DE69634003T2

DE69634003T2 - Hybrid-moleküle aus hitzelabilem enterotoxin und choleratoxin-b-untereinheiten

Info

Publication number: DE69634003T2
Application number: DE69634003T
Authority: DE
Inventors: Jan Holmgren; Michael Richard Lebens
Original assignee: Individual
Current assignee: Valneva Sweden AB
Priority date: 1995-05-05
Filing date: 1996-05-02
Publication date: 2005-12-29
Anticipated expiration: 2016-05-03
Also published as: CA2219943A1; WO1996034893A1; KR19990008290A; IL118136A; AU702637B2; JP4081140B2; ES2233968T3; EP0824548A1; IL118136A0; DE69634003D1; PT824548E; KR100492305B1; CN1154660C; DK0824548T3; US6019973A; CA2219943C; EP0824548B1; CN1189840A; SE9501682D0; AU5708596A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Hybridmoleküle zwischen hitzelabiler Enterotoxin-B-Untereinheit (LTB) und Choleratoxin-B-Untereinheit (CTB). Immunogene Proteine, umfassend solche Hybridmoleküle, optional fusioniert mit immunoreaktiven Aminosäuresequenzen von oder aus Zellen oder Viren, können als immunogene Komponenten in Vakzinen verwendet werden, z.B. in einem Breitspektrumvakzin gegen Enterotoxin-induzierte Diarrhoe.
Hintergrund
Cholera bleibt ein wichtiger Grund für Erkrankungen in vielen Entwicklungsländern und es wurde geschätzt, dass sie zu mehr als 200.000 Todesfällen pro Jahr führt. Eine Infektion mit enterotoxischem E. coli (ETEC) ist der häufigste Grund für eine Diarrhoe in Entwicklungsländern und bei Reisenden; sie ist verantwortlich für mehr als eine Milliarde Diarrhoe-Episoden und eine Million jährlicher Todesfälle. Die Infektion mit ETEC ist auch ein wichtiger Grund für eine Erkrankung bei Tieren. Sowohl für Cholera als auch ETEC-Infektionen besteht ein großer Bedarf an effektiven Vakzinen.
Sowohl bei Cholera als auch ETEC-Infektionen ist der Hauptgrund der Diarrhoe die Wirkung eines Enterotoxins, das durch die infizierenden Organismen im Verdauungstrakt freigesetzt wird; im Fall von Cholera das Choleratoxin (CT) und im Fall von ETEC das hitzelabile Enterotoxin (LT). Die beiden Toxine sind sowohl strukturell als auch funktionell eng verwandt und bestehen jeweils aus einer toxischen A-Untereinheit (CTA bzw. LTA), umgeben von fünf identischen B-Untereinheiten (CTB bzw. LTB) (Spangler, 1992). Die B-Untereinheit-Pentamere sind für die Bindung des Toxins an die GM1-Gangliosid-Rezeptoren verantwortlich, die auf der Oberfläche von intestinalen Epithelzellen vorliegen (Holmgren, 1981); LT kann auch an die strukturell verwandten Galactoproteinrezeptoren binden (Holmgren und Fredman, et al., 1982).
Obwohl beide Proteine interne Variationen in einigen Aminosäureresten aufweisen können, z.B. in humanen, gegenüber Tier-ETEC-Isolaten und bei klassischen, gegenüber El Tor Biotyp Cholerastämmen zeigen LTB und CTB einen hohen Homologiegrad mit 85%iger Konservierung von Aminosäuren im reifen Protein (1) und es gibt Beweise durch kristallografische Studien, dass LTB- und CTB-Pentamere auch strukturell ähnlich sind (Sixma und Pronk, et al., 1991, Sixma und Kalk, et al., 1993, Merritt und Sarfaty, et al., 1994). Es gibt auch einen hohen Grad einer immunologischen Kreuzreaktivität zwischen den beiden Molekülen (Svennerholm und Wickstrom, et al., 1986), trotz der Tatsache, dass der Hauptteil der Antikörper gegen strukturelle Merkmale von angesammelten Pentameren gerichtet ist; ein weiterer Indikator der strukturellen Ähnlichkeit zwischen den beiden Molekülen.
Es hat sich erwiesen, dass CT ein effektives orales Immunogen ist, das zu intestinalen IgA-Reaktionen führt, die im wesentlichen gegen die B-Untereinheit gerichtet sind. Weiterhin hat sich erwiesen, dass die orale Verabreichung von CTB allein effektiv ähnliche Reaktionen stimuliert und insbesondere hat es sich erwiesen, dass beim Menschen CTB ein starkes Immunogen in Abwesenheit von entweder Adjuvans oder toxischen Wirkungen des Holotoxins ist. Diese Reaktionen sind mit einem Schutz auf hohem Niveau, wenn auch von relativ kurzer Zeitdauer (ca. 6 bis 9 Monate) gegen eine Aussetzung oder natürliche Infektion gegenüber Vibrio cholerae verantwortlich sowie für ein sehr viel länger anhaltendes immunologisches Gedächtnis (Svennerholm und Sack, et al., 1982, Svennerholm und Gothefors, et al., 1984, Svennerholm und Jertborn, et al., 1984, Clemens und Sack, et al., 1990, Quiding und Nordström, et al., 1991).
Es scheint, dass die Antitoxin-Antikörper in ihrer Schutzwirkung synergistisch mit intestinalen IgA-Antikörpern wirken, die gegen mit Bakterienzellen assoziierte Antigene gerichtet sind, wie z.B. Lipopolysaccharid (LPS) von V. cholerae O1 (Svennerholm und Holmgren, 1976) oder des neuen Serotyps O139 (J. Holmgren, et al., nicht veröffentlicht). Basierend auf diesen Feststellungen wurde ein orales Vaccin gegen Cholera entwickelt, bestehend aus CTB zusammen mit abgetöteten ganzen Zellen von V. cholerae O1 (Holmgren und Svennerholm, et al., 1992), was zu einem Schutz geführt hat, der etliche Jahre anhält (Clemens und Sack, et al., 1990) und das zur Zeit modifiziert wird, um auch Zellen des O139-Serotyps einzuschließen.
Groß angelegte Feldversuche des B-Untereinheit-O1-Gesamtzellvaccins in Bangladesh demonstrierten zusätzlich zu dem gegen Cholera beobachteten Langzeitschutz signifikanten Kurzzeitkreuzreaktionsschutz gegen eine ETEC-Infektion aufgrund der CTB-Komponente (Clemens und Sack, et al., 1988(a)). Ein solcher Schutz gegen ETEC, der von dem Choleravaccin vermittelt wurde, wurde darauffolgend in einer Studie an finnischen Touristen bestätigt, die nach Marokko reisten (Peltola und Siitonen, et al., 1991). Basierend auf diesem wurde ein Vaccin mit einem breiteren Spektrum gegen ETEC entwickelt, worin CTB zusammen mit abgetötetem E. coli verwendet wird, der die Hauptkolonisierungsfaktor-Antigene exprimiert, die an der Adhäsion an das Intestinalepithel beteiligt sind (Svennerholm und Århen, et al., 1991). Die E. coli-Stämme wurden eingeschlossen, um eine Immunität gegen ETEC-Stämme bereitzustellen, die hitzestabile Enterotoxine (STa) entweder allein oder zusammen mit LT freisetzen.
In Bereichen, wo sowohl Cholera als auch ETEC endemisch sind, wäre es wünschenswert, ein einzelnes Vaccin zu haben, das gegen beide Infektionen effektiv schützen könnte. Dies könnte teilweise erreicht werden, indem der Schutz gegen ETEC, der von der CTB-Komponente des bereits zugelassenen Choleravaccins bereitgestellt wird, zu erhöhen. Obwohl LTB und CTB signifikante immunologische Kreuzreaktivität zeigen, ist die Neutralisierung von LT durch Serum von CTB-immunisierten Individuen nicht so effektiv wie dasselbe Serum bei der Neutralisierung von CT ist (Åhren und Wennerås, et al., 1993). Demgegenüber ist bekannt, dass Antiseren gegen LT oder LTB mit einem höheren Titer mit LT reagieren als mit CT (Svennerholm und Holmgren, et al., 1983). Es ist daher möglich, dass einige neutralisierende Epitope in LTB und CTB nicht vorliegen und umgekehrt. Dies wird weiter durch die Identifizierung von LTB-spezifischen neutralisierenden Antikörpern angezeigt (Svennerholm und Wickström, et al., 1986).
Der Einschluss von CTB sowohl in Cholera als auch ETEC-Vaccine hat zu der Entwicklung eines Expressionssystems für die Überproduktion von rekombinantem Protein geführt, das in großen Mengen und in vollständiger Abwesenheit der toxischen CTA-Untereinheit erzeugt werden kann (Sanchez und Holmgren, 1989, Lebens und Johansson, et al., 1993).
Dies hat auch einen Weg zu relativ einfachen Verfahren für die genetische Modifikation von CTB im wesentlichen für die Erzeugung von Proteinfusionen, die Fremdpeptid-Antigene tragen, eröffnet.
Die vorliegende Erfindung basiert auf einer Modifikation des Strukturgens, das CTB kodiert durch ortsgerichtete Mutagenese, resultierend in Hybridproteinen, worin die LTB-spezifischen Epitope in Proteine eingeführt wurden, die im wesentlichen CTB verblieben, wodurch solche Hybridmoleküle erzeugt wurden, die LTB-spezifische Epitope zusätzlich zu kreuzreaktiven und CTB-spezifischen trugen, um die immunologische Kreuzreaktivität zu erhöhen. Solche Hybrid-CTB/LTB-Moleküle wurden entwickelt, um ein Vaccin mit einem breiteren Spektrum für die Verhinderung oder Behandlung enterotixischer Krankheiten bereitzustellen.
Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft in einem Aspekt ein Hybridmolekül zwischen hitzelabiler Enterotoxin-B-Untereinheit (LTB) und Choleratoxin-B-Untereinheit (CTB), dadurch gekennzeichnet, dass das Molekül eine Aminosäuresequenz umfasst, die aus der Aminosäuresequenz von reifem CTB besteht, worin Aminosäurereste durch die korrespondierenden Aminosäurereste von reifem LTB substituiert sind, die LTB-spezifische Epitopeigenschaften an das immunogene reife CTB verleihen, so dass das Molekül LTB-spezifische Epitope zusätzlich zu den CTB-spezifischen Epitopen trägt.
In einem anderen Aspekt ist die Erfindung auf ein Hybridmolekül zwischen hitzelabiler Enterotoxin-B-Untereinheit (LTB) und Choleratoxin-B-Untereinheit (CTB) gerichtet, dadurch gekennzeichnet, dass das Molekül eine Aminosäuresequenz umfasst, die aus der Aminosäuresequenz von reifem LTB besteht, worin solche Aminosäurereste mit den korrespondierenden Aminosäureresten von reifem CTB substituiert sind, die CTB-spezifische Epitopeigenschaften an das immunogene reife LTB verleihen, so dass das Molekül CTB-spezifische Epitope zusätzlich zu den LTB-spezifischen Epitopen trägt.
In einer bevorzugten Ausführungsform weist das Hybridmolekül der Erfindung eine Aminosäuresequenz auf, die aus der Aminosäuresequenz von reifem CTB besteht, worin die Aminosäurereste an den Positionen 1, 94 und 95 durch die korrespondierenden Aminosäurereste von LTB ersetzt sind.
Gemäß einer anderen bevorzugten Ausführungsform weist das Hybridmolekül der Erfindung eine Aminosäuresequenz auf, die aus der Aminosäuresequenz von reifem CTB besteht, worin die Aminosäurereste in den Positionen 1 bis 25 durch die korrespondierenden Aminosäurereste von LTB ersetzt sind.
Die Aminosäuresequenzen von reifem CTB und reifem LTB sind in 1 dargestellt und beginnen mit Aminosäure +1. Korrespondierende Strukturgene sind in derselben Figur dargestellt.
Ein anderer Aspekt der Erfindung ist auf ein Strukturgen gerichtet, das für ein Hybridmolekül gemäß der Erfindung kodiert. Weiter ist die Erfindung auf ein Plasmid gerichtet, das ein solches Strukturgen enthält.
Noch ein weiterer Aspekt der Erfindung ist auf ein immunogenes Protein gerichtet, das ein Hybridmolekül gemäß der Erfindung umfasst.
In einer Ausführungsform dieses Aspekts der Erfindung ist das immunogene Protein ein Fusionsprotein des Hybridmoleküls der Erfindung und einer immunoreaktiven Aminosäuresequenz von oder aus einer prokaryotischen oder eukaryontischen Zelle oder einem Virus.
Noch ein weiterer Aspekt der Erfindung ist auf ein Vaccin gerichtet, das als immunisierenden Bestandteil eine immunologisch wirksame Menge eines immunogenen Proteins gemäß der Erfindung umfasst. Vorzugsweise ist das Vaccin gegen Enterotoxin-induzierte Krankheiten, wie z.B. Diarrhoe, gerichtet.
Das B-Untereinheitshybrid der Erfindung ist für seine Verwendung bei der Verhinderung oder Behandlung von Enterotoxin-induzierten Krankheiten bei einem Individuum (Tier oder Menschen) beabsichtigt, umfassend die Verabreichung einer immunologisch wirksamen Menge eines immunogenen Proteins gemäß der Erfindung an das Individuum.
Gemäß der Erfindung wird so ein immunogenes Protein der Erfindung zur Verwendung in einem Impfverfahren eines Individuums bereitgestellt.
Die Erfindung stellt auch die Verwendung eines immunogenen Proteins der Erfindung für die Herstellung eines Medikaments zur Verhinderung oder Behandlung von Enterotoxin-induzierten Krankheiten bei einem Individuum bereit.
Beschreibung der Zeichnungen
1: Vergleich zwischen den Sequenzen von LTB von einem menschlichen ETEC-Isolat (Leong, et al., 1985) und CTB (M. Lebens, nicht veröffentlicht). Für Unterschiede, die zu Aminosäureveränderungen führen, ist der Rest an der korrespondierenden Position von LTB oberhalb der DNA-Sequenz angegeben. Nummern unterhalb der CTB-Aminosäuresequenz geben die Position von Aminosäureresten in den reifen CTB- und LTB-Proteinen an.
2: Plasmide, die CTB/LTB-Hybride kodieren. In beiden Plasmiden werden die ctxB-abgeleiteten Gene von dem tac-Promotor exprimiert. a) pML-LCTBtacA wurde durch Insertion eines Gens erzeugt, worin das SacI/AccI-Fragment von pML-LCTBtac1 (21) durch synthetische Oligonukleotide ersetzt wurde, kodierend die ersten 25 Aminosäuren von LTB. Der Rest des ctxB-Gens war unverändert. Das Plasmid trägt das LTB-Signalpeptid und die Ribosomen-Bindungssequenzen, b) pML-LCTBtacB wurde aus pML-CTBtac durch PCR-gerichtete Mutagenese erzeugt, worin eine einzigartige EcoRI-Stelle eingeführt wurde und die Aminosäuren an den Positionen 94 und 95 wurden verändert, um zu der entsprechenden Position in LTB zu korrespondieren. Das Plasmid trägt das CTB-Signalpeptid und die lambda-Zellribosomen-Bindungssequenz. Veränderte Sequenzen sind in Kästchen dargestellt. Sequenzen zeigen nur die relevanten Regionen der Hybridgene.
3: IgG-Antikörperreaktion auf eine ip-Immunisierung mit entweder rCTB, rLTB oder den CTB/LTB-Hybridproteinen LCTBA (A) oder LCTBB (B) nach jeder von drei Immunisierungen (Gruppen 1,2 bzw. 3). Titer sind das Mittel von zwei Mäusen und wurden durch GM1-ELISA, wie beschrieben in Material und Methoden, bestimmt.
4: Wirkung der Absorption mit CTB auf Titer von CTB- und LTB-reaktiven Antikörpern in Seren von Mäusen, erhalten nach drei Immunisierungen mit entweder rCTB, rLTB oder den CTB/LTB-Hybridproteinen LCTBA oder LCTBB.
Herstellung der Hybrid-CTB/LTB-Moleküle der Erfindung
Die Hybrid-CTB/LTB-Moleküle der Erfindung können gemäß dem auf dem Gebiet zur Erzeugung von Peptiden und Proteinen bekannten Verfahren hergestellt werden, wie z.B. Gentechnik und/oder Peptidsynthese, z.B. gemäß Merrifield. Um die Präparation solcher Moleküle zu illustrieren, wurden zwei Hybrid-CTB/LTB-Moleküle der Erfindung wie folgt hergestellt.
Erzeugung von Hybrid-CTB/LTB-Molekülen
Die zwei in der Erfindung gegenwärtig verwendeten Hybridtoxingene wurden aus zwei unterschiedlichen CTB-Expressionsvektoren erzeugt. In dem ersten wurden die Modifikationen durch Insertion von synthetischen Oligonukleotiden zwischen geeigneten Restriktionsstellen innerhalb des ctxB-Gens erreicht und in dem zweiten wurden die Mutationen durch Verwendung von spezifischen Primern bei der PCR-Amplifikation des gesamten Plasmids, wie vorher beschrieben, erzeugt (Schödel und Milich, et al., 1991). Die zwei resultierenden Plasmide waren pML-LCTBtacA und pML-LCTBtacB, die die modifizierten ctxB-Gene trugen, deren Sequenzen durch DNA-Sequenzierung bestätigt wurden und in 2 angegeben sind. Das Hybridprotein LCTBA, exprimiert durch pML-LCTBtacA, ist zu LTB in seinen ersten 25 Amiosäuren und danach zu CTB identisch. Dasjenige, das durch pML-LCTBtacB exprimiert wird und als LCTBB bezeichnet wird, ist so verändert, dass es zu LTB an den Positionen 1, 94 und 95 korrespondiert, jedoch ansonsten zu nativem CTB von einem klassischen O1 V. cholerae Stamm 395 identisch ist.
Die Hybridproteine wurden in dem V. cholerae Stamm JS1569 exprimiert, was zu einer Anhäufung der Produkte im Wachstumsmedium führte, woraus sie durch Hexametaphosphat-Präzipitation, gefolgt von HPLC, gereinigt werden konnten.
Die Proteine erschienen auf der Grundlage von SDS PAGE als identisch zum Kontroll-CTB-Protein im Fall von LCTBA, schienen jedoch im Fall von LCTBB mehr wie LTB, insbesondere in monomerer Form, zu laufen.
Antigenanalyse der CTB/LTB-Hybride
Die zwei Hybridproteine wurden teilweise aus dem Wachstumsmedium von V. cholerae gereinigt, der die respektiven Expressionsvektoren trug und ei ner Vielzahl unterschiedlicher Assays unterzogen, um ihre antigenen Eigenschaften im Vergleich mit nativem CTB und LTB zu bestimmen.
Anfänglich fixierte Konzentrationen der unterschiedlichen Proteine wurden mit unterschiedlichen CTB- oder LTB-spezifischen Antikörpern in GM1-ELISA titriert. Das Verfahren würde Affinitätsunterschiede für einen oder beide von dem GM1-Rezeptor und den unterschiedlichen Nachweisantikörpern messen, jedoch haben wir bereits vorher gezeigt, dass die unterschiedlichen Proteine identisch an GM1 binden und dass die Unterschiede daher Antikörperspezifisch waren (Ergebnisse nicht dargestellt). Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 dargestellt. Es kann daraus abgelesen werden, dass das Profil der Titer, die für einen Bereich von sowohl monoklonalen Antikörpern als auch adsorbierten polyklonalen Antiseren erhalten wurden, zwischen Hybrid und nativen Proteinen differieren können. Die Ergebnisse zeigen an, dass das Hybridprotein LCTBA LTB-spezifische Epitope angenommen hat, die auf der Basis von Reaktionen mit monoklonalen Antikörpern erkannt werden können; insbesondere Epitope, die von den LTB-spezifischen monoklonalen Antikörpern LT33:8 und LT80:7 erkannt werden. Es reagiert jedoch immer noch mit dem CTB-spezifischen Antikörper CTWi. Dies wurde auch in Westernblots nachgewiesen.
Im Fall von LCTBB zeigte keiner der monoklonalen Antikörper, die verwendet wurden, irgendwelche Veränderungen in der Antigenizität des Hybridmoleküls. Hierfür gibt es zwei mögliche Erklärungen: eine ist diejenige, dass die relativ geringe Anzahl von Veränderungen im Molekül ein Screening mit einem größeren Bereich von Antikörpern nötig macht, um einen zu finden, der eine Affinität für das besondere Epitop demonstrieren würde. Alternativ könnten Assays, die auf GM1-ELISA basieren, keine Veränderungen im Bereich des Moleküls nachweisen, die innerhalb der GM1-Bindungsstelle versteckt liegen.
Immunisierungen mit Hybridproteinen führen zu kreuzreaktiven Antiseren.
Folgend auf die Immunisierung mit entweder LTB, CTB oder den unterschiedlichen Hybridmolekülen wurden die resultierenden Seren im Hinblick auf ihre Niveaus von Gesamt-Antikörpern gegen LTB und CTB und darauffolgend auf die Niveaus von LTB-spezifischen Antikörpern hin analysiert.
3 zeigt die Niveaus der Antikörper gegen CTB und LTB nach jeder der drei Immunisierungen. Vor der ersten Immunisierung gab es keine nachweisbaren Titer gegen irgendeine B-Untereinheit bei irgendeiner der überprüften Mäuse. In den Fällen von CTB und beiden Hybridproteinen waren die Titer gegen CTB konsistent höher als diejenigen gegen LTB. Bei den Mäusen, die mit LTB immunisiert worden waren, war die Situation umgekehrt. Bei mit CTB oder dem LCTBB-Hybridmolekül immunisierten Mäusen gab es keine signifikanten Unterschiede zwischen den gegen CTB und LTB nach den ersten und zweiten Immunisierungen erhaltenen relativen Titer. In beiden Fällen war der CTB-Titer deutlich höher als der gegen LTB. Bei mit LCTBA immunisierten Mäusen waren jedoch die Niveaus der Titer gegen LTB und CTB ähnlicher zueinander. Dies lag an einem erhöhten Niveau von Anti-LTB-Antikörpern und einem erniedrigten Niveau an Anti-CTB-Antikörpern im Vergleich mit den CTB- und LCTBB-immunisierten Mäusen. Nach der dritten Immunisierung kann gezeigt werden, dass bei beiden Gruppen mit Mäusen, die mit den Hybridmolekülen immunisiert wurden, die Anti-CTB-Titer ähnlich zu denjenigen bei Mäusen sind, die mit CTB immunisiert wurden, dass jedoch die Anti-LTB-Niveaus höher liegen.
Wenn Gesamtseren im Hinblick auf Titer von Antikörpern gegen LTB oder CTB überprüft wurden, ist die Überprüfung durch die Gegenwart von kreuzreaktiven Antikörpern unschärfer. Um zu bestimmen, ob die in den unterschiedlichen Seren beobachteten Unterschiede auf Veränderungen der Niveaus von LTB-spezifischen Antikörpern zurückzuführen waren, wurden die nach der dritten Immunisierung genommenen Seren mit CTB-Sepharose adsorbiert, um sowohl kreuzreaktive als auch CTB-spezifische Antikörper zu entfernen. Sie wurden dann im Hinblick auf Anti-CTB und Anti-LTB-Titer überprüft. Die Ergebnisse sind in 4 dargestellt. Es kann festgestellt werden, dass die Behandlung effektiv alle Anti-CTB-Antikörper aus den Seren entfernt. In mit CTB immunisierten Mäusen ist der gesamte beobachtete Anti-LTB-Titer auf kreuzreaktive Antikörper zurückzuführen und nach der Adsorption verbleiben keine LTB-reaktiven Antikörper. Im Fall von sowohl LCTBA als auch LCTBB verbleiben signifikante Anti-LTB-Titer, obwohl diese nicht so hoch sind wie bei Mäusen, die mit LTB immunisiert wurden. Es wird deutlich, dass die in das CTB-Molekül eingeführten Mutationen eine immunologische Wirkung aufweisen, die zu LTB-spezifischen Antikörpern führen. Es ist auch klar, dass in LCTBA, wo sieben Substitutionen im CTB-Molekül durchgeführt wurden, die Wirkung größer ist als bei LCTBB, wo es nur drei Substitutionen gab.
Neutralisierung von CT und LT durch unterschiedliche B-Untereinheits-Antiseren
Die unterschiedlichen Antiseren wurden in einem in-vitro-Assay im Hinblick auf ihre Fähigkeit zur Neutralisierung von entweder LT oder CT hin überprüft. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 dargestellt. Unter den in dem Assay verwendeten Bedingungen waren die CTB- und LTB-Antiseren nur leicht kreuzreaktiv. Das LTB-Antiserum neutralisierte CT bei keiner Verdünnung innerhalb des verwendeten Bereichs, während CTB-Antiserum eine leichte Wirkung auf LT aufwies. Demgegenüber hatten Antiseren gegen jedes der beiden Hybridmoleküle eine signifikante neutralisierende Aktivität gegen sowohl CT als auch LT. Selbst nach vollständiger Absorption der CT-neutralisierenden Aktivität der Antiseren mit CTB gab es immer noch eine signifikante LT-neutralisierende Aktivität. Diese Ergebnisse zeigen, dass die im CTB-Molekül durchgeführten Substitutionen neutralisierende LTB-Epitope einführen, während sie gleichzeitig die CT-neutralisierenden Epitope beibehalten. Es ist signifikant, dass das Niveau der neutralisierenden Aktivität, das gegen LT durch Antiserum von Mäusen, immunisiert mit LCTBB, demonstriert wurde, fast mit demjenigen vergleichbar ist, das bei Serum von LCTBA-immunisierten Mäusen angetroffen wird, trotz der Gegenwart von nur niedrigen Niveaus von LTB-spezifischen Antikörpern, wie getestet mit GM1-ELISA. Dies legt nahe, dass die Aminosäuren an den Positionen 94 und 95 der B-Untereinheitsstruktur einen Teil eines starken neutralisierenden Epitops bilden, das bei oder nahe der Rezeptor-Bindungsstelle lokalisiert sein könnte.
Zusammenfassung der Ergebnisse, die im experimentellen Teil der Beschreibung präsentiert werden
Die präsentierten Arbeiten beschreiben die Synthese und Analyse von zwei Hybrid-B-Untereinheits-Toxinmolekülen, die im wesentlichen aus CTB bestehen, worin Mutationen mit veränderten spezifischen Aminosäureresten eingeführt wurden, um den korrespondierenden Positionen bei menschlichem LTB zu entsprechen. Es hat sich erwiesen, dass die zwei Proteine auf hohem Niveau exprimiert werden und die essenziellen Eigenschaften von sowohl CTB als auch LTB beibehalten. Beide ordneten sich zu Pentameren an und beide banden an GM1-Gangliosid. Zusätzlich reagierten beide Moleküle ähnlich zu Wildtyp-CTB und -LTB mit dem kreuzreagierenden monoklonalen Antikörper LT39 und reagierten auch stark mit polyklonalen Antiseren gegen entweder CTB oder LTB. In Reaktionen mit anderen LTB- oder CTB-spezifischen monoklonalen Antikörpern konnten jedoch Unterschiede zwischen den unterschiedlichen Proteinen gemacht werden, die nahe legten, dass die neuen Proteine tatsächlich Epitope trugen, die für jedes der Wildtyp-Proteine auf demselben Molekül spezifisch waren. Dies wurde weiter durch Immunisierungsexperimente illustriert, die eine erhöhte Kreuzreaktivität von Seren demonstrierten, erhalten von Tieren, die mit den Hybrid-Proteinen immunisiert wurden. Es wurde demonstriert, dass in dem CHO-Zelltoxin-Neutralisierungsassay Antiseren gegen die Hybridmoleküle LT effektiver neutralisierten als Antiserum gegen CTB allein und dass diese Aktivität durch CTB nicht wegabsorbiert werden konnte.
Die zwei Hybridmoleküle, die in der gegenwärtigen Arbeit verwendet wurden, wurden erzeugt, um die Wirkung von Mutationen in unterschiedlichen Regionen des CTB-Moleküls zu illustrieren. In dem ersten Konstrukt wurde der Aminoterminus von CTB verändert, während in dem zweiten zwei Reste in einer Stellung nahe dem Carboxyterminus verändert wurden, von der angenommen wird, dass sie an der Substratspezifität der Rezeptorbindung beteiligt ist. Die Mutation Thr→Ala an Position 1 von LCTBB wurde in der gegenwärtigen Arbeit nicht untersucht. Das für Kontrollen verwendete rekombinante CTB wurde aus einem Expressionssystem erzeugt, das vorher beschrieben wurde (Lebens und Johansson, et al., 1993) und trug auch diese Mutation, von der bereits vorher gezeigt wurde, dass sie keine immunologische Signifikanz aufweist. (Lebens und Johansson, et al., 1993 und M. Lebens und J. Holmgren, nicht veröffentlicht).
Aus den Ergebnissen wird deutlich, dass die ausgedehntere Veränderung am Aminoterminus von CTB zu stärker LTB-spezifischen Antikörpern führt (wie definiert durch GM1-ELISA-Antikörpertiter, die nicht durch CTB-Sepharose wegabsorbiert wurden), im Vergleich mit den zwei-Rest-Veränderungen an den Positionen 94 und 95 des reifen Proteins, die zu nachweisbaren, aber sehr niedrigen Anti-LTB-spezifischen GM1-ELISA-Titern führten. von besonderem Interesse war daher die Feststellung, dass die Neutralisierung von LT (und CT) durch Antiseren zu den zwei mutierten B-Untereinheiten in der CHO-Zelle ähnlich war. Dies legt nahe, dass trotz der anscheinenden niedrigeren Titer von LTB-spezifischen Antikörpern, erzeugt durch das zweite Hybrid, die Antikörper eine äquivalente neutralisierende Wirkung aufwiesen, was anzeigt, dass die beiden Reste, die betroffen sind, innerhalb eines neutralisierenden Epitops liegen. Es wird weiter deutlich, dass es mehr als ein solches neutralisierendes Epitop auf den B-Untereinheitsmolekülen gibt, da keine der Mutanten die Fähigkeit zum Neutralisieren von CT verliert, trotz der Wahrscheinlichkeit, dass einige CTB-spezifische neutralisierende Epitope als Ergebnis der Substitutionen verloren gegangen sein könnten.
Die Kreuzreaktivität der mutierten CTB-Moleküle könnte spezifischen Veränderungen zugeschrieben werden, die erzeugt wurden, da diese zu LTB-spezifischen Antikörpern führten, die von einer CTB-spezifischen Immunosorbententfernung nicht betroffen waren, wie auch allen kreuzreaktiven Antikörpern, die zu einem vollständigen Verlust von CT-neutralisierender Akti vität im CHO-Zell-Assay führten. Die LT-neutralisierende Aktivität wurde jedoch beibehalten.
Aus diesen Untersuchungen wird deutlich, dass Hybridmoleküle, die sowohl CTB- als auch LTB-spezifische neutralisierende Epitope enthalten, erzeugt werden können. Zusätzlich ermöglicht das kürzlich beschriebene Überexpressionssystem für CTB, dass diese Proteine in großen Mengen erzeugt werden können. Auf diese Weise werden solche Moleküle nun für ihre Inkorporation entweder in getrennten Cholera- und ETEC-Vaccinen oder in ein einzelnes Breitspektrum-Vaccin bereitgestellt, das so entworfen ist, dass es einen signifikanten Schutz gegen beide Arten von Diarrhoe-Erkrankungen gibt.
Material und Methoden
Bakterielle Stämme und Plasmide
Die in der gegenwärtigen Arbeit für die Erzeugung von rekombinantem CTB (rCTB) und LTB (rLTB) und mutierten Derivaten verwendeten Stämme waren der O1 E1 Tor V. cholerae Stamm JBK70 (Kaper und Lockman, et al., 1984), und der klassische 01 V. cholerae Stamm JS1569 (Lebens und Johansson, et al., 1993). Stämme, die die geeigneten rekombinanten Plasmide trugen, wurden – eingefroren in einem Medium mit 20% Glycerin – bei –70°C gelagert. Die Kulturen wurden durch Ausstreichen jedes Stamms auf L-Agar, supplementiert mit Ampicillin, 100 μg/ml, wiederbelebt.
Plasmide, die in der gegenwärtigen Studie erzeugt wurden, sind in 2 dargestellt.
DNA-Manipulation
Die Manipulation der DNA, einschließlich der Plasmid-Präparation, der Verwendung von Restriktionsenzymen, einer DNA-Ligation und einer Agarosegelelektrophorese wurden gemäß den Standardverfahren durchgeführt, die im wesentlichen von Sambrook und Fritsch, et al. (1989) beschrieben werden. Restriktionsenzyme wurden in Puffern verwendet, die von den Herstellern zur Verfügung gestellt wurden. Die Oligonukleotide für die Insertion in Plasmide durch Ligation oder für die Vervielfältigung unter Verwendung von PCR wurden von Innovagen AB, Schweden, erhalten.
Es wurde eine PCR verwendet, um Mutationen in ein Plasmid-getragenes ctxB-Gen gemäß dem von Schödel und Milich, et al. (1991) beschriebenen Verfahren einzuführen. Die DNA-Sequenzierung wurde unter Verwendung des Sequenase, Version 2.0 Kits, erhalten von Amersham (UK) durchgeführt.
Herstellung von CTB und LTB und ihren mutierten Derivaten
Rohe rCTB und ihre Derivate wurden aus dem Stamm V. cholerae JS1569 hergestellt, der das relevante Expressionsplasmid trug. LTB wurde aus dem V. cholerae Stamm JBK70 hergestellt, der das Expressionsplasmid pMMB68 trug (Sandgvist und Hirst, et al., 1987).
Die Kulturen wurden auf modifizierter Syncase (Lebens und Johansson, et al., 1993) angezüchtet und das im Medium akkumulierte CTB oder LTB wurde durch Hexametaphosphatpräzipitation, wie vorher beschrieben, gewonnen (Lebens und Johansson, et al., 1993). Die Konzentration der B-Untereinheit, wie erhalten, wurde durch GM1-ELISA bestimmt (Svennerholm und Holmgren, 1978) und zwar unter Verwendung des kreuzreaktiven monoklonalen Antikörpers LT39.
Ein Verfahren zur weiteren Reinigung von LTB- und CTB-Derivaten wurde unter Verwendung von HPLC entwickelt. Hexametaphosphatpräzipitate werden in 20 mM Tris-HCl bei pH 9 wieder suspendiert. Die resultierende Suspension wurde dann bei 10.000 Upm 3 Minuten zentrifugiert und der Überstand, der die B-Untereinheit-enthielt, wurde durch einen 0,2 m sterilen Filter gefiltert. HPLC wurde auf einem Waters 600 Multisolvent Delivery System (Millipore Corp., USA) unter Verwendung einer DEAE Mem-Sep HP1000-Säule (Millipore Corp., USA) durchgeführt. Die B-Untereinheiten wurden zunächst an die Säule bei pH 9 (20 mM Tris-HCl) gebunden, und von der Säule mit 0,16 M (für LCTBA) oder 0,18 M (für LCTBB) Natriumacetat bei pH 8 eluiert.
In-vitro-Antigenizität und Proteinanalyse
Vertiefungen von Polystyrol-ELISA-Platten wurden mit 100 μl 0,3 nmol/ml GM1 Gangliosid 6 Stunden bei Raumtemperatur beschichtet und bei 4°C bis zur Verwendung erhalten. Die beschichteten Platten wurden zunächst mit zwei Veränderungen von PBS gewaschen und mit phosphatgepufferter Salzlösung, pH 7,2 (PBS), 0,1% (G/V) Rinderserumalbumin (BSA) 30 Minuten bei 37°C blockiert. Lösungen von 25 ng/ml von jeder B-Untereinheitspräparation wurden durch Verdünnung konzentrierter Ausgangslösungen in PBS, 0,1% BSA, erhalten. 100 ml Aliquots dieser verdünnten Proben wurden verwendet, um die blockierten Platten durch Inkubation für 1 Stunde bei Raumtemperatur zu beschichten.
Unterschiedliche Antikörperlösungen wurden dann der ersten Reihe der Platten zugefügt und mit 5fachen seriellen Verdünnungen titriert. Die an die B-Untereinheiten gebundenen Antikörper wurden dann mit einem sekundären Anti-Maus- oder Anti-Kaninchen-Immunglobulin, konjugiert mit Meerrettichperoxidase (HRP) (Jackson, Pa., USA) nachgewiesen. Nach Inkubation bei Raumtemperatur für 1 Stunde wurde die Bindung der Antikörper unter Verwendung des chromogenen Substrats o-Phenylendiamin (OPD) und H₂O₂ in Citratpuffer (pH 4,5), wie vorher beschrieben, (Svennerholm und Holmgren, 1978) nachgewiesen. Die Platten wurden dreimal mit PBS, 0,05% Tween zwischen jedem Schritt gewaschen. Die Titer wurden als reziproke Verdünnung, die eine Absorption bei 450 nm von 0,4 überhalb des Hintergrunds nach einer Reaktionszeit von 10 Minuten gibt, bestimmt.
Die SDS-Polyacrylamid-Elektrophorese und Elektrotransfer von gelösten Proteinen auf Nitrocellulose wurde unter Verwendung des Mini-Protean II-Apparats, erhalten von Biorad (CA, USA) unter den von den Herstellern empfohlenen Bedingungen durchgeführt.
Immunisierungen von Mäusen
Paare von C57/Black-Mäusen wurden dreimal intraperitoneal mit entweder CTB, LTB oder den mutierten CTB-Derivaten immunisiert. Die beiden ersten Dosen enthielten 10 mg B-Untereinheit, verabreicht in 200 ml enthaltend Freunds inkomplettes Adjuvans, und wurden mit 10 Tagen Abstand verabreicht. Die dritte Dosis der 20 mg B-Untereinheit wurde ohne irgendein Adjuvans 14 Tage nach der zweiten Dosis verabreicht. Den Mäusen wurde vor den ersten beiden Dosen Blut entnommen und sie wurden 7 Tage nach der dritten Dosis geopfert, woraufhin das Blut für die Analyse gesammelt wurde. Die Seren wurden hergestellt und bis zur Verwendung bei –20°C gelagert.
Serumtiter-Bestimmung
Die von den Immunisierungen erhaltenen Seren wurden durch GM1-ELISA (Svennerholm und Holmgren, 1978) getestet. Direkt vor der Verwendung wurden GM1-beschichtete Platten zunächst zweimal mit PBS gewaschen und dann mit PBS, 0,1% BSA bei 37°C für 30 Minuten blockiert. Die Platten wurden dann in zwei Gruppen unterteilt. 100 μl CTB, 0,5 μg/ml in PBS, 0,1% BSA wurde zu den Vertiefungen der ersten Gruppe der Platten zugefügt und 100 μl LTB, 0,5 μg/ml in PBS, 0,1% BSA wurde zu den Vertiefungen der zweiten Gruppe zugefügt. Die Platten wurden dann bei Raumtemperatur eine Stunde inkubiert und dreimal mit PBS, 0,05% Tween gewaschen. 100 μl einer Lösung PBS, 0,1% BSA, 0,05% Tween wurde dann allen Vertiefungen außer denjenigen in der ersten Reihe zugefügt. Zu Vertiefungen in der ersten Reihe wurden 150 ml Aliquots von 1/1000 Verdünnungen der Seren in PBS, 0,1% BSA zugefügt. Diese wurden dann mit seriellen Dreifach-Verdünnungen austitriert und bei Raumtemperatur 1 Stunde inkubiert. Nach drei Waschschritten mit PBS, 0,05% Tween wurden an CTB und LTB gebundene Antikörper durch Inkubation mit Anti-Maus-IgG, konjugiert mit HRP (Jackson, Pa., USA) bewertet. Das chromogene Substrat war OPD und die Titer wurden auf dieselbe Weise für die Bestimmung der oben beschriebenen in-vitro-Antigenizität berechnet.
CT8-Antikörper-Absorption
Die Seren wurden mit CTB-Sepharosekügelchen absorbiert, um sowohl CTB-spezifische Antikörper als auch Antikörper, die mit LTB kreuzreagieren würden, zu entfernen. CTB-Sepharose wurde durch kovalente Bindung von CTB-Pentameren an Cyanogenbromid-aktivierte Sepharose (Pharmacia AB, Schweden) gemäß den Anweisungen des Herstellers hergestellt.
Die Seren wurden zunächst 1:10 in PBS verdünnt. 100 μl dieser Verdünnung wurde in einem Mikrozentrifugenröhrchen mit 50 μl Sepharose-CTB-Kügelchen mit abwechselndem Schütteln für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Sie wurden dann bei 9000 Upm in einer Benchtop-Mikrozentrifuge 2 Minuten zentrifugiert und der Überstand wurde wiedergewonnen. Das Verfahren wurde dann wiederholt. Absorbierte Seren wurden, wie oben beschrieben, gegen CTB und LTB durch GM1-ELISA überprüft.
Toxia-Neutralisierungstests
Die nach der dritten Immunisierung von Mäusen mit den verschiedenen CTB-Derivaten und LTB erhaltenen Seren wurden in einem chinesischen Hamster-Ovar(CHO)-Zellassay (Guerrant und Brunton, et al., 1974) im Hinblick auf ihre Fähigkeit zur Inhibition der Toxizität von CT oder LT vor und nach Adsorption mit CTB-Sepharose getestet. Nicht-absorbierte Seren wurden zunächst 1:20 verdünnt. 50 ml Aliquots der resultierenden Seren wurden dann seriell im Duplikat in Mikrotiterplatten mit Dreifachverdünnungen verdünnt. Zu der ersten Gruppe von Duplikatvertiefungen wurden 0,2 ng CT in 50 μl HAM F12 Medium, enthaltend 1% BSA zugefügt und zu der zweiten Gruppe wurde eine Lösung von LT im selben Medium zugefügt. Die Platten wurden 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert, woraufhin 100 μl einer Suspension von 2 × 10⁵ Zellen/ml in F12 HAM Medium zu allen Vertiefungen zugefügt wurde. Man ließ die Inkubation 1 Stunde bei 37°C in einer 10% CO₂, 5% O₂-Atmosphäre fortschreiten. Die Zellen wurden mit Methanol fixiert und mit Giemsa-Lösung (Merck) gefärbt. Die Zellen wurden im Hinblick auf Schäden durch Lichtmikroskopie überprüft. Dasselbe Verfahren wurde auf die Seren angewandt, nachdem sie an die CTB-Sepharosekügelchen absorbiert worden waren. Alle Experimente wurden doppelt durchgeführt.
Literaturliste

(a) Clemens, J., Sack, D., Harris, J. R. J., Chakraborty, J., Neogy, P. K., Stanton, B., Huda, N., Khan, M. U., Kay, B. A., Khan, M. R., Ansaruzzaman, M., Yunus, M., Rao, M. R., Svennerholm A.–M. und Holmgren, J. (1988) J. Infect. Dis. 158, 372–377.
(b) Clemens, J., Sack, D., Harris, J. R. J., van Loon, F., Chakraborty, J., Ahmed, F., Rao, M. R., Khan, M. R., Yunus, M., Huda, N., Stanton, B., Kay, B. A., Walter, S., Eeckels, R., Svennerholm A.–M. und Holmgren, J. (1990) Lancet i, 270–273.
Guerrant, R. L.; Brunton, L. L.; Schnaitman, R. C.; Rebhun; L. I.; und Gliman, A. G. (1974) Infect. Immun. 10, 320–327
Holmgren, J. (1981) Nature 292, 413–417.
Holmgren, J., Fredman, P., Lindblad, M., Svennerholm, A.–M. und Svennerholm, L. (1982) Infect. Immun. 38, 424–433.
Holmgren, J., Svennerholm, A.–M.; Jertborn, M.; Clemens, J.; Sack, D. A.; Salenstedt, R. und Wigzell, H. (1992) Vaccine 10, 911–914.
Quiding, M., Nordström, I., Kilander, A., Andersson, G., Hanson L.–Å., Holmgren, J. und Czerkinsky C. (1991) J. Clin. Invest. 88, 143–148. Kaper, J. B., Lockman, H., Baldini, M. M. und Levine, M. M. (1984) Nature 308, 655–658.
Lebens, M., Johansson, S., Osek, J., Lindblad, M. und Holmgren; J. (1993) BioTechnology 11, 1574–1578.
Leong, J., Vinal, A. C. und Dallas, W. S. (1985) Infect. Immun. 48, 73–78.
Merrit, E. A., Sarfaty, S., van den Akker, F., L'Hoir, C., Martial, J. A., und Hol, W. G. J. (1994) Prot. Sci. 3, 166–175.
Peltola, H., Siitonen, A., Kyrönseppä, H., Simula, 2., Mattila, L., Oksanen, P., Kataja, M. J. und Cadoz, M. (1991) Lancet 338, 1285–1289. Sambrook, J., Fritsch, E. F. und Maniatis, T. (1989) Molecular cloning. A laboratory manual (2. Auflage) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y.
Sanchez, J., und Holmgren, J. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci USA 86, 481–485.
Sandkvist, M., Hirst, T. und Bagdasarian, M. (1987) J. Bacteriol. 169, 4570–4576.
Schödel, F., Milich, D. R. und Will, H. (1991) In Brown, F., Chanock, R. M., Ginsberg, H. S und Lerner, R. A. (Herausgeber), Vaccines 91, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. Seiten 319–325.
Sixma, T. K., Kalk, K. H., van Zanten, B. A. M., Dauter, Z., Kingma, J., Witholt, B. und Hol, W. G. J. (1993) J Mol. Biol. 230, 890–918.
Sixma, T. K., Pronk, S. E., Kalk, K. H., Wartner, E. S., van Zanten, B. A. M., Witholt, B. und Hol, W. G. J. (1991) Nature 351, 371–378. Spangler, B. D. (1992) Microbiol. Rev. 56, 622–647.
Svennerholm, A.–M., Gothefors, L., Sack, D. A., Bardhan, P. K. und Holmgren J. (1984) Bull. WHO. 62, 909–918.
Svennerholm, A.–M. und Holmgren, J. (1976) Infect. Immun. 13, 735–740.
Svennerholm A.–M. und Holmgren, J. (1978) Curr. Microbiol. 1, 19–23.
Svennerholm, A.–M., Holmgren, J., Black, R., Levine, M. und Merson. M. M. (1983) J. Infect. Dis. 147, 514–522.
Svennerholm, A.–M., Jertborn, M., Gothefors, L., Karim, A. M. M. M., Sack, D. A. und Holmgren J. (1984) J. Infect. Dis. 149, 884–893.
Svennerholm, A.–M., Wickström, M., Lindblad, M., und Holmgren, J. (1986) Med. Biol. 64, 23–30.
Svennerholm, A.–M., Sack, D. A., Holmgren J. und Bardhan, P. K. (1982) Lancet i, 305–308.
Svennerholm, A.–M., Åhren, C., Wennerås, C. und Holmgren, J. (1991) In Wadström, T., Mekele, H., Svennerholm, A.–M. und Wolf-Watz, H. (Herausgeber) Molecular pathogenesis of gastrointestinal infections Plenum, London. Seiten 287–294.
Ahrén, C., Wennerås, C., Holmgren, J. und Svennerholm, A.–M. (1993) Vaccine 11, 929–935.

Tabelle 1 Erzeugung von LTS-spezifischen Epitopen mit Rückhalt von CTB-Epitopen in Hybrid-Proteinen
Tabelle 2

Claims

Hybridmolekül zwischen der Untereinheit B des hitzelabilen Enterotoxins (LTB) und der Untereinheit B des Choleratoxins (CTB), dadurch gekennzeichnet, dass das Molekül eine Aminosäuresequenz, bestehend aus der Aminosäuresequenz von reifer CTB aufweist, in welcher Aminosäurereste durch die entsprechenden Aminosäurereste von reifer LTB substituiert sind, die der immunogenen reifen CTB LTB-spezifische Epitopmerkmale verleihen, so dass das Molekül zusätzlich zu den CTB-spezifischen Epitopen LTB-spezifische Epitope aufweist.
Hybridmolekül zwischen der hitzelabilen Untereinheit B des Enterotoxins (LTB) und der Untereinheit B des Choleratoxins (CTB), dadurch gekennzeichnet, dass das Molekül eine Aminosäuresequenz, bestehend aus der Aminosäuresequenz von reifer LTB aufweist, in welcher Aminosäurereste durch die entsprechenden Aminosäurereste von reifer CTB substituiert sind, die der immunogenen reifen LTB CTB-spezifische Epitopmerkmale verleihen, so dass das Molekül zusätzlich zu den LTB-spezifischen Epitopen CTB-spezifische Epitope aufweist.
Hybridmolekül nach Anspruch 1, worin die genannte Aminosäuresequenz aus der Aminosäuresequenz von reifer CTB besteht, in der die Aminosäurereste an den Positionen 1, 94 und 95 durch die entsprechenden Aminosäurereste von LTB substituiert sind.
Hybridmolekül nach Anspruch 1, worin die genannte Aminosäuresequenz aus der Aminosäuresequenz von reifer CTB besteht, in der die Aminosäurereste an den Positionen 1–25 durch die entsprechenden Aminosäurereste von LTB substituiert sind.
Strukturgen, welches für ein Hybridmolekül nach einem der Ansprüche 1–4 kodiert.
Plasmid, welches ein Strukturgen nach Anspruch 5 enthält.
Immunogenes Protein, welches ein Hybridmolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 4 enthält.
Immunogenes Protein nach Anspruch 7, worin das Protein ein Fusionsprotein des genannten Hybridmoleküls und einer immunoreaktiven Aminosäuresequenz einer oder aus einer prokaryotischen oder eukaryotischen Zelle oder eines oder aus einem Virus ist.
Impfstoff, der als immunisierende Komponente eine immunologisch wirksame Menge eines immunogenen Proteins nach Anspruch 7 oder 8 enthält.
Impfstoff nach Anspruch 9, worin der Impfstoff gegen Enterotoxininduzierte Krankheiten wirkt.
Immunogenes Protein nach Anspruch 7 oder 8 zur Verwendung in einem Verfahren zum Impfen eines Menschen.
Verwendung eines immunogenen Proteins nach Anspruch 7 oder 8 in der Herstellung eines Medikaments zur Vorbeugung oder Behandlung von Enterotoxin-induzierten Krankheiten bei einem Menschen.