DE60127401T2

DE60127401T2 - Milchvieh immunisierung mit mig protein

Info

Publication number: DE60127401T2
Application number: DE60127401T
Authority: DE
Inventors: Andrew A. Saskatoon POTTER; Alexandra J. Calgary BOLTON; Xin Ming Saskatoon SONG
Original assignee: University of Saskatchewan
Current assignee: University of Saskatchewan
Priority date: 2000-06-12
Filing date: 2001-06-11
Publication date: 2008-01-03
Anticipated expiration: 2021-06-12
Also published as: WO2001096380A2; ATE357248T1; PT1292327E; WO2001096380A3; ES2283419T3; DE60127401D1; AR030293A1; EP1292327B1; US20020025322A1; CY1107670T1; US6740322B2; CA2411925A1; DK1292327T3; WO2001096380A8; CA2411925C; EP1292327A2; UY26762A1

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein bakterielle Antigene sowie Gene, welche dieselben codieren. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung die Clonierung, Expression und Charakterisierung des Mig-Fe-Rezeptor-Proteins verschiedener Streptococcus-Bakterienarten, und die Verwendung desselben in Impfstoffzusammensetzungen.
Hintergrund
Mastitis ist eine Infektion der Brustdrüse, welche üblicherweise durch Bakterien oder Pilze hervorgerufen wird. Die auf eine Infektion folgende Entzündungsreaktion hat einen verminderten Milchertrag sowie eine geringere Qualität zur Folge und verursacht in der Milchindustrie jährlich bedeutende Verluste.
Zu den Bakterienarten, welche am häufigsten mit einer Mastitis assoziiert sind, gehören verschiedene Arten der Gattung Streptococcus, einschließlich Streptococcus aureus, Streptococcus uberis (nicht typisierbar), Streptococcus agalactiae (Lancefield-Gruppe B), Streptococcus dysgalactiae (Lancefield-Gruppe C), Streptococcus zooepidemicus sowie die Streptokokken der Lancefield-Gruppen D, G, L und N. Einige dieser Spezies sind kontagiöse Keime (z.B. S. agalactiae), während andere als Umweltpathogene angesehen werden (z.B. S. dysgalactiae und S. uberis).
Das Umweltpathogen S. uberis ist für etwa 20% aller klinischen Fälle einer Mastitis verantwortlich (Bramley A.J. und Dodd F.H., J. Dairy Res. 51 (1984), 481-512; Bramley A.J., Animal Health Nutrition 42 (1987), 12-16; Watts J.L., J. Dairy Sci. 71 (1988), 1616-1624); und ist der vorherrschende Organismus, welcher während der nicht säugenden Phase aus Brustdrüsen isoliert wird (Bramley A.J., Br. Vet. J. 140 (1984), 328-335; Bramley und Dodd, J. Dairy Res. 51 (1984), 481-512; Oliver S.P., Am. J. Vet. Res. 49 (1988), 1789-1793).
Eine Mastitis, welche aus einer Infektion mit S. uberis resultiert, verläuft im Allgemeinen subklinisch und ist durch eine anscheinend normale Milch gekennzeichnet, wobei eine Erhöhung der somatischen Zellzahlen aufgrund der Einwanderung von Leukocyten beobachtet wird. Die chemische Zusammensetzung der Milch wird aufgrund einer Suppression der Sekretion durch den Übertritt von Natriumchlorid und Bicarbonat aus dem Blut in die Milch verändert, wodurch eine Verschiebung des pH-Wertes zu einem alkalischeren Wert verursacht wird. Eine S. uberis-Mastitis kann auch die Form eines akuten klinischen Zustands mit offensichtlichen Krankheitssymptomen, wie einer Koagulation oder Verfärbung der Milch und einer Schwellung oder Verhärtung des Euters, annehmen. Einige Fälle der klinischen Erkrankung können schwer verlaufen, wobei auch Fieber auf treten kann. Für eine Besprechung der klinischen Manifestationen einer S. uberis-Mastitis vgl. Bramely (1991), Mastitis: Physiology or Pathology, S. 3-9, in C. Burvenich, G. Vandeputte-van Messom und A.W. Hill (Hrsg.), New Insights into the Pathogenesis of Mastitis, Rijksuniversiteit Gent, Belgien; und Schalm et al. (1971), The Mastitis Complex-A, Kurzzusammenfassung, S. 1-3, in Bovine Mastitis, Lea & Febiger, Philadelphia.
Herkömmliche antibakterielle Kontrollmethoden wie das Zitzentauchen und eine Antibiotikumtherapie sind bei der Kontrolle von vielen Formen einer kontagiösen Mastitis wirksam, wobei aber die Umweltorganismen, welche typischerweise in allen Milchviehställen zu finden sind, gegen solche Maßnahmen häufig resistent sind. Daher ist eine Impfung eine interessante Strategie, um Infektionen der Brustdrüsen zu verhindern, wobei gezeigt worden ist, dass sie im Fall von einigen pathogenen Erregern einer kontagiösen Mastitis vorteilhaft ist.
Jedoch ist die Literatur in Bezug auf Impfstudien mit Umwelterregern wie S. dysgalactiae und S. uberis begrenzt, wobei unterschiedliche Ergebnisse beobacht worden sind. In einigen Fällen hatte die Immunisierung eine erhöhte Empfindlichkeit gegen den spezifischen Organismus zur Folge, und in anderen Fällen ist ein stammspezifischer Schutz erzielt worden.
Zum Beispiel haben frühere Studien gezeigt, dass eine Primärinfektion mit S. uberis die Infektionsrate nach einer zweiten Exposition mit demselben Stamm erheblich vermindern kann (Hill A.W., Res. Vet. Sci. 44 (1988), 386-387). Eine lokale Impfung mit abgetöteten S. uberis-Bakterien schützt die Brustdrüse von Rindern gegen eine intramammäre Exposition mit dem homologen Stamm (Finch et al., Infect. Immun. 62 (1994), 3599-3603). Ebenso ist gezeigt worden, dass eine subkutane Impfung mit lebenden S. uberis-Bakterien eine drastische Modifikation der Pathogenese einer Mastitis durch denselben Stamm hervorruft (Hill et al., FEMS Immunol. Med. Microbiol. 8 (1994), 109-118). Die auf diese Weise geimpften Tiere sonderten weniger Bakterien in ihre Milch ab und viele Drüsenviertel blieben frei von einer Infektion.
Trotzdem kann eine Impfung mit lebenden oder attenuierten Bakterien Risiken für den Empfänger beinhalten. Ferner wird deutlich, dass herkömmliche Impfstoffe, welche abgetötete Erreger enthalten, im Allgemeinen gegen S. uberis und S. agalactiae weitgehend unwirksam sind, was entweder auf das Fehlen von protektiven Antigenen auf den in vitro gezüchteten Zellen oder die Maskierung dieser Antigene durch molekulare Mimikry zurückzuführen ist.
Das gegenwärtige Fehlen vorhandener Impfstoffe gegen S. agalactiae oder die kontagiösen Streptococcus-Stämme ist zumindest zum Teil auf einen Mangel an Kenntnissen in Bezug auf die Virulenzdeterminanten und die protektiven Antigene, welche durch diese Organismen produziert werden und welche an der Invasion und dem Schutz der Brustdrüse beteiligt sind, zurückzuführen (Collins et al., J. Dairy Res. 55 (1988), 25-32; Leigh et al., Res. Vet. Sci. 49 (1990), 85-87; Marshall et al., J. Dairy Res. 53 (1986), 507-514).
Es ist bekannt, dass S. dysgalactiae an mehrere extrazelluläre und aus dem Plasma stammende Proteine wie Fibronectin, Fibrinogen, Kollagen, alpha-II-Makroglobulin, IgG, Albumin und andere Verbindungen bindet. Der Organismus produziert auch Hyaluronidase und Fibrinolysin und ist in der Lage, sich an Rinder-Brustdrüsenepithelzellen anzuhaften und in diese einzudringen. Jedoch sind die genauen Funktionen der Bakterienkomponenten, welche für diese Phänotypen bei der Pathogenese verantwortlich sind, nicht bekannt.
In gleicher Weise ist die Pathogenese einer S. uberis-Infektion nur unzureichend verstanden. Außerdem ist der Einfluss von S. uberis-Virulenzfaktoren auf die Abwehrmechanismen des Wirtes und die Physiologie der Brustdrüse nicht hinreichend definiert. Bekannte Virulenzfaktoren, welche mit S. uberis assoziiert sind, schließen eine Hyaluronsäurekapsel (Hill A.W., Res. Vet. Sci. 45 (1988), 400-404), eine Hyaluronidase (Schaufuss et al., Zentralbl. Bakteriol. Ser. A 271 (1989), 46-53), ein R-ähnliches Protein (Groschup M.H. und Timoney J.F., Res. Vet. Sci. 54 (1993), 124-126) und ein Cohämolysin, den CAMP-Faktor, auch bekannt als UBERIS-Faktor (Skalka B. und Smola J., Zentralbl. Bakteriol. Ser. A 249 (1981), 190-194), ein R-ähnliches Protein, den Plasminogenaktivator und den CAMP-Faktor ein. Jedoch ist nur wenig über ihre Funktionen bei der Pathogenität bekannt.
Die Verwendung von Virulenzdeterminanten aus Streptococcus als immunogene Agenzien ist vorgeschlagen worden. Zum Beispiel ist gezeigt worden, dass der CAMP-Faktor von S. uberis ein Wirbeltier-Individuum vor einer Infektion durch diesen Organismus schützt (Jiang et al., US-Patent Nr. 5,863,543 ).
Das γ-Antigen des Gruppe B-Streptococcus-Stamms A909 (ATCC Nr. 27591) ist eine Komponente des c-Protein-Markerkomplexes, welcher des Weiteren eine α- und eine β-Untereinheit umfasst (Boyle, US-Patent Nr. 5,721,339 ). Es ist berichtet worden, dass Untergruppen von Serotyp Ia-, II- und praktisch allen Serotyp Ib-Zellen der Gruppe B-Streptokokken Komponenten des c-Proteins exprimieren. Die Verwendung der γ-Untereinheit als ein immunogenes Agens gegen Infektionen durch Lancefield-Gruppe B-Streptokokken ist vorgeschlagen worden. Jedoch ist die Verwendung davon zur Verhinderung oder Behandlung von Bakterieninfektionen bei Tieren, einschließlich einer Mastitis bei Rindern, nicht untersucht worden.
Das Gruppe A-Streptococcus-M-Protein wird aufgrund seiner Fähigkeit, einen Angriff durch menschliche Phagocyten zu verhindern, als einer der wichtigsten Virulenzfaktoren dieses Organismus angesehen (Lancefield R.C., J. Immunol. 89 (1962), 307-313). Die Bakterien persistieren in dem infizierten Gewebe bis Antikörper gegen das M-Molekül gebildet werden. Typspezifische Antikörper gegen das M-Protein sind in der Lage, die anti-phagocytische Wirkung des Moleküls aufzuheben und eine effiziente Eliminierung des eindringenden Organismus zu ermöglichen.
Die M-Proteine gehören zu den Hauptvirulenzfaktoren von Streptococcus pyogenes, da sie an der Vermittlung einer Resistenz gegen eine Phagocytose beteiligt sind (Kehoe M.A., Vaccine 9 (1991), 797-806), und aufgrund ihrer Fähigkeit, möglicherweise schädliche Immunreaktionen des Wirtes durch ihre Superantigenität hervorzurufen, sowie aufgrund ihrer Kapazität, Wirt-kreuzreaktive Antikörper-Reaktionen zu induzieren (Bisno A.L., New Engl. J. Med. 325 (1991), 783-793; Froude et al., Curr. Top. Microbiol. Immunol. 145 (1989), 5-26; Stollerman G.H., Clin. Immunol. Immunopathol. 61 (1991), 131-142).
Jedoch ist die Verwendung intakter M-Proteine als Impfstoffe mit Schwierigkeiten verbunden. Die Opsonin-Epitope des Proteins sind äußerst typspezifisch, woraus ein begrenzter typspezifischer Schutz resultiert. Ferner scheinen einige M-Proteine Epitope zu enthalten, welche mit den Geweben des immunisierten Individuums kreuzreaktiv sind, wodurch eine schädliche Autoimmunreaktion ausgelöst wird (vgl. z.B. Dale J.G. und Beachey E.H., J. Exp. Med. 156 (1982), 1165-1176; Dale J.B. und Beachey E.H., J. Exp. Med. 161 (1985), 113-122; Baird R.W., Bronze. M.S., Draus W., Hill H.R., Veasey L.G. und Dale J.B., J. Immun. 146 (1991), 3132-3137; Bronze M.S. und Dale J.B., J. Immun. 151 (1993), 2820-2828; Cunningham M.W. und Russell S.M., Infect. Immun. 42 (1983), 531-538).
Chimäre Proteine, enthaltend drei unterschiedliche Fibronectin-Bindungsdomänen (FNBDs), abgeleitet von Fibronectin-Bindungsproteinen aus S. dysgalactiae und Staphylococcus aureus, sind auf der Oberfläche von Staph. carnosus-Zellen exprimiert worden. Im Falle eines dieser Proteine hatten intranasale Immunisierungen mit lebenden rekombinanten Staph. carnosus-Zellen, welche das chimäre Protein auf ihrer Oberfläche exprimieren, eine stärkere Antikörperreaktion gegen ein Modell-Immunogen, das auf der Oberfläche des chimären Proteins präsentiert wird, zur Folge (Liljeqvist S. et al., FEBS Letters 446 (1999), 299-304).
Bakterielle Fc-Rezeptoren (Oberflächeneinheiten, die über einen nicht-immunen Mechanismus an Immunglobulinmoleküle, d.h. an den Fc-Teil des Antikörpers, binden) bilden eine Klasse von Bindungsproteinen, welche anhand ihrer Reaktivität mit verschiedenen Klassen und Unterklassen von Säugetier-Immunglobulinen weiter klassifiziert werden. Der Typ I-Rezeptor (auch bekannt als Protein A), welcher der am eingehendsten untersuchte und charakterisierte Rezeptor ist, ist aus Staphylococcus aureus isoliert worden, und bindet an die IgG-Typen 1, 2 und 4; wobei dieser Rezeptortyp außerdem eine Kreuzreaktivität mit IgA und IgM zeigt. Über den Typ II-Fc-Rezeptor, welcher auf einigen Streptokokken der Lancefield-Gruppe A vorkommt, und den Typ III-Rezeptor (auch bekannt als Protein G), welcher auf der Mehrzahl der menschlichen Gruppe C- und Gruppe G-Stämme von Streptococcus zu finden ist, ist berichtet worden, dass sie mit allen vier IgG-Typen reagieren. Im Falle des Typ III-Rezeptors ist die Bindung an IgG äußerst spezifisch, wobei das Protein keine Kreuzreaktivität mit IgA oder IgM zeigt. Der Typ IV-Rezeptor ist auf bestimmten Rinder-Streptokokken der Gruppe G zu finden, und der Typ V-Rezeptor kommt auf bestimmten Stämmen von Streptococcus zooepidemicus vor. Der Typ VI-Fe-Rezeptor ist aus den S. zooepidemicus-Stämmen S212 und RSS-212 isoliert worden und bindet mit hoher Affinität an Ratten-IgG, d.h. die Affinität ist 100-mal stärker als die Bindung von Protein A und 30- bis 40-mal stärker als die Bindung von Protein G (Boyle et al., US-Patent Nr. 4,997,082 ). Für eine Besprechung der Fc-Rezeptoren vgl. Langone, Adv. Immunol. 32 (1982), 167; und Myhre et al., Basic Concepts of Streptococci and Streptococcal Diseases (Holm & Christensen, Hrsg.), Redbook Ltd., Chertsey, Surrey, England.
US 5,328,987 offenbart eine DNA-Sequenz, welche ein menschliche IgA-Fc-Rezeptor-Protein codiert. Jonsson et al. (Euro: J. Biochem. 220 (1994), 819-826) beschreiben ein Mig-Protein.
Die Anwendung von Fc-Bindungsproteinen beschränkte sich bis heute auf den Nachweis und die Reinigung von Antikörpern. Im Hinblick auf klinische Anwendungen ist ein Verfahren zur extrakorporalen Blutbehandlung bei einer Autoimmunkrankheit, welches Fc-Bindungsproteine verwendet, um Antigen-Antikörper-Komplexe zu eliminieren, vorgeschlagen worden (vgl. z.B. Fahnestock, US-Patent Nr. 4,954,618 ). Jedoch ist die Verwendung davon in Impfstoffzusammensetzungen vorher weder beschrieben noch vorgeschlagen worden.
Bisher ist die protektive Kapazität des S. dysgalactiae-Mig-Proteins gegen eine Mastitis nicht erforscht worden, noch ist das S. dysgalactiae-Mig-Protein isoliert oder charakterisiert worden.
Zusammenfassung der Erfindung
Dementsprechend stellt die vorliegende Erfindung Fc-Rezeptor-Proteine und Anwendungen dafür bereit. In einer Ausführungsform betrifft die Erfindung eine Impfstoffzusammensetzung, welche einen pharmazeutisch annehmbaren Träger und ein Fc-Rezeptor-Protein umfasst. Das Fc-Rezeptor-Protein ist gewählt aus der Gruppe bestehend aus:

(a) einem Streptococcus dysgalactiae-Mig-Protein, umfassend die in Aminosäureposition 1 bis einschließlich 669 der 1A-1D (SEQ ID NO: 4) gezeigte Aminosäuresequenz; und
(b) einem Fc-Rezeptor-Protein, welches mindestens etwa 70% Sequenzübereinstimmung mit (a) auweist.

In einigen Ausführungsformen umfasst die Impfstoffzusammensetzung ein Adjuvans.
In noch weiteren Ausführungsformen betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer Impfstoffzusammensetzung. Das Verfahren umfasst die folgenden Schritte:

(a) Bereitstellen eines Fe-Rezeptor-Proteins, wobei das Rezeptor-Protein gewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: i) einem Streptococcus dysgalactiae-Mig-Protein, umfassend die in Aminosäureposition 1 bis einschließlich 669 der 1A-1D (SEQ ID NO: 4) gezeigte Aminosäuresequenz; und ii) einem Fc-Rezeptor-Protein, welches mindestens etwa 70% Sequenzübereinstimmung mit (i) aufweist, und
(b) Kombinieren des Proteins mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger.

In einer anderen Ausführungsform betrifft die Erfindung die Verwendung eines Fc-Rezeptor-Proteins, wobei das Fe-Rezeptor-Protein gewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: (a) einem Streptococcus dysgalactiae-Mig-Protein, umfassend die in Aminosäureposition 1 bis einschließlich 669 der 1A-1D (SEQ ID NO: 4) gezeigte Aminosäuresequenz; und (b) einem Fc-Rezeptor-Protein, welches mindestens etwa 70% Sequenzübereinstimmung mit (a) aufweist, bei der Herstellung eines Medikaments zur Verhinderung einer Bakterieninfektion in einem Wirbeltier-Individuum.
In bestimmten Ausführungsformen ist die Bakterieninfektion eine Streptokokken-Infektion. Weiterhin kann die Bakterieninfektion eine Mastitis verursachen.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung die Verwendung eines Polynucleotids, das eine codierende Sequenz für ein Fc-Rezeptor-Protein umfasst, wobei das Fc-Rezeptor-Protein gewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: (a) einem Streptococcus dysgalactiae-Mig-Protein, umfassend die in Aminosäureposition 1 bis einschließlich 669 der 1A-1D (SEQ ID NO: 4) gezeigte Aminosäuresequenz; und (b) einem Fc-Rezeptor-Protein, welches mindestens etwa 70% Sequenzübereinstimmung mit (a) aufweist, bei der Herstellung eines Medikaments, welches zur Behandlung oder Verhinderung einer Bakterieninfektion in einem Wirbeltier-Individuum nützlich ist.
In bestimmten Ausführungsformen ist die Bakterieninfektion eine Streptokokken-Infektion, welche eine Mastitis verursachen kann.
Diese und andere Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sind für Fachleute im Hinblick auf die Offenbarung hierin leicht ersichtlich.
Kurze Beschreibung der Figuren
Die 1A-1D zeigen die Polynucleotidsequenz, welche das Streptococcus dysgalactiae-Mig-Protein codiert, und die daraus abgeleitete Aminosäuresequenz (SEQ ID NO: 3 bzw. SEQ ID NO: 4).
2 zeigt die folgenden Ergebnisse für die Peptidstrukturanalyse des S. dysgalactiae-Mig-Proteins: ein Kyle-Doolittle-Hydropathiediagramm ("KD-Hydrophilizität"), gemittelt über ein Fenster von 7; ein Emini-Oberflächen-Probabilitätsdiagramm ("Oberflächen-Prob."); ein Karplus-Schulz-Kettenflexibilitätsdiagramm ("Flexibilität"); ein Jameson-Wolf-Antigenindex-Diagramm; und sowohl ein Chou-Fasman- als auch ein Garnier-Osguthorpe-Robson-Sekundärstruktur-Diagramm ("CF-alpha-Helices" und "CF-beta-Faltblätter"; bzw. "GOR-Schleifen", "GOR-alpha-Helices", "GOR-beta-Faltblätter" und "Glykosylierungsstellen").
3 ist ein Chou-Fasman-Sekundarstruktur-Diagramm für das S. dysgalactiae-Mig-Protein.
4 vergleicht die Veränderung hinsichtlich des Prozentsatzes der Euterviertel, welche mit S. dysgalactiae infiziert sind, über einen Zeitraum von 7 Tagen in drei Versuchsgruppen: (1) ungeimpfte Kontrolltiere; (2) Tiere geimpft mit dem Mig-Protein; und (3) Tiere geimpft mit GapC, einem aus S. dysgalactiae isolierten Plasmin-Bindungs- Protein, das gleichzeitig untersucht wurde. Eine Infektion wurde definiert als die Gewinnung von > 500 CFU der S. dysgalactiae-Bakterien pro ml der Milchsekretionen.
In 5 ist die beobachtete Entzündungsreaktion auf eine Infektion mit S. dysgalactiae als mittlere somatische Zellzahlen (SCC) für jede Versuchsgruppe gegen die Zeit in Tagen nach der Exposition graphisch dargestellt. In der Figur entsprechen Rauten (-✦-) nicht-exponierten, ungeimpften Drüsenvierteln; entsprechen Quadrate (-∎-) exponierten, ungeimpften Tieren; entsprechen Dreiecke (-Δ-) exponierten, Mig-geimpften Tieren; und entsprechen Xe (-X-) exponierten, GapC-geimpften Tieren.
6 veranschaulicht die somatischen Zellzahlen pro Brustdrüsenviertel am Tag 1 nach der Exposition. In der Figur kennzeichnet der Balken den Mittelwert für jede Gruppe. Quadrate (-∎-) entsprechen ungeimpften Tieren; Dreiecke
entsprechen GapC-geimpften Tieren; und umgedrehte Dreiecke
entsprechen Mig-geimpften Tieren.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Die Durchführung der vorliegenden Erfindung beinhaltet, sofern nicht anders angegeben, herkömmliche Techniken der Molekularbiologie, Mikrobiologie, DNA-Rekombinationstechnik und Immunologie, welche auf dem Fachgebiet bekannt sind. Diese Techniken werden in der Literatur ausführlich erläutert. Vgl. z.B. Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Bd. I, II und III, zweite Auflage (1989); Perbal B., A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); die Reihe 'Methods in Enzymology' (S. Colowick und N. Kaplan, Hrsg., Academic Press, Inc.); und 'Handbook of Experimental Immunology', Bd. I-IV (D.M. Weir und C.C. Blackwell, Hrsg., 1986, Blackwell Scientific Publications).

In dem Text werden die folgenden Aminosäureabkürzungen verwendet:

Alanin: Ala (A)	Arginin: Arg (R)
Asparagin: Asn (N)	Asparaginsäure: Asp (D)
Cystein: Cys (C)	Glutamin: Gin (Q)
Glutaminsäure: Glu (E)	Glycin: Gly (G)
Histidin: His (H)	Isoleucin: Ile (I)
Leucin: Leu (L)	Lysin: Lys (K)
Methionin: Met (M)	Phenylalanin: Phe (F)
Prolin: Pro (P)	Serin: Ser (S)
Threonin: Thr (T)	Tryptophan: Trp (W)
Tyrosin: Tyr (Y)	Valin: Val (V)

1. Definitionen
Bei der Beschreibung der vorliegenden Erfindung werden die folgenden Begriffe verwendet, welche definiert sind, wie nachstehend angegeben ist.
Es sollte angemerkt werden, dass die Singularformen "ein, eines oder einer" und "der, die oder das", so wie in dieser Beschreibung und den beigefügten Patentansprüchen verwendet, Verweise auf die Pluralform einschließen, falls aus dem Inhalt keine andere Bedeutung erkennbar wird. So schließt zum Beispiel der Verweis auf "ein Streptococcus dysgalactiae-Fc-Bindungsprotein" eine Mischung aus zwei oder mehreren solchen Proteinen und dergleichen ein.
Die Begriffe "Fe-Rezeptor-Protein" und "Fe-Bindungsprotein", welche hierin gleichbedeutend verwendet werden, bezeichnen ein bakterielles Protein, welches in der Lage ist, an Immunglobulinmoleküle an einer Stelle zu binden, welche sich von der Antigenerkennungsstelle unterscheidet, einschließlich, ohne Begrenzung darauf, der Fe-Region eines Immunglobulinmoleküls.
Die Begriffe "Mig-Protein" und "Mig-Fc-Rezeptor-Protein" und "Mig-Fc-Bindungsprotein" (hierin gleichbedeutend verwendet) oder eine Nucleotidsequenz, welche dasselbe codiert, bezeichnen ein Protein bzw. eine Nucleotidsequenz, das (die) von einem Mig-Gen abgeleitet ist, welches in einer Vielzahl von Bakterienarten, einschließlich, ohne Begrenzung darauf, in bestimmten Stämmen der Gruppe A-Streptokokken, vorkommt. Die Nucleotidsequenz eines charakteristischen Streptococcus-Mig-Gens aus S. dysgalactiae (SEQ ID NO: 3) und die entsprechende Aminosäuresequenz, welche durch das Gen codiert wird (SEQ ID NO: 4) sind in den 1A-1D dargestellt. Jedoch ist ein Mig-Protein, wie hierin definiert, nicht auf die gezeigten Sequenzen begrenzt, da Subtypen einer jeden dieser Streptococcus-Spezies bekannt sind und Variationen hinsichtlich der Mig-Proteine zwischen ihnen beobachtet werden.
Ein repräsentatives Mig-Gen, welches von S. dysgalactiae abgeleitet ist, ist in dem Plasmid pAA505Mig zu finden.
Weiterhin ist es nicht erforderlich, dass das abgeleitete Protein oder die abgeleiteten Nucleotidsequenzen auf physikalische Weise von dem oben beschriebenen Gen abgeleitet werden, sondern sie können in einer beliebigen Art und Weise, einschließlich zum Beispiel chemische Synthese, Isolierung (z.B. aus S. dysgalactiae) oder durch rekombinante Herstellung, basierend auf der hierin bereitgestellten Information erzeugt werden. Des Weiteren verweisen die Begriffe auf Proteine mit Aminosäuresequenzen, welche zu zusammenhängenden Aminosäuresequenzen, welche durch die Gene codiert werden, im Wesentlichen homolog sind (wie nachstehend definiert), und welche eine immunologische Aktivität und/oder eine Plasmin-Bindungsaktivität zeigen.
Somit verweisen die Begriffe auf vollständige, sowie immunogene, verkürzte und partielle Sequenzen und aktive Analoge und Vorläuferformen der Proteine. Die Begriffe schließen auch Nucleotidfragmente des Gens ein, welche mindestens etwa 8 aufeinanderfolgende Basenpaare, mehr bevorzugt mindestens etwa 10-20 aufeinanderfolgende Basenpaare und am meisten bevorzugt mindestens etwa 25 bis 50 oder mehr aufeinanderfolgende Basenpaare des Gens oder irgendwelche ganze Zahlen zwischen diesen Werten enthalten. Solche Fragmente sind als Sonden und bei diagnostischen Verfahren nützlich, wie nachstehend ausführlicher besprochen wird.
Die Begriffe schließen auch Formen ein, welche eine Signalsequenz besitzen, sowie solche, worin die Signalsequenz entfernt worden ist, falls eine solche vorhanden ist, und auch die Nucleinsäuresequenzen, welche diese codieren. Die Begriffe verweisen weiterhin auf Formen der Mig-Proteine, worin die Membranankerregion deletiert worden ist, sowie auf Nucleinsäuresequenzen, welche Proteine mit solchen Deletionen codieren. Solche Deletionen können in Systemen, welche keine Sekretion des Proteins vorsehen, wünschenswert sein. Außerdem können die Fc-Rezeptor-Bindungsdomänen des Proteins enthalten sein, wobei dies aber nicht erforderlich ist. So wird zum Beispiel, falls das Mig-Fc-Bindungsprotein für die Reinigung eines Immunglobulins verwendet wird, die Fc-Bindungsdomäne im Allgemeinen beibehalten. Falls das Protein zur Verwendung in Impfstoffzusammensetzungen bestimmt ist, sind immunogene Epitope vorhanden, welche die Fc-Rezeptor-Bindungsdomäne einschließen können, aber nicht müssen.
Die Begriffe schließen auch Proteine in neutraler Form oder in der Form von Basen- oder Säureadditionssalzen, abhängig von der Herstellungsweise, ein. Solche Säureadditionssalze können freie Aminogruppen enthalten, wobei basische Salze mit freien Carboxylgruppen gebildet werden können. Pharmazeutisch annehmbare Basen- und Säureadditionssalze werden nachstehend ausführlicher besprochen. Ferner können die Proteine durch die Kombination mit anderen biologischen Materialien wie Lipiden (sowohl solchen, welche in der Natur zusammen mit dem Molekül vorkommen, als auch anderen Lipiden, welche die immunologische Aktivität nicht beeinträchtigen) und Sacchariden oder durch eine Seitenkettenmodifikation, wie die Acetylierung von Aminogruppen, Phosphorylierung von Hydroxylseitenketten, Oxidation von Sulfhydrylgruppen oder Glykosylierung von Aminosäureresten, sowie anderen Modifikationen der codierten Primärsequenz modifiziert werden.
Die Begriffe schließen daher Deletionen, Additionen und Substitutionen innerhalb der Sequenz ein, solange das Polypeptid wirksam ist, um eine Immunantwort, wie hierin definiert, auszulösen. Im Hinblick darauf sind besonders bevorzugte Substitutionen im Allgemeinen konservativer Natur, d.h. solche Substitutionen, welche innerhalb einer Familie von Aminosäuren erfolgen. Zum Beispiel werden Aminosäuren im Allgemeinen in vier Familien unterteilt: (1) sauer – Aspartat und Glutamat; (2) basisch – Lysin, Arginin und Histidin; (3) unpolar – Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin, Prolin, Phenylalanin, Methionin und Tryptophan; und (4) ungeladen polar – Glycin, Asparagin, Glutamin, Cystin, Serin, Threonin und Tyrosin. Phenylalanin, Tryptophan und Tyrosin werden zuweilen als aromatische Aminosäuren klassifiziert. Zum Beispiel kann leicht vorhergesagt werden, dass ein vereinzelter Austausch von Leucin durch Isoleucin oder Valin oder umgekehrt; eines Aspartats durch ein Glutamat oder umgekehrt; eines Threonins durch ein Serin oder umgekehrt; oder ein ähnlicher konservierter Austausch einer Aminosäure durch eine strukturell verwandte Aminosäure keine große Auswirkung auf die biologische Aktivität hat. Proteine, welche im Wesentlichen dieselbe Aminosäuresequenz wie das Referenzmolekül haben, aber geringfügige Aminosäuresubstitutionen aufweisen, welche die Immunogenität und/oder Plasmin-Bindungsaffinität des Proteins nicht wesentlich beeinflussen, sind daher in der Definition des Referenzpolypeptids eingeschlossen.
Zum Beispiel kann das Polypeptid von Interesse bis zu etwa 5-10 konservative oder nichtkonservative Aminosäuresubstitutionen oder sogar bis zu etwa 15-25 oder 20-50 konservative oder nichtkonservative Aminosäuresubstitutionen oder irgendeine ganze Zahl zwischen diesen Werten enthalten, solange die gewünschte Funktion des Moleküls beibehalten wird.
In gleicher Weise wird die Immunogenität durch Substitutionen, welche in der Transmembran-Bindungsdomäne, falls vorhanden, und in der Signalsequenz, falls vorhanden, erfolgen, normalerweise nicht beeinflusst. Ein Fachmann kann unter Bezug auf die Peptidstukturdiagramme, welche hierin in 2 und 3 dargestellt sind, in einfacher Weise andere Regionen des Moleküls von Interesse ermitteln, welche eine Veränderung tolerieren können.
Der Begriff "Streptokokken-Mig-Protein" bezeichnet ein Mig-Fc-Bindungsprotein, wie oben definiert, welches von einer Streptokokken-Spezies abgeleitet ist, welche dasselbe herstellt, einschließlich, aber nicht darauf begrenzt, S. dysgalactiae. Zum Beispiel ist ein "S. dysgalactiae-Mig-Protein" ein Fc-Bindungsprotein, wie oben definiert, welches von S. dysgalactiae abgeleitet ist.
Die Begriffe "Wildtyp" oder "native" Proteine oder Polypeptide verweisen auf Proteine oder Polypeptide, welche aus der Quelle isoliert wurden, in welcher die Proteine natürlicherweise vorkommen. "Rekombinante" Polypeptide verweisen auf Polypeptide, welche durch DNA-Rekombinationstechniken hergestellt werden; d.h. durch Zellen hergestellt werden, welche mit einem exogenen DNA-Konstrukt, welches das gewünschte Polypeptid codiert, transformiert sind. "Synthetische" Polypeptide sind Polypeptide, welche durch eine chemische Synthese hergestellt werden.
Ein "isoliertes" Protein oder Polypeptid ist ein Protein- oder Polypeptidmolekül, welches separat und getrennt von dem gesamten Organismus vorliegt, in welchem das Molekül in der Natur vorkommt; oder ein Protein oder Polypeptid, welches im Ganzen oder zum Teil frei von Sequenzen ist, welche normalerweise in der Natur damit assoziiert sind; oder eine Sequenz, so wie sie in der Natur vorkommt, die aber heterologe Sequenzen (wie nachstehend definiert) enthält, welche damit assoziiert sind.
Der Begriff "funktionell äquivalent" bedeutet, dass die Aminosäuresequenz eines Mig-Fc-Bindungsproteins eine Sequenz ist, die eine im Wesentlichen äquivalente oder verstärkte Immunantwort, wie oben definiert, im Vergleich zu der Antwort, welche durch ein Fc-Bindungsprotein, das zu dem Referenz-Fc-Bindungsprotein identisch ist, oder einem immunogenen Teil davon ausgelöst wird, hervorruft.
Der Begriff "Epitop" bezieht sich auf die Stelle auf einem Antigen oder Hapten, auf welche spezifische B-Zellen und/oder T-Zellen antworten. Der Begriff wird auch gleichbedeutend mit "Antigendeterminante" oder "Antigendeterminantenstelle" verwendet. Antikörper, welche das gleiche Epitop erkennen, können in einem einfachen Immuntest unter Nachweis der Fähigkeit eines Antikörpers, die Bindung eines anderen Antikörpers an ein Zielantigen zu blockieren, identifiziert werden.
Der Begriff "immunogenes" Protein oder Polypeptid verweist auf eine Aminosäuresequenz, welche eine Immunantwort, wie nachstehend beschrieben, auslöst. Ein "immunogenes" Protein oder Polypeptid, wie hierin verwendet, schließt die vollständige Sequenz des fraglichen Fc-Rezeptor-Proteins, mit oder ohne der Signalsequenz, Membranankerdomäne und/oder Fc-Bindungsdomäne, Analoge davon oder immunogene Fragmente davon ein.
Mit einem "immunogenen Fragment" ist ein Fragment eines Fc-Rezeptor-Proteins gemeint, welches ein oder mehrere Epitop(e) einschließt und daher die nachstehend beschriebene Immunantwort auslöst. Solche Fragmente können mittels einer Reihe von Epitop-Kartierungstechniken identifiziert werden, welche auf dem Fachgebiet gut bekannt sind. Vgl. z.B. 'Epitope Mapping Protocols' in Molecular Biology, Bd. 66 (Glenn E. Morris, Hrsg., 1996), Humana Press, Totowa, New Jersey. Zum Beispiel können lineare Epitope z.B. durch das gleichzeitige Synthetisieren einer großen Anzahl von Peptiden an festen Trägern, wobei die Peptide Teilen des Proteinmoleküls entsprechen, und das Umsetzen der Peptide mit Antikörpern, während die Peptide noch an die Träger gebunden sind, ermittelt werden. Solche Techniken sind auf dem Fachgebiet bekannt und z.B. in US-Patent Nr. 4,708,871 ; Geysen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984), 3998-4002; Geysen et al., Molec. Immunol. 23 (1986), 709-715, beschrieben.
Ebenso können Konformationsepitope durch Bestimmung der räumlichen Konformation der Aminosäuren, wie z.B. durch Röntgenkristallographie oder eine zweidimensionale Kernmagnetresonanz, in einfacher Weise identifiziert werden. Vgl. z.B. Epitope Mapping Protocols, vorstehend. Antigene Bereiche von Proteinen können auch durch Standarddiagramme zur Antigenität und Hydropathie ermittelt werden, wie zum Beispiel solchen, welche unter Verwendung des Software-Programms Omiga, Version 1.0, erhältlich von der Oxford Molecular Group, berechnet werden. Dieses Computerprogramm verwendet die Hopp/Woods-Methode, Hopp et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78 (1981), 3824-3828, für die Bestimmung von Antigenitätprofilen, und die Kyte-Doolittle-Technik, Kyte et al., J. Mol. Biol. 157 (1982), 105-132, für Hydrophatiediagramme. Die 2 und 3 hierin zeigen Kyte-Doolittle-Profile für repräsentative Proteine, welche in der Erfindung eingeschlossen sind.
Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung enthalten immunogene Fragmente üblicherweise mindestens etwa 3 Aminosäuren, vorzugsweise mindestens etwa 5 Aminosäuren, mehr bevorzugt mindestens etwa 10-15 Aminosäuren und am meisten bevorzugt 25 oder mehr Aminosäuren des Ausgangsmoleküls des Mig-Fc-Rezeptor-Proteins. Hinsichtlich der Länge des Fragments gibt es keine kritische obere Grenze, wobei es nahezu die vollständige Länge der Proteinsequenz oder auch ein Fusionsprotein, umfassend zwei oder mehrere Epitope von Mig, umfassen kann.
Eine "immunogene Zusammensetzung" ist eine Zusammensetzung, welche ein Antigenmolekül umfasst, wobei die Verabreichung der Zusammensetzung an ein Individuum die Entwicklung einer humoralen und/oder einer zellulären Immunantwort auf das Antigenmolekül von Interesse in dem Individuum zur Folge hat.
Mit "Untereinheiten-Impfstoffzusammensetzung" ist eine Zusammensetzung gemeint, welche mindestens ein immunogenes Polypeptid, aber nicht alle Antigene enthält, welche von einem Antigen eines Pathogens von Interesse abgeleitet oder dazu homolog sind. Eine solche Zusammensetzung ist im Wesentlichen frei von intakten Zellen oder Partikeln des Pathogens oder das Lysat solcher Zellen oder Partikel. Demnach wird eine "Untereinheiten-Impfstoffzusammensetzung" aus zumindest teilweise gereinigten (vorzugsweise im Wesentlichen gereinigten), immunogenen Polypeptiden des Pathogens oder rekombinanten Analogen davon hergestellt. Eine Untereinheiten-Impfstoffzusammensetzung kann ein Untereinheiten-Antigen oder Untereinheiten-Antigene von Interesse umfassen, welche im Wesentlichen frei von anderen Antigenen oder Polypeptiden des Pathogens sind.
Mit "pharmazeutisch annehmbar" oder "pharmakologisch annehmbar" ist ein Material gemeint, welches biologisch oder anderweitig nicht unerwünscht ist, d.h. das Material kann in einer Formulierung oder Zusammensetzung an ein Individuum verabreicht werden, ohne irgendwelche unerwünschten biologischen Wirkungen hervorzurufen oder in einer nachteiligen Weise mit irgendeiner der Komponenten der Zusammensetzung, worin es enthalten ist, in Wechselwirkung zu treten.
Eine "Immunantwort" auf eine Zusammensetzung oder einen Impfstoff ist die Entwicklung einer zellulären und/oder Antikörpervermittelten Immunantwort auf die Zusammensetzung oder den Impfstoff von Interesse. Üblicherweise beinhaltet eine "Immunantwort" einen oder mehrere der folgenden Effekte, ist aber nicht darauf begrenzt: die Produktion von Antikörpern, B-Zellen, Helfer-T-Zellen, Suppressor-T-Zellen und/oder cytotoxischen T-Zellen und/oder γδ-T-Zellen, welche spezifisch gegen ein Antigen oder Antigene, welche in der Zusammensetzung oder dem Impfstoff von Interesse enthalten sind, gerichtet sind. Vorzugsweise zeigt der Wirt entweder eine therapeutische oder protektive Immunantwort, so dass die Resistenz der Brustdrüse gegen eine Neuinfektion erhöht wird und/oder die klinische Schwere der Krankheit vermindert wird. Ein solcher Schutz zeigt sich entweder durch eine Verringerung oder das Fehlen von Symptomen, die normalerweise durch einen infizierten Wirt gezeigt werden, und/oder eine schnellere Erholungszeit.
Mit "Nucleinsäure-Immunisierung" ist die Einschleusung eines Nucleinsäuremoleküls, welches ein oder mehrere ausgewählte Antigen(e) codiert, in eine Wirtszelle für die in-vivo-Expression eines Antigens, mehrerer Antigene, eines Epitops oder mehrerer Epitope gemeint. Das Nucleinsäuremolekül kann direkt in ein Empfängerindividuum eingebracht werden, wie zum Beispiel durch Injektion, Inhalation oder orale, intranasale und mukosale Verabreichung oder dergleichen, oder kann ex vivo in Zellen eingeschleust werden, welche aus dem Wirt gewonnen worden sind. Im letzteren Fall werden die transformierten Zellen wieder in das Individuum eingebracht, wo eine Immunantwort gegen das Antigen, welches durch das Nucleinsäuremolekül codiert wird, aufgebaut werden kann.
Der Begriff "Behandlung", wie hierin verwendet, verweist auf entweder (1) die Verhinderung einer Infektion oder Reinfektion (Prophylaxe), oder (2) die Verringerung oder Eliminierung von Symptomen der Krankheit von Interesse (Therapie).
Mit "Mastitis" ist eine Entzündung der Brustdrüse bei Säugetieren einschließlich bei Kühen, Mutterschafen, Ziegen, Sauen, Stuten und dergleichen gemeint, welche durch die Anwesenheit von S. uberis verursacht wird. Die Infektion selbst manifestiert sich durch die Infiltration von phagocytischen Zellen in die Drüse. Generell sind vier klinische Typen von Mastitis bekannt: (1) perakut, assoziiert mit einer Schwellung, einer Erregtheit, Schmerzen und einer abnormalen Sekretion in der Drüse, sowie begleitet von Fieber und anderen Anzeichen einer systemischen Störung, wie einer ausgeprägten Depression, einem schnellen schwachen Puls, eingesunkenen Augen, Schwache und einer vollständigen Anorexie; (2) akut, mit Veränderungen innerhalb der Drüse, ähnlich den vorstehenden, wobei aber das Fieber, die Anorexie und die Depression leicht bis mittelgradig sind; (3) subakut, wobei sich keine systemischen Veränderungen zeigen und die Veränderungen innerhalb der Drüse und hinsichtlich ihrer Sekretion weniger ausgeprägt sind; und (4) subklinisch, wobei die Entzündungsreaktion nur durch Standardtests für Mastitis nachweisbar ist.
Standardtests für den Nachweis von Mastitis schließen, aber sind nicht begrenzt auf, den California-Mastitis-Test, den Wisconsin-Mastitis-Test und den Nagase-Test ein, wobei die elektronische Zellzahl und die somatischen Zellzahlen verwendet werden, um einen anhaltend hohen Leukocytengehalt in der Milch nachzuweisen. Im Allgemeinen deutet eine somatische Zellzahl von etwa 300.000 bis etwa 500.000 Zellen pro ml oder höher in der Milch auf das Vorhandensein einer Infektion hin. Daher wird davon ausgegangen, dass ein Impfstoff im Hinblick auf die Behandlung und/oder Verhinderung einer Mastitis wirksam ist, wenn die somatische Zellzahl in der Milch zum Beispiel unterhalb von etwa 500.000 Zellen pro ml gehalten wird. Für eine Besprechung der Mastitis und der Diagnose davon vgl. z.B. The Merck Veterinary Manual: A Handbook of Diagnosis, Therapy, and Disease Prevention and Control for the Veterinarian, Merck and Co., Rahway, New Jersey, 1991.
Mit den Begriffen "Wirbeltier", "Individuum" und "Wirbeltier-Individuum" ist irgendein Vertreter des Unterstammes der Chordata gemeint, einschließlich, ohne Begrenzung darauf, Säugetiere wie Rinder, Schafe, Schweine, Ziegen, Pferde und Menschen; Haustiere wie Hunde und Katzen; sowie Vögel, einschließlich domestizierte, wilde und zahme Vögel, wie Hähne und Hühner, einschließlich Hühner, Truthähne und andere Hühnervögel: und Fische. Der Begriff bezieht sich nicht auf ein bestimmtes Alter. Daher sollen sowohl erwachsene als auch neugeborene Tiere, sowie Föten eingeschlossen sein.
Ein "Nucleinsäure"-Molekül kann prokaryontische Sequenzen, eine eukaryontische rRNA, eine cDNA einer eukaryontischen mRNA, genomische DNA-Sequenzen einer eukaryontischen DNA (z.B. eines Säugetieres) und auch synthetische DNA-Sequenzen einschließen, aber ist nicht darauf begrenzt. Der Begriff umfasst auch Sequenzen, welche irgendwelche der bekannten DNA- und RNA-Basenanalogen einschließen.
Ein "isoliertes" Nucleinsäuremolekül ist ein Nucleinsäuremolekül, das separat und getrennt von dem gesamten Organismus vorliegt, in welchem das Molekül in der Natur vorkommt; oder ein Nucleinsäuremolekül, welches im Ganzen oder zum Teil frei von Sequenzen ist, welche normalerweise in der Natur damit assoziiert sind; oder eine Sequenz, so wie sie in der Natur vorkommt, welche aber heterologe Sequenzen enthält (wie nachstehend definiert), welche damit assoziiert sind. Der Begriff "isoliert" in Zusammenhang mit einem Polynucleotid bedeutet, dass das Polynucleotid aus dem Chromosom isoliert wird, mit welchem es normalerweise assoziiert ist, und dass es aus der vollständigen genomischen Sequenz, worin es normalerweise vorkommt, isoliert wird.
"Gereinigtes Polynucleotid" verweist auf ein Polynucleotid von Interesse oder ein Fragment davon, welches im Wesentlichen frei von dem Protein ist, welches mit dem Polynucleotid natürlicherweise assoziiert ist, wobei es z.B. weniger als etwa 50%, vorzugsweise weniger als etwa 70% und mehr bevorzugt weniger als etwa 90% des Proteins enthält. Techniken zur Reinigung der Polynucleotide von Interesse sind auf dem Fachgebiet gut bekannt und schließen zum Beispiel das Aufbrechen der Zelle, welche das Polynucleotid enthält, mit einem chaotropen Mittel und das Abtrennen des Polynucleotids oder der Polynucleotide und Proteine durch eine Ionenaustauschchromatographie, Affinitätschromatographie oder eine Sedimentation nach Dichte ein.
Eine "codierende Sequenz" oder eine "Nucleotidsequenz, codierend" ein bestimmtes Protein, ist eine Nucleotidsequenz, welche in vitro oder in vivo in ein Polypeptid transkribiert und translatiert wird, wenn sie unter die Kontrolle von geeigneten regulatorischen Elementen gebracht wird. Die Grenzen der codierenden Sequenz werden durch ein Startcodon am 5'-(Amino)-Terminus und einem Translationsstoppcodon am 3'-(Carboxy)-Terminus festgelegt. Eine codierende Sequenz kann prokaryontische Sequenzen, eine cDNA einer eukaryontischen mRNA, genomische DNA-Sequenzen einer eukaryontischen DNA (z.B. eines Säugetieres) und auch synthetische DNA-Sequenzen einschließen, aber ist nicht darauf begrenzt. Üblicherweise ist eine Transkriptionsterminationssequenz 3' zu der codierenden Sequenz angeordnet. Eine "komplementäre" Sequenz ist eine Sequenz, in welcher die stickstoffhaltige Base an einer bestimmten Nucleotidposition das Gegenstück der stickstoffhaltige Base ist, welche an derselben Position in der Referenzsequenz vorkommt. Zur Verdeutlichung, das Gegenstück von Adenosin ist Tyrosin und umgekehrt; und in gleicher Weise ist Cyto sin zu Guanin komplementär und umgekehrt; daher würde der Komplementärstrang zu der Referenzsequenz 5'-ATGCTGA-3' der Sequenz 5'-TACGACT-3' entsprechen.
Eine "Wildtyp-" oder "native" Sequenz, wie hierin verwendet, verweist auf ein Polypeptid, welches Sequenzen codiert, die im Wesentlichen in der Form vorliegen, in welcher sie in der Natur vorkommen, wie z.B. die codierenden Sequenzen des S. dysgalactiae-Mig-Proteins, welche in den 1A-1D (SEQ ID NO: 4) gezeigt sind.
"Rekombinant", wie hierin zur Beschreibung eines Nucleinsäuremoleküls verwendet, bezieht sich auf ein Polynucleotid, welches von einem Genom, einer cDNA, semisynthetisch oder synthetisch abgeleitet ist, und welches aufgrund seiner Herkunft oder einer Manipulation: (1) nicht mit dem gesamten oder einem Teil des Polynucleotids assoziiert ist, mit welchem es in der Natur assoziiert ist; und/oder (2) mit einem Polynucleotid verbunden ist, welches sich von dem unterscheidet, mit welchem es in der Natur verbunden ist. Der Begriff "rekombinant", so wie im Hinblick auf ein Protein oder ein Polypeptid verwendet, bezieht sich auf ein Polypeptid, welches durch Expression eines rekombinanten Polynucleotids hergestellt wird. "Rekombinante Wirtszellen", "Wirtszellen", "Zellen", "Zelllinien", "Zellkulturen" und andere solche Begriffe, die prokaryontische Mikroorganismen oder eukaryontische Zelllinien bezeichnen, welche als einzellige Einheiten gezüchtet werden, werden gleichbedeutend verwendet und verweisen auf Zellen, welche als Empfänger für rekombinante Vektoren oder eine andere Transfer-DNA verwendet werden können oder verwendet worden sind, und welche die Nachkommen der ursprünglichen Zelle, welche transfiziert worden ist, einschließen. Es ist selbstverständlich, dass die Nachkommen einer einzelnen Stammzelle aufgrund einer zufälligen oder beabsichtigten Mutation nicht notwendigerweise in Bezug auf die Morphologie oder in Bezug auf die genomische DNA oder das gesamte DNA-Komplement mit der ursprünglichen Stammzelle identisch sein muss. Die Nachkommen der Stammzelle, welche zu der Stammzelle ausreichend ähnlich sind, um durch eine relevante Eigenschaft, wie zum Beispiel das Vorhandensein einer Nucleotidsequenz, welche ein gewünschtes Peptid codiert, charakterisiert werden zu können, sind in dem Begriff "Nachkommen, wie hierin definiert, eingeschlossen und werden durch die vorstehenden Begriffe abgedeckt.
"Homologie" verweist auf die prozentuale Identität zwischen zwei Polynucleotid- oder zwei Polypeptideinheiten. Zwei DNA-Sequenzen oder zwei Polypeptidsequenzen sind "im Wesentlichen homolog" zueinander, wenn die Sequenzen eine Sequenzidentität von mindestens etwa 80%-85%, vorzugsweise mindestens etwa 90% und am meisten bevorzugt mindestens etwa 95%-98% über eine definierte Länge der Moleküle aufweisen. Wie hierin verwendet, bezieht sich "im Wesentlichen homolog" auch auf Sequenzen, welche eine vollständige Identität zu der speziellen DNA-Sequenz oder Polypeptidsequenz aufweisen.
Im Allgemeinen bezieht sich "Identität" auf eine exakte Nucleotid-zu-Nucleotid- oder Aminosäure-zu-Aminosäure-Übereinstimmung zwischen zwei Polynucleotiden bzw. Polypeptidsequenzen. Die prozentuale Identität kann durch einen direkten Vergleich der Sequenzinformation zwischen zwei Molekülen durch die Abgleichung der Sequenzen, das Zählen der genauen Anzahl von Übereinstimmungen zwischen zwei ausgerichteten Sequenzen, das Dividieren durch die Länge der kürzeren Sequenz und das Multiplizieren des Ergebnisses mit 100 ermittelt werden. Leicht zugängliche Computerprogramme können verwendet werden, um die Analyse zu unterstützen, wie ALIGN, Dayhoff M.O., in Atlas of Protein Sequence and Structure 3, 353-358, Anhang 5, M.O. Dayhoff, Hrsg., National Biomedical Research Foundation, Washington, DC, welches den lokalen Homologie-Algorithmus von Smith und Waterman, Advances in Appl. Math. 2 (1981), 482-489, auf die Peptidanalyse anwendet. Programme zur Bestimmung der Nucleotidsequenzidentität sind im dem Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 (erhältlich von Genetics Computer Group, Madison, WI) verfügbar, zum Beispiel die BESTFIT-, FASTA- und GAP-Programme, welche ebenfalls auf dem Smith & Waterman-Algorithmus beruhen. Diese Programme werden in einfacher Weise in Verbindung mit den Standardwertparametern angewendet, welche durch den Hersteller empfohlen und in dem oben erwähnten Wisconsin Sequence Analysis Package beschrieben werden. Zum Beispiel kann die prozentuale Identität einer bestimmten Nucleotidsequenz mit einer Referenzsequenz unter Anwendung des Homologie-Algorithmus von Smith & Waterman mit einer Standardwert-Scoring-Tabelle und einem Gap Penalty von sechs Nucleotidpositionen ermittelt werden.
Ein anderes Verfahren zur Ermittlung der prozentuale Identität im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung des urheberrechtlich geschützten MPSRCH-Programmpaketes der University of Edinburgh, entwickelt von John F. Collins und Shane S. Sturrok und vertrieben durch IntelliGenetics, Inc. (Mountain View, CA). Aus dieser Paketfolge kann der Smith & Waterman-Algorithmus angewendet werden, wobei Standardwertparameter für die Scoring-Tabelle verwendet werden (zum Beispiel: Gap Open Penalty = 12, Gap Extension Penalty = 1, und Gap = 6). Der aus den Daten gebildete "Match"-Value gibt die "Sequenzidentität" wieder. Andere geeignete Programme für die Berechnung der prozentuale Identität oder Übereinstimmung zwischen Sequenzen sind auf dem Fachgebiet allgemein bekannt. Ein anderes Alignment-Programm ist zum Beispiel BLAST, welches mit Standardwertparametern verwendet wird. Zum Beispiel können BLASTN und BLASTP unter Verwendung der folgenden Standardwertparameter angewendet werden: genetischer Code = Standard; Filter = keiner; Strang = beide; Cut-Off = 60; Erwartet = 10; Matrix = BLOSUM62; Beschreibungen = 50 Sequenzen; Sortieren mit = HIGH SCORE; Datenbanken = nichtredundant, GenBank + EMBL + DDBJ + PDB + GenBank CDS-Translationen + Swiss Protein + Spupdate + PIR. Einzelheiten zu diesen Programmen sind unter der folgenden Internetaddresse zu finden: http://www.ncbi.nlm.nih.govBLAST/.
Alternativ kann die Homologie mittels Hybridisierung von Polynucleotiden unter Bedingungen, bei denen stabile Duplexe zwischen homologen Regionen gebildet werden, gefolgt durch einen Verdau mit einer oder mehreren Einzelstrang-spezifischen Nucleasen und eine Größenbestimmung der gespaltenen Fragmente, bestimmt werden. DNA-Sequenzen, welche "im Wesentlichen homolog" sind, können in einem Southern-Hybridisierungsexperiment unter stringenten Bedingungen, wie für dieses spezielle System definiert, identifiziert werden. Die Definition von geeigneten Hybridisierungsbedingungen ist auf dem Fachgebiet bekannt. Vgl. z.B. Sambrook et al., vorstehend; DNA Cloning, vorstehend; und Nucleic Acid Hybridization, vorstehend.
Mit dem Begriff "degenerierte Variante" ist ein Polynucleotid mit Veränderungen in der Nucleinsäuresequenz davon gemeint, welches ein Polypeptid codiert, das die gleiche Aminosäuresequenz wie das Polypeptid hat, welches durch das Polynucleotid codiert wird, von dem die degenerierte Variante abgeleitet ist.
Techniken zur Bestimmung der Aminosäuresequenz-"Übereinstimmung" sind auf dem Fachgebiet gut bekannt. Im Allgemeinen bezieht sich "Übereinstimmung" auf den exakten Aminosäure-zu-Aminosäure-Vergleich von zwei oder mehreren Polypeptiden an der entsprechenden Stelle, wo die Aminosäuren identisch sind oder ähnliche chemische und/oder physikalische Eigenschaften, wie Ladung oder Hydrophobizität, besitzen. Anschließend kann die so genannte "prozentuale Übereinstimmung" zwischen den verglichenen Polypeptidsequenzen ermittelt werden. Techniken zur Bestimmung der Nucleinsäure- und Aminosäuresequenz-Identität sind auf dem Fachgebiet ebenfalls gut bekannt und schließen die Bestimmung der Nucleotidsequenz der mRNA für das Gen (üblicherweise über ein cDNA-Zwischenprodukt) und die Bestimmung der dadurch codierten Aminosäuresequenz, sowie den Vergleich davon mit einer zweiten Aminosäuresequenz ein. Im Allgemeinen bezieht sich "Identität" auf eine exakte Nucleotid-zu-Nucleotid- oder Aminosäure-Aminosäure-Übereinstimmung von zwei Polynucleotiden bzw. Polypeptidsequenzen.
Eine "heterologe" Region eines DNA-Konstrukts ist ein identifizierbares DNA-Segment innerhalb oder gebunden an ein(es) anderes(n) DNA-Molekül(s), welches in der Natur nicht in Assoziation mit dem anderen Molekül vorkommt. Daher, falls die heterologe Region ein bakterielles Gen codiert, ist das Gen üblicherweise von DNA-Sequenzen umgeben, welche das bakterielle Gen in dem Genom der ursprünglichen Bakterien nicht umgeben. Bin anderes Beispiel für die heterologe codierende Sequenz ist ein Konstrukt, wobei die codierende Sequenz selbst nicht in der Natur vorkommt (z.B. synthetische Sequenzen mit Codons, welche sich von dem nativen Gen unterscheiden). Allelische Variationen oder natürlicherweise auftretende Mutationsereignisse haben keine heterologe DNA-Region, so wie hierin verwendet, zur Folge.
Ein "Vektor" ist ein Replikon, wie ein Plasmid, Phage oder Cosmid, an welches ein anderes DNA-Segment gebunden werden kann, um die Replikation des gebundenen Segments zu bewirken. Ein Vektor ist in der Lage, Gensequenzen auf Zielzellen zu übertragen (z.B. bakterielle Plasmidvektoren, virale Vektoren, nichtvirale Vektoren, teilchenförmige Träger und Liposomen).
Typischerweise verweisen die Begriffe "Vektorkonstrukt", "Expressionsvektor", "Genexpressionsvektor", "Genübertragungsvektor", "Gentransfervektor" und "Expressionskassette" alle auf eine Zusammenstellung, welche in der Lage ist, die Expression einer Sequenz oder eines Gens von Interesse zu steuern. Daher schließen die Begriffe Clonierungs- und Expressionsvehikel, sowie virale Vektoren ein.
Diese Zusammenstellungen schließen einen Promotor ein, welcher mit den Sequenzen oder dem (den) Gen(en) von Interesse funktionell verbunden ist. Andere Kontrollelemente können ebenfalls vorhanden sein. Die hierin beschriebenen Expressionskassetten können in einem Plasmidkonstrukt enthalten sein. Zusätzlich zu den Komponenten der Expressionskassette kann das Plasmidkonstrukt auch ein bakteriellen Replikationsursprung, einen oder mehrere selektierbare Marker, eine Signalsequenz, welche ermöglicht, dass das Plasmidkonstrukt als einzelsträngige DNA vorliegt (z.B. einen M13-Replikationsursprung), eine multiple Clonierungsstelle und einen "Säugetier"-Replikationsursprung (z.B. einen SV40- oder Adenovirus-Replikationsursprung) einschließen.
DNA-"Kontrollelemente" verweist zusammenfassend auf Transkriptionspromotoren, Transkriptionsenhancerelemente, Transkriptionsterminationssequenzen, Polyadenylierungssequenzen (angeordnet 3' zu dem Translationsstoppcodon), Sequenzen für die Optimierung der Translationsinitiation (angeordnet 5' zu der codierenden Sequenz), Translationsterminationssequenzen, stromaufwärts liegende regulatorische Sequenzen, Ribosomenbindungsstellen und dergleichen, welche gemeinsam für die Transkription und Translation einer codierenden Sequenz in einer Wirtszelle sorgen. Vgl. z.B. McCaughan et al., PNAS USA 92 (1995), 5431-5435; Kochetov et al., FEBS Letts. 440 (1998), 351-355. Es ist nicht erforderlich, dass alle diese Kontrollsequenzen immer in einem rekombinanten Vektor vorhanden sind, so lange das gewünschte Gen transkribiert und translatiert werden kann.
"Funktionell verbunden" verweist auf eine Anordnung von Elementen, wobei die so beschriebenen Komponenten derart angeordnet sind, dass sie ihre übliche Funktion ausüben. So sind Kontrollelemente, welche mit einer codierenden Sequenz funktionell verbunden sind, in der Lage, die Expression der codierenden Sequenz zu bewirken. Es ist nicht erforderlich, dass die Kontrollelemente mit der codierenden Sequenz zusammenhängen, so lange wie sie wirksam sind, die Expression davon zu steuern. So können zum Beispiel dazwischenliegende untranslatierte, jedoch transkribierte Sequenzen zwischen einem Promotor und der codierenden Sequenz vorhanden sein, wobei der Promotor dennoch als "funktionell verbunden" mit der codierenden Sequenz angesehen werden kann. In ähnlicher Weise verweist "Kontrollelemente, welche mit der Expression in einem Individuum kompatibel sind", auf solche Kontrollelemente, welche in der Lage sind, die Expression der codierenden Sequenz in dem Individuum zu bewirken.
Ein Kontrollelement wie ein Promotor "steuert die Transkription" einer codierenden Sequenz in einer Zelle, wenn eine RNA-Polymerase an den Promotor bindet und die codierenden Sequenz in eine mRNA transkribiert, welche dann in das Polypeptid translatiert wird, das durch die codierende Sequenz codiert wird.
Eine "Wirtszelle" ist eine Zelle, welche durch ein exogenes Nucleinsäuremolekül transformiert worden ist oder dadurch transformiert werden kann.
Eine Zelle ist durch eine exogene DNA "transformiert" worden, wenn eine solche exogene DNA innerhalb der Zellmembran eingeschleust worden ist. Die exogene DNA kann, aber muss nicht, in die chromosomale DNA, welche das Genom der Zelle ausmacht, integriert (kovalent damit verbunden) werden. In Prokaryonten und Hefen kann die exogene DNA zum Beispiel auf einem episomalen Element wie einem Plasmid beibehalten werden. Im Hinblick auf eukaryontische Zellen ist eine stabil transformierte Zelle eine Zelle, in welcher die exogene DNA in das Chromosom integriert worden ist, so dass sie durch Tochterzellen mittels Chromosomenreplikation vererbt wird. Diese Stabilität zeigt sich durch die Fähigkeit der eukaryontische Zelle, Zelllinien oder Clone zu begründen, die aus einer Population von Tochterzellen bestehen, welche die exogene DNA enthalten.
Wie hierin verwendet, verweist eine "biologische Probe" auf eine Gewebe- oder Flüssigkeitsprobe, welche aus einem Individuum isoliert wurde, einschließlich, aber nicht begrenzt auf, zum Beispiel Blut, Plasma, Serum, Kot, Urin, Knochenmark, Galle, Rückenmarksflüssigkeit, Lymphflüssigkeit, Proben der Haut, externe Sekrete der Haut sowie der Atemwege, des Darmtrakts und des Urogenitaltrakts, Tränen, Schleim, Milch, Blutzellen, Organe, Biopsien und auch Proben von in-vitro-Kulturbestandteilen, einschließlich, aber nicht begrenzt auf, konditionierte Medien, welche durch die Züchtung von Zellen oder Geweben in einem Kulturmedium erhalten werden, z.B. rekombinante Zellen und Zellkomponenten.
Wie hierin verwendet, verweisen die Begriffe "Marker" und "nachweisbarer Marker" auf ein Molekül, welches nachgewiesen werden kann, einschließlich, aber nicht begrenzt auf, radioaktive Isotope, fluoreszierende Substanzen, chemilumineszierende Substanzen, Enzyme, Enzymsubstrate, Enzym-Cofaktoren, Enzyminhibitoren, Chromophore, Farbstoffe, Metallionen, Metallsole, Liganden (z.B. Biotin oder Haptene) und dergleichen. Der Begriff "fluoreszierende Substanz" verweist auf eine Substanz oder einen Teil davon, welche(r) in der Lage ist, eine Fluoreszenz in einem nachweisbaren Bereich zu zeigen. Spezielle Beispiele für Marker, welche in der Erfindung verwendet werden können, schließen Fluorescein, Rhodamin, Dansyl, Umbelliferon, Texas-Rot, Luminol, NADPH und α-β-Galactosidase ein.
2. Art und Weise der Durchführung der Erfindung
Bevor die vorliegende Erfindung ausführlich beschrieben wird, sollte es selbstverständlich sein, dass diese Erfindung nicht auf bestimmte Formulierungen oder Prozessparameter begrenzt ist, welche natürlich variieren können. Es sollte ebenfalls selbstverständlich sein, dass die hierin verwendete Terminologie nur dem Zweck dient, die jeweiligen Ausführungsformen der Erfindung zu beschreiben, und nicht begrenzend sein soll.
Obwohl eine Reihe von Methoden und Materialien, welche den hierin beschriebenen gleichen oder entsprechen, bei der Durchführung der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, werden die bevorzugten Materialien und Methoden hierin beschrieben.
Im Mittelpunkt der vorliegenden Erfindung steht die Entdeckung, dass das Mig-Fc-Bindungsprotein, welches aus S. dysgalactiae isoliert wurde, in der Lage ist, in einem Wirbeltier-Individuum eine Immunantwort auszulösen. Insbesondere ist das Gen für das Mig-Protein von S. dysgalactiae isoliert, sequenziert und charakterisiert worden, und ist die Aminosäuresequenz, welche durch das Gen codiert wird, daraus abgeleitet worden. Die vollständige DNA-Sequenz für das S. dysgalactiae-Mig-Gen (SEQ ID NO: 3) und die entsprechende Aminosäuresequenz (SEQ ID NO: 4) sind in den 1A-1D dargestellt.
Wie in den Beispielen beschrieben, codiert die vollständige Länge des S. dysgalactiae-Mig-Gens, gezeigt in den Nucleotidpositionen 1 bis einschließlich 2010 der 1A-1D, die vollständige Länge des S. dysgalactiae-Mig-Proteins von 669 Amino säuren, welches eine erste Transmembranregion von 24 Aminosäuren (Reste 15 bis 39) und eine zweite Transmembranregion von 18 Aminosäuren (Reste 646 bis 664) einschließt. Die Transmembranregionen wurden unter Anwendung des TMpred-Programms bestimmt, welches Membran-durchspannende Regionen und deren Orientierung vorhersagt. Das Programm verwendet einen Algorithmus welcher auf der statistischen Analyse einer TMBase, einer Datenbank von natürlich vorkommenden Transmembranproteinen, unter Verwendung einer Kombination von mehreren Gewichtsmatrizes für das Scoring basiert. Vgl. Hofmann K. & Stoffel W., Biol. Chem. 347 (1993), 166.
Das S. dysgalactiae-Mig-Protein weist ein vorhergesagtes Molekulargewicht von etwa 73 kDa auf (berechnet mit Hilfe des Peptide Sort Program des GCG Wisconsin Package, Version 10, bereitgestellt durch das SeqWeb Sequence Analysis Package, Version 1.1, der Canadian Bioinformatics Resource). Die vollständige Länge der Sequenz schließt ein Signalpeptid ein.
In 2 sind die folgenden Ergebnisse der Strukturanalysen für das Mig-Protein der vorliegenden Erfindung graphisch dargestellt: Kyte-Doolittle-Hydropathie, gemittelt über ein Fenster von 7; Oberflächen-Probabilität nach Emini; Kettenflexibilität nach Karplus-Schulz; Antigenitätsindex nach Jameson-Wolf; Sekundärstruktur nach Garnier-Osguthorpe-Robson; Sekundärstruktur nach Chou-Fasman; und vorhergesagte Glykosylierungsstellen. In 3 ist die Sekundärstruktur nach Chou-Fasman für das Mig-Protein der vorliegenden Erfindung dargestellt. Ein Fachmann kann die in den 2 und 3 bereitgestellte Information in einfacher Weise verwenden, um immunogene Regionen in dem Protein für die Verwendung in Impfstoffzusammensetzungen zu ermitteln.
Mig-Fc-Rezeptor-Proteine, einschließlich, ohne Begrenzung darauf, des S. dysgalactiae-Mig-Proteins, immunogene Fragmente davon oder chimäre Proteine, enthaltend dieselben, können in Untereinheiten-Impfstoffzusammensetzungen bereitgestellt werden. Zusätzlich zu der Verwendung in Impfstoffzusammensetzungen können die Proteine oder Antikörper dagegen als diagnostische Reagenzien verwendet werden, um das Vorhandensein einer Infektion in einem Wirbeltier-Individuum nachzuweisen. In ähnlicher Weise können die Gene, welche die Proteine codieren, cloniert und für die Konstruktion von Sonden verwendet werden, um homologe Gene in anderen Bakterienstämmen nachzuweisen und zu isolieren. Zum Beispiel werden Fragmente, umfassend mindestens etwa 15-20 Nucleotide, mehr bevorzugt mindestens etwa 20-50 Nucleotide und am meisten bevorzugt etwa 60-100 Nucleotide oder irgendeine ganze Zahl zwischen diesen Werten in diesen Ausführungsformen Verwendung finden.
Die Impfstoffzusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können verwendet werden, um eine große Vielzahl von Bakterieninfektionen in Wirbeltier-Individuen zu behandeln oder zu verhindern. Zum Beispiel können Impfstoffzusammensetzungen, enthaltend, ohne Begrenzung darauf, das Mig-Fc-Rezeptor-Protein von S. dysgalactiae, verwendet werden, um Streptokokken-Infektionen in Wirbeltier-Individuen zu behandeln, welche durch diese oder ein andere Spezies verursacht werden. Insbesondere sind S. uberis, S. agalactiae und S. dysgalactiae verbreitete bakterielle Pathogene, welche mit einer Mastitis bei Rindern, Pferden, Schafen und Ziegen assoziiert sind. Ferner ist bekannt, dass Gruppe B-Streptokokken wie S. agalactiae zahlreiche andere Infektionen in Wirbeltieren verursachen, einschließlich Sepsis, Meningitis, Bakteriämie, Impetigo, Arthritis, Harnwegsinfektionen, Abszesse, Fehlgeburten, etc. Daher werden Impfstoffzusammensetzungen, enthaltend das Mig-Fc-Rezeptor-Protein, bei der Behandlung und/oder Verhinderung einer große Vielzahl von Streptokokken-Infektionen Verwendung finden.
In ähnlicher Weise werden Fc-Bindungsproteine, welche von anderen Bakteriengattungen wie Staphylococcus abgeleitet sind, bei der Behandlung von Bakterieninfektionen, die durch Spezies dieser Gattungen verursacht werden, Verwendung finden. Daher ist ohne Weiteres ersichtlich, dass die Fc-Bindungsproteine einer Vielzahl von Bakterienarten verwendet werden können, um eine große Vielzahl von Bakterieninfektionen in zahlreichen Tierarten zu behandeln und/oder zu verhindern.
Die Streptokokken-Fc-Bindungsproteine der vorliegenden Erfindung, einschließlich, ohne Begrenzung darauf, des Mig-Fc-Bindungsproteins, können in Impfstoffzusammensetzungen entweder allein oder in Kombination mit anderen bakteriellen, pilzlichen, viralen oder protozoalen Antigenen verwendet werden. Diese Antigene können separat oder auch als Fusionsproteine, umfassend ein oder mehrere Epitop(e) eines Fc-Bindungsproteins, verbunden mit einem oder mehreren dieser Antigene, bereitgestellt werden. Zum Beispiel können andere immunogene Proteine von S. uberis, wie der CAMP-Faktor, die Hyaluronsäurekapsel, eine Hyaluronidase, ein R-ähnliches Protein und der Plasminogenaktivator, zusammen mit dem Mig-Protein verabreicht werden. Zusätzlich können immunogene Proteine von anderen Organismen, welche an einer Mastitis beteiligt sind, wie aus den Gattungen Staphylococcus, Corynebacterium, Pseudomonas, Nocardia, Clostridium, Mycobacterium, Mycoplasma, Pasteurella oder Prototheca, anderen Streptokokken, coliformen Bakterien sowie Hefen, zusammen mit den hierin beschriebenen Fc-Bindungsproteinen verabreicht werden, um ein breites Schutzspektrum vorzusehen. So können zum Beispiel immunogene Proteine von Staphylococcus aureus, Str. agalactiae, Str. dysgalactiae, Str. zooepidemicus, Corynebacterium pyogenes, Pseudomonas aeruginosa, Nocardia asteroides, Clostridium perfringens, Escherichia coli, Enterobacter aerogenes und Klebsiella sp. zusammen mit den Fc-Bindungsproteinen der vorliegenden Erfindung bereitgestellt werden.
Ferner können Fc-Proteine anderer Streptokokkenarten gemeinsam in den Impfstoffzusammensetzungen der vorliegenden Erfindung verwendet werden. In dieser Ausführungsform können die mehreren Fc-Proteine entweder als Fusionsproteine oder als einzelne Antigene in denselben oder in verschiedenen Impfstoffzusammensetzungen bereitgestellt werden.
Herstellung der Fc-Bindungsproteine
Die oben beschriebenen Fc-Bindungsproteine sowie davon abgeleitete aktive Fragmente, Analoge und chimäre Proteine können durch eine Vielzahl von Methoden her gestellt werden. Insbesondere können die Fc-Bindungsproteine direkt aus den Bakterien isoliert werden, welche dieselben exprimieren. Dies wird im Allgemeinen dadurch erreicht, dass zuerst ein Rohextrakt hergestellt wird, welcher frei von Zellkomponenten und verschiedenen fremden Proteinen ist. Die gewünschten Proteine können dann aus der Zelllysatfraktion durch z.B. Säulenchromatographie, HPLC, Immunadsorptionstechniken oder andere herkömmliche Verfahren, welche auf dem Fachgebiet gut bekannt sind, weiter gereinigt werden.
Insbesondere sind Techniken zur Isolierung von Fc-Bindungsproteinen beschrieben worden. Zum Beispiel sind die Methoden von Reis et al. angewendet worden, um einen funktionell homologen FC-Rezeptor zu isolieren, welcher die Eigenschaften eines Typ III-Rezeptors besitzt (Reis et al., J. Immunol. 132 (1984), 3091).
Alternativ können die Proteine rekombinant hergestellt werden, wie hierin beschrieben wird. Wie oben dargelegt, können diese rekombinanten Produkte in Form von partiellen Proteinsequenzen, Sequenzen vollständiger Länge, Vorläuferformen, welche Signalsequenzen einschließen, reifen Formen ohne Signalsequenzen oder auch Fusionsproteinen (z.B. mit einer geeigneten Leadersequenz für den rekombinanten Wirt oder mit einer anderen Untereinheiten-Antigensequenz für Streptococcus oder ein anderes Pathogen) vorliegen.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird das S. dysgalactiae-Mig-Protein nach der rekombinanten Herstellung des Proteins durch eine Affinitätschromatographie aus einer Zelllysatfraktion aufgereinigt. Vgl. nachstehend Beispiel 1A-D.
Es können Genbanken konstruiert werden, wobei die erhaltenen Clone verwendet werden können, um eine geeignete Wirtszelle zu transformieren. Kolonien können vereinigt und auf Clone mit einer Fc-Rezeptor-Bindungsaktivität, d.h. auf Clone mit der Fähigkeit zur Bindung von IgG, durchmustert werden.
Alternativ können nach der Bestimmung der Aminosäuresequenzen Oligonucleotidsonden, welche die Codons für einen Teil der bestimmten Aminosäuresequenzen enthalten, hergestellt und für das Durchmustern von genomischen oder cDNA-Banken auf Gene, welche die vorliegenden Proteine codieren, verwendet werden. Die grundlegenden Strategien für die Herstellung von Oligonucleotidsonden und DNA-Banken, sowie die Durchmusterung davon mittels Nucleinsäurehybridisierung sind den Fachleuten hinreichend bekannt. Vgl. z.B. DNA Cloning: Bd. II, vorstehend; Nucleic Acid Hybridization, vorstehend; Oligonucleotide Synthesis, vorstehend; Sambrook et al., vorstehend. Nachdem ein Clon durch eine positive Hybridisierung in der durchmusterten Bank identifiziert worden ist, kann durch eine Restriktionsenzymanalyse und eine DNA-Sequenzierung bestätigt werden, dass die jeweilige Genbank-Insertion ein Fc-Bindungsprotein-Gen oder ein Homolog davon enthält. Die Gene können dann mittels Standardtechniken weiter isoliert werden, und gegebenenfalls können PCR-Ansätze oder Restriktionsenzyme verwendet werden, um Teile der vollständigen Länge der Sequenz zu deletieren.
In ähnlicher Weise können Gene unter Anwendung von bekannten Techniken, wie zum Beispiel einer Phenolextraktion, direkt aus Bakterien isoliert werden, und die Sequenz kann weiter manipuliert werden, um irgendwelche gewünschten Veränderungen vorzunehmen. Vgl. z.B. Sambrook et al., vorstehend, für eine Beschreibung von Techniken, welche bei der Gewinnung und Isolierung einer DNA angewendet werden.
Alternativ können DNA-Sequenzen, welche die Proteine von Interesse codieren, synthetisch hergestellt anstatt cloniert werden. Die DNA-Sequenzen können mit den geeigneten Codons für die jeweilige Aminosäuresequenz entworfen werden. Im Allgemeinen wird man bevorzugte Codons für den gewünschten Wirt auswählen, falls die Sequenz zur Expression verwendet wird. Die vollständige Sequenz wird durch Standardverfahren aus sich überlappenden Oligonucleotiden zusammengestellt und zu einer vollständigen codierenden Sequenz zusammengesetzt. Vgl. z.B. Edge, Nature 292 (1981), 756; Nambair et al., Science 223 (1984), 1299; Jay et al., J. Biol. Chem. 259 (1984), 6311.
Nachdem die codierenden Sequenzen für die gewünschten Proteine hergestellt oder isoliert worden sind, können sie in einen geeigneten Vektor oder ein geeignetes Replikon cloniert werden. Zahlreiche Clonierungsvektoren sind den Fachleuten bekannt, und die Auswahl eines geeigneten Clonierungsvektors ist eine Ermessenssache. Beispiele von rekombinanten DNA-Vektoren für eine Clonierung und von Wirtszellen, welche durch diese transformiert werden können, schließen den Bakteriophagen λ (E. coli), pBR322 (E. coli), pACYC177 (E. coli), pKT230 (Gram-negative Bakterien), pGV1106 (Gram-negative Bakterien), pLAFR1 (Gram-negative Bakterien), pME290 (Nicht-E. coli-, Gram-negative Bakterien), pHV14 (E. coli und Bacillus subtilis), pBD9 (Bacillus), pIJ61 (Streptomyces), pUC6 (Streptomyces), YIp5 (Saccharomyces), YCp19 (Saccharomyces) und das Rinderpapillomvirus (Säugerzellen) ein. Vgl. Sambrook et al., vorstehend; DNA Cloning, vorstehend; und Perbal B., vorstehend.
Das Gen kann unter die Kontrolle eines Promotors, einer Ribosomenbindungsstelle (für die Expression in Bakterien) und wahlweise eines Operators (hierin zusammenfassend als "Kontrollelemente" bezeichnet) gebracht werden, so dass die DNA-Sequenz, welche das gewünschte Protein codiert. in der Wirtszelle, welche durch einen Vektor, enthaltend dieses Expressionskonstrukt, transformiert wurde, in eine RNA transkribiert wird. Die codierende Sequenz kann, aber muss nicht, ein Signalpeptid oder eine Leadersequenz enthalten. Falls eine Signalsequenz enthalten ist, kann sie entweder die native homologe Sequenz oder eine heterologe Sequenz sein. Zum Beispiel kann die Signalsequenz für das S. dysgalactiae-Mig-Protein (Aminosäurerest 1 bis einschließlich 39) für die Sekretion davon verwendet werden, wie auch eine Reihe von anderen Signalsequenzen, welche auf dem Fachgebiet gut bekannt sind. Leadersequenzen können durch den Wirt bei der posttranslationalen Prozessierung entfernt werden. Vgl. z.B. US-Patent Nr. 4,431,739 ; 4,425,437 ; und 4,338,397 .
Andere regulatorische Sequenzen, welche die Regulation der Expression der Proteinsequenzen im Verhältnis zu dem Wachstum der Wirtszelle ermöglichen, können ebenfalls wünschenswert sein. Regulatorische Sequenzen sind auf den Fachleuten bekannt, und Beispiele schließen solche ein, welche bewirken, dass die Expression eines Gens als Antwort auf einen chemischen oder physikalischen Reiz, einschließlich der Anwesenheit einer regulatorischen Verbindung, an- oder abgeschaltet wird. Andere Arten von regulatorischen Sequenzen, zum Beispiel Enhancersequenzen, können ebenfalls in dem Vektor vorhanden sein.
Die Kontrollsequenzen und die anderen regulatorischen Sequenzen können mit der codierenden Sequenz vor der Insertion in einen Vektor, wie die oben beschriebenen Clonierungsvektoren, ligiert werden. Alternativ kann die codierende Sequenz direkt in einen Expressionsvektor cloniert werden, welcher bereits die Kontrollsequenzen und eine geeignete Restriktionsstelle enthält.
In einigen Fällen kann eine Modifikation der codierenden Sequenz erforderlich sein, so dass sie mit den Kontrollsequenzen in der geeigneten Orientierung verbunden werden kann; d.h. das richtige Leseraster beibehält. Es kann auch wünschenswert sein, Mutanten oder Analoge des Fc-Bindungsproteins herzustellen. Mutanten oder Analoge können durch die Deletion eines Teils der Sequenz, welche das Protein codiert, durch die Insertion einer Sequenz und/oder durch die Substitution eines oder mehrerer Nucleotids(e) innerhalb der Sequenz erzeugt werden. Techniken zur Modifizierung von Nucleotidsequenzen, wie zum Beispiel die ortsspezifische Mutagenese, sind z.B. bei Sambrook et al., vorstehend; in DNA Cloning, vorstehend; und in Nucleic Acid Hybridization, vorstehend, beschrieben.
Der Expressionsvektor wird dann verwendet, um eine geeignete Wirtszelle zu transformieren. Eine Reihe von Säugerzelllinien sind auf dem Fachgebiet bekannt und schließen immortalisierte Zelllinien ein, welche von der American Type Culture Collection (ATCC) erhältlich sind, wie zum Beispiel, aber nicht darauf begrenzt, Quarzellen des Chinesischen Hamsters (CHO-Zellen), HeLa-Zellen, Nierenzellen von Hamsterjungen (BHK-Zellen), Affennierenzellen (COS-Zellen), menschliche Leberzellkarzinomzellen (z.B. HepG2-Zellen), Madin-Darby-Rindernierenzellen ("MDBK"-Zellen), sowie andere. In ähnlicher Weise werden bakterielle Wirte wie E. coli, Bacillus subtilis und Streptococcus sp. in Verbindung mit den vorliegenden Expressionskonstrukten Verwendung finden. Hefewirte, welche in der vorliegenden Erfindung nützlich sind, schließen unter anderem Saccharomyes cerevisiae, Candida albicans, Candida maltosa, Hansenula polymorpha, Kluyveromyces fragilis, Kluyveromyces lactis, Pichia guillerimondii, Pichia pastoris, Schizosaccharomyces pombe und Yarrowia lipolytica ein. Insektenzellen zur Verwendung in Verbindung mit Baculovirus-Expressionsvektoren schließen unter anderem Aedes aegypti, Autographa californica, Bombyx mori, Drosophila melanogaster, Spodoptera frugiperda und Trichoplusia ni ein.
Abhängig von dem Expressionssystem und dem gewählten Wirt werden die Proteine der vorliegenden Erfindung durch das Züchten von Wirtszellen, welche mit einem oben beschriebenen Expressionsvektor transformiert sind, unter Bedingungen, bei denen das Protein von Interesse exprimiert wird, hergestellt. Das Protein wird dann aus den Wirtszellen isoliert und gereinigt. Falls das Expressionssystem das Protein in das Wachsturnsmedium sezerniert, kann das Protein direkt aus dem Medium gereinigt werden. Falls das Protein nicht sezerniert wird, wird es aus Zelllysaten isoliert. Die Wahl der geeigneten Wachstumsbedingungen und der Gewinnungsverfahren ist Erfahrungssache.
Die Proteine der vorliegenden Erfindung können auch durch chemische Synthese, wie zum Beispiel eine Festphasen-Peptidsynthese, unter Verwendung von bekannten Aminosäuresequenzen oder Aminosäuresequenzen, die von der DNA-Sequenz der Gene von Interesse abgeleitet sind, hergestellt werden. Solche Verfahren sind den Fachleuten bekannt. Vgl. z.B. Stewart J.M. und Young J.D., Solid Phase Peptide Synthesis, 2. Auflage, Pierce Chemical Co., Rockford, IL (1984), und Barany G. und Merrifield R.B., The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, Herausgeber E. Gross und J. Meienhofer, Bd. 2, Academic Press, New York (1980), S. 3-254, für Festphasen-Peptidsynthese-Techniken; und Bodansky M., Principles of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, Berlin (1984), und Gross E. und Meienhofer J., The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, vorstehend, Bd. 1, für klassische Lösungssynthesen. Die chemische Synthese von Peptiden kann bevorzugt werden, falls ein kleines Fragment des fraglichen Antigens in der Lage ist, eine Immunantwort in dem Individuum von Interesse auszulösen.
Die Fc-Bindungsproteine der vorliegenden Erfindung oder deren Fragmente können verwendet werden, um Antikörper, sowohl polyclonale als auch monoclonale, herzustellen. Falls polyclonale Antikörper gewünscht werden, wird ein ausgewähltes Säugetier (z.B. eine Maus, ein Kaninchen, eine Ziege, ein Pferd, etc.) mit einem Antigen der vorliegenden Erfindung oder einem Fragment davon oder einem mutierten Antigen immunisiert. Das Serum wird aus dem immunisierten Tier gewonnen und gemäß bekannten Verfahren behandelt. Vgl. z.B. Jurgens et al., J. Chrom. 348 (1985), 363-370. Falls Serum verwendet wird, welches polyclonale Antikörper enthält, können die polyclonalen Antikörper durch eine Immunaffinitätschromatographie unter Anwendung von bekannten Verfahren gereinigt werden.
Monoclonale Antikörper gegen das Mig-Protein oder gegen die Fragmente davon können durch einen Fachmann ebenfalls in einfacher Weise hergestellt werden. Die allgemeine Methodik für die Herstellung von monoclonalen Antikörpern mit Hilfe der Hybridomtechnik ist hinreichend bekannt. Immortalisierte Antikörperproduzierende Zelllinien können durch Zellfusion und auch durch andere Techniken, wie zum Beispiel die direkte Transformation von B-Lymphocyten mit einer onkogenen DNA oder die Transfektion mit dem Epstein-Barr-Virus, erzeugt werden. Vgl. z.B. Schreier M. et al., Hybridoma Techniques (1980); Hammerling et al., Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas (1981); Kennett et al., Monoclonal Antibodies (1980); vgl. auch US-Patent Nr. 4,341,761 ; 4,399,121 ; 4,427,783 ; 4,444,887 ; 4,452,570 ; 4,466,917 ; 4,472,500 ; 4,491,632 ; und 4,493,890 . Reihen von monoclonalen Antikörpern, welche gegen das Mig-Protein oder Fragmente davon erzeugt wurden, können auf verschiedene Eigenschaften, d.h. auf einen Isotyp, ein Epitop, Affinität, etc., durchmustert werden. Monoclonale Antikörper sind bei der Reinigung mittels Immunaffinitätstechniken der einzelnen Antigene, gegen welche sie gerichtet sind, nützlich. Sowohl polyclonale als auch monoclonale Antikörper können auch zur passiven Immunisierung verwendet werden oder können mit Untereinheiten-Impfstoff zubereitungen kombiniert werden, um die Immunantwort zu verstärken. Polyclonale und monoclonale Antikörper sind auch für diagnostische Zwecke nützlich.
Impfstoffformulierungen und Verabreichung
Die Fc-Bindungsproteine der vorliegenden Erfindung können entweder allein oder in Kombination mit anderen Antigenen als Impfstoffzusammensetzungen zur Verwendung bei der Immunisierung von Individuen, wie nachstehend beschrieben, zubereitet werden. Verfahren zur Herstellung solcher Formulierungen sind z.B. in Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, 18. Auflage, 1990, beschrieben. Typischerweise werden die Impfstoffe der vorliegenden Erfindung als Injektionspräparate, entweder als flüssige Lösungen oder Suspensionen, zubereitet. Feste Formen, welche zur Lösung oder Suspension in flüssigen Vehikeln vor der Injektion geeignet sind, können ebenfalls hergestellt werden. Die Zubereitung kann auch emulgiert werden, oder der Wirkstoffbestandteil kann in Liposomen-Vehikeln verkapselt werden. Der aktive immunogene Bestandteil wird im Allgemeinen mit einem verträglichen pharmazeutischen Träger vermischt, wie zum Beispiel Wasser, Kochsalzlösung, Dextrose, Glycerin, Ethanol oder dergleichen und Kombinationen davon. Zusätzlich, falls gewünscht, kann das Vehikel geringe Menge von Hilfssubstanzen wie Benetzungs- oder Emulgiermittel und pH-Pufferungsmittel enthalten.
Adjuvanzien, welche die Wirksamkeit des Impfstoffes verstärken, können ebenfalls zu der Formulierung zugegeben werden. Adjuvanzien können zum Beispiel Muramyldipeptide, Avridin, Aluminiumhydroxid, Dimethyldioctadecylammoniumbromid (DDA), Öle, Öl-in-Wasser-Emulsionen, Saponine, Cytokine und andere auf dem Fachgebiet bekannte Substanzen einschließen.
Das Mig-Protein kann an einen Träger gebunden werden, um die Immunogenität davon zu erhöhen. Geeignete Träger schließen große, langsam metabolisierte Makromoleküle wie Proteine, einschließlich Serumalbumine, Schlüsselloch-Napfschnecken-Hämocyanin, Immunglobulinmoleküle, Thyroglobulin, Ovalbumin und andere Proteine, welche den Fachleuten gut bekannt sind; Polysaccharide wie Sepharose, Agarose, Cellulose, Cellulose-Kügelchen und dergleichen; polymere Aminosäuren wie Polyglutaminsäure, Polylysin und dergleichen; Aminosäurecopolymere; und inaktive Viruspartikel ein.
Die Fc-Bindungsproteine der vorliegenden Erfindung können in ihrer nativen Form verwendet werden, oder der Gehalt an funktionellen Gruppen davon kann zum Beispiel durch die Succinylierung von Lysinresten oder die Umsetzung mit Cys-Thiolacton modifiziert werden. Auch kann zum Beispiel eine Sulfhydrylgruppe durch die Umsetzung von Aminofunktionen mit 2-Iminothiolan oder dem N-Hydroxysuccinimidester von 3-4-Dithiopyridylpropionat in den Träger (oder das Antigen) eingeführt werden. Geeignete Träger können auch durch den Einbau von Spacergruppen (wie Hexamethylendiamin oder anderen bifunktionellen Molekülen ähnlicher Größe) für die Bindung von Peptiden modifiziert werden.
Andere geeignete Träger für die Fc-Bindungsproteine der vorliegenden Erfindung schließen VP6-Polypeptide von Rotaviren oder funktionelle Fragmente davon, wie in US-Patent Nr. 5,071,651 offenbart, ein. Ebenfalls nützlich ist ein Fusionsprodukt aus einem viralen Protein und den vorliegenden Immunogenen, welches durch die in US-Patent Nr. 4,722,840 offenbarten Verfahren hergestellt wird. Weitere geeignete Träger schließen Zellen wie Lymphocyten ein, da die Präsentation in dieser Form die natürliche Art und Weise der Präsentation in dem Individuum, welche den immunisierten Zustand hervorruft, nachahmt. Alternativ können die Proteine der vorliegenden Erfindung an Erythrocyten, vorzugsweise die eigenen Erythrocyten des Individuums, gekoppelt werden. Verfahren für die Kopplung von Peptiden an Proteine oder Zellen sind den Fachleuten bekannt.
Ferner können die Fc-Bindungsproteine (oder Komplexe davon) in entweder der neutralen Form oder in der Salzform als Impfstoffzusammensetzungen zubereitet werden. Pharmazeutisch annehmbare Salze schließen die Säureadditionssalze ein (gebildet mit den freien Aminogruppen der aktiven Polypeptide), welche mit anorganischen Säuren, wie zum Beispiel Salzsäure oder Phosphorsäure, oder mit organischen Säuren, wie Essigsäure, Oxalsäure, Weinsäure, Mandelsäure und dergleichen, gebildet werden. Salze, welche durch freie Carboxylgruppen gebildet werden, können auch von anorganischen Basen, wie zum Beispiel Natrium-, Kalium-, Ammonium-, Calcium- oder Eisenhydroxiden, und von organischen Basen, wie Isopropylamin, Trimethylamin, 2-Ethylaminoethanol, Histidin, Procain und dergleichen, abgeleitet sein.
Impfstoffformulierungen enthalten eine "therapeutisch wirksame Menge" des Wirkstoffbestandteils, dass heißt, eine Menge, welche in der Lage ist, eine Immunantwort in einem Individuum auszulösen, an welches die Zusammensetzung verabreicht wird. Bei der Behandlung und der Verhinderung einer Mastitis wäre eine "therapeutisch wirksame Menge" zum Beispiel eine Menge, welche die Resistenz der Brustdrüse gegen eine Neuinfektion erhöht und/oder die klinische Schwere der Krankheit verringert. Ein solcher Schutz zeigt sich durch entweder eine Verringerung oder das Fehlen von Symptomen, die normalerweise durch einen infizierten Wirt gezeigt werden, eine schnellere Erholungszeit und/oder eine niedrigere somatische Zellzahl in der Milch aus dem infizierten Drüsenviertel. Zum Beispiel weist die Fähigkeit der Zusammensetzung, die somatische Zellzahl (SCC) in der Milch unterhalb von etwa 500.000 Zellen pro ml zu halten oder zu bringen, was dem Grenzwert entspricht, der durch die International Dairy Federation festgelegt wurde, oberhalb dem davon ausgegangen wird, dass die Tiere an einer klinischen Mastitis leiden, auf einen therapeutischen Effekt hin.
Die genaue Menge kann durch einen Fachmann mit Hilfe von Standardtests leicht ermittelt werden. Die Konzentration des Fc-Bindungsproteins liegt typischerweise im Bereich von etwa 1% bis etwa 95% (Gew./Gew.) der Zusammensetzung oder auch höher oder niedriger, falls angebracht. Bei den vorliegenden Impfstoffformulierungen sollten 5 bis 500 μg des Wirkstoffbestandteils pro ml der injizierten Lösung ausreichend sein, um eine Immunantwort auszulösen, wenn eine Dosis von 1 bis 3 ml pro Tier verabreicht wird.
Um ein Individuum zu immunisieren, wird der Impfstoff im Allgemeinen parenteral, üblicherweise durch intramuskuläre Injektion, verabreicht. Andere Verabreichungsweisen, wie die subkutane, intraperitoneale und intravenöse Injektion, sind jedoch ebenfalls annehmbar. Die zu verabreichende Menge hängt von dem zu behandelnden Tier, der Fähigkeit des Immunsystems des Tieres, Antikörper zu synthetisieren, und dem gewünschten Schutzgrad ab. Wirksame Dosierungen können durch einen Fachmann mit Hilfe von Routineversuche unter Aufstellung von Dosis-Antwort-Kurven leicht ermittelt werden. Das Individuum wird durch die Verabreichung des Impfstoffes in mindestens einer Dosis und vorzugsweise zwei Dosen immunisiert. Außerdem können an das Tier so viele Dosen verabreicht werden, wie erforderlich sind, um einen Status der Immunität gegen eine Infektion aufrechtzuerhalten.
Weitere Impfstoffformulierungen, welche für andere Verabreichungsweisen geeignet sind, schließen Zäpfchen und in einigen Fällen Aerosol-, intranasale oder orale Formulierungen, sowie Formulierungen mit einer verzögerten Freisetzung ein. Für Zäpfchen beinhaltet die Vehikelzusammensetzung traditionelle Bindemittel und Träger, wie zum Beispiel polyalkalische Glykole oder Triglyceride. Solche Zäpfchen können aus Mischungen gebildet werden, welche den Wirkstoffbestandteile in einer Menge im Bereich von etwa 0,5% bis etwa 10% (Gew./Gew.), vorzugsweise etwa 1% bis etwa 2%, enthalten. Orale Vehikel schließen die normalerweise verwendeten Träger ein, wie zum Beispiel pharmazeutische Qualitäten von Mannitol, Lactose, Stärke, Magnesium, Stearat, Natriumsaccharin, Cellulose, Magnesiumcarbonat und dergleichen. Die oralen Impfstoffzusammensetzungen können in Form von Lösungen, Suspensionen, Tabletten, Pillen, Kapseln, Formulierungen mit verzögerter Freisetzung oder Pulvern eingenommen werden und enthalten etwa 10% bis etwa 95% des Wirkstoffbestandteils, vorzugsweise etwa 25% bis etwa 70%.
Intranasale Formulierungen schließen üblicherweise Vehikel ein, welche weder eine Reizung der Nasenschleimhaut verursachen, noch die Kapillarfunktion wesentlich beeinträchtigen. Verdünnungsmittel wie Wasser, wässrige Kochsalzlösung oder andere bekannte Substanzen können in Verbindung mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Die nasalen Formulierungen können auch Konservierungsmittel wie Chlorbutanol und Benzalkoniumchlorid, welche aber nicht darauf begrenzt sind, enthalten. Ein Tensid kann vorhanden sein, um die Absorption der vorliegenden Proteine durch die Nasenschleimhaut zu verbessern.
Formulierungen mit einer kontrollierten oder verzögerten Freisetzung werden hergestellt, indem das Protein in Träger oder Vehikel wie Liposomen; nicht resorbierbare, impermeable Polymere wie Ethylenvinylacetcopolymere und Hytrel^®-Copolymere; quellbare Polymere wie Hydrogele; oder resorbierbare Polymere wie Kollagen; und bestimmte Polysäuren oder Polyester, wie solche, welche verwendet werden, um resorbierbare Nähte zu erhalten, eingebracht wird. Die Fc-Bindungsproteine können auch unter Verwendung von implantierten Minipumpen, welche auf dem Fachgebiet gut bekannt sind, abgegeben werden.
Die Fc-Bindungsproteine der vorliegenden Erfindung können auch über ein Trägervirus, welches dieselben exprimiert, verabreicht werden. Trägerviren, welche in Verbindung mit der vorliegenden Erfindung Verwendung finden, schließen, aber sind nicht begrenzt auf, das Vacciniavirus und andere Pockenviren, Adenoviren und Herpesviren ein. Beispielsweise können Vacciniavirus-Rekombinanten, welche die neuen Proteine exprimieren, wie folgt konstruiert werden. Die DNA, welche das jeweilige Protein codiert, wird zuerst in einen geeigneten Vektor inseriert, so dass sie einem Vaccinia-Promotor und umgebenden Vaccinia-DNA-Sequenzen, wie der Sequenz, welche eine Thymidinkinase (TK) codiert, benachbart ist. Dieser Vektor wird dann verwendet, um Zellen zu transfizieren, welche gleichzeitig mit dem Vacciniavirus infiziert werden. Die homologe Rekombination dient dazu, den Vaccinia-Promotor zusammen mit dem Gen, welches das vorliegende Protein codiert, in das Virusgenom zu inserieren. Die erhaltene TK^--Rekombinante kann durch Züchtung der Zellen in Gegenwart von 5-Bromdesoxyuridin und der Auswahl von Virusplaques, welche dagegen resistent sind, selektiert werden.
Ein anderer Verabreichungsweg beinhaltet die Gentherapie oder die Nucleinsäure-Immunisierung. So können Nucleotidsequenzen (und flankierende regulatorische Elemente), welche die vorliegenden Fc-Bindungsproteine codieren, für die in-vivo-Translation davon direkt an ein Individuum verabreicht werden. Alternativ kann ein Gentransfer durch die Transfektion der Zellen oder Gewebe des Individuums ex vivo und die Rückführung des transformierten Materials in den Wirt erreicht werden. Die DNA kann direkt, d.h. durch Injektion, in den Wirtsorganismus eingebracht werden (vgl. Internationale Veröffentlichung Nr. WO/90/11092 ; und Wolff et al., Science 247 (1990), 1465-1468). Ein Liposomen-vermittelter Gentransfer kann auch unter Anwendung von bekannten Verfahren erreicht werden. Vgl. z.B. Hazinski et al., Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 4 (1991), 206-209; Brigham et al., Am. J. Med. Sci. 298 (1989), 278-281; Canonico et al., Clin. Res. 39 (1991), 219A; und Nabel et al., Science 249 (1990), 1285-1288. Hinleitende Mittel, wie zum Beispiel Antikörper, die gegen Oberflächenantigene gerichtet sind, welche auf spezifischen Zelltypen exprimiert werden, können kovalent an die Liposomenoberfläche konjugiert werden, so dass die Nucleinsäure an spezifische Gewebe und Zellen, welche für eine Infektion anfällig sind, abgegeben werden kann.
Hinterlegung von Stämmen, welche bei der Durchführung der Erfindung nützlich sind
Die Hinterlegung von biologisch reinen Kulturen der folgenden Stämme erfolgte bei der American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas. Die angegebene Hinterlegungsnummer wurde nach einer erfolgreichen Lebensfähigkeitsprüfung erteilt, und die erforderlichen Gebühren wurden bezahlt. Die Hinterlegung erfolgte gemäß den Bedingungen des Budapester Vertrags über die internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen für die Zwecke cines Patentverfahrens und dessen Vorschriften (Budapester Vertrag). Dadurch wird die Aufbewahrung von lebensfähigen Kulturen für einen Zeitraum von dreißig (30) Jahren ab dem Datum der Hinterlegung gewährleistet. Die Organismen werden durch die ATCC gemäß den Bedingungen des Budapester Vertrags zugänglich gemacht, wodurch die dauerhafte und uneingeschränkte Verfügbarkeit der Nachkommen durch eine Person gewährleistet wird, welche durch den Präsidenten des US-Patent- und Markenamtes gemäß 35 USC § 122 und den entsprechenden Anordnungen des Präsidenten (einschließlich 37 CFR § 1.12, unter besonderer Bezugnahme auf 886 OG 638) als dazu bevollmächtigt ernannt wird. Bei der Erteilung eines Patents werden alle Beschränkungen hinsichtlich der Zugänglichkeit zu den hinterlegten Kulturen durch die Öffentlichkeit unwiderruflich aufgehoben.
Diese Hinterlegungen werden nur der Zweckmäßigkeit halber für Fachleute angegeben, und stellen kein Eingeständnis dar, dass eine Hinterlegung nach 35 USC § 112 erforderlich ist.

Bakterienstamm Plasmid Gen Hinterlegungsdatum ATCC Nr.

DH5α pAA505Mig S. dysgalactiae-Mig-Gen 31. Mai 2000 PTA-1977
Experimenteller Teil
Nachstehend werden Beispiele von spezifischen Ausführungsformen für die Durchführung der vorliegenden Erfindung angegeben. Die Beispiele dienen ausschließlich illustrativen Zwecken und sollen den Schutzumfang der vorliegenden Erfindung in keiner Weise begrenzen.
Es ist versucht worden, die Genauigkeit im Hinblick auf die verwendeten Zahlen (z.B. Mengen, Temperaturen, etc.) zu gewährleisten, aber natürlich sollten Versuchsfehler und -abweichungen in Betracht gezogen werden.
Falls nicht anders angegeben, sind Teile Gewichtsteile, ist das Molekulargewicht ein durchschnittliches Molekulargewicht, ist die Temperatur in Grad Celsius angegeben und liegt der Druck bei oder in der Nähe des Atmosphärendrucks.
Materialien und Methoden
Die Enzyme wurden von kommerziellen Quellen bezogen und entsprechend den Anweisungen der Hersteller verwendet.
Bei der Isolierung von DNA-Fragmenten wurden alle DNA-Manipulationen, sofern nicht anders angegeben, gemäß Standardverfahren durchgeführt. Vgl. Sambrook et al., vorstehend. Die Restriktionsenzyme, die T4-DNA-Ligase, die E. coli-Zellen, die DNA-Polymerase I, das Klenow-Fragment und die anderen biologischen Reagenzien können von kommerziellen Lieferanten bezogen und entsprechend den Anweisungen der Hersteller verwendet werden. Doppelsträngige DNA-Fragmente wurden auf Agarosegelen aufgetrennt.
Beispiel 1
Herstellung, Amplifikation, Sequenzierung, Expression, Reinigung und Charakterisierung des S. dysgalactiae-Mig-Fc-Rezeptor-Proteins
A. Präparation der chromosomalen DNA aus S. dysgalactiae
Ein klinisches S. dysgalactiae-Isolat eines Falls von Rinder-Mastitis (ATCC Hinterlegungsnummer 43078) wurde von der American Type Culture Collection (10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209) erhalten und als eine DNA-Quelle verwendet. Der Organismus wurde routinemäßig auf TSA-Schafblut-Agarplatten (PML Microbiologicals, Mississauga, Ontario) bei 37°C für 18 Stunden oder in Todd-Hewitt-Brühe (Oxoid Ltd., Hampshire, England), supplementiert mit 0,3% Hefeextrakt (Sigma, St. Louis, Missouri) (THB-YE), bei 37°C, 5% CO₂ gezüchtet.
Die chromosomale DNA wurde aus S. dysgalactiae-Zellen präpariert, welche in 100 ml THB-YE, supplementiert mit 20 mM Glycin, für etwa 6 Stunden gezüchtet wurden, bis ein A₆₀₀-Wert von 0,8 bis 1,0 erreicht wurde. Die Zellen wurden geerntet und in 50 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl, 0,5% Tween 20 (Sigma, St. Louis, MO) resuspendiert und mit RNAse A (200 mg/ml), Proteinase K (20 mg/ml), Lysozym (100 mg/ml) und Mutanolysin (100 mg/ml) (Sigma, St. Louis, Missouri) supplementiert. Nach der Bakterienlyse für 30 Minuten bei 37°C unter starkem Schütteln wurden Guanidinhydrochlorid und Tween 20, pH 5,5, mit dem Lysat vermischt, um eine Endkonzentration von 0,8 M bzw. 5% zu erhalten. Dieses Gemisch wurde bei 50°C für 30 Minuten inkubiert. Die chromosomale DNA wurde dann unter Verwendung eines Qiagen Genomic-Tips 100/G (Qiagen, Deutschland), gereinigt und unter Verwendung von 0,7 Volumenteilen von Isopropanol gefällt. Das erhaltene Pellet wurde in 70%igem Ethanol gewaschen und in 0,5 ml 10 mM Tris-HCl, pH 8,8, resuspendiert.
B. Amplifikation und Clonierung des S. dysgalactiae-Mig-Gens

Das Mig-Gen wurde unter Verwendung des Vorwärtsprimers mig1 (SEQ ID NO: 1, gezeigt in Tabelle 1) und des Rückwärtsprimers mig1r (SEQ ID NO: 2, gezeigt in Tabelle 1) mittels PCR amplifiziert (vgl. Mullis et al., US-Patent Nr. 4,683,195 ; Mullis, US-Patent Nr. 4,683,202 ). In den in Tabelle 1 gezeigten Sequenzen kennzeichnet eine Unterstreichung Nucleotide, welche an die ursprüngliche Sequenz angehängt wurden, und fett gedruckte Buchstaben geben die Lage von Restriktionsendonuclease-Erkennungsstellen an. Tabelle 1 Auflistung der Sequenzen

SEQUENZ ID NO:	Sequenzname	Nucleotid/Aminosäuresequenz
1	Primer mig1	5'-G CGG CCA TGG TAG AAA ATA CTA TAA CTG-3'
2	Primer mig1R	5'-ACG CCC GGG TTA GTC TTC TTT ACG TTT-3'
3	Streptococcus dysgalactiae Stamm SDG8 Mig-Gen	(vgl. Figur 1)
4	Streptococcus dysgalactiae Stamm SDG8 Mig-Protein	(vgl. Figur 1)
5	Prima mig-3	5'-GTT GGC CTA GAT ATC ACA GAA TTA CAA-3'
6	Primer mig-4	5'-AAA GCA CCC GGG CCA GCC ATT ACT G-3'
7	Primer mig-6	5'-AGG TGC TTC CCA TGG AAC TGC CTG AAC T-3'
8	Primer mig-7	5'-GGC GAG AGT CTA GAA ACT AAA GCG AAA AAC-3'
9	Primer mig-8	5'-GCA ATC ACC AGG ATC CTC AGT AAC CAT TTC-3'
10	Primer mig-9	5'-CAG GCA GTT CAT ATG GAA GCA CCT ACA GT-3'
11	Primer mig-10	5'-TCC CGG AGT AGC ATT GTC AGT C-3'
12	Primer mig-11	5'-GCA GCG GTC CAT ATG CCT GTT GGC CTA GAT-3'
13	Primer mig-12	5'-GCC TGA ACT GGA TCC CTC AAC TGA TCT G-3'
14	Primer mig-13	5'-TTC CGT TGG ATC CTG CAA CTC CAA TTG-3'
15	Primer mig-14	5'-TAA GTC AAA AGC TTT GAC AAT TAG TCT T-3'

Die PCR wurde unter Verwendung der Vent-DNA-Polymerase (New England Biolabs, Mississauga, Ontario, Kanada), 0,7 μg der genomischen DNA von S. dysgalactiae, jeweils 1 μM des mig1-Primers (SEQ ID NO: 1) und des mig1r-Primers (SEQ ID NO: 2) (vgl. vorstehend), jeweils 200 μM von dATP, dCTP, dGTP und dTTP, 3 mM MgSO₄ und 1x ThermoPol PCR-Puffer (New England Biolabs) durchgeführt, und 2 Einheiten Vent-DNA-Polymerase wurden zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde dann für 3 Zyklen von 1 Minute bei 94°C, 3 Minuten bei 50°C und 1 Minute, 10 Sekunden bei 72°C, gefolgt von 27 Zyklen von 15 Sekunden bei 95°C, 30 Sekunden bei 55°C und 1 Minute bei 72°C, gefolgt von einem einzigen Zyklus von 5 Minuten bei 72°C, inkubiert.
Das vorstehend erhaltene Mig-PCR-Produkt und der Expressionsvektor pAA505 (VIDO, Saskatoon, Saskatchewan, Kanada) wurden mit den Restriktionsenzymen NcoI und SmaI (Amersham Pharmacia, Quebec, Kanada) entsprechend den Anweisungen des Hersteller gespalten, und die Mig-Sequenz wurde an diesen Stellen in den Vektor ligiert.
Dieses Konstrukt wurde verwendet, um E. coli DH5α-Zellen (Life Technologies, Gaithersburg, MD) zu transformieren. Die transformierten E. coli DH5α-Zellen, welche das pAA505-Mig-Vektorkonstrukt tragen, wurden als E. coli DH5α-pAA505Mig bezeichnet.
C. Nucleotidsequenz des S. dysgalactiae-Mig-Gens und die daraus abgeleitete Aminosäuresequenz
Die Nucleotidsequenz des Mig-Gens für beide Orientierungen wurde mit einem ABI 373 DNA-Sequenzanalysengerät (Applied Biosystems) im Plant Biotechnology Institute (PBI, Saskatoon, Saskatchewan, Kanada) unter Verwendung der verschiedenen in Tabelle 1 gezeigten Primer (Primer mig2 bis mig14) bestimmt.
Die 1A-1D zeigen die Nucleotide codierende Sequenz bzw. die Aminosäuresequenz für das S. dysgalactiae-Mig-Protein (SEQ ID NO: 3 bzw. SEQ ID NO: 4).
Diese Sequenzen wurden durch eine BLAST-Analyse mit bekannten Sequenzen verglichen. Die Suchparameter, welche verwendet wurden, um die Nucleinsäuresequenz zu analysieren, waren wie folgt: Datenbank: nt; Anzahl der Zeichen in der Datenbank: 1.961.177.913; Anzahl der Sequenzen in der Datenbank: 614.801; Matrix: blastn-Matrix: 1-3; Gap Penalties: Vorhandensein = 5, Verlängerung = 2. Die erhaltenen Ergebnisse zeigten, dass das S. dysgalactiae SD8-Mig-Gen, dargestellt in den 1A-1D, zu mehreren bekannten Nucleotidsequenzen homolog ist; z.B. besteht eine Homologie von 98% zu dem Mig-Gen für S. dysgalactiae SC1 (Emb-Hinterlegungsnummer Z29666.1 SDMIGSUP).
Die Suchparameter, welche verwendet wurden, um die Aminosäuresequenz zu analysieren, waren wie folgt: Datenbank: nr; Anzahl der Zeichen in der Datenbank: 157.988.256; Anzahl der Sequenzen in der Datenbank: 503.479; Matrix: BLOSUM62; Gap Penalties: Vorhandensein = 11, Verlängerung = 1. Die erhaltenen Ergebnisse zeigten, dass die Aminosäuresequenz des S. dysgalactiae SD8-Mig-Gens, dargestellt in den 1A-1D, zu mehreren bekannten Nucleotidsequenzen bis zu 89% homolog ist.
D. Expression und Reinigung des rekombinanten S. dysgalactiae-Mig-Proteins
E. coli-Zellen, welche das vorstehend in Beispiel 1 hergestellte Konstrukt enthalten, wurden in LB-Brühe, enthaltend 100 μg/ml Ampicillin, bis zu einem A₆₀₀-Wert von etwa 0,5 gezüchtet. Die Expression des Mig-Proteins wurde dann durch die Zugabe von 1 mM Isopropyl-β,D-thiogalactosid (IPTG) (Signa, St. Louis, MO) induziert. Nach einer Inkubation für 3 Stunden bei 37°C wurden die Zellen geerntet, in Säulenpuffer (50 mM Natriumphosphat, pH 8,0, 0,2 M NaCl) gewaschen und durch Beschallung lysiert.
Etwa 40% des rekombinanten Proteins wurden aus der löslichen Fraktion der mit Ultraschall behandelten Zellen gewonnen, was einer Ausbeute von etwa 50 mg des rekombinanten Proteins pro Liter des Kulturvolumens entspricht, wie unter Verwendung eines DC-Proteintestkits (BioRad Laboratories, Mississauga, Ontario, Kanada) mit Rinderserumalbumin (Pierce, Rockford, Illinois) als Standard bestimmt wurde.
Das rekombinante Mig-Protein wurde mittels Affinitätschromatographie unter Verwendung einer Agarose-IgG-Matrix basierend auf der Fähigkeit des Proteins, an den Fc-Teil des IgG-Moleküls zu binden, gereinigt. Das Zelllysat wurde durch Zentrifugation geklärt, und die lösliche Fraktion wurde auf eine BLIgG-Agarose-Säule (Sigma, St. Louis, Missouri) aufgegeben. Die Säule wurde mit 10 Säulenvolumina von Säulenpuffer (50 mM Natriumphosphat, pH 8,0, 0,3 M NaCl) gewaschen, und das Protein wurde mit Säulenpuffer plus 0,1 M Glycin, pH 2,5, eluiert, wobei eine homogene Proteinfraktion mit einer Mig-Konzentration von etwa 10-15 mg/ml erhalten wurde. Das Eluat wurde gegen 2000 Volumenteile von PBSA dialysiert und bei -20°C gelagert.
E. Charakterisierung des rekombinanten Proteins
Die Analyse des gereinigten Proteins durch eine SDS-PAGE ergab eine Reinheit von 60%.
Beispiel 2
Immunisierung mit Mig und experimentelle Infektion von Rindern
Impfstoffe wurden derart formuliert, dass sie 50 mg/ml affinitätsgereinigtes rekombinantes Mig-Protein oder GapC in dem Ölbasis-Adjuvans VSA3 (VIDO, Saskatoon, Saskatchewan, Kanada) enthalten. VSA3 ist eine Kombination von Emulsigen Plus^TM (MVP Laboratories, Ralston, Nebraska) und Dimethyldioctadecylammoniumbromid (Kodak, Rochester, New York).
24 nicht säugende Holsteiner Rinder, deren Krankengeschichte keine S. dysgalactiae-Infektion beinhaltet, wurden von verschiedenen Farmen in Saskatchewan, Kanada, erhalten. Eine Woche vor der Impfung wurden alle Tiere mit Cepha-dry^TM (300 mg pro Drüsenviertel; Ayerst Laboratories, Montreal, Kanada) behandelt, um irgendeine Infektion der Euter vor dem Impfschritt zu heilen.
Drei Gruppen von acht Tieren wurden subkutan mit zwei Dosen der Impfstoffe, enthaltend Mig, CapC (ein Plasmin-Bindungsprotein, isoliert aus Streptococcus-Bakterien, welches gleichzeitig beurteilt wurde) oder ein Placebo, in einem Abstand von drei Wochen zwischen den Immunisierungen immunisiert. Zwei Wochen nach der zweiten Immunisierung wurden die Tiere mit 650 koloniebildenden Einheiten von S. dysgalactiae exponiert, welche mit einer Euter-Infusionskanüle in drei Drüsenviertel verabreicht wurden. Das vierte Drüsenviertel jedes Tieres diente als eine urinfizierte Kontrolle.
Alle Tiere wurden täglich auf klinische Symptome der Krankheit untersucht, und jeden Tag wurden Proben aus allen Eutervierteln gesammelt. Die Proben wurden hinsichtlich der Konsistenz und der somatischen Zellzahlen untersucht, wobei auch die Bakterienzahlen bestimmt wurden.
Beispiel 3
Bakterienkolonisierung
Die Bakterien wurden durch das Ausstreichen von Verdünnungsreihen (10⁰ bis 10^-3) direkt auf TSA-Schafblut-Agarplatten, gefolgt von einer Inkubation über Nacht bei 37°C, 5% CO₂, gezählt. Eine Kolonisierung ist definiert als die Rückgewinnung von > 500 CFU/ml des Expositionsorganismus.
Um zu bestätigen, dass es sich bei den Bakterien, welche aus den Milchsekreten gewonnen wurden, um S. dysgalactiae handelt, wurden ausgewählte Kolonien, welche von jedem Tier gewonnen wurden, unter Verwendung eines API strep-20-Tests (bioMerieux SA, Hazelwood, Missouri) entsprechend den Anweisungen des Herstellers getestet. Dieser Test ist ein Standardisierungsverfahren, welches 20 biochemische Tests auf die Enzymaktivität und die Zuckerfermentation kombiniert, wobei aus den Ergebnisse ein analytisches Profil erhalten wird. Das Profil erlaubt die Identifizierung der einzelnen vorhandenen Streptokokkenarten, entweder unter Bezugnahme auf einen analytischen Profilindex oder unter Verwendung einer Identifizierungssoftware.
Nach der Exposition mit S. dysgalactiae wurde für die Tiere in allen Gruppen gezeigt, dass sie durch S. dysgalactiae kolonisiert sind (4). Die Mig-immunisierten Tiere zeigten am Tag 3 und 4 nach der Exposition eine Verringerung hinsichtlich der Anzahl der infizierten Drüsenviertel.
Beispiel 4
Messung der Entzündungsantwort
Die Entzündungsantwort wurde als eine Funktion der somatischen Zellzahl (d.h. der Lymphocyten, Neutrophilen und Monocyten) gemessen. Die somatischen Zellzahlen wurden in einem Coulter-Zähler mittels Standardtechniken gemessen, wie in dem Merkblatt IDF50B (1985), Milk and Milk Products – Methods of Sampling, von Agriculture and Agri-Food, Kanada, empfohlen wird. Die Proben wurden immer innerhalb von 48 Stunden nach der Gewinnung und der Fixierung gemessen.
Die vorhandene Zahl der somatischen Zellen in der Drüse wurde an den Tagen 1 bis 7 nach der Exposition bestimmt. Die Zahlen für das nicht exponierte Drüsenviertel blieben während des Versuchs konstant, während die Mig-immunisierte Gruppe am Tag 1 eine geringere Zahl als die Placebo-immunisierte Gruppe zeigte (5). Die einzelnen Daten für den Tag 1 sind in 6 gezeigt.
Dementsprechend werden die Clonierung, Expression und Charakterisierung des S. dysgalactiae-Mig-Proteins, sowie Verfahren zur Verwendung desselben offenbart. Sequenzprotokoll

Claims

Impfstoffzusammensetzung, umfassend einen pharmazeutisch annehmbaren Träger und ein Fc-Rezeptor-Protein, wobei das Fc-Rezeptor-Protein ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: (a) einem Streptococcus dysgalactiae-Mig-Protein, umfassend die in Aminosäureposition 1 bis einschließlich 669 der 1A-1D(SEQ ID NO: 4) gezeigte Aminosäuresequenz; und (b) einem Fc-Rezeptor-Protein, welches mindestens 70% Sequenzübereinstimmung mit (a) aufweist.
Impfstoffzusammensetzung nach Anspruch 1, wobei das Mig-Protein die Aminosäuresequenz des Streptococcus dysgalactiae-Mig-Proteins, welche in Aminosäureposition 1 bis einschließlich 669 der 1A-1D (SEQ ID NO: 4) gezeigt ist, umfasst.
Impfstoffzusammensetzung nach Anspruch 1, weiterhin umfassend ein Adjuvans.
Verfahren zur Herstellung einer Impfstoffzusammensetzung, umfassend die Schritte: (a) Bereitstellen eines Fc-Rezeptor-Proteins, wobei das Fc-Rezeptor-Protein ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: i) einem Streptococcus dysgalactiae-Mig-Protein, umfassend die in Aminosäureposition 1 bis einschließlich 669 der 1A-1D (SEQ ID NO: 4) gezeigte Aminosäuresequenz; und ii) einem Fc-Rezeptor-Protein, welches mindestens 70% Sequenzübereinstimmung mit (i) aufweist, und (b) Kombinieren des Proteins mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger.
Verwendung eines Fc-Rezeptor-Proteins, wobei das Fc-Rezeptor-Protein ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: (a) einem Streptococcus dysgalactiae-Mig-Protein, umfassend die in Aminosäureposition 1 bis einschließlich 669 der 1A-1D (SEQ ID NO: 4) gezeigte Aminosäuresequenz; und (b) einem Fe-Rezeptor-Protein, welches mindestens 70% Sequenzübereinstimmung mit (a) aufweist, bei der Herstellung einer Impfstoffzusammensetzung, welche zur Behandlung oder Verhinderung einer Streptokokken-Infektion in einem Wirbeltier nützlich ist.
Verwendung nach Anspruch 5, wobei das Mig-Protein die Aminosäuresequenz des Streptococcus dysgalactiae-Mig-Proteins, welche in Aminosäureposition 1 bis einschließlich 669 der 1A-1D (SEQ ID NO: 4) gezeigt ist, umfasst.
Verwendung nach Anspruch 5 oder 6, wobei die Streptokokken-Infektion eine Brustdrüsenentzündung verursacht.
Verwendung eines Polynucleotids, umfassend eine codierende Sequenz für ein Fe-Rezeptor-Protein, wobei das Fc-Rezeptor-Protein ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: (a) einem Streptococcus dysgalactiae-Mig-Protein, umfassend die in Aminosäureposition 1 bis einschließlich 669 der 1A-1D (SEQ ID NO: 4) gezeigte Aminosäuresequenz; und (b) einem Fc-Rezeptor-Protein, welches mindestens 70% Sequenzübereinstimmung mit (a) aufweist, bei der Herstellung eines Medikaments, welches zur Behandlung oder Verhinderung einer Streptokokken-Infektion in einem Wirbeltier nützlich ist.
Verwendung nach Anspruch 8, wobei das Mig-Protein die Aminosäuresequenz des Streptococcus dysgalactiae-Mig-Proteins, welche in Aminosäureposition 1 bis einschließlich 669 der 1A-1D (SEQ ID NO: 4) gezeigt ist, umfasst.
Verwendung nach Anspruch 8 oder 9, wobei die Streptokokken-Infektion eine Brustdrüsenentzündung verursacht.