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Die Erfindung betrifft die Gewinnung
Borrelien-spezifischer Antigenfragmente aus dem mittleren Bereich
des Flagellins von Borrelia burgdorferi, die als Antigene für einen
empfindlichen und spezifischen Antikörpernachweis zur Erkennung
der durch Zecken übertragenen
Borreliose (Lyme-Borreliose) geeignet sind.
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Der Erreger Borrelia burgdorferi
verursacht beim Menschen eine multisystemische Infektion mir vielfältigen Krankheitserscheinungen
Die Infektion kann die Haut (Erythema chronicum migrans, Acrodermatitis chronica
atrophicans), das Nervengewebe (Polyradiculitis, Meningoenzephalitis,
Facialisparese) die Gelenke (Monoarthritis) und das Herz (Reizleitungsstörungen)
betreffen. Die Isolierung des Erregers ist schwierig und gelingt
nur selten. So beruht die Labordiagaostik auf dem Nachweis spezifscher
Antikörper.
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Stand der
Technik
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Gebräuchliche Verfahren und die
indirekte Immunfluoreszenz und verschiedene Anordnungen von Enzymimmunoassays.
Als Antigen verwendet werden entweder ganze Zellen oder Ultrasonikate
von Borrelia burgdorferi. Durch Auswahl bzw Anreicherung immundominanter
Antigene wie gereinigter Flagellen (Geißeln) von Borrelia burgdorferi
(Hansen et al. J. Clin. Microbiol. 26: 338–346, 1988; Hansen et al. J.
Clin. Microbiol. 29: 166–173,
1991) und einer mit Flagellin angereicherten Antigenpräparation
(Magnarelli et al. J. Infect. Dis. 159: 43–49, 1989) konnte die Spezifität der serologischen
Testverfahren verbessert werden.
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Kritik am
Stand der Technik
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Die bisherigen Teste sind noch unbefriedigend
sowohl hinsichtlich Sensibilität
als auch Spezifität
Die in der Frühphase
schwache Immunantwort wird mit diesen Testen nicht sicher erfaßt, es resultieren
relativ viel falsch negative Reaktionsausfälle. Die geringe Spezifität zeigt
sich daran, daß in
der Normalbevölkerung
ein relativ hoher Prozentsatz erhöhter Antikörpertiter gefunden wird, die
nicht mit klinischen Erscheinungen der Lyme-Borreliose in Zusammenhang gebracht
werden können.
Ursache hierfür
und offensichtlich kreuzreagierende Antikörper, die durch saprophytische
Spirochäten
oder andere Bakterien hervorgerufen werden, die Antigengemeinschaften
mir Borrelia burgdorfen aufweisen, wie z. B. das immundominante
60 KD Protein von B. burgdorferi, das als "Common Antigen" bei einer Vielzahl von Bakterien vorhanden
ist (Hansen et al. Infec. Imm. 56: 2047–2053, 1988 Kreuzreaktionen
sind daher vor allem bei der Verwendung von Ultrasonikaten oder ganzer
Zellen zu beobachten.
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Jedoch auch bei Verwendung von B.
burgdorfen Flagelln oder mit Flagellin angereicherter Antigenpräparationen
hat sich herausgestellt, daß der
Nachweis von Antikörpern
gegen das Flagellin im Immunblot keine hohe Spezifität besitzt
(Zöller
et al. J. Clin. Microbiol. 29. 174–182, 1991). Da Flagelline
aufgrund ihrer Funktion stark konservierte Proteine darstellen,
beruht die geringe Spezifität
auf Homologien zwischen den Flagellinen unterschiedlicher Bakterienspezies,
mit denen sich das Immunsystem des Menschen auseinanderzusetzen hat.
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Die Identifizierung Borrelienspezifischer
Epitope (umschriebene, mit spezifischen Antikörpern reagierende kleine Bezirke
auf dem Antigen) und die Isolierung von Teilstücken des Flagellins, die sowohl
immundominant als auch Borrelienspezifisch sind, sollte zu einem
spezifischeren und auch empfindlicheren Test führen. Die Sensitivität wird dadurch
erhöht,
daß durch
das Eliminieren kreuzreagierender Epitope bei der Verwendung B.
burgdorferispezifischer Fragmente im Testverfahren im Vergleich
zum intakten Flagellin mehr spezifische Epitope angeboten werden
können.
Durch die Reduktion unspezifischer Bindungen wird der Unterschied zwischen
positiv und negativ eines Testes erhöht.
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Das Flagellingen von Borrelia burgdorferi
(die Flagellen von B.b. besitzen nur einen Typ von Flagellin) wurde
kloniert, die DNA sequenziert und die Aminosäuresequenz des Flagellins daraus
abgeleitet Die Identität des
Proteins wurde durch Sequenzanalyse einiger tryptischer Peptide
des aus Borrelia burgdorferi isolierten Flagellins bestätigt. Ein
Vergleich der Aminosäuresequenz
des Flagellins von Borellia burgdorferi mit der von Escherichia
coli, Bacillus subtilis, Salmonelle typhimurium, Serratia marcescens
und Treponema pallidum ergab Homologien über große Bereiche an jeweils beiden
Enden der Flagellinmoleküle.
Die hiernach zu erwartende Kreuzantigenität zwischen Flagellinen nicht
verwandter Bakterienspezies konnte experimentell bestätigt werden
Antiseren von Kaninchen, die mit gereinigten Flagellen von Escherichia
coli, Bacillus subtilis, Salmonelle typhimurium oder Proteus mirabilis
immunisiert worden waren, reagierten im ELISA und Westernblot deutlich
mit dem Flagellin von Borrelia burgdorferi. Umgekehrt erkannten
Antiseren von Kaninchen, die mit dem Flagellin von Borrelia burgdorferi
immunisiert worden waren, die Flagelline von Treponema phagedenis, Escherichia
coli, Bacillus subtilis, Salmonelle typhimurium und Proteus mirabilis.
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Ein weiterer Kritikpunkt praktischer
Art ist die Tatsache, daß die
Isolierung von Flagellen oder auch von Flagellin aus in der Kultur
vermehrten B. burgdorferi arbeitsaufwendig und kostenintensiv ist
(Ultrazentrifugation, Dichtegradienten). Vorteilhafter ist, als
Ausgangsmaterial für
die Gewinnung spezifischer Fragmente rekombinantes Flagellin zu
verwenden. Desweiteren neigt Flagellin von B. burgdorferi, konventionell
isoliert oder als rekombinantes Protein hergestellt, in wäßrigen Lösungen zur
Aggregation, das Protein bleibt nur in Urea- oder Detergenz-haltigen
Puffern in Lösung.
Kleinere Fragmente dagegen sollten wasserlöslicher sein; dies ist ein
Vorteil, wenn man unlösliche
Träger,
wie z. B. Mikrotiterplatten, in reproduzierbarer Weise mit Antigen
beschichten möchte.
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Aufgabe
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Der vorliegenden Erfindung liegt
die Aufgabe zugrunde, durch die Verwendung spezifischer Fragmente
des B. burgdorferi Flagellins eine Verbesserung derSerologie hinsichtlich
Spezifität
zu erreichen.
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Eine Epitopanalyse mit überlappenden
Oktapeptiden des gesamten Flagellinmoleküls von B. burgdorferi ergab,
daß die
heterologen kreuzreagierenden Antiseren gegen Epitope am Amino-terminalen
Bereich (bis AS 131) und am Carboxy-terminalen Bereich (von AS 267
bis zum Ende des Moleküls
AS 336) gerichtet waren. Epitope des varablen mittleren Teiles wurden
von Antiseren erkannt, die durch Immunisierung mit Antigenpräparationen
erhalten wurden, die Borrelia burgdorferi-Flagellin enthielten.
Antiseren, die nur Epitope aus dem mittleren Teil des Borrelia burgdorferi-Flagellins
(AS 132 bis AS 266) erkannten, reagierten zwar nur Flagellin von
Borrelia hermsii, aber nicht mir Flagellinen von Treponema phagedenis,
Bacillus subtilis oder Escherichia coli im Immunoblot Borrelia hermsii,
Erreger von Zeckenrückfallfieber,
spielt in Europa keine Rolle.
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Eine starke Häufung der Borrelienspezifischen
Epitope fand sich zwischen den Aminosäuren 209 und 227.
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Aus diesen gewonnen Erkenntnissen
bietet sich die Verwendung eines Fragmentes aus dem mittleren Flagellinbereich
als spezifisches Antigen an. Das Flagellin steht als rekombinantes
Nichtfusionsprotein in ausreichender Menge zur Verfügung. Die
Verwendung von Fusionsproteinen, die Bereichen des mittleren Teils des
Flagellins von Borrelia burgdorferi entsprechen, ist nicht naheliegend,
da nach Collies und Peltz (Collins, C and Peltz, G, 1991, Inf. Immun.
59, 514–520)
die Immunantwort der Lyme-Borreliose-Patienten aussschließlich gegen
die konservierten Bereiche des Flagellins gerichtet sein soll Unsere
Ergebnisse mir Epitopen aus dem mittleren Teil des Flagellins widerlegen
diese Aussage.
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Lösung der Aufgabe
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Eine Lösung dieser Aufgabe besteht
in der Bereitstellung eines Proteinfragments aus dem mittleren Bereich
(Aminosäure
132 bis Aminosäure
266) des Flagellins von Borellia burgdorferi, das dadurch gekennzeichnet
ist, daß es
aus der Aminosäuresequenz
besteht.
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Ein solches Proteinfragment wird
vorzugsweise mittels eines Verfahrens hergestellt, bei dem durch proteolytische
oder chemische Spaltung des Flagellins von Borrelia burgdorferi
ein Fragment aus dem mittleren Borrelien-spezifischen Bereich (AS
132 bis AS 266) gewonnen wird.
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Als Ausgangsprotein für die Spaltung
wird vorteilhafterweise rekombinantes Borrelia burgdorferi Flagellin
(Nichtfusionsprotein) und als Protease wird vorteilhafterweise Trypsin
verwendet.
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Das Proteinfragment kann als rekombinantes
Nicht-Fusions-Protein, hergestellt werden.
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Das Proteinfragment nach Anspruch
1 wird vorzugsweise als Antigen zum labordiagnostischen Nachweis
von spezifischen Antikörpern
bei der Lyme-Borreliose verwendet. Zu diesem Zweck kann das Fragment allein
oder zusammen mit anderen borrelienspezifischen Antigenen an unlösliche Träger gebunden
sein und und Verdünnungen
von Patientenseren angeboten werden, um die Bindung der darin enthaltenen
Antikörper an
das Testantigen zu bestimmen. Alternativ kann das lösliche Fragment
in der wäßrigen Phase
vorher aus dem Patientenserum selektierten klassenspezifischen Antikörpern angeboten
und anschließend
das Ausmaß der
Bindung des Fragments an die klassenspezifischen Antikörper direkt
bzw. indirekt gemessen werden.
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Als Träger für das Testantigen werden vorzugsweise
mikroporöse
Membranen, Filterpapier, Mikrotiterplatten, Plastikröhrchen,
Latex-Partikel, Gelatinepartikel, Erythrozyten, verwendet.
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Die Bestimmung der borrelienspezifischen
Antikörper
kann klassenspezifisch und quantitativ erfolgen.
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Für
die genannte Verwendung des Proteinfragments sind Reagenzkits zur
Bestimmung von gegen das Testantigen gerichteten Antikörpern in
wäßrigen Testproben
vorgesehen, die durch ein erstes Reagenz, bestehend aus einem unlöslichen
Polymer, an das das Testantigen gebunden ist, ein zweites Reagenz,
bestehend aus einem Enzym-markierten Anti-Human Ig und ein drittes
Reagenz, bestehend aus einem geeigneten Substrat für das verwendete
Enzym gekennzeichnet sind.
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Als Alternative werden Reagenzkits
zur Bestimmung von gegen das Testantigen gerichteten Antikörpern vorgeschlagen,
die durch ein erstes Reagenz, das aus einem unlöslichen Polymer, an dem Anti-Human Ig
gebunden sind, besteht, ein zweites Reagenz, das aus löslichem
Testantigen besteht, ein drittes Reagenz, das aus enzymmarkierten
Antikörpern
spezifisch für
das Testantigen besteht, und ein viertes Reagenz, bestehend aus
einem geeigneten Substrat für
das Enzym, mit dem das Antiserum markiert ist, gekennzeichnet sind.
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Bei diesen Reagenzkits besteht die
Möglichkeit,
daß statt
des zweiten Reagenz direkt lösliches
enzymmarkiertes oder biotinylisiertes Testantigen angeboten wirdund
das Ausmaß des
gebundenen Antigens durch ein drittes Reagenz, bestehend aus einem
geeigneten Substrat, anschließend
quantifiziert werden kann.
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Ein Fragment des mittleren Bereiches
wurde durch proteolytischen Verdau des rekombinanten Flagellins
erhalten. Als eine geeignete Protease erwies sich Trypsin, das einen
großen
Teil des mittleren Bereiches des Flagellins intakt läßt. Mit
Staphylococcus aureus Protease V8 wird der variable Teil des Flagellins
in zu viele kleine Bruchstücke
zerlegt; es konnte kein Borrelien-spezifisches Fragment identifiziert
werden. Es ist allerdings denkbar, daß andere Proteasen, sowie die
chemische Spaltung mit Cyanbromid, ebenfalls erfolgreich verwendet
werden können.
Nach der Wanderungsgeschwindigkeit in der SDS-Gel-Elektrophorese
führt die Trypsinspaltung
zu einem 14KD großen
Fragment Durch N-terminale Sequenzierung und Aminosäureanalysen
des gereinigten 14KD Fragments konnte die genaue Zuordnung zum mittleren
Bereich ermittelt werden Das 14KD Fragment reicht von AS 175 bis
AS 252 (tatsächliches
MG 8,5KD) und liegt im Bereich der variablen Region (AS 132-AS 266),
die auch die meisten Borrelienspezifischen Epitope (AS 209 bis AS
227) tragt. Im Immunoblot und ELISA zeigte das Fragment im Gegensatz
zum intakten Flagellin keinerlei Kreuzreaktionen mit Kaninchen-Hyperimmunseren,
die gegen Flagellen von Bacillus subtilis, Escherichia coli, Salmonella
typhimurium, Treponema phagedenis und Proteus mirabilis gerichtet
waren. Schwache Kreuzreaktionen ergaben sich mit Kaninchenhyperimmunseren
gegen Borrelia hermsii, Borrelia turicatae und mit Borrelia parkeri.
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Letztere sind die Erreger der in
Nordamerika vorkommenden Formen des Rückfallfiebers; sie sind in Europa
von geringer Bedeutung. Im Vergleich zum gesamten Flagellin hat
ein Fragment aus dem Borrelienspezifischen mittleren Bereich zwei
wesentliche Vorteile: es macht den Antikörpernachweis zum einen spezifischer,
zum anderen auch sensitiver. Nur durch eine Borrelieninfektion selbst
hervorgerufene Antikörper
reagieren mit dem Fragment, nicht aber kreuzreagierende Antikörper. Die
in europäischen
Laboratorien geübte vorherige
Absorption der Patientenseren mit Kulturspirochäten wie Treponema phagedenis,
um die kreuzreagierenden Antikörper
zu entfernen, eliminiert nach unseren Erfahrungen nur einen Teil
dieser störenden
Antikörper.
Sie ist effektiv bei Luesantikörpern,
jedoch ungenügend
bei Vorliegen anderer kreuzreagierender Antikörper. Testung von mir Treponema
phagedenis absorbierten Humanseren im IgG-ELISA reduzierte eine
vorhandene Reaktion gegen Flagellen von E. coli und Bacillus subtilis
(und auch gegen Borrelia burgdorferi) nicht signifikant.
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Im folgenden sei beispielhaft die
Gewinnung des tryptischen 14 KD Fragmentes geschildert:
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Isolierung des rekombinanten
Flagellins.
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Der mit dem das Flagellingen tragende
Plasmid (pBb20) transformierte Escherichia coli Stamm HB191, der
ein Nichtfusionsprotein exprimiert, wird in 5 L Herz-Hirn Bouillon,
0,1 mg Ampicillin/ml enthaltend, für 24 Stunden bei 37° C bebrütet. Die
abzentrifugierten und gewaschenen Bakterien (ca. 10 g Feuchtgewicht) werden
in 100 ml 8M Urea (in 20 mM Imidazol pH 6,5) aufgenommen und in
einem 200 ml Erlenmeyerkolben auf dem Magnetrührer für zwei Stunden bei Zimmertemperatur
gerührt
Danach wird der Extrakt für
30 Minuten zentrifugiert und mit dem Überstand (Urea-Extrakt) direkt
eine DEAE-Anionenaustauschchromatographie durchgeführt Die
DEAE-Zellulose ist in 8M Urea äquilibrtert.
Die hochmolekularen Verunreinigungen sowie DNA und RNA werden von
der Säule
zurückgehalten,
das rekombinante Flagellin erscheint im Ausschußvolumen. Nach Dialyse gegen
Aqua bidest – das
Flagellin aggregiert – wird
das ausgefallene Protein in 50 mM MES und 8M Urea, pH 6,5 gelöst und über einen
Kationenaustauscher chromatographiert. Das rekombinante Flagellin
bindet unter diesen Bedingungen an den Kationenaustauscher und eluiert
im kontinuierlichen NaCl-Gradienten (0–1 M NaCl Das Flagellin ist
bis auf geringe Verunreinigungen mit niedermolekularen Peptiden
(< 30KD) sauber.
Letztere stören
im ELISA oder im Westernblot nicht Die Ausbeute an gereinigtem Flagellin
beträgt
insgesamt 12–16
mg pro 5 L Kultur.
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Tryptische
Verdauung
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Das gereiniegte Flagellin wird gegen
Aqua bidest dialysiert und ds aggregierte Protein in 0,1 M Tris/HCl
7,5 aufgenommen und die Proteinkonzentration auf 4 bis 6 mg/ml eingestellt
Zu 100 μg
Protein wird 1 μg
Trypsin zugegeben und bei 37°C
für mindestens
vier Stunden inkubiert. Die Isolierung des 14 KD Proteins erfolgt über FPLC-Gelfiltration.
Die Ausbeute an 14 KD Fragment beträgt ca. 3–6 mg (von der 5 L Escherichia coli
Kultur). Es ist im SDS-Gel frei von Verunreinigungen.
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Ausführungsbeispiel für den Nachweis
von Borrelienspezifischen Antikörpern
im Festphasen-ELISA mit dem rekombinanten Flagellin und dem 14KD-Protein
als Antigen
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Das rekombinante Flagellin und das
14 KD Fragment wurden im folgendes als Antigene in einem Festphasen-ELISA zum Nachweis
von IgG getestet.
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Gereinigtes rekombinantes Flagellin
und isoliertes 14KD-Fragment wurden in einer Konzentration von 0,25 μg/ml bzw
0,5 μg/ml
in 0,05 M Carbonatpuffer pH 9,6 aufgenommen. In jede Vertiefung
der Mikrotiterplatten werden 100 μl
gegeben und die Platten über
Nacht bei 4°C
stehengelassen. Die Antigen-beschichteten Plattem werden mit üblichem
Waschpuffer, enthaltend 0,2% Tween 20 in PBS, 5 × gewaschen.
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Bei –20° C halten sich die Platten mehrere
Monate lang. Die Ergebnisse des ELISA sind in den Tabellen 1 und
2 zusammengefaßt.
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Die mit intaktem Flagellin im ELISA
nicht selten gefündenen
erhöhten
Antikörpertiter
in Seren von Nicht-Borreliose-Patienten
sind mit dem 14KD-Fragment nicht zu beobachten (Tab. 1). Alle 14
Kontrollseren von Nicht-Borreliose-Patienten waren im ELISA mit
dem 14KD-Fragment negativ, während
einige falsch positive Reaktionsausfälle mit dem intakten Flagellin
auftraten (42%).
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Die Möglichkeit, im Test nur Borrelienspezifische
Bereiche des Flagellins als Antigen anzubieten, macht des Test auch
empfindlicher. Im ELISA hängt,
wie leicht einzusehen ist, die Menge der spezifischen Antikörper, die
gebunden werden können,
von der Antigenmenge ab, mit der die Festphase (Vertiefung der Mikrotiterplatte)
beschichtet werden kann. Der mittlere Borrelienspezifische Bereich
(AS 132 bis AS 266) macht etwa 38% des aus 336 Aminosäuren bestehenden
Gesamtmoleküls
aus. Bei Beschichtung der Mikrotiterplatten mit dem mittleren Fragment
statt mit dem gesamten Flagellinprotein dürften sich rechnerisch etwa
2,6 mal mehr Borrelienspezifische Antikörper binden Unter der Annahme,
daß alle
Borrelienspezifischen Antikörper vom
tryptischen 14KD-Fragment
erfaßt
werden, würde
die Empfindlichkeit um den Faktor 3 zunehmen. In der Realität ist die
Zunahme der Sensibilität
z. T. noch günstiger
(Tab. 2). Im ELISA sind die erzielten Antikörpertiter um 1 bis 4 geometrische
Titerstufen höher,
wenn man statt des gereinigten Flagellins das gereinigte 14KD-Fragment
als Antigen verwendet.
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Insgesamt schneidet der ELISA mit
dem 14KD Fragment als Testantigen wesentlich besser ab als bei Verwendung
des intakten Flagellins (Tab. 2). Von den 30 Seren werden mit dem
rekombinanten Flagellia als Antigen 18 (60%) als positiv erkannt,
mir dem 14 KD Fragment dagegen 27 (90%).
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Im Vergleich mit dem intakten Flagellin
ist der Test bei Verwendung des 14KD Fragmentes sowohl spezifischer
als auch sensitiver.
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Für
den Einsatz als Antigen z. B. im ELISA, ist es nötig, das 14 KD Fragment nach
dem Verdau des Flagellins zu reinigen, um kreuzreagierende kleine
Peptide des Flagellins und Kontaminationen mit Fragmenten von E.
coli Proteinen zu entfernen. Dies gelingt zuverlässig mittels Gelfiltration.
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Eine Kombination des 14KD-Fragmentes
mit anderen Borrelien- aber Nicht-Flagellin-Antigenen, wie dem 94/100KD-,
dem 34KD-, dem 31KD- und 21KD-Protein, gegen die in der Spätphase der
Infektion (Acrodermatitis chronica atrophicans, Arthritis) häufiger Antikörper gebildet
werden, könnte
zu einer weiteren Verbesserung eines Borrelienspezifischen Antikörpernachweises
führen.
Voraussetzung wäre,
daß die
verwendeten Antigene Borrelienspezifisch und frei von Kreuzreaktionen
mit Proteinen anderer Bakterien sind, was noch zu prüfen ist.
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Die Gewinnung von ausreichenden Mengen
an 14KD-Fragment oder anderer Fragmente aus dem mittleren Bereich
durch Verdau des rekombinanten Flagellins und die anschließende Reinigung
ist mit einem zumutbaren Arbeitsaufwand verbunden. Ökonomischer
könnte
es sein, entsprechende Genstücke
zu klonieren und Antigenfragmente als rekombinante Proteine zu exprimieren.
Dabei wären
Nichtfusionsproteine oder Fusionsproteine mit einem Abstandshalter
(linker) reinen Fusionsproteinen vorzuziehen. Ein Fusionsprotein des
gesamten variablen mittleren Bereiches erkannte im Immunoblot weniger
Borrelienspezifische Antikörper als
das tryptische 14KD Fragment.
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Der Antikörpernachweis mit dem tryptischen
14KD-Fragment kann im ELISA ohne weiteres klassenspezifisch in der
sogenannten Festphasenanordnung durchgeführt werden. Für den IgM-Antikörpernachweis muß lediglich
das Patientenserum vorher mit RF-Absorbens behandelt werden, um
störende
Rheumafaktoren zu entfernen. Eine andere Möglichkeit ist, die isolierte
IgM-Fraktion des Serums zu verwenden oder in einem sog. IgM-capture-Test
zunächst
die IgM-Globuline des Patientenserums selektiv zu binden, dann das
Antigenfragment direkt anzubieten (biotinyliert oder nicht biotinyliert)
und in einem weiteren Schritt entweder mit einem Enyzm-markierten
Antikörper
oder mir Enzymmarkiertem Avidin den Nachweis von spezifischen IgM-Antikörpern zu
führen.
besteht.
