DE3855442T2 - Verfahren zur Gewinnung von Schutzantigenen gegen Bordetella-Infektionen und toxische Prozesse - Google Patents
Verfahren zur Gewinnung von Schutzantigenen gegen Bordetella-Infektionen und toxische ProzesseInfo
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Description
- Verfahren zur Gewinnung von Schutzantigenen gegen Bordetella-Infektionen und toxische Prozesse
- Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Erhalt von Schutzantigenen gegen Bordetella-Infektionen und toxische Prozesse.
- Es ist gut bekannt, daß B. pertussis sowie B. parapertussis die Erreger von Keuchhustenanfällen sind.
- Untersuchungen der Virulenzfaktoren, die den Hauptbeitrag zur Pathogenese von Keuchhusten leisten, haben dazu geführt, zwei Hauptprodukte von B. pertussis, das filamentöse Hämagglutinin (FHA) und das Pertussis-Toxin (Ptx), als die Hauptdeterminanten der Pathogenese und effiziente Immunogene in Betracht zu ziehen.
- In einer früheren Arbeit (FR-Patentanmeldung 8615968 vom 10. November 1986 für das Institut Pasteur und Inserm) verwendeten die Erfinder Antikörper, die gegen ein anderes von B. pertussis synthetisiertes Produkt, die Adenylatcyclase (AC), erzeugt worden waren, zum Nachweis der Wirkung dieses Molekul als Haupttoxin im cytopathischen Lungensyndrom, wie es durch Induktion einer akuten adematösen hemorrhagischen Alveolitis (AEHA) in Mäusen gezeigt werden kann, und damit auch als ein potentielles Schutzantigen.
- Die Erfinder untersuchten nun die Wirkung einer von anderen Bordetella- Arten produzierten und freigesetzten Adenylatcyclase bei der Pathogenese und Immunität durch versuchsweise Infektion von Mäusen.
- Ein erfindungsgemäßer Gesichtspunkt ist somit die Verwendung einer anderen Bordetella-Art als B. pertussis zur Bereitstellung von Adenylatcyclase-Präparaten, die als Schutzantigene gegen Keuchhusten verwendet werden können.
- Diese Erfindung betriffi ein Verfahren zum Erhalt von Adenylatcyclase- Präparaten, wobei die Adenylatcyclase (AC)-Präparate eine aktive Adenylatcyclase mit einem Molekulargewicht (Mr) von etwa 43 ± 4,3 bis 45 ± 4,5 kDa umfassen wie mit Ovalbumin als Standard bestimmt, die durch spezifische polydonale und monodonale Anti-B. pertussis AC-Antikörper spezifisch erkannt wird und eine antigene Kreuzreaktivität mit der B. pertussis-AC zeigen kann, und/oder ein inaktives Protein mit einem Molekulargewicht Mr von etwa 43 ± 4,3 kDa, das durch polydonale Anti-AC- Antikörper spezifisch erkannt wird, die gegen gereinigte AC-Präparate erzeugt wurden, und das keine Calmodulin-aktivierbare Adenylatcyclase-Aktivität und keine Affinität für Calmodulin aufweist, wobei das Protein mit der B. pertussis-AC kreuzreagieren kann, wobei das Verfahren die Verwendung von B. parapertussis umfaßt. Es muß bemerkt werden, daß die Begriffe "aktiv" oder "inaktiv", wie in der Beschreibung verwendet, die Enzymaktivität der Adenylatcyclase betreffen.
- Die aktive Adenylatcyclase hat ein Molekulargewicht von etwa 43 ± 4,3 bis 45 ± 4,5 kDa (Molekulargewichtsbereich Mr, wie mit Ovalbumin als Standard be stimmt). Sie wird durch spezifische polydonale und monodonale Anti-B. pertussis-AC- Antikörper spezifisch erkannt.
- Diese aktive Adenylatcyclase ist zur antigenen Kreuzreaktivität mit der B pertussis-AC fähig.
- Diese Adenylatcyclase, die ein Cytotoxin ist, das für lokale Lungenläsionen im Zusammenhang mit Keuchhusten verantwortlich ist, besitzt vorteilhafte immunogene Eigenschaften
- Das inaktive Protein wird in der am gleichen Tag im Namen der Anmelder eingereichten EP-Patentanmeldung mit dem Titel "Immunoprotective antigenic protein against pathogenic bacteria" offenbart.
- Dieses inaktive Protein wird von polydonalen Anti-AC-Antikörpern, die gegen gereinigte AC-Präparate erzeugt werden, erkannt und weist keine CaM-aktivierbare Adenylatcyclase-Aktivität und keine Affinität für CaM auf. Es ist ferner zur antigenen Kreuzreaktivität mit der B. pertussis-AC fähig.
- Ein Komplex, in dem die aktive Adenylatcyclase mit dem inaktiven kreuzreaktiven Protein assoziiert ist, ist so von B. parapertussis oder von kreuzreagierende Proteine exprimierenden Varianten erhältlich.
- Die aktive und inaktive Form können so durch übliche Reinigungsverfahren isoliert werden.
- Diese Adenylatcyclase-Präparate sind überraschenderweise von B. parapertussis erhältlich, obwohl es zugegebenermaßen keine Kreuzimmunität zwischen B. pertussis- und B. parapertussis-Infektionen gibt.
- Dieser erfindungsgemäße Gesichtspunkt ist von großem Interesse, da im Gegensatz zu B. pertussis B. parapertussis, wie es gut bekannt ist, kein Ptx exprimiert.
- Die Erfindung stellt daher Verfahren zum Erhalt von antigenen Adenylatcyclase-Präparaten bereit, die keine Nebenwirkungen durch Ptx wie das Risiko von allergischer Encephalitis aufweisen.
- Gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren sind Ptx-freie antigene AC- Präparate aus B. parapertussis hly &spplus;-Clonen erhältlich. Diese Clone werden entweder in vitro selektiert oder nach einer Exposition aus Lungenhomogenat gewonnen und können eine akute adematöse hemorrhagische Alveolitis induzieren.
- Ein spezifischer hly &spplus;-Clon, der vorteilhafterweise große Mengen von aktiver AC exprimiert, wurde aus Lungen gewonnen und besteht aus dem Clon 63-25, der am 15. April 1988 unter der Nr. 1-749 bei der Collection Nationale de Culture de Microorganismes (CNCM) hinterlegt wurde.
- Die Kulturüberstände von 63-25, die den bakteriellen Standardsuspensionen aus 10&sup9; CFU/ml entsprechen, haben eine AC-Enzymaktivität von etwa 20 bis 25 Einheiten.
- Hly &spplus;-Clone mit einer geringeren spontanen AC-Expression können zur Erhöhung der AC-Aktivität auf dem intranasalen Weg in Mäuse injiziert und aus den Lungen erneut isoliert werden.
- Die abgeleiteten Clone, die die hly &spplus;-Expression des AC +-pHänotyps behalten, liegen im Schutzbereich der Erfindung. Der Clon 63-2TCS (Trypto-Casein-Soja) wurde beispielsweise vom Stamm 63-25 erhalten, der auf einem nicht-spezifischen Medium in Bezug auf Bordetella mit der gleichen Ausbeute und unter Beibehaltung der hly &spplus;-, AC + -Expression wächst.
- Eine Kreuzimmunität zwischen B. pertussis und B. parapertussis wurde durcb einen passiven Kreuzschutz mit Anti-B. pertussis-Adenylatcyclase-Antikörpern nachge wiesen. Die Untersuchungen, die mit erfindungsgemäß erhaltenen Adenylatcyclase- Präparaten durchgeführt wurden, zeigten, daß diese Moleküle Schutzantigene sind.
- Daher werden diese Adenylatcyclase-Präparate vorteilhaft erfindungsgemäß zur Herstellung von Impfstoffpräparaten verwendet, sofern sie keine Kreuzreaktionen mit der Adenylatcyclase des Wirts zeigen. Die Adenylatcyclase-Präparate umfassen sowohl aktive als auch inaktive Proteine oder nur eines dieser Proteine.
- Diese Impfstoffe, die so aus Adenylatcyclase-Präparaten von B. parapertussis hergestellt werden, sind molekulare Impfstoffe und können Bordetella-Infektionen und toxische Wirkungen in Menschen und Tieren verhindern. Es werden vorzugsweise die übliche Dosis und übliche Verabreichungsformen verwendet. Die Impfstoffe werden vorzugsweise als intranasale, orale oder parenterale Präparate verwendet.
- In den Impfstoffzusammensetzungen können die Adenylatcyclase-Präparate allein oder in Assoziation mit FHA in dem gleichen Inokulum enthalten sein. FHA wird dann gleichzeitig mit dem Adenylatcyclase-Präparat oder zu einem anderen Zeitpunkt verabreicht. FHA-Präparate werden vorzugsweise unter Verwendung beispielsweise des Verfahrens von Sato et al., Infect. Immun. 41(1983), 313-320, oder Imaizumi et al., Journal of Microbiol. Methods 2 (1984), 334-347, erhalten.
- Die Adenylatcyclase-Präparate können ferner mit gereinigten AC-Präparaten, die in der FR-Patentanmeldung 8615963 vom 17. November 1986 offenbart sind, und gegebenenfalls mit FHA assoziiert sein.
- Die erfindungsgemäßen Impfstoffzusammensetzungen beugen vorteilhaft einer Infektion vor. die von Bordetella wie B. pertussis, B. parapertussis, B. bronchiseptica und B. avium verursacht wird.
- Gemäß einer anderen Ausführungsform werden bakterielle Impfstoffe aus vollständigen Zellen von B. parapertussis hergestellt. Diese Impfstoffe weisen sowohl gegen B. parapertussis als auch B. pertussis eine Schutzwirkung auf.
- Weitere erfmdungsgemäße Gesichtspunkte und Vorteile werden im nachstehenden Beispiel unter Bezugnallme auf die Figuren beschrieben, wobei in Figur 1 die Kinetik einer Lungeninfektion mit B. parapertussis-Clonen dargestellt ist, und in
- Figur 2 Inununblots von AC enthaltenden Extrakten von B. pertussis mit polydonalen Anti-B. pertussis-AC-Antikörpem oder mit Serumantikörpern von mit B. parapertussis intranasal infizierten Mäusen dargestellt sind.
- Die im Beispiel verwendeten Materialien und Verfahren sind nachstehend beschrieben.
- B. pertussis 18323 (ATCC 9797) und B. parapertussis (CIP63-2) wurden auf Fibrinogen-freiem Pferdeblut enthaltendem (15% Endgehalt) Bordet Gengou- Agarmedium (BG) zur Selektion von hämolytischen (hly) oder nicht-hämolytischen Clonen, die in Stamer Scholte-Brühe subkultiviert wurden, plattiert.
- Verfahren zum Nachweis von AC und Ptx entweder über enzymatische oder biologische Aktivitäten oder durch Western-Blot-Analyse wurden von White A. A. et al., Methods Enzymol., 38C (1974), 41-46, wie von Hanoune et al., J. Biol. Chem. 252 (1977), 2039-2046, modifiziert, beschrieben.
- Drei Wochen alte, von bestinnnten Pathogenen freie, weibliche Swiss OF1- Mäuse mit einem Gewicht von 16 g ± 1 wurden von ferme expérimentale de Rennemoulin (Institut Pasteur, 78 Villepreux, France) erworben und in Gruppen von 5 in mit aufgesetzten Filterdeckeln (Techniplast, UAR, France) versehenen Käfigen auf sterilem Streu gehalten und mit durch Gannnastrahlen sterilisiertem Futter (granulés RO3, UAR, France) und mit autokiaviertem Trinkwasser gefüttert. Die Mäuse wurden im Alter von 4 Wochen nach einer kurzen Etheranästhesie durch intranasale Injektion von standardisierten bakteriellen Inokula (mit einem Volumen von 50 µl) mit dem Stamm B. pertussis Kendrick 18323 (Typstamm ATCC 9797) oder B. parapertussis CIP 63-2 infiziert.
- Die Lungen von infizierten Mäusen wurden zu bestimmten Zeitpunkten gesammelt, in 10% Formaldehyd fixiert, in Paraffin eingebettet und vor der Anfärbung mit Hämatoxilin und Eosin oder Giemsa zur Untersuchung im Lichtmikroskop in aufeinanderfolgende Gewebeschnitte zerlegt.
- Zwei Gruppen von Mäusen wurden intranasal mit Inokula infiziert, die entweder aus einem auf BG (63-2H) selektierten hly &spplus;-Clon oder aus dem unter der Nr. I- 749 hinterlegten, aus Lungenhomogenat von Mäusen am Tag 3 nach der Exposition (63- 2S) gewonnenen hly &spplus; -Clon hergestellt wurden.
- Die Dosis-Wirkungen der intranasalen Infektion sind in Figur 1 dargestellt, in der die Änderung von log&sub1;&sub0; CFU/Lunge (Kolonie-bildende Einheiten) bei 63-2H (Kurve ) und 63-2S (Kurve ) als Funktion von Tagen darstellt ist. Die vertikalen Balken sind arithmetische Durchschnittswerte von 5 Mäusen ± SEM.
- Wie in Figur 1 dargestellt, hatten beide Inokula eine ähnliche Virulenz (Bakterienwachstum/Überlebensrate), obwohl der Clon 63-25 signifikant pathogener als der Clon 63-2H war Die intranasale Injektion von log&sub1;&sub0; CFU entsprach der LD50% bei 63-2S und nur der LD2% % bei 63-2H.
- Die Lungen von Mäusen, die 24 Std. nach der Exposition tot waren, zeigten das typische AEHA, das bei einem von B. pertussis 18323 stammenden hly &spplus; AC&spplus;- Clon beobachtet wurde, wie von C. Brézin et al., FEMS Microbiol. Lett. 42 (1987) 75-80, beschrieben.
- Die Dosierung der AC in den Kulturüberständen von 63-2S und 63-2H, die bakteriellen Standardsuspensionen mit 10 CFU/ml entsprachen, zeigten, daß die AC- Enzymaktivitäten 20 bis 25 Einheiten bzw. 4 bis 7 Einheiten waren.
- Immunantwort von B. parapertussis-infizierten Mäusen auf AC:
- Eine Western-Blot-Analyse von B. parapertussis-Harnstoffextrakten wurde mit spezifischen polydonalen Anti-AC-Antikörpem durchgeführt.
- Die Harnstoffextrakte wurden wie nachstehend beschrieben erhalten:
- Bakterienrasen wurden in Puffer A (25 mmol/l Tris-HCl, 6 mmol/l MgCl&sub2; und 0,1 % NP40. pH 8) (1/3 Gew./Gew.) homogenisiert und die gleiche Menge 8 mol/l Harnstoff in Puffer A zugesetzt. Das Medium wurde 40 min. bei 30ºC gerührt. Eine Dialyse in Puffer A mit einer anschließenden Zentrifugation (5 000 g) 30 min. bei 6ºC wurde durchgeführt. Der Überstand wurde gewonnen und bestand aus dem Harnstoffextrakt.
- Die polydonalen Anti-AC werden durch Immunisierung von Tieren mit gereinigten AC-Präparaten von B. pertussis und Gewinnung der gegen die Präparate erzeugten Antikörper aus den Immunseren erhalten.
- Zur Erzeugung von Antikörpern bevorzugt verwendete AC-Präparate bestehen aus den gereinigten AC-Präparaten, die in der am 17. November 1986 im Namen des Anmelders eingereichten FR-Patentanmeldung 86/15963 mit dem Titel "Purified AC preparation, a method for obtaining the same and their biological applications" beschrieben werden.
- Diese Präparate sind dadurch charakterisiert, daß sie einen hohen Reinheitsgrad aufweisen und praktisch keine kontaminierenden bakteriellen Substanzen, besonders kein Pertussis-Toxin, Lipopolysaccharid (oder LPS) und filamentöses Haemagglutinin (oder FHA), enthalten. Die AC kann so in homogener Form erhalten werden, wobei sie mit einem S-Koeffizienten von 3,6 in einem Saccharose-Dichtegradienten sedimentiert und in zwei strukturell verwandten molekularen Formen von 45 bzw. 43 kDa existiert.
- Gemäß einem weiteren Gesichtspunkt werden die AC-Präparate charakterisiert und sie besitzen eine Aktivität, die 1 600 µMol cAMP min&supmin;¹ mg erreicht und sogar übersteigt.
- Diese gereinigten AC-Präparate können erhalten werden, indem ein zuvor konzentrierter Überstand von die Adenylatcyclase exprimierenden Bakteriehkulturen oder ein Extrakt dieser Bakterien mit Calmodulin in Kontakt gebracht wird.
- Die polydonalen Antikörper werden beispielsweise erzeugt, indem Tiere wie Kaninchen oder Mäuse mit den jeweiligen AC-Präparaten, in denen die AC frei oder in Form eines Komplexes mit eukaryontischen Proteinen, besonders mit Calmodulin, vorkommt, immunisiert und die Antikörper-enthaltenden Antiseren und anschließend die Antikörper selber durch Standardverfahren gewonnen werden.
- Die monodonalen Antikörper können durch Fusion von Maus-Myelomzellen mit Milzlymphocyten, die von mit gereinigter Adenylatcyclase immunisierten Mäusen stammen, erhalten werden.
- Monodonale Antikörper (8-25) werden besonders verwendet. Sie immunpräzipitieren ein Triplett von 50, 45 und 43 kDa sowie ein Protein mit einem Molekulargewicht von mehr als 100 kDa aus Rohextrakten und Präparaten des aus Bakterienzellen gereinigten Enzyms.
- Der die monodonalen Antikörper produzierende Hybridomstanim wurde am 9. Oktober 1986 unter der Nr. 1-610 bei der National Collection of Cultures of Microorganisms hinterlegt.
- Die Ergebnisse sind in Figur 2 dargestellt, in der die Bahnen A bis D jeweils zeigen:
- A. von B. pertussis gereinigte AC, die mit Anti-B. pertussis-AC-Antikörpern nachgewiesen wird,
- B. B. pertussis-Harnstoffextrakt, der mit polydonalen Anti-AC-Antikörpern von B. parapertussis-infizierten Mäusen nachgewiesen wird,
- C. B. pertussis-Harnstoffextrakt, der mit Serum von B. parapertussis-infizierten Mäusen nachgewiesen wird
- D. von B. pertussis gereinigte AC, die mit Serum-Antikörpern von B. parapertussis-ulfizierten Mäusen nachgewiesen wird.
- Diese Western-Blot-Analyse zeigte die Gegenwart eines Antigens von Mr 43 bis 45 kDa, das mit der AC von B. pertussis kreuzreagierte (Figur 2).
- Der vergleichende Immunblot der gereinigten AC von B. pertussis mit Serum von von einer B. parapertussis-Infektion genesenden Mäusen, das am Tag 27 nach der intranasalen Exposition gesammelt wurde (Figur 1), zeigte ferner die Gegenwart von Anti-B. pertussis-AC-Antikörpern.
- a) Das B. parapertussis-Inokulum wurde mit polydonalen oder monodonalen Anti-B. pertussis-AC-Antikörpern vorihkubiert. Die Ergebnisse sind nachstehend in Tabelle 1 dargestellt: Tabelle 1
- Wie in der Tabelle dargestellt, hemmte dieses B. parapertussis-Inokulum, das mit polydonalen oder monoclonalen Anti-B. pertussis-AC-Antikörpern inkubiert wurde, die lethale Exposition in einer dosisabhängigen Weise.
- Die Kreuzimmunogenität zwischen B. parapertussis und B. pertussis wurde durch Kreuzimpfüngsexperimente, wie in Tabelle 2 dargestellt, ermittelt. Tabelle 2
- a 20 min auf 56ºC erhitzte Bakteriensuspensionen; zwei sc-Injektionen im Abstand von 5 Tagen von 1,2 x 10&sup8; B. pertussis AC&spplus; (BPAC&spplus;), 2,5 x 10&sup8; B. pertussis AC&supmin;(BPAC&supmin;) oder 2,2 x 10&sup9; B. parapertussis 63-2S (BPP).
- b Intranasale Injektion von 5 x 10&sup7; CFU von BPAC&spplus; oder 8 x 10&sup8; CFU von BPP.
Claims (8)
1. Verfahren zum Erhalt von Adenylatcyclase-Präparaten,
wobei die Adenylatcyclase (AC)-Präparate eine aktive
Adenylatcyclase umfassen, mit einem Molekulargewicht (Mr)
von etwa 43 ± 4,3 bis 45 ± 4,5 kDa, bestimmt mit
Ovalbumin als Standard, die durch spezifische polydonale
und monodonale Anti-B. pertussis-AC-Antikörper
spezifisch erkannt wird und antigene Kreuzreaktivität mit
der B. pertussis-AC zeigen kann, und/oder ein inaktives
Protein mit einem Molekulargewicht Mr von etwa 43 ± 4,3
kDa, das durch polydonale Anti-AC-Antikirper spezifisch
erkannt wird, die gegen gereinigte AC-Präparate erzeugt
wurden, und das keine Calmodulin-aktivierbare
Adenylatcyclase-Aktivität und keine Affinität für
Calmodulin aufweist, wobei das Protein mit der B.
pertussis-AC kreuzreagieren kann, wobei das Verfahren die
Verwendung von B. parapertussis umfaßt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, umfassend den weiteren Schritt
der Abtrennung und Gewinnung des inaktiven Proteins bzw.
der aktiven Adenylatcyclase.
3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 2, wobei die
Adenylatcyclase-Präparate von hly&spplus;-Clonen von D.
parapertussis erhalten werden, die eine akute adematöse
hemorrhagische Alveolitis induzieren können, wobei die
done speziell ausgewählt werden entweder in vitro oder
von Lungenhomogenaten nach der Exposition.
4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei der hly&spplus;-Clon Clon 63-2S
ist, der unter der Nr. I 749 am 15. April 1988 hinterlegt
wurde, und abgeleitete Klone, die hly&spplus;, AC&spplus;-Phenotyp-
Expression zeigen.
5. Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, wobei die
Kulturüberstände, die standardisierten
Bakteriensuspensionen bei 10&sup9; CFU/ml entsprechen, eine AC-Enzymaktivität
von etwa 20 bis 25 Einheiten aufweisen.
6. Verfahren zur Herstellung von Impfstoff zusammensetzungen
zur Vorbeugung von Infektionen, die durch Bordetella
verursacht werden, umfassend die Verwendung von
Adenylatcyclase-Präparaten, die gemäß dem Verfahren nach
einem der Ansprüche 1 bis 5 erhalten wurden,
gegebenenfalls in Assoziation in dem gleichen Inokulum
oder nicht, mit filamentösem Haemagglutinin und/oder
gereinigtem AC.
7. Impfstoff aus einer ganzen Bakterienzelle, dadurch
gekennzeichnet, daß er aus B. parapertussis-Clonen
hergestellt ist, die die Adenylatcyclase gemäß der
Definition in Anspruch 1 enthalten.
8. Hly -Clon von B. parapertussis, hinterlegt am 15. April
1988 unter der Nr. I 749 bei der Collection Nationale de
Culture de Microorganismes (CNCM).
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