JP7214667B2 - クロストリジウムによる対象物の汚染を低減する方法 - Google Patents
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Description
CPEが媒介した集団食中毒は、一般に、多数の犠牲者を伴い、温度管理が不適切であった獣肉または鳥肉料理が関係している。CPE陽性C.パーフリンジェンス芽胞に汚染された食品が、ゆっくりと冷やされ、または10~54℃の温度範囲で維持されもしくは提供されると、食中毒の最適条件となり、C.パーフリンジェンスの発芽および迅速な増殖が可能となる(Li and McClane, 2006, Lindstrom et al., 2011)。この疾患に関連した費用は高額である。オランダでは、クロストリジウム・パーフリンジェンス胃腸炎の平均発生数は、年間171,000例で、食品に関連したC.パーフリンジェンス感染事例からの総費用は、2320万ユーロに達すると推定されている(Mangen et al., 2015)。
細菌の天敵であるバクテリオファージは、20世紀初頭に、主に抗生物質の発見以前に治療薬として使用されていた。抗生物質耐性病原体の問題の深刻化によって、バクテリオファージ療法や、食品処理を含む細菌汚染が懸念される他の分野での適用において改めて関心がもたれている。Intralytixによって開発されたファージカクテル(Listex P100、SalmoFresh、ListShield)が市販化されている。同社はまた、家禽のクロストリジウム・パーフリンジェンスを制御する、獣医学的適用のためのファージ製品、INT-401(商標)を開発し、ライセンスアウトした(Miller et al., 2010)。
(1)クロストリジウムによる食品または動物飼料などの対象物の汚染を予防するまたは低減する方法であって、前記対象物を、前記クロストリジウムに対して活性を有する少なくとも1つのエンドライシンを含む組成物と接触させることを含む方法。
(2)前記組成物が、植物材料またはその抽出物であり、または植物材料またはその抽出物を含み、植物材料が、前記少なくとも1つのエンドライシンを発現している植物、好ましくは前記少なくとも1つのエンドライシンを発現している食用植物からの材料である、請求項1に記載の方法。
(3)前記組成物が、前記少なくとも1つのエンドライシンを含有する水溶液である、項目1または2に記載の方法。
(4)前記少なくとも1つのエンドライシンを含有する前記水溶液が、50~400mMのNaCl、好ましくは140~310mMのNaCl、およびスルフヒドリル化合物を含有する緩衝化水溶液である、項目3に記載の方法。
(5)前記少なくとも1つのエンドライシンの総濃度が、0.001~1mg/ml、好ましくは0.01~0.5mg/mlである、項目3または4に記載の方法。
(6)前記組成物が、前記少なくとも1つのエンドライシンを含有する凍結乾燥または乾燥粉末であり、前記粉末が、使用前に水または水溶液に溶解または懸濁されていてもよい、項目1または2に記載の方法。
(7)前記対象物が、前記少なくとも1つのエンドライシンを含有する水溶液を吹き付けられる、または前記少なくとも1つのエンドライシンを含有する水溶液中へ浸漬される、項目1から6までのいずれか1項に記載の方法。
(8)前記食品が、生肉、加熱調理された肉、または肉汁などの食肉である、項目1から7までのいずれか1項に記載の方法。
(9)前記クロストリジウムが、クロストリジウム・パーフリンジェンス、好ましくはA型、B型、C型、D型、およびE型のクロストリジウム・パーフリンジェンスから選択されるいずれか1つまたは複数である、項目1から8までのいずれか1項に記載の方法。
(10)クロストリジウム・パーフリンジェンスが、エンテロトキシンCPEを含有するA型菌株である、項目9に記載の方法。
(11)前記少なくとも1つのエンドライシンのうちの少なくとも1つが、配列番号1のアミノ酸を含むPsm、配列番号2のアミノ酸を含むZP173、および配列番号3のアミノ酸を含むZP278、またはこれらのエンドライシンのいずれかの誘導体から選択され、前記誘導体が、その由来元であるエンドライシンの少なくとも33%の溶菌活性を有する、項目1から10までのいずれか1項に記載の方法。
(12)前記少なくとも1つのエンドライシンのうちの少なくとも1つが、配列番号4のアミノ酸を含むCP25L、配列番号5のアミノ酸を含むPlyCP26F、および配列番号6のアミノ酸を含むPlyCP39O、またはこれらのエンドライシンのいずれかの誘導体から選択され、前記誘導体が、その由来元であるエンドライシンの少なくとも33%の溶菌活性を有する、項目1から10までのいずれか1項に記載の方法。
(13)前記誘導体が、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、または配列番号6のいずれか1つのアミノ酸配列に対して、少なくとも80%の配列同一性、好ましくは少なくとも85%の配列同一性、より好ましくは少なくとも90%の配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも95%の配列同一性、最も好ましくは少なくとも97%の配列同一性を有する;または、
前記誘導体が、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、または配列番号6のいずれか1つのアミノ酸配列と比較して、1~30個の、好ましくは1~20個の、より好ましくは1~15個の、さらにより好ましくは1~10個のアミノ酸置換、挿入、および/または欠失を有する、項目11または12に記載の方法。
(14)前記少なくとも1つのエンドライシンが、ZP278、CP25L、および/もしくはZP173、またはそれらの誘導体であり、前記組成物が、150~700mMのNaCl、好ましくは200~550mMのNaClを含有する、前記ZP278、CP25L、および/もしくはZP173L、またはそれらの誘導体の緩衝化水溶液である、項目1から13までのいずれか1項に記載の方法。
(15)前記少なくとも1つのエンドライシンのうちの少なくとも1つが、ZP173またはそれらの誘導体であり、前記組成物が、pH4.5~8.0のpHを有する、好ましくはpH4.7~6.0のpHを有する、前記ZP173またはそれらの誘導体の緩衝化水溶液である、項目1から14までのいずれか1項に記載の方法。
(16)前記植物材料が、ホウレンソウ、フダンソウ、ビートの根、ニンジン、テンサイ、ニコチアナ・タバカム(Nicotiana tabacum)、ニコチアナ・ベンサミアナ(Nicotiana benthamiana)からなる群から選択される植物由来の材料である、かつ/または前記植物材料が、1つまたは複数の葉、根、塊茎、もしくは種子、または前記葉、根、塊茎、もしくは種子の、破砕された、粉砕された、もしくは微粉砕された生成物である、項目2に記載の方法。
(17)クロストリジウムに対して活性を有する少なくとも1つのエンドライシンを含む組成物を生成するプロセスであって、
(i)前記少なくとも1つのエンドライシンを、植物中で、好ましくは食用植物中で発現させるステップ、
(ii)前記植物体から、発現されたエンドライシンを含有する植物材料を収穫するステップ、
(iii)水性バッファーを使用して、前記植物材料から前記少なくとも1つのエンドライシンを抽出して、前記少なくとも1つのエンドライシンを含有する組成物を得るステップ
を含み、
(iv)前記組成物から望ましくない汚染物質を除去するステップ
を含んでもよいプロセス。
(18)ステップ(iii)が、50~400mMのNaCl、好ましくは140~310mMのNaCl、およびスルフヒドリル化合物を含有する、水性バッファーを使用して行われる、項目17に記載のプロセス。
(19)ステップ(iv)が、疎水性相互作用クロマトグラフィーステップ、脱塩ステップ、およびイオン交換クロマトグラフィーステップをこの順序で含む、項目17に記載のプロセス。
(20)前記エンドライシンが、項目11から13のいずれか1項に規定の通りである、または項目11から13のいずれか1項に規定の誘導体である、項目17に記載のプロセス。
(21)クロストリジウムに対して活性を有するエンドライシンを含む組成物。
(22)クロストリジウム・ディフィシルまたはクロストリジウム・パーフリンジェンスなどのクロストリジウムによる感染を治療するまたは予防する方法において使用される、項目21に記載の組成物。
(23)前記エンドライシンが、項目11から13のいずれか1項に規定の通りである、または項目11から13のいずれか1項に規定の誘導体である、項目21または22に記載の組成物。
(24)クロストリジウム・ディフィシルまたはクロストリジウム・パーフリンジェンスなどのクロストリジウムによる感染を治療する方法であって、クロストリジウムによる感染を患う対象へ、前記クロストリジウムに対して活性を有する少なくとも1つのエンドライシンを含む組成物を投与することを含む方法。
1)N-アセチルムラミダーゼ(リゾチーム)が、NAG-NAM間のβ-1-4-グリコシド結合を切断する、
2)N-アセチル-β-D-グルコサミニダーゼ(グルコシダーゼ)が、NAM-NAG間のβ-1-4-グリコシド結合を切断する、
3)N-アセチルムラモイル-L-アラニンアミダーゼが、糖とペプチドとの間のアミド結合を切断する(EC3.5.1.28)、
4)L-アラノイル-D-グルタミン酸エンドペプチダーゼおよびペプチド間架橋特異的エンドペプチダーゼが、細胞壁ペプチドグリカンのペプチド部分を切断する
の少なくとも4群がある。
本発明において使用されるライシンは、これらのタイプ1)~4)のいずれか1つまたは複数であってもよい。
クロストリジウム・ボツリヌス(Clostridium botulinum):ボツリヌス毒素を産生する;ボツリヌス中毒の原因となる;
クロストリジウム・ディフィシル:抗生物質療法後の細菌叢異常症;偽膜性大腸炎
クロストリジウム・パーフリンジェンス:食中毒からガス壊疽まで、広範な症状;
クロストリジウム・テタニ(Clostridium tetani):破傷風毒素を産生する;破傷風の原因となる;
クロストリジウム・ソルデリイ(Clostridium sordelii):医学的妊娠中絶後、きわめてまれに、致死的感染の原因となりうる
が挙げられる。
本発明の組成物および方法において、少なくとも1つのライシンが使用される。複数のライシン、例えば2つ、3つ、4つ、またはそれ以上のライシンを、例えば混合物として、本発明の方法、プロセス、または組成物において使用してもよい。2つ以上のライシンを組み合わせる場合、広範囲の抗クロストリジウム活性を獲得するために、かつ/またはクロストリジウムの変異によるライシンに対する抵抗性の発生を回避するために、ライシンの結合ドメインによって決定されるような、異なる標的特異性を有するライシンを組み合わせることが好ましい。別法としてまたは追加的に、2つ以上のライシンは、上記の1)~4)の4タイプのうちの様々な触媒活性を有する方法または組成物において使用される。例えば、タイプ1)のライシンをタイプ3)のライシンと組み合わせてもよい。
上記に示した配列番号のアミノ酸配列からなるアミノ酸配列を有するPsm、ZP173、およびZP278、CP25L、PlyCP26F、およびPlyCP39Oは、本明細書において、親ライシンとも呼ばれる。
配列番号1の残基10は、Lysである、
配列番号1の残基11は、Glyである;
配列番号1の残基12は、Ileである;
配列番号1の残基13は、Aspである;
配列番号1の残基21は、IleまたはLeuである;
配列番号1の残基27は、Lysである;
配列番号1の残基41は、Glyである;
配列番号1の残基46は、Aspである;
配列番号1の残基52は、Asnである;
配列番号1の残基63は、Valである;
配列番号1の残基64は、Glyである;
配列番号1の残基66は、Tyrである;
配列番号1の残基79は、Alaである;
配列番号1の残基86は、LeuまたはIleである;
配列番号1の残基100は、Leu、ValまたはIleである;
配列番号1の残基101は、AspまたはGluである;
配列番号1の残基123は、AspまたはGluである;
配列番号1の残基126は、Argである;
配列番号1の残基129は、Glyである;
配列番号1の残基135は、Tyrである;
配列番号1の残基143は、Asnである;
配列番号1の残基149は、LeuまたはIleである;
配列番号1の残基152は、Tyrである;
配列番号1の残基155は、Trpである;
配列番号1の残基159は、Tyrである;
配列番号1の残基169は、Ileである;
配列番号1の残基170は、Trpである;
配列番号1の残基177は、Glnである;
配列番号1の残基178は、Tyrである;
配列番号1の残基179は、Serである;
配列番号1の残基180は、Gluである;
配列番号1の残基181は、Asnである;
配列番号1の残基182は、Glyである;
配列番号1の残基189は、Glyである;
配列番号1の残基192は、Asp、Glu、またはAsn、好ましくはAspである;
配列番号1の残基198は、Asp、Glu、またはAsn、好ましくはGluである;
配列番号1の残基213は、Thrである;
配列番号1の残基221は、Leuである;
配列番号1の残基224は、Argである;
配列番号1の残基235は、Glyである;
配列番号1の残基237は、Ileである;
配列番号1の残基240は、Glyである;
配列番号1の残基251は、Aspである;
配列番号1の残基260は、Tyrである;
配列番号1の残基270は、Aspである;
配列番号1の残基282は、Asnである;
配列番号1の残基283は、Valである;
配列番号1の残基287は、Leuである;
配列番号1の残基290は、Argである;
配列番号1の残基292は、Gluである;
配列番号1の残基297は、Serである;および/または
配列番号1の残基306は、Glyである。
配列番号4の残基12は、Glyである;
配列番号4の残基45は、Glyである;
配列番号4の残基71は、Glyである;
配列番号4の残基72は、Alaである;
配列番号4の残基121は、Glyである;
配列番号4の残基149は、Glyである;
配列番号4の残基188は、Asnである;
配列番号4の残基189は、Argである;
配列番号4の残基209は、Ile、LeuまたはValである;
配列番号4の残基226は、Ile、LeuまたはValである;
配列番号4の残基267は、Alaである;
配列番号4の残基273は、Proである;
配列番号4の残基282は、Argである;
配列番号4の残基283は、Valである;
配列番号4の残基287は、Argである;
配列番号4の残基311は、GluまたはAsp、好ましくはGluである;
配列番号4の残基312は、Lysである;
配列番号4の残基317は、Ile、LeuまたはValである;
配列番号4の残基323は、Tyrである;および/または
配列番号4の残基330は、Ile、LeuまたはVal、好ましくはIleである。
(a)例えば、上記で定義したような水性バッファーを使用して、植物材料から発現されたライシンを抽出するステップ、
(b)抽出物から不溶性材料を除去して、水性バッファー中ライシン溶液を得るステップ、この後、この溶液を濃縮してもよい、
(c)水性バッファー中ライシン溶液を疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC)にかけるステップ、この後、脱塩またはバッファー交換をしてもよい
を含んでもよい。
さらなる精製ステップとして、ステップ(c)の後に、イオン交換クロマトグラフィーステップを用いてもよい。イオン交換クロマトグラフィーは、陽イオン交換クロマトグラフィーステップでも陰イオン交換クロマトグラフィーステップでもよい。ライシンZP173、PlyCP26F、PlyCP39O、およびそれらの誘導体のためには、陽イオン交換クロマトグラフィーが好ましい。ライシンZP278、CP25L、およびpsm、ならびにそれらの誘導体のためには、陰イオン交換クロマトグラフィーが好ましい。
本発明のライシンは、クロストリジウムによる食物などの対象物の汚染を予防するまたは低減するために用いてもよい。クロストリジウムによる対象物の汚染とは、対象物へのクロストリジウム生細胞またはそれらの芽胞の付着を意味する。クロストリジウムによる汚染を低減するとは、対象物に付着しているクロストリジウム生細胞の数を低減することを意味する。クロストリジウムによる対象物の汚染を判定することは、一般知識の一部である。例えば、実施例において行われているような、ホモジナイズした食品の溶液もしくは分散液の希釈液のプレーティング、または他の対象物のすすぎ液の希釈液のプレーティングを行い、その後、細菌コロニーを数えてもよい。
(a)組成物は、ZP278もしくはそれらの誘導体、CP25Lもしくはそれらの誘導体、Psmもしくはそれらの誘導体、および/またはZP173もしくはそれらの誘導体から選択される少なくとも1つのエンドライシンを含有し、それによって、Psmまたはその誘導体、およびZP173またはその誘導体は、代替的に存在してもよい;
(b)組成物は、ZP278またはそれらの誘導体を含有する;
(c)組成物は、ZP173またはそれらの誘導体を含有する;
(d)組成物は、Psmまたはそれらの誘導体を含有する;
(e)組成物は、CP25Lまたはそれらの誘導体を含有する;
(f)組成物は、ZP278またはそれらの誘導体およびZP173またはそれらの誘導体を含有する;
(g)組成物は、ZP278またはそれらの誘導体およびPsmまたはそれらの誘導体を含有する;
(h)組成物は、ZP278またはそれらの誘導体およびZP173またはそれらの誘導体、ならびにCP25Lまたはそれらの誘導体を含有する;
(i)組成物は、ZP278またはそれらの誘導体およびPsmまたはそれらの誘導体、ならびにCP25Lまたはそれらの誘導体を含有する;
(j)組成物は、150~700mMのNaCl、好ましくは200~550mMのNaClを含有する緩衝化水溶液であり、組成物は、上記の項目(a)から(i)のいずれか1項に規定された通りである;
(k)処理されるべき対象物は食品であり、組成物は、上記の項目(a)から(i)のいずれか1項に規定された通りである;
(l)処理されるべき対象物は、食肉であり、組成物は、上記の項目(a)から(j)のいずれか1項に規定された通りであり、好ましくは、組成物は、4~8のpHの水溶液、好ましくは4.5~7のpHの水溶液、より好ましくは5.0~6.5のpHの水溶液、さらにより好ましくは5.0~6のpHの水溶液である。
クロストリジウムによる対象物の汚染を予防するまたは低減するために、対象物の表面を、例えば上述のような濃度の、本発明の1つまたは複数のライシンを含有する溶液で濡らしてもよい。例えば、食品などの対象物を、本発明の1つまたは複数のライシンの溶液中に浸しても、本発明の1つまたは複数のライシンの溶液を吹き付けてもよい。濡らした後、濡らした対象物を、さらに処理してもよく、またはそのままにして乾燥させてもよい。食品の場合、濡らした食品は、薄切りにするまたは挽くなどさらに加工されてもよく、かつ/または顧客への輸送用に梱包されても、食するために調理されてもよい。
ライシンがクロストリジウムによる動物またはヒトの感染を予防するまたは治療するために使用される場合は、ライシンは動物またはヒトに投与される。動物の例としては、家禽およびウシなどの家畜である。一般に、動物またはヒトへの投与のために、ライシンを含有する液体または固体医薬組成物が調製される。液体組成物は、上述のような水溶液であってもよい。固体組成物は、少なくとも1つのライシンを含有する、例えば凍結乾燥形態の粉末、またはこのような粉末から得られた錠剤であってもよい。投与は、経口であってもよい。この場合、医薬調製物は、胃の中の酸性媒体による作用を受けることなく胃を通過できる医薬調製物である。ライシンは、次いで、腸の中で医薬調製物から放出される必要がある。このような医薬調製物は、当技術分野で既知である。例としては、胃の中の酸性媒体に耐性のある錠剤およびカプセル剤である。発現されたライシンを含有する大腸菌または植物材料などの生物学的材料を患者へ経口的に投与することが、さらに可能である。ライシンは、1日当たり1mg~1000mgの量でヒト成人へ、好ましくは1日当たり10mg~250mgの量でヒト患者へ投与されてもよい。このような量を、また動物へ投与してもよい。
別の投与経路としては、クロストリジウムによる感染を予防するための、患者の血流中への注入がある。この目的のために、ライシンを生理食塩水中に溶解してもよく、溶液は滅菌する。
本発明のまた別の態様は、以下のとおりであってもよい。
〔1〕クロストリジウムによる食品の汚染を予防するまたは低減する方法であって、前記食品を、前記クロストリジウムに対して活性を有する少なくとも1つのエンドライシンを含む組成物と接触させることを含む方法。
〔2〕クロストリジウムによる食品の汚染を予防するまたは低減する方法であって、前記食品を、植物材料またはその抽出物である組成物であって、前記クロストリジウムに対して活性を有する少なくとも1つのエンドライシンを含む前記組成物と接触させることを含み、植物材料が、前記少なくとも1つのエンドライシンを発現している食用植物由来の材料である、前記方法。
〔3〕前記組成物が、植物材料もしくはその抽出物であるか、または植物材料もしくはその抽出物を含み、植物材料が、前記少なくとも1つのエンドライシンを発現している植物、好ましくは前記少なくとも1つのエンドライシンを発現している食用植物由来の材料である、前記〔1〕に記載の方法。
〔4〕前記組成物が、前記少なくとも1つのエンドライシンを含有する水溶液であり、または前記組成物が、前記少なくとも1つのエンドライシンを含有する凍結乾燥粉末または乾燥粉末であり、前記粉末が、使用前に水または水溶液に溶解または懸濁されていてもよい、前記〔1〕から〔3〕までのいずれか1項に記載の方法。
〔5〕前記少なくとも1つのエンドライシンを含有する前記水溶液が、50~400mMのNaCl、好ましくは140~310mMのNaClを含有する緩衝化水溶液であり、スルフヒドリル化合物をさらに含有していてもよい、前記〔4〕に記載の方法。
〔6〕前記食品が、前記少なくとも1つのエンドライシンを含有する水溶液を吹き付けられる、または前記少なくとも1つのエンドライシンを含有する水溶液中へ浸漬される、前記〔1〕から〔5〕までのいずれか1項に記載の方法。
〔7〕前記食品が食肉である、前記〔1〕から〔6〕までのいずれか1項に記載の方法。
〔8〕前記食肉が、生肉、加熱調理された肉、または肉汁である、前記〔7〕に記載の方法。
〔9〕前記クロストリジウムが、クロストリジウム・パーフリンジェンスである、前記〔1〕から〔8〕までのいずれか1項に記載の方法。
〔10〕前記クロストリジウム・パーフリンジェンスが、A型、B型、C型、D型、およびE型から選択されるいずれか1つまたは複数、好ましくはエンテロトキシンCPEを含有するA型菌株である、前記〔9〕に記載の方法。
〔11〕前記少なくとも1つのエンドライシンのうちの少なくとも1つが、配列番号1のアミノ酸配列を含むPsm、配列番号2のアミノ酸配列を含むZP173、および配列番号3のアミノ酸配列を含むZP278、またはこれらのエンドライシンのいずれかの誘導体から選択され、前記誘導体が、その由来元であるエンドライシンの少なくとも33%の溶菌活性を有する;または、
前記少なくとも1つのエンドライシンのうちの少なくとも1つが、配列番号4のアミノ酸配列を含むCP25L、配列番号5のアミノ酸配列を含むPlyCP26F、および配列番号6のアミノ酸配列を含むPlyCP39O、またはこれらのエンドライシンのいずれかの誘導体から選択され、前記誘導体が、その由来元であるエンドライシンの少なくとも33%の溶菌活性を有する、前記〔1〕から〔10〕までのいずれか1項に記載の方法。
〔12〕前記誘導体またはエンドライシンが、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、または配列番号6のいずれか1つのアミノ酸配列に対して、少なくとも80%の配列同一性、好ましくは少なくとも85%の配列同一性、より好ましくは少なくとも90%の配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも95%の配列同一性、最も好ましくは少なくとも97%の配列同一性を有する;または、
前記誘導体またはエンドライシンが、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、または配列番号6のいずれか1つのアミノ酸配列と比較して、1~30個の、好ましくは1~20個の、より好ましくは1~15個の、さらにより好ましくは1~10個のアミノ酸置換、挿入、および/または欠失を有する、前記〔11〕に記載の方法。
〔13〕前記少なくとも1つのエンドライシンが、ZP278もしくはそれらの誘導体、CP25Lもしくはそれらの誘導体、および/またはZP173もしくはそれらの誘導体である、前記〔1〕から〔12〕までのいずれか1項に記載の方法。
〔14〕前記少なくとも1つのエンドライシンが、ZP278またはそれらの誘導体およびZP173またはそれらの誘導体であり、または前記少なくとも1つのエンドライシンが、ZP278またはそれらの誘導体およびPsmまたはそれらの誘導体である、前記〔1〕から〔13〕までのいずれか1項に記載の方法。
〔15〕前記少なくとも1つのエンドライシンが、ZP278またはそれらの誘導体、およびZP173またはそれらの誘導体、およびCP25Lまたはそれらの誘導体である、前記〔1〕から〔14〕までのいずれか1項に記載の方法。
〔16〕前記食品が食肉である、前記〔13〕、〔14〕、または〔15〕のいずれか1項に記載の方法。
〔17〕前記組成物が、150~700mMのNaCl、好ましくは200~550mMのNaClを含有する緩衝化水溶液であり、かつ/または前記組成物が、4~8のpHの水溶液、好ましくは4.5~7のpHの水溶液、より好ましくは5.0~6.5のpHの水溶液、さらにより好ましくは5.0~6.0のpHの水溶液である、前記〔13〕、〔14〕、〔15〕、または〔16〕のいずれか1項に記載の方法。
〔18〕前記少なくとも1つのエンドライシンが、ZP278、CP25L、および/もしくはZP173、またはそれらの誘導体であり、前記組成物が、150~700mMのNaCl、好ましくは200~550mMのNaClを含有する、前記ZP278、CP25L、および/もしくはZP173L、またはそれらの誘導体の緩衝化水溶液である、前記〔1〕から〔12〕または〔13〕から〔17〕のいずれか1項に記載の方法。
〔19〕前記植物材料が、ホウレンソウ、フダンソウ、ビートの根、ニンジン、テンサイ、ニコチアナ・タバカム、ニコチアナ・ベンサミアナからなる群から選択される植物由来の材料である、かつ/または前記植物材料が、1つまたは複数の葉、根、塊茎、もしくは種子、または前記葉、根、塊茎、もしくは種子の、破砕された、粉砕された、もしくは微粉砕された生成物である、前記〔2〕または〔3〕に記載の方法。
〔20〕クロストリジウムに対して活性を有する少なくとも1つのエンドライシンを含む組成物を生成する方法であって、
(i)前記少なくとも1つのエンドライシンを、植物中で、好ましくは食用植物中で発現させるステップ、
(ii)前記植物から、発現されたエンドライシンを含有する植物材料を収穫するステップ、
(iii)水性バッファーを使用して、前記植物材料から前記少なくとも1つのエンドライシンを抽出して、前記少なくとも1つのエンドライシンを含有する組成物を得るステップ
を含み、
(iv)前記組成物から望ましくない汚染物質を除去するステップ
を含んでもよい、前記方法。
〔21〕ステップ(iv)が、疎水性相互作用クロマトグラフィーステップ、脱塩ステップ、およびイオン交換クロマトグラフィーステップをこの順序で含む、前記〔20〕に記載の方法。
〔22〕クロストリジウムに対して活性を有するエンドライシンを含む組成物。
〔23〕クロストリジウム・ディフィシルまたはクロストリジウム・パーフリンジェンスなどのクロストリジウムによる感染を治療するまたは予防する方法において使用するための、前記〔22〕に記載の組成物。
(細菌株および増殖条件)
本研究において使用したA.ツメファシエンス(A.tumefaciens)菌株は、表1に列記する。大腸菌株DH5αは、すべてのクローニング手順の受容体として使用した。大腸菌およびA.ツメファシエンス細胞は、いずれもLB培地中で、それぞれ37℃または30℃で増殖させた。培地はすべて、必要に応じて、100μg/mLアンピシリン、50μg/mLスペクチノマイシン、50μg/mLカナマイシン、および25μg/mLリファンピシンを補充した。クロストリジウム・パーフリンジェンスは、AnaeroGenガス発生システム(Oxoid)を使用して、嫌気性条件で、TSB培地(トリプティックソイブロス)中で、37℃で増殖させた。本研究で使用したC.パーフリンジェンス菌株を、表2に列記する。
植物中で発現させるエンドライシンを、表3に記載する。植物に最適化させた遺伝子をコードする配列は、Eurofins、Austria(psm、PlyCP26F、PlyCP39O)およびGenScript、USA(CP25L、ZP173、ZP278)によって合成した。
得られた3’プロベクターpNMDV503(PlyCP26F)およびpNMDV516(PlyCP39O)のT-DNA領域、ならびに連結ベクターpNMDV509(細胞質ゾルpsm)、pNMDV600(細胞質ゾルZP173)、pNMDV601(細胞質ゾルZP278)、pNMDV599(細胞質ゾルCP25L)、pNMDV508(葉緑体psm)、pNMDV603(葉緑体ZP_02640173)、pNMDV604(葉緑体ZP278)、pNMDV602(葉緑体CP25L)のT-DNA領域を、図1に示す。Thermo Scientificからの制限酵素および修飾酵素を、すべてのクローニングステップに使用した。
植物におけるライシン発現
N.ベンサミアナおよびホウレンソウ植物体は、16時間の明期および8時間の暗期の光周期で、25℃で、育成チャンバー内で生育させた。4~6週齢の植物体を、組換えA.ツメファシエンスによるインフィルトレーションおよび吹き付けに使用した。
A.ツメファシエンスは、50mg/lリファンピシンおよびプラスミドの種類に応じたその他の適切な抗生物質(インテグラーゼ、TMV3’プロベクター、およびTMV連結ベクターの選択には50mg/lカナマイシン;5’TMVプロベクターの選択には50mg/lカルベニシリン)を含有するLuria-Bertani培地中で、30℃で、一晩増殖させた。アグロバクテリウムを一晩培養した培養液を、1.5のOD600に調整し、3220×gで5分間、沈殿させ、同量の水道水に再懸濁した。
植物アグロインフィルトレーションは、既述のように実施した(Starkevic at al., 2015)。5’プロベクター、3’プロベクター、およびインテグラーゼプラスミド構築物を含有する、3つのA.ツメファシエンス菌株の混合物を、針のないシリンジを使用して、葉の背軸側へインフィルトレートさせた。細胞質ゾル標的化用(pICH20111)および葉緑体標的化用(pICH20030)のMagnICON 5’プロベクターモジュール、ならびにインテグラーゼ発現ベクターpICH14011は、3’モジュールpNMDV503およびpNMDV516と一緒に使用した。5’および3’プロベクターモジュールを含有する菌株は1:100の希釈で、インテグラーゼカセット含有菌株は1:40の希釈で使用した。植物の葉を観察し、インフィルトレーションの5~6日後に収集した。pICH20111(細胞質ゾル発現用の5’プロベクター)、pICH20030(葉緑体発現用の5’プロベクター)、およびpICH14011(インテグラーゼ)構築物は、Kalthoff et al. (2010)に記載されている。
連結ベクターを使用した、N.ベンサミアナおよびホウレンソウ中でのライシン発現のために、Hahn et al. (2014)に記載されているように、連結ベクターを含有するA.ツメファシエンス菌株の1:1000希釈液を植物の葉に吹き付けた。吹き付けは、0.1%(体積/体積)Silwet L77(Kurt Obermeier)を含有する水道水に希釈した細菌を用いて実施した。植物の葉を観察し、吹き付けの6~10日後に収集した。
溶菌活性試験のためのタンパク質粗抽出物の調製
凍結した植物材料を、冷やした乳鉢および乳棒を用いてホモジナイズし、バッファー5mlに対して組織1gの比で、抽出バッファー(50mMのNaH2PO4、5mMのDTT、150mMのNaCl、pH7.5と混合した。細胞破片は、4℃で、3220gで60分間の遠心分離によって除去した。上清をろ過し、総可溶性タンパク質として得た。
ライシンの精製は、試料のホモジナイゼーション、清澄化、HICクロマトグラフィー、続いて脱塩、およびCEXCまたはAEXCカラムという、一般的なスキームに従った(図2)。
ZP173. 50mMのNaH2PO4、2mMのDTT、0.1%Tween80(pH7.0)を含有するバッファーで抽出したホモジナイズした植物材料を、清澄化し、ブチルセファロースFFカラムに載せる。カラムを、50mMのNaH2PO4、2mMのDTT、1.1Mの(NH4)2SO4、pH7.0で、135~145mS/cmで洗浄する。ライシンを、50mMのNaH2PO4、2mMのDTT、pH7.0を含有する溶出バッファーの30%での段階的勾配によって溶出する。濃縮/希釈手順(導電率<7ms/cm)によるバッファー交換後、調製物をSPセファロースFFカラムに載せる。カラムを、50mMのNaH2PO4、2mMのDTT、pH5.0で洗浄し、50mMのNaH2PO4、2mMのDTT、0.5MのNaCl、pH5.0の直線勾配(0~100%)によって溶出する(図2A)。
溶菌活性試験
(濁度低下アッセイおよびcfu計数)
タンパク質粗抽出物または精製したライシンを、溶菌活性試験で使用した。C.パーフリンジェンスは、嫌気性条件下で、TSB中でOD600約0.7まで増殖させ、遠心分離によって沈殿させ、選択したバッファーに再懸濁した。細菌懸濁液950~999μLを、精製ライシンまたはタンパク質粗抽出物1~50μLと混合し、RT(室温)でインキュベートした。OD600測定値は、5~10分毎に、分光光度計(Genesys20、Thermo Scientific)によって得た。実験は3回同じ方法で実施した。
細菌と植物抽出物との60分の共インキュベーションの後、cfu計数のための段階希釈をpH7.3の1×PBSで行った。非希釈、10、102、103、104、および105倍に希釈した各試料30μLを、TSAプレート上にプレーティングした。嫌気性条件下で、37℃で一晩インキュベートした後、CFUを数えた。
加熱調理された肉におけるライシン粗抽出物の溶菌活性試験
タンパク質粗抽出物は、6dpiでアグロインフィルトレーションしたN.ベンサミアナ植物を収穫して、50mMのNaH2PO4、300mMのNaCl(pH5.0)を含有するバッファーを使用して調製した。タンパク質抽出物は、約0.44~0.66μg/μLの濃度に希釈した。C.パーフリンジェンスNCTC8237菌株は、嫌気性条件下で、TSB中でOD600=0.24~0.26まで増殖させた。七面鳥胸肉および牛塊肉は、地元の市場から購入した。ぶつ切りにした七面鳥肉は、圧力鍋で30分間、ぶつ切りにした牛肉は60分間、加熱調理した。
被分析試料の段階希釈は、pH7.3の1×PBSで行い、非希釈、10、102、103、104、および105倍の各試料30μLを、TSAプレート上にプレーティングした。嫌気性条件下で、37℃で一晩インキュベートした後、細菌cfu/mLを数えた。
(ZP173およびZP278配列の解析)
ZP_02640173(WP_003469359)およびZP_02640278(WP_003469445)(以降、本文および図面中で、それぞれ「ZP173」および「ZP278」と呼ぶ)のアミノ酸配列のBlast解析から、両タンパク質においてGH25ドメインが明らかとなった。いずれのタンパク質も、GenBankでは細菌細胞壁ヒドロラーゼとして注釈がつけられているが、クロストリジウム・パーフリンジェンスF4969ゲノム(コンティグNZ_ABDX01000023.1およびNZ_ABDX01000024.1)の詳しい調査からは、ZP173およびZP278いずれの近傍にも幾つかのファージ遺伝子が存在することがわかる。ZP173の右側には、クロストリジウムファージphiSM101のDNAアデニン特異的メチルトランスフェラーゼに近似のDNAアデニン特異的メチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子がある。クロストリジウムファージphiS63のgp17に相同のタンパク質、ファージのマイナー構造タンパク質、ファージtail tape measureタンパク質もまた近くに位置する。ZP278はまた、ファージ様タンパク質:ファージのマイナー構造タンパク質、tail tape measureタンパク質、キャプシドタンパク質の近傍に位置する。おそらく、ZP173およびZP278はいずれも、C.パーフリンジェンスF4969ゲノムに取り込まれたプロファージ領域の残遺物中に局在化しており、バクテリオファージ溶菌酵素ファミリーに属する。
ニコチアナ・ベンサミアナにおけるライシン発現の最適化のために、Marillonet et al. (2004)およびEP1385968によって既述されている、magnICONプロベクターシステム(Icon Genetics、Halle、Germany)を使用した。細胞質ゾル発現および葉緑体標的化を運命づけた一連の5’TMVモジュール(図1A)を使用して、組換えライシンの発現レベルを試験した。植物シリンジインフィルトレーション実験には、プロベクターモジュール(pNMDV503およびpNMDV516)を使用した。植物吹き付け実験には、連結ベクター(pNMDV509、pNMDV599、pNMDV600、pNMDV601、pNMDV508、pNMDV602、pNMDV603、およびpNMDV604)を使用した(図1BおよびC)。
3種のA.ツメファシエンス菌株(インテグラーゼ、5’プロベクターのどれか、および3’プロベクターのどれか)の組合せをインフィルトレートさせたまたは連結ベクターを有するA.ツメファシエンス菌株を吹き付けたN.ベンサミアナの葉を、インフィルトレーションの5~10日後に収穫し、タンパク質抽出を行った。Laemmliバッファーによる葉の抽出物を、SDS-PAGEによって分析した(図4)。
細胞質ゾル構築物では、psmおよびZP173ライシンのクマシー染色したSDS-PAGEゲルにおいて、約38~39kDaの予想されたサイズの特異的バンドが検出された。葉緑体標的化psmは、細胞質ゾル構築物と同レベルの泳動度であり、これは、シグナルペプチドが完全に切断されていることを示している。しかしながら、葉緑体標的化ZP173は、より高い分子量タンパク質として泳動され、これは、葉緑体シグナルペプチドがほとんど切断されていないことを示している。理論的なZP278の分子量は40.2kDaであるが、SDS-PAGEでは、このライシンは約2kDaの差がある二重バンドとして泳動され、上方のバンドは理論的なサイズと一致していた。同様の傾向が、葉緑体のZP278構築物について観察された(図4A)。
次に、食用植物における組換えライシン発現レベルを決定した。若いホウレンソウ植物体に、連結したライシン発現ベクターを保有するA.ツメファシエンス菌株を吹き付けた。3つの被験ライシン(psm、ZP173、およびZP278)すべてを、ホウレンソウで発現させた。発現レベルは、葉緑体構築物を使用した場合が勝っていた。ZP173は、葉緑体トランジットペプチドの切断は、ホウレンソウではタバコよりはるかに良好であったが、細胞質ゾルZP173の発現は、きわめて弱いものであった(図4C)。
C.パーフリンジェンスファージライシン、psm、ZP173、ZP278、CP25L、PlyCP26F、およびPlyCP39Oを発現した植物の粗抽出物を、まず、C.パーフリンジェンス基準株NCTC8237(ATCC13124)と試験した(図5)。細菌懸濁液と植物の発現抽出物とのインキュベーションによって、(反応性の順に)ZP173、psm、ZP278、およびCP25Lの迅速なODの低下がもたらされた。PlyCP26FおよびPlyCP39Oもまた、細菌懸濁液を清澄化することができたが、よりゆっくりと、比較的低い程度で作用した(図5A)。ライシン抽出物で1時間処理した細菌懸濁液のCFU数から、被験ライシンはすべて高活性であることが実証された。この実験では、CP25L処理は、C.パーフリンジェンスcfu/mlの数値を5.7log10、ZP173処理は4.8log10低減させ、psm処理は、cfu/mlの数値を4log10、PlyCP26F処理は3.1log10、ZP278処理は2.6log10、PlyCP39O処理は2log10低減させた(図5B)。
クロストリジウム・パーフリンジェンスは、加熱調理された肉製品および仕出し食品の摂取による感染の最も一般的な原因である。食品添加物としてライシンをうまく使用するためには、ライシンは、食品中で通常みられるpHおよび塩分条件で有効である必要がある。ライシンを食品加工助剤として使用するつもりであれば、ライシンは、食品の調製に用いられる条件下で、それらの活性を発揮できる必要もある。様々な因子:pH、NaCl濃度、温度が、精製したライシンの活性に及ぼす影響を評価した(図7)。
ライシンが機能性をとどめる極端な温度条件を探した。ZP173は、37℃~44℃で30分間のインキュベーション後、その十分な活性を維持していた。50℃では、ライシン活性は低下し、55℃ではほぼ完全に消失した(図8A)。
周囲温度および37℃でのより長い時間のインキュベーションの影響を検討した。ZP173は、37℃で3日まで安定しており(図8C)、室温での貯蔵6週間後は、50%の活性を維持した(図8B)。CP25Lは、室温ではきわめて安定しており、6週間のインキュベーション後、その活性は実質的に変化していなかった。しかしながら、37℃では、2日後、その活性は衰えはじめ、37℃でのインキュベーションの7日後には、CP25Lは、本来の活性の約20%を保持したに過ぎなかった(図8BおよびC)。
hisタグ付けして大腸菌で発現させたCP25Lの熱安定性が、Gervasi et al. (2014)によって評価されている、ここに記載されている研究では、CP25Lは、4℃で同様に安定であったが、貯蔵の15日後、室温で活性を失いはじめ、よって、植物で産生されたCP25Lは、細菌で産生されたその同等物より良好な安定性を示す。本発明者らは、精製したZP173およびCP25Lライシンは、4℃できわめて安定であり、周囲温度で数日から数週間の貯蔵の後、高い活性を保持し、37℃では数日後でも有意な機能性を示すと結論する。
植物で発現させたライシン精製物を、さらに、食品から分離した様々なC.パーフリンジェンス菌株と試験した(表2)。ライシン処理した食品分離株のCfu係数実験は、ライシンに対する異なる菌株特異性を実証しているが、被験菌株はすべて、6種のライシンすべてに対して多かれ少なかれ感受性であった(図9)。Psm、ZP173、およびZP278はcfu数を非常に強力に低減させ(1~8Δlog10)、CP25Lはcfu数を1.5~4Δlog10低減させ、PlyCP26FおよびPlyCP39Oはそれより低い程度で作用した(1Δlog10まで)。本発明者らの実験条件(pH5.5)が、よりアルカリ性媒体でより良好な活性を有するCP25Lよりも、ZP173およびZP278、ことによるとpsmにより最適なものであることに注目すべきである。PlyCP26FおよびPlyCP39Oの最適pH条件が、それぞれ6.8および8.2であったことも発表されている(Simmons et al., 2010)。本発明者らが選択したpHは、食品で非常に一般的にみられる酸性度条件に関連し、Psm、ZP173、およびZP278が最も有望な候補であるような条件ではあるが、よりアルカリ性の食品と使用する場合には、CP25L、PlyCP26F、およびPlyCP39Oの使用を検討することができる。
インビトロで植物psm、Z173、およびZP278抽出物の活性を実証した後、ライシン抽出物を使用して、食品中のC.パーフリンジェンス栄養細胞の数を減少させることができるかどうかを検討した。不適切に管理された食品の条件をシミュレートするために、細かく刻んだ加熱調理された七面鳥肉および牛肉を室温で使用した。psmを発現するN.ベンサミアナの全タンパク質抽出物300μgを使用して、104cfu/mlのC.パーフリンジェンスが接種された肉10gを処理した。一晩インキュベートした後の両種類の肉において、psmを用いた試料では、cfu数は変化してなかったのに対し、対照試料では、細菌cfu数は4log増え、108cfu/mlに達した(図10)。
このように、植物で発現されたC.パーフリンジェンスライシンのタンパク質粗抽出物を使用して、少なくとも幾つかの条件において、食品中のC.パーフリンジェンス細菌の栄養増殖を制御することが可能である。
食中毒の原因であるほかに、C.パーフリンジェンスは、ヒトにおけるより重篤な疾患:ガス壊疽および壊疽性腸炎の病原体である。C.パーフリンジェンスはまた、重大な家禽疾患である壊死性腸炎の原因物質でもある。壊死性腸炎は、多因子病であり、家禽において疾患への進行をもたらすその素因はまだ完全に理解されていないが、植物で発現させたライシンの飼料または寝わらを補充することが、クロストリジウムの数を制御する一助となる可能性がある。
バクテリオファージライシンは、一般的に安全とみなされており、したがって、食品の処理のために、また、抗生物質に替わるヒトおよび動物の治療薬として使用することができる。
加熱調理された肉における溶菌活性
(方法)
C.パーフリンジェンスNCTC8237を、モデル病原菌株として使用した。培養物は、嫌気的に、TSB中でOD600約0.3まで増殖させ、次いで、OD600=0.025まで希釈した。細かく刻んだ加熱調理された七面鳥肉10gの試料は、856mMのNaClを補充したpH5.5のクエン酸-リン酸バッファー3mlおよび希釈した細菌100μL(4log cfu/ml)と混合した。精製ライシン25μgまたはナイシン50μgを加え、徹底的に混合し、嫌気的に室温でインキュベートした。ナイシン(Sigma)は、粉末を0.02NのHCl中に溶解して、5mg/ml保存液を調製した。被分析試料の段階希釈は、256mMのNaClを補充したpH5.5のクエン酸-リン酸バッファーで行い、各試料50μLをTSAプレート上にプレーティングした。嫌気性条件下で、37℃で一晩インキュベートした後、細菌cfu/ml計数を行った。非希釈試料のプレート当たり25cfuの数を検出下限(500cfu/mlまたは2.7log10cfu/ml)とみなした(Sutton (2011))。
ライシンが、食品基質上のC.パーフリンジェンス栄養生細胞の数を減少させることができるかどうかを分析した。不適切に管理された食品の条件をシミュレートするために、104cfu/mlのC.パーフリンジェンス栄養細胞を接種した、細かく刻んだ加熱調理された七面鳥を室温で使用した。現在、ポリペプチドナイシンは、食品防腐剤として承認されている唯一のバクテリオシンであり、食品産業でその常用が増えているのはそれが理由である。ナイシンは、グラム陽性菌に対する抗菌活性、特に芽胞形成種に対する抗菌活性を有しており、栄養細胞、および発芽芽胞からの再増殖の両方を阻害することができる(Gharsallaoui (2016))。しかしながら、ナイシンは、実験室条件下で、C.パーフリンジェンスの芽胞からの再増殖および栄養細胞に対する阻害効果を示したにもかかわらず、食肉モデル系において接種したC.パーフリンジェンス芽胞へのナイシンの阻害効果は観察されなかった(Udompijitkul (2012))。このことは、ナイシンが、発芽した芽胞からの再増殖だけを阻止することを示唆している。栄養細胞に対するナイシン作用は、ナイシンの濃度、細菌の濃度、細菌株、生理的状態、および曝露条件によって、殺菌性か静菌性のいずれかでありえ、Garde (2014)によって概説されているように、ほとんどの場合、ナイシンの作用は、殺芽胞性であるよりもむしろ静芽胞性である。
Claims (23)
- クロストリジウムによる食品の汚染を予防するまたは低減する方法であって、前記食品を、前記クロストリジウムに対して活性を有する少なくとも1つのエンドライシンを含む組成物と接触させることを含み、ここで
前記少なくとも1つのエンドライシンの少なくとも1つが、配列番号2のアミノ酸配列を有するZP173、またはその誘導体であり、
前記誘導体が、配列番号2のアミノ酸配列に対して少なくとも85%の配列同一性を有するか、又は、配列番号2のアミノ酸配列と比較して、1~30個のアミノ酸残基の置換、挿入、および/または欠失を有する、
前記方法。 - クロストリジウムによる食品の汚染を予防するまたは低減する方法であって、前記食品を、植物材料またはその抽出物である組成物であって、前記クロストリジウムに対して活性を有する少なくとも1つのエンドライシンを含む前記組成物と接触させることを含み、ここで、
植物材料が、前記少なくとも1つのエンドライシンを発現している食用植物由来の材料であり、
前記少なくとも1つのエンドライシンの少なくとも1つが、配列番号2のアミノ酸配列を有するZP173、またはその誘導体であり、
前記誘導体が、配列番号2のアミノ酸配列に対して少なくとも85%の配列同一性を有するか、又は、配列番号2のアミノ酸配列と比較して、1~30個のアミノ酸残基の置換、挿入、および/または欠失を有する、
前記方法。 - 前記組成物が、植物材料もしくはその抽出物であるか、または植物材料もしくはその抽出物を含み、植物材料が、前記少なくとも1つのエンドライシンを発現している植物由来の材料である、請求項1に記載の方法。
- 前記組成物が、前記少なくとも1つのエンドライシンを含有する水溶液であり、または前記組成物が、前記少なくとも1つのエンドライシンを含有する凍結乾燥粉末または乾燥粉末であり、前記粉末が、使用前に水または水溶液に溶解または懸濁されていてもよい、請求項1から3までのいずれか1項に記載の方法。
- 前記少なくとも1つのエンドライシンを含有する前記水溶液が、50~400mMのNaClを含有する緩衝化水溶液であって、かつスルフヒドリル化合物をさらに含有していてもよい、前記緩衝化水溶液である、請求項4に記載の方法。
- 前記食品が、前記少なくとも1つのエンドライシンを含有する水溶液を吹き付けられる、または前記少なくとも1つのエンドライシンを含有する水溶液中へ浸漬される、請求項1から5までのいずれか1項に記載の方法。
- 前記食品が食肉である、請求項1から6までのいずれか1項に記載の方法。
- 前記食肉が、生肉、加熱調理された肉、または肉汁である、請求項7に記載の方法。
- 前記クロストリジウムが、クロストリジウム・パーフリンジェンスである、請求項1から8までのいずれか1項に記載の方法。
- 前記クロストリジウム・パーフリンジェンスが、A型、B型、C型、D型、およびE型から選択されるいずれか1つまたは複数である、請求項9に記載の方法。
- 前記誘導体が、配列番号2のエンドライシンZP173の少なくとも33%の溶菌活性を有する、請求項1から10までのいずれか1項に記載の方法。
- 前記食品が食肉である、請求項9、10、または11のいずれか1項に記載の方法。
- 前記組成物が、150~700mMのNaClを含有する緩衝化水溶液であり、かつ/または前記組成物が、4~8のpHの水溶液である、請求項9、10、11、または12のいずれか1項に記載の方法。
- 前記組成物が、5.0~6.5のpHの水溶液である、請求項13に記載の方法。
- 前記植物材料が、ホウレンソウ、フダンソウ、ビートの根、ニンジン、テンサイ、ニコチアナ・タバカム、ニコチアナ・ベンサミアナからなる群から選択される植物由来の材料である、かつ/または前記植物材料が、1つまたは複数の葉、根、塊茎、もしくは種子、または前記葉、根、塊茎、もしくは種子の、破砕された、粉砕された、もしくは微粉砕された生成物である、請求項2または3に記載の方法。
- クロストリジウムに対して活性を有する少なくとも1つのエンドライシンを含む組成物を生成する方法であって、
(i)前記少なくとも1つのエンドライシンを、植物中で発現させるステップ、
(ii)前記植物から、発現されたエンドライシンを含有する植物材料を収穫するステップ、
(iii)水性バッファーを使用して、前記植物材料から前記少なくとも1つのエンドライシンを抽出して、前記少なくとも1つのエンドライシンを含有する組成物を得るステップ
を含み、
(iv)前記組成物から望ましくない汚染物質を除去するステップ
を含んでもよく、
ここで、前記少なくとも1つのエンドライシンの少なくとも1つが、配列番号2のアミノ酸配列を有するZP173、またはその誘導体であり、
前記誘導体が、配列番号2のアミノ酸配列に対して少なくとも85%の配列同一性を有するか、又は、配列番号2のアミノ酸配列と比較して、1~30個のアミノ酸残基の置換、挿入、および/または欠失を有する、
前記方法。 - ステップ(iv)が、疎水性相互作用クロマトグラフィーステップ、脱塩ステップ、およびイオン交換クロマトグラフィーステップをこの順序で含む、請求項16に記載の方法。
- クロストリジウム・ディフィシルまたはクロストリジウム・パーフリンジェンスなどのクロストリジウムによる感染を治療するまたは予防する方法において使用するための、クロストリジウムに対して活性を有するエンドライシンを含む組成物であって、
前記少なくとも1つのエンドライシンの少なくとも1つが、配列番号2のアミノ酸配列を有するZP173、またはその誘導体であり、
前記誘導体が、配列番号2のアミノ酸配列に対して少なくとも85%の配列同一性を有するか、又は、配列番号2のアミノ酸配列と比較して、1~30個のアミノ酸残基の置換、挿入、および/または欠失を有する、
前記組成物。 - クロストリジウムによる食品の汚染を予防するまたは低減する方法に用いるための、前記クロストリジウムに対して活性を有する少なくとも1つのエンドライシンを含む組成物であって、
前記少なくとも1つのエンドライシンの少なくとも1つが、配列番号2のアミノ酸配列を有するZP173、またはその誘導体であり、
前記誘導体が、配列番号2のアミノ酸配列に対して少なくとも85%の配列同一性を有するか、又は、配列番号2のアミノ酸配列と比較して、1~30個のアミノ酸残基の置換、挿入、および/または欠失を有する、
前記組成物。 - 前記組成物が、植物材料もしくはその抽出物であるか、または植物材料もしくはその抽出物を含み、植物材料が、前記少なくとも1つのエンドライシンを発現している植物由来の材料である、請求項19に記載の組成物。
- 前記組成物が、前記少なくとも1つのエンドライシンを含有する水溶液であり、または前記組成物が、前記少なくとも1つのエンドライシンを含有する凍結乾燥粉末または乾燥粉末である、請求項19又は20に記載の組成物。
- 前記少なくとも1つのエンドライシンを含有する前記水溶液が、50~400mMのNaClを含有する緩衝化水溶液であって、かつスルフヒドリル化合物をさらに含有していてもよい、前記緩衝化水溶液である、請求項21に記載の組成物。
- 前記クロストリジウムが、クロストリジウム・パーフリンジェンスである、請求項19から22までのいずれか1項に記載の組成物。
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