KR19990008290A - 열에 불안정한 엔테로톡신과 콜레라 톡신 b 유니트간의 혼성분자 - Google Patents
열에 불안정한 엔테로톡신과 콜레라 톡신 b 유니트간의 혼성분자 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 열에 불안정한 엔테로톡신 B 서브유니트(LTB)와 콜레라톡신 B 서브유니트(CTB)간의 혼성분자에 관한 것이다. 이 혼성분자는 성숙 CTB의 아미노산 배열을 구성하고 있는 아미노산 배열을 함유하며 이때 아미노산 잔기는 상기 면역적 성숙 CTB에 LTB-특이적 에피토프 특성을 부여하는 성숙 LTB의 해당 아미노산 잔기로 치환된 것을 특징으로 하며 또는 그 반대로도 가능하다. 또한 본 발명은 이러한 혼성분자를 코드하는 구조 유전자, 이러한 구조유전자를 함유하는 플라즈미드, 이러한 혼성분자 및 임의선택적으로 원핵세포나 진핵세포 또는 바이러스의 면역반응성 아미노산 배열을 함유하는 면역 단백질에 관한 것이다. 또한 본 발명은 예를 들면 장독소로 인한 질병에 대한 것으로서 이러한 면역 단백질을 함유하는 백신, 및 장독소로 인한 질병을 예방 또는 치료하는 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 열에 불안정한 엔테로톡신 B 유니트(LTB)와 콜레아 톡신 B 유니트(CTB)간의 혼성분자에 관한 것이다. 임의 선택적으로 세포나 바이러스의 면역반응성 아미노산 배열에 융합되는 이러한 혼성분자를 함유하는 면역 단백질은 예를 들면 장독소로 인한 설사에 대항하는 광범위한 스펙트럼을 가지는 백신의 면역성분으로서 사용된다.
[발명의 배경]
콜레라는 많은 개발도상국가에서 중요한 발병 원인으로 남아 있으며, 매년 200,000 이상의 사망자가 생기는 것으로 추정된다. 장독소 대장균(ETEC)에의 감염은 개발도상국가에서, 그리고 여행자의 가장 빈번한 설사 원인이다. 즉 매년 10억 이상의 사람이 설사에 걸리고 백만명 이상이 사망하는 원인이 되는 것이다. 또한 ETEC에의 감염은 동물의 질병의 중요한 원인이다. 콜레라 및 ETEC 감염에 대한 효과적인 백신의 필요성이 매우 높다.
콜레라 및 ETEC 감염에 있어서, 설사의 주 원인은 장내의 감염균에 의해 방출되는 엔테로톡신의 작용이다. 즉, 콜레라의 경우 콜레라 톡신(CT), ETEC의 경우 열에 불안정한 엔테로톡신(ET)이 원인이다. 이 두 톡신은 구조적으로나 기능적으로나 밀접한 관계가 있으며, 각각은 독성 A유니트(각각 CTA 또는 LTA)가 5개의 동일한 B 유니트에 의해 둘러싸여져 있다(Spangler, 1992). B 유니트 펜타머는 장내 상피세포의 표면에 존재하는 GM1 강글리오시드 수용체에 톡신이 결합되게 하는 역할을 한다(Holmgren, 1981). 또한 LT는 구조적으로 관계있는 유단백질 수용체에 결합될 수 있다(Holmgren and Fredman, et al., 1982).
두가지 단백질은 예를 들면 사람 대 동물 ETEC 분리물에 있어서나 표준 균주대 EI T 또는 생물형 콜레라 균주에 있어서 몇몇 아미노산 잔기에 내부 변화가 나타날 수 있다 할지라도, LTB 및 CTB는 성숙 단백질(도 1)에서 아미노산 보존율이 85%인 높은 수준의 상동성을 나타내며, 결정학적 연구로부터 LTB와 CTB 펜타머는 또한 구조적으로 동일하다는 증거가 존재한다(Sixma and Pronk, et al., 1991, Sixma and Kalk, et al., 1993, Merrit and Sarfaty, et al., 1994). 또한 항체의 대부분이 집합된 펜타머의 구조적 특징에 대항한다는 사실에도 불구하고, 두 분자 사이에는 높은 수준의 면역 교차반응이 존재한다(Svennerhorm and Wickstron, et al., 1986). 즉, 두 분자 사이에 구조적 동일성을 보다 더 제시하게 된다.
CT는 주로 B 유니트에 대항하는 장내 lgA 반응을 생기게 하는 효과적인 경구용 면역원으로 밝혀졌다. 또한 CTB만을 단독으로 경구투여하는 것이 동일한 반응을 효과적으로 자극시키는 것으로 밝혀졌으며, 특히 사람에 있어서 CTB는 보조제나 홀로톡신의 독소 효과 없이 강한 면역원으로 작용한다는 것이 밝혀졌다. 이러한 반응은 비브리오 콜레라에의 자연 감염이나 침입에 대한 보호가 비교적 단기간(ca. 6~9개월)이라 할지라도, 고함량으로 수반되며 훨씬 긴 지속성의 면역학적 메모리를 수반한다(Svennerholm and Sack, et al., 1982, Svennerholm and Gothefors, et al., 1984, Svennerholm and Jertborn, et al., 1984, Clemens and Sack, et al., 1990, Quiding and Nordstrom, et al., 1991).
항독소 항체는 V. 콜레라 01(Svennerholm and Holmgren, et al., 1976)의 리포다당류(LPS)나 신규한 세로타입 0139(J. Holmgren, et al., 미공표)와 같은 세균성 세포를 수반하는 항원에 대항하는 장내 IgA 항체와 함께 상승작용적으로 보호작용의 역할을 하는 것으로 밝혀졌다. 이러한 발견을 근거로 하여, 수년간 지속적으로 보호작용을 하며(Clemens and Sack, et al., 1990), 0139 세로타입의 세포가 포함되도록 현재 변성중에 있는 V. 콜레라 01(Holmgren and Svennerholm, et al., 1992)의 죽은 전세포와 함께 CTB로 구성되는 콜레라에 대한 경구용 백신을 개발하여 왔다.
방글라데시에서의 B 서브유니트-01 전세포 백신에 대한 전역적인 시험에서 콜레라에 대해 장기간의 보호가 관찰되었으며, CTB 성분으로 인한 ETEC 감염에 대해 상당히 단기간의 교차-보호가 이루어졌다(Clemens and Sack, et al., 1988(a)). 콜레라 백신에 의해 제공되는 ETEC에 대한 이러한 보호는 그 후 모로코에 여행중인 핀란드인 관광객에 대한 연구에서 확인되었다(Peltola and Siitonen, et al., 1991). 이를 근거로 하여 ETEC에 대한 보다 광번위한 스펙트럼을 가지는 백신을 개발하여 왔다. 이때 장내 상피세포에 점착되어 포함되어 있는 주 클론화 인자 항체를 발현하는 죽은 대장균과 함께 CTB가 사용된다(Svennerholm and Arhen, et al., 1991). 대장균 균주는 LT와 함께 또는 단독으로 열에 안정한 엔테로톡신(STa)을 방출하는 ETEC 균주에 대항하는 면역성을 제공하기 위해 함유된다.
콜레라 및 ETEC 모두 풍토병인 지역에서는 두가지 감염에 대해 효과적으로 보호할 수 있는 단일 백신을 가지는 것이 바람직하다. 이는 이미 공인된 콜레라 백신의 CTB 성분에 의해 제공되는 ETEC에 대한 보호를 증가시킴으로써 부분적으로 달성될 수 있다. LTB 및 CTB가 상당한 면역학적 교차 반응성을 가진다 할지라도 CTB-면역된 개인의 혈청에 의한 LT의 중화는 동일 혈청에서 CT를 중화하는 경우와 같이 효과적이지 못하다(). 반대로 LT 또는 LTB에 대한 면역혈청은 CT보다는 LT와 고역가로 반응하는 것으로 알려져 있다(Svennerholm and Holmgren, et al., 1983). 그러므로 LTB내의 일부 중화 에피토프가 CTB에는 존재하지 않을 수도 있으며 또 그 반대의 경우도 가능하다. 이는 LTB에 특이적인 중화 하체의 확인에 의해 보다 상세히 제시된다().
콜레라 및 ETEC 백신에 CTB를 함유시킴으로써 독성 CTA 서브유니트 전혀 없이 대량으로 생산할 수 있는 재조합 단백질의 과잉생산을 위한 발현 시스템을 개발하게 되었다(Sanchez and Holmgren, 1989, Lebens and Jojansson, et al., 1933). 이로써 또한 외래 펩티드 항원을 동반하는 융합의 생성을 위한 CTB의 유전적 변성을 비교적 간단하게 하는 절차방법을 공개하였다.
본 발명은 면역학적 교차반응성을 증가시키기 위해서, CTB를 코드하는 구조 유전자를 사이트에 관한 변성에 의해 수정시킴으로써 LTB에 특이적인 에피토프가 기본적으로 CTB가 남아있는 단백질에 삽입되게 하여 교차 반응성을 가지며 CTB에 특이적이면서 동시에 LTB에 특이적인 에프토프를 동반하는 혼성분자를 생성시키는 것을 기본으로 한다. 이러한 혼성 CTB/LTB분자는 장독소성 질병의 예방 또는 치료 목적을 위한 광범위한 스펙트럼의 백신을 제공하기 위해 개발되어 왔다.
도 1은 사람의 ETEC분리물의 LTB의 배열과 CTB의 배열(M.Lebens, 미공표)을 비교도시한 것으로, 아미노산 변화로 인한 차이를 나타내기 위해, LTB의 해당위치의 아미노산 잔기를 DNA 배열의 위에 표기하였다. CTB 아미노산 배열의 아래에 있는 숫자는 성숙 CTB와 LTB 단백질의 아미노산 잔기의 위치를 나타내는 것이다.
도 2는 CTB/LTB 혼성분자를 코드하는 플라즈미드를 도시한 것이다. 두 플라즈미드 있어서 ctxB 유도 유전자는 tac 프로모터로부터 발현된다. a) pML-LCTBtacA는 pML-LCTBtac1으로부터의 SacI/AccI 단편(21)이 LTB의 제 1의 25아미노산을 코드하는 합성 올리고펩티드로 대체되는 유전자의 삽입에 의해 생성된다. ctxB 유전자의 나머지는 바뀌지 않는다. 플라즈미드는 LTB 시그널 펩티드와 리보좀 결합 배열을 동반한다. b) pML-LCTBtacB는 유일한 EcoRI 자리가 도입되고 94 및 95 위치의 아미노산이 LTB의 같은 위치에서 해당 아미노산으로 변화되는 PCR에 관한 변성에 의해 pML-CTBtac로부터 생성된다. 이 플라지미드는 CTB 시그널 펩티드와 람다 cII리보즘 결합 배열을 동반한다. 변화된 배열은 박스내로 도시하였다. 배열은 혼성유전자 관련 영역만을 기재한 것이다.
도 3은 각각 rCTB, rLTB 또는 CTB/LTB 혼성 단백질 LCTBA(A) 또는 LCTBB(B)로 각각 ip 면역화한(1군, 2군 및 3군)후에 이에 대한 IgG 항체 반응을 도시한 것이다. 여기서 역가는 두마리 쥐에 대한 평균이며 이후에 기술되는 재료 및 방법에서 설명하는 GMI-ELISA에 의해 측정되었다.
도 4는 rCTB, rLTB 또는 CTB/LTB 혼성 단백질 LCTBA 또는 LCTBB로 3가지 면역화한 후에 얻어지는 쥐 혈청의 CTB- 및 LTB-반응성 항체의 역가에 대한 CTB 흡수효과를 도시한 그래프이다.
본 발명의 혼성 CTB/LTB 분자의 제조
본 발명의 혼성 CTB/LTB 분자는 유전자 공법 및/또는 예를 들면 메리필드(Merrifield)에 따르는 펩티드 제조법과 같이 펩티드 및 단백질 합성분야에 알려진 어떠한 방법에 의해서도 제조될 수 있다. 이러한 분자의 제조방법을 설명하기 위해 본 발명의 두가지 혼성 CTB/LTB분자를 다음과 같이 제조하였다.
혼성 CTB/LTB 분자의 제조
본 발명에 사용되는 두가지 혼성 독소 유전자를 두 개의 서로 다른 CTB 발현벡터로부터 제조하였다. 첫째로, ctxB 유전자내의 편리한 한정 사이트 사이에 합성 올리고뉴클레오티드를 삽입시킴으로써 변성시킨 다음 둘째로, 앞서 기술한 바와 같이 완전한 플라즈미드의 PCR확장에 특이적 프라이머를 사용함으로써 변성을 일으키게 하였다(). 이렇게 하여 생성된 두 개의 플라즈미드는 변성된 ctxB 유전자를 동반한 pML-LCTBtacA와 pML-LCTBtacB이다. 유전자의 배열은 DNA 배열법에 의해 확인되었으며 도 2에 도시되어 있다. pML-LCTBtacA에 의해 밸현되는 혼성 단백질 LCTBA는 초기 25 아미노산의 LTB와 동일하며 그 다음 CTB와 동일하다. pML-LCTBtacB에 의해 발현되며 LCTBB로 기재되는 것은 1, 94 및 95 위치에서 LTB에 해당하는 것으로 대체되었다. 그렇지 않은 경우 표준 01 V. 콜레라 균주 395의 천연 CTB와 동일하다.
혼성 단백질은 V. 콜레라 균주 JS1569 내에서 발현되며 그 결과 증식 배지내에서 생성물이 축적되어 있는 증식배지로부터 헥사메타포스페이트 침전후 HPLC에 의해 정제될 수 있다.
단백질은 LCTBA의 경우 대조용 CTP 단백질과 동일하며, LCTBB의 경우 특히 모노레믹 형태의 LTB와 일치하는 SDS PAGE를 기본으로 하는 것으로 밝혀졌다.
CTB/LTB 혼성분자의 항원성 분석
각각의 발현벡터를 동반하는 V. 콜레라의 증식배지로부터 두 개의 혼성 단백질을 부분 정제하여 다양한 분석을 행함으로써 천연 CTB와 LTB와 비교하여 항원성을 측정하였다.
초기에 정해진 농도의 서로 다른 단백질을 GM1-ELISA내의 서로 다른 CTB 또는 LTB에 특이적인 항체로 적정하였다. 이로부터 GM1 수용체와 서로 다른 검출 항체 둘다 또는 이들중 하나에 대한 친화력 차이를 측정하였으나, 우리는 이미 서로 다른 단백질이 GM1와 동일하게 결합하며 따라서 차이점은 항체에 특이적(결과는 도시하지 않음)이라는 것을 보여주었다. 그 결과는 표 1에 나타내었다. 이로부터 일련의 모노클론 항체와 흡착된 폴리클론 면역혈청에 대해 얻어지는 역가 특성은 혼성 단백질과 천연 단백질 간에 서로 다르다는 것을 알 수 있다. 이 결과는 혼성 단백질 LCTBA가 모노클론 항체와의 반응을 근거로 하여 인식될 수 있는 LTB에 특이적인 에피토프를 획득하였다는 것을 말해준다. 즉, 에피토프는 LTB에 특이적인 모노클론 항체 LT 33:8 및 LT 80:7에 의해 인식된다. 그러나 이는 여전히 CTB에 특이적인 항체 CTWi와 반응한다. 또한 웨스턴 블로트를 나타낸다.
LCTBB의 경우 사용된 모노클론 항체 중 그 어느것도 혼성분자의 항원성에 어떠한 변화도 일으키지 않았다. 이에 대해 두가지 해석이 가능하다. 하나는 보다 광범위한 항체로 스크리닝되어 특정 에피토프에 친화력을 나타내는 항체를 찾기 위해서 분자내에 비교적 작은 수의 변화를 필요로 하기 때문인 것으로 풀이된다. 또 하나는 GM1-ELISA를 기본으로 하는 분석으로 GM1 결합 사이트내에 숨겨져 있는 분자영역의 변화를 검출할 수 없다는 것이다.
교차 반응성 면역 혈청을 생기게 하는 혼성 단백질로 면역화
LTB, CTB 또는 여러 가지 다른 혼성분자로 면역화한 후, 이렇게 하여 생성된 혈청을 LTB 및 CTB에 대한 총 항체의 양을 분석한 후 LTB에 특이적인 항체의 양을 분석하였다.
도 2은 각각 3가지로 면역화한 후에 CTB 및 LTB에 대한 항체의 양을 도시한 것이다. 첫 번째 면역화 이전에는 테스트된 쥐 중 어느것의 B 서브 유니트에 대해서도 검출될 만한 역가가 존재하지 않았다. CTB 및 혼성 단백질의 경우, CTB에 대한 역가가 항상 LTB에 대한 역가보다 높다. LTB로 면역화된 쥐의 경우는 상황이 반대였다. CTB나 LCTBB 혼성분자로 면역화된 주의 경우 첫 번째 및 두 번째 면역화 후에 CTB 및 LTB에 대하여 얻어지는 관련 역가 사이에 큰 차이점이 없다. 두 경우 모두, CTB 역가가 LTB에 대한 역가보다 확실히 높다. 그러나 LCTBA로 면역화된 쥐의 경우 LTB 및 CTB 에 대한 역가가 서로 비슷하다. 이는 CTB 및 LCTBB로 면역화된 쥐와 비교할 때 항-CTB 항체의 감소량과 항-LTB 항체의 증가량 때문이다. 세 번째 면역화 후에 혼성분자로 면역화된 쥐의 2가지 군의 경우, 항-CTB 역가가 CTB로 면역화된 주의 역가와 같으나, 항-LTB 양은 높다는 것을 알 수 있다.
LTB 또는 CTB에 대한 항체의 역가에 대해 총 혈청을 테스트하는 경우 교차 반응성 항체의 존재에 의해 결과가 모호하게 된다. 서로 다른 혈청에서 관찰되는 차이가 LTB에 특이적인 항체의 양의 변화 때문인지를 측정하기 위해서, 세 번째 면역화 후에 취해진 혈청에 CTB-세파로즈로 흡착함으로써 교차 반응성 항체 및 CTB에 특이적인 항체를 제거하였다. 그 결과는 도 4에 도시되어 있다. 이로부터 치료에 의해 혈청으로부터 모든 항-CTB 항체가 효과적으로 제거된다는 것을 알 수 있다. CTB로 면역화된 쥐의 경우 관찰되는 총 항-LTB 역가는 교차 반응성 항체에 기인하며 흡착후에는 LTB 반응성 항체가 남아있지 않다. LCTBA 및 LCTBB의 경우에는 LTB로 면역화된 쥐에서와 같은 높은 수준은 아니지만 상당한 항-LTB 역가가 남아있다. 이는 CTB 분자내에 도입되는 변성이 LTB에 특이적인 항체를 생기게 하는 면역학적 효과를 가진다는 증거이다. 또한 LCTBA에 있어서 CTB 분자내에 7개의 치환체가 존재하는 경우 단지 3개의 경우인 LCTBB에보 보다 그 효과가 크다는 것을 명백히 알 수 있다.
서로 다른 B 서브유니트 면역혈청에 의한 CT 및 LT의 중화
서로 다른 면역혈청에 대해서 LT 또는 CT를 중화할 수 있는 능력을 알아보기 위한 시험관내 분석 테스트를 행하였다. 분석에 사용된 조건하에서 면역혈청은 단지 약간의 교차 반응성을 가진다. LTB 면역혈청은 사용된 조건 범위내에서 어떠한 농도로도 CT를 중화시키지 못했으나 반면 CTB 면역혈청은 LT에 대해 약간의 효과를 가졌다. 이와는 대조적으로 혼성분자중 어느 하나에 대한 면역혈청은 CT와 LT 둘다에 대해 뛰어난 중화능력을 CTB 면역혈청의 CT 중화능력이 완전히 흡수된 후에는 여전히 뛰어난 LT 중화능력을 가지고 있었다. 이러한 결과는 CTB 분자내에서 만들어진 치환체가 증화 LTB 에피토프를 도입시키는 동시에 CT 중화 에피토프도 보유하고 있다는 것을 암시한다. LCTBB로 면역화된 주의 면역혈청에 의해 LT에 대해 나타나는 중화능력의 수준이 GM1 ELISA로 테스트하는 경우 LTB에 특이적인 항체가 적은량 존재함에도 불구하고 LCTBA로 면역화된 주의 혈청에서 발견되는 것과 거의 같은 수준이라는 것은 중요한 일이다. 이는 B 서브유니트 구조의 94 및 95 위치의 아미노산이 수용-결합 사이트에 또는 그 가까이에 위치하게 되는 강력한 중화에피토프 부분을 형성시킨다는 것을 말해주는 것이다.
명세서의 실험부분에서 제시되는 결과의 개요
본 연구는 기본적으로 CTB로 구성되어 있는 두가지 혼성 B 유니트 독소분자의 제조 및 분석에 관한 것이다. 이 분자는 변성을 시킴으로써 사람의 해당위치와 같도록 특이적 아미노산 잔기를 변화시킨 것이다. 두 단백질을 고농도에서 발현되며 CTB와 LTB 둘다의 기본적인 특성을 유지하는 것으로 밝혀졌다. 이 두 분자는 펜타머에 조합되며 GM1 강글리오시드에 결합된다. 또한 두 분자는 교차 반응성 모노클론 항체 LT 39와 야생형 CTB 및 LTB에 대해 동일하게 반응하며, 또한 CTB 또는 LTB에 대해 폴리클론 면역혈청과 강하게 반응한다. 그러나 다른 LTB 또는 CTB에 특이적인 모노클론 항체와의 반응에 있어서 서로 다른 단백질간에 구별이 생길 수 있다. 이는 신규한 단백질이 동일 분자내의 야생형 단백질 각각에 특이적인 에피토프를 동반한다는 것을 의미하는 것이다. 이는 또한 혼성 단백질로 면역화된 동물로부터 얻어지는 혈청의 교차 반응성 증가를 보여주는 면역실험에 의해 설명된다. 이는 CHO 세포 독소-중화 분석에 있어서 혼성분자에 대한 면역혈청이 CTB 단독에 대한 면역혈청보다 효과적으로 LT를 중화시켰으며, 이러한 능력은 CTB에 의해 흡수되어 버리지 않았다는 것을 증명하는 것이다.
본 연구에서 사용되는 두 혼성분자는 CTB 분자의 별개영역에서의 변성효과를 설명하기 위해 제조되었다. 첫 번째 제조에 있어서는 CTB의 아미노 말단이 변화되는 반면 두 번째 제조에 있어서는 주 잔기가 수용체 결합의 기질 특이성이 포함되어 있음을 가르쳐주는 카르복시 말단에 인접한 로커스에서 변화된다. LCTBB의 1위치에서의 Thr→Ala로의 변성은 본 연구에서는 조사되지 않았다. 대조용으로 사용된 재조합 CTB는 앞서 기술한 발현시스템으로부터 제조되었으며(Lebens and Johansson, et al., 1993), 또한 우리가 앞서 어떠한 면역학적 중요성도 가지지 않은 것으로 설명한 변성을 동반하였다(Lebens and M. Lebens and J. Holmgren, 미공표 데이터).
상기 결과로부터 CTB의 아미노 말단에서 보다 강하게 변성됨으로써 검출될만한 수준이나 항-LTB 특이적 GM1-ELISA 역가가 매우 적은 성숙 단백질의 94 및 95 위치에서의 두 잔기 변화와 비교할 때, 보다 LTB에 특이적인 항체(CTB-세파로제에 의해 흡수되어 버리지 않는 GM1-ELISA 항체 역가에 의해 제시됨)을 형성시키게 된다는 것을 명백히 알 수 있다. 그러나 CHO 세포에서 두 변성 B 서브유니트에 대한 면역혈청에 의해 LT(및 CT)가 중화되는 것은 동일한 것으로 밝혀진 것은 매우 흥미로운 일이다. 이는 두번째 혼성에 의해 생성되는 LTB에 특이적인 항체의 역가가 매우 낮은 수준임에도 불구하고 항체가 동일한 중화효과를 가진다는 것을 시사한다. 이는 영향을 받은 두 잔기가 중화 에피토프내에 존재한다는 것을 의미한다. 이는 또한 일부 CTB에 특이적인 중화 에피토프가 치환의 결과로서 손실될 가능성이 있음에도 불구하고 변성으로 인해 CT를 중화시키는 능력이 상실되지 않기 때문에 이러한 B 서브유니트 분자에 대한 중화 에피토프가 하나 이상 존재한다는 것을 의미한다.
이러한 연구조사로부터 CTB와 LTB에 특이적인 중화 에피토프를 함유하는 혼성분자가 제조될 수 있다는 것이 명백하다. 또한 최근 발표된 CTB 오버-발현 시스템은 이러한 단백질을 대량생산하는 것을 가능하게 한다. 따라서 이제 이러한 분자는 각각의 콜레라 및 ETEC 백신에 혼입되거나, 두가지 형태의 설사병에 대해 뛰어난 보호효과를 주기 위한 광범위한 단일 스펙트럼을 가지는 백신에 혼입되기 위해 제조된다.
방법 및 재료
박테리아 균주 및 플라즈미드
재조합 CTB(rCTB) 및 LTB(rLTB)의 제조를 위해 박테리아 균주를 사용하였으며, 변성 유동체로는 01E1Tor V. 콜레라 균주 JBK70(Kaper and Lockman, et al., 1984) 및 01 Classical V. 콜레라 균주 JS 1569(Lebens and Johansson, et al, 1993)을 사용하였다. 적절한 재조합 플라즈미드를 동반하는 균주를 -70℃에서 20% 글리세롤을 함유하는 배지속에서 냉동저장하였다. 암피실린 100㎍/㎖로 보충시킨 L-한천상에서 각 균주를 스트리킹시킴으로써 배양균을 소생시켰다. 본 연구에서 제조된 플라즈미드는 도 2에 도시되어 있다.
DAN 조작
플라즈미드 제조를 포함한 DNA 조작, 제한효소의 사용, DNA 결찰 및 아가로즈겔 전기영동은 기본적으로 Sambrook and Fritsch, et al.(1989)에 기술된 바와 같은 표준방법에 따라 행하여 졌다. 제한효소는 제조업자가 공급한 완충액으로서 사용하였다. 결찰에 의해 플라즈미드내로 삽입시키거나 또는 PCR을 이용해 확장시키기 위한 올리고뉴클레오티드는 Innovagen AB(스웨덴)으로부터 얻어졌다.
(1991)에 의해 기술된 방법에 따라 플라즈미드-함유 ctxB 유전자에 변성을 도입하기 위해 PCR을 사용하였다. DNA 배열은 Amersham(UK)으로부터 구입되는 Sequenase version 2.0Kit를 사용하여 행해졌다.
CTB 및 LTB와 그 변성 유도체의 제조
원 rCTB 및 그 유도체는 관련 발현 플라지미드를 동반하는 균주 V. 콜레라 JS 1569부터 제조하였다. LTB는 발현 플라즈미드 pMMB68을 동반하는 V.콜레라 균주로부터 제조하였다(Sandqvist and Hirst, ot al., 1987). 변성된 시나카제상에서 배양균을 증식시킨 다음(Lebens and Johansson, et al., 1933), 배지에 수집된 CTB 또는 LTB를 앞서 기술한 바와 같은 헥사메타 포스페이트 침전에 의해 회수하였다(Lebens and Johanson, et al., 1993). 얻어진 B 서브유니트의 농도를 교차반응성 모노클론 항체 LT39를 사용하여 GM1-ELISA(Svennerholm and Holmgren, 1978)에 의해 측정하였다.
LTB 및 CTB를 보다 더 정제하는 방법은 HPLC를 사용함으로써 이루어졌다. 헥사메타포스페이트 침전물을 pH9의 20mM 트리스-HCl에 재현탁시켰다. 이렇게하여 형성된 현탁액을 10,000rpm으로 3분간 원심분리시킨 다음 B 서브유니트가 함유된 상청액을 0.2m 살균필터를 통해 여과시켰다. DEAE Mem-Sep HP 1000칼럼(Millipore Corp., USA)상에서 HPLC를 행하였다. 우선 B 서브유니트를 pH9(20mM 트리스-Hcl)에서 칼럼에 결합시킨 다음 pH8에서 0.16M(LCTBA의 경우) 또는 0.18M(LCTBB의 경우)초산 나트륨으로 칼럼으로부터 용출시켰다.
시험관내 항원성 및 단백질 분석
폴리스티렌 ELISA 플레이트의 웰을 실온에서 시간 동안 100㎕의 0.3nmol/㎖ GM1 강글리오시드로 코팅한 후에 사용할 때까지 4℃로 유지시켰다. 이 코팅된 플레이트를 우선 PBS에 변화를 주면서 2회 세척한 다음 37℃에서 30분간 포스페리트 완충염(pH 7.2,PBS), 0.1%(W/V) 송아지 혈청 알부민(BSA)으로 블로킹시켰다. PBS, 0.1% BSA중 농축원액을 희석시킴으로써 각 B 서브유니트 제제 25ng/㎖의 용액을 얻었다. 실온에서 1시간 배양시킴으로써 블로킹된 플레이트를 코팅하기 위해 이 희석샘플을 100㎖ 분량 사용하였다.
그 다음 첫 번째 열의 플레이트에 서로 다른 항체용액을 가하고 5배 연속 희석액으로 적정하였다. 그 다음 양고추냉이 과산화 요소(HRP)(Jakkson, PA, USA)와 공역화된 제 2항-쥐 또는 항-토끼 면역 글로블린으로 B 서브유니트에 결합된 항체를 검출하였다. 실온에서 1시간 배양한 후에, 앞서 기술한 바와 같이 구연산염 완충액(pH 4.5)중의 H2O2와 색소생성 기질 O-페닐렌디아민(OPD)을 사용하여 항체의 결합성을 검출하였다(Svennerholm and Holmgren, 1978). 플레이트를 각 단계사이에 PBS, 0.05% 트웬(Tween)을 사용하여 3회 세척하였다. 10분의 반응시간 후에 450nm에서 흡광도가 0.4이상인 배경을 제공하는 희석액의 역수로서 역가를 결정하였다.
니트로셀룰로즈에 대해 용해된 단백질의 전기이동 및 SDS-폴리아크릴아미드 전기영동은 제조업자가 권고한 조건허에 Biorad(CA, USA)로부터 구입가능한 miniprotean II 장치를 사용하여 수행되었다.
쥐 면역화
수쌍의 C57/Black 쥐를 CTB, LTB 또는 변성 CTB 유도체로 3회 복강내 면역화시켰다. 처음 두 투여량에는 10㎎의 B 서브유니트가 함유되어 있으며, 프로인트 불완전 보조액을 함유하는 용액 200㎖를 투여한 후 10일 간격으로 두었다. 세 번째 투여량에는 200㎎의 B 서브유니트가 함유되어 있으며 두 번째 투여후 14일간 어떠한 보조액도 없이 유지되었다. 첫 번째 두 투여량을 투여하기 전에 쥐로부터 피를 뺀 다음 세번째 투여한지 7일후에 희생시키고 그 다음 분석을 위해 피를 수집하였다. 혈청을 마련하고, 사용할 때까지 -20℃에서 저장하였다.
혈청 역가 측정
면역화로부터 획득된 혈청을 GM1-ELISA(Svennerhorm and Holmgren, 1978)에 의해 테스트하였다. 우선 GM1 코팅된 플레이트를 사용하기 직전에 PBS로 2회 세척하고 37℃에서 30분간 PBS, 0.1% BSA 블로킹시켰다. 그 다음 이 플레이트를 두군으로 분류하였다. 제 1군의 플레이트의 웰에는 PBS, 0.1% BSA 중의 CTB 0.5㎍/㎖ 100㎕를 가하였으며, 제 2군의 플레이트의 웰에는 PBS, 0.1% BSA 중의 LTB 0.5㎍/㎖ 100㎕를 가하였다. 그 다음 이 플레이트를 실온에서 1시간 배양시킨 후에 PBS 0.05% 트웬으로 3회 세척하였다. 그 다음 PBS, 0.1% BSA, 0.05% 트웬의 용액 100㎕를 첫 번째 줄의 플레이트를 제외한 모든 웰에 가하였다. 첫 번째 줄의 웰에는 PBS, 0.1% BSA 중의 혈청의 1/1000배 희석액 150㎖ 분량을 가하였다. 그 다음 이것을 일련의 3배 희석액으로 적정하고, 실온에서 1시간동안 배양시켰다. PBS, 0.05% 트웬으로 3회 세척한 후에, CTB 및 LTB에 결합된 항체를 HRP(Jackson, PA, USA)와 공역화된 항-쥐 IgG로 배양함으로써 분석하였다. 색소생성 기질은 OPD였으며, 앞서 기술한 시험관내 항원성 측정에서와 같은 방법으로 역가를 계산하였다.
CTB 항체 흡수
CTB에 특이적인 항체와 LTB와 교차반응하는 항체를 제거하기 위해서 CTB-세파로즈 비드를 사용하여 혈청을 흡수하였다. CTB-세파로즈는 제조업자의 설명에 따라서 브롬화 시아노겐-활성화 세파로즈(Pharmacia AB, 스웨덴)에 CTB 펜타머를 공유 결합시킴으로써 제조되었다.
우선 혈청을 PBS 중에 1:10으로 희석시켰다. 이 희석액 100㎕를 실온에서 1시간 동안 간헐적으로 흔들어 주면서 50㎕의 세파로즈-CTB 비드가 들어있는 미세원심 분리관내에서 배양시켰다. 그 다음 이것을 벤치 탑 미세원심분리기내에서 2분동안 9000rpm으로 원심분리시킨 후에 상청액을 회수하였다. 그 다음 이 과정을 반복하였다. 흡수된 혈청을 앞서 기술한 바와 같이 CM1-ELISA를 사용하여 CTB 및 LTB에 대하여 분석하였다.
독소 중화 테스트
여러 가지 CTB 유도체 및 LTB로 세 번째 면역화된 쥐로부터 획득된 혈청에 대해 CTB-세파로즈로 흡수되기 이전과 이후의 CT 또는 LT의 독소를 억제시키는 능력을 알아보기 위해서 중국 햄스터 난소(CHO) 세포 분석법(Gverrant and Brunton, et al., 1974)으로 테스트하였다. 우선 흡수안된 혈청을 1:20으로 희석시켰다. 그 다음 이렇게 하여 생성된 혈청 50㎖분량을 3배 희석액으로 미세 적정 플레이트내에서 연속적으로 중복하여 희석시켰다. 제 1군의 웰에는 1% BSA를 함유하는 50㎕ HAMF12 배지중의 0.2ng CT를 가하였고 제 2군의 웰에는 동일한 배지중의 LT 용액을 가하였다. 이 플레이트를 실온에서 1시간 동안 배양시킨 후에 모든 웰에 F12 HAM 배지중의 2×105세포/㎖의 현탁액 100㎕를 가하였다. 10% CO2, 5% O2대기중의 37℃에서 1시간 동안 배양을 진행시켰다. 세포를 메탄올로 고정시킨 후에 김사(Gimsa)용액(Merck)으로 착색하였다. 세포에 대해 광현미경 검사법에 의해 손상도 여부를 관찰하였다. CTB-세파로즈 비드로 흡수시킨 후 혈청에 대해 같은 방법을 수행하였다. 모든 실험은 중복해서 행하여졌다.
참고문헌
[표 1]
혼상 단백질에서 CTB 에피토프를 보유하면서 LTB에 특이적인 에피토프의 형성
a항체역가는 GM1-ELISA 방법에 의해 결정되었다(재료 및 방법 참조). LT 39는 LTB와 CTB 둘다와 동일하게 반응하는 교차 반응성 모노클론 항체이다. LT 33:8 및 LT 80:7은 LTB에 특이적인 모노클론 항체이며 CTWi는 CTB에 특이적인 모노클론 항체이다. R953은 LTB에 대하여 생성된 토끼의 폴리클론 초면역 혈청이며, R953abs는 같은 혈청으로서 CTB로 흡수시킨 후의 혈청이다. 측정된 역가 차이가 log10= 0.5(즉, 3배)를 초과하는 것은 상당한 수준으로 고려된다.
[표 2]
LT-중화능력이 증가된 면역혈청을 생성시키는 혼성 단백질
aCTB, LTB 또는 두 LTB/CTB 혼성분자중 어느 하나로 쥐를 3회 면역화시킨 후에 얻어지는 혈청에 의한 LT 및 CT의 중화도를 CHO세포 분석법(재료 및 방법참조)를 이용하여 결정하였다. 이 혈청은 또한 CTB-세파로즈를 사용하여 흡수시켰으며 같은 방법으로 분석하였다. 첫 번째 웰의 개시농도가 CTB-세파로즈로 흡수되기 전과 후의 혈청에 대한 실험에서와 같도록 실험이 수행되었다. 이를 위해 첫 번째 웰에서는 흡수안된 혈청을 1:20으로 희석시켰으며, 흡수후에는 희석되지 않은 것을 사용하였다. 흡수안된 혈청은 3배 희석액으로 연속적으로 희석되었으며 흡수된 혈청은 2배 희석액으로 연속적으로 희석되었다. 제시된 역가는 혈청이 손상으로부터 세포를 보호하는 최대 희석액을 의미하며, 그 범위는 두 개의 분리된 중복실험에서 수행된 적정으로부터 얻어진 것을 의미한다.
본 발명의 첫번째 특징은 열에 불안정한 엔테로톡신 B 서브유니트(LTB)와 콜레라톡신 B 서브유니트(CTB)간의 혼성분자로써 이 분자는 성숙 CTB의 아미노산 배열을 구성하고 있는 아미노산 배열을 함유하며 이때 아미노산 잔기는 상기 면역적 성숙 CTB에 LTB-특이적 에피토프 특성을 부여하는 성숙 LTB의 해당 아미노산 잔기로 치환된 것을 특징으로 하며 또는 그 반대로도 가능한 혼성분자를 제공한다. 따라서, 상기 혼성분자는 반대로 성숙 LTB의 아미노산 배열로 구성되는 아미노산 배열을 함유하며 이때 아미노산 잔기가 면역적인 성숙 LTB에 CTB-특이적 에피토프 특성을 부여하는 성숙 CTB의 해당 아미노산 잔기로 치환된 것일 수도 있다.
본 발명의 바람직한 실시예에 있어서, 혼성분자는 성숙 CTB의 아미노산 배열로 구성되는 아미노산 배열을 가지며 이때 1, 94 및 95 위치의 아미노산 잔기는 LTB의 해당 아미노산 잔기로 치환된 것이다.
본 발명의 다른 바람직한 실시예에 있어서, 혼성분자는 성숙 CTB의 아미노산 배열로 구성되는 아미노산 배열을 가지며 이때 1~25 위치의 아미노산 잔기는 LTB의 해당 아미노산 잔기로 치환된 것이다.
성숙 CTB 및 성숙 LTB의 아미노산 배열은 도 1에 도시되어 있으며 아미노산 +1에서부터 개시된다. 해당 구조 유전자도 같은 도면에 도시되어 있다.
본 발명이 두번째 특징은 본 발명에 따르는 혼성분자를 코드하는 구조 유전자를 제공한다. 또한 본 발명은 이러한 구조유전자를 함유하는 플라즈미드를 제공한다.
본 발명의 세번째 특징은 본 발명에 따르는 혼성분자를 함유하는 면역 단백질을 제공한다.
이러한 본 발명의 특징을 보여주는 실시예에 있어서, 상기 면역 단백질은 본 발명의 혼성분자의 융합 단백질이며 원핵세포나 진핵세포 또는 바이러스로부터 생성되는 또는 그 자체의 면역반응성 아미노산 배열을 가진다.
본 발명의 네번째 특징은 면역성분으로서 면역학적 유효량의 본 발명에 따르는 면역 단백질을 함유하는 백신을 제공한다. 이러한 백신은 설사와 같은 장독소로 인한 질병에 대한 백신으로서 사용되는 것이 바람직하다.
본 발명의 B 서브유니트 혼성분자는 면역학적 유효량의 본 발명에 따르는 면역 단백질을 각 대상(동물 또는 사람)에 투여함으로써 각 대상의 장독소로 인한 질병을 예방 또는 치료하는 방법에 사용하기 위한 것이다.
Claims (11)
- 열에 불안정한 엔테로톡신 B 서브유니트(LTB)와 콜레라톡신 B 서브유니트(CTB)간의 혼성분자에 있어서,상기 분자는 성숙 CTB의 아미노산 배열을 구성하고 있는 아미노산 배열을 함유하며 이때 아미노산 잔기는 상기 면역적 성숙 CTB에 LTB-특이적 에피토프 특성을 부여하는 성숙 LTB의 해당 아미노산 잔기로 치환된 것을 특징으로 하는 혼성분자.
- 열에 불안정한 엔테로톡신 B 서브유니트(LTB)와 콜레라톡신 B 서브유니트(CTB)간의 혼성분자에 있어서,상기 분자는 성숙 LTB의 아미노산 배열을 구성하고 있는 아미노산 배열을 함유하며 이때 아미노산 잔기는 상기 면역적 성숙 LTB에 CTB-특이적 에피트포 특성을 부여하는 성숙 CTB의 해당 아미노산 잔기로 치환된 것을 특징으로 하는 혼성분자.
- 제 1항에 있어서,상기 아미노산 배열은 성숙 CTB의 아미노산 배열로 구성되는 아미노산 배열을 가지며 이때 1, 94 및 95위치의 아미노산 잔기가 LTB의 해당 아미노산 잔기로 치환된 것을 특징으로 하는 혼성분자.
- 제 1항에 있어서,상기 아미노산 배열은 성숙 CTB의 아미노산 배열로 구성되는 아미노산 배열을 가지며 이때 1, 94 및 95 위치의 아미노산 잔기가 LTB의 해당 아미노산 잔기로 치환된 것을 특징으로 하는 혼성분자.
- 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 따르는 혼성분자를 코드하는 구조 유전자.
- 제 5항에 따르는 구조 유전자를 함유하는 플라즈미드.
- 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 따르는 혼성분자를 함유하는 면역 단백질.
- 제 7항에 있어서,상기 단백질은 상기 혼성분자의 융합 단백질이며 원핵세포나 진핵세포 또는 바이러스로부터 생성되는 또는 그 자체의 면역반응성 아미노산 배열을 가지는 것을 특징으로 하는 면역 단백질.
- 면역성분으로서 면역학적 유효량의 제 7항 또는 제 8항에 따르는 면역 단백질을 함유하는 백신.
- 제 9항에 있어서,상기 백신은 장독소로 인한 질병에 대한 백신인 것을 특징으로 하는 백신.
- 면역학적 유효량의 제 7항 또는 제 8항에 따르는 면역 단백질을 각 대상에 투여함으로써 각 대상의 장독소로 인한 질병을 예방 또는 치료하는 방법.
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