KR100471115B1

KR100471115B1 - 장병원성 대장균 감염의 예방 및 치료를 위한 수용성단백질 및 이를 포함한 알 및 이들의 제조방법

Info

Publication number: KR100471115B1
Application number: KR10-2001-0085472A
Authority: KR
Inventors: 김정우; 김도균; 안태영
Original assignee: 주식회사 단바이오텍; 김정우
Priority date: 2001-12-26
Filing date: 2001-12-26
Publication date: 2005-03-08
Also published as: KR20030055030A

Abstract

본 발명은 영아 및 유아의 설사증을 유발하는 장병원성 대장균의 부착 (adherence) 단백질을 항원으로 사용하여 면역화된 산란계로부터 산란되고 영아 및 유아의 설사증을 예방 및 치료하는데 유용한 수용성 단백질을 포함한 알에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 알의 난황으로부터 분리되고 영아 및 유아의 설사증을 예방 및 치료하는데 유용한 수용성 단백질에 관한 것이다.

Description

장병원성 대장균 감염의 예방 및 치료를 위한 수용성 단백질 및 이를 포함한 알 및 이들의 제조방법{Soluble Protein For Prevention And Treatment Of Enteropathogenic E.coli Infection, Eggs Containing Thereof And Method For Producing Thereof}

본 발명은 장병원성 대장균 감염의 예방 및 치료를 위한 수용성 단백질 및 이를 포함한 알에 관한 것이다. 구체적으로 본 발명은 보다 자세하게는, 항원으로서 장병원성 대장균의 부착(adherence) 단백질로 면역화된 산란계로부터 배출되고 영아 및 유아의 설사증을 예방 및 치료하는데 유용한 수용성 단백질을 포함한 알 및 이러한 알의 난황으로부터 분리되고 영아 및 유아의 설사증을 예방 및 치료하는데 유용한 수용성 단백질에 관한 것이다. 또한, 이들의 제조방법에 관한 것이다.

설사증은 영아 및 유아에 있어 가장 흔한 질환중의 하나이다. 대부분의 영아 및 유아들은 생후 첫 3년 내에 심한 급성 설사를 경험하게 되는데 원인치료를 하지 않을 경우 만성화돼 장의 영양분 흡수율이 떨어져 발육부전이 될 수도 있다. 한국에서 연령별 설사 감염율의 조사 결과로서, 유아기에서 로타바이러스가 약66%의 높은 감염율을 나타내는 반면 영아 및 소아에서는 병원성 대장균 및 살모넬라에 의한 설사 질환이 로타바이러스보다 높은 감염율을 나타낸다는 보고가 있다.

병원성 대장균은 독성형질, 일상 역학, 임상 형질 및 병리생리학적 작용기전에 따라 네 가지 아유형인 장병원성 대장균(Enteropathogenic E. coli), 장독성 대장균(Enterotoxigenic E. coli, ETEC), 장침입성 대장균(Enteroinvasive E. coli); 및 장출혈성 대장균(Enterohemorrhagic E. coli)으로 분류된다.

장병원성 대장균(enteropathogenic E.coli : EPEC)은 대표적인 영아 및 유아 설사증을 유발하는 원인균이다(Nataro JP and JB Kaper, Clin. Microbiol Rev., 11, 142-201 (1998)). 장병원성 대장균은 장독소를 생성하지 않으나, 숙주세포에서 미세융모의 소멸(effacement) 및 숙주세포막의 부착(attachment)과 같은 부착 및 소멸(attaching and effacing ; A/E) 손상을 유발하여 장관 상피세포의 기능을 파괴한다(Frankel et al., Mol Microbiol., 30, 911-921 (1998)).

장병원성 대장균의 부착성은 eae(effacing and attaching E. coli)유전자 산물에 의해 조절되는데, 상기 유전자는 인티민(intimin)이라 명명된 94kDa의 세포외막단백질을 코딩한다(Jerse et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 7839-7843 (1990)). 장병원성 대장균은 인티민 단백질이 먼저 숙주의 표적세포에 작살을 박듯이 붙으면, 그 다음으로 숙주 세포의 표피막에 Tir 이라는 수용체를 박아 넣게 되어 장세포를 감염시킨다. McKee 등은 인티민에 대한 항혈청이 HEp-2세포에 대한 대장균의 부착성을 차단한다고 보고하였으며 또한 인티민의 아미노산 서열 중에서 중앙, N-말단 위치보다 C-말단의 아미노산 잔기가 HEp-2세포와의 상호작용이 훨씬 강하게 일어난다고 보고하였다(Kenny 등, 1997).

상기 병원체에 의한 영아 및 유아의 설사증을 예방 및 치료하기 위한 항혈청, 초유 및 단일클론 항체 등이 많이 개발되었다. 그러나, 항혈청이나 초유, 단일클론항체를 이용한 항체의 활용은 매우 효과적이나 다량의 혈청항체를 얻기 위해서는 비용이 많이 소요되며 또한 분리 및 보관에 따른 기술적 문제점이 발생된다. 혈청항체는 혈액으로부터 혈청과 면역글로불린을 분리 및 보관하는데 따른 제반 기술 및 소요경비가 고가이기 때문에 실용적이지 못하다. 초유의 경우는 제한된 기간에만 분비되기 때문에 충분한 양의 초유항체 생산은 불가능하다.

80년대 후반에서 90년대 초에 이르러 몇몇 연구자들에 의해 산란계의 알을 이용한 항체단백질에 대한 연구가 시작되었다. 산란계의 알, 특히 난황(yolk of the egg)은 특이항체의 풍부한 자원으로써 알려져 있다 (Gassmann, et al., FASEB J, 4, 2528-2538 (1990)). 토코로 등은 병원체를 항원으로 사용하여 면역화시킨 닭에 의해 생산된 알, 알의 알부민 및 난황으로부터 획득한 항체를 함유한 물질로 장관 감염성 질병의 치료방법을 제시한 바 있다(미국특허 제5080895호). 또한, 유전자 백신을 이용한 병원성 대장균에 대한 난황항체(국제특허공개 제01/48018호), 자돈의 장관 감염성 질병의 치료를 위한 난황항체(유럽특허공개 제0955061호, 대한민국특허 제267747호, 대한민국특허 제267746호), 로타바이러스에 대한 난황항체(대한민국특허공개 제2001-16599호) 등이 개시된 바 있다. 상술한 방법들은 산란계에 항체를 유도하기 위한 항원으로서, 살아있는 바이러스 또는 세균, 약독화 및 불활화된 바이러스 또는 세균, 바이러스 및 세균의 병원성 관련 유전자를 사용한 것이다.

그러나, 세균 또는 바이러스의 균주 자체를 항원으로 사용하는 경우, 균체 내에 여러 이종 단백질을 많이 함유하고 있기 때문에 단일항원을 사용하는 경우에 비해 항체 역가가 높게 나타나지 않는 단점이 있다.

본 발명자들은 영아 및 유아의 설사증을 유발하는 장병원성 대장균의 부착 단백질을 유전자 재조합에 의해 제조하고, 이를 항원으로 이용하여 산란계를 면역시킨 다음 면역화된 산란계로부터 산란된 알의 난황에서 수용성 단백질을 분리하고, 이에 따라 수득된 수용성 단백질이 영아 및 유아의 설사증을 유발하는 장병원성 대장균에 고도의 결합력을 나타냄으로써 영아 및 유아의 설사증을 예방 및 치료하는데 유용할 수 있음을 확인하였다.

따라서, 한 가지 관점으로서, 본 발명은 유전자 재조합에 의해 제조된 영아 및 유아의 설사증을 유발하는 장병원성 대장균의 부착 단백질을 항원으로서 사용하여 면역화된 산란계로부터 산란되고 영아 및 유아 설사증의 예방 및 치료에 유용한 수용성 단백질을 포함한 알을 제공한다.

다른 관점으로서, 본 발명은 유전자 재조합에 의해 제조된 영아 및 유아의 설사증을 유발하는 장병원성 대장균의 부착 단백질을 항원으로서 사용하여 면역화된 산란계로부터 산란된 알의 난황으로부터 분리되고 영아 및 유아 설사증의 예방 및 치료에 유용한 수용성 단백질을 제공한다.

또 다른 관점으로서, 본 발명은 (a) 장병원성 대장균의 부착단백질을 코딩하는 DNA 서열을 이 DNA 서열에 작동가능하게 연결되어(operatively linked) 그의 발현을 조절하는 하나 또는 그 이상의 발현 조절 서열(expression control sequence)을 포함하는 벡터에 삽입시키고, (b) 이로부터 형성된 재조합 발현 벡터로 숙주를 형질전환시키며, (c) 생성된 형질전환체를 상기 DNA 서열이 발현되도록 하기에 적절한 배지 및 조건하에서 배양하고, (d) 배양된 형질전환체를 파쇄시키고 파쇄물로부터 실질적으로 순수한 부착 단백질을 회수하며, (e) 회수된 부착단백질로 산란계를 면역화시키고, (f) 면역화된 산란계로부터 알을 산란시키는 단계를 포함함을 특징으로 하여, 영아 및 유아의 설사증을 예방 및 치료하는데 유용한 수용성 단백질을 포함한 알을 제조하는 방법을 제공한다.

또 다른 관점에서, 본 발명은 (a) 장병원성 대장균의 부착단백질을 코딩하는 DNA 서열을 이 DNA 서열에 작동가능하게 연결되어(operatively linked) 그의 발현을 조절하는 하나 또는 그 이상의 발현 조절 서열(expression control sequence)을 포함하는 벡터에 삽입시키고, (b) 이로부터 형성된 재조합 발현 벡터로 숙주를 형질전환시키며, (c) 생성된 형질전환체를 상기 DNA 서열이 발현되도록 하기에 적절한 배지 및 조건하에서 배양하고, (d) 배양된 형질전환체를 파쇄시키고 파쇄물로부터 실질적으로 순수한 부착 단백질을 회수하며, (e) 회수된 부착단백질로 산란계를 면역화시키고, (f) 면역화된 산란계로부터 알을 산란시키고, (g) 산란된 알의 난황으로부터 수용성 단백질을 분리하는 단계를 포함함을 특징으로 하여, 영아 및 유아의 설사증을 예방 및 치료하는데 유용한 수용성 단백질을 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명에 있어서 영아 및 유아의 설사증을 유발하는 장병원성 대장균의 병원성인자로서 장병원성 대장균의 부착 단백질이 사용되며 대표적으로 인티민 단백질이 예시된다. 바람직하게는, 상기 인티민 단백질의 C-말단 아미노산 잔기 2699부터 3511로 구성된 단백질 IntC가 예시된다. 여기서, 용어 "영아"는 생후 2주부터 만 2세까지의 시기에 있는 아이를 가리키며 용어 "유아"는 만 2세부터 만 6세까지의 시기에 있는 아이를 가리킨다.

상기 장병원성 대장균의 병원성인자는 유전자 재조합으로 제조한다. 유전자 재조합에 의한 병원성 인자의 제조는 공지 기술을 사용할 수 있다. 일반적으로, 유전자 재조합에 의한 병원성인자의 제조는 병원체로부터 게놈 DNA를 분리하고, 이로부터 중합효소 연쇄반응을 실시하여 cDNA를 제조하며, 생성된 cDNA를 주형으로 하여 표적유전자를 증폭하고, 상기 표적유전자의 DNA 서열을 하나 또는 그 이상의 발현 조절 서열(expression control sequence)을 포함하는 벡터에, 그 DNA 서열과 작동가능하게 연결되어(operatively linked) 그 DNA 서열의 발현을 조절할 수 있도록 삽입시키고, 이로부터 형성된 재조합 발현 벡터로 숙주를 형질감염 또는 형질전환시키며, 생성된 형질감염 또는 형질전환체를 상기 DNA 서열이 발현되도록 하기에 적절한 배지 및 조건하에서 배양하고, 배양된 형질전환체로부터 생성된 재조합 단백질을 분리 및 정제하는 단계로 구성된다.

장병원성 대장균의 게놈 DNA는 장병원성 대장균을 배양용 배지에 접종하여 적합한 배양 조건 하에서 배양하여 균체를 획득한 다음, 여기에 용해완충용액을 가하여 균체를 용균시키고, 원심분리하여 획득한 상청액으로부터 단백질과 RNA 등을 제거하여 순수한 DNA만을 추출함으로써 획득할 수 있다. 장병원성 대장균의 배양용 배지로는 특별히 한정되지는 않으나 트립톤, 효모 추출물 및 NaCl로 구성된 LB배지를 사용한다. 바람직한 배양 조건으로는 배양 온도 범위 30℃ 내지 40℃에서 10시간 내지 30시간 배양한다. 배양액의 원심분리는 10,000rpm 내지 15,000rpm에서 1분 내지 10분간 실시한다.

장병원성 대장균의 부착 단백질을 코딩하는 유전자는 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하여 중합효소 연쇄반응을 실시함으로써 제조할 수 있다. 중합효소 연쇄반응에 사용되는 시발체는 유전자 은행에서 획득한 염기서열을 참고로 하여 합성할 수 있다.

상기와 같은 방법으로 제조된 유전자를 적합한 벡터에 클로닝한다. 본 발명의 한 가지 양태는 본 발명에 따른 장병원성 대장균의 부착단백질을 코딩하는 유전자(eae)를 포함하고 발현할 수 있는 재조합 플라스미드 pGEX:IntC를 제공한다. 용어 "벡터"는 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자, 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물일 수 있다. 예를 들어 pUC8, pBR322, pET/Rb, pGEX, pET28a 등을 사용할 수 있으며 바람직하게는, pGEX를 사용한다. 본 발명에서 예시된 발현벡터는 pGEX:IntC이다.

상술한 발현 벡터에 의해 형질전환 또는 형질감염된 숙주 세포는 본 발명의 또 다른 측면을 구성한다. 본원 명세서에 사용된 용어 "형질전환"은 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체외 인자로서 또는 염색체 통합완성에 의해 복제가능하게 되는 것을 의미한다. 본원 명세서에 사용된 용어 "형질감염"은 임의의 코딩 서열이 실제로 발현되든 아니든 발현 벡터가 숙주 세포에 의해 수용되는 것을 의미한다.

발명의 숙주 세포는 원핵 또는 진핵생물 세포일 수 있다. 또한, DNA의 도입효율이 높고, 도입된 DNA의 발현효율이 높은 숙주가 통상 사용된다. 대장균, 슈도모나스, 바실러스, 스트렙토마이세스, 진균, 효모와 같은 주지의 진핵 및 원핵 숙주들을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 대장균을 사용한다.

본 발명의 재조합 벡터 pGEX:IntC를 상기 숙주세포에 형질전환하는 방법은 통상의 형질전환 방법, 예를 들어 DEAE-덱스트란, 칼슘 포스페이트법, 일렉트로포레이션 방법을 사용할 수 있다.

형질전환체 또는 형질감염체 및 이의 배양물로부터 재조합 부착 단백질을 분리하는 것은 통상적인 공지의 방법에 의해 실시될 수 있다. 불필요한 세포 조각(cell debris) 등을 제거하기 위해 세포 용해물 또는 세포 배양물을 원심분리한 후, 침전, 투석, 각종 컬럼 크로마토그라피 등을 적용한다. 예를 들면 이온교환 크로마토그라피, 겔-침투 크로마토그라피, HPLC, 역상-HPLC, 프렙용 SDS-PAGE, 친화성 컬럼 등의 컬럼 크로마토그라피를 적용할 수 있다. 이온교환 크로마토그래피에 일반적으로 사용되는 이온교환수지로는 셀룰로오스, 덱스트란, 아가로오스 및 폴리아크릴아미드 및 이들의 유도체를 사용할 수 있다. 또한, 겔-배제 크로마토그래피는 덱스트란, 아가로오스 및 폴리아크릴아미드 상에서의 단백질 분리에 많이 사용되는 것으로, 단백질 시료를 단계적으로 또는 농도 구배에 따라 용리함으로써 분리할 수 있다. 겔 여과 크로마토그래피는 분자의 크기에 따라서 분리하는 방법으로 기질 또는 방해물질과 같은 특이한 분자들에 대한 단백질의 자연적인 친화성을 이용하는 친화 크로마토그래피가 매우 유용하게 사용된다. 이는 단백질과 결합하는 분자를 아가로오스와 같은 비불용성인 지지체에 공유결합으로 결합시킨 다음에 이것을 적당한 단백질을 선택적으로 흡착하는 지지체로 사용함으로써 단백질을 분리하는 방법이다. 바람직하게는, 본 발명에 따라 형질전환된 대장균 및 이의 배양물을 초음파 파쇄한 후 약 4℃에서 5,000 내지 9,000×g, 10분 내지 40분간 원심분리하여 상청액을 회수하고, 회수한 상청액을 아밀로즈 컬럼을 이용하여 순수한 장병원성 대장균의 부착 단백질 분획을 분리한다.

본 발명에 따라 제조된 상기 재조합 단백질을 항원으로 사용하여 산란계에 면역화시키는 방법은 당 분야의 통상적인 기술에 따라 실시할 수 있다. 본 발명에 이용되는 산란계로는 특별히 한정되지 않으며, 예를 들면 산란율이 높은 백색레그혼계, 로드아일랜드계, 하이라인 브라운계 등을 이용하는 것이 바람직하다. 산란계에 항원 단백질을 투여하는 경로로는 복멤브레인내, 근육내, 안내 또는 피하 주사 등이 포함된다. 본 발명의 항원 단백질은 보조제, 예를 들어 프로인트(Freund)의 완전 보조제 또는 불완전 보조제를 사용하여 그 면역성을 증가시킬 수 있다.

추가항원접종(booster)은 충분한 항체가 얻어질 때까지 실시할 수 있다. 바람직하게는 2주 간격으로 3회 면역을 실시하고, 다음 접종은 약 8주 간격으로 실시한다. 면역화된 산란계로부터 알을 수집하고 이로부터 목적하는 단백질을 분리한 다음 유도된 단백질의 양을 측정하여 그 증가량이 정체 상태에 도달하면, 최종적으로 알을 회수한다.

상기 유도된 단백질의 양은 당 분야의 통상적인 방법에 따라 측정할 수 있다. 바람직하게는, 효소면역흡착법 또는 마이크로타이터법으로 측정한다. 더욱 바람직하게는, 마이크로플레이트에 부착된 재조합 단백질 IntC와 본 발명에 따라 면역화된 알의 난황으로부터 분리한 수용성 단백질을 반응시킨 다음 알칼린 포스페이트로 희석한 2차 항체를 반응시키고 여기에 기질용액으로 포스페이트 섭스트레이트 타블레트를 가하여 효소작용에 의한 발색반응을 약 405nm의 파장에서 측정함으로써 유도된 단백질을 정량할 수 있는 방법인 효소면역측정법(Enzyme Linked Immunosorbent Assay: ELISA)을 사용한다.

본 발명에 따른 수용성 단백질은 상기 회수된 알에서 난황을 분리하고, 이를 증류수로 희석한 다음, 희석액의 pH를 4.0 내지 6.0으로 조절한 후 동결시키고, 동결체를 해동시켜 원심분리하며, 형성된 상청액을 여과함으로써 분리할 수 있다. 바람직하게는 회수된 알에서 난황을 분리하고 증류수를 가하여 5배 내지 15배로 희석한 다음, 희석액의 pH를 약 5.0으로 조절한 후 -10℃ 내지 -30℃에서 약 24시간 이상 동결시키고, 동결체를 실온에서 해동시켜 5,000 내지 15,000×g, 10℃ 내지 20℃에서 20 내지 40분간 원심분리하며, 형성된 상청액을 여과지로 여과하여 분리한다.

본 발명에 따라 면역화된 알의 난황으로부터 분리된 단백질은 장병원성 대장균과 강력하게 결합하는 능력이 있다. 이는 형광성항체시험법, 효소면역측정법 및 방사면역분석을 통해 확인할 수 있다. 예를 들면, 상기 난황 수용성 단백질 각각을 농도별로 장병원성 대장균 배양액에 첨가하고 그 결합정도를 경쟁적 샌드위치 효소면역측정법으로 분석한 결과, 상기 병원체와 강력한 결합능력이 있음을 확인하였다.

본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 본 발명이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1

장병원성 대장균의 IntC 유전자 클로닝

(1-1) 장병원성 대장균으로부터 게놈 DNA의 분리

장병원성 대장균(ATCC 33780)을 LB 배지(트립톤 10g, 효모 추출물 10g, NaCl 10g 1ℓ^-1)에서 37℃, 호기성 조건 하에서 하루동안 배양하였다. 배양하여 회수한 균체를 1회 원심세척하고 0.15M PBS [phosphate-buffered saline, (pH 7.4)]로 재부유시킨 후 동량의 용해버퍼 [50mM Tris-HCl, 50mM EDTA, 0.3% SDS, 20㎍/㎖ proteinase K (pH 8.0)]를 가하여 50℃에서 2시간 용균시켰다. 원침한 후 상청액을 수거하여 2회에 걸쳐 페놀-클로로포름-이소아밀 알콜[phenol-chloroform-isoamyl alcohol (25 : 24 : 1, v/v)]로 추출한 다음 에탄올 침전법으로 게놈 DNA를 분리하였다.

(1-2) 장병원성 대장균의 eaeA 유전자 클로닝

장병원성 대장균의 부착성을 조절하는 eaeA(effacing and attaching E. coli)유전자의 DNA 염기서열(U60002)은 유전자은행(EMBL, Nucleotide Sequence Database, Cambridge, UK.)으로부터 얻었다. 총 2820bp 유전자 중에서 중합효소 연쇄반응에 의해 증폭된 부분은 2699부터 3511의 위치였다. 중합효소연쇄반응 혼합액에는 정방향 시발체(5'-BamHI-gcgaaggcagatggttctg-3') 0.2μM, 역방향 시발체 (5'-ECoRI-ttattttacacaaacagaaaaagc-3') 0.2μM, 주형으로는 1㎕의 플라스미드 DNA, 200μM dNTP 및 Taq 폴리머라제 2 유닛을 포함하여 총 50㎕의 반응액을 사용하였다. 표적유전자를 증폭하기 위해서 초기변성 단계(94℃에서 5분간)를 실시한 후 총 30회(cycle)을 수행하였으며 1회(cycle)당 94℃에서 2분간, 56℃에서 1분간, 72℃에서 1분간을 단계적으로 진행하고 마지막 연장반응으로 10분간 72℃에서 반응시켰다. 반응이 끝난 후 아가로즈 젤에서 용출하였다.

증폭된 삽입 DNA와 pGEX.4T.1 벡터(Phamacia)를 제한효소 BamHI과 EcoRI를 이용하여 37℃에서 반응하였다. 절단된 DNA를 전기영동을 실시한 후 젤 클린 키트 (Geneclean kit ;BIO 101)를 이용하여 DNA단편들을 얻어내었다. 삽입 DNA와 벡터를 혼합한 후 라이게이즈 완충액과 T4라이게이즈를 첨가하여 4℃에서 16시간 동안 접합반응을 수행하였다(도 1). 이를 대장균 JM109혹은 BL21에 형질전환시켜 양성클론을 선택하였다.

실시예 2

재조합 단백질 IntC의 발현 및 정제

(2-1) 재조합 단백질 IntC의 발현

실시예 1에서 획득한 양성클론을 취하여 10㎖의 암피실린을 포함한 LB 배지에 접종 후 하룻밤동안 37℃에서 진탕 배양하였다. 준비된 1000㎖의 LB 배지에 밤새 배양된 대장균을 접종하여 흡광도(A₆₀₀)가 1.0이 되도록 진탕배양하고 발현을 유도하기 위해 0.1mM의 IPTG를 가하여 30℃에서 3시간 더 배양하였다. 원침 (8,000rpm, 20분, 4℃)하여 대장균을 얻은 다음 -70℃에서 저장하면서 다음 실험의 시료로 사용하였다.

(2-2) 재조합 단백질 IntC의 정제

장병원성 대장균 펠렛을 컬럼 완충액(20mM Tris-HCl pH7.4, 200mM NaCl, 1mM EDTA)으로 재부유시켰다. 현탁액을 초음파 파쇄를 실시한 후 원침(9,000Xg, 30분, 4℃)하여 상청액을 취한 뒤 컬럼 완충액으로 적당히 희석하여 평형화된 아밀로즈 컬럼에 로딩하였다. 컬럼 완충액(컬럼 부피의 12배)으로 세척하고, 용출 완충액(10mM이 함유된 컬럼 완충액)으로 단백질 분획을 얻어내었으며 BCA 분석 키트(pierce)로 정량하였다. 분리된 단백질을 SDS-PAGE(도 2, 레인1: 단백질 마커, 레인2: GST-IntC)와 웨스턴 블럿으로 정성검사를 하였다.

실험 결과, 정량된 단백질을 1리터 대장균을 배양시를 기준으로 환산할 경우 20mg의 수율이며 이것은 자연형에서 표적하는 단백질을 분리하는 것보다 높은 수율이다.

실시예 3

장병원성 대장균 크루드 인티민 단백질 IntC 분획의 면역원성 검사

장병원성 대장균을 LB배지에서 18시간 동안 37℃에서 진탕 배양하였다. 용해 완충액(50mM Tris[pH 7.5], 50mM NaCl, 1mM phenymethy lsulfonyl fluoride)으로 재부유 시킨 후 세포를 파쇄하였다. 파쇄가 안된 세균을 제거하기 위해 저속에서 원침하였다. 상청액에 트립톤X-100이 1%가 되도록 가한 후 교반한 후 실온에서 다시 원심분리를(20000xg, 150분)하여 침전물을 시료 완충용액(sample buffer)에 녹여 SDS-PAGE의 시료로 사용하였다. 준비된 재조합 단백질(IntC)의 토끼 항혈청을 이용하여 웨스턴 블럿을 실시하여 약 94kDa의 단백질임을 확인하였다 (도 3).

실시예 4

재조합 단백질 IntC를 이용한 산란계의 면역유도

(4-1) 공시동물

상기 실시예에서 획득한 재조합 단백질 IntC를 이용한 산란계의 면역 유도에 사용된 동물은 산란을 시작한 36주령의 ISA-브라운계의 산란계 15수를 사용하였다.

(4-2) 산란계의 면역유도

준비된 재조합 단백질(1㎎/㎖)과 프로운트의 완전 보조제(Freund's complete adjuvant, Sigma Chemical Co.)를 각각 동량 혼합하여 유화시켰다. 상기 유화액 1 ㎖를 산란계의 흉근에 각각 0.25 ㎖씩 4곳에 근육 주사하여 1차 접종하였다. 추가항원주입(Booster injection)은 1차 접종 후 2주 간격으로 총 3 내지 4회 실시하였으며 다음 접종은 8주 간격으로 실시하였다. 2차 접종부터는 프로운트의 불완전 보조제(Freund's incomplete adjuvant, Gibco)로 유화하여 1차 접종과 동일한 방법으로 실시하였다. 난은 매일 회수하여 8 ℃에 저장하여 실험에 이용하였다.

(4-3) 수용성 단백질의 분리

채집한 알에서 난황을 분리 후 증류수(pH 5.0)로 10배 희석하였다. 희석용액을 pH 5.0으로 조정 후 -20℃에서 하루 동안 동결하였다. 이를 실온에서 해동시킨 후 30분간 15℃에서 원심분리(10,000×g)하여 상청액만 수거하였다. 상청액을 여과지(Whatman No.1)로 여과하여 알 유래단백질을 분리하였다. 그리고 분리된 수용성 단백질은 -20℃에 보관하면서 각종 실험의 시료로 사용하였으며 일부는 냉동건조하여 보관하였다.

(4-4) ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)분석

재조합 단백질 IntC를 각각 5 내지 10 ㎍/㎖이 되도록 중탄산염 완충용액(pH 9.6)으로 희석하여 마이크로플레이트(MicrotestⅢ flexible Assay plate, Falcon 3991)에 4℃에서 하루 동안 피복하였다. 피복이 완료된 플레이트를 세척용액 (0.02M 포스페이트 완충용액, 0.13M NaCl, pH 7.2, 0.05 % 트윈20)으로 3회 세척한 후 5%탈지유 용액(pH 7.3, Difco)으로 2시간 동안 실온에서 방치하였다. 본 발명에 따른 수용성 단백질은 5% 탈지유 용액과 PBST(PBS containing 0.05% Tween-20)를 동량으로 섞은 희석용액으로 2,000배부터 1,458,000배까지 3배수로 희석한 후 37℃에서 2시간 반응시켰다. 2차 항체는 알칼린 포스페이트로 컨쥬게이티드 어피니퓨어 토끼 항-닭 IgY(IgG)(conjugated AffiniPure rabbit anti-chicken IgY(IgG), Jackson, USA)를 5,000배로 희석하여 37℃에서 2시간 반응시켰다. 기질용액으로는 포스페이트 섭스트레이트 타블레트(Phosphate substrate tablets: ρ-nitrophenyl phosphate, Sigma-104)를 10% 디에탄올아민(0.5mM MgCl₂ pH 9.8를 포함하는 디에탄올아민)에 녹인 용액을 사용하여 20분간 효소반응시켰다. 각 과정 중 플레이트의 세척은 6회씩 실시하였다. 반응억제제는 5 M 수산화나트륨을 사용하였으며 마이크로플레이트 리더(Molecular Devices ;E Max)를 이용하여 405nm에서 OD(optical density)를 측정한 결과, 표 1에 나타낸 바와 같이, 수용성 단백질이 유도됨을 확인하였다.

재조합 단백질 IntC에 의해 유도된 수용성 단백질

접종후 평균 O.D (50000배 희석)
0주	2주	4주	12주	20주
< 0.01	0.2	0.82	1.51	1.41

실시예 5

장병원성 대장균에 대한 수용성 단백질의 결합력 조사

1×10⁹(CFU/㎖) 농도로 희석된 균체용액 10㎖을 멸균된 시험관에 분주한 후, 분리된 알 유래단백질의 농도가 각각 5, 10, 15, 20, 25㎎이 되도록 첨가하였고, 첨가하지 않은 군을 대조군으로 하였다. 첨가 후 37℃에서 2시간동안 진탕배양한 후 냉장보관하여 실험에 이용하였다. 반응정도 조사는 경쟁적 샌드위치 ELISA(competitive sandwich ELISA) 방법을 이용하였다. 2차 항체로는 토끼 항-IntC 항체(Rabbit anti-IntC antibody,1:2000)과 AP-당나귀 항-토끼 IgG(AP-Donkey anti-rabbit IgG, 1:1250)을 혼합한 용액을 사용하였으며 완충액 및 세척방법은 상기 실시예 (4-4)의 방법과 동일하게 사용하였다. 균주의 표준 농도는 1X10¹⁰, 1X10⁹, 1X10⁸, 1X10⁷, 1X10⁶, 1X10⁵, 1X10⁴(CFU/ml)으로 작성하였다.

실험 결과, 표 2에 나타낸바와 같이, 본 발명에 따른 수용성 단백질은 영아 및 유아 설사증의 원인균주인 장병원성 대장균과 모두 강력한 결합능력이 있는 것으로 나타났다.

본 발명에 따른 수용성 단백질의 장병원성 대장균에 대한 결합력

수용성 단백질	장병원성 대장균의 농도(cfu/ml)
0mg	1x10⁹
5mg	1.5x10⁶
15mg	1.6x10⁶
20mg	4.5x10⁶
25mg	2.1x10⁶

상술한 바와 같이, 장병원성 대장균의 부착에 관여하는 단백질로 면역화된 산란계로부터 산란된 알 및 상기 알의 난황으로부터 분리된 수용성 단백질은 장병원성 대장균과 강력한 결합능력이 있다. 따라서 본 발명에 따른 알 및 상기 알로부터 분리된 단백질은 영·유아 설사증의 원인이 되는 장병원성 대장균의 검출, 예방 및 치료제로 사용할 수 있다.

도 1은 장병원성 대장균의 인티민의 C-말단을 발현벡터에 클로닝한 모식도이다.

도 2는 발현된 단백질의 분리, 정제된 SDS-PAGE의 사진이다(레인 1 : 단백질 마커, 레인 2 : GST-IntC).

도 3은 장병원성 대장균의 재조합 단백질 IntC와 이의 항혈청을 이용한 웨스턴 블럿 결과이다.

Claims

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(a) 장병원성 대장균의 인티민을 코딩하는 DNA 서열을 이 DNA 서열에 작동가능하게 연결되어(operatively linked) 그의 발현을 조절하는 하나 또는 그 이상의 발현 조절 서열(expression control sequence)을 포함하는 벡터에 삽입시키고, (b) 이로부터 형성된 재조합 발현 벡터로 숙주를 형질전환시키며, (c) 생성된 형질전환체를 상기 DNA 서열이 발현되도록 하기에 적절한 배지 및 조건하에서 배양하고, (d) 배양된 형질전환체를 파쇄시키고 파쇄물로부터 실질적으로 순수한 인티민을 회수하며, (e) 회수된 인티민으로 산란계를 면역화시키고, (f) 면역화된 산란계로부터 알을 산란시키는 단계를 포함함을 특징으로 하여, 영아 및 유아의 설사증을 예방 및 치료하는데 유용한 수용성 단백질을 포함한 알을 제조하는 방법.
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제8항에 있어서, 재조합 발현 벡터가 재조합 플라스미드 pGEX:IntC인 방법.
(a) 장병원성 대장균의 인티민을 코딩하는 DNA 서열을 이 DNA 서열에 작동가능하게 연결되어(operatively linked) 그의 발현을 조절하는 하나 또는 그 이상의 발현 조절 서열(expression control sequence)을 포함하는 벡터에 삽입시키고, (b) 이로부터 형성된 재조합 발현 벡터로 숙주를 형질전환시키며, (c) 생성된 형질전환체를 상기 DNA 서열이 발현되도록 하기에 적절한 배지 및 조건하에서 배양하고, (d) 배양된 형질전환체를 파쇄시키고 파쇄물로부터 실질적으로 순수한 인티민을 회수하며, (e) 회수된 인티민으로 산란계를 면역화시키고, (f) 면역화된 산란계로부터 알을 산란시키고, (g) 산란된 알의 난황으로부터 수용성 단백질을 분리하는 단계를 포함함을 특징으로 하여, 영아 및 유아의 설사증을 예방 및 치료하는데 유용한 수용성 단백질을 제조하는 방법.
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제11항에 있어서, 재조합 발현 벡터가 재조합 플라스미드 pGEX:IntC인 방법.
제11항에 있어서, 알의 난황으로부터 수용성 단백질을 분리하는 단계가 알의 난황을 증류수로 희석하고, 희석된 난황 용액의 pH를 4.0 내지 6.0으로 조절한 후 동결시키고, 동결체를 해동시켜 원심분리하며, 형성된 상청액을 여과하여 분리하는 것으로 구성되는 방법.