTGGAGGACCGCAGCATCAGCGACAAGCAGCAGTGGGACGCCGCCATCTACTTCATGGAGGAGGCCCTGCAGG CCCGCCTGAAGGACACCGAGAACGCCATCGAGAACATGGTGGGCCCCGACTGGAAGAAGCGCTGGCTGTACTGGAAG AACCGCACCCAGGAGCAGTGCGTGCACAACGAGACCAAGAACGAGCTGGAGAAGATGCTGAAGTGCAACGAGGAGCA CCCCGCCTACCTGGCCAGCGACGAGATCACCACCGTGCGCAAGAACCTGGAGAGCCGCGGCGTGGAGGTGGACCCCA GCCTGATCAAGGACACCTGGCACCAGGTGTACCGCCGCCACTTCCTGAAGACCGCCCTGAACCACTGCAACCTGTGC CGCCGCGGCTTCTACTACTACCAGCGCCACTTCGTGGACAGCGAGCTGGAGTGCAACGACGTGGTGCTGTTCTGGCG CATCCAGCGCATGCTGGCCATCACCGCCAACACCCTGCGCCAGCAGCTGACCAACACCGAGGTGCGCCGCCTGGAGA AGAACGTGAAGGAGGTGCTGGAGGACTTCGCCGAGGACGGCGAGAAGAAGATCAAGCTGCTGACCGGCAAGCGCGTG CAGCTGGCCGAGGACCTGAAGAAGGTGCGCGAGATCCAGGAGAAGCTGGACGCCTTCATCGAGGCCCTGCACCAGGAGAAGTAA(SEQ ID NO.:1)

融合核酸

本发明还提供了一种融合核酸，其包含本发明第一方面所述的编码人Ⅱ型线粒体动力蛋白样GTP酶的核酸序列。

如本文所用，“融合核酸”指由两个或两个以上不同来源的核苷酸序列连接而成的核酸，或者由同一来源但其天然位置并不互相连接的两个或两个以上核苷酸序列连接而成的核酸。

另一优选例中，所述融合核酸还包含选自下组的序列：UTR序列、启动子序列、或其组合。

优选地，所述融合核酸在所述的编码人Ⅱ型线粒体动力蛋白样GTP酶的核酸可操作性地连接有UTR序列。

在另一优选例中，所述UTR序列包括3’-UTR和/或5’-UTR。

在另一优选例中，所述UTR序列中含有稳定结构的ployA序列。

在另一优选例中，所述融合核酸从5’端-3’端具有式I结构：

Z1-Z2-Z3 (I)

式中，

各“-”独立地为键或核苷酸连接序列；

Z1为5’-UTR序列；

Z2为如本发明第一方面所述的核苷酸序列；和

Z3为3’-UTR序列。

表达载体和宿主细胞

本发明还提供了一种用于OPA1蛋白的表达载体，它含有本发明的优化OPA1编码序列。

通过提供的序列信息，熟练的技术人员可以使用可用的克隆技术以产生适于转导进入细胞的核酸序列或载体。

优选地，编码OPA1蛋白的核酸序列作为载体，优选地表达载体被提供。优选地，其可作为优选地适用于在视网膜靶细胞中转导和表达的基因治疗载体被提供。载体可以是病毒的或非病毒的(例如质粒)。病毒载体包括源自以下的那些病毒载体:腺病毒、包括突变的形式的腺相关病毒(AAV)、逆转录病毒、慢病毒、疱疹病毒、牛痘病毒、MMLV、GaLV、猿猴免疫缺陷病毒(SIV)、HIV、痘病毒和SV40。优选地，病毒载体是复制缺陷的 (replicationdefective)，尽管设想其可以是复制缺乏的(replication deficient)、能够复制或条件性复制的。病毒载体通常可以保持染色体外状态而不整合进入靶视网膜细胞的基因组。用于向视网膜靶细胞引入编码OPA1蛋白的核酸序列的优选的病毒载体是AAV 载体，例如自身互补的腺相关病毒(scAAV)。使用特定的AAV血清型(AAV血清型2到AAV 血清型12)或这些血清型中的任何一个的修饰的版本(包括AAV 4YF和AAV 7m8载体)可以实现选择性靶向。

病毒载体可被修饰以缺失任何非必需的序列。例如，AAV中，病毒可被修饰以缺失全部或部分的IX基因、Ela和/或Elb基因。对于野生型AAV，没有辅助病毒诸如腺病毒的存在，复制是非常低效率的。对于重组的腺相关病毒，优选地，复制基因和衣壳基因以反式被提供(在pRep/Cap质粒中)，并且仅AAV基因组的2ITR被保留并且包装进入病毒体，同时需要的腺病毒基因被被腺病毒或另一个质粒提供。也可对慢病毒载体做出类似的修饰。

病毒载体具有进入细胞的能力。然而，非病毒载体诸如质粒可与剂复合以有利于病毒载体被靶细胞的摄取。此类剂包括聚阳离子剂。可选地，递送系统诸如基于脂质体的递送系统可被使用。用于在本发明中使用的载体优选地适于在体内或体外使用，并且优选地适于在人类中使用。

载体将优选地包含一个或多个调节序列以指导核酸序列在视网膜靶细胞中的表达。调节序列可以包括与核酸序列可操作地连接的启动子、增强子、转录终止信号、多腺苷酸化序列、复制起点、核酸限制性位点、和同源重组位点。载体还可包括选择性标记，例如来确定载体在生长系统(例如细菌细胞)中或在视网膜靶细胞中的表达。

“可操作地连接”意指，核酸序列在功能上与其可操作地连接的序列相关，以使得它们以使得它们影响彼此的表达或功能的方式连接。例如，与启动子可操作地连接的核酸序列将具有被启动子影响的表达模式。

启动子介导与其连接的核酸序列的表达。启动子可以是组成型的或可以是诱导型的。启动子可以指导在内视网膜细胞中遍在的表达，或神经元特异的表达。在后一种情况中，启动子可以指导细胞类型特异的表达，例如对给视神经节细胞。合适的启动子将是本领域技术人员己知的。例如，合适的启动子可以选自由以下组成的组:L7、thy-1、恢复蛋白、钙结合蛋白、人类CMV、GAD-67、鸡β肌动蛋白、hSyn、Grm6、Grm6增强子SV40融合蛋白。使用细胞特异的启动子可以实现靶向，例如Grm6-SV40用于选择性靶向给视神经细胞。Grm6启动子是Grm6基因的200碱基对增强子序列和SV40真核启动予的融合体，Grm6基因编码给视神经细胞特异的代谢型谷氨酸受体mGluR6。Grm6基因的优选的来源是小鼠和人类。使用泛-神经元的启动子可以实现遍在的表达，其实例在本领域是己知的并且可得的。一个此类实例是CAG。CAG启动于是CMV早期增强子和鸡β肌动蛋白启动子的融合体。

合适的启动子的一个例子为即时早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列。该启动子序列为能够驱动可操作地连接至其上的任何多核苷酸序列高水平表达的强组成型启动子序列。合适的启动子的另一个例子为延伸生长因子-1α(EF-1α)。然而，也可使用其他组成型启动子序列，包括但不限于类人猿病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳癌病毒(MMTV)、人免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复(LTR)启动子、MoMuLV启动子、鸟类白血病病毒启动子、艾伯斯坦-巴尔(Epstein-Barr)病毒即时早期启动子、鲁斯氏肉瘤病毒启动子、以及人基因启动子，诸如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红素启动子和肌酸激酶启动子。进一步地，本发明不应被限于组成型启动子的应用。诱导型启动子也被考虑为本发明的一部分。诱导型启动子的使用提供了分子开关，其能够当这样的表达是期望的时，打开可操作地连接诱导型启动子的多核苷酸序列的表达，或当表达是不期望的时关闭表达。诱导型启动子的例子包括但不限于金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素启动子。

许多表达载体可应用OPA1蛋白在哺乳动物细胞(较佳地为人，更佳地为人视神经细胞或感光细胞)表达。本发明优选用腺相关病毒作为表达载体。

本发明还提供一种重组人Ⅱ型线粒体动力蛋白样GTP酶基因的重组应用腺相关病毒载体的构建方法，该方法能快速，简便地构建携带重组人Ⅱ型线粒体动力蛋白样GTP酶基因的重组腺相关病毒载体，并包装获得复杂缺陷腺相关病毒载体。

本发明还提供了一种宿主细胞，用于表达OPA1蛋白。优选地，所述宿主细胞为哺乳动物细胞(较佳地为人，更佳地为人视神经细胞或感光细胞)，提高OPA1蛋白的表达量。

制剂和组合物

本发明提供一种制剂或组合物，所述制剂或组合物含有(a)本发明第三方面所述的载体，以及(b)药学上可接受的载体或赋形剂。

在另一优选例中，所述药物制剂用于治疗眼部疾病。

本发明所述药物组合物中的“活性成分”是指本发明所述的载体(vector)，例如病毒载体(包括腺相关病毒载体)。本发明所述的“活性成分”、制剂和/或组合物可用于治疗眼部疾病。“安全有效量”指的是：活性成分的量足以明显改善病情或症状，而不至于产生严重的副作用。“药学上可接受的载体或赋形剂(excipient)”指的是：一种或多种相容性固体或液体填料或凝胶物质，它们适合于人使用，而且必须有足够的纯度和足够低的毒性。“相容性”在此指的是组合物中各组份能和本发明的活性成分以及它们之间相互掺和，而不明显降低活性成分的药效。

组合物可以是液体或固体，例如粉末、凝胶或糊剂。优选地，组合物是液体，优选地可注射液体。合适的赋形剂将是本领域技术人员己知的。

在本发明中，所述载体可通过视网膜下或玻璃体内施用向眼睛施用。在任一种施用模式中，优选地，载体作为可注射液体被提供。优选地，可注射液体作为胶囊或注射器被提供。

药学上可以接受的载体部分例子有纤维素及其衍生物(如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素钠、纤维素乙酸酯等)、明胶、滑石、固体润滑剂(如硬脂酸、硬脂酸镁)、硫酸钙、植物油(如豆油、芝麻油、花生油、橄榄油等)、多元醇(如丙二醇、甘油、甘露醇、山梨醇等)、乳化剂

润湿剂(如十二烷基硫酸钠)、着色剂、调味剂、稳定剂、抗氧化剂、防腐剂、无热原水等。

组合物可包含生理上可接受的无菌含水或无水溶液、分散液、悬浮液或乳液，和用于重新溶解成无菌的可注射溶液或分散液的无菌粉末。适宜的含水和非水载体、稀释剂、溶剂或赋形剂包括水、乙醇、多元醇及其适宜的混合物。

本发明提供的编码OPA1的核酸或融合核酸，可以体外或体内生产OPA1蛋白或OPA1融合蛋白，所述融合蛋白或者含所述融合蛋白的制剂可应用于制备治疗常染色体显性视神经萎缩(ADOA)的药物。

经优化的编码人Ⅱ型线粒体动力蛋白样GTP酶的核酸表达量更高，从而翻译出更多的 OPA1蛋白，而优化后的OPA1蛋白中的MIS序列可以准确地将GTP功能蛋白进入到线粒体内，因此有更多的GTP酶转染到在线粒体中。将含有本发明核酸的药剂注入兔眼玻璃体腔中，该药剂在玻璃体腔内保持活力，并转染到视神经细胞。优化OPA1核酸编码比现有技术表达更多的OPA1蛋白，能较好地治疗常染色体显性视神经萎缩(ADOA)。

与现有技术相比，本发明主要具有以下优点：

1.本发明重组人Ⅱ型线粒体动力蛋白样GTP酶(OPA1)编码基因序列进行了特殊优化，包括对OPA1中的MIS编码序列和GTP酶结构域编码序列的优化。与OPA1的未优化的 DNA编码序列相比，表达量显著提高，更多的OPA1蛋白转染到在线粒体中。优化后的序列OPA1蛋白表达量显著提高、生物活性高。

2.本发明优化的OPA1编码基因(SEQ ID NO.:1)或融合核酸能够非常有效地治疗常染色体显性视神经萎缩(ADOA)，并且安全性好。

下面结合具体实施，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

实施例1重组人Ⅱ型线粒体动力蛋白样GTP酶基因的重组腺相关病毒载体构建及其病毒包装纯化方法

1.含有人Ⅱ型线粒体动力蛋白样GTP酶基因重组腺相关病毒载体的构建

1)载体构建

将特殊优化后的重组人Ⅱ型线粒体动力蛋白样GTP酶基因(SEQ ID NO：1)加Kpn I和Sal I两个酶切位点或者将以该新基因设计引物用PCR扩增的产物与pSNaV质粒载体，分别进行Kpn I和Sal I双酶切，回收酶切产物，T4DNA Ligase连接过夜，连接产物转化感受态细胞得到重组pSNaV/rAAV2/2-hOPA1 isoform 2(图2)。

2)重组子的筛选和鉴定

取37℃培养后的LB平板，出现蓝斑和白斑，其中白色为重组克隆。挑取白色的菌落加入到含有Amp 100mg/L的LB液体培养基中，37℃，200rpm培养8h。培养好后取菌液，提取质粒，质粒提取步骤参照Biomiga说明书。取1uL质粒作为模板，所述特异性引物为：

1F:5’-ATGTGGCGACTACGTCG-3’(SEQ ID NO.:4)；

1R:5’-TTATTTCTCCTGATGAAGAG-3’(SEQ ID NO.:5)；

PCR扩增程序

对PCR产物电泳检测，结果如图3所示，得到一个大小约3000bp左右的目的条带。鉴定结果表明该克隆中含有目的基因。

3)菌液保存及PCR扩增及其片段测序

吸取1mL经过鉴定的菌液与灭菌后的甘油1:3比例混匀,于-80℃保存，进行菌液测序，将测序得到的序列与重组人Ⅱ型线粒体动力蛋白样GTP酶基因比对分析，成功得到序列正确的重组腺相关病毒质粒pSNaV/rAAV2/2-hOPA1(图4)。

2.rAAV2/2-hOPA1 isoform 2重组腺相关病毒包被

1)转染前一天，将293T细胞接种于225cm²细胞培养瓶中，接种密度3.0×10⁷个/mL细胞,培养基为DMEM+10％牛血清，置37℃含5％CO₂的培养箱中培养过夜。

2)转染当天换液，用新鲜的含10％牛血清的DMEM培养基继续培养。待细胞生长至80～ 90％时，弃去培养基，用PlasmidTrans II(VGTC)转染试剂盒进行转染。具体步骤为：

(a)每个转染瓶取pAdHelper、pAAV-r2c5、pSNaV-hOPA1质粒按要求比例与 DMEM+PlasmidTrans II(VGTC)(转染试剂)在1.5mL无菌Ep管中混匀，编号为A试剂，室温静止10～15min；

(b)将A试剂同30mL DMEM+10％牛血清混合均匀，编号B试剂；

(c)将B试剂均匀加入细胞培养瓶中，37℃含5％CO₂的培养箱中继续培养；

(d)转染16h后，换完全培养基(DMEM+10％牛血清)。

3)转染48h后，收取细胞。

4)将收取细胞用PBS重悬，并反复冻融3次。

3.rAAV2/2-hOPA1 isoform 2病毒的纯化与浓缩

采用氯仿处理-PEG/NaCl沉淀-氯仿抽提三步来分离、浓缩和纯化rAAV2/2-hOPA1病毒。总回收率＝终产物的病毒颗粒数/起始物的病毒颗粒数。

4.病毒纯度和滴度验证

灌制SDS-PAGE分离胶和积层胶,分离胶浓度为10％。分别按每个加样孔加样15μg。电泳完毕后用考马斯亮蓝染色，用相应的脱色液脱色直到显出低背景的、清晰的条带(图5)。

结果如图5所示，VP1/VP2/VP3＝1:1:10，条带清晰，比例正常，无可见杂带，纯度在99％以上。

rAAV2/2-hOPA1 isoform 2的滴度测定采用荧光定量PCR方法检测rAAV2/2-hOPA1isoform 2的物理滴度。

实验材料：SYBRⅡ(takara)；目的片段引物(20uM)；包装病毒用目的质粒(已知浓度)；待测病毒；PCR八联管(Bio-red)。

实验方法：模板1ul，SYBRⅡ7ul引物1 0.25ul，引物2 0.25ul，加nuclease-free水到14ul。

PCR反应条件：预变性：95℃10min；循环：95℃15sec，60℃1min。

最终确定其基因组滴度为1×10¹²vg/mL。

实施例2：rAAV2/2-hOPA1重组腺相关病毒对ADOA显性遗传视神经病变的效果实验

1.兔眼玻璃体腔注射

取24只兔子分为3组，分为实验组A、实验组B和对照组，分别吸取50ul 1×10¹²vg/mL 的rAAV2/2-优化hOPA1 isoform 2、rAAV2/2-原hOPA1 isoform 2和rAAV-ZsGreen在距角膜缘外3mm处穿刺睫状体平坦部进入玻璃体腔内，进行玻璃体腔注射。

2.裂隙灯、眼压、眼底照相检查

两组兔子分别于术后1、3、7、30天进行裂隙灯，眼压的检查。所有兔子均无明显异常，无结膜充血、分泌物，无眼内炎，眼压均无升高。术后一个月的眼底照相显示。

结果如图6所示，所有兔子的视网膜血管和视神经均无明显并发症或损害，表明正规标准的玻璃体腔注射不会发生明显的炎症反应或其他并发症。

3.视网膜的荧光照相

玻璃体腔注射30天后，ZsGreen组(对照组)视网膜的荧光照相显示，GFP成功在视网膜上表达，表明以rAAV为载体，携带GFP转染兔眼玻璃体内，证明rAAV2/2-hOPA1 isoform2重组基因可以在视网膜上表达。

4.hOPA1的免疫荧光检测

玻璃体腔注射30天后，剥离实验组A、B和对照组眼球，制成石蜡切片。石蜡切片置于65℃烘箱中烘片2h，脱蜡至水，用PBS冲洗三次，每次5min。切片置于EDTA缓冲液中微波修复，中火至沸后断电，间隔10min低火至沸。自然冷却后PBS洗3次，每次 5min。切片放入3％过氧化氢溶液，室温下孵育10min。PBS洗3次，每次5min，甩干后 5％BSA封闭20min。去除BSA液，每张切片加入50μl稀释的一抗覆盖组织，4℃过夜。 PBS洗三次，每次5min。去除PBS液，每张切片加50μl-100μl相应种属的荧光二抗，避光室温下孵育50min-1h。避光PBS洗3次，每次5min。去除PBS液。每张切片加50-100μl DAPI避光染核5min。PBS洗3次，每次5min。切片稍干后用抗荧光淬灭封片剂封片，4℃避光保存待拍照。

视网膜抗hOPA1的免疫荧光结果如图7所示，实验组A的荧光强度显著高于实验组B的，存在显著差异，提高了一倍以上。表明实验组A视网膜上的hOPA1表达量明显高于对照组和实验组B。

5.OCT检测

结果显示实验组A和实验组B的视网膜神经纤维层厚度分别为67.55μm和66.00 μm，无明显差别(P＞0.05，图8)。

6.HE检测

HE结果显示实验组和对照组的视网膜神经节细胞数量基本一样，且结构完整，表明 rAAV-hOPA1重组基因是安全的，没有对视网膜造成损伤(图9)。

7.Real-Time PCR检测hOPA1的表达

首先用NCBI的保守结构域分析软件分析hOPA1的保守结构，确保所设计引物的扩增片段位于非保守区；然后根据荧光定量PCR的引物设计原则，用primer premier 5设计引物：

兔-actin-F：CCTTCTACAACGAGCTGCGC(SEQ ID NO.:6)

兔-actin-R：TACAGGGACAGCACGGCC(SEQ ID NO.:7)

原hOPA1-F：TTAGGTTATTTTGCTGTTGT(SEQ ID NO.:8)

原hOPA1-R：TTGTAGTCACTTGGTGTGCC(SEQ ID NO.:9)

优化hOPA1-F：CTGGGCTACTTCGCCGTGGT(SEQ ID NO.:10)

优化hOPA1-R：GGGTGGTCACCTGGTGGGCC(SEQ ID NO.:11)

1)提取RNA、反转录

利用TRIZOL试剂盒提取不同实验组兔子视网膜的总RNA并反转录合成cDNA模板。

2)荧光定量PCR的反应体系和反应程序

在Real-time PCR Detection System仪器上进行荧光定量PCR。在0.2mL的PCR 反应管中加入SYBR Green mix 12.5μL、ddH2O 8μL，一对引物各1μL，cDNA样品2.5μL，总体系25μL。每个样品既要用于扩增目的基因又要扩增内参基因兔-actin，各个基因的扩增都做三个重复。实际加样时，为减小误差，各PCR反应管中共有的试剂可加在一起然后分装。加样完毕，进行荧光定量PCR。

按照95℃预变性1s，94℃变性15s，55℃退火15s，72℃延伸45s，共40个循环的反应程序进行扩增，并于每个循环的延伸阶段采集荧光信号。反应结束后做94℃～55℃的融解曲线分析。

采用2-△△CT相对定量方法(Livak等，2001)研究基因表达量的差异，该方法无需制作标准曲线，以看家基因兔-actin为内参基因，仪器自带的分析软件即可自动生成表达数值。

结果如图10所示，实验组A、实验组B的hOPA1基因mRNA的相对表达量均比对照组的hOPA1基因相对表达量高，实验组A的mRNA的水平相对表达水平比实验组B略高。

8.Western blot检测hOPA1蛋白的表达

分离不同实验组的家兔眼球的视网膜，按100μL/50mg组织加入对应体积的RIPA裂解液，匀浆器匀浆后离心收取上清。BCA法测定蛋白浓度后，按总蛋白50μg计算实验组和对照组上样体积，进行SDS-PAGE凝胶电泳和Western blot。抗体孵育后进行ECL显影。

结果如图11所示，蛋白质印迹的实验组A的hOPA1相对表达水平明(1.13)明显高于实验组B(0.19)和对照组(0.05)，有显著差异P＞0.05，表明，实验组A视网膜上hOPA1 的表达水平明显提高，相对于实验组B和对照组分别提高了约5倍和22倍。

讨论

随着基因治疗在眼部疾病治疗上的快速发展，治愈ADOA也将不是难事。因为人眼与兔眼的解剖和体积相似，本发明以兔子眼睛为模型进行rAAV2/2-hOPA1 isoform 2的玻璃体腔注射。本实验研究注射剂量，安全水平，术后并发症，为未来的临床试验提供重要的参考。所有兔子的裂隙灯，眼压的检查，均无明显异常，无结膜充血、分泌物，无眼内炎，眼压均无升高。术后一个月的眼底照相显示，所有兔子的视网膜血管和视神经均无明显并发症或损害。表明本实验是安全的。

免疫荧光、实时定量PCR和Western blot的结果可以证明hOPA1能稳定地表达于兔子的视网膜上。因为ADOA的病变会引起视盘周围的视网膜神经节细胞凋亡， rAAV-ZsGreen组的视网膜切片能够检测到视盘周围的视网膜有稳定的荧光表达。hOPA1 的荧光染色结果可以说明其能够到达视网膜神经节细胞中，表明rAAV2/2-hOPA1 isoform 2能到达病人眼中病变的区域。眼底照相、OCT的结果显示单次玻璃体腔注射5×10¹⁰vg/mL rAAV2/2-hOPA1isoform 2是安全的，并且没有视网膜毒性，能被应用在未来的临床试验。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 武汉纽福斯生物科技有限公司

<120> 重组人Ⅱ型线粒体动力蛋白样GTP酶基因序列及其应用

<130> P2018-1423

<160> 11

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2775

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 1

atgtggcgcc tgcgccgcgc cgccgtggcc tgcgaggtgt gccagagcct ggtgaagcac 60

agcagcggca tcaagggcag cctgcccctg cagaagctgc acctggtgag ccgcagcatc 120

taccacagcc accaccccac cctgaagctg cagcgccccc agctgcgcac cagcttccag 180

cagttcagca gcctgaccaa cctgcccctg cgcaagctga agttcagccc catcaagtac 240

ggctaccagc cccgccgcaa cttctggccc gcccgcctgg ccacccgcct gctgaagctg 300

cgctacctga tcctgggcag cgccgtgggc ggcggctaca ccgccaagaa gaccttcgac 360

cagtggaagg acatgatccc cgacctgagc gagtacaagt ggatcgtgcc cgacatcgtg 420

tgggagatcg acgagtacat cgacttcggc agccccgagg agaccgcctt ccgcgccacc 480

gaccgcggca gcgagagcga caagcacttc cgcaaggtga gcgacaagga gaagatcgac 540

cagctgcagg aggagctgct gcacacccag ctgaagtacc agcgcatcct ggagcgcctg 600

gagaaggaga acaaggagct gcgcaagctg gtgctgcaga aggacgacaa gggcatccac 660

caccgcaagc tgaagaagag cctgatcgac atgtacagcg aggtgctgga cgtgctgagc 720

gactacgacg ccagctacaa cacccaggac cacctgcccc gcgtggtggt ggtgggcgac 780

cagagcgccg gcaagaccag cgtgctggag atgatcgccc aggcccgcat cttcccccgc 840

ggcagcggcg agatgatgac ccgcagcccc gtgaaggtga ccctgagcga gggcccccac 900

cacgtggccc tgttcaagga cagcagccgc gagttcgacc tgaccaagga ggaggacctg 960

gccgccctgc gccacgagat cgagctgcgc atgcgcaaga acgtgaagga gggctgcacc 1020

gtgagccccg agaccatcag cctgaacgtg aagggccccg gcctgcagcg catggtgctg 1080

gtggacctgc ccggcgtgat caacaccgtg accagcggca tggcccccga caccaaggag 1140

accatcttca gcatcagcaa ggcctacatg cagaacccca acgccatcat cctgtgcatc 1200

caggacggca gcgtggacgc cgagcgcagc atcgtgaccg acctggtgag ccagatggac 1260

ccccacggcc gccgcaccat cttcgtgctg accaaggtgg acctggccga gaagaacgtg 1320

gccagcccca gccgcatcca gcagatcatc gagggcaagc tgttccccat gaaggccctg 1380

ggctacttcg ccgtggtgac cggcaagggc aacagcagcg agagcatcga ggccatccgc 1440

gagtacgagg aggagttctt ccagaacagc aagctgctga agaccagcat gctgaaggcc 1500

caccaggtga ccacccgcaa cctgagcctg gccgtgagcg actgcttctg gaagatggtg 1560

cgcgagagcg tggagcagca ggccgacagc ttcaaggcca cccgcttcaa cctggagacc 1620

gagtggaaga acaactaccc ccgcctgcgc gagctggacc gcaacgagct gttcgagaag 1680

gccaagaacg agatcctgga cgaggtgatc agcctgagcc aggtgacccc caagcactgg 1740

gaggagatcc tgcagcagag cctgtgggag cgcgtgagca cccacgtgat cgagaacatc 1800

tacctgcccg ccgcccagac catgaacagc ggcaccttca acaccaccgt ggacatcaag 1860

ctgaagcagt ggaccgacaa gcagctgccc aacaaggccg tggaggtggc ctgggagacc 1920

ctgcaggagg agttcagccg cttcatgacc gagcccaagg gcaaggagca cgacgacatc 1980

ttcgacaagc tgaaggaggc cgtgaaggag gagagcatca agcgccacaa gtggaacgac 2040

ttcgccgagg acagcctgcg cgtgatccag cacaacgccc tggaggaccg cagcatcagc 2100

gacaagcagc agtgggacgc cgccatctac ttcatggagg aggccctgca ggcccgcctg 2160

aaggacaccg agaacgccat cgagaacatg gtgggccccg actggaagaa gcgctggctg 2220

tactggaaga accgcaccca ggagcagtgc gtgcacaacg agaccaagaa cgagctggag 2280

aagatgctga agtgcaacga ggagcacccc gcctacctgg ccagcgacga gatcaccacc 2340

gtgcgcaaga acctggagag ccgcggcgtg gaggtggacc ccagcctgat caaggacacc 2400

tggcaccagg tgtaccgccg ccacttcctg aagaccgccc tgaaccactg caacctgtgc 2460

cgccgcggct tctactacta ccagcgccac ttcgtggaca gcgagctgga gtgcaacgac 2520

gtggtgctgt tctggcgcat ccagcgcatg ctggccatca ccgccaacac cctgcgccag 2580

cagctgacca acaccgaggt gcgccgcctg gagaagaacg tgaaggaggt gctggaggac 2640

ttcgccgagg acggcgagaa gaagatcaag ctgctgaccg gcaagcgcgt gcagctggcc 2700

gaggacctga agaaggtgcg cgagatccag gagaagctgg acgccttcat cgaggccctg 2760

caccaggaga agtaa 2775

<210> 2

<211> 2775

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 2

atgtggcgac tacgtcgggc cgctgtggcc tgtgaggtct gccagtcttt agtgaaacac 60

agctctggaa taaaaggaag tttaccacta caaaaactac atctggtttc acgaagcatt 120

tatcattcac atcatcctac cttaaagctt caacgacccc aattaaggac atcctttcag 180

cagttctctt ctctgacaaa ccttccttta cgtaaactga aattctctcc aattaaatat 240

ggctaccagc ctcgcaggaa tttttggcca gcaagattag ctacgagact cttaaaactt 300

cgctatctca tactaggatc ggctgttggg ggtggctaca cagccaaaaa gacttttgat 360

cagtggaaag atatgatacc ggaccttagt gaatataaat ggattgtgcc tgacattgtg 420

tgggaaattg atgagtatat cgattttggt tctccggaag aaacggcgtt tagagcaaca 480

gatcgtggat ctgaaagtga caagcatttt agaaaggtgt cagacaaaga gaaaattgac 540

caacttcagg aagaacttct gcacactcag ttgaagtatc agagaatctt ggaacgatta 600

gaaaaggaga acaaagaatt gagaaaatta gtattgcaga aagatgacaa aggcattcat 660

catagaaagc ttaagaaatc tttgattgac atgtattctg aagttcttga tgttctctct 720

gattatgatg ccagttataa tacgcaagat catctgccac gggttgttgt ggttggagat 780

cagagtgctg gaaagactag tgtgttggaa atgattgccc aagctcgaat attcccaaga 840

ggatctgggg agatgatgac acgttctcca gttaaggtga ctctgagtga aggtcctcac 900

catgtggccc tatttaaaga tagttctcgg gagtttgatc ttaccaaaga agaagatctt 960

gcagcattaa gacatgaaat agaacttcga atgaggaaaa atgtgaaaga aggctgtacc 1020

gttagccctg agaccatatc cttaaatgta aaaggccctg gactacagag gatggtgctt 1080

gttgacttac caggtgtgat taatactgtg acatcaggca tggctcctga cacaaaggaa 1140

actattttca gtatcagcaa agcttacatg cagaatccta atgccatcat actgtgtatt 1200

caagatggat ctgtggatgc tgaacgcagt attgttacag acttggtcag tcaaatggac 1260

cctcatggaa ggagaaccat attcgttttg accaaagtag acctggcaga gaaaaatgta 1320

gccagtccaa gcaggattca gcagataatt gaaggaaagc tcttcccaat gaaagcttta 1380

ggttattttg ctgttgtaac aggaaaaggg aacagctctg aaagcattga agctataaga 1440

gaatatgaag aagagttttt tcagaattca aagctcctaa agacaagcat gctaaaggca 1500

caccaagtga ctacaagaaa tttaagcctt gcagtatcag actgcttttg gaaaatggta 1560

cgagagtctg ttgaacaaca ggctgatagt ttcaaagcaa cacgttttaa ccttgaaact 1620

gaatggaaga ataactatcc tcgcctgcgg gaacttgacc ggaatgaact atttgaaaaa 1680

gctaaaaatg aaatccttga tgaagttatc agtctgagcc aggttacacc aaaacattgg 1740

gaggaaatcc ttcaacaatc tttgtgggaa agagtatcaa ctcatgtgat tgaaaacatc 1800

taccttccag ctgcgcagac catgaattca ggaactttta acaccacagt ggatatcaag 1860

cttaaacagt ggactgataa acaacttcct aataaagcag tagaggttgc ttgggagacc 1920

ctacaagaag aattttcccg ctttatgaca gaaccgaaag ggaaagagca tgatgacata 1980

tttgataaac ttaaagaggc tgttaaggaa gaaagtatta aacgacacaa gtggaatgac 2040

tttgcggagg acagcttgag ggttattcaa cacaatgctt tggaagaccg atccatatct 2100

gataaacagc aatgggatgc agctatttat tttatggaag aggctctgca ggctcgtctc 2160

aaggatactg aaaatgcaat tgaaaacatg gtgggtccag actggaaaaa gaggtggtta 2220

tactggaaga atcggaccca agaacagtgt gttcacaatg aaaccaagaa tgaattggag 2280

aagatgttga aatgtaatga ggagcaccca gcttatcttg caagtgatga aataaccaca 2340

gtccggaaga accttgaatc ccgaggagta gaagtagatc caagcttgat taaggatact 2400

tggcatcaag tttatagaag acatttttta aaaacagctc taaaccattg taacctttgt 2460

cgaagaggtt tttattacta ccaaaggcat tttgtagatt ctgagttgga atgcaatgat 2520

gtggtcttgt tttggcgtat acagcgcatg cttgctatca ccgcaaatac tttaaggcaa 2580

caacttacaa atactgaagt taggcgatta gagaaaaatg ttaaagaggt attggaagat 2640

tttgctgaag atggtgagaa gaagattaaa ttgcttactg gtaaacgcgt tcaactggcg 2700

gaagacctca agaaagttag agaaattcaa gaaaaacttg atgctttcat tgaagctctt 2760

catcaggaga aataa 2775

<210> 3

<211> 924

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 3

Met Trp Arg Leu Arg Arg Ala Ala Val Ala Cys Glu Val Cys Gln Ser

1 5 10 15

Leu Val Lys His Ser Ser Gly Ile Lys Gly Ser Leu Pro Leu Gln Lys

20 25 30

Leu His Leu Val Ser Arg Ser Ile Tyr His Ser His His Pro Thr Leu

35 40 45

Lys Leu Gln Arg Pro Gln Leu Arg Thr Ser Phe Gln Gln Phe Ser Ser

50 55 60

Leu Thr Asn Leu Pro Leu Arg Lys Leu Lys Phe Ser Pro Ile Lys Tyr

65 70 75 80

Gly Tyr Gln Pro Arg Arg Asn Phe Trp Pro Ala Arg Leu Ala Thr Arg

85 90 95

Leu Leu Lys Leu Arg Tyr Leu Ile Leu Gly Ser Ala Val Gly Gly Gly

100 105 110

Tyr Thr Ala Lys Lys Thr Phe Asp Gln Trp Lys Asp Met Ile Pro Asp

115 120 125

Leu Ser Glu Tyr Lys Trp Ile Val Pro Asp Ile Val Trp Glu Ile Asp

130 135 140

Glu Tyr Ile Asp Phe Gly Ser Pro Glu Glu Thr Ala Phe Arg Ala Thr

145 150 155 160

Asp Arg Gly Ser Glu Ser Asp Lys His Phe Arg Lys Val Ser Asp Lys

165 170 175

Glu Lys Ile Asp Gln Leu Gln Glu Glu Leu Leu His Thr Gln Leu Lys

180 185 190

Tyr Gln Arg Ile Leu Glu Arg Leu Glu Lys Glu Asn Lys Glu Leu Arg

195 200 205

Lys Leu Val Leu Gln Lys Asp Asp Lys Gly Ile His His Arg Lys Leu

210 215 220

Lys Lys Ser Leu Ile Asp Met Tyr Ser Glu Val Leu Asp Val Leu Ser

225 230 235 240

Asp Tyr Asp Ala Ser Tyr Asn Thr Gln Asp His Leu Pro Arg Val Val

245 250 255

Val Val Gly Asp Gln Ser Ala Gly Lys Thr Ser Val Leu Glu Met Ile

260 265 270

Ala Gln Ala Arg Ile Phe Pro Arg Gly Ser Gly Glu Met Met Thr Arg

275 280 285

Ser Pro Val Lys Val Thr Leu Ser Glu Gly Pro His His Val Ala Leu

290 295 300

Phe Lys Asp Ser Ser Arg Glu Phe Asp Leu Thr Lys Glu Glu Asp Leu

305 310 315 320

Ala Ala Leu Arg His Glu Ile Glu Leu Arg Met Arg Lys Asn Val Lys

325 330 335

Glu Gly Cys Thr Val Ser Pro Glu Thr Ile Ser Leu Asn Val Lys Gly

340 345 350

Pro Gly Leu Gln Arg Met Val Leu Val Asp Leu Pro Gly Val Ile Asn

355 360 365

Thr Val Thr Ser Gly Met Ala Pro Asp Thr Lys Glu Thr Ile Phe Ser

370 375 380

Ile Ser Lys Ala Tyr Met Gln Asn Pro Asn Ala Ile Ile Leu Cys Ile

385 390 395 400

Gln Asp Gly Ser Val Asp Ala Glu Arg Ser Ile Val Thr Asp Leu Val

405 410 415

Ser Gln Met Asp Pro His Gly Arg Arg Thr Ile Phe Val Leu Thr Lys

420 425 430

Val Asp Leu Ala Glu Lys Asn Val Ala Ser Pro Ser Arg Ile Gln Gln

435 440 445

Ile Ile Glu Gly Lys Leu Phe Pro Met Lys Ala Leu Gly Tyr Phe Ala

450 455 460

Val Val Thr Gly Lys Gly Asn Ser Ser Glu Ser Ile Glu Ala Ile Arg

465 470 475 480

Glu Tyr Glu Glu Glu Phe Phe Gln Asn Ser Lys Leu Leu Lys Thr Ser

485 490 495

Met Leu Lys Ala His Gln Val Thr Thr Arg Asn Leu Ser Leu Ala Val

500 505 510

Ser Asp Cys Phe Trp Lys Met Val Arg Glu Ser Val Glu Gln Gln Ala

515 520 525

Asp Ser Phe Lys Ala Thr Arg Phe Asn Leu Glu Thr Glu Trp Lys Asn

530 535 540

Asn Tyr Pro Arg Leu Arg Glu Leu Asp Arg Asn Glu Leu Phe Glu Lys

545 550 555 560

Ala Lys Asn Glu Ile Leu Asp Glu Val Ile Ser Leu Ser Gln Val Thr

565 570 575

Pro Lys His Trp Glu Glu Ile Leu Gln Gln Ser Leu Trp Glu Arg Val

580 585 590

Ser Thr His Val Ile Glu Asn Ile Tyr Leu Pro Ala Ala Gln Thr Met

595 600 605

Asn Ser Gly Thr Phe Asn Thr Thr Val Asp Ile Lys Leu Lys Gln Trp

610 615 620

Thr Asp Lys Gln Leu Pro Asn Lys Ala Val Glu Val Ala Trp Glu Thr

625 630 635 640

Leu Gln Glu Glu Phe Ser Arg Phe Met Thr Glu Pro Lys Gly Lys Glu

645 650 655

His Asp Asp Ile Phe Asp Lys Leu Lys Glu Ala Val Lys Glu Glu Ser

660 665 670

Ile Lys Arg His Lys Trp Asn Asp Phe Ala Glu Asp Ser Leu Arg Val

675 680 685

Ile Gln His Asn Ala Leu Glu Asp Arg Ser Ile Ser Asp Lys Gln Gln

690 695 700

Trp Asp Ala Ala Ile Tyr Phe Met Glu Glu Ala Leu Gln Ala Arg Leu

705 710 715 720

Lys Asp Thr Glu Asn Ala Ile Glu Asn Met Val Gly Pro Asp Trp Lys

725 730 735

Lys Arg Trp Leu Tyr Trp Lys Asn Arg Thr Gln Glu Gln Cys Val His

740 745 750

Asn Glu Thr Lys Asn Glu Leu Glu Lys Met Leu Lys Cys Asn Glu Glu

755 760 765

His Pro Ala Tyr Leu Ala Ser Asp Glu Ile Thr Thr Val Arg Lys Asn

770 775 780

Leu Glu Ser Arg Gly Val Glu Val Asp Pro Ser Leu Ile Lys Asp Thr

785 790 795 800

Trp His Gln Val Tyr Arg Arg His Phe Leu Lys Thr Ala Leu Asn His

805 810 815

Cys Asn Leu Cys Arg Arg Gly Phe Tyr Tyr Tyr Gln Arg His Phe Val

820 825 830

Asp Ser Glu Leu Glu Cys Asn Asp Val Val Leu Phe Trp Arg Ile Gln

835 840 845

Arg Met Leu Ala Ile Thr Ala Asn Thr Leu Arg Gln Gln Leu Thr Asn

850 855 860

Thr Glu Val Arg Arg Leu Glu Lys Asn Val Lys Glu Val Leu Glu Asp

865 870 875 880

Phe Ala Glu Asp Gly Glu Lys Lys Ile Lys Leu Leu Thr Gly Lys Arg

885 890 895

Val Gln Leu Ala Glu Asp Leu Lys Lys Val Arg Glu Ile Gln Glu Lys

900 905 910

Leu Asp Ala Phe Ile Glu Ala Leu His Gln Glu Lys

915 920

<210> 4

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 4

atgtggcgac tacgtcg 17

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 5

ttatttctcc tgatgaagag 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 6

ccttctacaa cgagctgcgc 20

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 7

tacagggaca gcacggcc 18

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 8

ttaggttatt ttgctgttgt 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 9

ttgtagtcac ttggtgtgcc 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 10

ctgggctact tcgccgtggt 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 11

gggtggtcac ctggtgggcc 20

Claims

1.一种核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列编码人Ⅱ型线粒体动力蛋白样GTP酶，且所述核苷酸序列选自下组：

(a)所述核苷酸序列如SEQ ID NO.:1所示；和

(b)所述核苷酸序列与SEQ ID NO.:1所示的核苷酸序列有≥95％相同性，优选地≥98％，更优选地≥99％。

2.一种融合核酸，其特征在于，所述融合核酸包含如权利要求1所述的核苷酸序列。

3.如权利要求2所述的融合核酸，其特征在于，所述融合核酸从5’端-3’端具有式I结构：

Z1-Z2-Z3 (I)

式中，

各“-”独立地为键或核苷酸连接序列；

Z1为无、或5’-UTR序列；

Z2为如权利要求1所述的核苷酸序列；和

Z3为3’-UTR序列。

4.一种载体，其特征在于，所述载体含有如权利要求1所述的核苷酸序列或权利要求2所述的融合核酸。

5.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有权利要求4所述的载体，或其染色体中整合有外源的如权利要求1所述的核苷酸序列或权利要求2所述的融合核酸。

6.如权利要求5所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞选自下组：293T细胞、感光细胞(包括锥状细胞和/或杆状细胞)、其他视觉细胞(如双节细胞)、(视)神经细胞、或其组合。

7.如权利要求4所述的载体的用途，其特征在于，用于制备一制剂或组合物，所述制剂或组合物用于恢复受试者视力和/或治疗眼部疾病。

8.一种药物制剂，其特征在于，所述的制剂含有(a)权利要求4所述的载体，以及(b)药学上可接受的载体或赋形剂。

9.一种治疗方法，其特征在于，所述方法包括将权利要求4所述的载体施用于需要的对象。

10.一种重组人Ⅱ型线粒体动力蛋白样GTP酶的制备方法，其特征在于，包括步骤：培养权利要求5所述的宿主细胞，从而得到重组人Ⅱ型线粒体动力蛋白样GTP酶。