JPH11286499A - 病原性大腸菌を認識するモノクローナル抗体、該モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ及び該モノクローナル抗体を用いた病原性大腸菌の検出方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 病原性大腸菌、好ましくは腸管出血性大腸
菌、更に好ましくはベロ毒素を産生する腸管出血性大腸
菌、特に好ましくはインティミンを有する腸管出血性大
腸菌を認識するモノクローナル抗体、該モノクローナル
抗体を産生するハイブリドーマ及び該モノクローナル応
対を用いた病原性大腸菌の検出方法。 【効果】 本発明により、病原性大腸菌を認識するモノ
クローナル抗体を提供し、多量検体測定にも迅速に対応
できる免疫測定方法による病原性大腸菌の測定方法の
他、病原性大腸菌の集菌や排除等幅広い応用方法を提供
することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、病原性大腸菌に特
異的なモノクローナル抗体、該モノクローナル抗体を産
生するハイブリドーマ及び該モノクローナル抗体を用い
た病原性大腸菌の検出方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】１９９６年、日本では、病原性大腸菌Ｏ
−１５７による食中毒が散発し、死亡者も含めて患者数
は９０００人にも上がった。病原性大腸菌Ｏ−１５７
は、腸管出血性大腸菌の一種で、赤痢菌の毒素に類似し
たベロ毒素を産生し、出血性大腸炎や溶血性尿毒症症候
群等を引き起こす。重症となった場合は死亡率が高いた
め、感染初期での確定診断や早期治療等が必須である。

【０００３】しかしながら、病原性大腸菌、特にＯ−１
５７の検出手段としては、Ｏ−１５７がソルビトール非
分解性または遅分解性である性質を利用したソルビトー
ル添加の選択培地にて、患者検体を培養するという古典
的な方法が一般的に取られており、時間と手間を要する
ため、緊急の検査には間に合わないことがあった。ま
た、患者からの臨床分離株では、ベロ毒素産生株として
Ｏ−１５７ばかりではなく、Ｏ−２６やＯ−１１１が散
発している事が報告され（Acta Paediatr. Jpn.:37, 46
9-473, (1995)、日本臨牀：55, 651-654, (1997))、大
腸菌培養にＯ−１５７選択培地を用いる培養では、他の
菌株の検出には問題を生じる可能性が危惧される。

【０００４】一方、培養法における選択培地の問題を解
消するために、大腸菌膜表面の糖鎖によって大腸菌のＯ
抗原型を判別する方法も取られてきた。すなわち、膜表
面に存在する糖鎖に対する抗血清を用い、培養によって
増殖させた大腸菌との反応の有無によりＯ抗原型の同定
を行うものである。この方法によれば、選択培地を用い
る方法よりは正確に同定することができるものの、１７
０種類以上が知られているＯ抗原型別分類のうち日本国
内で市販されているＯ抗原型別抗血清は４０種程度であ
り、非常に数多くの株に対応した抗血清を常備しておく
事は、抗血清の特異性、再現性、費用等の面で問題が多
い。また、この方法を用いた場合でも、感度の点で大腸
菌の培養が必要となるため、迅速な対応を必要とする毒
素産生病原性大腸菌の同定には不向きであった。

【０００５】近年では、ベロ毒素産生の有無を検出する
ために、ベロ毒素遺伝子のＰＣＲ法による遺伝子増幅法
も用いられている。ＰＣＲ法による遺伝子増幅は、検出
感度は優れているものの、疑似遺伝子の増幅等による疑
陽性を防ぐためには、検体の前処理を必要とするため、
多数検体の測定に当たっては煩雑さが否めない。また、
前培養後にＯ−１５７に対する抗血清を固定した磁性粒
子を用いて、大腸菌Ｏ−１５７だけを検体中から集菌
し、選択的にＯ−１５７を検出する方法も確立された
（J. Med. Microbiol.: 40, 424-427, (1994) 、 J. Me
d. Microbiol.: 44, 267-271, (1996)、Appl. Environ.
Microbiol.: 62, 587-592, (1996))。しかしながら、
上述したように大腸菌Ｏ−１５７だけがベロ毒素産生株
では無く、抗血清の特異性にも問題があるため、より広
くかつ見逃しの無い反応性を持った病原性大腸菌の検出
方法が望まれていた（日本臨牀：55, 651 - 654 (199
7)）。

【０００６】これらの方法は、Ｏ抗原による型分類別の
病原性大腸菌を検出するものであるが、他方では、病原
性大腸菌に共通する構造を認識する抗体を作製し、ベロ
毒素を産生する危険性の高い病原性大腸菌を一括して検
出しようとする試みもなされ、その中でも腸管出血性大
腸菌の外膜蛋白質であるインティミンが注目されてい
る。インティミンは、大腸粘膜の腸管粘膜上皮細胞に強
い粘着性を示す粘着因子として知られており、腸管出血
性大腸菌はこのインティミンを介して腸管粘膜上皮細胞
に取りつき、ＡＥ障害（Attaching & Effacing）と呼ば
れる一連の細胞骨格構造障害を引き起こして、感染を成
立させる。

【０００７】しかしながら、感染部位への粘着因子とし
て作用するインティミンは、Ｏ抗原型毎の構造が解明さ
れつつある段階で、未だその全容が明らかにはなってな
いない。M.Louie 等のグループは、Ｏ−１５７のインテ
ィミンのＣ末端側２６６アミノ酸残基をＧＳＴと融合さ
た蛋白質を発現させ、これを免疫原として作製した抗血
清により、Ｏ−５、Ｏ−２６、Ｏ−５５、Ｏ−１１１、
Ｏ−１２７、Ｏ−１５７等の種々の大腸菌の交差反応性
を認めたとする報告（Infect. Immun., 61, 4085 - 409
2 (1993)）をしている。

【０００８】一方で、ヒトへの感染株として恐れられて
いるＯ−１５７（ＥＨＥＣ）のインティミンと兎への感
染株として最も良く解明されているＯ−１２７（ＥＰＥ
Ｃ）のインティミンとを比較すると、インティミンのＣ
末端側は非常に変異が激しく株特異的な配列を有してお
り、Ｎ末端側は比較的ホモロジーが高い領域が存在して
いる事が推測される。T.S.Agin等のグループも、Ｏ−２
６とＯ−１１１のインティミンの遺伝子解析において、
株特異的なＣ末端領域の解析を試みており、Ｎ末端領域
に関する遺伝子解析はなされていない (Infect. Immu
n., 65, 320 - 326 (1997)）。

【０００９】これらの報告では、インティミンを用いた
場合の病原性大腸菌の共通認識部位が明らかではなく、
また、抗血清は量が限られるため、研究材料としても充
分ではなかった。よって、病原性大腸菌を広く認識し、
集団感染の検査においても潤沢に再現性良く供給し得る
ようなモノクローナル抗体を作製することが望まれてい
た。

【００１０】

【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
は、病原性大腸菌を直接認識できるようなモノクローナ
ル抗体、該モノクローナル抗体を産生するハイブリドー
マ及び該モノクローナル抗体を用いた病原性大腸菌の免
疫測定方法を提供することにある。

【００１１】

【課題を解決するための手段】本発明者等は、従来の課
題を解決すべく、病原性大腸菌に関する研究を重ねた結
果、ベロ毒素を産生する主な病原性大腸菌のインティミ
ンを共通に認識するモノクローナル抗体を作成し、該モ
ノクローナル抗体を用いた免疫測定方法により病原性大
腸菌の免疫測定をする事に成功して本発明を完成した。
すなわち、本発明は、病原性大腸菌を認識するモノクロ
ーナル抗体、該モノクローナル抗体を産生するハイブリ
ドーマ及び該モノクローナル抗体を用いた病原性大腸菌
の免疫測定方法を提供するものである。

【００１２】本発明のモノクローナル抗体を用いれば、
病原性大腸菌を短時間で直接検出する事ができ、病原性
大腸菌感染の確定診断、食中毒発生の原因解明等に広く
応用する事が出来る他、不溶性物質等に固定化したモノ
クローナル抗体を用いた腸管出血性大腸菌の集菌或いは
体内からの排除等の病原性大腸菌感染後の対応にも応用
することが出来る。

【００１３】以下、本発明を詳細に説明する。本発明に
於て病原性大腸菌とは、腸管病原性大腸菌（ＥＰＥ
Ｃ）、腸管毒素原性大腸菌（ＥＴＥＣ）、腸管侵入性大
腸菌（ＥＩＥＣ）、腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）、腸
管凝集性大腸菌（ＥＡｇｇＥＣ）等の病気を引き起こす
大腸菌を言い、好ましくは腸管出血性大腸菌、更に好ま
しくはベロ毒素を産生する腸管出血性大腸菌、特に好ま
しくは外膜蛋白質としてインティミンを有する大腸菌を
意味する。

【００１４】ベロ毒素を産生する大腸菌としては、Ｏ−
２、Ｏ−５、Ｏ−８、Ｏ−２２、Ｏ−２６、Ｏ−３８、
Ｏ−６９、Ｏ−８４、Ｏ−９８、Ｏ−１０３、Ｏ−１１
１、Ｏ−１１３、Ｏ−１１６、Ｏ−１３２、Ｏ−１４
５、Ｏ−１５３、Ｏ−１５６、Ｏ−１５７等、インティ
ミンを有する大腸菌としては、Ｏ−５、Ｏ−２６、Ｏ−
６９、Ｏ−８４、Ｏ−９８、Ｏ−１０３、Ｏ−１１１、
Ｏ−１４５、Ｏ−１５６、Ｏ−１５７等が挙げられる。
これら病原性大腸菌はウシを媒体としてヒトに感染する
と考えられているが、ヒトから臨床分離された病原性大
腸菌株のほとんどは、インティミンを有していると言う
見方もある。

【００１５】大腸菌Ｏ−１５７のインティミンの分子量
は、９４〜９７ｋＤａで、その塩基配列はG.Beebakhee
やJ.Yue & J.B.Kaoer 等によって明らかにされている
（FEMSMicrobiol. Lett.: 91, 63-68, (1992)、Mol. Mi
crobiol.: 6, 411-417, (1992) ）。また、これまでに
牛から単離された腸管出血性大腸菌株について、インテ
ィミンの遺伝子であるｅａｅＡ ｇｅｎｅの有無を検討
した報告もなされている(Epidemiol. Infect., 116, 1
- 7 (1996)) 。

【００１６】病原性大腸菌を認識するモノクローナル抗
体を取得するには、免疫原として、病原性大腸菌体その
ものを用いても良いが、病原性大腸菌の特異的外膜蛋白
質であるインティミンを用いることが望ましい。免疫原
としてのインティミンは、その全体を用いても、一部分
を用いてもよいが、どのような免疫原として用いたとし
ても、モノクローナル抗体を確立する際にインティミン
に特異的なモノクローナル抗体を選別すればよく、免疫
原はこれらに限定されるものではない。

【００１７】上記のような免疫原を、マウス、ラット、
ハムスター等の免疫動物に免疫する。免疫は常法に従っ
て行うことができ、免疫原は単独でまたはアジュバンド
と共に免疫動物に投与する。免疫後は、血清を採取して
抗体価の上昇を確認し、必要に応じて追加免疫を行うと
よい。抗体価の上昇を確認後、脾臓細胞等のような抗体
産生細胞と、ミエローマ細胞のような腫瘍細胞とを、ポ
リエチレングリコール等のような融合剤で融合してハイ
ブリドーマを作製する。次いでハイブリドーマをＨＡＴ
培地のような選択培地を用いて選択し、限界希釈法等の
適当な方法でモノクローナル化して培養する。この培養
上清を酵素免疫測定法のような適当な免疫測定法で分析
し、目的とする病原性大腸菌に特異的なモノクローナル
抗体を産生しているクローンを選択する。選択の際に
は、インティミン、病原性大腸菌、病原性を示さない大
腸菌等の反応性の有無を基準にして選択することが好ま
しい。

【００１８】これらのモノクローナル抗体作製の手法
は、公知の方法、例えば、ケーラーとミルシュタイン
（Nature 256 495 1975 ）、シェーラー（Nature 285 4
46 1980）等の方法により行うことができる。また上述
の手法により作製したモノクローナル抗体は、プリスタ
ン処理したマウスに該モノクローナル抗体を産生するハ
イブリドーマを投与して得られた腹水、あるいは該モノ
クロナール抗体を産生するハイブリドーマの培養上清か
ら、塩折、イオン交換クロマトグラフィー、プロテイン
Ａを固定化したアフィニティークロマトグラフィー等の
分析・精製手段により回収することができる。

【００１９】本発明のモノクローナル抗体は、病原性大
腸菌の検出方法に様々に用いることができる。例えば、
大腸菌の集菌、免疫測定方法等である。検出方法が集菌
の場合は、例えば本願発明のモノクローナル抗体を不溶
性担体等に固定化し、モノクローナル抗体を介して不溶
化された病原性大腸菌を不溶性担体ごと集めることがで
きる。これを体内にて行えば、感染した体内から病原性
大腸菌のみを排除することもできる。

【００２０】検出方法が免疫測定方法の場合は、公知の
免疫測定方法に用いることができる。例えば、本発明の
モノクローナル抗体を蛍光標識した組織免疫染色法、ウ
エスタンブロット法、本発明のモノクローナル抗体を２
種類用いたサンドイッチ免疫測定法、本発明のモノクロ
ーナル抗体と抗大腸菌抗体とを用いたサンドイッチ免疫
測定法、標識インティミンを用いた競合免疫測定法等を
挙げることができるが、本発明の免疫測定法はこれらに
限定されるものではない。なお、測定する検体には制限
が無く、例えば便、組織抽出液、組織、食品、血清等の
病原性大腸菌の測定に適応できる。

【００２１】

【実施例】本発明を以下参考例及び実施例により更に詳
細に説明する。 参考例１ 病原性大腸菌Ｏ−１５７からのインティミン
遺伝子の単離並びにその解析 報告されているインティミン遺伝子の塩基配列（FEMS M
icrobiol. Lett.:91,63-68, (1992) ) を参考にして、
Ｏ−１５７ゲノムＤＮＡを鋳型として用いてＰＣＲ法に
てインティミン遺伝子３２ａａ−９３５ａａ領域を増幅
した。増幅した断片は、制限酵素ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄ
ＩＩＩで水解した後、図１に示す発現用プラスミドｐＷ
６ＡのＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ部位に挿入し、プラ
スミドｐＷ６ＡｅａｅＡ９００を作製した。挿入された
ＤＮＡ断片の塩基配列を調べたところ、配列番号１に示
すＤＮＡ配列を有し、該ＤＮＡ配列は配列番号１に示す
アミノ酸配列をコードしていた。さらにプラスミドｐＷ
６ＡｅａｅＡ９００を鋳型としてＰＣＲ法にてインティ
ミン遺伝子の３８ａａ−５２２ａａ領域を増幅した。増
幅した断片は制限酵素ＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで水解し
た後、発現用プラスミドｐＷ６ＡのＥｃｏＲＩ−Ｂａｍ
ＨＩ部位に挿入し、プラスミドｐＷ６ＡｅａｅＡＮｐを
作製した。次いでｐＷ６ＡｅａｅＡ９００とｐＷ６Ａｅ
ａｅＡＮｐをそれぞれ用いて、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ
３）（Brookhaven National Laboratoryより入手）を形
質転換させ、インティミンポリペプチド３２ａａ−９３
５ａａ及び３８ａａ−５２２ａａを発現するアンピシリ
ン耐性の形質転換体大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＷ６
ＡｅａｅＡ９００とＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＷ６Ａｅａ
ｅＡＮｐを得た。

【００２２】参考例２ 組換え蛋白質の発現と解析 参考例１で作製した形質転換体を、５０μｇ／ｍｌのア
ンピシリンを含むＬＢ培地２ｍｌ中３７℃で培養した。
予備培養にて６００ｎｍでＯＤを０．６〜０．８にした
後、０．５ｍＭ ＩＰＴＧを添加し発現誘導をおこな
い、さらに２時間培養した。１．５ｍｌ量の菌体培養液
を５０００ｒｐｍで２分間遠心分離して菌体を集め、１
００μｌの緩衝液（１０ｍＭトリス−塩酸ｐＨ８．０、
０．１Ｍ塩化ナトリウム、１ｍＭ ＥＤＴＡ）に懸濁
し、１５分間の超音波破砕により完全に菌体を破砕し
た。これを菌体試料とする。

【００２３】菌体試料８μｌに３倍濃度のポリアクリル
アミドゲル緩衝液（０．１Ｍトリス塩酸ｐＨ６．８、６
％ＳＤＳ、２４％グリセリン、６ｍＭ ＥＤＴＡ、３％
２−メルカプトエタノール、０．０１％ＢＰＢ）４μ
ｌを加え、十分撹拌した後、ＳＤＳポリアクリルアミド
ゲル電気泳動を行った。泳動後ポリアクリルアミドゲル
をタンパク染色し、菌体試料に含まれるタンパクの展開
像を観察した。形質転換体ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＷ６
ＡｅａｅＡ９００及びＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＷ６Ａｅ
ａｅＡＮｐ試料中には、非形質転換体ＢＬ２１（ＤＥ
３）では認められない分子量約９４〜９７ｋＤａ及び約
５５ｋＤａのポリペプチドが存在した。これはプラスミ
ドｐＷ６ＡｅａｅＡ９００及びｐＷ６ＡｅａｅＡＮｐか
らの発現産物と考えられる。発現産物はそれぞれインテ
ィミン９００及びインティミンＮｐと名付けた。

【００２４】参考例３ インティミンＮｐの精製 大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＷ６ＡｅａｅＡＮｐをＬ
Ｂ培地３７℃条件下で培養した。予備培養にて６００ｎ
ｍでＯＤを約０．７の濃度にした後、０．５ｍＭ ＩＰ
ＴＧを添加し発現誘導を行った。４時間培養後、遠心を
行い大腸菌を回収した。回収した大腸菌に５０ｍＭトリ
ス−塩酸緩衝液ｐＨ８．０、２Ｍ尿素を２００ｍｌ加
え、氷冷下で超音波破砕処理を行った。発現したインテ
ィミンＮｐは、遠心後不溶性画分に回収された。不溶性
画分を６Ｍ尿素、２０ｍＭ水酸化ナトリウム溶液ｐＨ１
２．０で可溶化し直ちに１．０Ｍトリス−塩酸緩衝液ｐ
Ｈ８．０を添加してｐＨ９．０とし遠心を行い上清画分
を回収した。この上清を、６Ｍ尿素、５０ｍＭトリス−
塩酸緩衝液ｐＨ９．０で平衡化したＱＦＦ陰イオン交換
カラム（ファルマシア社製）でイオン交換精製した。塩
化ナトリウムを含むカラム平衡化緩衝液で溶出したとこ
ろで約０．３Ｍ塩化ナトリウム溶出画分にインティミン
Ｎｐを回収した。セントリプレップ１０（アミコン社
製）で濃縮を行ったＱＦＦ溶出画分を６Ｍ尿素、０．５
Ｍ塩化ナトリウム、５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液ｐＨ
９．６で平衡化したスーパーデックス２００ゲル濾過カ
ラム（ファルマシア社製）で精製し、分子量約５５ｋＤ
ａのインティミンＮｐを得た。

【００２５】実施例１ 抗インティミンモノクローナル
抗体産生ハイブリドーマの作製 参考例３で調製したインティミンＮｐをフロイント完全
アジュバントと等量混合し、ＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔
内に２００μｌ（約４０μｇ／マウス）投与した。約２
週間の間隔をおいて更に２回、インティミンＮｐをフロ
イント不完全アジュバントと等量混合し、腹腔内に投与
した。抗体価の上昇を確認した後、最終免疫としてイン
ティミンＮｐ約４０μｇを静脈内に投与し、その３日後
に脾臓を摘出した。単離した脾細胞とマウス骨髄腫細胞
株であるＰ３−ｘ６３−Ａｇ８−Ｕ１（大日本製薬から
購入）とを３：１の細胞数の割合で混合し、５０％ポリ
エチレングリコール１５００を用いて細胞融合を行っ
た。細胞はＨＡＴ（１ｘ１０ ^-4Ｍヒポキサンチン、４ｘ
１０^-7Ｍアミノプテリン、１．６ｘ１０^-5Ｍチミン）及
び１０％ウシ胎仔血清添加ＲＰＭＩ１６４０培地（以
下、本明細書においてＨＡＴ培地と記載する）に懸濁
し、９６穴のマイクロカルチャープレートに分注して培
養した。ハイブリドーマが増殖してきたウェルの培養上
清を以下のＥＬＩＳＡ法により調べ、インティミンに反
応するモノクローナル抗体を産生しているハイブリドー
マを選択した。すなわち、参考例３で調製したインティ
ミンＮｐをリン酸緩衝液（以下、本明細書においてＰＢ
Ｓと記載する）で希釈し、９６穴ＥＬＩＳＡプレートに
分注し、４℃で一晩放置して固相に結合させた。次に、
０．０５％ツィーン２０を含むＰＢＳ（以下、本明細書
においてＰＢＳＴと記載する）で洗浄した後、１％スキ
ムミルクを含むＰＢＳを分注し、１時間、３７℃に放置
してブロッキングした。ＰＢＳＴで洗浄後、ハイブリド
ーマの培養上清を分注し、１時間、３７℃に放置した。
続いて同様に洗浄後、ペルオキシダーゼ（以下、本明細
書においてＰＯＤと記載する）標識抗マウス免疫グロブ
リン抗体（ダコ社製）を１０００倍希釈したものを分注
し、１時間、３７℃に放置した。同様の洗浄後、ＰＯＤ
基質（ＡＢＴＳ−過酸化水素系）を加え、室温、１０分
間放置した後反応停止液を加え、４０５ｎｍの吸収を測
定した。陽性ウェルの細胞は限界希釈法にてクローニン
グした。単一コロニーを含むウェルの細胞上清の抗体活
性を上記の方法で調べ、選択、培養し、インティミンに
反応するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ
ＩＮＴＮ２０２、ＩＮＴＮ２０３、ＩＮＴＮ２１５、Ｉ
ＮＴＮ２１６及びＩＮＴＮ２２８を樹立した。これらの
ハイブリドーマは大量培養し、それぞれマウス腹腔内に
投与し、腹水を回収した。さらに、アフィ−プレッププ
ロテインＡマップスＩＩキット（バイオラド社製）を用
いて腹水より抗体を精製し、モノクローナル抗体を得
た。これらの抗体をモノクローナル抗体ｉｎｔｎ２０
２、ｉｎｔｎ２０３、ｉｎｔｎ２１５、ｉｎｔｎ２１６
及びｉｎｔｎ２２８と命名した。尚、樹立したハイブリ
ドーマのうち、ＩＮＴＮ２１５とＩＮＴＮ２２８は生命
工学工業技術研究所に寄託され、その受託番号はＦＥＲ
Ｍ Ｐ−１６７２９、ＦＥＲＭ Ｐ−１６７３０であ
る。

【００２６】実施例２ 抗インティミンモノクローナル
抗体の反応性 （１）発現誘導した大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＷ６
ＡｅａｅＡ９００に対する反応性 参考例２と同様の方法で発現誘導させた大腸菌ＢＬ２１
（ＤＥ３）／ｐＷ６ＡｅａｅＡ９００及び大腸菌ＢＬ２
１（ＤＥ３）をＰＢＳで３回洗浄後、６６０ｎｍで１．
０のＯＤになるようにをＰＢＳで稀釈した。これを９６
穴ＥＬＩＳＡプレートに分注し、３７℃で一晩放置して
乾固させた。次に、ＰＢＳＴで洗浄した後、１％スキム
ミルクを含むＰＢＳを加え、３７℃で１時間ブロッキン
グした。ＰＢＳＴで洗浄後、１％ＢＳＡ−ＰＢＳで２μ
ｇ／ｍｌに希釈した抗インティミンモノクローナル抗体
ｉｎｔｎ２０２、ｉｎｔｎ２０３、ｉｎｔｎ２１５、ｉ
ｎｔｎ２１６、ｉｎｔｎ２２８及び陰性コントロール抗
体としてインティミンに反応しないモノクローナル抗体
をそれぞれ加え、３７℃で１時間反応させた。続いて同
様に洗浄後、１０００倍希釈したＰＯＤ標識抗マウス免
疫グロブリン抗体（ダコ社製）を加え、３７℃で１時間
反応させた。同様の洗浄後、ＰＯＤ基質（ＡＢＴＳ−過
酸化水素系）を加え、室温、１０分間放置した後反応停
止液を加え、４０５ｎｍの吸収を測定した。。結果を表
１に示す。抗インティミンモノクローナル抗体ｉｎｔｎ
２０２、ｉｎｔｎ２０３、ｉｎｔｎ２１５、ｉｎｔｎ２
１６及びｉｎｔｎ２２８は通常の大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ
３）には反応しないが、インティミン９００を発現させ
た大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＷ６ＡｅａｅＡ９００
には反応することが確認できた。

【００２７】

【表１】

【００２８】（２）ウエスタンブロットによる病原性大
腸菌Ｏ−１５７、Ｏ−２６、Ｏ−１１１に対する反応性
の確認 病原性大腸菌Ｏ−１５７、Ｏ−２６、Ｏ−１１１及び遺
伝子工学の分野で用いられている大腸菌ＤＨ５α、ＢＬ
２１（ＤＥ３）をＬＢ培地で３７℃一晩培養した。１ｍ
ｌ量の菌体培養液を５０００ｒｐｍで２分間遠心分離し
て菌体を集め、１５０μｌのポリアクリルアミドゲル緩
衝液（２０％グリセリン、１％ＳＤＳ、１０ｍＭトリス
−塩酸、ｐＨ６．８、１％ ２−メルカプトエタノー
ル、０．０１％ＢＰＢ）に懸濁し、１５分間の超音波破
砕により完全に菌体を破砕した。沸騰水中で加熱した
後、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ
−ＰＡＧＥ）を行い、更にニトロセルロース膜に転写し
た。転写膜を１％スキムミルクを含むＰＢＳでブロッキ
ングした後、１％ＢＳＡ−ＰＢＳで２μｇ／ｍｌに希釈
した抗インティミンモノクローナル抗体ｉｎｔｎ２０
２、ｉｎｔｎ２０３、ｉｎｔｎ２１５、ｉｎｔｎ２１６
及びｉｎｔｎ２２８を室温、１時間反応させた。ＰＢＳ
Ｔによる洗浄後、３００倍希釈したＰＯＤ標識抗マウス
免疫グロブリン抗体（ダコ社製）と室温、１時間反応さ
せた。更にＰＢＳＴによる洗浄を行った後、ＰＯＤ不溶
性基質（４クロロナフトール−過酸化水素系）を加え
て、発色させた。結果を図２に示す。病原性大腸菌Ｏ−
１５７、Ｏ−２６、Ｏ−１１１では分子量９４ｋＤａ付
近にバンドを生じたが、大腸菌ＤＨ５α、ＢＬ２１（Ｄ
Ｅ３）では同様のバンドが認められなかった。抗インテ
ィミンモノクローナル抗体ｉｎｔｎ２０２、ｉｎｔｎ２
０３、ｉｎｔｎ２１５、ｉｎｔｎ２１６及びｉｎｔｎ２
２８は病原性大腸菌Ｏ−１５７、Ｏ−２６、Ｏ−１１１
のインティミンに反応することが確認できた。

【００２９】実施例３ 抗インティミンモノクローナル
抗体のエピトープ解析 （１）エピトープ解析用のペプチド作製 エピトープ解析用のペプチドとして、免疫原として用い
たインティミンＮｐの部分ペプチドを作製した。まず、
参考例１で作製したｐＷ６ＡｅａｅＡＮｐを鋳型として
用いてＰＣＲ法にて特定の部分ペプチド領域をコードす
る遺伝子領域を増幅した。増幅した断片は、それぞれ制
限酵素ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩで水解した後、図２
に示すチオレドキシン融合発現プラスミドｐＷＴ８Ａの
ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ部位に挿入した。次いで、
それぞれの組み換えプラスミドを用いて、大腸菌ＢＬ２
１（ＤＥ３）（Brookhaven National Laboratoryより入
手）を形質転換した。形質転換体は、参考例２と同様の
方法でチオレドキシン融合蛋白として発現させた。発現
させた特定の部分ペプチド領域は、配列表１に示すイン
ティミンのアミノ酸番号で、３８〜２３５、２３７〜５
２２、１５８〜３５１、３８〜１５７、１５８〜２３
６、３８〜９０、９１〜１５７、８２〜９９の計８種類
である。これらの部分ペプチドは、ＮｐＡ、ＮｐＢ、Ｎ
ｐＣ、ＮｐＤ、ＮｐＦ、ＮｐＨ、ＮｐＩ、ＮｐＮと命名
した。

【００３０】（２）実施例３−（１）で作製した部分ペ
プチド８種類を用いて、ウエスタンブロットにより、実
施例１で作製したハイブリドーマが産生するモノクロー
ナル抗体のエピトープ解析を行った。ウエスタンブロッ
ト法は、実施例３−（１）で作製した部分ペプチド８種
をＳＤＳ−ＰＡＧＥした他は、実施例２−（２）に記載
の方法にて行った。結果を表２に示す。表２に示すよう
に、モノクローナル抗体ｉｎｔｎ２０２、ｉｎｔｎ２０
３、ｉｎｔｎ２１５、ｉｎｔｎ２１６及びｉｎｔｎ２２
８はいずれも、インティミンの３８〜１５７アミノ酸領
域に結合することが明らかとなった。

【００３１】

【表２】

【００３２】

【発明の効果】本発明により、病原性大腸菌に特異的な
モノクローナル抗体、該モノクローナル抗体を産生する
ハイブリドーマ及び該モノクローナル抗体を用いた病原
性大腸菌の免疫測定方法を提供し、病原性大腸菌を簡便
に測定することができる。

【００３３】

【配列表】 配列番号：１ 配列の長さ：２７１２ 配列の型：核酸 トポロジー：二本鎖 配列の種類：核酸 配列 TAT GTT AAT CAG AAT TCA TTT GCA AAT GGT GAA AAT TAT TTT AAA TTG 48 Tyr Val Asn Gln Asn Ser Phe Ala Asn Gly Glu Asn Tyr Phe Lys Leu 5 10 15 GGT TCG GAT TCA AAA CTG TTA ACT CAT GAT AGC TAT CAG AAT CGC CTT 96 Gly Ser Asp Ser Lys Leu Leu Thr His Asp Ser Tyr Gln Asn Arg Leu 20 25 30 TTT TAT ACG TTG AAA ACT GGT GAA ACT GTT GCC GAT CTT TCT AAA TCG 144 Phe Tyr Thr Leu Lys Thr Gly Glu Thr Val Ala Asp Leu Ser Lys Ser 35 40 45 CAA GAT ATT AAT TTA TCG ACG ATT TGG TCG TTG AAT AAG CAT TTA TAC 192 Gln Asp Ile Asn Leu Ser Thr Ile Trp Ser Leu Asn Lys His Leu Tyr 50 55 60 AGT TCT GAA AGC GAA ATG ATG AAG GCC GCG CCT GGT CAG CAG ATC ATT 240 Ser Ser Glu Ser Glu Met Met Lys Ala Ala Pro Gly Gln Gln Ile Ile 65 70 75 80 TTG CCA CTC AAA AAA CTT CCC TTT GAA TAC AGT GCA CTA CCA CTT TTA 288 Leu Pro Leu Lys Lys Leu Pro Phe Glu Tyr Ser Ala Leu Pro Leu Leu 85 90 95 GGT TCG GCA CCT CTT GTT GCT GCA GGT GGT GTT GCT GGT CAC ACG AAT 336 Gly Ser Ala Pro Leu Val Ala Ala Gly Gly Val Ala Gly His Thr Asn 100 105 110 AAA CTG ACT AAA ATG TCC CCG GAC GTG ACC AAA AGC AAC ATG ACC GAT 384 Lys Leu Thr Lys Met Ser Pro Asp Val Thr Lys Ser Asn Met Thr Asp 115 120 125 GAC AAG GCA TTA AAT TAT GCG GCA CAA CAG GCG GCG AGT CTC GGT AGC 432 Asp Lys Ala Leu Asn Tyr Ala Ala Gln Gln Ala Ala Ser Leu Gly Ser 130 135 140 CAG CTT CAG TCG CGA TCT CTG AAC GGC GAT TAC GCG AAA GAT ACC GCT 480 Gln Leu Gln Ser Arg Ser Leu Asn Gly Asp Tyr Ala Lys Asp Thr Ala 145 150 155 160 CTT GGT ATC GCT GGT AAC CAG GCT TCG TCA CAG TTG CAG GCC TGG TTA 528 Leu Gly Ile Ala Gly Asn Gln Ala Ser Ser Gln Leu Gln Ala Trp Leu 165 170 175 CAA CAT TAT GGA ACG GCA GAG GTT AAT CTG CAG AGT GGT AAT AAC TTT 576 Gln His Tyr Gly Thr Ala Glu Val Asn Leu Gln Ser Gly Asn Asn Phe 180 185 190 GAC GGT AGT TCA CTG GAC TTC TTA TTA CCG TTC TAT GAT TCC GAA AAA 624 Asp Gly Ser Ser Leu Asp Phe Leu Leu Pro Phe Tyr Asp Ser Glu Lys 195 200 205 ATG CTG GCA TTT GGT CAG GTC GGA GCG CGT TAC ATT GAC TCC CGC TTT 672 Met Leu Ala Phe Gly Gln Val Gly Ala Arg Tyr Ile Asp Ser Arg Phe 210 215 220 ACG GCA AAT TTA GGT GCG GGT CAG CGT TTT TTC CTT CCT GCA AAC ATG 720 Thr Ala Asn Leu Gly Ala Gly Gln Arg Phe Phe Leu Pro Ala Asn Met 225 230 235 240 TTG GGC TAT AAC GTC TTC ATT GAT CAG GAT TTT TCT GGT GAT AAT ACC 768 Leu Gly Tyr Asn Val Phe Ile Asp Gln Asp Phe Ser Gly Asp Asn Thr 245 250 255 CGT TTA GGT ATT GGT GGC GAA TAC TGG CGA GAC TAT TTC AAA AGT AGC 816 Arg Leu Gly Ile Gly Gly Glu Tyr Trp Arg Asp Tyr Phe Lys Ser Ser 260 265 270 GTT AAC GGC TAT TTC CGC ATG AGC GGC TGG CAT GAG TCA TAC AAT AAG 864 Val Asn Gly Tyr Phe Arg Met Ser Gly Trp His Glu Ser Tyr Asn Lys 275 280 285 AAA GAC TAT GAT GAG CGC CCA GCA AAT GGC TTC GAT ATC CGT TTT AAT 912 Lys Asp Tyr Asp Glu Arg Pro Ala Asn Gly Phe Asp Ile Arg Phe Asn 290 295 300 GGC TAT CTA CCG TCA TAT CCG GCA TTA GGC GCC AAG CTG ATA TAT GAG 960 Gly Tyr Leu Pro Ser Tyr Pro Ala Leu Gly Ala Lys Leu Ile Tyr Glu 305 310 315 320 CAG TAT TAT GGT GAT GAT GTT GCT TTG TTT AAT TCT GAT AAG CTG CAG 1008 Gln Tyr Tyr Gly Asp Asp Val Ala Leu Phe Asn Ser Asp Lys Leu Gln 325 330 335 TCG AAT CCT GGT GCG GCG ACC GTT GGT GTA AAC TAT ACT CCG ATT CCT 1056 Ser Asn Pro Gly Ala Ala Thr Val Gly Val Asn Tyr Thr Pro Ile Pro 340 345 350 CTG GTG ACG ATG GGG ATC GAT TAC CGT CAT GGT ACG GGT AAT GAA AAT 1104 Leu Val Thr Met Gly Ile Asp Tyr Arg His Gly Thr Gly Asn Glu Asn 355 360 365 GAT CTC CTT TAC TCA ATG CAG TTC CGT TAT CAG TTT GAT AAA TCG TGG 1152 Asp Leu Leu Tyr Ser Met Gln Phe Arg Tyr Gln Phe Asp Lys Ser Trp 370 375 380 TCT CAG CAA ATT GAA CCA CAG TAT GTT AAC GAG TTA AGA ACA TTA TCA 1200 Ser Gln Gln Ile Glu Pro Gln Tyr Val Asn Glu Leu Arg Thr Leu Ser 385 390 395 400 GGC AGC CGT TAC GAT CTG GTT CAG CGT AAT AAC AAT ATT ATT CTG GAG 1248 Gly Ser Arg Tyr Asp Leu Val Gln Arg Asn Asn Asn Ile Ile Leu Glu 405 410 415 TAC AAG AAG CAG GAT ATT CTT TCT CTG AAT ATT CCG CAT GAT ATT AAT 1296 Tyr Lys Lys Gln Asp Ile Leu Ser Leu Asn Ile Pro His Asp Ile Asn 420 425 430 GGT ACT GAA CAC AGT ACG CAG AAG ATT CAG TTG ATC GTT AAG AGC AAA 1344 Gly Thr Glu His Ser Thr Gln Lys Ile Gln Leu Ile Val Lys Ser Lys 435 440 445 TAC GGT CTG GAT CGT ATC GTC TGG GAT GAT AGT GCA TTA CGC AGT CAG 1392 Tyr Gly Leu Asp Arg Ile Val Trp Asp Asp Ser Ala Leu Arg Ser Gln 450 455 460 GGC GGT CAG ATT CAG CAT AGC GGA AGC CAA AGC GCA CAA GAC TAC CAG 1440 Gly Gly Gln Ile Gln His Ser Gly Ser Gln Ser Ala Gln Asp Tyr Gln 465 470 475 480 GCT ATT TTG CCT GCT TAT GTG CAA GGT GGC AGC AAT ATT TAT AAA GTG 1488 Ala Ile Leu Pro Ala Tyr Val Gln Gly Gly Ser Asn Ile Tyr Lys Val 485 490 495 ACG GCT CGC GCC TAT GAC CGT AAT GGC AAT AGC TCT AAC AAT GTA CAG 1536 Thr Ala Arg Ala Tyr Asp Arg Asn Gly Asn Ser Ser Asn Asn Val Gln 500 505 510 CTT ACT ATT ACC GTT CTG TCG AAT GGT CAA GTT GTC GAC CAG GTT GGG 1584 Leu Thr Ile Thr Val Leu Ser Asn Gly Gln Val Val Asp Gln Val Gly 515 520 525 GTA ACG GAC TTT ACG GCG GAT AAG ACT TCG GCT AAA GCG GAT AAC GCC 1632 Val Thr Asp Phe Thr Ala Asp Lys Thr Ser Ala Lys Ala Asp Asn Ala 530 535 540 GAT ACC ATT ACT TAT ACC GCG ACG GTG AAA AAG AAT GGG GTA GCT CAG 1680 Asp Thr Ile Thr Tyr Thr Ala Thr Val Lys Lys Asn Gly Val Ala Gln 545 550 555 560 GCT AAT GTC CCT GTT TCA TTT AAT ATT GTT TCA GGA ACT GCA ACT CTT 1728 Ala Asn Val Pro Val Ser Phe Asn Ile Val Ser Gly Thr Ala Thr Leu 565 570 575 GGG GCA AAT AGT GCC AAA ACG GAT GCT AAC GGT AAG GCA ACC GTA ACG 1776 Gly Ala Asn Ser Ala Lys Thr Asp Ala Asn Gly Lys Ala Thr Val Thr 580 585 590 TTG AAG TCG AGT ACG CCA GGA CAG GTC GTC GTG TCT GCT AAA ACC GCG 1824 Leu Lys Ser Ser Thr Pro Gly Gln Val Val Val Ser Ala Lys Thr Ala 595 600 605 GAG ATG ACT TCA GCA CTT AAT GCC AGT GCG GTT ATA TTT TTT GAT CAA 1872 Glu Met Thr Ser Ala Leu Asn Ala Ser Ala Val Ile Phe Phe Asp Gln 610 615 620 ACC AAG GCC AGC ATT ACT GAG ATT AAG GCT GAT AAG ACA ACT GCA GTA 1920 Thr Lys Ala Ser Ile Thr Glu Ile Lys Ala Asp Lys Thr Thr Ala Val 625 630 635 640 GCA AAT GGT AAG GAT GCT ATT AAA TAT ACT GTA AAA GTT ATG AAA AAC 1968 Ala Asn Gly Lys Asp Ala Ile Lys Tyr Thr Val Lys Val Met Lys Asn 645 650 655 GGT CAG CCA GTT AAT AAT CAA TCC GTT ACA TTC TCA ACA AAC TTT GGG 2016 Gly Gln Pro Val Asn Asn Gln Ser Val Thr Phe Ser Thr Asn Phe Gly 660 665 670 ATG TTC AAC GGT AAG TCT CAA ACG CAA GCA ACC ACG GGA AAT GAT GGT 2064 Met Phe Asn Gly Lys Ser Gln Thr Gln Ala Thr Thr Gly Asn Asp Gly 675 680 685 CGT GCG ACG ATA ACA CTA ACT TCC AGT TCC GCC GGT AAA GCG ACT GTT 2112 Arg Ala Thr Ile Thr Leu Thr Ser Ser Ser Ala Gly Lys Ala Thr Val 690 695 700 AGT GCG ACA GTC AGT GAT GGG GCT GAG GTT AAA GCG ACT GAG GTC ACT 2160 Ser Ala Thr Val Ser Asp Gly Ala Glu Val Lys Ala Thr Glu Val Thr 705 710 715 720 TTT TTT GAT GAA CTG AAA ATT GAC AAC AAG GTT GAT ATT ATT GGT AAC 2208 Phe Phe Asp Glu Leu Lys Ile Asp Asn Lys Val Asp Ile Ile Gly Asn 725 730 735 AAT GTC AAG AGG TCG ATG TTG CCT AAT ATT TGG CTG CAA TAT GGT CAG 2256 Asn Val Lys Arg Ser Met Leu Pro Asn Ile Trp Leu Gln Tyr Gly Gln 740 745 750 TTT AAA CTG AAA GCA AGC GGT GGT GAT GGT ACA TAT TCA TGG TAT TCA 2304 Phe Lys Leu Lys Ala Ser Gly Gly Asp Gly Thr Tyr Ser Trp Tyr Ser 755 760 765 GAA AAT ACC AGT ATC GCG ACT GTC GAT GCA TCA GGG AAA GTC ACT TTG 2352 Glu Asn Thr Ser Ile Ala Thr Val Asp Ala Ser Gly Lys Val Thr Leu 770 775 780 AAT GGT AAA GGC AGT GTC GTA ATT AAA GCC ACA TCT GGT GAT AAG CAA 2400 Asn Gly Lys Gly Ser Val Val Ile Lys Ala Thr Ser Gly Asp Lys Gln 785 790 795 800 ACA GTA AGT TAC ACT ATA AAA GCA CCG TCG TAT ATG ATA AAA GTG GAT 2448 Thr Val Ser Tyr Thr Ile Lys Ala Pro Ser Tyr Met Ile Lys Val Asp 805 810 815 AAG CAA GCC TAT TAT GCT GAT GCT ATG TCC ATT TGC AAA AAT TTA TTA 2496 Lys Gln Ala Tyr Tyr Ala Asp Ala Met Ser Ile Cys Lys Asn Leu Leu 820 825 830 CCA TCC ACA CAG ACG GTA TTG TCA GAT ATT TAT GAC TCA TGG GGG GCT 2544 Pro Ser Thr Gln Thr Val Leu Ser Asp Ile Tyr Asp Ser Trp Gly Ala 835 840 845 GCA AAT AAA TAT AGC CAT TAT AGT TCT ATG AAC TCA ATA ACT GCT TGG 2592 Ala Asn Lys Tyr Ser His Tyr Ser Ser Met Asn Ser Ile Thr Ala Trp 850 855 860 ATT AAA CAG ACA TCT AGT GAG CAG CGT TCT GGA GTA TCA AGC ACT TAT 2640 Ile Lys Gln Thr Ser Ser Glu Gln Arg Ser Gly Val Ser Ser Thr Tyr 865 870 875 880 AAC CTA ATA ACA CAA AAC CCT CTT CCT GGG GTT AAT GTT AAT ACT CCA 2688 Asn Leu Ile Thr Gln Asn Pro Leu Pro Gly Val Asn Val Asn Thr Pro 885 890 895 AAT GTC TAT GCG GTT TGT GTA GAA 2712 Asn Val Tyr Ala Val Cys Val Glu 900

【図面の簡単な説明】

【図１】発現用プラスミドｐＷ６Ａの制限酵素地図であ
る。

【図２】発現用プラスミドｐＷＴ８Ａの制限酵素地図で
ある。

【図３】ウエスタンブロットによる病原性大腸菌Ｏ−１
５７、Ｏ−２６、Ｏ−１１１の測定結果を示す図であ
る。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 33/577 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｃ //(Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 上野 英一 東京都中央区日本橋浜町２丁目62番５号 富士レビオ株式会社内 (72)発明者 伊藤 哲 東京都中央区日本橋浜町２丁目62番５号 富士レビオ株式会社内

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 病原性大腸菌を認識するモノクローナル
   抗体。
2. 【請求項２】 病原性大腸菌が腸管出血性大腸菌である
   請求項１に記載のモノクローナル抗体。
3. 【請求項３】 病原性大腸菌がベロ毒素を産生する大腸
   菌である請求項１または２に記載のモノクローナル抗
   体。
4. 【請求項４】 認識部位がインティミンである請求項１
   ないし３のいずれかに記載のモノクローナル抗体。
5. 【請求項５】 モノクローナル抗体がｉｎｔｎ２０２、
   ｉｎｔｎ２０３、ｉｎｔｎ２１５、ｉｎｔｎ２１６及び
   ｉｎｔｎ２２８である請求項１ないし４のいずれかに記
   載のモノクローナル抗体。
6. 【請求項６】 請求項１ないし５のいずれかに記載のモ
   ノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
7. 【請求項７】 ハイブリドーマがＩＮＴＮ２０２、ＩＮ
   ＴＮ２０３、ＩＮＴＮ２１５、ＩＮＴＮ２１６及びＩＮ
   ＴＮ２２８である請求項６に記載のハイブリドーマ。
8. 【請求項８】 請求項１ないし５のいずれかに記載のモ
   ノクローナル抗体を用いた病原性大腸菌の検出方法。
9. 【請求項９】 検出方法が免疫測定方法である請求項８
   に記載の検出方法。