JPH02131432A - 百日咳感染及び毒性過程に対する保護抗原を得るための方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、百日咳感染及び毒性過程に対する保護抗原を
得るための方法に関する． −１１ご≦匹』−２ノ、及びＢ　バーベル　シスの両者
は、百日咳の発生の原因物質である。

百日咳の病因に強く関与する毒性因子に対する研究が、
病因の主要決定因子及び効果的な免疫原として、旦一さ
止Ｌ之スの２種の生成物、すなわち繊維性赤血球凝集素
（ＰＨ八）及び百日咳毒素（Ｐｔｘ）に対して行なわれ
て来た． これまでの研究（Ｉｎｓｔｉｔｕｔ　Ｐａｓｔｅｕｒ　
ａｎｄ　Ｉｎｓｅｒｍの名義での１９８６年１１月１０
日のＦＲ特許出願第８６１５９６８号）においては、発
明者は、急性水腫性出血性肺胞炎（ＡＥＨＡ）をマウス
に誘発することにより明示されるように、肺の細胞変性
症候群における主要毒素及び従って可能性ある保護抗原
としてアデニル酸シクラーゼ（ＡＣ）の役割を示すため
に、旦一三上久之スにより合成された他の生成物、すな
わちＡＣに対して発生せしめられた抗体を用いていた。

本発明者は、他の百日咳種により生成され、そして開放
されるアデニル酸シクラーゼの役割を調べ、そしてマウ
スの実験的感染において病因及び免疫性におけるその役
割を調べた。

Ｕ匹１＜ク、とは異なる百日咳菌種を用いて、百日咳に
対する保護抗原として有用なアデニル酸シクラーゼ調製
物を提供することが本発明の目的である。

活性アデニル酸シクラーゼ及び／又は交差反応性不活性
タンパク賞を得るための本発明の方法は、Ｂ．パーペル
　シス又はその変異体の使用を特徴とする。

本明細書に使用される用語“活性”又は“不活性゜゜と
はアデニル酸シクラーゼ酵素活性を言及する。

活性アデニル酸シクラーゼは、約４３±４．３〜４５±
４．５Ｋドルトン（対照として使用されるオボアルブミ
ンに対して決定されるような分子量範囲Ｍｒ）の分子量
を有する。それは特に、特定のポリクローナル及びモノ
クローナル抗−Ｂ　ペルｔ之久ＡＣ抗体により認識され
る． 前記活性アデニル酸シクラーゼは、旦一二火Ｌ＆ＸＡＣ
と抗原的に交差反応することができる。

百日咳に存在する局部の肺病変の原因の細胞毒素である
前記アデニル酸シクラーゼは、都合良く免疫原特性を付
与される。

不活性タンパク質は、・“病原性細菌に対する免疫保護
性抗原性タンパク質”に関係する、同じ日に出願された
ＥＰ特許出願に開示される。

前記不活性タンパク質は、精製されたＡＣｔＡ製物に対
して生ぜしめられたポリクローナル抗一ＡＣ抗体により
特異的に認識され、そしてアデニル酸シクラーゼＣａＭ
一活性可能な活性及びＣａＭに対する親和性を欠いてい
る。それはまた、１よｉＡＣと抗原的に交差反応するこ
とができる． 活性アデニル酸シクラーゼ及び不活性交差反応性タンパ
ク質の複合体は、 Ｂ　バーベル　シス又は交差反応性を有するタンパク賞
を発現する変異体から得ることができる。

従って、活性形及び不活性形は、通常の精製技法により
単離され得る。

驚くべきには、前記アデニル酸シクラーゼ調製物は、Ｂ
　バーベル　シスから得ることができ、そして交差免疫
性は旦一二土叉２ス感染とＢ　パ！冫！、感染との間に
存在しないことが認められた． 本発明のこの観点はひじょうに興味あるものである。な
ぜならばＢ　パーペル　シスは、それがよく知られてい
るようにＰｔｘを発現せず、ところが前記毒素は旦一ユ
夾久之スによってのみ発現されるからである。

従って、本発明は、ＰＬに関連する副作用、たとえばア
レルギー性脳炎の危険を持たない抗原性アデニル酸シク
ラーゼ調製物を得るための手段を提供する。

本発明の方によれば、Ｐｔｘを含まない抗原性ＡｃｔＮ
’Ａ物がＢ　バーベル　シスｈｚｙ”クローンから得る
ことができる。前記クローンは、インビト口で選択され
、又はチャレンジ後の肺のホモジネートから回収され、
そして急性水腫性出血性肺胞炎に関与することができる
。

高い量の活性ＡＣを都合良く発現する特定のｈｆ）＋”
クローンが肺から回収され、そして１９８８年４月１５
日にＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　Ｎａｔｉｏｎａｌｅ　ｄｅ
　Ｃｕｌｔｕｒｅ　ｄｅＭｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ
　（ＣＮＣＭ）にト７４９として寄託されている６３　
−　２Ｓクローンから成る．１０’ＣＦＵ／ｍｌでの標
準化された細菌懸濁液に対応する６３　−　２５の培養
上清液は、約２０〜２５単位のＡＣ酵素活性を有する。

低いＡＣの自発的発現を有するｈｐｙ’クローンが、Ａ
Ｃ活性を高めるために、マウスの鼻腔内注入され、そし
て肺から再単離され得る。

ｉｙ”，ＡＣ”表現型の発現を維持する誘導体化された
クローンは、本発明の範囲内にある。たとえば、クロー
ン６３−２ＴＣＳ　（　１−リブトーガゼインーソイ（
ｔｒｙｐｔｏ−ｃａｓｅｉｎ−ｓｏｙ）　）は、同じ収
率及びｈｌｙ”．Ａｃ”発現の維持を伴って、百日咳に
関する非特異的媒体上で増殖する６３　−　２Ｓ株から
得られた。

ｆ３　　＜ＪＩｉ　　−７７，とＢ　パーペル　シスと
の間の交差免疫性は、抗一旦一二土叉之入アデニル酸シ
クラーゼ抗体による受身交差保護により明示された．本
発明に従って得られたアデニル酸シクラーゼ調製物に対
して行なわれた研究は、前記分子が保護抗原であること
を示した。

従って、前記アデニル酸シクラーゼ調製物は、それらが
宿主のアデニル酸シクラーゼと交差反応しない条件下で
、ワクチン調製物を製遣するために本発明に従って都合
良く使用される。そのアデニル酸シクラーゼ調製物は、
活性及び不活性タンパク質の両者又は前記タンパク質の
１つのみを含有する。

Ｂ．パーペル　シスから得られたアデニル酸シクラーゼ
調製物から得られるそのようなワクチンは、分子ワクチ
ンであり、そしてヒト及び動物において百日咳感染及び
毒性効果を防ぐことができる。通常の投与量及び投与形
が都合良く使用される。ワクチンは、好ましくは鼻腔内
、経口又は非経口製剤の形として存在する。

ワクチン組成物において、アデニル酸シクラーゼ調製物
は、同じ接種物においてＦＨＡと組合しても良《又はし
なくても良い。ＦＨＡは、アデニル酸シクラーゼ調製物
と同時に又は異なった時に投与され得る。ＦＨＡ調製物
は、たとえばＳａ　ｔｏなど．，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍ
ｕｎ．．　１９Ｂ３．　４１，３１３〜３２０ページ又
はＩｍａｉｚｕｍｉｒ．Ｋ？．＋Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ
　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．　Ｍｅｔｈｏｄｓ２，　３３４
〜３４７ページ（１９８４）の方法を用いて都合良く得
られる。

本発明のアデニル酸シクラーゼ調製物はまた、１９８６
年１１月１７日に出願されたＦＲ特許第８６１５９６３
号に開示される精製されたＡＣ調製物、及び場合によっ
てはＦＨＡとも組合され得る。

好都合には、本発明のワクチン組成物は、百日咳菌、た
とえば一司一二ｊ匹多一乞２１、一旦一ノエラ工し欠ク
ー’ｙ７、Ｂ　ブロンキスペチカ（Ｌ虹並堕ロＬ旦９）
及びＢ．アビウム（Ｂ，ａｖｉｕｍ）により引き起こさ
れる感染を阻止する。

他の態様によれば、細菌性の完全な細胞ワクチンはＢ　
バーベル　シスから調製される。そのようなワクチンは
、Ｂ　バーベル　シス及びＢ　ぺ止叉之スの両者に対し
て保護効果を有する。

本発明の他の特徴及び利点は、次の例で付与されるであ
ろう。

この例に使用される材料及び方法は次の通りである： ａ　一　　　　　　　　び土立　　　　　　　：１−二
サし漏江入１８３２３（ＡＴＣＣ　９７９７）及び１−
ノシチベルタシス（ＣＴＰ６３−２）を、溶血性（ｈｊ
！ｙ”）又は非熔血性クローンを選択するために、脱フ
イブリン化された馬の血液により補充されたＢｏｒｄｅ
ｔ　Ｇｅｎｇｏｕ寒天培地（最終濃度１５％）（ＢＧ）
上にプレートし、そしてＳｔａｉｎｅｒ　Ｓｃｈｏｌｔ
ｅブイヨンに継代培養した。

ｂ−ＡＣ　　びＰｔｘのためのアッセイ：酵素活性又は
生物学的活性のいづれかからの、又はウェスターンプロ
ット分析によるＡＣ及びＰｔｘの検出方法は、Ｗｈｉｔ
ｅ　Ａ．Ａなど−　＋　Ｍｅ　ｔｈｏｄｓ勤１ｕカー．
　３　８　ｃ　．　４１　〜４　６ページ、１９７４及
びＭａｎｏｕｎｅなど，，　Ｊ．Ｂｉｏｌ，Ｃｈｅｍ．
，　２５２．２０３９〜２０４６ページ、１９７７によ
り記載されている。

Ｃ−ヱ盈ノ己（社）改束： 特定の病原体を有さない３週歳のＳｗｉｓｓαＦ１雌マ
ウス（１６ｇ±１８の体重）を、ｆｅｒｍｅ　ｅｘｐ６
ｒｉｍｅｎ−ｔａｌｅ　ｄｅ　Ｒｅｎｎｅｍｏｕｌｉｎ
　（Ｉｎｓｔｉｔｕｔ　Ｐａｓｔｅｕｒ，７８　Ｖｉｌ
ｌｅ−ｐｒｅｎｘ，　Ｆｒａｎｃｅ）から購入し、そし
てフィルター力ップを上部に備えたカゴ（Ｔｅｃｈｎｉ
ｐｌａｓｔ，　ＯＡＲ．Ｆｒａｎｃｅ）中に５匹のグル
ープで維持し、そしてγ線により殺菌された食物（ｇｒ
ａｎｕｌ’ｅｓ　ＲＯ３，　ＯＡＲ，Ｆｒａｎｃｅ　）
及びオートクレープされた飲み水を供給した。４週歳で
のマウスを、エーテル麻酔した後、ｋル３−２ノ，株Ｋ
ｅｎｄｒｉｃｋ　１８３２３　　（菌株タイブＡＴＣＣ
９７９７　）又はＢ　バーベル　シスＣＩＰ６３−２か
らの標準化された細菌接種物（５０ｊ１１の体積で）の
鼻腔内注入により感染せしめた。

ｄ−■職Ｍ理学： 感染されたマウスからの肺を、選択された時間テ集め、
１０％ホルムアルデヒド中に固定し、パラフィン中に固
定し、そして光学顕微鏡による試験のためにヘマトキシ
リンーエオシン又はＧｉｅｍｓａにより染色する前、連
続的に区分した。

詰一来： 一Ｂ　パーペル　シスによる肺感染力 ２種のグループの・マウスを、ＢＧに基づいて選択され
たｈｚｙ”クローン（６３−２Ｈ）又はチャレンジ後３
日でのマウスの肺のホモジネートから回収された、’．
１７４９として寄託されている前記ｈｐｙ’クローン（
６３−２Ｓ）のいづれかから調製された接種物を鼻腔内
に注入することによって感染せしめた。

鼻腔内感染の投与量一効果が第１図に報告され、そして
これは６３−２｝！　（曲線●・・・●）及び６３　−
　２５（曲線▲−▲）を伴って日数に対するｌｏｇ．。

ＣＦＵ／肺（コロニー形成単位）の変化の関数を示す。

垂直の線は、５匹のマウスのＳＥＭの平均である。

第１図に示されるように、両接種物は類似する毒性を有
し（細菌の増殖／生存割合に関して）、ところがクロー
ン５３　−　２Ｓはクローン６３　−　２Ｈよりも有意
により病原性であった。１０’ＣＦＵの鼻腔内注入は、
６３　−　２Ｓの場合、ＬＤ５０％に相当し、そして６
３　−　２Ｈの場合、ＬＤ２　５％に相当した。

−組織病理学的発見 チャレンジ後２４時間で死んだマウスの肺は、Ｂｒｅｚ
ｉｎ　Ｃ．など，，　ｄａｎｓ　ＦＥＭＳ　Ｍｉｃｒｏ
ｂｉｌｏ．Ｌｅｔｔ．，４２．　７５〜８０．　１９８
７により報告されているように、一旦エーゴソｋ夕じ２
２、に由来するｈｌｙ”Ａｃ’クローンにより観察され
る典型的なＡＨ｝ＩＡを示した。

−ＡＣ活性 １０ＣＦＵ／ｒｒｄｌでの標準化された細蘭懸濁液に相
当する６３　−　２５及び６３−２．Ｈの培養上清液中
のＡＣの用量は、ＡＣ酵素活性がそれぞれ２０〜２５単
位及び４〜７単位であることを示した。

Ｍ叉之スとＢ．パーペル　シスとの間 の交差免疫性 Ｂ．バーベルタシスにより感染されたマウスのＡＣに対
する免疫応答： 特定のポリクローナル抗一ＡＣ抗体によりＢ，，バシシ
ジ乃弓一之ノエの尿素抽出物のウェスターンプロット分
析を行なった。

尿素抽出物は次のようにして得られた：細菌部分を緩衝
ｆｉＡ（Ｔｒｉｓ　ＨＣｊ！　２５ｍＭ，　ＭｇＣＰ．
ｚ６ｍＭ，　ＮＰ４０　０．１％，　ｐＨ８）　（１／
３　　；Ｗ／へ）中でホモジネート１、そして緩衝液Ａ
中８Ｍの尿素の同量を添加した。培地を３０゜Ｃで４０
分間撹拌した。

緩衝液Ａ中での透析を行ない、続いて６゜Ｃで３０分間
遠心分離にかけた（５０００　ｇで）。その上清液を回
収し、そして尿素抽出物を構成する。

ポリクローナル抗−ＡＣを、一司＝！１匹づ仁之ノ、か
ら得られた精製されたＡＣ調製物により動物を免疫化し
、そして免疫血清からの調製物に対して生ゼしめられた
抗体を回収することによって得る。

抗体を生ぜしめるために使用される好ましいＡＣ調製物
は、“精製されたＡＣ調節物、前記のものを得るための
方法及びそれらの生物学的適用”に関する、１９８６年
１１月１７日に出願されたＦＲ特許出願第８６／１５９
６３号に開示される精製されたＡＣ調製物である。

そのような調製物は、それらが高度の純度を有し、そし
て汚染性細菌物質、特に百日咳毒素、リボ多糖（又はＬ
ＰＳ）及び繊維性赤血球凝集素（又はＦＨＡ）を完全に
欠くことを特徴とする。従って、ＡＣは、スクロース密
度グラジェントにおいて３．６に等しいＳ係数で沈殿し
、そしてそれぞれ４５及び４３Ｋドルトンの２種の構造
的に関連する分子形で存在する均一形で得ることができ
る。

もう１つの観点によれば、ＡＣｇｌ製物は、それらが達
成することができ、そしてさらに１６００μモルのＣＡ
ＭＰ／分・■を越える活性を有することを特徴とする。

前記精製されたＡＣ調製物は、前もって濃縮された、ア
デニル酸シクラーゼを示す細菌培養物の上清液又はこれ
らの細菌の抽出物とカルモジュリンとを接触することに
よって得ることができる。

ポリクローナル抗体は、ＡＣが遊離状態で存在するか又
は真核タンパク質、特にカルモジュリンとの複合体の形
で存在する問題のＡＣｇＪｌ製物により動物、たとえば
ウサギ又はマウスを免疫化し、そして抗体を含む抗血清
及び次に抗体自体を標準方法により回収することによっ
て生成される。

モノクローナル抗体は、マウス骨髄腫と精製されたアデ
ニル酸シクラーゼにより免疫化されたマウスに由来する
肺臓リンパ球との融合により得ることができる。

モノクローナル抗体（８〜２５）が特に使用される。そ
れらは、５０　．　４５及び４３Ｋドルトンのトリプレ
ット及び粗抽出物における１００Ｋドルトン以上の分子
量のタンパク質並びに細菌細胞から精製された酵素の調
製物を免疫沈殿せしめる。

モノクローナル抗体を生成するハイプリドーマ株は、１
９８６年１０月９日、Ｉ−６１０としてＮａｔｉｏｎａ
ｌＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　ａ　
ｏｆ　Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ（ＣＮＣＭ）に寄
託された。

結果が第２図上に与えられ、ここでレーン１〜４はそれ
ぞれ下記に相当する： １．抗一旦一二ヱ久之久ＡＣ抗体により示されるＢ　パ
ーペル　シス抽出物、 ２．　　８　　パーペル　シスにより感染されたマウス
からの血清により示される精製されたＢ　ペルｌ之囚Ａ
Ｃ， ３．　　Ｂ　　バーベル　シスにより感染されたマウス
からの血清により示されるＢ．パーペル　シス薗■貫、
及び ４．抗−８百日咳ＡＣ抗体を有する一Ｗ−ヱシＬベ，少
多一乞クヨ抽出物に示されるＢ．バーベル　シスＡＣ， 前記ウェスターンプロット分析は、一司一ご＜／Ｌ／ク
−シスＡＣと交差反応した分子量４３〜４５Ｋドルトン
の抗原の存在を示した（第２図）。

さらに、鼻腔内チャレンジの後２１日目で集められた、
精製された一迂一ご１匹多一乞２ＡＣとＢ　バーシゴ』
一と冫ノ，感染が回復に向かっているマウスからの血清
との比較免疫プロット（第１図）は、抗−１一二土叉之
スＡＣ抗体の存在を示した。

−Ｂ　　パーペル　シスによるマウスの呼ｌｉｔの致命
的な感染に対する抗−一迂一：≦四じＬ之ノ，ＡＣ抗体
の保護効果 ａ）Ｂ　　バーベル　シス接種物を、ポリクローナル又
はモノクローナル抗一一隨一二一四多一２ノ，ＡＣ抗体
と共に予備インキユベートした．その結果は、下記の第
１表に示される： 表に示されるように、ポリクローナル又はモノクローナ
ル抗一旦−ｍ之λＡＣ抗体と共にインキエベートされた
前記Ｂ　バーベル　シス接種物は、投与量依存性態様で
致命的なチャレンジを抑制した． Ｂ　パーペル　シスと１エこ塑ｃＬ乙入との間の交差免
疫原性が、第２表に示されるように交差予防接種実験に
より評価された． Ｕ一表 ８．ペルタシス又はＢ．パラペルタシスに対する交差予
防接種ａ：５６℃で２０分間加熱された細菌懸濁液；１
．２Ｘ１０’個（７）Ｂ　　ｇ）ｋ　　＞７ＡＣ”ＣＢ
ＰＡＣ”＞．２．５Ｘ１０”個の旦一二９七Ｌ乞入ＡＣ
−　（ＢＰＡＣ−）　，又は ２．２Ｘ１０”個のＢ　バーベル　シス６３　−　２Ｓ
（ＢＰＰ）の５日間隔での２回のＳＣ注入。

ｂ　：　５　Ｘ１０′ＴＣＦυのＢＰＡＣ　’″又は８
Ｘ１０”ＣＦυのＢＰＰの鼻腔内注入。

【図面の簡単な説明】

第１図は、Ｂ．バーベル　シスクローンによる肺感染の
動力学を示し、そして 第２図は、ポリクローナル抗一旦一二土Ｌ之ムＡＣ抗体
による、Ｂ．バーベル　シス及びＢ６ぺ永Ｌ之久からの
ＡＣ含有抽出物の免疫プロットを示し、そしてこれは図
面に代わる写真である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、Ｂ、パラペルタシス（Ｂ．ｐａｒａｐｅｒｔｕｓｓ
   ｉｓ）又は変異体の使用を特徴とするアデニル酸シクラ
   ーゼ調製物を得るための方法。 ２、前記Ｂ．パラペルタシス又は変異体から得られたア
   デニル酸シクラーゼ（ＡＣ）調製物が、特定のポリクロ
   ーナル及びモノクローナル抗−Ｂ．ペルタシス（ａｎｔ
   ｉ−Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｉｓ）ＡＣにより特異的に認識さ
   れ、そしてＢ．ペルタシスＡＣと抗原的に交差反応する
   ことができる、約４３±４．３〜４５±４．５Ｋドルト
   ンの分子量（Ｍｒ）を有する活性アデニル酸シクラーゼ
   、及び／又は精製されたＡＣ調製物に対して高められた
   ポリクローナル抗−ＡＣ抗体により特異的に認識され、
   そしてアデニル酸シクラーゼカルモジュリン（ＣａＭ）
   活性可能な活性及びＣａＭに対する親和性を欠く、 約４３±４．３Ｋドルトンの分子量（Ｍｒ）を有する不
   活性タンパク質（該タンパク質はＢ．ペルタシスＡＣと
   交差反応することができる）を含んで成る請求項１記載
   の方法。 ３、それぞれ不活性タンパク質及び活性アデニル酸シク
   ラーゼを分離し、そして回収する段階をさらに含んで成
   る請求項２記載の方法。 ４、前記アデニル酸シクラーゼ調製物が、急性水腫性出
   血性肺胞炎を誘発することができるＢ．パラペルタシス
   のｈｌｙ＾＋（溶血性）クローン〔特にインビトロ又は
   チャレンジ後（ｐｏｓｔ　ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）の肺の
   ホモジネートから選択される〕から得られる請求項１〜
   ３のいづれか１項記載の方法。 ５、前記ｈｌｙ＾＋クローンが１９８８年４月１５日に
   Ｉ　７４９として寄託されている６３−２Ｓクローンで
   あり、そしてｈｌｙ＾＋、ＡＣ＾＋表現型の発現を維持
   する誘導体化されたクローンである請求項４記載の方法
   。 ６、１０＾９ＣＦＵ／ｍｌでの標準化された細菌懸濁液
   に対応する培養上清液が、約２０〜２５単位のＡＣ酵素
   活性を有する請求項４又５記載の方法。 ７、百日咳により引き起こされる感染を防ぐためにワク
   チン組成物を製造するための方法であって、請求項１〜
   ７のいづれか１項記載の方法に従って得られたアデニル
   酸シクラーゼを、場合によては同じ接種物中にＦＨＡ（
   繊維状赤血球凝集素）及び／又は精製されたＡＣと共に
   組合して使用すること又は単独で使用することを含んで
   成る方法。 ８、Ｂ．パラペルタシスから調製される事実を特徴とす
   る細菌性の完全な細胞ワクチン。 ９、１９８８年４月１５日にＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　ｎ
   ａｔｉｏｎａｌｅ　ｄｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　ｄｅ　Ｍｉ
   ｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅ（ＣＮＣＭ）にＩ　７４９と
   して寄託されているＢ．パラペルタシスのｈｌｙ＾＋ク
   ローン。