PT1292327E - Imunização de vacas leiteiras com proteina mig. - Google Patents

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PT1292327E PT01944804T PT01944804T PT1292327E PT 1292327 E PT1292327 E PT 1292327E PT 01944804 T PT01944804 T PT 01944804T PT 01944804 T PT01944804 T PT 01944804T PT 1292327 E PT1292327 E PT 1292327E
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Andrew A Potter
Alexandra J Bolton
Xin Ming Song
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Univ Saskatchewan
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Description

1
DESCRIÇÃO "IMUNIZAÇÃO DE VACAS LEITEIRAS COM PROTEÍNA Mig"
ÁREA TÉCNICA A presente invenção refere-se genericamente a antigenes bacterianos e a genes que os codificam. Mais particularmente, a presente invenção diz respeito à clonagem, expressão e caracterização da proteína receptora de Fc Mig de várias espécies de bactérias Streptococcus e à sua utilização em composições de vacinas.
CONTEXTO A mastite é uma infecção das glândulas mamárias habitualmente causada por bactérias ou fungos. A resposta inflamatória após a infecção resulta num decréscimo da produção de leite, bem como da qualidade, e provoca grandes prejuízos económicos anuais na indústria de lacticínios.
Entre as espécies bacterianas mais habitualmente associadas à mastite contam-se várias espécies do género Streptococcus, incluindo Streptococcus aureus,
Streptococcus uberis (não é possível determinar o tipo), Streptococcus agalactiae (grupo B de Lancefield), Streptococcus dysgalactiae (grupo C de Lancefield), Strptococcus zooepidemicus e estreptococos dos grupos de Lancefield D, - G, L e N. Algumas dessas espécies são contagiosas (por exemplo, S. agalactiae), ao passo que outras são consideradas patogenes ambientais (por exemplo, S. dysgalactiae e S. uberis) . 2 0 patogene ambiental S. uberis é responsável por cerca de 20% de todos os casos clínicos de mastite (Bramley, A. J., e Dodd, F. H. (1984) J. Dairy Res. .51: 481-512;
Bramley, A. J. (1987) Animal Health Nutrition _42: 12-16; Watts, J. L. (1988) J. Dairy Sei. Tl: 1616-1624); é o organismo predominante isolado de glândulas mamárias durante o período não de lactação (Bramley, A. J. (1984) Br. Vet. J. 14 0: 328-335; Bramley e Dodd (1984) J. Dairy Res. .51: 481-512; Oliver, S. P. (1988) Am. J. Vet. Res. 49: 1789-1793). A mastite resultante de infecção com S. uberis é habitualmente subclínica, caracterizada por leite aparentemente normal, com um aumento da contagem de células somáticas devido ao influxo de leucócitos. A composição química do leite altera-se devido à supressão da secreção com transferência de cloreto e bicarbonato de sódio do sangue para o leite, o que causa um desvio do pH para um nível mais alcalino. A mastite provocada por S. uberis também pode tomar a forma de um estado clínico agudo, com sinais óbvios de doença, como coágulos ou descoloração do leite e inchaço ou endurecimento das glândulas mamárias. Alguns casos da doença clínica podem ser graves, podendo ocorrer pirexia. Para uma revisão das manifestações clínicas de mastite provocada por S. uberis ver Bramley (1991) "Mastitis: physiology or pathology", páginas 3-9, em C. Burvenich, G. Vandeputte-van Messom e A. W. Hill (editores) "New insights into the pathogenesis of mastitis" Rijksuniversiteit Gent, Bélgica, e Schalm et al. (1971) "The mastitis complex-A brief summary", páginas 1-3, em "Bovine Mastitis" Lea & Febiger, Filadélfia. 3 Métodos convencionais de controlo antibacteriano, como tratamento das tetas por imersão e terapia com antibióticos, são eficazes no controlo de muitos tipos de mastite contagiosa, mas os organismos ambientais tipicamente presentes em todos os celeiros da indústria leiteira são muitas vezes resistentes a essas medidas. Em consequência, a vacinação é uma estratégia atractiva para prevenir infecções das glândulas mamárias, tendo sido mostrado ser benéfica no caso de alguns patogenes de mastite contagiosa.
No entanto, a literatura é limitada no que se refere a estudos de vacinação com patogenes ambientais, como S. dysgalactiae e S. uberis, tendo-se observado resultados variáveis. Nalguns casos, a imunização resultou em sensibilidade acrescida ao organismo especifico, noutros casos obteve-se protecção especifica para estirpes.
Por exemplo, estudos prévios mostraram que a infecção primária com S. uberis pode reduzir consideravelmente a taxa de infecções após uma segunda provocação com a mesma estirpe (Hill, A. W. (1988) Res. Vet. Sei. 4_4: 386-387). A vacinação local com S. uberis mortos protege as glândulas mamárias dos bovinos contra provocação intra-mamária com a estirpe homóloga (Finch et al. (1994) Infect. Immun. 62: 3599-3603) . De modo semelhante, foi mostrado que a vacinação subcutânea com S. uberis vivos modifica dramaticamente a patogénese de mastite com a mesma estirpe (Hill et al. (1994) FEMS Immunol. Med. Microbiol. 8_: 109-118). Os animais vacinados deste modo lançaram menos bactérias no seu leite e muitos quartos não foram infectados. 4
Ainda assim, a vacinação com bactérias vivas ou atenuadas pode colocar riscos para o receptor. Suplementarmente, é claro que, em geral, vacinas mortas convencionais são amplamente ineficazes contra S. uberis e S. agalactiae, devido à ausência de antigenes protectores em células que cresceram in vitro ou dissimulação destes antigenes por mimica molecular. A presente falta de vacinas existentes para a mastite contra S. agalactiae ou contra as estirpes de estreptococos contagiosas deve-se, pelo menos em parte, à falta de conhecimento no que se refere a determinantes de virulência e antigenes protectores produzidos por aqueles organismos que estão envolvidos na invasão e protecção das glândulas mamárias (Collins et al. (1988) J. Dairy Res. J55: 25-32; Leigh et al. (1990) Res. Vet. Sei. 49_: 85-87; Marshall et al. (1986) J. Dairy Res. .53: 507-514).
Sabe-se que S. dysgalactiae se liga a várias proteínas extracelulares e derivadas do plasma, como fibronectina, fibrinogénio, colagénio, alfa-II-macroglobulina, IgG, albumina e outros compostos. O organismo também produz hialuronidase e fibrinolisina e é capaz de aderir e de invadir células epiteliais mamárias de bovino. Contudo, não se conhecem os papéis exactos dos componentes bacterianos responsáveis por estes fenótipos na patogénese.
De modo semelhante, compreende-se mal a patogénese da infecção por S. uberis. Além disso, a influência de factores de virulência de S. uberis nos mecanismos de defesa do hospedeiro e fisiologia das glândulas mamárias não está bem definida. Factores de virulência conhecidos associados a S. uberis incluem uma cápsula de ácido 5 hialurónico (Hill, A. W. (1988) Res. Vet. Sei. 4L5: 4 00 —
404), hialuronidase (Schaufuss et al. (1989) Zentralbl. Bakteriol. Ser. A 271: 46-53), proteína do tipo R (Groschup, Μ. H., e Timoney, J. F. (1993) Res. Vet. Sei. 54: 124-126), e uma co-hemolisina, o factor CAMP, também conhecido como factor UBERIS (Skalka, B., e Smola, J. (1981) Zentralbl. Bakteriol. Ser. A 249: 190-194), proteína do tipo R, activador do plasminogénio e factor CAMP. No entanto, sabe-se muito pouco acerca dos seus papéis na patogenicidade.
Foi proposta a utilização de determinantes de virulência de Streptococcus como agentes imunogénicos. Por exemplo, foi mostrado que o factor CAMP de S. uberis protege sujeitos vertebrados de infecções por esse organismo (Jiang et al., Patente U.S. N° 5 863 543). O antigene γ da estirpe de Streptococcí do grupo B A909 (ATCC N° 27591) é um componente do complexo marcador da proteína c, que compreende adicionalmente uma subunidade α e β (Boyle, Patente U.S. N° 5 721 339). Foi relatado que subconjuntos do serótipo Ia, II e virtualmente todas as células do serótipo Ib de estreptococos do grupo B expressam componentes da proteína c. Foi proposta a utilização da subunidade γ como agente imunogénico contra infecções por Streptococcus do Grupo B de Lancefield. Todavia, a sua utilização para prevenir ou tratar infecções bacterianas em animais, incluindo mastite em gado vacum, não foi estudada. A proteína M de estreptococos do grupo A é considerada um dos principais factores de virulência deste organismo, 6 em virtude da sua capacidade para impedir o ataque por fagócitos humanos (Lancefield, R. C. (1962) J. Immunol. 89: 307-313) . A bactéria persiste no tecido infectado até serem produzidos anticorpos contra a molécula M. Anticorpos específicos para tipos para a proteína M conseguem inverter o efeito anti-fagocítico da molécula e permitem uma eliminação eficiente do organismo invasor.
As proteínas M são um dos factores-chave de virulência de Streptococcus pyogenes devido ao seu envolvimento na mediação da resistência à fagocitose (Kehoe, Μ. A. (1991) Vaccine 9: 797-806) e à sua capacidade para induzir respostas imunológicas do hospedeiro potencialmente nocivas via a sua super-antigenicidade e a sua capacidade para induzir respostas de anticorpos que reagem de forma cruzada no hospedeiro (Bisno, A. L. (1991) New Engl. J. Med. 325: 783-793; Froude et al. (1989) Curr. Top. Microbiol. Immunol. 145: 5-26; Stollerman, G. H. (1991) Clin. Immunol. Immunopathol. _61: 131-142).
No entanto, há obstáculos à utilização de proteínas M intactas como vacinas. Os epítopos opsónicos da proteína são extremamente específicos para tipos, o que resulta numa protecção de curto espectro específica para tipos. Além disso, algumas proteínas M parecem conter epítopos que reagem de forma cruzada com tecidos do sujeito imunizado, o que causa uma resposta autoimune nociva (ver, por exemplo, Dale, J. G., e Beachey, E. H. (1982) J. Exp. Med. 156: 1165-1176; Dale, J. B., e Beachey, E. H. (1985) J. Exp. Med. 161: 113-122; Baird, R. W., Bronze, M. S., Draus, W.,
Hill, H. R., Veasey, L. G., e Dale, J. B. (1991) J. Immun. 146: 3132-3137; Bronze, M. S., e Dale, J. B. (1993) J. 7
Irrnun. 151: 2820-2828; Cunningham, M. W., e Russell, S. M. (1983) Infect. Immun. 42: 531-538).
Proteínas quiméricas que contêm três domínios de ligação de fibronectina (FNBDs) diferentes derivados de proteínas de ligação à fibronectina de S. dysgalactiae e Staphylococcus aureus foram expressas na superfície de células de Staph. carnosus. No caso de uma destas proteínas, imunizações intranasais com células vivas recombinantes de Staph. carnosus que expressam a proteína quimérica na sua superfície resultaram numa resposta melhorada de anticorpos a um imunogene modelo presente na proteína quimérica de superfície (Liljeqvist, S. et al. (1999) FEBS Letters 446: 299-304).
Receptores de Fc bacterianos (fracções de superfície que se ligam a moléculas de imunoglobulinas por um mecanismo não imunológico, isto é, à porção Fc do anticorpo) constituem uma classe de proteínas de ligação suplementarmente caracterizadas pela sua reactividade com diferentes classes e subclasses de imunoglobulinas de mamífero. O receptor de tipo I (também conhecido como Proteína A) , o mais extensamente estudado e caracterizado, foi isolado de Staphylococcus aureus e liga-se a IgG dos tipos 1, 2 e 4; este tipo de receptor também exibe reactividade cruzada com IgA e IgM. Foi relatado que o receptor de Fc de tipo II, presente nalguns estreptococos do Grupo A de Lancefield, e o receptor de tipo III (também conhecido como Proteína G), presente na maioria das estirpes de streptococcus humanos do grupo C e grupo G, reagem com os quatro tipos de IgG. No caso do receptor de tipo III, a ligação a IgG é altamente especifica; a
proteína não reage de forma cruzada com IgA ou IgM. O receptor de tipo IV está presente em certos estreptococos do grupo G de bovinos, e o receptor de tipo V está presente em certas estirpes de Streptococcus zooepidemicus. 0 receptor de Fc de tipo VI foi isolado das estirpes S212 e RSS-212 de S. zooepidemicus e liga-se à IgG de rato com afinidade elevada, isto é, 100 vezes a afinidade da ligação da Proteína A e 30 até 40 vezes mais do que a ligação da Proteína G (Boyle et al., Patente U.S. N° 4 977 082). Para uma discussão de receptores de Fc ver Langone (1982) Adv. Immunol. 32_: 167, e Myhre et al. (1984) "Basic Concepts of Streptococci and Streptococcal Diseases" (Holm & Christensen, editores) Redbook Ltd., Chertsey, Surrey, Inglaterra. A patente U.S. 5 328 987 revela uma sequência de DNA que codifica uma proteína receptora de Fc de IgA humana. Jonsson et al. (Euro. J. Biochem. (1994) 220: 819-826) descrevem uma proteína Mig.
Até à data, a utilidade de proteínas de ligação a FC tem-se limitado à detecção e purificação de anticorpos. No que se refere a aplicações clínicas, foi proposto um método de tratamento de sangue extra-corporal de doenças autoimunes que emprega proteínas de ligação a Fc para remover complexos antigene-anticorpo (ver, por exemplo, Fahnestock, Patente U.S. N° 4 954 618). No entanto, a sua utilização em composições de vacinas não foi previamente descrita nem sugerida.
Até à data não foi estudada a capacidade protectora da proteína Mig de S. dysgalactiae contra mastite, nem foi isolada nem caracterizada a proteína Mig de S. dysgalactiae. 9
RESUMO DA INVENÇÃO
Em conformidade, a presente invenção proporciona proteínas receptoras de Fc e suas utilizações. Numa especificação, a invenção é dirigida a uma composição de vacina que compreende um veículo farmaceuticamente aceitável e uma proteína receptora de Fc. A proteína receptora de Fc é seleccionada do grupo que consiste em: (a) uma proteína Mig de Streptococcus dysgalactiae que compreende a sequência de aminoácidos apresentada nas posições de aminoácidos 1 até 669, inclusive, das Figuras 1A-1D (ID SEQ NO: 4); (b) uma proteína receptora de Fc que possui pelo menos cerca de 70% de identidade de sequências com (a).
Nalgumas especificações, a composição de vacina compreende um adjuvante.
Ainda noutras especificações, a invenção é dirigida a um método para produzir uma composição de vacina. O método compreende os passos seguintes: (a) proporcionar uma proteína receptora de Fc, em que essa proteína receptora é seleccionada do grupo que consiste em: (i) uma proteína Mig de Streptococcus dysgalactiae que compreende a sequência de aminoácidos apresentada nas posições de aminoácidos 1 até 669, inclusive, das Figuras 1A-1D (ID SEQ NO: 4), e (ii) uma proteína receptora de Fc que possui pelo menos cerca de 70% de identidade de sequências com (i), e 10 (b) combinar essa proteína com um veículo farmaceuticamente aceitável.
Noutra especificação, a invenção é dirigida à utilização de uma proteína receptora de Fc, em que essa proteína receptora de Fc é seleccionada do grupo que consiste (a) numa proteína Mig de Streptococcus dysgalactiae que compreende a sequência de aminoácidos apresentada nas posições de aminoácidos 1 até 669, inclusive, das Figuras 1A-1D (ID SEQ NO: 4), e (b) numa proteína receptora de Fc que possui pelo menos cerca de 70% de identidade de sequências com (a), no fabrico de um medicamento para prevenir uma infecção bacteriana num sujeito vertebrado.
Em certas especificações, a infecção bacteriana é uma infecção causada por estreptococos. Adicionalmente, a infecção bacteriana pode causar mastite.
Ainda noutra especificação, a invenção é dirigida à utilização de um polinucleótido que compreende uma sequência codificadora para uma proteína receptora de Fc, em que essa proteína receptora de Fc é seleccionada do grupo que consiste (a) numa proteína Mig de Streptococcus dysgalactiae que compreende a sequência de aminoácidos apresentada nas posições de aminoácidos 1 até 669, inclusive, das Figuras 1A-1D (ID SEQ NO: 4), e (b) numa proteína receptora de Fc que possui pelo menos cerca de 70% de identidade de sequências com (a) , no fabrico de um medicamento útil para tratar ou prevenir uma infecção bacteriana num sujeito vertebrado. 11
Em certas especificações, a infecção bacteriana é uma infecção causada por estreptococos e pode causar mastite.
Estas e outras especificações da presente invenção ocorrerão prontamente aos habitualmente experimentados na área considerando a revelação aqui apresentada.
DESCRIÇÃO BREVE DAS FIGURAS
As Figuras 1A-1D apresentam a sequência polinucleotidica que codifica a proteína Mig de Streptococcus dysgalactiae e a sequência de aminoácidos deduzida daquela (ID SEQ NO: 3 e ID SEQ NO: 4, respectivamente). A Figura 2 apresenta os seguintes resultados da análise da estrutura peptídica da proteína Mig de S. dysgalactiae: gráfico de Hidropatia de Kyle-Doolittle ("Hidrofilicidade KD"), tendo sido tomada a média numa janela de 7; um gráfico de probabilidade de superfície de Emini ("Prob. Superfície"); um gráfico de flexibilidade das cadeias de Karplus-Schulz ("Flexibilidade"); um gráfico do índice antigénico de Jameson-Wolf e gráficos de estruturas secundárias de Chou-Fasman e Garnier-Osguthorpe-Robson ("Hélices Alfa CF" e "Folhas Beta CF", e "Laços GOR", "Hélices Alfa GOR", "Folhas Beta GOR" e "Sítios de Glicosilação", respectivamente). A Figura 3 é um gráfico de estrutura secundária de Chou-Fasman para a proteína Mig de S. dysgalactiae. A Figura 4 compara a alteração da percentagem de quartos de tetas infectados com S. dysgalactiae durante um 12 período de 7 dias entre três grupos experimentais: (1) animais de controlo não vacinados; (2) animais vacinados com a proteína Mig, e (3) animais vacinados com GapC, uma proteína de ligação a plasmina isolada de S. dysgalactiae, que foi avaliada simultaneamente. Definiu-se a infecção como a recuperação de > 500 cfu de S. dysgalactiae por ml de secreções de leite. A Figura 5 apresenta a resposta inflamatória observada à infecção com S. dysgalactiae, representada graficamente como contagens de células somáticas (SCC) médias para cada grupo experimental versus tempo em dias pós-provocação. Na figura, os losangos (-♦-) representam quartos não provocados e não vacinados, os quadrados (--) representam animais provocados e não vacinados, os triângulos (-Δ-) representam animais provocados e vacinados com Mig e x's (-X-) representam animais provocados e vacinados com GapC. A Figura 6 ilustra contagens de células somáticas por quarto mamário no dia 1 pós-provocação. Na figura, a barra representa a média para cada grupo. Os quadrados (--) representam animais não vacinados, os triângulos (-A-) representam animais vacinados com GapC e triângulos invertidos (-V-) representam animais vacinados com Mig.
DESCRIÇÃO PORMENORIZADA DA INVENÇÃO A menos que indicado em contrário, a prática da presente invenção empregará técnicas convencionais de biologia molecular, microbiologia, tecnologia de DNA recombinante e imunologia, que são comuns na área. Essas técnicas estão completamente explicadas na literatura. Ver, por exemplo, Sambrook, Fritsch & Maniatis, "Molecular 13
Cloning: A Laboratory Manual" Volumes I, II e III, Segunda Edição (1989); Perbal, B., "A Practical Guide to Molecular Cloning" (1984); a série "Methods in Enzymology" (S. Colowick e N. Kaplan, editores, Academic Press, Inc.), e "Handbook of Experimental Immunology" Volumes I-IV (D. M. Weir e C. C. Blackwell, editores, 1986, Blackwell Scientific Publications) .
Ao longo do texto utilizam-se as seguintes abreviaturas de aminoácidos:
Arginina: Arg (R) Ácido aspártico: Asp (D) Glutamina: Gin (Q) Glicina: Gly (G) Isoleucina: Ile (I) Lisina: Lys (K) Fenilalanina: Phe (F) Serina: Ser (S) Triptofano: Trp (W) Valina: Vai (V)
Alanina: Ala (A)
Asparagina: Asn (N)
Cisteina: Cys (C) Ácido glutâmico: Glu (E)
Histidina: His (H)
Leucina: Leu (L)
Metionina: Met (M)
Prolina: Pro (P)
Treonina: Thr (T)
Tirosina: Tyr (Y)
1. DEFINIÇÕES
Na descrição da presente invenção empregar-se-ão os termos seguintes, pretendendo-se que sejam definidos como indicado abaixo.
Deve notar-se que, tal como são utilizadas nesta especificação e nas reivindicações adjuntas, as formas singulares "um", "uma" e "o", "a" incluem referentes plurais, a menos que o contexto imponha claramente o contrário. Assim, por exemplo, referência a "uma proteína 14 de ligação a Fc de Streptococcus dysgalactiae" inclui uma mistura de duas ou mais dessas proteínas, e afins.
Os termos "proteina receptora de Fc" e "proteina de ligação a Fc", utilizados aqui de forma intermutável, designam uma proteina bacteriana capaz de se ligar a moléculas de imunoglobulinas num sitio diferente do sitio de reconhecimento de antigenes, incluindo, sem limitação, a região Fc de uma molécula de imunoglobulina.
Os termos "proteina Mig" e "proteina receptora de Fc Mig" e "proteina de ligação a Fc Mig" (utilizados aqui de forma intermutável) , ou uma sequência de nucleótidos que a codifica, designam uma proteina ou uma sequência de nucleótidos, respectivamente, que deriva de um gene Mig presente numa variedade de espécies bacterianas, incluindo, sem limitação, certas estirpes de estreptococos do grupo A. A sequência de nucleótidos de um gene Mig de Streptococcus representativo de S. dysgalactiae (ID SEQ NO: 3) e a sequência de aminoácidos correspondente codificada por esse gene (ID SEQ NO: 4) estão representadas nas Figuras 1A-1D. No entanto, uma proteina Mig como definida aqui não se limita às sequências representadas, pois são conhecidos subtipos de cada uma destas espécies de Streptococcus e ocorrerão entre eles variações nas proteínas Mig.
Um gene Mig representativo derivado de S. dysgalactiae encontra-se no plasmídeo pAA505Mig.
Além disso, não é necessário que as sequências proteicas ou de nucleótidos derivadas derivem fisicamente do gene descrito acima, podendo ser geradas de qualquer modo, incluindo, por exemplo, síntese química, isolamento 15 (por exemplo, de S. dysgalactiae) ou por produção recombinante, com base nas informações fornecidas aqui. Adicionalmente, pretende-se que o termo designe proteínas com sequências de aminoácidos substancialmente homólogas (como definido abaixo) a sequências de aminoácidos contíguas codificadas pelos genes que exibem actividade imunológica e/ou de ligação à plasmina.
Assim, os termos designam sequências completas, bem como truncadas e parciais e imunogénicas, e análogos activos e formas precursoras das proteínas. 0 termo também inclui fragmentos de nucleótidos do gene que incluem pelo menos cerca de 8 pares de bases contíguos, mais preferivelmente pelo menos cerca de 10-20 pares de bases contíguos e muito preferivelmente pelo menos cerca de 25 até 50, ou mais, pares de bases contíguos do gene, ou quaisquer inteiros entre estes valores. Esses fragmentos são úteis como sondas e em métodos de diagnóstico, discutidos mais pormenorizadamente abaixo.
Os termos também incluem aquelas formas que têm, e que não têm, uma sequência de sinal, se estiver presente, bem como as sequências de ácidos nucleicos que as codificam. Adicionalmente, o termo designa formas das proteínas Mig sem uma região de ancoragem membranar, e sequências de ácidos nucleicos que codificam proteínas com essas deleções. Essas deleções podem ser desejáveis em sistemas que não proporcionam a secreção da proteína. Suplementarmente, os domínios receptores-de ligação a Fc das proteínas podem ou não estar presentes. Assim, por exemplo, se a proteína de ligação a Fc Mig for utilizada para purificar imunoglobulinas, o domínio de ligação a Fc será geralmente retido. Se a proteína se destinar a ser 16 utilizada em composições de vacinas, estarão presentes epitopos imunogénicos que podem ou não incluir o domínio receptor-de ligação a Fc.
Os termos também incluem proteínas em forma neutra ou na forma de sais de adição básicos ou ácidos, dependendo do modo de preparação. Esses sais de adição ácidos podem envolver grupos amino livres e podem formar-se sais básicos com carboxilos livres. Sais de adição básicos e ácidos farmaceuticamente aceitáveis são suplementarmente discutidos abaixo. Adicionalmente, as proteínas podem ser modificadas por combinação com outros materiais biológicos, como lípidos (tanto os que ocorrem naturalmente com a molécula ou outros lípidos que não destruam a actividade imunológica) e sacáridos, ou por modificação de cadeias laterais, como acetilação de grupos amino, fosforilação de cadeias laterais hidroxilo, oxidação de grupos sulfidrilo, glicosilação de resíduos de aminoácidos, bem como outras modificações da sequência primária modificada.
Em consequência, o termo designa deleções, adições e substituições na sequência, desde que o polipéptido produza uma resposta imunológica como definida aqui. A este respeito, substituições particularmente preferidas terão natureza geralmente conservativa, isto é, aquelas substituições que ocorrem numa família de aminoácidos. Por exemplo, os aminoácidos são geralmente divididos em quatro famílias: (1) acídicos - aspartato e glutamato; (2) básicos - lisina, arginina, histidina; (3) não polares - alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano, e (4) polares sem carga - glicina, asparagina, glutamina, cistina, serina, treonina, tirosina. Fenilalanina, triptofano e tirosina são por vezes 17 classificados como aminoácidos aromáticos. Por exemplo, é razoavelmente previsível que uma substituição isolada de leucina por isoleucina ou valina, ou vice-versa, um aspartato por um glutamato, ou vice-versa, uma treonina por uma serina, ou vice-versa, ou uma substituição conservativa semelhante de um aminoácido por um aminoácido estruturalmente relacionado, não exerça um efeito significativo na actividade biológica. Assim, proteínas que possuam substancialmente a mesma sequência de aminoácidos da molécula de referência mas com pequenas substituições de aminoácidos que não afectem substancialmente a imunogenicidade e/ou afinidade de ligação à plasmina da proteína são abrangidas pela definição do polipéptido de referência.
Por exemplo, o polipéptido de interesse pode incluir até cerca de 5-10 substituições de aminoácidos conservativas ou não conservativas, ou mesmo até cerca de 15-25 ou 20-50 substituições de aminoácidos conservativas ou não conservativas, ou qualquer inteiro entre estes valores, desde que a função desejada da molécula permaneça intacta.
De modo semelhante, substituições que ocorram no domínio de ligação transmembranar, se estiver presente, e na sequência de sinal, se estiver presente, normalmente não afectarão a imunogenicidade. O experimentado na área pode facilmente determinar outras regiões da molécula de interesse que consigam tolerar alterações relativamente aos gráficos da estrutura peptídica apresentados aqui na Figura e Figura 3. 18 0 termo "proteína Mig de estreptococos" designa uma proteína de ligação a Fc Mig, como definida acima, derivada de uma espécie de estreptococos que a produz, incluindo, mas não se limitando a S. dysgalactiae. Por exemplo, uma "proteína Mig de S. dysgalactiae" é uma proteína de ligação a Fc como definida acima derivada de S. dysgalactiae.
Proteínas ou polipéptidos "de tipo selvagem" ou "nativos" referem-se a proteínas ou polipéptidos isolados da fonte onde as proteínas ocorrem naturalmente. Polipéptidos "recombinantes" referem-se a polipéptidos produzidos por técnicas de DNA recombinante, isto é, produzidos a partir de células transformadas por uma construção de DNA exógeno que codifica o polipéptido desejado. Polipéptidos "sintéticos" são os polipéptidos preparados por síntese química.
Uma proteína ou polipéptido "isolado" é uma molécula de proteína ou polipéptido separada e discreta do organismo completo onde a molécula está presente na natureza, ou uma proteína ou polipéptido que não tem, na totalidade ou em parte, sequências normalmente associadas a ele na natureza, ou uma sequência tal como existe na natureza mas com sequências heterólogas (como definido abaixo) associadas a ela. 0 termo "funcionalmente equivalente" significa que a sequência de aminoácidos de uma proteína de ligação a Fc Mig é tal que irá induzir uma resposta imunológica substancialmente equivalente ou aumentada, como definido acima, em comparação com a resposta induzida por uma proteína de ligação a Fc possuindo identidade com a 19 proteína de ligação a Fc de referência, ou respectiva porção imunogénica. 0 termo "epítopo" refere-se ao sítio de um antigene ou hapteno ao qual respondem células B e/ou células T específicas. 0 termo também é utilizado de forma intermutável com "determinante antigénico" ou "sítio de determinante antigénico". Anticorpos que reconhecem o mesmo epítopo podem ser identificados num imunoensaio simples que mostre a capacidade de um anticorpo para bloquear a ligação de outro anticorpo a um antigene-alvo.
Os termos proteína ou polipéptido "imunogénico" referem-se a uma sequência de aminoácidos que induz uma resposta imunológica como descrito abaixo. Uma proteína ou polipéptido "imunogénico", tal como é aqui utilizado, inclui a sequência completa da proteína receptora de Fc em questão, com ou sem a sequência de sinal, domínio de ancoragem membranar e/ou domínio de ligação a Fc, respectivos análogos ou respectivos fragmentos imunogénicos.
Por "fragmento imunogénico" pretende-se significar um fragmento de uma proteína receptora de Fc que inclui um ou mais epítopos e, assim, induz a resposta imunológica descrita abaixo. Esses fragmentos podem ser identificados utilizando qualquer número de técnicas de mapeamento de epítopos, bem conhecidas na área. Ver, por exemplo, "Epitope Mapping Protocols", em "Methods in Molecular Biology", Volume 66 (Glenn E. Morris, Editor, 1996) Humana Press, Totowa, Nova Jersey. Por exemplo, podem determinar-se epítopos lineares, por exemplo, sintetizando concomitantemente um grande número de péptidos em suportes 20 sólidos, em que os péptidos correspondem a porções da molécula proteica, e fazendo reagir os péptidos com anticorpos enquanto os péptidos ainda estão ligados aos suportes. Essas técnicas são conhecidas na área e estão descritas, por exemplo, na Patente U.S. N° 4 708 871; Geysen et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 8_1: 3998— 4002; Geysen et al. (1986) Molec. Immunol. 23: 709-715.
De modo semelhante, epitopos conformacionais são facilmente identificados determinando a conformação espacial de aminoácidos, tal como, por exemplo, por cristalografia de raios X e ressonância magnética nuclear 2-dimensional. Ver, por exemplo, "Epitope Mapping Protocols", supra. Também podem identificar-se regiões antigénicas de proteínas utilizando gráficos comuns de antigenicidade e hidropatia, como os calculados utilizando, por exemplo, o programa de "software" Omiga versão 1.0 disponibilizado pelo Oxford Molecular Group. Este programa computacional emprega o método de Hopp/Woods, Hopp et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1981) 7_8; 3824-3828, para determinar perfis de antigenicidade, e a técnica de Kyte-Doolittle, Kyte et al., J. Mol. Biol. (1982) 157: 105-132, para gráficos de hidropatia. As Figuras 2 e 3 apresentadas aqui ilustram perfis Kyte-Doolittle para proteínas representativas abrangidas pela invenção.
Para as finalidades da presente invenção, fragmentos imunogénicos incluirão habitualmente pelo menos cerca de 3 aminoácidos, preferivelmente pelo menos cerca de 5 aminoácidos, mais preferivelmente pelo menos cerca de 10-15 aminoácidos e muito preferivelmente 25 ou mais aminoácidos da molécula da proteína receptora de Fc Mig paterna. Não é imposto nenhum limite superior crítico ao comprimento do 21 fragmento, que pode compreender quase toda a sequência proteica, ou mesmo uma proteína de fusão compreendendo dois ou mais epítopos de Mig.
Uma "composição imunogénica" é uma composição que compreende uma molécula antigénica, em que a administração da composição a um sujeito resulta no desenvolvimento, no sujeito, de uma resposta imunológica humoral e/ou celular à molécula antigénica de interesse.
Por "composição de vacina de subunidade" pretende-se significar uma composição que contém pelo menos um polipéptido imunogénico, mas não todos os antigenes, derivado ou homólogo a um antigene de um patogene de interesse. Essa composição está substancialmente livre de células ou partículas do patogene intacto, ou do lisato dessas células ou partículas. Assim, "uma composição de vacina de subunidade" é preparada a partir de polipéptidos imunogénicos pelo menos parcialmente purificados (preferivelmente substancialmente purificados) do patogene, ou respectivos análogos recombinantes. Uma composição de vacina de subunidade pode compreender o antigene ou antigenes de interesse de subunidade substancialmente livres de outros antigenes ou polipéptidos do patogene.
Por "farmaceuticamente aceitável" ou "farmacologicamente aceitável" pretende-se significar um material que não é indesejável biologicamente ou de qualquer outra forma, isto é, o material pode ser administrado a um indivíduo numa formulação ou composição sem causar quaisquer efeitos biológicos indesejáveis nem interagir de forma prejudicial com qualquer um dos componentes da composição onde está contido. 22
Uma "resposta imunológica" a uma composição ou vacina consiste no desenvolvimento no hospedeiro de uma resposta imunológica celular e/ou mediada por anticorpos à composição ou vacina de interesse. Habitualmente, uma "resposta imunológica" inclui, mas não se limita a um ou mais dos efeitos seguintes: produção de anticorpos, células B, células T auxiliadoras, células T supressoras e/ou células T citotóxicas e/ou células T γδ, dirigidas especificamente para um antigene ou antigenes incluídos na composição ou vacina de interesse. Preferivelmente, o hospedeiro exibirá uma resposta imunológica terapêutica ou protectora de modo que a resistência das glândulas mamárias a nova infecção será aumentada e/ou a gravidade clínica da doença será reduzida. Essa protecçâo será demonstrada por uma redução ou ausência dos sintomas normalmente exibidos por um hospedeiro infectado e/ou uma recuperação mais rápida.
Por "imunização com um ácido nucleico" pretende-se significar a introdução de uma molécula de ácido nucleico que codifica um ou mais antigenes seleccionados numa célula-hospedeiro, para a expressão in vivo de um antigene, antigenes, um epítopo ou epítopos. A molécula de ácido nucleico pode ser introduzida directamente num sujeito receptor, tal como por administração por injecção, inalação, oral, intranasal e mucosa, ou afins, ou pode ser introduzida ex vivo em células que foram removidas do hospedeiro. No último caso, as células transformadas são reintroduzidas no sujeito, onde pode ser accionada uma resposta imunológica contra o antigene codificado pela molécula de ácido nucleico. 23
Tal como é aqui utilizado, o termo "tratamento" refere-se à (1) prevenção de infecção ou reinfecção (profilaxia) ou à (2) redução ou eliminação dos sintomas da doença de interesse (terapia).
Por "mastite" pretende-se significar uma inflamação das glândulas mamárias em mamíferos, incluindo em vacas, ovelhas, cabras, porcas, éguas e afins, causada pela presença de S. uberis. A infecção manifesta-se pela infiltração de células fagocíticas nas glândulas. Genericamente, reconhecem-se 4 tipos clínicos de mastite: (1) hiperaguda, associada a inchaço, calor, dor e secreção anormal nas glândulas, sendo acompanhada por febre e outros sinais de perturbação sistémica, como depressão acentuada, pulsação fraca e rápida, olhos encovados, fraqueza e anorexia completa; (2) aguda, com alterações nas glândulas semelhantes às descritas acima mas em que a febre, anorexia e depressão são ligeiras a moderadas; (3) subaguda, em que não são exibidas alterações sistémicas e as alterações nas glândulas e sua secreção são menos acentuadas, e (4) subclínica, em que a reacção inflamatória é detectável apenas por testes padrão para mastite.
Testes padrão para a detecção de mastite incluem, mas não se limitam a estes, o Teste de Mastite de Califórnia, o Teste de Mastite de Wisconsin, o teste Nagase, a contagem electrónica de células e contagens de células somáticas, utilizados para detectar um teor persistentemente elevado de glóbulos brancos no leite. Em geral, uma contagem de células somáticas de cerca de 300 000 até cerca de 500 000 células por ml, ou mais elevado, no leite indicará a presença de infecção. Assim, uma vacina é considerada eficaz no tratamento e/ou prevenção de mastite quando, por 24 exemplo, a contagem de células somáticas no leite permanecer inferior a cerca de 500 000 células por ml. Para uma discussão de mastite e seu diagnóstico ver, por exemplo, "The Merck Veterinary Manual: A Handbook of Diagnosis, Therapy, and Disease Prevention and Control for the Veterinarian" Merck and Co., Rahway, Nova Jersey, 1991.
Pelos termos "vertebrado", "sujeito" e "sujeito vertebrado" pretende-se significar qualquer membro do sub-filo Chordata, incluindo, sem limitação, mamíferos como gado vacum, ovelhas, porcos, cabras, cavalos e humanos; animais domésticos, como cães e gatos, e pássaros, incluindo pássaros lutadores domésticos e selvagens, como galos, e fêmeas de aves, incluindo galinhas, peruas e outras aves galináceas, e peixes. O termo não designa uma idade particular. Assim, pretende-se que estejam abrangidos animais adultos e recém-nascidos, bem como fetos.
Uma molécula de "ácido nucleico" pode incluir, mas não se limita a sequências procarióticas, mRNA eucariótico, cDNA de mRNA eucariótico, sequências de DNA genómico de DNA eucariótico (por exemplo, de mamifero) e mesmo sequências de DNA sintético. O termo também abrange sequências que incluam qualquer um dos análogos de bases conhecidos de DNA e RNA.
Uma molécula de ácido nucleico "isolada" é uma molécula de ácido nucleico separada e discreta do organismo completo onde a molécula se encontra na natureza, ou uma molécula de ácido nucleico que não tem, na totalidade ou em parte, sequências normalmente associadas a ela na natureza, ou uma sequência tal como existe na natureza mas com sequências heterólogas (como definido abaixo) associadas a ela. No 25 contexto de um polinucleótido, o termo "isolado" significa que o polinucleótido está isolado do cromossoma ao qual está normalmente associado e está isolado da sequência genómica completa onde normalmente ocorre. "Polinucleótido purificado" refere-se a um polinucleótido de interesse, ou respectivo fragmento, que está essencialmente livre, por exemplo, contém menos de cerca de 50%, preferivelmente menos de cerca de 70% e mais preferivelmente menos de cerca de 90% da proteína à qual o polinucleótido está naturalmente associado. Técnicas de purificação de polinucleótidos de interesse são bem conhecidas na área e incluem, por exemplo, desagregação da célula que contém o polinucleótido com um agente caotrópico e separação do(s) polinucleótido(s) e proteínas por cromatografia de permuta iónica, cromatografia de afinidade e sedimentação de acordo com a densidade.
Uma "sequência codificadora" ou uma "sequência de nucleótidos que codifica" uma proteína particular é uma sequência de nucleótidos que é transcrita e traduzida num polipéptido in vitro ou in vivo quando colocada sob o controlo de elementos reguladores apropriados. As fronteiras da sequência codificadora são determinadas por um codão de início no terminal 5' (amino) e um codão de terminação da tradução no terminal 3' (carboxi). Uma sequência codificadora pode incluir, mas não se limita a sequências procarióticas, cDNA de mRNA eucariótico, sequências de DNA genómico de DNA eucariótico (por exemplo, de mamífero) e mesmo sequências de DNA sintético. Uma sequência de terminação da transcrição estará habitualmente localizada a 3' da sequência codificadora. Uma sequência "complementar" é tal que a base azotada numa dada posição 26 de nucleótidos é o complemento da base azotada que aparece na mesma posição na sequência de referência. Como ilustração, o complemento de adenosina é tirosina, e vice-versa; de modo semelhante, citosina é complementar a guanina, e vice-versa; assim, o complemento da sequência de referência 5'-ATGCTGA-3' será 5'-TACGACT-3'.
Tal como utilizado aqui, uma sequência "de tipo selvagem" ou "nativa" refere-se a sequências codificadoras de polipéptidos essencialmente como se encontram na natureza, por exemplo, as sequências codificadoras de proteína Mig de S. dysgalactiae representadas nas Figuras 1A-1D (ID SEQ NO: 4). "Recombinante", tal como é utilizado aqui para descrever uma molécula de ácido nucleico, significa um polinucleótido de origem genómica, de cDNA, semi-sintética ou sintética que, em virtude da sua origem ou manipulação: (1) não está associado à totalidade ou a uma porção do polinucleótido ao qual está associado na natureza, e/ou (2) está ligado a um polinucleótido diferente daquele ao qual está ligado na natureza. 0 termo "recombinante", tal como é utilizado relativamente a uma proteína ou polipéptido, significa um polipéptido produzido por expressão de um polinucleótido recombinante. "Células-hospedeiro recombinantes", "células-hospedeiro", "células", "linhas de células", "culturas de células" e outros termos semelhantes que designam microrganismos procarióticos ou linhas de células eucarióticas cultivadas como entidades unicelulares são utilizados de forma intermutável e referem-se a células que podem ser, ou que foram, utilizadas como receptores de vectores recombinantes ou outro DNA de transferência e incluem a progenitura da célula original que foi 27 transfectada. Entende-se não ser necessário que a progenitura de uma célula paterna isolada seja completamente idêntica, no que se refere à morfologia ou complemento genómico ou de DNA total, à célula paterna original devido a mutação acidental ou deliberada. A progenitura da célula paterna que é suficientemente semelhante à célula paterna para ser caracterizada pela propriedade relevante, como a presença de uma sequência de nucleótidos que codifica um péptido desejado, está incluída na progenitura designada por esta definição e é abrangida pelos termos acima. "Homologia" refere-se à identidade percentual entre duas fracções polinucleotídicas ou duas fracções polipeptídicas. Duas sequências de DNA ou duas sequências polipeptídicas são "substancialmente homólogas" entre si quando as sequências exibem pelo menos cerca de 80%-85%, preferivelmente pelo menos cerca de 90% e muito preferivelmente pelo menos cerca de 95%—98% de identidade de sequências num comprimento definido das moléculas. Tal como é aqui utilizado, substancialmente homólogo também se refere a sequências que exibem identidade completa com a sequência de DNA ou polipeptídica especificada.
Em geral, "identidade" refere-se a uma correspondência exacta nucleótido-nucleótido ou aminoácido-aminoácido de duas sequências polinucleotídicas ou polipeptídicas, respectivamente. Pode determinar-se a identidade percentual por comparação directa das informações de sequências entre duas moléculas alinhando as sequências, contando o número exacto de correspondências entre as duas sequências alinhadas, dividindo pelo comprimento da sequência mais pequena e multiplicando o resultado por 100. Para auxiliar 28 a análise podem utilizar-se programas computacionais facilmente disponíveis, como ALIGN, Dayhoff, M. 0., em Atlas of Protein Sequence and Structure M. 0. Dayhoff, editor, 5 Suplemento 3: 353-358, National Biomedical Research Foundation, Washington, DC, que adapta o algoritmo de homologia local de Smith e Waterman (1981) Advances In Appl. Math. 2: 482-489 para análise de péptidos. Programas para determinar a identidade de sequências de nucleótidos estão disponíveis no Wisconsin Sequence Analysis Package, Versão 8 (disponibilizado pelo Genetics Computer Group, Madison, WI) , por exemplo, os programas BESTFIT, FASTA e GAP, que também se baseiam no algoritmo de Smith e Waterman. Estes programas são facilmente utilizados com os parâmetros por defeito recomendados pelo fabricante e descritos no Wisconsin Sequence Analysis Package referido acima. Por exemplo, pode determinar-se a identidade percentual entre uma sequência de nucleótidos particular e uma sequência de referência utilizando o algoritmo de homologia de Smith e Waterman com uma tabela de pontuação por defeito e uma penalidade de hiatos de seis posições de nucleótidos.
Outro método para estabelecer a identidade percentual no contexto da presente invenção consiste em utilizar o pacote de programas MPSRCH com direitos de autor assegurados pela Universidade de Edimburgo, desenvolvido por John F. Collins e Shane S. Sturrok e distribuído pela IntelliGenetics, Inc. (Mountain View, CA) . Com este conjunto de pacotes pode empregar-se o algoritmo de Smith-Waterman, utilizando os parâmetros por defeito para a tabela de pontuação (por exemplo, penalidade aberta de hiato de 12, penalidade de extensão de hiato de um e um hiato de seis). A partir dos dados gerados, o valor de 29 "Match" reflecte a "identidade de sequências". Outros programas adequados para calcular a identidade ou semelhança percentual entre sequências são genericamente conhecidos na área; por exemplo, outro programa de alinhamento é BLAST, utilizado com parâmetros por defeito. Por exemplo, podem utilizar-se BLASTN e BLASTP utilizando os seguintes parâmetros por defeito: código genético = padrão; filtro = nenhum; filamento = ambos; limite = 60; valor de expectação = 10; Matriz = BLOSUM62; Descrições = 50 sequências; apresentar por = PONTUAÇÃO ELEVADA; Bases de dados = não redundantes, GenBank + EMBL + DDBJ + PDB + GenBank CDS Translations + Swiss protein + Spupdate + PIR. Podem encontrar-se pormenores destes programas no seguinte endereço de "internet": http://www,ncbi.nhu.nih.gov/BLAST/.
Alternativamente, pode determinar-se a homologia por hibridização de polinucleótidos em condições que formam hélices duplas estáveis entre regiões homólogas, seguido de digestão com nuclease(s) especifica (s) para filamentação simples e determinação do tamanho dos fragmentos digeridos. Podem identificar-se sequências de DNA substancialmente homólogas numa experiência de hibridização "Southern", por exemplo, em condições restritas, como definido para esse sistema particular. A definição de condições de hibridização apropriadas pertence ao âmbito da área. Ver, por exemplo, Sambrook et ai., supra; "DNA Cloning", supra; "Nucleic Acid Hybridization", supra.
Pelo termo "variante degenerada" pretende-se significar um polinucleótido que contém alterações na sequência do seu ácido nucleico e que codifica um polipéptido com a mesma sequência de aminoácidos do polipéptido codificado pelo polinucleótido de onde deriva a variante degenerada. 30 Técnicas para determinar a "semelhança" entre sequências de aminoácidos são bem conhecidas na área. Em geral, "semelhança" significa a comparação exacta aminoácido-aminoácido de dois ou mais polipéptidos no local apropriado, em que os aminoácidos são idênticos ou possuem propriedades químicas e/ou físicas semelhantes, como carga ou hidrofobicidade. Em seguida pode determinar-se a denominada "semelhança percentual" entre as sequências polipeptídicas comparadas. Técnicas para determinar a identidade de sequências de ácidos nucleicos e aminoácidos também são bem conhecidas na área e incluem determinar a sequência de nucleótidos do mRNA para esse gene (habitualmente via um cDNA intermediário), determinar a sequência de aminoácidos codificada por aquela e comparar esta com uma segunda sequência de aminoácidos. Em geral, "identidade" refere-se a uma correspondência exacta nucleótido-nucleótido ou aminoácido-aminoácido de duas sequências polinucleotídicas ou polipeptídicas, respectivamente.
Uma região "heteróloga" de uma construção de DNA é um segmento identificável de DNA dentro ou ligado a outra molécula de DNA que não se encontra associado à outra molécula na natureza. Assim, quando a região heteróloga codifica um gene bacteriano, o gene será habitualmente flanqueado por DNA que não flanqueia o gene bacteriano no genoma da bactéria-fonte. Outro exemplo da sequência codificadora heteróloga é uma construção em que a própria sequência codificadora não se encontra na natureza (por exemplo, sequências sintéticas com codões diferentes do gene nativo). Acontecimentos de variação alélica ou mutação 31 de ocorrência natural não dão origem a uma região heteróloga de DNA, tal como o termo é aqui utilizado.
Um vector é um replicão, como um plasmideo, fago ou cosmídeo, ao qual pode ser ligado outro segmento de DNA de modo a possibilitar a replicação do segmento ligado. Um vector é capaz de transferir sequências de genes para células-alvo (por exemplo, vectores plasmídicos bacterianos, vectores virais, vectores não virais, transportadores em partículas e lipossomas).
Tipicamente, todos os termos "construção de vector", "vector de expressão", "vector de expressão de genes", "vector de distribuição de genes", "vector de transferência de genes" e "cassete de expressão" referem-se a uma montagem que é capaz de dirigir a expressão de uma sequência ou gene de interesse. Assim, os termos incluem veículos de clonagem e expressão, bem como vectores virais.
Estas montagens incluem um promotor que está operativamente ligado às sequências ou gene(s) de interesse. Também podem estar presentes outros elementos de controlo. As cassetes de expressão descritas aqui podem estar contidas numa construção plasmídica. Para além dos componentes da cassete de expressão, a construção plasmídica também pode incluir uma origem da replicação bacteriana, um ou mais marcadores seleccionáveis, um sinal que permite à construção plasmídica existir como DNA de filamentação simples (por exemplo, uma origem da replicação M13), um sítio de clonagem múltipla e uma origem da replicação "de mamífero" (por exemplo, uma origem da replicação de SV40 ou adenovírus). 32 0 termo "elementos de controlo" de DNA refere-se colectivamente a promotores da transcrição, elementos intensificadores da transcrição, sequências de terminação da transcrição; sequências de poliadenilação (localizadas a 3' do codão de terminação da tradução), sequências para optimizar a iniciação da tradução (localizadas a 5' da sequência codificadora), sequências de terminação da tradução, domínios reguladores a montante, sítios de ligação de ribossomas e afins, que proporcionam colectivamente a transcrição e tradução de uma sequência codificadora numa célula-hospedeiro. Ver, por exemplo, McCaughan et al. (1995) PNAS USA _92: 5431-5435; Kochetov et al. (1998) FEBS Letts. 440: 351-355. Nem sempre é necessário que todas estas sequências de controlo estejam presentes num vector recombinante, desde que o gene desejado possa ser transcrito e traduzido. "Operativamente ligado" refere-se a uma disposição de elementos em que os componentes descritos estão configurados de modo a desempenharem a sua função habitual. Assim, elementos de controlo operativamente ligados a uma sequência codificadora conseguem proceder à expressão da sequência codificadora. Não é necessário que os elementos de controlo sejam contíguos na sequência codificadora, desde que dirijam a sua expressão. Assim, por exemplo, podem estar presentes sequências intervenientes não traduzidas mas transcritas entre um promotor e a sequência codificadora, e ainda pode considerar-se que o promotor está "operativamente ligado" à sequência codificadora. De modo semelhante, "elementos de controlo compatíveis com expressão num sujeito" são aqueles que conseguem proceder à expressão da sequência codificadora nesse sujeito. 33
Um elemento de controlo, como um promotor, "dirige a transcrição" de uma sequência codificadora numa célula quando RNA polimerase se ligar ao promotor e transcrever a sequência codificadora em mRNA, que é então traduzido no polipéptido codificado pela sequência codificadora.
Uma "célula-hospedeiro" é uma célula que foi transformada, ou que é capaz de sofrer transformação, por uma molécula de ácido nucleico exógeno.
Uma célula foi "transformada" por DNA exógeno quando esse DNA exógeno tiver sido introduzido no interior da membrana celular. DNA exógeno pode, ou não, ser integrado (covalentemente ligado) em DNA cromossómico que constitui o genoma da célula. Em procariotas e leveduras, por exemplo, o DNA exógeno pode ser mantido num elemento epissomal, como um plasmideo. Relativamente a células eucarióticas, uma célula transformada de modo estável é uma célula na qual o DNA exógeno foi integrado no cromossoma, de modo que é herdado por células filhas por replicação cromossómica. Esta estabilidade é demonstrada pela capacidade da célula eucariótica para estabelecer linhas celulares ou clones compreendidos por uma população de células filhas que contêm o DNA exógeno.
Tal como é aqui utilizado, uma "amostra biológica" refere-se a uma amostra de tecido ou fluido isolado de um sujeito, incluindo, mas não se limitando, por exemplo, a sangue, plasma, soro, matéria fecal, urina, medula óssea, bilis, fluido espinal, fluido linfático, amostras de pele, secreções externas da pele, tractos respiratório, intestinal e genitourinário, lágrimas, saliva, leite, células sanguíneas, órgãos, biopsias e também amostras de 34 constituintes de culturas de células in vitro, incluindo mas não se limitando a meios condicionados resultantes do crescimento de células e tecidos em meio de cultura, por exemplo, células recombinantes e componentes celulares.
Tal como são aqui utilizados, os termos "etiqueta" e "etiqueta detectável" referem-se a uma molécula que permite detecção, incluindo mas não se limitando a isótopos radioactivos, agentes fluorescentes, agentes quimioluminescentes, enzimas, substratos enzimáticos, cofactores enzimáticos, inibidores enzimáticos, cromóforos, corantes, iões metálicos, sóis metálicos, ligandos (por exemplo, biotina ou haptenos) e afins. 0 termo "agente fluorescente" refere-se a uma substância, ou respectiva porção, que é capaz de exibir fluorescência na gama detectável. Exemplos particulares de etiquetas que podem ser utilizadas na invenção incluem fluoresceína, rodamina, dansilo, umbeliferona, vermelho Texas, luminol, NADPH e a-β-galactosidase.
2. MODOS DE IMPLEMENTAR A INVENÇÃO
Antes de descrever a presente invenção em pormenor, deve entender-se que esta invenção não se limita a formulações ou parâmetros de processos particulares, pois estes, obviamente, podem variar. Também deve entender-se que a terminologia aqui utilizada se destina apenas a descrever especificações particulares da invenção, não se pretendendo que seja limitadora.
Apesar de alguns métodos e materiais semelhantes ou equivalentes aos descritos aqui poderem ser utilizados na 35 prática da presente invenção, descrevem-se aqui os materiais e métodos preferidos. 0 aspecto central da presente invenção é a descoberta de que a proteína de ligação a Fc Mig isolada de S. dysgalactiae consegue induzir uma resposta imunológica num sujeito vertebrado. Em particular, o gene da proteína Mig em S. dysgalactiae foi isolado, sequenciado e caracterizado e a sequência de aminoácidos codificada pelo gene foi deduzida daquele. A sequência de DNA completa do gene mig de S. dysgalactiae (ID SEQ NO: 3) e a correspondente sequência de aminoácidos (ID SEQ NO: 4) estão apresentadas nas Figuras 1A-1D.
Como descrito nos exemplos, o gene mig de S. dysgalactiae completo, representado nas posições de nucleótidos 1-2 010 inclusive das Figuras 1A-1D, codifica a proteína Mig de S. dysgalactiae completa de 669 aminoácidos, que inclui uma primeira região transmembranar de 24 aminoácidos (resíduos 15 e 39) e uma segunda região transmembranar de 18 aminoácidos (resíduos 646-664) . Determinaram-se as regiões transmembranares utilizando o programa TMpred, que prevê regiões que abrangem membranas e a sua orientação. O programa utiliza um algoritmo baseado na análise estatística de TMbase, uma base de dados de proteínas transmembranares de ocorrência natural, utilizando uma combinação de várias matrizes de ponderação para a pontuação. Ver Hofmann, K., & Stoffel, W. (1993) Biol. Chem. 347: 166. A Mig de S. dysgalactiae tem um peso molecular previsto de cerca de 73 kDa (calculado utilizando o programa Peptide Sort do GCG Wisconsin Package, versão 10, fornecido pelo 36 pacote de análise de sequências SeqWeb, versão 1.1, da Canadian Bioinformatics Resource) . A sequência completa inclui um péptido de sinal. A Figura 2 representa graficamente os seguintes resultados de análises estruturais para a proteína Mig da presente invenção: hidropatia de Kyte-Doolittle, tendo sido tomada a média numa janela de 7; probabilidade de superfície de acordo com Emini; flexibilidade das cadeias de acordo com Karplus-Schulz; índice de antigenicidade de acordo com Jameson-Wolf; estrutura secundária de acordo com Garnier-Osguthorpe-Robson; estrutura secundária de acordo com Chou-Fasman, e sítios de glicosilação previstos. A Figura 3 representa graficamente a estrutura secundária de acordo com Chou-Fasman para a proteína Mig da presente invenção. 0 experimentado na área pode facilmente utilizar as informações apresentadas nas Figuras 2 e 3 para determinar regiões imunogénicas na proteína para utilização em composições de vacinas.
Proteínas receptoras de Fc Mig, incluindo sem limitação a proteína Mig de S. dysgalactiae, respectivos fragmentos imunogénicos ou proteínas quiméricas incluindo aqueles podem ser proporcionados em composições de vacinas de subunidades. Para além da utilização em composições de vacinas, as proteínas ou anticorpos para aquelas podem ser utilizados como reagentes de diagnóstico para detectar a presença de infecção num sujeito vertebrado. De modo semelhante, os genes que codificam as proteínas podem ser clonados e utilizados para conceber sondas destinadas a detectar e isolar genes homólogos noutras estirpes bacterianas. Por exemplo, serão úteis nestas especificações fragmentos compreendendo pelo menos cerca de 15-20 37 nucleótidos, mais preferivelmente pelo menos cerca de 20-50 nucleótidos e muito preferivelmente cerca de 60-100 nucleótidos, ou qualquer inteiro entre estes valores.
As composições de vacinas da presente invenção podem ser utilizadas para tratar ou prevenir uma qrande variedade de infecções bacterianas em sujeitos vertebrados. Por exemplo, composições de vacinas incluindo, sem limitação, a proteína receptora de Fc Mig de S. dysgalactiae podem ser utilizadas para tratar infecções por estreptococos em sujeitos vertebrados que são causadas por esta ou outras espécies. Em particular, S. uberis, S. agalactiae e S. dysgalactiae são patogenes bacterianos comuns associados a mastite em espécies bovinas, equinas, ovinas e caprinas. Adicionalmente, sabe-se que estreptococos do grupo B, como S. agalactiae, causam numerosas infecções diferentes em vertebrados, incluindo septicemia, meningite, bacteremia, impetigo, artrite, infecções do tracto urinário, abcessos, aborto espontâneo, etc. Assim, as composições de vacinas que contêm a proteína receptora de Fc Mig serão úteis no tratamento e/ou prevenção de uma grande variedade de infecções causadas por estreptococos.
De modo semelhante, proteínas de ligação a Fc derivadas de outros géneros bacterianos, como Staphylococcus, serão úteis para tratar infecções bacterianas causadas por espécies pertencentes a esses géneros. Assim, é claro que proteínas de ligação a Fc de uma variedade de espécies bacterianas podem ser utilizadas para tratar e/ou prevenir uma grande variedade de infecções bacterianas em numerosas espécies animais. 38
As proteínas de ligação a Fc de estreptococos da presente invenção, incluindo sem limitação a proteína de ligação a Fc Mig, podem ser utilizadas em composições de vacinas isoladamente ou em combinação com outros antigenes bacterianos, fúngicos, virais ou de protozoários. Estes antigenes podem ser fornecidos separadamente ou mesmo na forma de proteínas de fusão compreendendo um ou mais epítopos de uma proteína de ligação a Fc fundida a um ou mais destes antigenes. Por exemplo, podem ser administradas com a proteína Mig outras proteínas imunogénicas de S. uberis, como o factor CAMP, cápsula de ácido hialurónico, hialuronidase, proteína de tipo R e activador do plasminogénio. Adicionalmente, proteínas imunogénicas de outros organismos envolvidos em mastite, como dos géneros Staphylococcus, Corynebacterium, Pseudomonas, Nocardia, Clostridium, Mycobacterium, Mycoplasma, Pasteurella, Prototheca, outros estreptococos, bactérias coliformes, bem como levedura, podem ser administradas juntamente com as proteínas de ligação a Fc descritas aqui para proporcionar um espectro largo de protecção. Assim, por exemplo, proteínas imunogénicas de Staphylococcus aureus, Str. agalactiae, Str. dysgalactiae, Str. zooepidemicus, Corynebacterium pyogenes, Pseudomonas aeruginosa, Nocardia asteroides, Clostridium perfringens, Escherichia coli, Enterobacter aerogenes e Klebsiella spp. podem ser fornecidas juntamente com as proteínas de ligação a Fc da presente invenção.
Adicionalmente, proteínas Fc de diferentes espécies de estreptococos podem ser utilizadas juntamente nas composições de vacinas da presente invenção. Nesta especificação, as múltiplas proteínas Fc podem ser 39 proporcionadas como proteínas de fusão ou como antigenes discretos na mesma ou em diferentes composições de vacinas.
Produção de Proteínas de Ligação a Fc
As proteínas de ligação a Fc descritas acima e fragmentos activos, análogos e proteínas quiméricas derivadas daquelas podem ser produzidas por uma variedade de métodos. Especificamente, proteínas de ligação a Fc podem ser isoladas directamente de bactérias que as expressem. Isto é geralmente conseguido preparando primeiramente um extracto em bruto sem componentes celulares e várias proteínas estranhas. As proteínas desejadas podem então ser suplementarmente purificadas da fracção do lisato celular, por exemplo, por cromatografia em coluna, HPLC, técnicas imunoadsorventes ou outros métodos convencionais bem conhecidos na área.
Mais particularmente, foram descritas técnicas para isolar proteínas de ligação a Fc. Por exemplo, foram utilizados os métodos de Reis et al. para isolar um receptor de Fc funcionalmente homogéneo que tem as propriedades de um receptor de tipo III (Reis et al. (1984) J. Immunol. 132: 3091).
Alternativamente, as proteínas podem ser produzidas de forma recombinante como descrito aqui. Como explicado acima, estes produtos recombinantes podem tomar a forma de sequências proteicas parciais, sequências completas, formas precursoras que incluem sequências de sinal, formas maduras sem sinais ou mesmo proteínas de fusão (por exemplo, com um líder apropriado para o hospedeiro recombinante, ou com 40 outra sequência de antigene de subunidade para Streptococcus ou outro patogene).
Numa especificação da presente invenção, a proteína Mig de S. dysgalactiae é purificada de uma fracção de lisato celular utilizando cromatografia de afinidade após a produção recombinante da proteína. Ver Exemplo 1A-D, infra.
Podem construir-se bibliotecas de genes e utilizar os clones resultantes para transformar uma célula-hospedeiro apropriada. Colónias podem ser reunidas e rastreadas quanto a clones com actividade receptora-de ligação a Fc, isto é, quanto a clones capazes de se ligarem à IgG.
Alternativamente, depois de determinadas as sequências de aminoácidos, sondas oligonucleotídicas que contêm os codões para uma porção das sequências de aminoácidos determinadas podem ser preparadas e utilizadas para rastrear bibliotecas genómicas ou de cDNA quanto a genes que codificam as proteínas em questão. As estratégias básicas para preparar sondas oligonucleotídicas e bibliotecas de DNA, bem como o seu rastreio por hibridização de ácidos nucleicos, são bem conhecidas dos experimentados na área. Ver, por exemplo, "DNA Cloning", Volume 11, supra; "Nucleic Acid Hybridization", supra; "Oligonucleotide Synthesis", supra; Sambrook et al., supra. Depois de um clone da biblioteca rastreada ter sido identificado por hibridização positiva, pode confirmar-se, por análise de enzimas de restrição e sequenciação de DNA, que a inserção da biblioteca particular contém um gene da proteína de ligação a Fc ou respectivo homólogo. Em seguida, os genes podem ser suplementarmente isolados utilizando técnicas comuns e, se desejado, podem empregar- 41 se abordagens de PCR ou enzimas de restrição para procederem à deleção de porções da sequência completa.
De modo semelhante, podem isolar-se genes directamente de bactérias utilizando técnicas conhecidas, como extracção com fenol, e a sequência pode ser suplementarmente manipulada para produzir quaisquer alterações desejadas. Ver, por exemplo, Sambrook et al., supra, quanto a uma descrição de técnicas utilizadas para obter e isolar DNA.
Alternativamente, sequências de DNA que codificam as proteínas de interesse podem ser preparadas sinteticamente em vez de serem clonadas. As sequências de DNA podem ser concebidas com os codões apropriados para a sequência de aminoácidos particular. Em geral, seleccionar-se-âo codões preferidos para o hospedeiro pretendido se a sequência for utilizada para expressão. A sequência completa é reunida a partir de oligonucleótidos com sobreposição, preparados por métodos comuns e reunidos numa sequência codificadora completa. Ver, por exemplo, Edge (1981) Nature 292: 756;
Nambair et al. (1984) Science 223: 1299; Jay et al. (1984) J. Biol. Chem. 259: 6311.
Depois das sequências codificadoras para as proteínas desejadas terem sido preparadas ou isoladas, podem ser clonadas em qualquer vector ou replicão adequado. Os experimentados na área conhecem numerosos vectores de clonagem, e a selecção de um vector de clonagem apropriado é uma questão de escolha. Exemplos de vectores de DNA recombinantes para clonagem e células-hospedeiro que aqueles conseguem transformar incluem o bacteriófago λ (E. coli), pBR322 (E. colí), pACYC177 (E. coli), pKT230 (bactérias gram-negativas), pGV1106 (bactérias gram- 42 negativas), pLAFRl (bactérias gram-negativas), pME290 (bactérias gram-negativas não E. coli), pHV14 (E. coli e Bacillus subtilis), pBD9 (Bacillus), pIJ61 {Streptomyces), pUC6 (Streptomyces), Ylp5 (Saccharomyces), YCpl9 (Saccharomyces) e vírus papiloma bovino (células de mamífero). Ver Sambrook et al., supra; "DNA Cloning", supra; B. Perbal, supra. 0 gene pode ser colocado sob o controlo de um promotor, sítio de ligação de ribossomas (para expressão bacteriana) e, opcionalmente, um operador (colectivamente referidos aqui como elementos de "controlo"), de modo que a sequência de DNA que codifica a proteína desejada seja transcrita em RNA na célula-hospedeiro transformada com um vector que contém esta construção de expressão. A sequência codificadora pode ou não conter um péptido de sinal ou sequência líder. Se for incluída uma sequência de sinal, pode ser a sequência nativa e homóloga ou uma sequência heteróloga. Por exemplo, a sequência de sinal para a proteína Mig de S. dysgalactiae (resíduos de aminoácidos 1 até 39, inclusive) pode ser utilizada para a sua secreção, tal como o podem algumas sequências de sinal diferentes, bem conhecidas na área. Sequências líder podem ser removidas pelo hospedeiro em processamento pós-tradução. Ver, por exemplo, Patentes U.S. N°s 4 431 739, 4 425 437, 4 338 397.
Também podem ser desejáveis outras sequências reguladoras que permitam a regulação da expressão das sequências proteicas relativamente ao crescimento da célula-hospedeiro. Sequências reguladoras são conhecidas dos experimentados na área e exemplos incluem aquelas que ligam ou desligam a expressão de um gene em resposta a um 43 estímulo químico ou físico, incluindo a presença de um composto regulador. Também podem estar presentes no vector outros tipos de elementos reguladores, por exemplo, sequências intensificadoras.
As sequências de controlo e outras sequências reguladoras podem ser ligadas à sequência codificadora antes da inserção num vector, como os vectores de clonagem descritos acima. Alternativamente, a sequência codificadora pode ser clonada directamente num vector de expressão que já contenha as sequências de controlo e um sítio de restrição apropriado.
Nalguns casos poderá ser necessário modificar a sequência codificadora de modo a poder ser ligada às sequências de controlo com a orientação apropriada; isto é, para manter a fase de leitura apropriada. Também pode ser desejável produzir mutantes ou análogos da proteína de ligação a Fc. Podem preparar-se mutantes ou análogos por deleção de uma porção da sequência que codifica a proteína, por inserção de uma sequência e/ou por substituição de um ou mais nucleótidos na sequência. Técnicas para modificar sequências de nucleótidos, como mutagénese dirigida a sítios, são descritas, por exemplo, em Sambrook et al., supra; "DNA Cloning", supra; "Nucleic Acid Hybridization", supra.
Em seguida, o vector de expressão é utilizado para transformar uma célula-hospedeiro apropriada. São conhecidas na área algumas linhas de células de mamífero, que incluem linhas de células imortalizadas disponibilizadas pela American Type Culture Collection (ATCC), tais como, mas não se limitando a estas, células de 44 ovário de hamster chinês (CHO), células HeLa, células de rim de hamster bebé (BHK) , células de rim de macaco (COS) , células de carcinoma hepatocelular humano (por exemplo, Hep G2), células de rim de bovino Madin-Darby ("MDBK") e outras. De modo semelhante, hospedeiros bacterianos, como E. coli, Bacillus subtilis e Streptococcus spp. serão úteis nas presentes construções de expressão. Hospedeiros de levedura úteis na presente invenção incluem, inter alia, Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans, Candida maltosa, Hansenula polymorpha, Kluyveromyces fragilis, Kluyveromyces lactis, Pichia guillerimondii, Pichia pastoris, Schizosaccharomyces pombe e Yarrowia lipolytica. Células de insecto para utilização com os vectores de expressão de baculovirus incluem, inter alia, Aedes aegypti, Autographa californica, Bômbix mori, Drosophila melanogaster, Spodoptera frugiperda e Trichoplusia ni.
Dependendo do sistema de expressão e hospedeiro seleccionados, as proteínas da presente invenção são produzidas por cultura de células-hospedeiro transformadas por um vector de expressão descrito acima em condições em que a proteína de interesse é expressa. Em seguida, a proteína é isolada das células-hospedeiro e é purificada. Se o sistema de expressão segregar a proteína para o meio de crescimento, a proteína pode ser purificada directamente a partir do meio. Se a proteína não for segregada, é isolada de lisatos celulares. A selecção das condições de crescimento apropriadas e de métodos de recuperação pertence ao âmbito da área.
As proteínas da presente invenção também podem ser produzidas por síntese química, como síntese de péptidos em fase sólida, utilizando sequências de aminoácidos 45 conhecidas ou sequências de aminoácidos derivadas da sequência de DNA dos genes de interesse. Esses métodos são conhecidos dos experimentados na área. Ver, por exemplo, J. M. Stewart e J. D. Young, "Solid Phase Peptide Synthesis", 2a Edição, Pierce Chemical Co., Rockford, IL (1984), e G. Barany e R. B. Merrifield, "The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology", editores E. Gross e J. Meienhofer, Volume 2, Academic Press, Nova Iorque (1980), páginas 3-254, quanto a técnicas de síntese de péptidos em fase sólida, e M. Bodansky, "Principies of Peptide Synthesis" Springer-Verlag, Berlim (1984), e E. Gross e J. Meienhofer, Editores, "The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology", supra, Volume 1, quanto a síntese clássica em solução. A síntese química de péptidos pode ser preferível se um fragmento pequeno do antigene em questão for capaz de dirigir uma resposta imunológica no sujeito de interesse.
As proteínas de ligação a Fc da presente invenção, ou seus fragmentos, podem ser utilizadas para produzir anticorpos, policlonais e monoclonais. Se forem desejados anticorpos policlonais, um mamífero seleccionado (por exemplo, ratinho, coelho, cabra, cavalo, etc.) é imunizado com um antigene da presente invenção, ou seu fragmento, ou um antigene mutado. Recolhe-se soro do animal imunizado, sendo tratado de acordo com procedimentos conhecidos. Ver, por exemplo, Jurgens et al. (1985) J. Chrom. 348: 363-370. Se for utilizado soro que contém anticorpos policlonais, os anticorpos policlonais podem ser purificados por cromatografia de imunoafinidade, utilizando procedimentos conhecidos.
Anticorpos monoclonais para a proteína Mig e seus fragmentos também podem ser facilmente produzidos pelo 46 experimentado na área. A metodologia geral para preparar anticorpos monoclonais utilizando a tecnologia de hibridomas é bem conhecida. Podem criar-se linhas de células imortalizadas produtoras de anticorpos por fusão celular e também por outras técnicas, como transformação directa de linfócitos B com DNA oncogénico, ou transfecção com virus Epstein-Barr. Ver, por exemplo, M. Schreier et al., "Hybridoma Techniques" (1980); Hammerling et al., "Monoclonal Antibodies and T-cell Hybridomas" (1981); Kennett et al., "Monoclonal Antibodies" (1980); ver também as Patentes U.S. N°s 4 341 761, 4 399 121, 4 427 783, 4 444 887, 4 452 570, 4 466 917, 4 472 500, 4 491 632 e 4 493 890. Painéis de anticorpos monoclonais produzidos contra a proteina Mig, ou respectivos fragmentos, podem ser rastreados quanto a várias propriedades, isto é, quanto a isotipos, epitopos, afinidade, etc. Os anticorpos monoclonais são úteis na purificação, utilizando técnicas de imunoafinidade, dos antigenes individuais contra os quais são dirigidos. Anticorpos policlonais e monoclonais também podem ser utilizados para imunização passiva ou podem ser combinados com preparações de vacinas de subunidades para intensificar a resposta imunológica. Anticorpos policlonais e monoclonais também são úteis para fins de diagnóstico.
Formulações e Administração de Vacinas
As proteínas de ligação a Fc da presente invenção podem ser formuladas em composições de vacinas, isoladamente ou em combinação com outros antigenes, para utilização na imunização de sujeitos como descrito abaixo. Métodos de preparação dessas formulações estão descritos, por exemplo, em "Remington's Pharmaceutical Sciences", Mack Publishing 47
Company, Easton, Pensilvânia, 18a Edição, 1990. Tipicamente, as vacinas da presente invenção são preparadas na forma de injectáveis, como soluções ou suspensões liquidas. Também podem preparar-se formas sólidas adequadas para solução ou suspensão em veículos líquidos antes da injecção. A preparação também pode ser emulsionada, ou o ingrediente activo pode ser encapsulado em veículos de lipossomas. O ingrediente imunogénico activo é geralmente misturado com um veículo farmacêutico compatível, tal como, por exemplo, água, solução salina, dextrose, glicerol, etanol ou afins, e combinações destes. Adicionalmente, se for desejado, o veículo pode conter quantidades muito pequenas de substâncias auxiliares, como agentes humedecedores ou emulsionantes e agentes de tamponamento do pH.
Também podem adicionar-se à formulação adjuvantes que aumentem a eficácia da vacina. Adjuvantes podem incluir, por exemplo, dipéptidos muramilo, avridina, hidróxido de alumínio, brometo de dimetildioctadecilamónio (DDA), óleos, emulsões óleo-em-água, saponinas, citoquinas e outras substâncias conhecidas na área. A proteína Mig pode ser ligada a um transportador para aumentar a sua imunogenicidade. Transportadores adequados incluem macromoléculas grandes lentamente metabolizadas, como proteínas, incluindo albuminas do soro, hemocianina de lapa californiana, moléculas de imunoglobulinas, tiroglobulina, ovalbumina e outras proteínas bem conhecidas dos experimentados na área; polissacáridos, como sefarose, agarose, celulose, esférulas de celulose e afins; aminoácidos poliméricos, como ácido poliglutâmico, 48 polilisina e afins; copolímeros de aminoácidos, e partículas de vírus inactivos.
As proteínas de ligação a Fc da presente invenção podem ser utilizadas na sua forma nativa ou o seu teor de grupos funcionais pode ser modificado, por exemplo, por succinilação de resíduos lisina ou reacçâo com Cys-tiolactona. Também pode ser incorporado no transportador (ou antigene) um grupo sulfidrilo, por exemplo, por reacção de funções amino com 2-iminotiolano ou o éster de N-hidroxissuccinimida de propionato de 3-(4-ditiopiridilo). Transportadores adequados também podem ser modificados de modo a incorporarem braços espaçadores (como hexametileno-diamina ou outras moléculas bifuncionais de dimensão semelhante) para a ligação de péptidos.
Outros transportadores adequados para as proteínas de ligação a Fc da presente invenção incluem polipéptidos VP6 de rotavírus, ou respectivos fragmentos funcionais, como revelado na Patente U.S. N° 5 071 651. Também é útil um produto de fusão de uma proteína virai e os imunogenes em questão preparados por métodos revelados na Patente U.S. N° 4 722 840. Ainda outros transportadores adequados incluem células, como linfócitos, uma vez que a apresentação nesta forma imita o modo natural de apresentação no sujeito que dá origem ao estado imunizado. Alternativamente, as proteínas da presente invenção podem ser acopladas a eritrócitos, preferivelmente aos eritrócitos do próprio sujeito. Métodos de acoplamento de péptidos a proteínas ou células são conhecidos dos experimentados na área.
Suplementarmente, as proteínas de ligação a Fc (ou respectivos complexos) podem ser formuladas em composições 49 de vacinas na forma neutra ou de sal. Sais farmaceuticamente aceitáveis incluem os sais de adição ácidos (formados com os grupos amino livres dos polipéptidos activos) e que são formados com ácidos inorgânicos, tais como, por exemplo, os ácidos clorídrico ou fosfórico, ou ácidos orgânicos tais como ácido acético, oxálico, tartárico, mandélico e afins. Sais formados a partir de grupos carboxilo livres também podem derivar de bases inorgânicas, tais como, por exemplo, hidróxidos de sódio, potássio, amónio, cálcio ou férrico, e de bases orgânicas como isopropilamina, trimetilamina, 2-etilaminoetanol, histidina, procaína e afins.
Formulações de vacinas conterão uma "quantidade terapeuticamente eficaz" do ingrediente activo, isto é, uma quantidade capaz de induzir uma resposta imunológica num sujeito ao qual é administrada a composição. No tratamento e prevenção de mastite, por exemplo, uma "quantidade terapeuticamente eficaz" será preferivelmente uma quantidade que aumenta a resistência das glândulas mamárias a nova infecção e/ou reduz a gravidade clínica da doença. Essa protecção será demonstrada por uma redução ou ausência dos sintomas normalmente exibidos por um hospedeiro infectado, uma recuperação mais rápida e/ou uma contagem decrescida de células somáticas no leite do quarto infectado. Por exemplo, a capacidade da composição para reter ou diminuir a contagem de células somáticas (SCC) no leite para menos de cerca de 500 000 células por ml - em que o valor limite é fixado pela Federação Internacional de Lacticínios, acima do qual se considera que os animais têm mastite clínica - será indicador de um efeito terapêutico. 50 A quantidade exacta é facilmente determinada pelo experimentado na área utilizando testes comuns. A concentração da proteina de ligação a Fc variará tipicamente desde cerca de 1% até cerca de 95% (p/p) da composição, ou mesmo um valor superior ou inferior, se apropriado. Com as presentes formulações de vacinas, 5 até 500 μς de ingrediente activo por ml de solução injectada devem ser adequados para dirigir uma resposta imunológica quando se administrar uma dose de 1 até 3 ml por animal.
Para imunizar um sujeito, a vacina é geralmente administrada parentericamente, habitualmente por injecção intramuscular. No entanto, também são aceitáveis outros modos de administração, como injecção subcutânea, intraperitoneal e intravenosa. A quantidade a ser administrada depende do animal a ser tratado, da capacidade do sistema imunológico do animal para sintetizar anticorpos e do grau de protecção desejado. Dosagens eficazes podem ser facilmente estabelecidas pelo habitualmente experimentado na área por ensaios de rotina para determinar curvas de resposta à dose. 0 sujeito é imunizado por administração da vacina em pelo menos uma dose, e preferivelmente em duas doses. Além disso, podem administrar-se ao animal tantas doses quantas as necessárias para manter um estado de imunidade à infecção.
Formulações de vacinas adicionais que são adequadas para outros modos de administração incluem supositórios e, nalguns casos, formulações de aerosol, intranasais, orais e formulações de libertação prolongada. Para supositórios, a composição do veiculo incluirá aglutinantes e transportadores tradicionais, tais como glicóis polialcalinos ou triglicéridos. Esses supositórios podem 51 ser preparados a partir de misturas que contêm o ingrediente activo na gama de cerca de 0,5% até cerca de 10% (p/p) , preferivelmente cerca de 1% até cerca de 2%. Veiculos orais incluem aqueles excipientes normalmente empregues, tais como, por exemplo, qualidades farmacêuticas de manitol, lactose, amido, estearato de magnésio, sacarina sódica, celulose, carbonato de magnésio e afins. Estas composições de vacinas orais podem ser tomadas na forma de soluções, suspensões, pastilhas, comprimidos, cápsulas, formulações de libertação prolongada ou pós e podem conter desde cerca de 10% até cerca de 95% do ingrediente activo, preferivelmente cerca de 25% até cerca de 70%.
Formulações intranasais incluirão habitualmente veiculos que não causem irritação na mucosa nasal nem perturbem significativamente a função ciliar. Com a presente invenção podem empregar-se diluentes tais como água, solução salina aquosa ou outras substâncias conhecidas. As formulações nasais também podem conter conservantes tais como, mas não se limitando a estes, clorobutanol e cloreto de benzalcónio. Pode estar presente um surfactante para aumentar a absorção das proteínas em questão pela mucosa nasal.
Preparam-se formulações de libertação controlada ou prolongada incorporando a proteína em transportadores ou veículos, tais como lipossomas, polímeros impermeáveis não reabsorvíveis, como copolímeros de etileno-acetato de vinilo e copolímeros Hytrel®, polímeros dilatáveis, como hidrogéis, ou polímeros reabsorvíveis, como colagénio e certos poliácidos ou poliésteres, como os utilizados para preparar suturas reabsorvíveis. As proteínas de ligação a 52
Fc também podem ser distribuídas utilizando mini-bombas implantáveis, bem conhecidas na área.
As proteínas de ligação a Fc da presente invenção também podem ser administradas via um vírus transportador que as expressa. Vírus transportadores que serão úteis na presente invenção incluem, mas não se limitam ao vírus vacínia e outros vírus pox, adenovírus e vírus herpes. A título exemplificativo, recombinantes de vírus vacínia que expressam as novas proteínas podem ser construídos do modo seguinte. 0 DNA que codifica a proteína particular é primeiramente inserido num vector apropriado de modo a ficar adjacente a um promotor de vacínia e flanqueando sequências de DNA de vacínia, como a sequência que codifica a timidina-quinase (TK). Em seguida, este vector é utilizado para transfectar células que são simultaneamente infectadas com vacínia. A recombinação homóloga serve para inserir o promotor de vacínia mais o gene que codifica a presente proteína no genoma virai. 0 recombinante TK’ resultante pode ser seleccionado por cultura das células na presença de 5-bromodesoxiuridina e escolhendo placas virais resistentes àquela.
Uma via de administração alternativa envolve terapia genética ou imunização com ácidos nucleicos. Assim, sequências de nucleótidos (e elementos reguladores adjuntos) que codificam as proteínas de ligação a Fc em questão podem ser administradas directamente a um sujeito para a sua tradução in vivo. Alternativamente, pode proceder-se à transferência de genes por transfecção das células ou tecidos do sujeito ex vivo e reintrodução do material transformado no hospedeiro. 0 DNA pode ser introduzido directamente no organismo do hospedeiro, isto 53 é, por injecção (ver Publicação Internacional N° WO/90/11092, e Wolff et al. (1990) Science 247: 1465-1468). A transferência de genes mediada por lipossomas também pode ser feita utilizando métodos conhecidos. Ver, por exemplo, Hazinski et al. (1991) Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 4_: 206-209; Brigham et al. (1989) Am. J. Med. Sei. 298: 278 — 281; Canonico et al. (1991) Clin. Res. _39; 219A, e Nabel et al. (1990) Science 24 9: 1285-1288. Agentes de abordagem selectiva, como anticorpos dirigidos contra antigenes de superfície expressos em tipos específicos de células, podem ser covalentemente conjugados à superfície lipossómica de modo que o ácido nucleico possa ser distribuído em tecidos e células específicos susceptíveis de sofrerem infecção.
Depósitos de Estirpes Úteis na Prática da Invenção
Fez-se um depósito de culturas biologicamente puras das estirpes seguintes na American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas. O número de acesso indicado foi atribuído após a realização de testes de viabilidade bem sucedidos, e as taxas necessárias foram pagas, nas condições do Tratado de Budapeste relativas ao Reconhecimento Internacional do Depósito de Microrganismos para a Finalidade do Procedimento de Patentes e Regulamentações subjacentes (Tratado de Budapeste). Isto assegura a manutenção de culturas viáveis durante um período de trinta (30) anos desde a data do depósito. Os organismos serão disponibilizados pela ATCC nos termos do Tratado de Budapeste, que assegura disponibilidade permanente e não restrita da progenitura à pessoa que o Comissário dos E.U.A. de Patentes e Marcas Registadas determinou ter esse direito de acordo com 35 U.S.C. §122 e com as regras do Comissário aplicáveis (incluindo 37 C.F.R. 54 §1.12, com referência particular a 886 OG 638). Ao ser concedida uma patente, todas as restrições impostas à disponibilidade ao público das culturas depositadas serão irrevogavelmente removidas.
Estes depósitos são proporcionados aos experimentados na área meramente por conveniência, não constituindo uma admissão da necessidade de um depósito ao abrigo de 35 U.S.C. § 112.
Estirpe Plasmídeo Gene Data do Depósito N2 ATCC Bacteriana DH5a pAA505Mig gene mig de S. 31 de Maio 2000 PTA- dysgalactiae 1977
EXPERIMENTAL
Apresentam-se abaixo exemplos de formas de realização especificas para implementar a presente invenção. Os exemplos são oferecidos apenas a titulo ilustrativo, não se pretendendo que limitem o âmbito da presente invenção de modo nenhum.
Fizeram-se esforços para assegurar rigor relativamente aos números utilizados (por exemplo, quantidades, temperaturas, etc.), mas obviamente devem permitir-se alguns erros experimentais e desvios. A menos que indicado em contrário, as partes são partes por peso, o peso molecular é peso molecular médio em peso, temperatura é apresentada em graus Centígrados e pressão é pressão atmosférica ou quase atmosférica. 55
Materiais e Métodos
Adquiriram-se enzimas de fontes comerciais, tendo sido utilizadas de acordo com as directrizes dos fabricantes.
No isolamento de fragmentos de DNA, excepto quando notado, todas as manipulações de DNA foram feitas de acordo com procedimentos comuns. Ver Sambrook et al., supra. Enzimas de restrição, DNA ligase de T4, E. colí, DNA polimerase I, fragmento Klenow e outros reagentes biológicos podem ser adquiridos a fornecedores comerciais e utilizados de acordo com as directrizes dos fabricantes. Os fragmentos de DNA de filamentação dupla foram separados em géis de agarose. EXEMPLO 1
Preparação, Amplificação, Sequenciação, Expressão, Purificação e Caracterização da Proteína Receptora de Fc
Mig de S. dysgalactiae A, Preparação de DNA Cromossómico de S. dysgalactiae
Obteve-se um isolado clínico de S. dysgalactiae de um caso de mastite bovina (ATCC N° de Acesso 43078) da American Type Culture Collection (10801 University
Boulevard, Manassas, VA 20110-2209), tendo sido utilizado como fonte de DNA. O organismo cresceu de forma rotineira em placas de agar sangue de ovelha TSA (PML
Microbiologicals, Mississauga, Ontário) a 37°C durante 18 horas, ou em caldo Todd-Hewitt (Oxoid Ltd., Hampshire, Inglaterra) suplementado com extracto de levedura 0,3% (Sigma, St. Louis, Missouri) (THB-YE) a 37°C, 5% de CO2. 56
Preparou-se DNA cromossómico de S. dysgalactiae que cresceu em 100 ml de THB-YE suplementado com glicina 20 mM durante aproximadamente 6 horas até se obter um A60o de 0,8 até 1,0. As células foram recolhidas e novamente suspensas em EDTA 50 mM, Tris-HCl 50 mM, TWEEN-20 0,5% (Sigma, St. Louis, MO) e suplementadas com RNase A (200 mg/ml), proteinase K (20 mg/ml), lisozima (100 mg/ml) e mutanolisina (100 mg/ml) (Sigma, St. Louis, Missouri). Após lise bacteriana durante 30 minutos a 37°C com agitação vigorosa, misturaram-se com o lisato cloridrato de guanidina e TWEEN-20, pH 5,5, para uma concentração final de 0,8 Me 5%, respectivamente. Incubou-se a mistura a 50°C durante 30 minutos. Em seguida purificou-se o DNA cromossómico utilizando um Qiagen Genomic-Tip lOOg (Qiagen, Alemanha), tendo sido precipitado utilizando 0,7 volumes de isopropanol. O grânulo resultante foi lavado em etanol a 70% e foi novamente suspenso em 0,5 ml de Tris-HCl 10 mM, pH 8,8. B. Amplificação e Clonaqem do Gene Miq de S. dysgalactiae O gene Mig foi amplificado por PCR (ver Mullis et ai., Patente U.S. N° 4 683 195; Mullis, Patente U.S. N° 4 683 202) utilizando o "primer" directo rnigl (ID SEQ NO: 1, apresentado na Tabela 1) e o "primer" reverso miglr (ID SEQ NO: 2, apresentado na Tabela 1). Nas sequências representadas na Tabela 1, os sublinhados designam nucleótidos adicionados à sequência original e os caracteres a cheio indicam a localização de sítios de reconhecimento de endonucleases de restrição. 57 TABELA 1
Tabulação de Sequências ID SEQ NO: NOME DA SEQUÊNCIA SEQUÊNCIA DE NUCLEÓTIDOS/ AMINOÁCIDOS 1 "Primer" migl 5'- G CGG CCA TGG TAG AAA ATA CTA TAA CTG- 3' 2 "Primer" miglR 5'- ACG ÇCC GGG TTA GTC TTC TTT ACG TTT- 3' 3 Gene mig da estirpe SDG8 de Streptococcus dysgalactiae (ver Figura 1) 4 Proteína Mig da estirpe SDG8 de Streptococcus dysgalactiae 5 "Primer" mig-3 5'- GTT GGC CTA GAT ATC ACA GAA TTA CAA -3' 6 "Primer" mig-4 5'- AAA GCA CCC GGG CCA GCC ATT ACT G -3' 7 "Primer" mig-6 5'- AGG TGC TTC CCA TGG AAC TGC CTG AAC T -3' S "Primer" mig-7 5'- GGC GAG AGT CTA GAA ACT AAA GCG AAA AAC -3' 9 "Primer" mig-8 5'- GCA ATC ACC AGG ATC CTC AGT AAC CAT TTC -3' 10 "Primer" mig-9 5'- CAG GCA GTT CAT ATG GAA GCA CCT ACA GT -3' 11 "Primer" mig-10 5'- TCC CGG AGT AGC ATT GTC AGT C -3' 12 "Primer" mig-11 5'- GCA GCG GTC CAT ATG CCT GTT GGC CTA GAT -3' 13 "Primer" mig-12 5'- GCC TGA ACT GGA TCC CTC AAC TGA TCT G -3' 14 "Primer" míg-13 5'- TTC CGT TGG ATC CTG CAA CTC CAA TTG -3' 15 "Primer" mig-14 5'- TAA GTC AAA AGC TTT GAC AAT TAG TCT T -3'
Efectuou-se PCR utilizando DNA polimerase Vent (New England Biolabs, Mississauga, Ontário, Canadá). Combinaram-se 0,7 μg de DNA genómico de S. dysgalactiae, 1 μΜ de cada um dos "primers" migl (ID SEQ NO: 1), miglr (ID SEQ NO: 2) (ver acima), 200 μΜ de cada um de dATP, dCTP, dGTP e dTTP, MgS04 3 mM, IX tampão de PCR ThermoPol (New England 58
Biolabs) e 2 unidades de DNA Polimerase Vent. Em seguida, a mistura reaccional foi incubada durante 3 ciclos de 1 minuto a 94°C, 3 minutos a 50°C e 1 minuto, 10 segundos a 72°C, seguido de 27 ciclos de 15 segundos a 95°C, 30 segundos a 55°C, 1 minuto a 72°C, seguido de um único ciclo de 5 minutos a 72°C. O produto de PCR mig obtido acima e o vector de expressão pAA505 (VIDO, Saskatoon, Saskatchewan, Canadá) foram digeridos com as enzimas de restrição Ncol e Smal (Amersham Pharmacia, Quebec, Canadá) de acordo com as instruções do fabricante, e a sequência mig foi ligada nos mesmos sitios do vector.
Utilizou-se esta construção para transformar DH5 α de E. coli (Life Technologies, Gaithersburg, MD) . As células DH5 α de E. coli transformadas com a construção de vector pAA505-míg foram designadas E. coli DH5a pAA505Mig. C. Sequência de nucleótidos do Gene mig de S. dysqalactiae e Correspondente Sequência de Aminoácidos Deduzida
Determinou-se a sequência de nucleótidos em ambas as orientações do gene mig num sequenciador automático de DNA ABI 373 (Applied Biosystems) no Plant Biotechnology Institute (PBI, Saskatoon, Saskatchewan, Canadá) utilizando os "primers" múltiplos apresentados na Tabela 1 ("Primers" mig-2 até mig-14) .
As Figuras 1A-1D apresentam a sequência codificadora de nucleótidos e a sequência de aminoácidos, respectivamente, 59 para a proteína Mig de S. dysgalactíae (ID SEQ NO: 3 e ID SEQ NO: 4, respectivamente).
Compararam-se estas sequências contra sequências conhecidas via análise BLAST. Os parâmetros de busca utilizados para analisar as sequências de ácidos nucleicos foram os seguintes: Base de dados: nt; Número de letras na base de dados: 1 961 177 913; Número de sequências na base de dados: 614 801; Matriz: matriz blastn: 1-3; Penalidades de Hiato: Existência: 5, Extensão: 2. Os resultados obtidos revelaram que o gene mig de SD8 de S. dysgalactíae representado nas Figuras 1A-1D é homólogo a várias sequências de nucleótidos conhecidas, por exemplo, há 98% de homologia com o gene mig de SCI de S. dysgalactíae (Emb N° de Acesso Z29666.1 SDMIGSUP).
Os parâmetros de busca utilizados para analisar a sequência de aminoácidos foram os seguintes: Base de dados: nr; Número de letras na base de dados: 157 988 256; Número de Sequências na base de dados: 503 479; Matriz: BLOSUM62; Penalidades de Hiato: Existência: 11, Extensão: 1. Os resultados obtidos revelaram que a sequência de aminoácidos mig de SD8 de S. dysgalactíae apresentada nas Figuras 1A-1D é até 89% homóloga a várias sequências de aminoácidos conhecidas. D. Expressão e Purificação da Proteína Mig de S. dysgalactíae Recombinante E. coli que continha a construção preparada no Exemplo 1B, supra, cresceu em caldo LB com 100 μg/ml de ampicilina para um A6oo de aproximadamente 0,5. Em seguida, induziu-se expressão da proteína Mig por adição de isopropil-β, D- 60 tiogalactósido (IPTG) 1 mM (Sigma, St. Louis, MO). Após três horas de incubação a 37°C, as células foram recolhidas, lavadas em tampão de coluna (fosfato de sódio 50 mM, pH 8,0, NaCl 0,2 M) e submetidas a lise por sonicação.
Aproximadamente 40% da proteína recombinante estava presente na fracção solúvel do sonicado de células com um rendimento de aproximadamente 50 mg da proteína recombinante por litro do volume da cultura, determinado utilizando um estojo de Ensaio de Proteínas DC (BioRad Laboratories, Mississauga, Ontário, Canadá) com albumina de soro bovino (Pierce, Rockford, Illinois) como padrão. A proteína Mig recombinante foi purificada por cromatografia de afinidade utilizando uma matriz agarose-IgG, com base na capacidade da proteína para se ligar à porção Fc da molécula de IgG. O lisato de células foi clarificado por centrifugação e aplicou-se a fracção solúvel numa coluna BLIgG agarose (Sigma, St. Louis, Missouri). A coluna foi lavada com 10 volumes de coluna de tampão de coluna (fosfato de sódio 50 mM, pH 8,0, NaCl 0,3 M) e a proteína eluiu com tampão de coluna mais glicina 0,1 M, pH 2,5, dando origem a uma fracção de proteína homogénea com uma concentração de Mig de aproximadamente 10-15 mg/ml. O eluato foi dialisado contra 2 000 volumes de PBSA e foi armazenado a -20°C. E. Caracterização da Proteína Recombinante A análise da proteína purificada por SDS-PAGE revelou um grau de pureza de 60%. 61 EXEMPLO 2
Imunização com Mig e infecgão experimental de gado vacum
Formularam-se vacinas de modo a conterem 50 mg/ml de Mig recombinante purificada por afinidade ou GapC no adjuvante à base de óleo VSA3 (VIDO, Saskatoon, Saskatchewan, Canadá). VSA3 é uma combinação de Emulsigen Plus™ (MVP Laboratories, Ralston, Nebraska) e brometo de dimetildioctadecilamónio (Kodak, Rochester, Nova Iorque).
Obtiveram-se de várias quintas em Saskatchewan, Canadá, 24 Holsteins fora do período de lactação sem historial de infecção com S. dysgalactiae. Uma semana antes da vacinação, todos os animais foram tratados com Cepha-dry™ (300 mg por quarto; Ayerst Laboratories, Montreal, Canadá), para limpar qualquer infecção das tetas antes do passo de vacinação.
Três grupos de oito animais foram imunizados subcutaneamente com duas doses de vacinas que continham Mig, GapC (uma proteína de ligação à plasmina isolada de bactérias estreptococos que foi avaliada simultaneamente) ou um placebo, com um intervalo de três semanas entre as imunizações. Duas semanas após a segunda imunização, os animais foram expostos a 650 unidades formadoras de colónias de S. dysgalactiae distribuídas em três quartos com uma cânula de infusão pelas tetas. O quarto quarto de cada animal serviu de controlo não infeccioso.
Todos os animais foram examinados diariamente quanto a sinais clínicos de doença, tendo-se recolhido diariamente amostras de todos os quartos de tetas. Observaram-se as amostras quanto à consistência e contagens de células 62 somáticas, tendo-se igualmente determinado os números bacterianos. EXEMPLO 3
Colonização Bacteriana
Enumeraram-se bactérias espalhando diluições em série (10° até 10’3) directamente em placas de agar sangue de ovelha TSA, seguido de incubação durante a noite a 37°C, 5% de C02. Define-se colonização como > 500 cfu/ml do organismo de provocação recuperado.
Para confirmar que as bactérias recuperadas de secreções de leite eram S. dysgalactiae, testaram-se colónias seleccionadas recuperadas de cada animal utilizando um teste API strep-20 (bioMerieux SA, Hazelwood, Missouri) de acordo com as instruções do fabricante. Este teste é um método padronizado que combina 20 ensaios bioquímicos para actividade enzimática e fermentação de açúcar, cujos resultados dão origem a um perfil analítico. O perfil permite identificar a espécie de estreptococo particular presente por referência a um índice do perfil analítico ou utilizando "software" de identificação.
Após a provocação com S. dysgalactiae, verificou-se que animais de todos os grupos estavam colonizados por S. dysgalactiae (Figura 4) . Os animais imunizados com Mig exibiram uma redução do número de quartos infectados nos dias três e quatro pós-provocação. 63 EXEMPLO 4
Medição da Resposta Inflamatória
Mediu-se a resposta inflamatória em função da contagem de células somáticas (isto é, linfócitos, neutrófilos e monócitos). As contagens de células somáticas foram medidas num contador Coulter utilizando técnicas comuns, como recomendado pelo Panfleto de Agricultura e Agri-Alimentação do Canadá IDF50B (1985) "Milk and Milk Products - Methods of Sampling". As amostras foram sempre lidas num período de 48 horas após a recolha e fixação.
Determinou-se o número de células somáticas presentes nas glândulas nos dias 1 até 7 pós-provocação. Os números do quarto não provocado permaneceram constantes ao longo do ensaio, ao passo que, no dia 1, o grupo imunizado com Mig tinha valores inferiores ao grupo imunizado com placebo (Figura 5) . Apresentam-se na Figura 6 os dados individuais do dia 1.
Assim, são reveladas a clonagem, expressão e caracterização da proteína Mig de S. dysgalactiae, bem como métodos para utilizá-la. LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Universidade de Saskatchewan
Potter, Andrew A._
Bolton, Alexandra J._
Song, Xin Ming
<120> IMUNIZAÇÃO DE VACAS LEITEIRAS COM PROTEÍNA MIG <130> 08-891815WO <140> <141> 64 <16 Ο > 15 <170> Patent In Versão 2.0
<210 > 1 <211> 28 <212> ADN <213> Sequência Artificial <2 2 0 > <223> Descrição da Sequência Artificial: "primer" < 4 0 0 > 1 gcggccatgg tagaaaatac tataactg 28
<210> 2 <211> 27 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: "primer" miglR <400> 2 acgcccgggt tagtcttctt tacgttt 27
<210> 3 <211> 2010 <212> ADN <213> Streptococcus dysgalactiae <2 2 0 >
<221> CDS <222> (1) .. (2010) < 4 0 0 > 3
at:g gaa as& gaa aaa aaa gta feac Èfct tta egt ssa tca gct fctt U mt <31u lifs alu fcys í»ys vai hys Tyr ?he Leu srg- hys s«r Ma X $ 10 u 65 gga tta geg fccfc gfca tca gct gcg ttt tta gfct tcg ggs gera cta gaa as F“Í! MU .Ala Ser Vai Ser Ala Ala Phs Mu Vai Ser aiy Ala Mu Slu 30 35 ‘ 30 aat act afcá act. gtfc tcfe gea act ata cct gca gcp gtc att gfca 144 ÀSÍl Thr Tle Tfct Vai Ser Ais aiu Thr ile Pro Ala Alã Vai ile Vai. 35 40 45 ç«t gtfe gge ct& gat act aoa gaa tfca caa aaa tgg fcafe gac att gea 193 Pro Vai Giy Mu Asp Vhr ifcr Slu Leu Qlu Lys Trp iyr Asp lia âiã 50 55 SÕ aat gafe fcfca gtt gcg act gac aat gct act ccg gga m* gt® ttt aca 340 Mn Ãstp Mu Vai Ala Thr Acp Asa Ma Pru Gly Giy V«tl. 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Asp Ma Lys Lys Asp Asp Thr Lys Lys vai Asp Thr Lys Lys Glu Asp E9S SOO SOS Ala Lys !ys Pro Mu Ala Lyis Lys Pro GÀu Ala Lys Lys 81» Gltt Ala £18 SIS €20 Lys X>ys dia Ç.i. u Ala Lys Lys Ala Ala Thr Leu Pro Thr Thr Gly Slu. 625 £30 £35 < £40 Sly ser Pro Pise Phe Thr Ala Ala Ma Leu Ala Vai ííet Ma Gly $4$ sso S5S Ala Gly Ala Leu Ala Vai Ala Ssr Ly& Arg Lye Slu Aap
<210> 5 <211> 27 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: "primer" mig-3 <400> 5 gttggcctag atatcacaga attacaa 27
<210> 6 <211> 25 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: "primer" mig-4 <400> 6 aaagcacccg ggccagccat tactg 25
<210> 7 <211> 28 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: "primer" mig-6 < 4 0 0 > 7 aggtgcttcc catggaactg cctgaact 28 <210> 8 <211> 30 71
<212> ADN <213> Sequência Artificial <2 2 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: "primer" mig-7 <400> 8 ggcgagagtc tagaaactaa agcgaaaaac 30
<210>9 <211 >30 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: "primer" mig-8 <400> 9 gcaatcacca ggatcctcag taaccatttc 30
<210> 10 <211> 29 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: "primer" mig-9 <4 0 0> 10 caggcaggtc atatggaagc acctacagt 29
<210> 11 <211> 22 <212> ADN <213> Sequência Artificial <2 2 0 > <223> Descrição da Sequência Artificial: "primer" mig-10 < 4 0 0 > 11 tcccggagta gcattgtcag tc 22
<210> 12 <211> 30 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> 72 <223> Descrição da Sequência Artificial: "primer" mig-11 <4 0 0> 12 gcagcggtcc atatgcctgt tggcctagat 30
<210 > 13 <211> 28 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: "primer" mig-12 <400> 13 gcctgaactg gatccctcaa ctgatctg 28
<210> 14 <211> 27 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: "primer" mig-13 < 4 0 0 > 14 ttccgttgga tcctgcaact ccaattg 27
<210 > 15 <211> 28 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: "primer" mig-14 <400> 15 taagtcaaaa gctttgacaa ttagtctt 28
Lisboa, 11 de Maio de 2007.

Claims (10)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Composição de vacina que compreende um veiculo farmaceuticamente aceitável e uma proteína receptora de Fc, em que a referida proteína receptora de Fc é seleccionada do qrupo que consiste em: a) uma proteína Mig de Streptococcus dysgalactiae que compreende a sequência de aminoácidos apresentada nas posições de aminoácidos 1 até 669, inclusive, das Figuras 1A-1D (ID SEQ NO: 4), e b) uma proteína receptora de Fc que possui pelo menos 70% de identidade de sequências com (a).
2. Composição de vacina da Reivindicação 1, em que a referida proteína Mig compreende a sequência de aminoácidos da proteína Mig de Streptococcus dysgalactiae apresentada nas posições de aminoácidos 1 até 669, inclusive, das Figuras 1A-1D (ID SEQ NO: 4).
3. Composição de vacina da Reivindicação 1 que também compreende um adjuvante.
4. Método para produzir uma composição de vacina que compreende os passos seguintes: a) proporcionar uma proteína receptora de Fc, em que a referida proteína receptora é seleccionada do grupo que consiste em: (i) uma proteína Mig de Streptococcus dysgalactiae que compreende a sequência de aminoácidos apresentada nas posições de aminoácidos 1 até 669, inclusive, das Figuras 2 1A-1D (ID SEQ NO: 4), e (ii) uma proteína receptora de Fc que possui pelo menos 70% de identidade de sequências com (i), e b) combinar a referida proteína com um veículo farmaceuticamente aceitável.
5. Utilização de uma proteína receptora de Fc, em que a referida proteína receptora de Fc é seleccionada do grupo que consiste em: a) uma proteína Mig de Streptococcus dysgalactiae que compreende a sequência de aminoácidos apresentada nas posições de aminoácidos 1 até 669, inclusive, das Figuras 1A-1D (ID SEQ NO: 4), e b) uma proteína receptora de Fc que possui pelo menos 70% de identidade de sequências com (a), no fabrico de uma composição de vacina útil para tratar ou prevenir uma infecção causada por estreptococos no sujeito vertebrado.
6. Utilização de acordo com a Reivindicação 5, em que a referida proteína Mig compreende a sequência de aminoácidos da proteína Mig de Streptococcus dysgalactiae apresentada nas posições de aminoácidos 1 até 669, inclusive, das Figuras 1A-1D (ID SEQ NO: 4).
7. Utilização de acordo com qualquer uma das Reivindicações 5 ou 6, em que a referida infecção por estreptococos causa mastite.
8. Utilização de um polinucleótido que compreende uma sequência codificadora para uma proteína receptora de 3 Fc, em que a referida proteína receptora de Fc é seleccionada do grupo que consiste em: a) uma proteína Mig de Streptococcus dysgalactiae que compreende a sequência de aminoácidos apresentada nas posições de aminoácidos 1 até 669, inclusive, das Figuras 1A-1D (ID SEQ NO: 4), e b) uma proteína receptora de Fc que possui pelo menos 70% de identidade de sequências com (a),no fabrico de um medicamento útil para tratar ou prevenir uma infecção por estreptococos num sujeito vertebrado.
9. Utilização de acordo com a Reivindicação 8, em que a referida proteína Mig compreende a sequência de aminoácidos da proteína Mig de Streptococcus dysgalactiae apresentada nas posições de aminoácidos 1 até 669, inclusive, das Figuras 1A-1D (ID SEQ NO: 4).
10. Utilização de acordo com qualquer uma das Reivindicações 8 ou 9, em que a referida infecção por estreptococos causa mastite. Lisboa, 11 de Maio de 2007.
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