JP2005516618A - 新規タンパク質 - Google Patents
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Abstract
Description
(a)配列番号1に記載のヌクレオチド配列、
(b)配列番号1に記載のヌクレオチドの変異体、ホモログ、誘導体または断片であるヌクレオチド配列、
(c)配列番号1に記載のヌクレオチド配列の相補鎖であるヌクレオチド配列、
(d)配列番号1に記載のヌクレオチド配列の変異体、ホモログ、誘導体または断片の相補鎖であるヌクレオチド配列、
(e)配列番号1に記載のヌクレオチド配列にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列、
(f)配列番号1に記載のヌクレオチド配列の変異体、ホモログ、誘導体または断片にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列、
(g)配列番号1に記載のヌクレオチド配列にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列の相補鎖であるヌクレオチド配列、
(h)配列番号1に記載のヌクレオチド配列の変異体、ホモログ、誘導体または断片にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列の相補鎖であるヌクレオチド配列、
(i)配列番号1に記載のヌクレオチド配列の相補鎖にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列、
(j)配列番号1に記載のヌクレオチド配列の変異体、ホモログ、誘導体または断片の相補鎖にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列、
(k)(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)、(i)および/または(j)のいずれか1つを含むヌクレオチド配列。
(a)配列番号1に示す配列を含むヌクレオチド配列、
(b)高いストリンジェンシーの条件下および/または中程度のストリンジェンシーの条件下で配列番号1に示す配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列、および
(c)遺伝コードの縮重によって配列番号1のヌクレオチド配列に関係づけられるヌクレオチド配列
からなる群より選択される核酸に関する。
好ましくは、本発明の核酸は実質的に純粋な形態をとっている。
一般に、本明細書に記載する分子技術はいずれも当分野ではよく知られているが、特にSambrook et al.,「Molecular Cloning,A Laboratory Manual」(1989)およびAusubel et al.,「Short Protocols in Molecular Biology」(1999)第4版,John Wiley & Sons,Inc.を参照することができる。
本明細書で使用する用語「ライシン」は用語「エンドライシン」を包含する。本明細書で使用する用語「ライシン(溶解素)」は、細胞を溶解する能力を有する酵素または毒素などの任意の薬剤(agent)を意味する。
本明細書で使用する用語「薬剤」は、本発明のライシンおよび/または本発明のライシンをコードするヌクレオチド配列を含む核酸で形質転換された宿主を意味する。
本明細書で使用する用語「医薬品」は、ヒト医学および獣医学におけるヒト用および動物用の医薬品をどちらも包含する。また、本明細書で使用する用語「医薬品」は、動物飼料、特に家禽飼料への配合を意図した製品も包含する。
本明細書で処置と言えば、治療的処置、待期的処置および予防的処置を包含すると理解すべきである。
通例、本発明のヌクレオチド配列は、組換えDNA技術によって製造することができる。
本明細書で使用する用語「アミノ酸配列」は、用語「ポリペプチド」および/または用語「タンパク質」と同義である。用語「アミノ酸配列」は用語「ペプチド」と同義である場合もある。用語「アミノ酸配列」は用語「タンパク質」と同義である場合もある。
本明細書で使用する用語「ヌクレオチド配列」は用語「ポリヌクレオチド」と同義である。
本明細書に記載する特定のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列ならびに前記ヌクレオチド配列から得ることができるアミノ酸配列だけでなく、本発明は、その変異体、ホモログおよび誘導体の使用も包含する。この場合、用語「相同性」は「一致度」と同一視することができる。
本明細書で使用する用語「ハイブリダイゼーション」は、「ヌクレオチド配列の鎖が塩基対形成によって相補鎖と結びつく過程」、ならびにポリメラーゼ連鎖反応(PCR)技術で行われるような増幅過程を包含するものとする。
本発明のライシンまたはそれをコードするヌクレオチド配列を含むヌクレオチドは、好ましくは、実質的に純粋な形態をとっているか、または単離された形態をとっている。
本発明のライシンは、薬学的に許容できるその塩(例えば酸付加塩もしくは塩基塩)またはその溶媒和物(その水和物を含む)の形態をとることができ、そして/またはそのような形態で投与することができる。適切な塩に関する総説としてBerge et al.,J.Pharm.Sci.,1977,66,1−19を参照されたい。
本薬剤、例えばライシンは、多型として存在しうる。
本発明は、ライシンまたは薬学的に許容できるその塩の適切なアイソトープ変異体もすべて包含する。本発明のライシンまたは薬学的に許容できるその塩のアイソトープ変異体は、少なくとも1つの原子が、原子番号は同じであるが原子質量が自然界に通常見いだされる原子質量とは異なっている原子で置き換えられているものと定義される。本薬剤および薬学的に許容できるその塩に組み込むことができる同位体の例には、水素、炭素、窒素、酸素、リン、硫黄、フッ素および塩素の同位体、例えばそれぞれ2H、3H、13C、14C、15N、17O、18O、31P、32P、35S、18Fおよび36Clなどがある。本薬剤および薬学的に許容できるその塩のアイソトープ変異体の一部、例えば3Hまたは14Cなどの放射性同位体が組み込まれているものは、薬物および/または基質の組織分布研究に役立つ。トリチウム(すなわち3H)同位体および炭素14(すなわち14C)同位体は、製造が容易で検出しやすいので、特に好ましい。さらに、重水素(すなわち2H)は、高い代謝安定性に起因する特定の治療上の利点、例えば生体内半減期の増加や、所要量の減少などをもたらすので、好ましい場合がありうる。ライシンおよび薬学的に許容できるその塩のアイソトープ変異体は一般に、従来の方法により、適切な試薬の適当なアイソトープ変異体を使って、製造することができる。
本発明のライシンがプロドラッグに由来してもよいことは、当業者には理解されるだろう。プロドラッグの例として、ある種の保護基を有し、そのままでは薬理活性を有し得ないが、一定の場合には、投与(例えば経口投与または非経口投与)されると、体内で代謝されて、薬理活性な薬剤を生成するような物体が挙げられる。
さらに、例えばH.Bundgaardの「Design of Prodrugs」(Elsevier,1985)(その開示は参照することにより本明細書に組み込まれる)などに記載されいているように、「プロ部分(pro−moiety)」と呼ばれる一定の部分を、薬剤の適当な官能基上に置くことができることも、理解されるだろう。そのようなプロドラッグも本発明の範囲に包含される。
本発明は、治療有効量の本発明の薬剤、すなわち本発明のライシン、および薬学的に許容できる担体、希釈剤または賦形剤(その組合せを含む)を含む医薬組成物も提供する。
「投与」という用語は、ウイルス技術または非ウイルス技術による送達を包含する。ウイルス送達機構には、例えばアデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクター、ヘルペスウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、およびバキュロウイルスベクターなどがあるが、これらに限るわけではない。非ウイルス送達機構には、例えば脂質を使ったトランスフェクション、リポソーム、イムノリポソーム、リポフェクチン、陽イオン性面状両親媒性物質(cationic facial amphiphile=CFA)およびそれらの組合せなどがある。
通例、医師または獣医師が個々の対象に最適であろう実投与量を決定することになる。特定の対象に対する具体的な用量レベルおよび投与頻度はさまざまであり、例えば使用する化合物の活性、代謝安定性およびその化合物の作用の長さ、年齢、体重、全身の健康状態、性別、食餌、投与の形式と時間、排泄速度、併用薬、その状態の重症度、および治療を受けている対象を含む種々の要因に依存するだろう。本発明の薬剤および/または医薬組成物は、1日1〜10回、例えば1日1回または2回という用法で投与することができる。
本発明の薬剤は、例えば、当分野で知られている技術を使って1つ以上の適切な担体、希釈剤または賦形剤と混合することなどによって、医薬組成物に製剤化することができる。
本明細書で使用する用語「被検対象(subject)」は、脊椎動物、特に哺乳動物種のメンバーを指す。この用語には、家畜、スポーツ動物、農業家畜、霊長類およびヒトが包含されるが、これらに限定されない。用語「農業家畜」は家禽、例えばブロイラー鶏を包含する。
好ましくは、本発明の化合物(または組合せ)は経口生物学的利用能を有する。経口生物学的利用率とは、経口投与した薬物のうち体循環に達する薬物の割合を指す。薬物の経口生物学的利用率を決定する要因は、溶解、膜透過性および代謝安定性である。通例、経口生物学的利用率の決定には、まずはin vitro法、次にin vivo法による、スクリーニングカスケードが使用される。
本発明のライシンは、化学合成法によって製造することができる。
本明細書で使用する用語「ミメティック」は、基準薬剤と定性的に同じ活性または作用を有する任意の化学物質(例えばペプチド、ポリペプチド、抗体または他の有機化学物質を含むが、これらに限らない)に関する。すなわち、ミメティックは、既知の薬剤の機能的等価物である。
本明細書で使用する用語「誘導体」または「誘導体化」には、薬剤の化学修飾が含まれる。そのような化学修飾の実例として、ハロ基、アルキル基、アシル基またはアミノ基による水素の置き換えが挙げられる。
本発明の一実施形態として、ライシンは化学修飾ライシンであることができる。
本発明の一実施形態として、本発明のライシンは、対象に直接投与することができる。
本発明のライシンをコードするヌクレオチド配列を含むベクターは、「裸の核酸コンストラクト」(好ましくは宿主細胞ゲノムに相同な隣接配列を含むもの)として、直接投与することができる。
あるいは、本発明のヌクレオチド配列を含むベクターまたは本発明のライシンを、当分野で知られるさまざまな非ウイルス技術、例えばトランスフェクション、形質転換、エレクトロポレーションおよびバイオリスティック(biolistic)形質転換などを使って、適切な宿主細胞中に導入することもできる。
あるいは、本発明の薬剤または本発明のヌクレオチド配列を含むベクターは、当分野で知られているさまざまなウイルス法を使って、例えばレトロウイルス、単純疱疹ウイルスおよびアデノウイルスなどの組換えウイルスベクターによる感染などを使って、適切な宿主細胞に導入することもできる。
「標的指向性ベクター」という用語は、細胞に感染/トランスフェクト/形質導入する能力または宿主および/または標的細胞中で発現される能力が、宿主生物内の一定の細胞タイプ(通常は共通するまたは類似する表現型を有する細胞)に制限されているベクターを指す。
本発明のライシンをコードするヌクレオチド配列を含む核酸は、組換え複製ベクターに組み込むことができる。このベクターは、適合する宿主細胞中で前記ヌクレオチド配列を複製するために使用することができる。したがって、本発明の一実施形態として、本発明は、本発明のヌクレオチド配列を含む核酸を複製可能なベクターに導入し、そのベクターを適合する宿主細胞中に導入し、その宿主細胞をベクターの複製をもたらす条件下で成長させることによって、本発明のヌクレオチド配列を含む核酸を製造する方法を提供する。ベクターは、宿主細胞から回収することができる。
ベクターに挿入された本発明のヌクレオチド配列または本発明のライシンは、好ましくは、宿主細胞によるコード配列の発現に備えることができる制御配列に作動可能に連結される。すなわちこのベクターは発現ベクターである。「作動可能に連結」という用語は、記載した成分が意図する形で機能できるような関係にある並置を指す。コード配列に「作動可能に連結」された調節配列は、その制御配列に適合する条件下でコード配列の発現が達成されるような形で連結されている。「調節配列」という用語は、プロモーターおよびエンハンサーならびに他の発現調節シグナルを包含する。
本発明のポリペプチドの発現を指示するには、本発明のポリペプチドの遺伝子に固有のプロモーターだけでなく、他のプロモーターを使用することもできる。
本発明のベクターは、本発明のライシンを発現させることができるように、以下に述べるように、適切な宿主細胞および/または標的細胞に形質転換またはトランスフェクトすることができる。このプロセスには、発現ベクターで形質転換された宿主細胞および/または標的細胞を、本発明のライシンをコードするコード配列がベクターによって発現されるような条件下で培養し、要すれば、発現した本発明の薬剤を回収することが含まれうる。ベクターとしては、例えば、複製起点を有し、要すれば、前記ポリヌクレオチドを発現させるためのプロモーターと、要すれば、そのプロモーターの調節因子を有するプラスミドまたはウイルスベクターが挙げられる。ベクターは、1つ以上の選択可能マーカー遺伝子、例えば細菌プラスミドの場合はアンピシリン耐性遺伝子、哺乳類ベクターの場合はネオマイシン耐性遺伝子などを含みうる。本発明の薬剤または本発明の標的の発現は、それらが構成的に産生されるように構成的であってもよいし、誘導性であって、発現を開始するのに刺激を必要としてもよい。誘導性発現の場合は、必要な時に、例えば、デキサメタゾンやIPTGなどの誘導物質を培養培地に添加することなどによって、本発明の薬剤または標的の産生を開始させることができる。
本発明のポリペプチドは、多くの場合、発現宿主から培養培地に分泌させることが望ましく、培養培地から本発明のポリペプチドを回収する方が容易である。本発明では、本発明のポリペプチドの天然分泌リーダー配列を使って、発現された本発明のポリペプチドの分泌を達成することができる。しかし、本発明のポリペプチドの発現量が増加すると、タンパク質の産生が、発現宿主のプロセシング能力および分泌能力を超えて、ボトルネックを生じ、その結果、タンパク質産物が細胞内に蓄積する場合がある。そこで本発明は、選択した発現宿主から本発明のポリペプチドが最も効率よく分泌されるように、異種リーダー配列も提供する。
本発明のライシンは、本発明のライシンの抽出および精製および/または被検対象への送達を助けるために、融合タンパク質として発現させることができる。融合タンパク質パートナーの例には、グルタチオン−S−トランスフェラーゼ(GST)、6×His、GAL4(DNA結合ドメインおよび/または転写活性化ドメイン)およびβ−ガラクトシダーゼなどがある。また、融合タンパク質配列を除去することができるように、融合タンパク質パートナーと目的のタンパク質配列との間にタンパク質分解部位を含めると便利だろう。融合タンパク質は、好ましくは、ライシンの活性を妨害しない。
本発明のライシンをコードするヌクレオチド配列を発現させるには、広範囲にわたる多様な宿主細胞を使用することができる。これらの細胞は原核宿主細胞でも真核宿主細胞でもよい。したがって、さらにもう一つの態様として、本発明は、本発明のポリペプチドを製造する方法であって、上述の発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞を、前記ポリペプチドをコードするコード配列がベクターによって発現されるような条件下で培養し、発現されたポリペプチドを回収することを含む方法を提供する。好適な宿主細胞としては、大腸菌、ラクトバチルス属の種、バチルス属の種、およびラクトコッカス属の種、酵母、糸状菌、昆虫細胞、哺乳類細胞、通例、不死化したもの、例えばマウス、CHO、ヒトおよびサル細胞株ならびにその誘導体が挙げられる。
本発明に関して、用語「生物」は、本発明のライシンをコードするヌクレオチド配列を含む核酸および/またはそこから得られる産物を含むことができる生物であって、転写調節配列が、その生物内に存在する時に、本発明のヌクレオチド配列の発現を可能にするような、任意の生物を包含する。好適な生物としては、原核生物、真菌、酵母または植物を挙げることができる。好ましい生物として、細菌、好ましくはラクトバチルス属の細菌、より好ましくはラクトバチルス・アシドフィラスを挙げることができる。
前述のように宿主生物は原核生物または真核生物であることができる。好適な原核宿主の例には、大腸菌、枯草菌またはラクトバチルス・アシドフィラスなどがある。原核宿主の形質転換については当分野では詳細に記載されている。例えばSambrook et al.,(Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第2版,1989,Cold Spring Harbor Laboratory Press)およびAusubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology(1995),John Wiley & Sons,Inc.を参照されたい。
本発明の検出方法およびアッセイ方法(ならびにスクリーニング)には多種多様なレポーターを使用することができ、好ましいレポーターは、便利に(例えば分光法などによって)検出できるシグナルを与える。一例として、レポーター遺伝子は、光吸収特性を変化させる反応を触媒する酵素をコードしてもよい。
1つ以上の適当な標的(例えば1つ以上の病原性クロストリジウム細菌、特にクロストリジウム・パーフリンジェンス細菌を含む試料)を使って、さまざまな薬物スクリーニング技術で、本発明のライシンを同定することができる。そのような試験で使用される標的は溶解した状態で遊離していてもよいし、固相に固定されていてもよいし、細胞表面に担持されていてもよいし、細胞内にあってもよい。さらに、標的は動物モデルの体内にあってもよく、この場合、その標的は外来の標的または導入された標的であることができる。動物モデルは非ヒト動物モデルだろう。標的活性の消滅または標的と被験ライシンとの結合複合体の形成を測定することができる。
本発明は、標的、すなわち病原性クロストリジウム細菌、特にクロストリジウム・パーフリンジェンス細菌を検出するための診断組成物またはキットも提供する。この組成物またはキットは、試験試料中に1つ以上のクロストリジウム細菌(特にクロストリジウム・パーフリンジェンス細菌)が存在することまたは存在しないことを示す能力を有する本発明のライシンに基づく診断マーカーを含むだろう。試験試料として、好ましくは、食料品、消化混合物(digesta)または対象の腸管から得られる試験試料などを挙げることができる。
疾患の診断に根拠を与えるには、試料中の病原性クロストリジウム細菌の量、特にクロストリジウム・パーフリンジェンス細菌の量の正常値または標準値を確立すべきである。例えば、対象の腸管内に一定レベルの前記細菌が存在しても、必ずしもその個体に有害であるとは限らない。細菌数が閾値レベルを超えて増加した場合にのみ、有害な影響が観察され、疾患状態が確立されうる。したがって、診断試験は、試料中に病原性クロストリジウム細菌、特にクロストリジウム・パーフリンジェンスが存在することを確認することができるだけでなく、感染レベルを定量することもできるだろう。試料中の細菌量は、既知量の細菌を添加した陽性対照の希釈系列と比較することによって、定量することができる。
本発明のもう一つの態様は、本発明のライシンをコードするヌクレオチド配列をコードするポリヌクレオチド配列(ゲノム配列を含む)または近縁関係にある分子(例えば対立遺伝子)を検出する能力を有する核酸ハイブリダイゼーションプローブまたはPCRプローブの提供である。プローブの特異性、すなわちそれが高度に保存された領域もしくはドメインに由来するか、保存された領域もしくはドメインに由来するか、それとも保存されていない領域もしくはドメインに由来するかと、ハイブリダイゼーションまたは増幅のストリンジェンシー(高、中、低)は、そのプローブにより、本発明のライシンをコードする天然ヌクレオチド配列だけが同定されるか、類縁配列が同定されるかを決定するだろう。類縁核酸配列を検出するためのプローブは、標的ファミリーメンバーの保存されたまたは高度に保存されたヌクレオチド領域から選択され、そのようなプローブを、縮重プローブのプールとして使用することができる。同一核酸配列の検出が目的である場合、または最大限の特異性を望む場合は、標的ポリヌクレオチドの非保存的ヌクレオチド領域またはユニーク領域から、核酸プローブを選択する。本明細書で使用する用語「非保存的ヌクレオチド領域」とは、本明細書に開示するライシンコード配列に特有であって、類縁ファミリーメンバー中には存在しないヌクレオチド領域を指す。
一般的な意味で、本発明のライシンおよび/または本発明のライシンをコードするヌクレオチド配列で形質転換された宿主は、病原性クロストリジウム細菌、特にクロストリジウム・パーフリンジェンス細菌の存在に関係する障害を処置するための医薬品の製造に使用することができる。
本発明のライシンおよび/または本発明のライシンをコードするヌクレオチド配列を含む核酸で形質転換された宿主は、動物飼料を含む食料品に使用することもできる。
〔実施例1〕
方法:さまざまな分離源から分離された51株のクロストリジウム株を、Loessner et al(1990 Appl.Environ.Microbiol,56,1912−8)に記載のUV照射法により、溶原性についてスクリーニングした。指数増殖期のクロストリジウム(10ml)をUV光(254nm,0.0132Jcm-2)に5分間ばく露した。暗所で3時間培養(37℃)した後、培養物を遠心分離(10分,8000g)し、滅菌濾過した。ローン(lawn)法により、すべてのクロストリジウム・パーフリンジェンス株に対して、ファージ活性を調べた。
〔実施例2〕
方法:上記2つのファージのクロストリジウム・パーフリンジェンス株溶解能力を、ドロップ・オン・ザ・ローン(drop−on−the−lawn)法によって調べた。クロストリジウム・パーフリンジェンス株を接種した平板上に10μlのファージストック(107pfu/ml)を置いた。終夜培養後の細菌ローンにおけるプラークの形成によって溶解活性を観察した。
〔実施例3〕
方法:バクテリオファージλDNAの標準的抽出方法(Sambrook et al.,(前掲)参照)を使ってφ3626のゲノムDNAを得た。バクテリオファージφ3626のゲノムライブラリーの構築は、Loessner et al(2000 Mol.Microbiol 35,324−40)に詳述されているように行った。DNAをTsp509I(New England Biolabs)で時間を制限して消化し、HindIII(MBI Fermentas)およびTaqI(Roche)を使って完全に消化した。望ましい長さ(1〜2kbp)の断片をアガロースゲルから回収し、pBluescriptベクター(Stratagene)にライゲートした。そのライゲーション産物を大腸菌DH5αMCRにエレクトロポレーションした。インサートを保有する形質転換体の同定には、Xgal含有寒天平板上でのブルーホワイトスクリーニングを用いた。小規模培養物からプラスミドを単離し(Qiaprep Miniprep Kit,Qiagen)、PauI(MBI)で消化した。1〜2kbpのさまざまな長さの異なるインサートを保有する58個のクローンを、アガロースゲルでの制限酵素切断パターンによって同定した。これらのクローンを使って、pBluescriptのマルチクローニング部位に隣接する配列に相補的な蛍光標識(IRD−8000 LI−COR)標準プライマーによる配列決定を行った。配列決定は、耐熱性ポリメラーゼ(SequiTherm EXCEL II DNAシークエンシングキットLC;Epicentre Technologies)を使って、自動DNAシーケンサー(4200IR2;IL−COR)で行った。
〔実施例3〕
方法:他のバクテリオファージ(φ105、Sfi2l、φadh、φSLT、φPVL)と比較したところ、φ3626のゲノムはよく似た構成を有することがわかった。典型的には、エンドライシンは溶原性制御領域の上流に位置し、そのORFは通常は反対方向を向いている(図3参照)。ORF19の産物は、枯草菌ファージφ105由来のホリンと思われる配列(Kobayashi,K et al.,未公表,アクセッション番号AB016282)との類似性(105アミノ酸にわたって50%)を示した。Sonnhammer et al(1998 Proc.Int.Conf.Intell.Syst.Mol.Biol.,6:175−182)に記載のTmHMMを実行するバイオインフォマティック解析により、この推定タンパク質は2つの膜貫通ヘリックス領域を有する可能性が高いことが証明された。したがって、ORF19はφ3626のホリンをコードしていると、暫定的に考えた。
〔実施例4〕
バイオインフォマティック解析に基づいて、PCRを使ってply3626を増幅するためのプライマーを設計した。これらのプライマーは、遺伝子の両端に相補的であるように設計すると共に、発現ベクターpQE30(Qiagen)への定方向的クローニングを可能にする目的で、遺伝子の上流と下流に制限部位を有するように設計した。PCR産物を精製し、適当な制限エンドヌクレアーゼで消化し、調製したベクターにライゲートした。そのライゲーション産物をエレクトロポレーションによって大腸菌JM109に形質転換した。この大腸菌JM109は、Zdanovsky et al(2000 App.Environ Microbiol.166:3166−73)の厚意で提供されたプラスミドpACYC−IRL10で形質転換することにより、前もって準備しておいたものである。pACYC−IRL10は、大腸菌ではまれにしか使用されないがクロストリジウムでは頻繁に使用されるtRNAの遺伝子(ileX、argUおよびleuW)を、大腸菌に与える。
〔実施例5〕
溶解活性を測光法でアッセイするために、ply3626の基質として、クロストリジウム・パーフリンジェンスNCTC3110を使用した。細菌を終夜成長させ(500ml)、遠心分離(8000gで15分間)によって収集し、PBS緩衝液(5ml)に再懸濁した。細胞を使用するまで−20℃で保存した。溶解アッセイのために、細胞を490nmで光学密度が0.7〜0.8になるまでPBS緩衝液に希釈した。この基質180μlに、エンドライシンを産生する組換え大腸菌の粗抽出物20μlを加え、光学密度の変化を経時的に測定した。ネガティブコントロールとして、3’切断型ply3626を有するベクターを保有する大腸菌の粗抽出物を使用した。基質の細胞壁の破壊による可視光の光学密度の低下を、エンドライシンply3626を含むREに関して、ネガティブコントロールと比較して、測定した(図4参照)。
〔実施例6〕
方法:クロストリジウム・パーフリンジェンスから得られたライシンの基質特異性を決定するために、ply3626を使った溶解アッセイをさまざまな細菌で行った。49種類の細菌種、109株を、Ply3626に対する感受性に関してスクリーニングした。細菌を標準条件下で成長させ、遠心分離によって収集し、ペレットをPBS中に再懸濁した。これらのストックを使用時まで−20℃で保存した。光学密度が0.5〜0.9になるように細胞を希釈し(490nmで)、180μlの希釈細胞懸濁液を基質として、組換え大腸菌のPly3626含有粗抽出物20μlを加えることにより、溶解アッセイを行った。
したがって、驚いたことに、クロストリジウム・パーフリンジェンスのバクテリオファージから単離され配列決定されたライシンは、クロストリジウム・パーフリンジェンスに種特異的または実質的に種特異的である。このような種特異性の利点は、前記ライシンを対象に投与すると、有益なそして/または無害な細菌を傷つけずに、クロストリジウム・パーフリンジェンスおよび/またはクロストリジウム・ファラクス(共にクロストリジウム属の病原種)の選択的破壊が起こることである。
Claims (31)
- クロストリジウム・パーフリンジェンス(Clostridium perfringens)に定着できるバクテリオファージから取得可能なライシン(溶解素)。
- 配列番号2に示すアミノ酸配列またはその変異体、ホモログもしくは誘導体を含む実質的に純粋な形態のライシン。
- 配列番号2に示すアミノ酸配列またはその変異体、ホモログもしくは誘導体を含むライシンをコードするヌクレオチド配列を含む核酸。
- ライシンをコードするヌクレオチド配列を含む核酸であって、前記ヌクレオチド配列が配列番号1に示す配列またはその変異体、ホモログもしくは誘導体を含む核酸。
- 請求項1に記載のヌクレオチド配列を含む核酸であって、前記ヌクレオチド配列がクロストリジウム・パーフリンジェンスに定着できるバクテリオファージから取得可能である核酸。
- 請求項3〜5のいずれか一項に記載の核酸の発現によって取得可能である実質的に純粋なライシン。
- 請求項3〜5のいずれか一項に記載のライシンをコードする核酸により形質転換された宿主。
- 請求項3〜5のいずれか一項に記載の核酸により形質転換された宿主。
- 微生物宿主である、請求項7または請求項8に記載の宿主。
- 食品用生物である、請求項7〜9のいずれか一項に記載の宿主。
- 腸内にコロニーを形成する生物である、請求項7〜10のいずれか一項に記載の宿主。
- エシェリキア(Escherichia)属、ラクトバチルス(Lactobacillus)属、バチルス(Bacillus)属、ラクトコッカス(Lactococcus)属、スタフィロコッカス(Staphylococcus)属、ペディオコッカス(Pediococcus)属から選択される1つ以上の微生物である、請求項7〜11のいずれか一項に記載の宿主。
- 大腸菌(Escherichia coli)、ラクトバチルス・アシドフィラス(Lactobacillus acidophilus)、スタフィロコッカス・カルノサス(Staphylococcus carnosus)または類縁種の1つ以上から選択される細菌である、請求項7〜12のいずれか一項に記載の宿主。
- 請求項7〜13のいずれか一項に記載の宿主を培養することによって得られるライシン。
- 実質的に純粋な形態をとっている請求項14に記載のライシン。
- 請求項1〜2、6または14〜15のいずれか一項に記載のライシンを含む組成物。
- 医薬組成物であり、薬学的に許容できる希釈剤、賦形剤または担体をさらに含む、請求項16に記載の組成物。
- 医薬品として使用される請求項1〜2、6または14〜15のいずれか一項に記載のライシン。
- クロストリジウム属の病原種に関係する障害、疾患または状態を処置するための医薬品の製造における、請求項1〜2、6または14〜15のいずれか一項に記載のライシンの使用。
- クロストリジウム・パーフリンジェンスに関係する障害、疾患または状態を処置するための医薬品の製造における、請求項3〜5または12〜13のいずれか一項に記載のライシンの使用。
- 前記障害、疾患または状態が、体重減少、壊疽性腸炎、壊疽の1つ以上である、請求項19または請求項20に記載の使用。
- 請求項1〜2、6または14〜15のいずれか一項に記載のライシンを含む医薬品。
- 処置を必要とする被検対象における障害、疾患または状態を処置する方法であって、有効量の、請求項1〜2、6もしくは14〜15のいずれか一項に記載のライシンまたは請求項16〜17のいずれか一項に記載の組成物を、前記被検対象に投与することを含む方法。
- 1つ以上の区画を含む医薬パックであって、少なくとも1つの区画が、請求項1〜2、6もしくは14〜15のいずれか一項に記載の1つ以上のライシンまたは請求項16〜17のいずれか一項に記載の組成物を含む医薬パック。
- 請求項17に記載の医薬組成物の製造方法であって、請求項1〜2、6または14〜15のいずれか一項に記載の1つ以上のライシンを、薬学的に許容できる希釈剤、賦形剤または担体と混合することを含む方法。
- クロストリジウム属の病原性細菌を破壊する方法であって、請求項1〜2、6もしくは14〜15のいずれか一項に記載のライシンまたは請求項16〜17のいずれか一項に記載の組成物により、病原性クロストリジウム細菌を溶解することを含む方法。
- 前記クロストリジウム細菌が種クロストリジウム・パーフリンジェンスに属する、請求項26に記載の方法。
- 前記クロストリジウム細菌が被検対象の腸管内に存在する、請求項26〜27のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項3〜5のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列と、適切な宿主中でコード配列を発現させるためにそれに付随している調節領域とを含む発現媒体。
- 請求項1〜2、6もしくは14〜15のいずれか一項に記載のライシンまたはそのミメティックに基づく診断マーカーを使って、試料中のクロストリジウム細菌を検出する方法。
- 前記クロストリジウム細菌が種クロストリジウム・パーフリンジェンスに属する、請求項30に記載の方法。
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