ES2092560T5 - Proteinas inmunologicamente activas de borrelia burgdorferi, estuches de ensayo relacionados y vacuna. - Google Patents

Abstract

PROTEINAS ACTIVAS INMUNOLOGICAS DE BORRELIA BURGDORFERI, KITS DE PRUEBA RELACIONADOS Y VACUNAS. DIVERSAS PROTEINAS INMUNOLOGICAMENTE ACTIVAS DE BORRELIA BURGDORFERI SE PRODUJERON EN MICROORGANISMOS POR TRATAMIENTO TECNOLOGICO DE GENES. PARA ELLO, SE SELECCIONARON LAS SECUENCIAS DE DNA ESPECIFICAS DE UN BANCO DE GENES DE B. BURGDORFERI CON METODOS DE BUSQUEDA APROPIADOS Y SE REPRESENTARON DIRECTAMENTE MEDIANTE LA AMPLIFICACION DEL DNA CON PRUEBAS DE HIDRURACION SELECCIONADAS Y BAJO EL CONTROL DE PROMOTORES INDUCIBLES COMO POR EJEMPLO EL PROMOTOR LAC. MEDIANTE LA DESCRIPCION DE PROCEDIMIENTOS DE LIMPIEZA EFICIENTES PARA LOS ANTIGENOS EXPRIMIDOS, SE PUDIERON DISPONER LAS PROTEINAS EN LA FORMA APROPIADA. CON ESTAS PROTEINAS SE PUEDEN CONFECCIONAR KITS DE PRUEBA ESPECIFICOS Y DIAGNOSTICOS SENSITIVOS. MEDIANTE LA COMBINACION SELECTIVA DE LAS PROTEINAS ACTIVAS INMUNOLOGICAMENTE ES POSIBLE UN DIAGNOSTICO PRECISO. ADEMAS, SE GENERARON ANTICUERPOS MONOCLONALES, QUE ENCUENTRAN APLICACION COMO REACTANTES PARA LA PRUEBA DE EXCITACION DIRECTAMENTE DE PRUEBAS DE EXAMEN Y DESPUES DEL CULTIVO. LAS SECUENCIAS DE DNA ESPECIFICAS DE LA BORRELIA BURGDORFERI SE PUEDEN APLICAR EN PRUEBAS DE PACIENTES PARA LA DEMOSTRACION DIRECTA DEL EXCITANTE (P.EJ. MEDIANTE REACCION PCR).

Description

Proteínas inmunológicamente activas de Borrelia burgdorferi, estuches de ensayo relacionados y vacuna.

La borreliosis de Lyme es la enfermedad infecciosa más frecuente en el hombre, transmitida por garrapatas, en la República Federal Alemana. En contraposición a la meningoencefalitis de comienzos de veranos (FSME), que es transmitida asimismo por garrapatas, la borreliosis de Lyme no se limita a unas pocas zonas endémicas, sino que se presenta en todas las regiones de la República Federal Alemana. La epidemia del vector principal en Europa, Ixodes ricinus, con el agente patógeno de la borreliosis de Lyme, la espiroqueta Borrelia burgdorferi, se encuentra en la región sur de Alemania en aproximadamente el 20% de los adultos, aproximadamente el 10% de las ninfas y en aproximadamente el 1% de las larvas. El vector principal en los Estados Unidos, Ixodes dammini, puede estar afectado por borrelias en hasta un 100% en zonas altamente endémicas.

B. burgdorferi pertenece a la familia de las espiroquetas. Las espiroquetas son bacterias helicoidales de una longitud de 8-30 \mum. Consisten en una envuelta exterior, los endoflagelos en el periplasma y el cilindro protoplasmático. El cilindro protoplasmático es un complejo a base de citoplasma, membrana celular interna y péptidoglicano. A los representantes patógenos humanos de las espiroquetas pertenecen, junto a B. burgdorferi, las borrelias de fiebre recurrente (por ejemplo B. recurrentis), el agente patógeno de la sífilis (Treponema (T.) pallidum) y las leptospiras. En virtud de la estrecha relación inmunológica de los agentes patógenos, son un problema, con los ensayos hasta ahora disponibles, las reacciones cruzadas en la detección serológica de anticuerpos en el caso de sífilis y borreliosis de
Lyme.

Una infección con B. burgdorferi conduce a un cuadro clínico complejo que, de manera similar al caso de la sífilis, se puede dividir en tres estadíos diferentes. Las manifestaciones más importantes son:

Fase temprana:	estadío I	erisipeloide
		meningorradiculitis linfocitaria Bannwarth (MRL)
		linfocitoma por borrelias
Fase tardía:	estadío III	artritis de Lyme
		acrodermatitis crónica atrofiante (ACA)
		encefalomielitis crónica por borrelias

Manifestaciones clínicas más raras son: carditis, miositis, iritis y panoftalmitis. Es posible la transmisión diaplacentaria del agente patógeno, pero hasta ahora sólo están documentados unos pocos casos de una borreliosis de Lyme conatal. Los diferentes estadíos pueden manifestarse individualmente o combinados. La infección con B. burgdorferi puede discurrir también subclínicamente. Estudios epidemiológicos en 375 casos clínicamente detectados mostraron algunas particularidades en la distribución por edades y sexo en las distintas manifestaciones clínicas. Así, pacientes con erisipeloide se encontraron de la forma más frecuente en el grupo de edad de los 30 a los 60 años. Manifestaciones neurológicas mostraron dos picos de edad: el primero, en niños y jóvenes de hasta 20 años, y el segundo en personas de 40 a 70 años. La artritis de Lyme se observó de la forma más frecuente en personas de 30 a 60 años. Pacientes con ACA no eran en ningún caso menores de 30 años. La ACA afecta claramente de forma más frecuente a mujeres que a hombres. La investigación serológica mostró en el ensayo de inmunofluorescencia en pacientes con erisipeloide predominantemente síntomas de IgM positivos y en el caso de manifestaciones neurológicas, predominantemente síntomas de IgG positivos. En las manifestaciones tardías de ACA y artritis de Lyme, los títulos de IgG estaban regularmente incrementados y los anticuerpos de IgM sólo se podían detectar ya en casos especiales.

Para el diagnóstico, se encuentra a disposición tanto la detección del agente patógeno como también la detección del anticuerpo. La detección del agente patógeno a partir de material del paciente (biopsias de piel, líquido cefalorraquídeo, líquido extraído por punción) es particularmente aconsejable en el estadío temprano (erisipeloide), en el que una detección del anticuerpo es a menudo negativa. No obstante, para el cultivo de B. burgdorferi es necesario un medio nutricio complejo (Preac-Mursic, V.; Wilske, B.; Schierz, G. (1986): European Borreliae Burgdorferi isolated from humans and ticks -culture conditions and antibiotic susceptibility. Zbl. Bakt. Hyg. A 163, 112-118) y, por lo tanto, el cultivo está reservado a laboratorios especiales. Para el aislamiento del agente patógeno, se requiere, además, un tiempo de hasta 5 semanas. El aislamiento de B. burgdorferi se consigue a partir de muestras de piel en el 50-70% de los casos con manifestaciones de la piel y en el 3-5% de los casos con neuroborreliosis (Preac-Mursic, V.; resultados no publicados).

La detección del anticuerpo (IgM, IgG) se lleva a cabo en el suero y, en manifestaciones neurológicas, también a partir del líquido cefalorraquídeo. El síntoma serológico depende de la fase de la enfermedad, la duración de los síntomas y una eventual terapia con antibióticos ya realizada. Así, la detección del anticuerpo con los ensayos hasta ahora disponibles en el caso de erisipeloide sólo tenía éxito en el 20-50% de los casos, en manifestaciones neurológicas en el 50-90% y en ACA y artritis en el 90-100%.

La terapia de la borreliosis de Lyme se lleva a cabo predominantemente con penicilina G, tetraciclinas, eritromicina o cefalosporinas. La borreliosis de Lyme cura ciertamente a menudo de manera espontánea en las fases tempranas, pero tampoco entonces se han de excluir manifestaciones tardías. Por lo tanto, es inevitable una terapia en el estadío temprano. Además, una curación clínica después de terapia con antibióticos en manifestaciones tardías sólo se puede conseguir en una parte de los casos (por ejemplo, sólo aproximadamente 50% en el caso de artritis de Lyme).

Por lo tanto, la borreliosis de Lyme debería diagnosticarse lo más temprano posible. Dado que (como ya se ha explicado) el aislamiento del agente patógeno es costoso, laborioso y, además, no siempre efectivo, deberían desarrollarse mejores ensayos serodiagnósticos. Los procedimientos hasta ahora utilizados (ensayo de inmunofluorescencia (IFT), ensayo de hemaglutinación indirecto (IHA), análisis con enzima unida a inmunosorbente (ELISA) fracasan a menudo en los estadíos tempranos. Como antígenos se emplean para estos ensayos células completas de B. burgdorferi o ultrasonicados de células completas. El empleo de diferentes cepas de B. burgdorferi como antígeno conduce en el ELISA con ultrasonicados a diferentes resultados de ensayo. Las células se fijan sobre portaobjetos o el antígeno del ultrasonicado se fija sobre placas de microtitulación, se incuban con suero o líquido cefalorraquídeo y los anticuerpos específicos de borrelia se detectan con un segundo anticuerpo, marcado por fluorescencia o con peroxidasa, de la correspondiente clase de inmunoglobulinas. La reacción se evalúa entonces en el microscopio de fluorescencia (IFT) o según una reacción de color en el fotómetro (ELISA).

Un problema de la especificidad de los ensayos son amplias reacciones cruzadas del agente patógeno B. burgdorferi con otros agentes patógenos bacterianos, en particular con T. pallidum, el agente patógeno de la sífilis. Dado que los antígenos de ensayo consisten, por lo general, en lisados del agente patógeno completo, también se determinan anticuerpos contra el denominado "antígeno común" (Hansen, K.; Hindersson, P.; Pedersen, N.S. (1988): Measurement of antibodies to the Borrelia burgdorferi flagellum improves sorodiagnosis in Lyme disease. J. Clin. Microbiol., 26, 338-346). "Antígenos comunes" son proteínas muy difundidas y fuertemente conservadas en su secuencia, es decir los "antígenos comunes" de borrelias, treponemas, pero también numerosas otras bacterias poseen epítopos comunes. Junto a ello, pueden manifestarse reacciones falsas positivas en el IFT con IgM o en el ELISA con IgM en el caso de sueros con actividad de factor del reuma. Con el fin de hacer más específicos los ensayos, se lleva a cabo por lo tanto en la detección de anticuerpos de IgG e IgM una pre-absorción de los sueros con un ultrasonicado de treponema y, adicionalmente, en el caso de la detección de anticuerpos de IgM, además una absorción con absorbente del factor del reuma.

Gassmann et al. (Nucleic Acids Research, Vol. 17 (1989), pág. 3590) describen la secuencia de ADN de una flagelina principal de la cepa B31 de Borrelia burgdorferi.

Wallich et al. (Nucleic Acids Research, Vol. 17 (1989), pág. 8864) describen la clonación y secuenciación de un gen que codifica la proteína A de la superficie exterior (OspA) de la cepa ZS7 de Borrelia burgdorferi.

Wilske et al. (Annals New York Acad. Science, 1988, Vol. 539, págs. 126-143) describen la variabilidad antigenética de diferentes cepas de Borrelia burgdorferi. Las investigaciones se llevaron a cabo esencialmente con borrelias completas o con lisados de células completas. La producción de proteínas individuales con ayuda de métodos de tecnología genética no se describe en esta cita bibliográfica.

Luft et al. (Infection and Immunity (noviembre 1989), págs. 3637-3645) describen la caracterización bioquímica e inmunológica de proteínas de superficie de Borrelia burgdorferi, utilizándose en particular la cepa B31. La secuencia aminoterminal de la proteína de 22 kDa, indicada en esta cita bibliográfica, se diferencia por completo de la correspondiente secuencia de la proteína conforme a la invención.

Es por lo tanto misión de la presente invención poner a disposición proteínas inmunológicamente activas de Borrelia burgdorferi que encuentran aplicación en un estuche de ensayo que no presenta los inconvenientes antes mencionados. Además, este estuche de ensayo ha de posibilitar la detección rápida y fiable de anticuerpos dirigidos contra Borrelia burgdorferi.

Además de ello, se han de poner a disposición proteínas inmunológicamente activas que sean adecuadas como vacunas contra infecciones provocadas por cepas de borrelias.

En la investigación de sueros de pacientes de diferentes estadíos patológicos de la borreliosis de Lyme en la transferencia de Western, así como en la investigación de pacientes que no padecen borreliosis de Lyme (en particular pacientes de sífilis) en cuanto a la reactividad cruzada con B. burgdorferi se encontraron proteínas inmunológicamente activas (antígenos de B. burgdorferi) que, por una parte, provocan una buena respuesta del anticuerpo después de la infección y, por otra, muestran una escasa reactividad cruzada con sueros no B. burgdorferi-positivos (Ejemplo 1). Se demostró que una determinada cepa de B. burgdorferi, con la denominación interna de laboratorio PKo que fue depositada en la Colección Alemana para Microorganismos (DSM) bajo el número 5662, posee, entre otros, una proteína inmunodominante en el intervalo de pesos moleculares de alrededor de 22 kD (proteína pC). La determinación del peso molecular de las proteínas conformes a la invención se realizó según métodos en sí conocidos, en particular mediante electroforesis en gel con SDS. Se encontró que esta proteína es inmunodominante para la respuesta de IgM. Esta proteína no está expresada de la misma manera en todas las cepas de B. burgdorferi. Conforme a la invención, esta proteína inmunológicamente activa (proteína pC) se preparó por tecnología genética (Ejemplo 3).

También otras proteínas inmunológicamente activas (antígenos), que son adecuadas de manera particular para el empleo en estuches de ensayo, se prepararon en células de Escherichia coli generalmente accesibles y adquiribles en el comercio, tales como por ejemplo las cepas JM 105 (Pharmacia) o DH 5 (Gibco-BRL). Para ello, se aislaron los fragmentos de ADN de B. burgdorferi que codifican estas proteínas y, a continuación, se introdujeron en vectores de expresión eficaces (Ejemplos 2 y 3).

La identificación y el aislamiento de los correspondientes fragmentos de ADN se efectuó según métodos diferentes. Así, se preparó una proteína inmunológicamente activa, no conforme a la invención, con un peso molecular de aproximadamente 41 kD, que en lo que sigue se denomina también como proteína p41, mediante reacción en cadena de polimerasa (PCR) y cebadores específicos, cuyas secuencias se prepararon por vía sintética (Ejemplo 2).

Además, se preparó un banco de genes del genoma de B. burgdorferi que se investigó mediante anticuerpos monoclonales en cuanto a la expresión directa de proteínas inmunológicamente activas.

De manera correspondiente, también se clonaron y secuenciaron proteínas con pesos moleculares de aproximadamente 100 kD y 31 kD.

Otro método consistía en purificar determinadas elegidas proteínas inmunológicamente activas (antígenos) a partir de lisados de B. burgdorferi y determinar secuencias de aminoácidos de estos antígenos. A continuación, se sintetizaron oligodesoxinucleótidos correspondientes a la secuencia de aminoácidos y, mediante hibridación, se identificaron los clones del banco de genes que presentaban las secuencias de ADN que codifican las proteínas inmunológicamente activas. Los dos métodos mencionados en último lugar se explican con mayor detalle en el Ejemplo 3.

Después de la caracterización, secuenciación y reclonación de los genes en correspondientes vectores de expresión, se expresaron los antígenos en células de E. coli y a continuación se purificaron. Un procedimiento de purificación preferido se describe en el Ejemplo 4.

Las proteínas inmunológicamente activas de Borrelia burgdorferi, preparadas conforme a la invención, pueden utilizarse en estuches de ensayo que ponen a disposición una detección sorprendentemente sensible de anticuerpos contra B. burgdorferi en diferentes líquidos de investigación. Una ventaja de las proteínas inmunológicamente activas, preparadas conforme a la invención, consistía en que las preparaciones sólo se componían de la proteína deseada y, posiblemente, de proteínas que han de atribuirse a manifestaciones de degradación y/o a una traducción completa. Estas preparaciones no contienen proteínas de B. burgdorferi de este tipo que no corresponden a la proteína producida por vía recombinante, ya que se prepararon por tecnología genética.

Las proteínas conformes a la invención se caracterizan porque presenta o presentan

a) la secuencia de aminoácidos

1

o una secuencia parcial de la misma de al menos 10 aminoácidos, o

b) la secuencia de aminoácidos

2

\vskip1.000000\baselineskip

o una secuencia parcial de la misma de al menos 10 aminoácidos, o

c) se compone de la secuencia de aminoácidos

3

\vskip1.000000\baselineskip

o de la secuencia parcial de esta proteína con una deleción de 20-25 aminoácidos en el N-terminal de la proteína, o

d) la secuencia de aminoácidos

4

o una secuencia parcial de la misma de al menos 10 aminoácidos.

Bajo la expresión "estuches de ensayo" se entiende un conjunto de reactivos de ensayo que posibilita la detección de determinados anticuerpos. Los principios en los que se fundamentan los estuches de ensayo se describieron en "Immunoassays for the 80s" (1981) de A. Voller et al., aparecido en MTP Press Ltd, Falcon House, Lancaster, Inglaterra. Los reactivos de ensayo presentan como componente más importante el o los antígenos y eventualmente anticuerpos específicos, preferiblemente monoclonales.

Los estuches de ensayo conformes a la invención para la detección de anticuerpos contra Borrelia burgdorferi se caracterizan porque contienen al menos una proteína inmunológicamente activa conforme a la invención, antes definida, que se encuentra a disposición sin impurificaciones por otras proteínas de la cepa de Borrelia burgdorferi. Esta proteína inmunológicamente activa actúa como antígeno y reacciona con los anticuerpos presentes en el líquido de investigación. Preferiblemente, los estuches de ensayo conformes a la invención presentan dos a cuatro proteínas inmunológicamente activas que se encuentran a disposición sin impurificación por otras proteínas de B. burgdorferi. Además, el estuche de ensayo contiene un componente indicador que posibilita la presencia de complejos a base de antígenos y anticuerpos.

Los estuches de ensayo conformes a la invención pueden basarse en diferentes principios, en sí conocidos. Básicamente, el antígeno puede portar una marcación, pudiendo consistir la marcación en un isótopo radiactivo o en una enzima que cataliza una reacción de color. Asimismo, el antígeno puede estar fijado a una base sólida (placas de microtitulación o esferitas), y el componente indicador puede consistir en un anticuerpo dirigido contra un anticuerpo, que porta una marcación, pudiendo consistir la marcación en un isótopo radiactivo o una enzima que cataliza una reacción de color.

En el marco de la presente invención se prefiere como estuche de ensayo el denominado ELISA (análisis con enzima unida a inmunosorbente). Una forma de realización del mismo se describe con mayor detalle en el Ejemplo 5. Los resultados de este ejemplo demuestran que, sorprendentemente, mediante el empleo de sólo una proteína inmunológicamente activa conforme a la invención se podía conseguir una especificidad muy elevada del estuche de ensayo. Además de ello, los estuches de ensayo conformes a la invención posibilitan, de manera sorprendente, una diferenciación correlacionada con el estadío de la enfermedad. El empleo combinado de varios antígenos en un estuche de ensayo posibilita la detección de anticuerpos contra Borrelia burgdorferi también en aquellos casos en los que todavía no se han manifestado clínicamente los síntomas de la enfermedad. Asimismo, pueden diagnosticarse infecciones con B. burgdorferi en las que el paciente atraviesa sólo una infección subclínica. La manifestación que puede obtenerse mediante los estuches de ensayo conformes a la invención es particularmente importante en los casos en los que se pudo comprobar una picadura de garrapata, pero no está claro si está presente una infección con una cepa de borrelias.

En el marco de la presente invención se prefiere el empleo combinado de varias proteínas inmunológicamente activas. Es muy particularmente preferida una combinación de las proteínas pC y p100. Mediante el empleo de los estuches de ensayo ELISA preferidos conformes a la invención puede efectuarse también una diferenciación en relación con la naturaleza de los anticuerpos. Por ejemplo, si se han de detectar anticuerpos de IgM, se puede emplear el denominado análisis de captura \mu, en el que anticuerpos dirigidos contra anticuerpos de IgM se fijan a la fase sólida. Después de incubación de las placas de ensayo con el líquido a investigar se fijan a la fase sólida los anticuerpos de IgM presentes en el líquido de investigación. Después de la saturación de uniones no específicas, puede entonces agregarse a la presente invención una proteína inmunológicamente activa. Este antígeno se detecta entonces mediante una molécula indicadora. En este caso, el antígeno puede estar biotinilidado, añadiéndose a continuación avidina que presenta peroxidasa fijada covalentemente. La peroxidasa cataliza entonces una reacción que conduce a la formación de color.

Otra posibilidad consiste en añadir al complejo soporte/ anticuerpo anti-IgM, anticuerpo a detectar/ antígeno conforme a la invención anticuerpos monoclonales que son específicos para el antígeno y que están biotinilados. La biotinilación se describe por ejemplo en Monoklonale Antikörper (1985) editorial Springer, J. H. Peters et al. La detección del complejo se efectúa allí por adición de avidina a la que está acoplada una enzima que cataliza una reacción de color.

Otra forma de realización de la presente invención consiste en que la detección de IgM se lleva a cabo mediante el ELISA indirecto. En este caso, los antígenos conformes a la invención se fijan sobre placas de microtitulación, se incuban con el líquido a investigar y, después del lavado, se efectúa la detección de los complejos inmunes mediante conjugado anti-\mu.

También se pueden preparar anticuerpos monoclonales que están dirigidos contra las proteínas inmunológicamente activas de Borrelia burgdorferi. La producción de anticuerpos monoclonales de este tipo se explica más detalladamente en el Ejemplo 6. Se pueden emplear anticuerpos monoclonales de este tipo en calidad de reactivos para la detección directa del agente patógeno. Sin embargo, también se pueden acoplar anticuerpos monoclonales a la fase sólida de una placa de microtitulación. Después de la adición de las proteínas inmunológicamente activas (antígenos), éstas se fijan a la placa de microtitulación mediante fijación anticuerpo-antígeno. A continuación, se añade el líquido de investigación (del que se puede tratar por ejemplo de suero o líquido de cefalorraquídeo). Los anticuerpos presentes en el líquido cefalorraquídeo se fijan entonces al antígeno y se pueden detectar con ayuda de un componente indicador.

Además de ello, los anticuerpos monoclonales se pueden utilizar muy bien para la purificación de las proteínas inmunológicamente activas (antígenos). Es ventajoso en este caso que la purificación sea particularmente moderada. Para ello, los anticuerpos monoclonales se fijan a una matriz sólida. Preferiblemente, esta matriz sólida se encuentra en forma de una columna. A continuación, los antígenos parcialmente prepurificados se reúnen, en condiciones fisiológicas, con los anticuerpos acoplados a una matriz sólida. Después del lavado del complejo matriz-anticuerpo-antígeno se pueden eluir los antígenos. Habitualmente, se utilizan para ello elevadas concentraciones de sales o tampones con un valor del pH que posibilite la elución.

También se pueden poner a disposición secuencias de ADN que corresponden, en su totalidad o en parte, a la secuencia de aminoácidos de las proteínas inmunológicamente activas. Estas secuencias de ADN pueden utilizarse preferiblemente para la detección mediante hibridación de cepas de borrelias en el material de investigación. Para ello, se prepara un oligonucleótido que corresponde en parte a la secuencia de ADN. Este oligonucleótido se marca radiactivamente. Por otra parte, el ADN del material de investigación se fija a un filtro adecuado, preferiblemente nitrocelulosa, y a continuación se hibrida con el oligonucleótido radiactivamente marcado. Asimismo, las secuencias de ADN conformes a la invención pueden utilizarse para la hibridación in situ para la detección directa de B. burgdorferi en el tejido infectado. En lugar de los oligonucleótidos químicamente sintetizados, también se pueden multiplicar en bacterias correspondientes fragmentos de ADN y, a continuación, separarse de los vectores por corte con ayuda de endonucleasas de restricción. Después del aislamiento de estos fragmentos de ADN, éstos se pueden marcar radiactivamente y utilizar para la hibridación tal como se ha descrito antes.

Otro aspecto de la presente invención consiste en poder utilizar las proteínas inmunológicamente activas (antígenos) conformes a la invención de Borrelia burgdorferi como vacunas. Para ello, los antígenos conformes a la invención se preparan en forma pura. A continuación, se aplican a la persona a vacunar individualmente o en combinación con o sin un agente que estimula la respuesta inmune. Con ello, se excita la formación de anticuerpos que son específicos contra cepas de Borrelia burgdorferi.

Las proteínas conformes a la invención pueden encontrar aplicación en diferentes sectores. Así, los estuches de ensayo conformes a la invención pueden utilizarse también para la detección de infecciones por B. burgdorferi en animales, y las proteínas pueden también utilizarse para la vacunación de animales, en particular de animales valiosos.

En la medida en que la presente invención concierne a proteínas de Borrelia burgdorferi, también se puede tratar de fragmentos de proteínas que presentan únicamente una secuencia parcial de la secuencia completa del aminoácido. Secuencias parciales de este tipo presentan al menos 10 aminoácidos y, preferiblemente, al menos 15 aminoácidos.

Sin embargo, habitualmente, los fragmentos de proteínas son mayores.

En el marco de la presente invención se prefieren particularmente las proteínas conformes a la invención con un peso molecular de aproximadamente 22 kD o 100 kD. Estas proteínas pueden proceder también de otras cepas de Borrelia burgdorferi, siempre que correspondan a la definición antes mencionada.

Con ayuda de las siguientes tablas, figuras y ejemplos se explican más detalladamente las formas de realización preferidas de la presente invención.

La proteína p41 mencionada en los Ejemplos no es objeto de la invención.

Ejemplo 1 Determinación de las proteínas de borrelias inmunorrelevantes y específicas del género

Se buscaron anticuerpos de suero específicos y que aparecen frecuentemente, que están dirigidos contra determinados antígenos individuales de B. burgdorferi, que muestran una reactividad cruzada lo más escasa posible con proteínas de agentes patógenos relacionados y que, adicionalmente, también permiten una correlación con los distintos estadíos de la enfermedad de borreliosis de Lyme.

La búsqueda de antígenos reconocidos frecuentemente se efectuó mediante la transferencia de Western. Para ello, un extracto de bacterias de B. burgdorferi (cepa PKo) (Preac-Mursic, V.: Wilske, B.; Schierz, G. (1986): European Borreliae burgdorferi isolated from humans and ticks -culture conditions and antibiotic susceptibility. Zbl. Bakt. Hyg. A 163, 112-118) se separó, después de sedimentación, resuspensión en PBS/NaCl y tratamiento con ultrasonidos, electroforéticamente en un gel de poliacrilamida con SDS (Laemmli, U.K. (1970): Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227, 680-685).

Los geles consistían en un gel recolector con bolsas para las muestras y en un gel separador. La composición de los geles separadores era la siguiente: acrilamida al 15% (Bio-Rad), dialiltartardiamida al 0,026% (DATD, Bio-Rad) por porcentaje de acrilamida, SDS al 0,15%, Tris-HCl 375 mM pH 8,5, peroxodisulfato de amonio 0,14 mM (AMPER, Bio-Rad) y N,N,N',N'-tetrametiletilendiamina al 0,035% (TEMED, Bio-Rad). En este caso, AMPER y TEMED servían como iniciadores de radicales para la polimerización. 2-4 h después de la polimerización, el gel recolector (acrilamida al 3,1%, dialiltartardiamida al 0,08%, SDS al 0,1%, Tris-HCl 125 mm pH 7,0, AMPER 3 mM y TEMED al 0,05) se vertió sobre el gel separador y se proveyó de un peine de teflón. Las cámaras del ánodo y cátodo se rellenaron con solución tampón idéntica: base Tris 25 mM, glicina 192 mM y SDS al 0,1%, pH 8,5.

Por bolsa se aplicaron en cada caso 20 \mul de muestra de tampón de lisis (sacarosa al 3%, SDS al 2%, \beta-mercaptoetanol al 5%, Tris-HCl 20 mM, pH 7,0, azul de bromofenol; calentado durante 5 min. a 100ºC). La electroforesis se llevó a cabo a la temperatura ambiente durante una noche con una intensidad constante de corriente de 6 mA para geles con un tamaño de 20 x 15 cm. A continuación, los geles se transfirieron sobre nitrocelulosa (NC).

Para la transferencia de proteínas, el gel se encontraba con la nitrocelulosa contigua entre papel de filtro Whatman 3 MM, conductor, material esponjado de 1 cm de espesor y dos placas de carbón que conducían la corriente a través de electrodos de platino. El papel de filtro, el material esponjado y la nitrocelulosa se impregnaron bien con tampón de borrón (glicina 192 mM, base Tris 25 mM, metanol al 20%, pH 8,5). La transferencia tuvo lugar a 2 mA/cm^{2} durante 2 h. Los lugares de fijación libres sobre la nitrocelulosa se saturaron durante 1 h a 37ºC con tampón Cohen (1 mg/ml de Ficoll 400, 1 mg/ml de polivinilpirrolidona, 16 mg/ml de albúmina de suero bovino, NP 40 al 0,1%, gelatina Bacto al 0,05% en tampón borato de sodio pH 8,2); (Cohen G. H., Dietzschold, B., Ponce de Leon, M., Long, D., Golub, E., Varrichio, A., Pereira, L y Eisenberg, R.J.: Localisation and synthesis of an antigenic determinant of Herpes simplex virus glycoprotein D that stimulates the production of neutralizing antibodies. J. Virol. 49 (1984) 4183-4187). El borrón se incubó bajo sacudimiento durante una noche a temperatura ambiente con los sueros de los pacientes (dilución 1:100 en NaCl 154 mM y Tris-HCl 10 mM pH 7,5).

Después de la incubación del suero, el borrón se lavó durante cuatro veces en cada caso durante 15 min. con TTBS (Tris-HCl 50 mM pH 7,5, NaCl 500 mM, Tween 20 al 0,01%). A continuación, el borrón se incubó durante 2 h a la temperatura ambiente con inmunoglobulina anti-humana acoplada con peroxidasa (DAKO, Hamburgo, dilución 1:1000 en NaCl 154 mM y Tris-HCl 10 mM, pH 7,5). Después de un lavado múltiple con TTBS, el borrón se tiñó con 0,5 mg/ml de diaminobencidina y peróxido de hidrógeno al 0,01% en Tris-HCl 50 mM pH 7,5. A continuación, la tinción se detuvo con ácido sulfúrico 1 N, el borrón se lavó con agua hasta quedar exento de ácido y se secó entre papel de filtro.

En las figuras 1, 2a y b se muestra una elección del modelo de reacción de diferentes sueros con las tiras de transferencia de Western.

Como inmunodominantes se manifestaron en este caso las siguientes proteínas: p17 (17 kDa), pC (22 kDa), p41 (41 kDa) y p100 (100 kDa con variaciones del tamaño en diferentes materiales aislados de B. burgdorferi). A excepción de p41, las funciones biológicas de estos antígenos son desconocidas; p41 representa la proteína flagelina (Barbour, A.G.S., Hayes, S.F., Heiland, R.A., Schrumpf, M.E. y Tessier, S.L.: A Borrelia genus-specific monoclonal antibody binds to a flagellar epitope. Infect. Immun. 52 (1986) 549-554).

En virtud de estos análisis, que se llevaron a cabo con un gran número de sueros de pacientes procedentes de los distintos estadíos de la enfermedad, resultaron puntos de partida que con un único antígeno no siempre se determinan todos los infectados por B. burgdorferi. Se demostró que, ante todo en el caso de sueros con anticuerpos de IgM (infección reciente) se reconoce de manera particularmente frecuente, junto a la flagelina (p41), además, una proteína (pC) en el intervalo de 22 kD. La simultánea manifestación de los dos anticuerpos no era sin embargo obligatoria. Se podían encontrar tanto sueros que sólo poseían anticuerpos contra p41 o sólo anticuerpos contra la proteína pC (figuras 1 y 2a, transferencias de Western). En la neuroborreliosis es de gran importancia la detección de los anticuerpos formados intratecalmente en el líquido cefalorraquídeo. Las transferencias de Western con IgG en el caso de 12 pares de líquido cefalorraquídeo/suero de pacientes una meningorradiculitis linfocitaria Bannwarth demostraron en todos los casos una respuesta inmune intratecal local contra p41. En la fase tardía se encontraron, junto a anticuerpos de IgG contra la flagelina, sobre todo anticuerpos contra proteínas en el intervalo de 100 kD (p100) y en el intervalo de 17 kD (p17), que en los estadíos tempranos no se podían o sólo se podían raramente detectar. Por consiguiente, reactividades de anticuerpos contra las proteínas p17 y p100 son buenos marcadores para alcanzar el estadío III (figura 2b, transferencia de Western).

Con ayuda de estos cuatro antígenos puede alcanzarse una mejor estandarización de los ensayos.

Las proteínas p41, pC y p17 muestran, además, sólo una escasa reactividad cruzada por otras cepas de bacterias, y la proteína p100 se manifestó como una proteína específica del género con epítopos específicos de B. burgdorferi. En la Tabla 2 (reactividad de sueros inmunes contra diferentes agentes patógenos bacterianos con proteínas de B. burgdorferi) se recoge de manera sintetizada la reactividad cruzada de sueros contra diferentes agentes patógenos relacionados con antígenos de B. burgdorferi según el análisis de la transferencia de Western. En el caso de ensayos para purificar las cuatro proteínas (p41, pC, p17, p100) de extractos de B. burgdorferi, se demostró que se requieren grandes cantidades de material de partida. Una particular dificultad la ofrecía la purificación de p100, que está subrepresentada en el extracto total. Dado que el cultivo es complejo y caro, se hubieron de buscar posibilidades de tecnología genética para la preparación de estos antígenos. El análisis de sueros de pacientes mediante la transferencia de Western ha demostrado que con una combinación de p41, pC, p17 así como p100 como antígeno, producidas por tecnología genética, se puede realizar una determinación casi completa de todos los sueros positivos y, además, se da una correlación con la fase de la enfermedad.

Ejemplo 2 Producción por tecnología genética de p41 (flagelina) de B. burgdorferi en Escherichia coli

La zona codificante de p41 se obtuvo mediante amplificación del ADN por una "reacción en cadena de polimerasa" (PCR) a partir de una preparación de ADN total de B. burgdorferi (DSM-Nº 5662 P/Ko2/85). La secuencia, así obtenida, se puso a continuación bajo el control de promotores inducibles y, después de la transfección, se expresó en E. coli (Maniatis, T.; Fritsch, E.F.; Sambrook, J. (1982) Molecular cloning. Cold Spring Harbor).

Para ello, las células de B. burgdorferi se cultivaron durante 2 semanas a 37ºC en 2 1 de medio de Barbour-Stoenner-Kelly-(BSK) modificado (Preac-Mursic, V.; Wilske, B.; Schierz, G. (1986): European Borreliae burgdorferi isolated from humans and ticks -culture conditions and antibiotic susceptibility. Zbl. Bakt. Hyg. A 163, 112-118), se sedimentaron a 6000 rpm, se lavaron en tampón TEN (Tris-HCl 10 mM pH 7,6; EDTA 1 mM; NaCl 10 mM) y se resuspendieron en 20 ml de tampón de lisozima (sacarosa al 20%, Tris-HCl 50 mM pH 7,6, EDTA 50 mM, 5 mg/ml de lisozima). Después de la incubación durante 30 min. a 37ºC, los protoplastos resultantes por la acción de la lisozima sobre la pared celular se lisaron mediante la adición de 1 ml de SDS (dodecilsulfato de sodio) al 25%. Después de otros 10 min., se añadieron 4 ml de una solución de NaCl 5 M. La proteína se desnaturalizó mediante la adición de un mismo volumen de fenol saturado con TE (TE: Tris/HCl 10 mM pH 7,8, EDTA 1 mM). Mediante centrifugación a 4ºC y 6500 rpm durante 5 min. se efectuó la separación de las fases. La fase acuosa superior con contenido en ADN se transfirió cuidadosamente a un tubito reciente con una pipeta con una boca ancha (para evitar fuerzas de cizallamiento) y a continuación se extrajo otra vez con el mismo volumen de fenol/cloroformo/alcohol isoamílico (1:1:0,04). Después de la separación, la fase acuosa superior se transfirió de nuevo cuidadosamente a un nuevo tubito y el ADN se precipitó con el doble volumen de etanol. Después de aproximadamente 5 min., el ADN precipitado en forma de una estructura larga y a modo de hilo se retira mediante enrollamiento en una varilla de vidrio y se transfiere a una solución en etanol al 70% para el lavado. El ADN unido por adhesión a la varilla de vidrio se almacenó a continuación durante 2 h a la temperatura ambiente, con el fin de provocar una separación por evaporación del etanol y después se transfirió a 4 ml de tampón TEN.

En cada caso 1 \mul del ADN total de B. burgdorferi, así obtenido, se amplificó en cinco tandas PCR de 100 \mul.

Como cebador específico para la amplificación catalizada por polimerasa se eligieron secuencias que contenían la información para la iniciación de la traducción, así como el extremo 3' de p41 (flagelina). Para ello, se utilizaron las secuencias de ADN mostradas en la figura 3. Los dos oligodesoxinucleótidos se sintetizaron en un sintetizador de ADN Milligen/Biosearch 8700 en columnas de 1 \mumol, después de la disociación con amoníaco, se purificaron toscamente mediante precipitación con etanol y se recogieron en cada caso en 400 \mul de H_{2}O. Por cada tanda de PCR se emplearon en cada caso 1 \mul de esta solución de oligodesoxinucleótidos; los tampones, nucleótidos y la Taq-polimerasa procedían de un estuche de ensayo adquirible en el comercio (Cetus/Perkin-Elmer, Überlingen) y se utilizaron también según las prescripciones del ensayo. Las condiciones de temperatura para los distintos ciclos eran:

2 min. de desnaturalización a	94ºC
2 min. de reasociación a	45ºC
4 min. de síntesis de ADN a	73ºC

se llevaron a cabo 50 ciclos.

A continuación, las tandas procedentes de las PCR's se reunieron y el ADN se precipitó mediante la adición de NaCl con una concentración final de 0,2 M, con 2,5 veces la cantidad en etanol a -20ºC durante 5 h. Después de la sedimentación y el lavado en etanol al 70%, el ADN se disolvió en 200 \mul de H_{2}O y, después de la adición de correspondientes tampones, se separó con las enzimas de restricción Bam HI y Pst I (Boehringer Mannheim) según los datos del fabricante.

Después de la separación electroforética en un gel de agarosa al 1,5%, se aisló el fragmento de ADN amplificado (aprox. 1000 pb) y se insertó en un vector pUC8 cortado con BamHI y PstI (Pharmacia) (Vieira, J.; Messing, J. (1982): The pUC plasmids, and M13mp7-derived system for insertion mutagenesis and sequencing with synthetic universal primers. Gene 19, 259-268), empleándose 0,25 \mug del vector, 0,5 \mug del fragmento p41 y 2 unidades de T4-ADN-ligasa con tampón según las indicaciones del fabricante (Boehringer Mannhein).

Después de la transformación de los fragmentos ligados de ADN en la cepa de E. coli JM 109 (Pharmacia) (Yanisch-Perron, C.; Vieira, J.; Messing, J. (1985): Improved M13 phage cloning vectors and host strains: nucleotide sequences of the M13mp18 and pUC19 vectors. Gene 33, 103-119) y la extensión sobre placas de agar con ampicilina (50 \mug/ml) y X-Gal (30 \mug/ml) se cultivaron colonias blancas en 5 ml de medio L-Broth, y los plásmidos aislados se investigaron mediante disociación con enzimas de restricción en cuanto a sus inserciones.

El fragmento de ADN que codifica la flagelina de B. burgdorferi está asentado, por consiguiente, detrás del promotor lacUV5 inducible del vector en el mismo marco de lectura que el segmento transcrito que codifica lacZ\alpha, iniciado por este promotor. Con ello, resulta una flagelina que en su N-terminal contiene algunos aminoácidos codificadores de pUC8. Esta zona se recoge seguidamente:

5

De los clones E. coli positivos (por ejemplo pUC8 1y13), que contenían el vector con la inserción de ADN con la longitud esperada (1000 pb) se dispusieron de nuevo cultivos líquidos, y la transcripción del promotor lac del plásmido se indujo mediante inducción durante 3 horas con IPTG 1 mM a 37ºC y sacudimiento. 1,5 ml de estos cultivos se sedimentaron entonces durante breve tiempo, las bacterias se lisaron con una "mezcla hirviendo" (sacarosa al 3%, SDS al 2%, \beta-mercaptoetanol al 5%, Tris-HCl 20 mM pH 7,0, azul de bromofenol al 2%) a 100ºC durante 10 min., y las proteínas se separaron mediante PAGE con SDS al 17,5%. Mediante la tinción de las proteínas por azul brillante Coomasie, se demostró en las células con la inserción del plásmido una nueva banda adicional en aproximadamente 41 kD que corresponde al tamaño esperado de la flagelina. Una reacción específica de este antígeno recombinante con un suero de un paciente de borreliosis de Lyme así como con un anticuerpo monoclonal contra la flagelina p41 de B. burgdorferi se detecta en la inmunotransferencia mostrada en la figura 4.

Al igual que pUC8, también cualquier otro plásmido inducible que inicia una transcripción en el mismo marco de lectura, es adecuado para la producción de p41. Mediante la separación de la zona codificadora de p41 en la iniciación de la traducción con BspHI (TC ATG A) y PstI (en el extremo 3') e introducción del fragmento en el lugar NcoI (CC ATG G) y el lugar PstI de un denominado vector ATG, también es posible la expresión de una p41 auténtica que no tiene fusionados ningún tipo de aminoácidos extraños. Para los procedimientos mostrados a continuación, se utilizó el clon pUC81y17.

Ejemplo 3 Producción de pC, OspA y p100 en E. coli a partir de bancos de genes de B. burgdorferi

Para la puesta a disposición de secuencias de ADN específicas de B. burgdorferi se dispuso en E. coli un banco de genes cromosomal. Con ayuda de métodos adecuados, tales como inmunoevaluación o hibridación con oligonucleótidos elegidos, se pudieron identificar en este banco de genes clones de E. coli que contenían correspondientes secuencias de ADN específicas de B. burgdorferi. Después del análisis con enzimas de restricción, se preparó un mapa de enzimas de restricción. Este mapa se pudo utilizar con el fin de transformar deliberadamente las secuencias de ADN buscadas en vectores de expresión o de llevar a cabo su secuenciación. En este caso, se procedió en particular como sigue: para el aislamiento de ADN (ADN cromosómico, tal como ADN del plásmido) de B. burgdorferi (DSM-Nº 5662), las células se cultivaron tal como se describe en el Ejemplo 2. Después de la centrifugación a 12000 rpm durante 20 minutos, las células se lavaron y se resuspendieron en tampón SET (sacarosa al 20%, Tris-HCl 50 mM pH 7,6; EDTA 50 mM). Mediante la adición de 15 mg/5 ml de lisozima durante 20 minutos, la pared de la célula se separó parcialmente. A continuación, las células protoplastadas se lisaron mediante la adición de SDS (sal sódica de N-dodecilsulfato) con una concentración final de 1%. Después de 20 minutos a 37ºC, se añadió proteinasa K (concentración final 1 mg/ml) por dos veces durante 1 hora, y la solución con contenido en ADN se ajustó a NaCl 100 mM con tampón TEN (Tris-HCl 10 mM pH 7,6, EDTA 1 mM, NaCl 300 mM). Se realizaron una extracción con fenol y otras dos extracciones con fenol/cloroformo/alcohol iso-amílico (fenol:cloroformo en la relación 1:1; cloroformo:alcohol iso-amílico en la relación 24:1). El material sobrenadante, así extraído, se reunió con 2,5 volúmenes de etanol al 95% y el ADN se precipitó a -20ºC. Mediante el enrollamiento en una varilla de vidrio, se pudo obtener el ADN en forma de hilo precipitado y se pudo lavar en etanol al 70%. Después de un breve secado en el desecador, el ADN se recogió en tampón TE (Tris-HCl 10 mM pH 7,6, EDTA 1 mM) que contenía RNAsa (20 \mug/ml). El ADN, así preparado, se utilizó para las etapas ulteriores.

El ADN de B. burgdorferi se incubó con la enzima de restricción Sau 3A (Boehringer Mannheim) según las prescripciones del fabricante. Mediante la elección de diluciones adecuadas con enzima o de un tiempo de acción de la enzima sobre el ADN, se alcanzó una separación parcial del mismo. El ADN separado parcialmente, así obtenido, se ligó con ADN de vector (pUC18 u otro ADN de vector adecuado) restringido con BamHI y desfosforilado mediante tratamiento con fosfatasa alcalina. Para ello, se empleó T4-ADN-ligasa (Boehringer Manheim) según las prescripciones del fabricante. Por cada tanda de transformación se emplearon 0,2-0,5 \mug/\mul de ADN total. E. coli JM 109 (u otras cepas de E. coli adecuadas) se transformaron con el ADN ligado según el protocolo de Hanahan (Hanahan, D. (1985): Techniques of Transformation of Escherichia coli, págs. 109-135. En: D.M. Glover (ed.) DNA cloning, Vol. 1., A practical approach. IRL Press, Oxford) o según Maniatis et al., (Maniatis, T. (1982): Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York). Los clones de E. coli recombinantes se seleccionaron y cultivaron en medio LB (10 g de triptona, Difco, 5 g de extracto de levadura, Difco, 5 g de NaCl, Merck), que contenía 100 \mug/ml de ampicilina (u otro antibiótico adecuado). El modelo de colonia se transfirió de manera idéntica sobre placas LB y se prepararon réplicas de colonias sobre nitrocelulosa. Las células de estas réplicas de colonias se lisaron de manera diferente sobre el filtro, en función del procedimiento de evaluación empleado. En el caso de utilizar sueros monoclonales o policlonales (inmunoevaluación) para la detección de productos génicos específicos de B. burgdorferi, que son inducidos mediante el ADN incorporado por recombinación, las células se lisaron durante 15 min. a través de vapor de cloroformo saturado. Después de la saturación del filtro así tratado con una solución de leche desnatada durante 2 horas, los filtros se incubaron durante una noche con los distintos sueros, se lavaron varias veces con tampón TTBS (véase antes) y se incubaron durante 2 horas con el segundo anticuerpo conjugado con peroxidasa (Dako, Hamburgo). El lavado renovado con tampón TTBS servía para la reducción de anticuerpos conjugados con peroxidasa fijados de manera no específica. Mediante reacción enzimática de los sustratos diaminobencidina (Sigma Chemie, Munich) y H_{2}O_{2} en un pigmento pardo insoluble se pudieron reconocer clones de E. coli positivos, es decir, productores de antígenos de B. burgdorferi. Los clones de E. coli positivos, así reconocidos, se inocularon de la placa de partida y se analizaron. En el caso de emplear oligonucleótidos específicos para la hibridación y, por consiguiente, para la detección de secuencias específicas de antígenos de B. burgdorferi (evaluación mediante hibridación), las células se lisaron alcalinamente sobre el filtro de nitrocelulosa (Schleicher & Schuell) (por humectación de los filtros durante 5 minutos con NaOH 0,5 M, NaCl 1,5 M). Después de la neutralización (por humectación de los filtros durante 5 minutos en NaCl 1,5 M, Tris-HCl 0,5 M pH 8,0), los filtros se humectaron con el ADN desnaturalizado con 2x SSPE (20x SSPE: NaCl 3,6 M, NaH_{2}PO_{4} 200 mM, pH 7,4, EDTA 20 mM, pH 7,4) y se secaron. Mediante cocción de los filtros durante 2 horas a 80ºC, se fijó el ADN. Los filtros, así tratados, se emplearon entonces para la hibridación. La hibridación se efectuó con empleo de métodos de detección radiactivos (^{32}P) o no radiactivos (por ejemplo digoxigenina, Boehringer Mannheim). En este caso, se procedió según métodos de marcación (marcación con ^{32}P con ^{32}P-gamma-ATP y reacción de quinasa, o marcación con digoxigenina con Dig-11-UTP y reacción de transferasa terminal) conocidos (Maniatis, T. (1982): Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor) o aconsejados por el fabricante (Boehringer Mannheim). De los clones de E. coli positivos se constituyó un análisis con enzimas de restricción, y con esta información se llevó a cabo una expresión de las secuencias de ADN codificadoras de los antígenos en vectores adecuados o su secuenciación.

En calidad de sondas de hibridación se emplearon al comienzo oligodesoxinucleótidos sintéticos, cuyas secuencias se eligieron con ayuda de secuencias de aminoácidos de p100 y pC. En este caso, se procedió de la forma siguiente:

A partir de lisados de B. burgdorferi se purificaron parcialmente las dos proteínas por extracción con n-octil-\beta-D-tioglucopiranósido y se separaron ulteriormente mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS. A continuación, los antígenos se transfirieron a una matriz de fibra de vidrio mediante la transferencia de Western y se cortaron los trozos correspondientes con las proteínas de B. burgdorferi. Después, p100 se incorporó por secuenciación en el N-terminal y se determinaron los primeros 22 aminoácidos del amino-terminal (este método de la "microsecuenciación" se describe en: Eckerskorn, C., Mewes, W., Goretzki, H. y Lottspeich, F.: A new siliconized fiber as support for protein-chemical analysis of electroblotted proteins. Eur. J. Biochem. 176 (1988) 509-519). En el caso de pC no era posible una incorporación por secuenciación directa, ya que el N-terminal no es directamente accesible a una secuenciación, es decir en este caso se encuentran presentes eventualmente una miristilación o modificaciones similares. Por ello, esta proteína se separó trípticamente, los fragmentos se separaron mediante HPLC y después se incorporaron por secuenciación dos de ellos. A partir de las secuencias de aminoácidos, así obtenidas, se dedujeron entonces las secuencias de oligodesoxinucleótidos que se recogen seguidamente. Ya que la mayoría de las veces existen varias posibilidades de codones para un aminoácido, tuvieron que tenerse en cuenta en los correspondientes lugares del oligonucleótido también las variaciones de bases e incorporarse en relaciones equimolares durante la síntesis.

Secuencia de aminoácidos de p100-p1-p100:

Glu Leu Asp Lys Glu Lys Leu Lys Asp Phe Val Asn Leu Asp Leu Glu Phe Val Asn Thr

La secuencia del oligodesoxinucleótido de p100, las bases indicadas entre paréntesis y separadas por ";" se incorporaron durante la síntesis (en un sintetizador de ADN Milligen/Biosearch 8700) en relaciones equimolares:

6

La secuencia de oligodesoxinucleótidos se utilizó como sonda y se hibridó con los clones que contenían el ADN de B. burgdorferi. Después de la subclonación se obtuvo un clon que contiene el gen para p100. Se determinó la siguiente secuencia de ADN codificante de p100 (extremo 5') de la cepa PKo a una longitud de 346 pares de bases:

7

Después de la clonación completa, se determinó la siguiente secuencia de aminoácidos:

8

\hskip1.7cm

Secuencia de aminoácidos de la proteína p100

De manera análoga se sintetizaron, a través de las secuencias de aminoácidos de pC:

21

las correspondientes secuencias de oligodesoxinucleótidos: Secuencia de oligodesoxinucleótidos de pC-p1:

9

Secuencia de oligodesoxinucleótidos de pC-p2:

10

Después de hallar clones adecuados mediante hibridación y subclonación del gen deseado, se pudo determinar la siguiente secuencia de ADN codificante de pC de la cepa PKo a una longitud de 639 pares de bases:

11

La proteína pC presenta, a una longitud de 212 aminoácidos las siguientes secuencias:

12

\hskip0.3cm

Secuencia de aminoácidos de la proteína pC -22 kD-

De manera correspondiente también se determinó una parte de la secuencia de ADN codificante de OspA (extremo 5') de la cepa PKo a una longitud de 680 pares de bases:

13

Después de la secuenciación completa, se pudo determinar la siguiente secuencia de aminoácidos para la proteína de 31 kD:

14

\hskip1.5cm

Secuencia de aminoácidos de OspA (cepa PKo) Ejemplo 4 Purificación de los antígenos de B. burgdorferi producidos por vía recombinante a) En el ejemplo de la p41 (flagelina)

Un cultivo de una noche de 50 ml del clon pUC81y2 descrito en el Ejemplo 2 se añadió a 1,5 ml de medio de L-Broth de reciente aportación y se incubó a 37ºC y con intenso sacudimiento. Al alcanzar una densidad óptica de 0,7, el cultivo se indujo con IPTG en una concentración final de 1 mM y se incubó durante otras 3 h. Las bacterias se sedimentaron (6000 rpm, 10 min.), se resuspendieron en 300 ml de Tris-HCl 20 mM pH 8,0, EDTA 50 mM, 0,5 mg/ml de lisozima y se añadieron durante 45 min. a un baño de agua a 37ºC. Después de la adición de NaCl en una concentración final de 150 mM y Triton-X-100 en una concentración final de 1%, se incubó ulteriormente durante 45 min. a 37ºC, y la suspensión se trató a continuación con ultrasonidos por tres veces en cada caso durante 5 min. Los componentes insolubles se sedimentaron a 9000 rpm en el espacio de 30 min., se resuspendieron en Tris-HCl 20 mM pH 8,0, ditiotreitol 10 mM y octil-glucopiranósido al 1% (Sigma-Chemie, Munich) y se agitó durante 1 h a la temperatura ambiente. Después de la subsiguiente sedimentación de los componentes insolubles a 17000 rpm en el espacio de 30 min., el material sobrenadante se decantó cuidadosamente.

A continuación, el sedimento se resuspendió mediante agitación durante 2 h en 150 ml de Tris-HCl 20 mM pH 8,0, urea 8 M y \beta-mercaptoetanol al 1%. También aquí, los componentes insolubles se separaron de nuevo por centrifugación a 17000 rpm en el espacio de 30 min., y el material sobrenadante se bombeó sobre una columna de DEAE-Sephacel (Pharmacia, Freiburg) con un volumen de gel de 550 ml (3 cm de diámetro, 80 cm de altura). La elución del antígeno de p41 se efectuó en un gradiente de NaCl de 0-800 mM en un volumen total de 600 ml. La p41 recombinante se eluye a una concentración de NaCl de aproximadamente 0,25 M. Las correspondientes fracciones se reunieron y se purificaron ulteriormente mediante una HPLC con una columna Mono Q (intercambiador de aniones) (figura 4). En la figura 5 se muestra un perfil de elución con la p41 purificada en un gradiente de NaCl de 0-800 mM. Las fracciones p41-positivas de este caso (según el análisis de la transferencia de Western) se dializaron contra Tris-HCL 20 mM pH 8,0, MgCl_{2} 10 mM y \beta-mercaptoetanol al 0,1% y a continuación se utilizaron los ensayos mostrados en el Ejemplo 5. A partir de una purificación de p41 partiendo de 11 cultivos de bacterias puede esperarse típicamente un rendimiento de 5 a 10 mg.

Después de la secuenciación, se pudo determinar la siguiente secuencia de aminoácidos:

15

\hskip1.4cm

Secuencia de aminoácidos de la proteína p41 b) Purificación de antígeno pC de Borrelia burgdorferi recombinante a partir de E. coli

Un clon que contiene el gen para el antígeno pC (pDS1PC5) se inocula en 100 ml de L-Broth (con 50 \mug de ampicilina/ml), se deja crecer durante una noche y después se trasladan 900 ml de L-Broth/ampicilina -extracto de levadura doblemente concentrado/2 ml de glicerol-, se induce después de aproximadamente 1 h con IPTG 2 mM y se sacude ulteriormente durante 2-3 h.

Después de separar por centrifugación a 8000 rpm durante 10 min., el sedimento se resuspende en 20 ml de tampón de lisis (Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, EDTA 2 mM, DTE 0,1 mM, PMSF 0,1 mM; 0,4 mg/ml de lisozima). Después de agitar durante 30 min. a temperatura ambiente se efectúa la adición de Triton-X-100 (concentración final 0,1-0,2%). Adicionalmente, se añaden 10 \mul de benzonasa (Merck). Se agita durante otros 30 min. a temperatura ambiente. La solución ahora transparente se ajusta con NaCl sólido a NaCl 1 M y se agita durante otros 30 min.-60 min. (a 4ºC).

Después de la centrifugación a 4ºC, 30 min., a 15000 rpm, la proteína pC se encuentra cuantitativamente en el material sobrenadante. El sedimento se desecha. El material sobrenadante se dializa contra Tris-HCl 10 mM pH 8,0, efectuándose varias veces un cambio del tampón. Después de la centrifugación y/o filtración, se aplica sobre DEAE-Sepharose (Pharmacia), equilibrándose la columna con Tris-HCl 10 mM, pH 8,0. En la elución con NaCl 0 M, la proteína pC se encuentra en el 2º pico del recorrido. Las primeras fracciones se pueden desechar y el resto se recoge y recromatografía. La columna de separación se regenera con NaCl 1 M y se equilibra en Tris-HCl 10 mM pH 8,0. El antígeno, así obtenido, puede utilizarse entonces en un estuche de ensayo adecuado, por ejemplo un ELISA.

c) Purificación de antígeno OspA de Borrelia burgdorferi recombinante a partir de E. coli

Un clon que contiene el gen para el antígeno OspA (pDS10spA) se inocula en 100 ml de L-Broth (con 50 \mug de ampicilina/ml) y se cultiva durante una noche. El caldo del cultivo se transfiere a 900 ml de L-Broth/ampicilina -extracto de levadura doblemente concentrado/2 ml de glicerol-, después de aproximadamente 1 h se induce con IPTG 2 mM y se continúa sacudiendo durante 2-3 h.

Las células se separan por centrifugación a 6000 rpm, 5 min., y el sedimento se resuspende en 20 ml de tampón de lisis (Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, EDTA 2 mM, DTE 0,1 mM, PMSF 0,1 mM; 0,4 mg/ml de lisozima). Después de agitar durante 30 min. a la temperatura ambiente, se efectúa la adición de Triton-X 100 (concentración final 0,5-1%). Adicionalmente, se añaden 10 \mul de benzonasa (MERCK). Después de ello, se agita durante otros 30 min. a la temperatura ambiente.

La solución ahora transparente se ajusta con NaCl sólido a NaCl 1 M y se continúa agitando (a 4ºC). Después de la centrifugación a 4ºC durante 30 min. y a 15000 rpm, el OspA se encuentra casi cuantitativamente en el sedimento. El material sobrenadante se desecha, y el sedimento se resuspende en urea 2 M (con Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, EDTA 2 mM, DTE 0,1 mM). OspA se encuentra ahora en el material sobrenadante.

El material sobrenadante se dializa en la manguera de diálisis contra tampón MES 5 mM (ácido 2-[N-morfolino] etanosulfónico), pH 6,0, siendo absolutamente necesario cambiar varias veces el tampón. Después de la centrifugación y filtración, la proteína se aplica sobre una columna de flujo rápido de S-Sepharose (Pharmacia). Primero se lava con NaCl 0 M y luego se eluye con un gradiente de NaCl 0 a 1 M. El antígeno de OspA eluye en forma de un pico nítido en aproximadamente NaCl 0,4 M. Después de la diásilis contra Tris-HCl 10 mM, pH 7,5, el antígeno OspA puede utilizarse entonces en un estuche de ensayo adecuado, por ejemplo un ELISA.

Ejemplo 5 Empleo de antígenos (por ejemplo p41) de B. burgdorferi, producidos por vía recombinante, en el ELISA

Condicionado por la elevada pureza de los antígenos recombinantes producidos, son posibles ensayos específicos para B. burgdorferi que se pueden leer en la máquina y se pueden realizar sin una gran complejidad técnica y de personal.

Las placas de microtitulación se recubrieron en cada caso con 50 \mul de la p41 purificada (concentración 0,5-5 \mug/ml) por pocillo. Las placas se incubaron según métodos estándares a 4ºC durante una noche, se lavaron y los lugares de unión todavía libres se saturaron con solución de albúmina de suero bovino al 2%. A continuación, se añadieron a ello por pipeteado en cada caso 50 \mul de suero (dilución 1:200), se incubaron durante 2 h a 37ºC, las partes no unidas se separaron por lavado y los complejos inmunes unidos se detectaron en cada caso con 50 \mul de IgG anti-humana marcada con peroxidasa (solución 1:1000). Después de varios lavados, los pocillos se cargaron en cada caso con 100 \mul de ortofenilendiamina (concentración, 0,1% en tampón fosfato 0,1 M, pH 6,0 con H_{2}O_{2} al 0,03%) como reactivo de color, y la tinción llevada a cabo en la oscuridad se detuvo después de 10 min. con 100 \mul de ácido sulfúrico 1 N. La placa de microtitulación se evaluó en un fotómetro a 486 nm (figura 6).

En el ejemplo aquí mostrado, se ensayaron 7 sueros anti-B. burgdorferi positivos y 8 negativos. De los sueros Lyme-positivos, asegurados clínicamente, tres, que no mostraban ninguna reacción con p41 sobre tiras de la transferencia de Western con B. burgdorferi como antígeno, es decir representaban sueros del estadío temprano de la infección. Estos reaccionaron en el ELISA con el antígeno recombinante, asimismo sólo hasta un valor límite. Por el contrario, los sueros p41-positivos normales reaccionaron muy bien, mientras que los sueros Lyme-negativos permanecieron en el intervalo inferior a una DO = 0,3.

Ejemplo 6 Preparación de anticuerpos monoclonales específicos de B. burgdorferi

Ratones Balb/c hembras se inmunizaron intraperitonealmente con B. burgdorferi (DSM-Nº 5662). La 1ª inmunización se efectuó con coadyuvante completo de Freund, a la que siguieron 2-5 inmunizaciones adicionales con coadyuvante incompleto de Freund a intervalos de 2 semanas. 2 semanas después, el antígeno se aplicó sin coadyuvante y 3 días después se sacrificó a los ratones y se les retiró el bazo.

Los linfocitos del bazo se mezclaron con células de mieloma de ratón (Ag8-653) en la relación 1:1, se sedimentaron y se reunieron con solución de fusión (2,5 g de polietilenglicol (PEG), 2,5 ml de medio RPMI, 250 \mul de DMSO): adición durante 1 min. de la solución de fusión, incubación durante 90 s a 37ºC. Las células se sedimentaron de nuevo, se retiró el PEG y se añadió medio de cultivo (medio HAT). Por último, la suspensión de células se sembró en placas de microtitulación que contenían macrófagos como células cebadoras, y se cultivaron. Los materiales sobrenadantes del hibridoma se ensayaron sin dilución en la inmunofluorescencia indirecta (IFT) (Wilske, B.; Schierz, G.; Preac-Mursic, V.; Weber, K; Pfister, H.-W.; Einhäupl, K. (1984): Serological diagnosis of Erythema migrans disease and related disorders. Infection, 12, 331-337).

Los materiales sobrenadantes de células IFT-positivos se analizaron mediante la transferencia de Western. Hibridomas reactivos en la transferencia de Western se subclonaron 4 veces mediante "dilución limitante", y se identificaron en relación con su clase de inmunoglobulina y subclase de IgG.

De este modo, se obtuvieron los siguientes anticuerpos monoclonales (MAB):

1.

MAB contra p41:

(a)

L41 1C11

Este anticuerpo era reactivo con todas las 30 cepas de B. burgdorferi sometidas a ensayo y con borrelias de fiebre recurrente (a excepción de B. hermsii), pero no con treponemas.

(b)

L41 1D3

Este anticuerpo era reactivo con la mayoría (21 de 24) de las cepas de B. burgdorferi, pero no con las borrelias de fiebre recurrente y treponemas.

2.

MAB contra p100 (L100 1D4):

Este anticuerpo era reactivo con todas las 30 cepas de B. burgdorferi sometidas a ensayo, pero no con borrelias de fiebre recurrente o treponemas.

3.

MAB contra pC (L22 1F8):

Este MAB era reactivo con proteínas pC de cepas de la piel y del líquido cefalorraquídeo, y por el contrario eran negativas las proteínas pC de algunas pero no de todos los géneros de garrapatas.

4.

MAB contra OspA:

OspA es una proteína principal (intervalo de 30 kD) de la membrana externa de la mayoría de las cepas de B. burgdorferi. Las proteínas OspA de cepas europeas de B. burgdorferi son antigenéticamente heterogéneas y se diferencian antigenéticamente de las cepas americanas. Las pocas cepas OspA-negativas tienen proteínas pC.

(a)

L32 2E7

En total, de 32 cepas, 29 eran reactivas. Las cepas negativas no presentaban ninguna proteína OspA. Las 3 cepas negativas eran reactivas con el MAB L22 específico de pC.

(b)

L32 1G3:

Este MAB sólo era reactivo en 3 de 25 cepas sometidas a ensayo.

La combinación de MAB L32 2E7 y MAB L22 1F8, así como la reacción con MAB L100 1D4 permite la identificación de borrelias de B. burgdorferi y treponemas. Una identificación y diferenciación seguras de B. burgdorferi no era posible con los anticuerpos monoclonales disponibles hasta ahora.

Ejemplo 7 Determinación de la secuencia de aminoácidos de una proteína con un peso molecular de aproximadamente 22 kD a partir de otra cepa

Conforme a los métodos descritos en los ejemplos precedentes, se determinó la secuencia de aminoácidos de una proteína con un peso molecular de aproximadamente 22 kD. Esta proteína se clonó en otra cepa de borrelia y a continuación se secuenció. Esta cepa se depositó en la ATCC bajo el número 35210 y es generalmente accesible. En este caso, se determinó la siguiente secuencia de aminoácidos:

16

\hskip1cm

Secuencia de aminoácidos de proteína pC Ejemplo 8 Comparación de estuches de ensayos con proteínas conformes a la invención con respecto a aquellos en los que se utilizó un material tratado con ultrasonidos

Se sometieron a ensayo 74 sueros de pacientes con erisipeloide en cuanto a anticuerpos de IgM e IgG. Adicionalmente, se examinó un grupo testigo negativo de 100 donantes de sangre. En los ensayos se emplearon en una ocasión, conforme a métodos de realización de ensayo ELISA en sí conocidos, preparados de ultrasonidos de Borrelia burgdorferi. Por otra parte, se emplearon por separado y en común proteínas recombinantes preparadas conforme a la invención. Las siguientes Tablas muestran claramente que mediante el procedimiento conforme a la invención se puede conseguir una sensibilidad considerablemente más elevada en comparación con el empleo de material tratado con ultrasonidos.

Detección de anticuerpos de IgM

ELISA/antígeno	Erisipeloide (n=74)
Material tratado con ultrasonidos	20 27,0%
p41 (recomb.)	22 29,7%
OspA (recomb.)	7 9,4%
pC (recomb.)	26 35,1%
p41 y/o pC	34 45,9%
p41 y/o PC y/u OspA	34 45,9%

Detección de anticuerpos de IgG

ELISA/antígeno	Erisipeloide (n=74)
Material tratado con ultrasonidos	17 22,9%
p41 (recomb.)	23 31,1%
OspA (recomb.)	6 8,1%
pC (recomb.)	27 36,5%
p41 y/o pC	34 45,9%
p41 y/o PC y/u OspA	35 47,3%

Detección de anticuerpos IgG y/o IgM

ELISA/antígeno	Erisipeloide (n=74)
Material tratado con ultrasonidos	30 40%
p41 (recomb.)	39 53%
OspA (recomb.)	11 15%
pC (recomb.)	41 55%
p41 y/o pC	53 72%
p41 y/o PC y/u OspA	53 72%

Descripción de las figuras

Figuras 1 a y b

Reactividad de pacientes infectados con B. burgdorferi con lisados de 5 cepas diferentes de B. burgdorferi en la transferencia de Western

Se sometieron a ensayo sueros de los estadíos II y III (neuroborreliosis, estadío II (IgM e IgG); acrodermatitis (IgG) y artritis (IgG), estadio III). La respuesta inmune temprana es independiente de la cepa de ensayo contra un estrecho espectro de proteínas de borrelias (pC y p41). La respuesta inmune tardía está dirigida contra un amplio panel de proteínas de borrelias. Proteínas inmunodominantes son (independientemente de la cepa de ensayo) p100 (con peso molecular variable) y p41.

Figura 2 2a) Control del progreso (transferencia de Western con IgM) en el caso de erisipeloide

La proteína pC puede ser la proteína inmunodominante de la respuesta inmune temprana. Posteriormente, pueden aparecer anticuerpos contra p41 y sólo estar débilmente acusados. En el caso de una duración mayor de la enfermedad, también pueden manifestarse anticuerpos de IgM contra p17.

2b) Transferencia de Western con IgG en el caso de manifestaciones tardías

Los anticuerpos de IgG reconocen un amplio espectro de proteínas de borrelias. En el caso de emplear la cepa PKo, se manifiestan como proteínas inmunodominantes p17 y p100. p17 es fuertemente expresada por la cepa PKo (en contraposición con otras cepas; véase la figura 1). La flagelina p41 no fue reconocida en 2 de estos Ejemplos (sueros 1 y 2).

Figura 3 Esquema de la amplificación de ADN de la región codificadora de p41

A; segmento del ADN de B. burgdorferi con la región codificadora de p41 (segmento negro).

B; aumento del extremo 5' o 3' del gen de p41 con el de las respectivas secuencias de ADN. Se indica adicionalmente el comienzo de la traducción (ATG), así como el codón de terminación en el extremo 3' (TAA). Las secuencias de cebador utilizadas para la PCR están indicadas adicionalmente por debajo (cebador 1) o por encima (cebador 2) de la doble cadena de ADN codificadora de p41. Una hibridación del cebador sólo puede efectuarse con los respectivos extremos 3'. Los extremos 5' contienen partes no hibridantes, que representan lugares de corte para enzimas de restricción: GGATCC-BamHI; TCATGA-BspHI, en el extremo 5'; GACGTC-PstI en el extremo 3'.

Figura 4 Expresión, reactividad y purificación de p41 recombinante

Parte izquierda: gel de poliacrilamida con SDS teñido con azul Coomasie. Las distintas pistas estaban cargadas como sigue: 1, lisado de E. coli, testigo negativo; 2, lisado de E. coli con pUC81y17 después de inducción con IPTG, la p41 producida por vía recombinante se puede reconocer como banda adicional en el intervalo de aproximadamente 45 kDa; 3, material sobrenadante del lisado de 2 después de lisar las células tal como se describe en el Ejemplo 4; 4, fracción de sedimento de las células lisadas con la p41 recombinante; 5, material sobrenadante de octil-glucopiranósido; 6, como 5, pero fracción de sedimento; 7 - 10, fracciones después de la elución de p41 de una columna Mono Q a través de una gradiente de sales; las pistas 9 y 10 contienen p41 recombinante, condicionado por manifestaciones de degradación, así como por una traducción incompleta, se manifiestan, junto al producto completo, además pequeños fragmentos que se pueden encontrar también sin embargo en material de p41 auténtico de B. burgdorferi.

Parte derecha: transferencia de Western inmunocoloreada de un gel de SDS con muestras del gel teñido con Coomasie. La tinción inmunológica se llevó a cabo con un anticuerpo monoclonal descrito en el Ejemplo 6. Designación de las pistas o de las muestras, tal como gel teñido con Coomasie; pista 0, pista vacía.

Figura 5 Perfil de elución por HPLC de p41 de una columna de intercambiador de iones con un gradiente de sales

A continuación de la purificación del intercambiador de aniones (Mono Q de Pharmacia) de p41, el antígeno se volvió a dializar contra urea 4 M sin sal y, de nuevo, se añadió a la columna Mono Q con el fin de verificar la pureza. El perfil de elución ya sólo muestra un pico de adsorción de proteínas. El pico menor directamente delante de la porción principal corresponde al fragmento p41 visible en la figura 4, pista 8, con un tamaño de aproximadamente 30 kD (ensayado mediante transferencia de Western).

Figura 6 ELISA de IgG con p41 recombinante como antígeno

El antígeno recombinante purificado a través de un intercambiador de aniones (Mono Q) (véase la figura 5) se empleó en una concentración de 0,5 \mug/ml. Se sometieron a ensayo 7 sueros de pacientes con una borreliosis de Lyme definida clínicamente y 8 sueros de personas sanas. 4 sueros de los pacientes con borreliosis de Lyme eran fuertemente reactivos en la transferencia de Western con la p41 recombinante (= positivos), 3 sueros eran débilmente reactivos (= valor límite) y los sueros de las personas sanas no reaccionaron (= negativos). El ELISA de IgG mostró un resultado equiparable. Eje Y: densidad óptica a una longitud de onda de 486 nm; vl = valor límite.

Figura 7 Reactividad de anticuerpos monoclonales contra diferentes antígenos de B. burgdorferi

Seis anticuerpos monoclonales contra B. burgdorferi se sometieron a ensayo con 30 cepas diferentes de B. burgdorferi, 4 cepas de borrelias de fiebre recurrente y 2 treponemas distintos. En la figura se representan a título de ejemplo tres materiales aislados diferentes de B. burgdorferi (1 = B31, cepa americana; 2 = PKo, cepa alemana de la piel; 3 = PBi, cepa alemana del líquido cefalorraquídeo), una borrelia de fiebre recurrente (4 = B. hermsii) y una cepa de treponema (5 = T. phagedenis). Se emplearon los anticuerpos monoclonales preparados conforme al Ejemplo 6.

Claims (12)

1. Procedimiento para la preparación de una proteína inmunológicamente activa de Borrelia burgdorferi que se presenta en una forma libre de otras proteínas procedentes de Borrelia burgdorferi, y que

a) presenta la secuencia de aminoácidos

17

o una secuencia parcial de la misma de al menos 10 aminoácidos, o

b) presenta la secuencia de aminoácidos

18

o una secuencia parcial de la misma de al menos 10 aminoácidos, o

c) se compone de la secuencia de aminoácidos

19

o de la secuencia parcial de esta proteína con una deleción de 20-25 aminoácidos en el N-terminal de la proteína, o

d) presenta la secuencia de aminoácidos

20

200

o una secuencia parcial de la misma de al menos 10 aminoácidos, caracterizado porque se prepara por tecnología genética.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque la proteína inmunológicamente activa se puede preparar empleando ADN aislado de Borrelia burgdorferi.

3. Procedimiento según la reivindicación 2, caracterizado porque la proteína inmunológicamente activa se puede preparar empleando ADN aislado de Borrelia burgdorferi (DSM-Nº 5662).

4. Estuche de ensayo para la detección de anticuerpos contra cepas de borrelias, caracterizado porque contiene al menos una proteína inmunológicamente activa que se puede preparar según una de las reivindicaciones 1 a 3 y que puede reaccionar con los anticuerpos presentes en el líquido de investigación, y porque presenta al menos un componente indicador que posibilita la detección de complejos a base de proteína inmunológicamente activa y anticuer-
pos.

5. Estuche de ensayo según la reivindicación 4, caracterizado porque contiene 2 a 4 proteínas inmunológicamente activas que se pueden preparar según las reivindicaciones 1 a 3.

6. Estuche de ensayo según una de las reivindicaciones 4 ó 5, caracterizado porque el componente indicador es un anticuerpo dirigido contra el anticuerpo a detectar, que presenta una marcación.

7. Estuche de ensayo según la reivindicación 6, caracterizado porque la marcación consiste en un isótopo radiactivo.

8. Estuche de ensayo según una de las reivindicaciones 4 a 6, caracterizado porque la marcación consiste en una enzima que puede catalizar una reacción de color.

9. Estuche de ensayo según una de las reivindicaciones 4 ó 5, caracterizado porque la proteína inmunológicamente activa o un anticuerpo monoclonal dirigido contra ella está biotinilado, y el componente indicador es avidina o estreptoavidina con una enzima unida a ella de forma covalente, en particular peroxidasa.

10. Estuche de ensayo según una de las reivindicaciones 4 a 6, caracterizado porque es un estuche de ensayo ELISA.

11. Estuche de ensayo según la reivindicación 10, caracterizado porque está acoplada a placas de microtitulación al menos una proteína inmunológicamente activa según una de las reivindicaciones 1 a 3, y el componente indicador se compone de inmunoglobulina anti-humana, en particular anticuerpos de IgG y/o IgM, a los que está acoplada una enzima que cataliza una reacción de color.

12. Procedimiento para la preparación de vacunas para la protección contra infecciones, de bacterias borrelias, preferiblemente cepas de Borrelia burgdorferi, caracterizado porque se utilizan proteínas inmunológicamente activas que se pueden preparar según una de las reivindicaciones 1 a 3.