JPH0440330B2 - - Google Patents
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- JPH0440330B2 JPH0440330B2 JP55501359A JP50135980A JPH0440330B2 JP H0440330 B2 JPH0440330 B2 JP H0440330B2 JP 55501359 A JP55501359 A JP 55501359A JP 50135980 A JP50135980 A JP 50135980A JP H0440330 B2 JPH0440330 B2 JP H0440330B2
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Description
技術分野
この発明は遺伝的に弱毒化された菌株から成る
細菌性ワクチン及びその製造方法に関するもので
ある。 背景技術 細菌性及びウイルス性のワクチンはヒトや他の
動物を感染性の疾病から守ることに関して大きな
成功を収めている。細菌やウイルスからワクチン
をつくる方法はいろいろある。あらゆるワクチン
及びその製造方法について必要とされる基本的な
要件は、(1)得られたワクチンが宿主体内での抗体
の生産を誘導するのに必要な抗原決定基を含んで
いること、(2)ワクチンが高い免疫原性を持つてい
ること、(3)得られたワクチンが、被接種者及びそ
のあらゆる接触者の両方に対して臨床感染の危険
性がなく投与し得るに充分に安全であること、及
び、それ故にワクチン接種に付随する危険性が完
全に排除されないまでも最小限におさえられてい
ること、(4)得られたワクチンが毒的な副作用、例
えば殺された又は抽出された細胞内に存在するエ
ンドトキシンによる発熱等、を伴わないこと、(5)
得られたワクチンが効果的なルート、例えば経
口、鼻腔内、局所的又は非経口的なルートによる
投与に適していること、(6)得られたワクチン及び
その投与の態様が自然の感染の場合と条件が非常
によく似ていること、(7)得られたワクチンが長期
間の保存条件に適していること、及びその長期間
の保存は室温下でなされること、並びに(8)得られ
たワクチンが通常の不活性なワクチン担体に適合
性のあることである。 これらの諸要件の１又はそれ以上を満たすこと
を試みた従来技術は、殺された全細胞、精製又は
部分的に精製された選ばれた抗原成分、化学的に
又は遺伝的に弱毒化された生きた微生物、から成
るワクチンに及んでいる。 殺された全細胞をワクチンとして使用すること
はスウイツツアー（Switzer）らによつて米国特
許4016253に記載されており、彼らはその方法を
豚のボルデテラブロンチセプテイカ
（Bordetellabronchiseptica）の感染に対するワ
クチンの製造方法に用いている。殺された全細胞
はインフルエンザ菌による慢性気管支炎に対する
ワクチンの製造にも用いられている（ブラウン
（Brown）とウイルソン（Wilson）、Br.Med.
J.1：2631959）。しかしながら殺された全細胞の
使用は通常免疫原性の減少を伴う。なぜならば細
胞を殺す過程において、宿主内での特異的な抗体
の誘導に必要な抗原決定基の表面の多くが通常破
壊され又は変化されるからである。このような変
化された抗原に反応して生成された抗体は生きた
生物の表面の分子構造に対して特異的でなく、し
たがつて、侵入してくる病原体に対して効果的で
ない。 微生物から分離され、精製された抗原成分もま
たワクチンとして用いられている。これは、例え
ばインフルエンザ菌ｂ型の莢膜の精製した多糖類
物質をこの生物によつて引き起こされる髄膜炎に
対するワクチンとして使用することに代表される
（パーク（Parke）らJ.Inf.Dis.136（Suppl.）：S51、
1977；アンダーソン（Anderson）らJ.Inf.
Dis.136（Suppl）：S63、1977；マケラ（Makela）
らJ.Inf.Dis.136（Suppl.）：S43、1977）。この方法
もまた、この全細胞内の位置から抗原成分を遊離
させる過程において抗原の精密な三次元構造を極
めて危うくするような分離及び精製操作を必要と
するという点において難点がある。全細胞から抽
出された抗原はまた本来の免疫原性を減少させら
れ、このことは、このようなワクチンを非常に小
さな子供に用いた場合の成功率を減少させる（上
記文献、デイヴイス（Davis）、J.Immunol.33：
１、1937及びモント（Monto）らJ.Inf.Dis.127：
394、1973）。このように、成長した子供や成人に
対してのインフルエンザ菌ｂ型から精製した莢膜
の多糖類の接種は体液中に抗体を誘導するが、病
気に対して最も感受性の強い非常に小さな子供
（生後14カ月ないし18カ月未満）に対しては意義
のある、持続的な反応を起こさせることができな
い（上記文献）。精製した莢膜の多糖類ワクチン
を肺炎双球菌や髄膜炎菌から製造し、これを小さ
な子供に接種する場合にも同様の難点がある（デ
イヴイーズ（Davies）J.Immunol33：１、
1937；モントらJ.Inf.Dis.127：394、1973）。 従来技術では、化学的に弱毒化された生きた微
生物もワクチンとして使用されている。このワク
チンの製法は例えば、米国特許3907987及び
3975517におけるウイルソン（Wilson）による研
究に代表される。ウイルソンは、大腸菌の菌株を
選んでこれを弱毒化するために希ホルマリンで処
理し、動物の腸炎に対する細菌性ワクチンを作つ
た。バウアー（Bauer）らは米国特許4058599に
おいて、微生物をエチレンイミンで処理すること
によつて弱毒化した不活性な、しかし免疫原性の
あるワクチンの製法を記載している。微生物全体
を化学的に処理することは、その免疫原性を著し
く損い、そして多くの場合毒性を望むほど減少さ
せることはできない。 生きた微生物を、その免疫原性を保つたままで
弱毒化する第２の方法は、無毒の又はゆつくり増
殖する菌株、又は宿主体内では自身を持続的に複
製することができない突然変異株を利用すること
である。このような突然変異株はうまく選ぶと、
特異的な抗体を誘導するのに必要な細胞表面の構
造を全く完全な形で保持したまま、しかも病気を
引き起こすことができない。なぜならばそれらは
(1)毒素を生産することができない、(2)増殖の速さ
が遅すぎる、又は(3)宿主体内では全く増殖しな
い、からである。種々のこのような遺伝的変異株
は細菌性の、又はウイルス性のワクチンの製造に
利用されている。 スミス（Smith）（米国特許3364117）、ヒルマ
ン（Hillman）（米国特許4133875）、及びジヤー
マニアー（Germanier）（米国特許3856935）らは
すべて、おそらく毒素の生産に関与している遺伝
子に突然変異を起こしたが故に病気を引き起こす
能力を失つた菌株をワクチンに利用することにつ
いて記載している。スミス（上記）によつて記載
されたワクチンは、豚に対する毒性を失つたこと
を除いては野生型とほとんど性質の違わない豚コ
レラ菌のＳ−Ｒ変異株から成つている。この突然
変異株はラフ変異株であるので、細菌表面の性質
が変化しており、それが故に、病原菌型の抗原を
真に有してはいない。ヒルマン（上記）はＬ（＋）
−乳酸脱水素酵素をコードしている構造遺伝子上
で単点突然変異を起こした、特徴のあるストレプ
トコツカスミユータンス（Streptococcus
mutans）の突然変異株について記載している。
この突然変異株は酸をあまり生産せず、むし歯の
発生及び悪化防止のために、口腔内フロラ
（flora）中の酸を多く生産する野性型のストレプ
トコツカスミユータンスにとつて変わらせること
ができる。ジヤーマニアー（上記）はガラクトー
ス代謝酵素の遺伝子の発現に大きく影響する単突
然変異（欠失として特徴づけられる）を有するチ
フス菌の突然変異株について記載している。これ
らの遺伝子は１つの単位、すなわちガラクトース
オペロンに集中しており、３つの酵素（ウクジン
ジフオスフオガラクトース−４−エピメラーゼ、
ガラクトース−１−フオスフエートウリジルトラ
ンスフエラーゼ、及びガラクトキナーゼ）の合成
に関する情報をコードしている。この突然変異株
における欠失はエピメラーゼ遺伝子中に起こつて
おり、機能的なエピメラーゼ酵素を生産すること
ができない。特徴的にこのような欠失はまた、オ
ペロン内の遠位の遺伝子に対し、強い極性効果を
持つており（マーチン（Martin）らCold Spring
Habor Symp.Quant.Biol.31：215、1966）、した
がつてこの菌株では、ガラクトキナーゼ及びガラ
クトース−１−フオスフエートウリジルトランス
フエラーゼの生産も極度におさえられる。欠失は
通常安定であり、この突然変異株の復帰株はまだ
検出されていない。しかしながら、このようなガ
ラクトース代謝酵素突然変異は、リポ多糖類の側
鎖の形成を妨げることによつて細胞表面の性質に
変化を引き起こす。したがつて、特異的な抗体を
誘導するための構造が危うくなる。さらに、ガラ
クトース代謝酵素突然変異は自己消化を引き起こ
し、それが為に、宿主体内で長く免疫的な刺激を
与える能力が危うくなる。 ヒトの体温（37℃）ではゆつくりとしか複製で
きず、したがつて病気を引き起こすことができな
いインフルエンザ及び呼吸シンシチウムウイルス
がつくられた（マーフイー（Murphy）らJ.Inf.
Dis.128：479、1973及びチヤノツク（Chanock）
らPediatr.Res.11：264、1977）。これらの単突然
変異株はワクチン中で多くの有毒な復帰株を生産
し、実用的でないことがわかつた。ワクチンとし
ての使用に適した増殖速度の遅い細菌突然変異株
に関する報告はないが、増殖速度の遅いウイルス
突然変異株の場合と同じ制限があてはまるであろ
う。 宿主体内では全く複製しないワクチン用の突然
変異株には２種類のものがある。１つは複製する
ために異常な栄養素や増殖要素を（宿主の生化学
的反応経路には存在しない化合物）を必要とする
ものであり、レビン（（Levine）J.Inf.Dis.133：
424、1976）とレイマン（（Reitman）J.Inf.
Dis.117：101、1967）によつて記載されている。
これらの研究者は増殖にストレプトマイシンを必
要とするチフス菌及び腸チフス菌を記載してい
る。おそらくこれらの菌株ではリボゾームタンパ
ク質の構造が変化しておりリボゾームが本来の機
能を発揮するためにストレプトマイシンを必要と
するのであろう。しかしながら、これらの突然変
異株は真に安全なワクチンとして利用できるほど
遺伝的に安定していない。 ２番目の種類は、フアヘイ（Fahey）とクーパ
ー（Cooper）（Infect.Immun.1：263、1970）、マ
ヘスワラン（Maheswaran）（米国特許3855408）
及びヘルムス（Helms）ら（J.Inf.Dis.135：582、
1977）によつて記載されている、ある一定温度以
上の温度下では自身を複製することができない突
然変異株である。腸炎菌、パスツレラ菌及び肺炎
双球菌の温度感受性株がこれらの研究者によつて
分離され、部分的に特徴づけられている。この突
然変異株は、それらが試験された動物の体温下で
は増殖することができなかつたが、細胞表面の性
質が変化していないので、すぐれた抗原として働
いた。しかしながら、有毒な野性型への復帰がか
なり多いので、ヒトや動物に対し、これらをワク
チンとして用いることはできない。 温度感受性突然株をワクチンとして使用する際
に伴う野性型への復帰の問題は、この方法の本質
的な限界であるように思われる。これは、突然変
異が単一の塩基の置換によるものであり、したが
つて自然に復帰するものがかなり多くなるからで
ある。同様に、野性型への復帰はまた、遺伝的に
弱毒化したウイルスをワクチンとして使用する場
合の安全性にも問題となる（ヘンダーソン
（Henderson）らJ.A.M.A.190：41、1964；チヤ
ノツク（Chanock）らPediatr.Res.11：264、
1977及びマーフイーJ.Inf.Dis.128：479、1973）。 この問題を克服するために、従来技術におい
て、増殖抑制によつて弱毒化される２つの突然変
異を含むウイルスの突然変異株をワクチンに使用
することが研究されている（マーフイーら
Virology88：231、1978及びマーフイーらInfect.
Immun.23：249、1979）。このような株では異な
る表現型の２種の突然変異が、復帰頻度が減少す
るであろうという考えの下に、組み合わされてい
る。 複数の温度感受性突然変異を１つの菌株に組み
合わせるのには２つの方法が利用されている。１
つはチヤノツクら（Pediatr.Res.11：264、1977）
による方法で、すでに１つの温度感受性突然変異
を持つた呼吸シンシチウムウイルス株にさらに突
然変異を起こさせるものである。１つの突然変異
がウイルスの複製を39℃で完全に止め、もう１つ
の突然変異が37℃で複製を厳しく制限し、これに
より、二重突然変異株が認められる。 生体内での中立遺伝的組換えを利用するもう１
つの方法がマーフイーらによつて報告されている
（Virology88：231、1978）。彼らは、増殖抑制温
度が37℃の突然変異を持つ株と、増殖抑制温度が
38℃の突然変異を持つ株との２種類のインフルエ
ンザウイルスの突然変異株を細胞に共感染させる
ことによつて２重の温度感受性突然変異株をつく
り、その組換え体を後代の中から分離した。これ
らの突然変異株をつくる根拠は、最終的に分離さ
れた株は、２つの増殖抑制突然変異を有する、す
なわち、１つの突然変異は38℃あるいは39℃で複
製を厳しく抑制し、もう１つの突然変異は37℃以
上で複製を厳しく抑制する、ということである。
39℃またはそれ以上の温度下ではウイルスの複製
は両方の突然変異によつて厳しく抑制され、また
復帰株は極めて希である（前述のとおり）。しか
しながら、ヒトの正常な体温である37℃では、１
つの突然変異だけが増殖を制限しており、ウイル
スは１つの突然変異だけを発現しているにすぎな
い。その結果、復帰頻度は37℃で増殖を抑制する
突然変異が１つだけ存在する場合と同じである。
増殖抑制温度が異なる２重の温度感受性突然変異
株では、それが低い方の増殖抑制温度付近に生育
する場合には、２つの突然変異のうちの１つにつ
いての復帰株はかなり存在するので復帰株が増殖
する可能性は１つの突然変異を持つ温度感受性株
の場合と同じになる。このような温度は半許容的
であり、復帰株が選択的に異常増殖する条件を与
える。 多重突然変異は細菌性のワクチン用の菌株には
利用されていないけれども、カーテイス
（Curtiss）は遺伝子のクローニングのために、表
現型の異なる多重突然変異によつて弱毒化された
大腸菌の突然変異株をつくつた（Ann.Rev.
Microbiol.30：507、1976）。この研究の重要な考
えは、実験室内につくられた特殊な環境以外の環
境では生きることができない突然変異株をつくる
ことである。実際、この菌株に導入された少なく
とも１つの突然変異によつて、これらが限られた
特定の環境外で成育しようとすると細胞の自己破
壊が起こる。カーテイスはこの菌株は細菌毒の遺
伝子のクローニングに利用でき、ついで大量に細
菌毒をワクチン用に生産することができることを
示唆している（ibid.510ページ26−28行）。さら
に、1978年７月５日に英国で発行された英国特許
明細書１−516−458には、この微生物、すなわち
大腸菌Ｋ−12X1776に、原核細胞及び真核細胞タ
ンパク質（例えばコレラ毒あるいはインシユリ
ン）、又は有機酸（例えばグルコースの発酵によ
つて生産されるクエン酸あるいは乳酸）を大規模
に生産する際の安全性を確保するために、多くの
突然変異を導入することが記載されている。この
明細書の第４ページには自然な生態学的環境下で
は増殖できない、すなわちコロニーをつくること
ができない微生物の利用について記載されてい
る。しかしながら、この明細書で力点が置かれて
いるのは、異なる表現型を表わす種々の突然変異
を持つ細菌株である。このような菌株をワクチン
として利用することの欠点を以下に述べる。 異なる表現型を表わす２つの突然変異を１つの
菌株に組み入れることは、両方の突然変異が同時
に抑制的である場合にのみ、その復帰頻度を引き
下げることについて効果的である。この議論は温
度感受性、増殖要素、及び毒素に関する突然変異
に関して、これらが単独であれ組み合わされてい
る場合であれ、等しくあてはまる。単一の菌株に
２以上の突然変異を組み入れて復帰頻度を減少さ
せるためには、理想的には突然変異が常に協働す
ることを保証するために、これらの突然変異は同
一表現型を発現するものでなければならない。 発明の開示 それ故にこの発明の目的は生きた、遺伝的に弱
毒化された細菌をその基礎とする安全なワクチン
を提供することである。この発明のもう１つの目
的は２又はそれ以上の突然変異を有する細菌株を
その基礎とするワクチンを提供することである。 さらにこの発明の目的は、増殖抑制温度が同一
である２以上の温度感受性突然変異を含む菌株を
その基礎とする細菌性ワクチンを提供することで
ある。 また、さらにこの発明の目的は、完全な抗原性
を保ち、投与後においてもこれを完全なまま保つ
菌株をその基礎とする細菌性ワクチンを提供する
ことである。 この発明の１つの目的はまた、自然な感染の初
期状態をまねるために、宿主内で少なくとも抑制
されつつ複製できる菌株をその基礎とする細菌性
ワクチンを提供することである。 さらにこの目的は、それ自体がインフルエンザ
菌に対するワクチンとして適わしい細菌株を提供
し、この菌株に適当な莢膜の情報を遺伝的に加え
ることにより、あらゆる抗原型のインフルエンザ
菌に対するワクチンを提供することである。 この発明の１つの目的はまた、２又はそれ以上
の、同一表現型の突然変異を含んだ、遺伝的に弱
毒化されたワクチン用の細菌株を利用することに
よる、感染病に対する接種方法を提供することで
ある。 さらにもう１つのこの発明の目的は、同一表現
型の、２以上の突然変異を含む遺伝的に弱毒化さ
れたワクチン用の細菌株を製造する方法を提供す
ることである。 これらの及び以下により明瞭となるであろう多
のこの発明の目的は、細菌をその免疫原性を保つ
たまま弱毒化する同一表現型の２以上の突然変異
を有する、遺伝的に弱毒化された細菌株から成る
ワクチンを提供することによつて達成される。 この発明の目的はまた、同一表現型の２以上の
突然変異が同一表現型の温度感受性突然変異であ
る細菌性ワクチンを提供することによつて達成さ
れる。 この発明の目的はまた、同一表現型を持つ少な
くとも２つの異なる温度感受性突然変異を有する
遺伝的に弱毒化されたインフルエンザ菌から成
る、髄膜炎やこの微生物によつて引き起こされる
他の病気に対するワクチンを提供することによつ
て達成される。
細菌性ワクチン及びその製造方法に関するもので
ある。 背景技術 細菌性及びウイルス性のワクチンはヒトや他の
動物を感染性の疾病から守ることに関して大きな
成功を収めている。細菌やウイルスからワクチン
をつくる方法はいろいろある。あらゆるワクチン
及びその製造方法について必要とされる基本的な
要件は、(1)得られたワクチンが宿主体内での抗体
の生産を誘導するのに必要な抗原決定基を含んで
いること、(2)ワクチンが高い免疫原性を持つてい
ること、(3)得られたワクチンが、被接種者及びそ
のあらゆる接触者の両方に対して臨床感染の危険
性がなく投与し得るに充分に安全であること、及
び、それ故にワクチン接種に付随する危険性が完
全に排除されないまでも最小限におさえられてい
ること、(4)得られたワクチンが毒的な副作用、例
えば殺された又は抽出された細胞内に存在するエ
ンドトキシンによる発熱等、を伴わないこと、(5)
得られたワクチンが効果的なルート、例えば経
口、鼻腔内、局所的又は非経口的なルートによる
投与に適していること、(6)得られたワクチン及び
その投与の態様が自然の感染の場合と条件が非常
によく似ていること、(7)得られたワクチンが長期
間の保存条件に適していること、及びその長期間
の保存は室温下でなされること、並びに(8)得られ
たワクチンが通常の不活性なワクチン担体に適合
性のあることである。 これらの諸要件の１又はそれ以上を満たすこと
を試みた従来技術は、殺された全細胞、精製又は
部分的に精製された選ばれた抗原成分、化学的に
又は遺伝的に弱毒化された生きた微生物、から成
るワクチンに及んでいる。 殺された全細胞をワクチンとして使用すること
はスウイツツアー（Switzer）らによつて米国特
許4016253に記載されており、彼らはその方法を
豚のボルデテラブロンチセプテイカ
（Bordetellabronchiseptica）の感染に対するワ
クチンの製造方法に用いている。殺された全細胞
はインフルエンザ菌による慢性気管支炎に対する
ワクチンの製造にも用いられている（ブラウン
（Brown）とウイルソン（Wilson）、Br.Med.
J.1：2631959）。しかしながら殺された全細胞の
使用は通常免疫原性の減少を伴う。なぜならば細
胞を殺す過程において、宿主内での特異的な抗体
の誘導に必要な抗原決定基の表面の多くが通常破
壊され又は変化されるからである。このような変
化された抗原に反応して生成された抗体は生きた
生物の表面の分子構造に対して特異的でなく、し
たがつて、侵入してくる病原体に対して効果的で
ない。 微生物から分離され、精製された抗原成分もま
たワクチンとして用いられている。これは、例え
ばインフルエンザ菌ｂ型の莢膜の精製した多糖類
物質をこの生物によつて引き起こされる髄膜炎に
対するワクチンとして使用することに代表される
（パーク（Parke）らJ.Inf.Dis.136（Suppl.）：S51、
1977；アンダーソン（Anderson）らJ.Inf.
Dis.136（Suppl）：S63、1977；マケラ（Makela）
らJ.Inf.Dis.136（Suppl.）：S43、1977）。この方法
もまた、この全細胞内の位置から抗原成分を遊離
させる過程において抗原の精密な三次元構造を極
めて危うくするような分離及び精製操作を必要と
するという点において難点がある。全細胞から抽
出された抗原はまた本来の免疫原性を減少させら
れ、このことは、このようなワクチンを非常に小
さな子供に用いた場合の成功率を減少させる（上
記文献、デイヴイス（Davis）、J.Immunol.33：
１、1937及びモント（Monto）らJ.Inf.Dis.127：
394、1973）。このように、成長した子供や成人に
対してのインフルエンザ菌ｂ型から精製した莢膜
の多糖類の接種は体液中に抗体を誘導するが、病
気に対して最も感受性の強い非常に小さな子供
（生後14カ月ないし18カ月未満）に対しては意義
のある、持続的な反応を起こさせることができな
い（上記文献）。精製した莢膜の多糖類ワクチン
を肺炎双球菌や髄膜炎菌から製造し、これを小さ
な子供に接種する場合にも同様の難点がある（デ
イヴイーズ（Davies）J.Immunol33：１、
1937；モントらJ.Inf.Dis.127：394、1973）。 従来技術では、化学的に弱毒化された生きた微
生物もワクチンとして使用されている。このワク
チンの製法は例えば、米国特許3907987及び
3975517におけるウイルソン（Wilson）による研
究に代表される。ウイルソンは、大腸菌の菌株を
選んでこれを弱毒化するために希ホルマリンで処
理し、動物の腸炎に対する細菌性ワクチンを作つ
た。バウアー（Bauer）らは米国特許4058599に
おいて、微生物をエチレンイミンで処理すること
によつて弱毒化した不活性な、しかし免疫原性の
あるワクチンの製法を記載している。微生物全体
を化学的に処理することは、その免疫原性を著し
く損い、そして多くの場合毒性を望むほど減少さ
せることはできない。 生きた微生物を、その免疫原性を保つたままで
弱毒化する第２の方法は、無毒の又はゆつくり増
殖する菌株、又は宿主体内では自身を持続的に複
製することができない突然変異株を利用すること
である。このような突然変異株はうまく選ぶと、
特異的な抗体を誘導するのに必要な細胞表面の構
造を全く完全な形で保持したまま、しかも病気を
引き起こすことができない。なぜならばそれらは
(1)毒素を生産することができない、(2)増殖の速さ
が遅すぎる、又は(3)宿主体内では全く増殖しな
い、からである。種々のこのような遺伝的変異株
は細菌性の、又はウイルス性のワクチンの製造に
利用されている。 スミス（Smith）（米国特許3364117）、ヒルマ
ン（Hillman）（米国特許4133875）、及びジヤー
マニアー（Germanier）（米国特許3856935）らは
すべて、おそらく毒素の生産に関与している遺伝
子に突然変異を起こしたが故に病気を引き起こす
能力を失つた菌株をワクチンに利用することにつ
いて記載している。スミス（上記）によつて記載
されたワクチンは、豚に対する毒性を失つたこと
を除いては野生型とほとんど性質の違わない豚コ
レラ菌のＳ−Ｒ変異株から成つている。この突然
変異株はラフ変異株であるので、細菌表面の性質
が変化しており、それが故に、病原菌型の抗原を
真に有してはいない。ヒルマン（上記）はＬ（＋）
−乳酸脱水素酵素をコードしている構造遺伝子上
で単点突然変異を起こした、特徴のあるストレプ
トコツカスミユータンス（Streptococcus
mutans）の突然変異株について記載している。
この突然変異株は酸をあまり生産せず、むし歯の
発生及び悪化防止のために、口腔内フロラ
（flora）中の酸を多く生産する野性型のストレプ
トコツカスミユータンスにとつて変わらせること
ができる。ジヤーマニアー（上記）はガラクトー
ス代謝酵素の遺伝子の発現に大きく影響する単突
然変異（欠失として特徴づけられる）を有するチ
フス菌の突然変異株について記載している。これ
らの遺伝子は１つの単位、すなわちガラクトース
オペロンに集中しており、３つの酵素（ウクジン
ジフオスフオガラクトース−４−エピメラーゼ、
ガラクトース−１−フオスフエートウリジルトラ
ンスフエラーゼ、及びガラクトキナーゼ）の合成
に関する情報をコードしている。この突然変異株
における欠失はエピメラーゼ遺伝子中に起こつて
おり、機能的なエピメラーゼ酵素を生産すること
ができない。特徴的にこのような欠失はまた、オ
ペロン内の遠位の遺伝子に対し、強い極性効果を
持つており（マーチン（Martin）らCold Spring
Habor Symp.Quant.Biol.31：215、1966）、した
がつてこの菌株では、ガラクトキナーゼ及びガラ
クトース−１−フオスフエートウリジルトランス
フエラーゼの生産も極度におさえられる。欠失は
通常安定であり、この突然変異株の復帰株はまだ
検出されていない。しかしながら、このようなガ
ラクトース代謝酵素突然変異は、リポ多糖類の側
鎖の形成を妨げることによつて細胞表面の性質に
変化を引き起こす。したがつて、特異的な抗体を
誘導するための構造が危うくなる。さらに、ガラ
クトース代謝酵素突然変異は自己消化を引き起こ
し、それが為に、宿主体内で長く免疫的な刺激を
与える能力が危うくなる。 ヒトの体温（37℃）ではゆつくりとしか複製で
きず、したがつて病気を引き起こすことができな
いインフルエンザ及び呼吸シンシチウムウイルス
がつくられた（マーフイー（Murphy）らJ.Inf.
Dis.128：479、1973及びチヤノツク（Chanock）
らPediatr.Res.11：264、1977）。これらの単突然
変異株はワクチン中で多くの有毒な復帰株を生産
し、実用的でないことがわかつた。ワクチンとし
ての使用に適した増殖速度の遅い細菌突然変異株
に関する報告はないが、増殖速度の遅いウイルス
突然変異株の場合と同じ制限があてはまるであろ
う。 宿主体内では全く複製しないワクチン用の突然
変異株には２種類のものがある。１つは複製する
ために異常な栄養素や増殖要素を（宿主の生化学
的反応経路には存在しない化合物）を必要とする
ものであり、レビン（（Levine）J.Inf.Dis.133：
424、1976）とレイマン（（Reitman）J.Inf.
Dis.117：101、1967）によつて記載されている。
これらの研究者は増殖にストレプトマイシンを必
要とするチフス菌及び腸チフス菌を記載してい
る。おそらくこれらの菌株ではリボゾームタンパ
ク質の構造が変化しておりリボゾームが本来の機
能を発揮するためにストレプトマイシンを必要と
するのであろう。しかしながら、これらの突然変
異株は真に安全なワクチンとして利用できるほど
遺伝的に安定していない。 ２番目の種類は、フアヘイ（Fahey）とクーパ
ー（Cooper）（Infect.Immun.1：263、1970）、マ
ヘスワラン（Maheswaran）（米国特許3855408）
及びヘルムス（Helms）ら（J.Inf.Dis.135：582、
1977）によつて記載されている、ある一定温度以
上の温度下では自身を複製することができない突
然変異株である。腸炎菌、パスツレラ菌及び肺炎
双球菌の温度感受性株がこれらの研究者によつて
分離され、部分的に特徴づけられている。この突
然変異株は、それらが試験された動物の体温下で
は増殖することができなかつたが、細胞表面の性
質が変化していないので、すぐれた抗原として働
いた。しかしながら、有毒な野性型への復帰がか
なり多いので、ヒトや動物に対し、これらをワク
チンとして用いることはできない。 温度感受性突然株をワクチンとして使用する際
に伴う野性型への復帰の問題は、この方法の本質
的な限界であるように思われる。これは、突然変
異が単一の塩基の置換によるものであり、したが
つて自然に復帰するものがかなり多くなるからで
ある。同様に、野性型への復帰はまた、遺伝的に
弱毒化したウイルスをワクチンとして使用する場
合の安全性にも問題となる（ヘンダーソン
（Henderson）らJ.A.M.A.190：41、1964；チヤ
ノツク（Chanock）らPediatr.Res.11：264、
1977及びマーフイーJ.Inf.Dis.128：479、1973）。 この問題を克服するために、従来技術におい
て、増殖抑制によつて弱毒化される２つの突然変
異を含むウイルスの突然変異株をワクチンに使用
することが研究されている（マーフイーら
Virology88：231、1978及びマーフイーらInfect.
Immun.23：249、1979）。このような株では異な
る表現型の２種の突然変異が、復帰頻度が減少す
るであろうという考えの下に、組み合わされてい
る。 複数の温度感受性突然変異を１つの菌株に組み
合わせるのには２つの方法が利用されている。１
つはチヤノツクら（Pediatr.Res.11：264、1977）
による方法で、すでに１つの温度感受性突然変異
を持つた呼吸シンシチウムウイルス株にさらに突
然変異を起こさせるものである。１つの突然変異
がウイルスの複製を39℃で完全に止め、もう１つ
の突然変異が37℃で複製を厳しく制限し、これに
より、二重突然変異株が認められる。 生体内での中立遺伝的組換えを利用するもう１
つの方法がマーフイーらによつて報告されている
（Virology88：231、1978）。彼らは、増殖抑制温
度が37℃の突然変異を持つ株と、増殖抑制温度が
38℃の突然変異を持つ株との２種類のインフルエ
ンザウイルスの突然変異株を細胞に共感染させる
ことによつて２重の温度感受性突然変異株をつく
り、その組換え体を後代の中から分離した。これ
らの突然変異株をつくる根拠は、最終的に分離さ
れた株は、２つの増殖抑制突然変異を有する、す
なわち、１つの突然変異は38℃あるいは39℃で複
製を厳しく抑制し、もう１つの突然変異は37℃以
上で複製を厳しく抑制する、ということである。
39℃またはそれ以上の温度下ではウイルスの複製
は両方の突然変異によつて厳しく抑制され、また
復帰株は極めて希である（前述のとおり）。しか
しながら、ヒトの正常な体温である37℃では、１
つの突然変異だけが増殖を制限しており、ウイル
スは１つの突然変異だけを発現しているにすぎな
い。その結果、復帰頻度は37℃で増殖を抑制する
突然変異が１つだけ存在する場合と同じである。
増殖抑制温度が異なる２重の温度感受性突然変異
株では、それが低い方の増殖抑制温度付近に生育
する場合には、２つの突然変異のうちの１つにつ
いての復帰株はかなり存在するので復帰株が増殖
する可能性は１つの突然変異を持つ温度感受性株
の場合と同じになる。このような温度は半許容的
であり、復帰株が選択的に異常増殖する条件を与
える。 多重突然変異は細菌性のワクチン用の菌株には
利用されていないけれども、カーテイス
（Curtiss）は遺伝子のクローニングのために、表
現型の異なる多重突然変異によつて弱毒化された
大腸菌の突然変異株をつくつた（Ann.Rev.
Microbiol.30：507、1976）。この研究の重要な考
えは、実験室内につくられた特殊な環境以外の環
境では生きることができない突然変異株をつくる
ことである。実際、この菌株に導入された少なく
とも１つの突然変異によつて、これらが限られた
特定の環境外で成育しようとすると細胞の自己破
壊が起こる。カーテイスはこの菌株は細菌毒の遺
伝子のクローニングに利用でき、ついで大量に細
菌毒をワクチン用に生産することができることを
示唆している（ibid.510ページ26−28行）。さら
に、1978年７月５日に英国で発行された英国特許
明細書１−516−458には、この微生物、すなわち
大腸菌Ｋ−12X1776に、原核細胞及び真核細胞タ
ンパク質（例えばコレラ毒あるいはインシユリ
ン）、又は有機酸（例えばグルコースの発酵によ
つて生産されるクエン酸あるいは乳酸）を大規模
に生産する際の安全性を確保するために、多くの
突然変異を導入することが記載されている。この
明細書の第４ページには自然な生態学的環境下で
は増殖できない、すなわちコロニーをつくること
ができない微生物の利用について記載されてい
る。しかしながら、この明細書で力点が置かれて
いるのは、異なる表現型を表わす種々の突然変異
を持つ細菌株である。このような菌株をワクチン
として利用することの欠点を以下に述べる。 異なる表現型を表わす２つの突然変異を１つの
菌株に組み入れることは、両方の突然変異が同時
に抑制的である場合にのみ、その復帰頻度を引き
下げることについて効果的である。この議論は温
度感受性、増殖要素、及び毒素に関する突然変異
に関して、これらが単独であれ組み合わされてい
る場合であれ、等しくあてはまる。単一の菌株に
２以上の突然変異を組み入れて復帰頻度を減少さ
せるためには、理想的には突然変異が常に協働す
ることを保証するために、これらの突然変異は同
一表現型を発現するものでなければならない。 発明の開示 それ故にこの発明の目的は生きた、遺伝的に弱
毒化された細菌をその基礎とする安全なワクチン
を提供することである。この発明のもう１つの目
的は２又はそれ以上の突然変異を有する細菌株を
その基礎とするワクチンを提供することである。 さらにこの発明の目的は、増殖抑制温度が同一
である２以上の温度感受性突然変異を含む菌株を
その基礎とする細菌性ワクチンを提供することで
ある。 また、さらにこの発明の目的は、完全な抗原性
を保ち、投与後においてもこれを完全なまま保つ
菌株をその基礎とする細菌性ワクチンを提供する
ことである。 この発明の１つの目的はまた、自然な感染の初
期状態をまねるために、宿主内で少なくとも抑制
されつつ複製できる菌株をその基礎とする細菌性
ワクチンを提供することである。 さらにこの目的は、それ自体がインフルエンザ
菌に対するワクチンとして適わしい細菌株を提供
し、この菌株に適当な莢膜の情報を遺伝的に加え
ることにより、あらゆる抗原型のインフルエンザ
菌に対するワクチンを提供することである。 この発明の１つの目的はまた、２又はそれ以上
の、同一表現型の突然変異を含んだ、遺伝的に弱
毒化されたワクチン用の細菌株を利用することに
よる、感染病に対する接種方法を提供することで
ある。 さらにもう１つのこの発明の目的は、同一表現
型の、２以上の突然変異を含む遺伝的に弱毒化さ
れたワクチン用の細菌株を製造する方法を提供す
ることである。 これらの及び以下により明瞭となるであろう多
のこの発明の目的は、細菌をその免疫原性を保つ
たまま弱毒化する同一表現型の２以上の突然変異
を有する、遺伝的に弱毒化された細菌株から成る
ワクチンを提供することによつて達成される。 この発明の目的はまた、同一表現型の２以上の
突然変異が同一表現型の温度感受性突然変異であ
る細菌性ワクチンを提供することによつて達成さ
れる。 この発明の目的はまた、同一表現型を持つ少な
くとも２つの異なる温度感受性突然変異を有する
遺伝的に弱毒化されたインフルエンザ菌から成
る、髄膜炎やこの微生物によつて引き起こされる
他の病気に対するワクチンを提供することによつ
て達成される。
この発明及びこの発明に付随する多くの利点
が、添付の図面と共に以下の詳細な記載を参照す
ることによつて、より完全に理解できるであろ
う。 第１図はインフルエンザ菌の温度感受性突然変
異株の分離に用いられるプロトコールを示す。 第２図は突然変異を起こしたインフルエンザ菌
の温度感受性突然変異部位の位置づけと特徴づけ
に用いられる一般的方法を示す。 第３図は29℃における多重突然変異A214−
Ａ／３−C2／13o及び野生型001ロの増殖曲線を
示す。 第４図は29℃から34℃への温度変更後の多重突
然変異株Ａ−214−Ａ／３−C2／13o及び野生型
001菌株ロの増殖曲線を示す。 第５図は29℃から36℃への温度変更後の多重突
然変異株A214−Ａ／３−C2／13o及び野生型001
菌株ロの増殖曲線を示す。 第６図はタイトなts変異体（Ｄ／１／８）また
はコーストする変異体（Ｅ／９／９）を鼻腔内投
与することによつて免疫され、野生型緑膿菌を含
有するエアロゾルを吸引したマウスにおける肺ク
リアランスの増加を示すグラフ。 第７図はタイトなts変異体（Ｄ／１／８）また
はコーストする変異体（Ｅ／９／９）を腹腔内投
与することにより免疫されたICRマウスにおける
緑膿菌ELISA IgGの量を示すグラフ。 第８図はts変異体を鼻腔内投与することにより
免疫し、wt親株を含有するエアロゾルを吸引し
たDBA／2Jマウスにおける肺クリアランスの増
加を示すグラフ。 第９図は緑膿菌のts変異体Ｄ／１／８または
Ｅ／９／９を腹腔内投与または鼻腔内投与された
ICRマウスにおけるELISA抗体の誘発を示すグラ
フ。 発明を実施するための最良の態様 ワクチンにとつての必須の性質は、(1)宿主体内
で抗体の生産を誘導すること、(2)病気を引き起こ
さないこと、及び(3)毒的な副作用を持たないこ
と、である。ワクチンにとつて望ましい他の性質
は、(1)他の病気体の担体となる状態を確立できな
いこと、(2)廉価で簡単に製造できること、(3)安定
であること、及び(4)投与が容易であること、であ
る。この発明によるワクチンはこれらのすべての
要件を満たしている。なぜならそれらは、(1)細胞
表面の抗原が野生型の抗原と同じである全細胞を
用いており、したがつて高い免疫原性を有してい
るので、少量の投与で効果的であり、投与に依存
する毒的な副作用を最小限に抑えることができ
る、(2)遺伝的に弱毒化された、宿主に病気を引き
起こすことができない生きた細胞を用いている、
(3)本質的に有毒な病原型の菌が存在しない（有毒
な菌は1021個のワクチン微生物中１個以下）、(4)
標準的な微生物学的、免疫学的方法で培養、保
存、及び投与ができる。 特にこの発明は安全で効果的な生きたワクチン
用菌株の製法について記載している。これは、同
一表現型の複数の弱毒化突然変異を組合わせて、
その他は正常な病原性の菌株と変わらない菌株と
し、このようにして宿主内では無毒な菌株に変え
ることによつて達成される。 生きた、遺伝的に弱毒化されたワクチンの優れて
いる点 分離された抗原成分を利用するよりも、生きた
突然変異株を利用する方が優れている点の１つ
は、後者は少なくとも細胞表面や細胞外の抗原成
分に影響を与えない突然変異を選ぶことによつ
て、宿主体内での適切な抗体生産の誘導に必要な
構造が存在することが保証されている。抗原結合
部位の精密な三次元構造は極めて特異的であり、
抗体による抗原の分子レベルでの認識が必要であ
ることはすでに確められている（カバト
（Kabat）、Structure Concepts in Immunology
and Immunochemistry、Holt、Rinehart and
winston、Inc.、1968第６章）。もし、抗体生産を
誘導するワクチンの三次元分子構造が、感染性の
微生物の三次元分子構造に可能な限り同一でなけ
れば、ワクチンによつて誘導された抗体は、感染
性の病原菌に対してうまく働かない。言い換える
と、これらの抗体の、正常な抗原に対する親和性
は低い。もしワクチンの抗原が病原菌の抗原と同
一であるならば、ワクチンに対して生産された抗
体の親和性は病原菌の抗原に対しても同様に高
い。 この発明によるワクチンにはまた、全細胞に本
来備わつているアジユバンド性を保持していると
いう特に優れた点がある。ある抗原（例えば多糖
類）の免疫原性が他の細胞性成分によつて高めら
れることは多くの文献に記載されている。この発
明はこの性質を最大限に利用している。 さらにこの発明の特に優れた点は、適当な弱毒
化突然変異を有する菌株からつくられたワクチン
は宿主体内でいくらか増殖でき、自然な感染をま
ねることができるということである。 この発明の特徴 この発明において最も重要な要素は、微生物が
同一表現型の多重突然変異を有するということで
ある。このことは、突然変異株が有毒な野生型に
復帰することを防ぐ。このことはまた、遺伝的に
弱毒化された細菌性ワクチンの分野において長年
必要とされてきた解決策を提供する。ウイルスや
細菌の突然変異株の遺伝的な不安定さは、遺伝的
に弱毒化された菌株がワクチンとして広範に利用
されることにとつて重大な障害であつた。この発
明はこの障害を完全に取り除き、突然変異のワク
チンとしての広範な利用への扉を開いた。この発
明は突然変異株の復帰の問題を、これらの復帰頻
度を無視できる程度（＜10-20）まで引き下げる
ことによつて克服した。これは同一表現型を発現
する、複数の独立した突然変異を単一の菌株を組
み入れることによつて達成される。用いられる２
以上の独立した突然変異が、菌株を宿主体内にお
いて病気を引き起こすことができないように変え
てしまう。同一表現型の複数の突然変異を含む菌
株の復帰率は個々の突然変異の復帰率の積であ
る。もしそれぞれの復帰率が約10-7である突然変
異が３つ組み合わされた場合には、その菌株の復
帰率は10-21となる。このことは、もし現在及び
将来地球上に存するすべての男女及び子供に100
万個の微生物を有するワクチンを接種するとすれ
ば、1000年間（1015人）にわずか１人が有毒な復
帰株にさらされることになる。 弱毒化突然変異の選択 この発明による復帰の問題の解決における重要
な局面は、すべての突然変異が、宿主の正常な生
理的環境下では正常に戻ることができないよう
に、菌の機能に影響を与えるということである。
このような突然変異株には、潜在的に、次のよう
なものが含まれる。(1)宿主体内では毒素をつくら
ないもの。(2)宿主体内では通常存在しない物質が
なければ増殖できないもの。(3)宿主の体温下では
持続的に増殖できないもの。 第１番目のグループ、すなわち、宿主内で毒素
をつくらないもの、はどのような環境下でも、又
は宿主の生理的環境下では機能的な毒素をつくる
ことができない突然変異株であると定義できる。
このような突然変異株には、例えば、毒性はない
が免疫原性のある毒素断片のみを生産するもの、
宿主の体温下では毒をつくらないもの、あらゆる
環境下で毒をつくることができないもの等が含ま
れる。このような突然変異株にはまた、組織侵入
に必要な要素をつくることができない菌株も含ま
れるであろう。このような突然変異株にはまた、
動物細胞に接着するために必要なピリ繊毛（コロ
ニー化要素）をつくることができない菌株も含ま
れるであろう。ただし、このようなワクチン用菌
株はそれによつて重要な抗原を失い、必要な抗体
生産を誘導することができなくなる場合があるこ
とに留意しなければならない。 第２番目のグループは２つのクラスに分けるこ
とができる。１つは原核生物に固有な中間代謝物
を合成することができない突然変異株である。１
つの例としてジアミノピメリン酸がある。この化
合物は真核生物中には見出されないが、多くの細
菌では細胞壁の生合成には必須の中間体である。
ジアミノピメリン酸の存在しない環境下ではこの
ような菌株は細胞増殖の結果溶解されてしまう。
もう１つは、代謝はされないが増殖に必須なある
化合物を必要とする突然変異株である。ストレプ
トマイシンを必要とする突然変異株はこのクラス
に入る。 第３番目のグループは、宿主の体温下では持続
的に増殖することができない異常性を有する温度
感受性突然変異株である。この異常性が転写や翻
訳や転移などの必須の機能に直接影響を与えてい
る場合には、温度以外のどのような環境要素によ
つても正常に増殖することはできない。それ故
に、必須の機能に影響を与えている温度感受性突
然変異は、増殖要素に依存する突然変異（第２番
目のグループ）に比べてきわだつて優れた点を有
する。なぜなら宿主のフロラ又は宿主に投与され
る他の医薬などによつて、微生物に固有な代謝物
が供給される可能性が常に存在するからである。 具体的には、温度感受性突然変異は次の４つの
クラスに分けることができる。(1)非許容的な温度
下に移されると直ちに増殖が止まるもの。(2)非許
容的な温度では増殖速度が制限されるもの。(3)増
殖し溶解するもの。(4)抑制的な温度下では直ちに
増殖をやめることはないが、いくつもの細胞分裂
の後に増殖が止まるもの。第１番目のクラスの菌
株では、個々の被接種者体内での微生物の数を精
密にコントロールできるけれども、接種の直後に
増殖が止まるのでワクチンの免疫原性が危うくな
る。なぜなら病気感染の初期の過程がまねられな
いからである。温度感受性突然変異の第２番目の
クラスは、抑制的な温度下でゆつくりと増殖する
ことができるものであり、長期間微生物の抗原に
さらすことができるが、このような菌株は無限に
自己を複製していくことができ、被接種者が有毒
な復帰株にさらされる可能性を排除することがで
きない。温度感受性突然変異の第３番目のクラス
は抑制的な温度下ではやがて溶解されるものであ
るが、宿主内での免疫的な反応が始まる前にワク
チン微生物がいなくなつてしまう場合がある。温
度感受性突然変異の第４番目のクラスは、抑制的
な温度下に移されても初めは「正常」に自身を複
製するが、被接種者体内での持続的な複製は完全
に止められるというものであり、これは接種に際
し正常な感染の過程を開始することはできるが病
気を引き起こすことはできないワクチン用菌株を
生産することに利用できる。 ここで述べられている方法で最も本質的な特徴
は、１つの菌株に与えられたすべての突然変異が
同一表現型を発現するということである。この特
徴は組合わされたすべての突然変異が共働するこ
とを保証する重要なものである。これによつて、
効果的な復帰頻度が、個々の突然変異の復帰頻度
の積として常に保証されている。この点をさらに
念入りに説明すると、この発明の細菌性ワクチン
は、多重（すなわち２以上の）突然変異を有して
おり、これらは互いに独立しており、しかも同一
の表現型を発現するということである。このよう
に、例えばこの発明の一態様において細菌が37℃
以上で増殖できない２つの温度感受性突然変異、
ts1及びts2を有しているとする。この得られた微
生物は37℃以上では増殖することができない。特
定の理論によつて裏付けられているわけではない
が、発明者はこの異なる２つの突然変異は増殖に
必須な２つの異なるタンパク質、すなわちタンパ
ク質１及びタンパク質２に影響を与えているもの
と考える。多重突然変異株では37℃又はそれ以上
の温度下では両方のタンパク質とも機能的でない
が、37℃より低い温度下では両方とも機能的であ
る。もしts1突然変異が自然に復帰したとすると、
生産されるタンパク質１は37℃において機能的な
ものになる。しかしながらts2が復帰していない
のでタンパク質２は37℃において依然非機能的で
あるので、この復帰株の増殖及び複製は37℃にお
いて依然抑制されたままである。ts1及びts2の両
方が復帰しない限り細胞は機能的なタンパク質１
及び２をつくることができず、37℃で増殖する能
力を再取得することはできない。同じモデルが抗
生物質異存性突然変異やその他の突然変異にも適
用できる。この要件（同一の表現型）を満たすこ
とは実際に困難な場合がある。例えばストレプト
マイシン要求性の多重突然変異において、すべて
の突然変異が同一の遺伝子に載つている場合等で
ある。このような菌株は、つくることが技術的に
困難なだけでなく、細胞内での遺伝的に組み換え
に際して小さなDNAが断片が組入れられること
によつてすべてのこれらの突然変異による異常性
が排除されてしまう。温度感受性突然変異は、複
製の突然変異が遺伝物質全体に散らばつているの
でこのような制限はない。それ故に、異常性が正
常化される確率は、個々の突然変異が細胞内で遺
伝的に正常化される確率によつて抑えられてい
る。広範に散らばつた突然変異についてこのこと
（細胞内での遺伝的組換え）が生ずる確率は問題
とするに足らない程低い（カーテイスAnn.Rev.
Microbiol.30：507、1976）。 突然変異株の分離 弱毒化突然変異を有する菌株は自然に突然変異
を起こしたものでもよいし、突然変異誘発処理を
行つたものでもよい。突然変異誘発処理は生物全
体に対して行つても良いし、関連する遺伝情報を
含んだDNAに対して行つてもよい。（ただし、引
き続きそのDNAが生物に組入れられる場合に限
る）。その突然変異が選択可能な表現型を与える
場合には、その突然変異株から複製された菌株は
標準的な遺伝学的方法で分離できる。突然変異が
特殊な技術によらなければ検出できない表現型を
与える場合には、それらの技術を採用することに
よつて同定できる（例えば、マース（Mass）ら、
Proc.Nat.Acad.Sci.75：1384、1978を参照）。複
製が温度感受性である突然変異株の分離について
の詳細な説明は次のセクシヨンにおいて示す。 多重突然変異株の製造 この発明の重要な特徴は、単一のワクチン用菌
株に組合わされた多重突然変異が同一の表現型を
発現するということである。それぞれの突然変異
が同一の表現型を発現するので多重突然変異株を
直接選び出すことはできない。なぜなら単突然変
異株と多重突然変異株とを識別する簡単な方法が
存在しないからである。我々は、単一の弱毒化突
然変異を有する突然変異株を分離し、それからこ
れらの突然変異を単一の菌株に伝達する（遺伝的
伝達及び組換えによつて）ことによつてこの問題
を解決した。望ましい弱毒化突然変異を組入れた
菌株の検出を容易にするため、用いられるそれぞ
れの弱毒化突然変異は一般に容易に選出、記録で
きる非弱毒化対立遺伝子と連鎖している。菌株作
製において、連鎖した標識が選び出され、次に、
同時に組入れられた望ましい弱毒化突然変異がそ
の選び出された組換え体について調べられる。こ
のような菌株作製に利用される表現型には次の２
つの種類がある。(1)栄養要求−アミノ酸又は他の
栄養素の厳しい要求、及び(2)染色体的耐性−特定
の薬剤等（例えば抗生物質、コリシン、バクテリ
オフアージ等）に耐性な突然変異。 上記２つの表現型を発現する突然変異体は簡単
な方法で分離でき、確実に遺伝的選別に用いるこ
とができる（例えば、原栄養要求−特定の栄養素
要求が「治癒」されたこと、又は耐性−殺菌性物
質の存在下で増殖することができること）。弱毒
化された突然変異株は栄養要求株又は野生株から
分離される。適当な選別可能な標識がマツピイン
グ操作の一部として導入される。選別可能な標識
と連鎖した弱毒化突然変異を含む菌株はさらに、
必要な菌株作製に用いられる。潜在的に弱毒化突
然変異を組入れた組換え体は、先ず連鎖した選別
可能な標識を選別することによつて同定される。
うまく付随伝達された弱毒化突然変異は組換え体
の突然変異の再分離によつて確認される（この操
作に関する詳細な説明は次のセクシヨンにおいて
行う）。 遺伝的伝達及び組換えの機構 この発明のワクチン製造に利用できる、１つの
細菌細胞から別の細菌細胞に遺伝子（DNA）を
伝達するための認められた機構には次の４つがあ
る。(1)形質転換−細胞「Ａ」から裸のDNAが細
胞「Ｂ」によつて捕獲され、細胞「Ｂ」の染色体
の中に組込まれる（アレキサンダー（Alexande）
とレイデイ（Leidy）J.Ex.Med.97：17（1953））。
(2)形質導入−細胞ＡのDNAを含むウイルス粒子
が細胞「Ｂ」に付き、そのDNAを細胞「Ｂ」内
に「注入」し、そのDNAが細胞「Ｂ」の染色体
に組込まれる（レノツクス）（Lennox）、
Virology1：190、1955）。(3)接合−細胞「Ａ」と
細胞「Ｂ」が接着し、細胞ＡのDNAが細胞「Ｂ」
にランダムに渡され、細胞「Ｂ」の染色体に組込
まれる（ウオールマン（Wollman）らCold
Spring Harbor Symp.Quant.Biol.21：113、
1964）。(4)融合−細胞「Ａ」と細胞「Ｂ」が化学
的に処理され、これら２細胞の融合が起こり、組
換えが起こる前に細胞「Ａ」及び細胞「Ｂ」の
DNAが一時的に同一の細胞に存在する（フオー
ダー（Fodor）とアルフオデイ（Aufodi）、Proc.
Natl.Acad.Sci.73：2147、1976）。細胞外での遺
伝情報の組換えは、DNAを分離し、酵素切断に
よつて細胞「Ａ」のDNAを細胞「Ｂ」のDNAに
挿入し、それからそのハイブリツドDNAによつ
て形質転換が行われることによつて成し遂げるこ
とができる。これらのどの機構でも細菌同志の間
で遺伝子を移動させることができる。 この発明の細菌性ワクチンを製造する他の方法
には、特定のDNA分子の細胞外での突然変異生
成（バウツーフリーゼ（Bautz−Freese）とフリ
ーゼ（Freese）Virology13：19、1961）、新たな
遺伝子合成（コラナ（Khorana）、Science203：
614、1979）、及びDNA組換え技術による突然変
異遺伝子の作製がある。これらの方法はまだ未発
達ではあるが、DNAレベルでの２以上のはつき
りした塩基置換を持つ遺伝子を選択的、特異的に
作製できる可能性を予想できる。このようにはつ
きり特徴づけられる遺伝子は細菌の染色体に組込
まれ、その結果はつきり特徴づけられる突然変異
体をつくることができる。もし２以上の塩基置換
が同一の表現型を発現する２以上の異なる突然変
異を引き起こすように選ばれたなら、その得られ
た細菌はこの発明の範囲に入る。 マスター菌株の優れた点 この発明の１つの大きな優れた点は、この方法
が、同一表現型の多重突然変異を例えば肺炎双球
菌の「ラフ」変異株に導入し、次にそれぞれの臨
床的に意義のある抗原型（少なくとも14種ある）
の莢膜遺伝子によつて「マスター」菌株を形質転
換し、それぞれのワクチン用菌株をつくることに
適用できるということである。事実、この発明に
よる多重突然変異株はインフルエンザ菌の「ラ
フ」変異株であり、この菌株はそれ自身がこのよ
うな「抗原型に分類できない」インフルエンザ菌
による感染（例えば、幼ない子供の中耳カタルは
ほとんどインフルエンザ菌のラフ変異株によつて
引き起こされる。）から守るためのワクチンとし
て使用できるだけでなく、ｂ抗原型の莢膜遺伝子
による形質転換によつて、インフルエンザ菌性髄
膜炎に対するワクチンとしてふさわしいものに変
えることができる。 貯 蔵 この発明の優れた点の１つは、ワクチンが簡単
に製造でき、ガラスびん中で不活性で無毒な適当
な担体（後述）の存在下で凍結乾燥でき、その能
力を失うことなく室温で貯蔵できるということで
ある。冷蔵や他の特殊な貯蔵装置を必要としな
い。 品質管理 ワクチンの組成は知られなければならず、終始
一貫していなくてはならない。このことは、製造
に当つて、品質管理された特定量の化学的及び生
物学的成分を用いることによつて達成される。化
学物質の品質管理の方法はこの分野において確立
されており、ここでは述べない。ワクチンの化学
的純粋さは、毒性老廃物又は細胞破砕物、並びに
妨害性及び類似の免疫原性物質がないことである
と定義できる。この純粋さは純粋培養（他の細胞
やウイルスがワクチン用菌株中に存在しない）を
用い及び培養細胞を増殖の対数期（自己消化酵素
の合成前）に回収することによつて保証される。
物理的方法（遠心）による培地からの回収及び洗
浄によつて、低分子の不純物は上清に残される。 この発明にはワクチンの生物的物質の品質管理
に関して優れた点がある。ワクチンの一般的な生
物学的純度（混入ウイルスや細菌が存在しないこ
と）の監視には標準的な方法が使用できる。保た
れなければならないもう１つの生物学的純粋さ、
すなわち遺伝的な純粋さに関してこの発明は特に
優れている。遺伝的に弱毒化されたワクチン用菌
株の培養増殖における遺伝的純粋さの保持にとつ
て最も重要な要素は、弱毒化突然変異の選択であ
る。ワクチンの保持、パイロツト規模又は大規模
生産に用いられるあらゆる条件下において、この
ような突然変異はその増殖速度を制限するもので
あつてはならない。このことは、復帰株が現われ
たとしてもそれらはワクチン用菌株に比べて増殖
に関して選択的な優位性を持たず、従つて許容条
件下でのワクチン用菌株のあらゆる培養期におい
てもそれらが異常増殖（その結果ワクチン用菌株
が復帰株に置き換わる）しないことを保証する。
復帰株の出現は、培養細胞の１部を非許容的条件
下でプレート培養することによつて監視できる。
ワクチン用菌株に組込まれた弱毒化突然変異の存
続は、ワクチンから取られたサンプルの細胞の突
然変異を利用してチエツクすることができる。 投 与 この発明によるワクチンは、病原性の微生物の
感染に対し感受性である、あらゆる温血及び冷血
動物に投与できる。ヒト及びヒト以外の動物が宿
主として恩恵を受けることができる。 投与は非経口的に行つても良いが、好ましくは
自然の感染ルートに依存して経口又は鼻腔内投与
を行うのが良い。例えば家畜では、ワクチンをえ
さや飲用水の中に混ぜて投与することができる。
投与量は被接種者の年令、健康状態、体重や、も
しあれば同時に行われる処理（他の施薬等）の種
類、及び微生物の性質等に依存する。一般的に、
活性な成分の投与量は宿主当り１回の投与での細
胞数が約10個ないし約1010個である。鼻腔内投与
において好ましい投与量は一般的に約106個の微
生物であり、0.05mlないし0.1mlの免疫学的に不
活性な担体に懸濁して行われる。この発明で記載
された方法によつてつくられたワクチン用菌株、
例えばチフス菌の経口投与では、たぶん106個な
いし108個の微生物が必要であり、１mlないし２
mlの例えばスキムミルクに懸濁して行われる。ワ
クチンは、経口投与のためにはカプセル、溶液、
懸濁液、又はエリキシル等の形態をとり得るし、
非経口的、鼻腔内、又は局所的（例えば、外傷や
やけど）な投与のためには、溶液や懸濁液をつく
るための純粋溶液の形態をとることができる。不
活性な免疫学的に採用することができる、塩水や
リン酸バツフアー塩化ナトリウム溶液やスキムミ
ルク等のような担体が好ましく利用される。 適 用 感染性の病気を引き起こすことができるあらゆ
る微生物はこの発明の方法によつて弱毒化され、
有用で安全なワクチンにすることができる。これ
らのうち、細菌、ウイルス、寄生虫は最も一般的
な微生物である。この発明は特に細菌の突然変異
に関している。なぜなら、望む（組換え）突然変
異株をつくることが容易であるからである。第１
表には一般的な細菌性感染病及びそれを引き起こ
す微生物が掲載されている。適用は第１表に掲載
されたものに限られることはなく、第１表は単に
多くの細菌のうちこの発明が利用できるものを例
示しているにすぎない。宿主はヒト及びすべての
ヒト以外の動物である。 一般的にこの発明を記載してきたが、より完全
な理解のためにある特定の実施例を述べる。これ
は単なる例示であつて他に明示ない限り、これに
限られるものではない。
が、添付の図面と共に以下の詳細な記載を参照す
ることによつて、より完全に理解できるであろ
う。 第１図はインフルエンザ菌の温度感受性突然変
異株の分離に用いられるプロトコールを示す。 第２図は突然変異を起こしたインフルエンザ菌
の温度感受性突然変異部位の位置づけと特徴づけ
に用いられる一般的方法を示す。 第３図は29℃における多重突然変異A214−
Ａ／３−C2／13o及び野生型001ロの増殖曲線を
示す。 第４図は29℃から34℃への温度変更後の多重突
然変異株Ａ−214−Ａ／３−C2／13o及び野生型
001菌株ロの増殖曲線を示す。 第５図は29℃から36℃への温度変更後の多重突
然変異株A214−Ａ／３−C2／13o及び野生型001
菌株ロの増殖曲線を示す。 第６図はタイトなts変異体（Ｄ／１／８）また
はコーストする変異体（Ｅ／９／９）を鼻腔内投
与することによつて免疫され、野生型緑膿菌を含
有するエアロゾルを吸引したマウスにおける肺ク
リアランスの増加を示すグラフ。 第７図はタイトなts変異体（Ｄ／１／８）また
はコーストする変異体（Ｅ／９／９）を腹腔内投
与することにより免疫されたICRマウスにおける
緑膿菌ELISA IgGの量を示すグラフ。 第８図はts変異体を鼻腔内投与することにより
免疫し、wt親株を含有するエアロゾルを吸引し
たDBA／2Jマウスにおける肺クリアランスの増
加を示すグラフ。 第９図は緑膿菌のts変異体Ｄ／１／８または
Ｅ／９／９を腹腔内投与または鼻腔内投与された
ICRマウスにおけるELISA抗体の誘発を示すグラ
フ。 発明を実施するための最良の態様 ワクチンにとつての必須の性質は、(1)宿主体内
で抗体の生産を誘導すること、(2)病気を引き起こ
さないこと、及び(3)毒的な副作用を持たないこ
と、である。ワクチンにとつて望ましい他の性質
は、(1)他の病気体の担体となる状態を確立できな
いこと、(2)廉価で簡単に製造できること、(3)安定
であること、及び(4)投与が容易であること、であ
る。この発明によるワクチンはこれらのすべての
要件を満たしている。なぜならそれらは、(1)細胞
表面の抗原が野生型の抗原と同じである全細胞を
用いており、したがつて高い免疫原性を有してい
るので、少量の投与で効果的であり、投与に依存
する毒的な副作用を最小限に抑えることができ
る、(2)遺伝的に弱毒化された、宿主に病気を引き
起こすことができない生きた細胞を用いている、
(3)本質的に有毒な病原型の菌が存在しない（有毒
な菌は1021個のワクチン微生物中１個以下）、(4)
標準的な微生物学的、免疫学的方法で培養、保
存、及び投与ができる。 特にこの発明は安全で効果的な生きたワクチン
用菌株の製法について記載している。これは、同
一表現型の複数の弱毒化突然変異を組合わせて、
その他は正常な病原性の菌株と変わらない菌株と
し、このようにして宿主内では無毒な菌株に変え
ることによつて達成される。 生きた、遺伝的に弱毒化されたワクチンの優れて
いる点 分離された抗原成分を利用するよりも、生きた
突然変異株を利用する方が優れている点の１つ
は、後者は少なくとも細胞表面や細胞外の抗原成
分に影響を与えない突然変異を選ぶことによつ
て、宿主体内での適切な抗体生産の誘導に必要な
構造が存在することが保証されている。抗原結合
部位の精密な三次元構造は極めて特異的であり、
抗体による抗原の分子レベルでの認識が必要であ
ることはすでに確められている（カバト
（Kabat）、Structure Concepts in Immunology
and Immunochemistry、Holt、Rinehart and
winston、Inc.、1968第６章）。もし、抗体生産を
誘導するワクチンの三次元分子構造が、感染性の
微生物の三次元分子構造に可能な限り同一でなけ
れば、ワクチンによつて誘導された抗体は、感染
性の病原菌に対してうまく働かない。言い換える
と、これらの抗体の、正常な抗原に対する親和性
は低い。もしワクチンの抗原が病原菌の抗原と同
一であるならば、ワクチンに対して生産された抗
体の親和性は病原菌の抗原に対しても同様に高
い。 この発明によるワクチンにはまた、全細胞に本
来備わつているアジユバンド性を保持していると
いう特に優れた点がある。ある抗原（例えば多糖
類）の免疫原性が他の細胞性成分によつて高めら
れることは多くの文献に記載されている。この発
明はこの性質を最大限に利用している。 さらにこの発明の特に優れた点は、適当な弱毒
化突然変異を有する菌株からつくられたワクチン
は宿主体内でいくらか増殖でき、自然な感染をま
ねることができるということである。 この発明の特徴 この発明において最も重要な要素は、微生物が
同一表現型の多重突然変異を有するということで
ある。このことは、突然変異株が有毒な野生型に
復帰することを防ぐ。このことはまた、遺伝的に
弱毒化された細菌性ワクチンの分野において長年
必要とされてきた解決策を提供する。ウイルスや
細菌の突然変異株の遺伝的な不安定さは、遺伝的
に弱毒化された菌株がワクチンとして広範に利用
されることにとつて重大な障害であつた。この発
明はこの障害を完全に取り除き、突然変異のワク
チンとしての広範な利用への扉を開いた。この発
明は突然変異株の復帰の問題を、これらの復帰頻
度を無視できる程度（＜10-20）まで引き下げる
ことによつて克服した。これは同一表現型を発現
する、複数の独立した突然変異を単一の菌株を組
み入れることによつて達成される。用いられる２
以上の独立した突然変異が、菌株を宿主体内にお
いて病気を引き起こすことができないように変え
てしまう。同一表現型の複数の突然変異を含む菌
株の復帰率は個々の突然変異の復帰率の積であ
る。もしそれぞれの復帰率が約10-7である突然変
異が３つ組み合わされた場合には、その菌株の復
帰率は10-21となる。このことは、もし現在及び
将来地球上に存するすべての男女及び子供に100
万個の微生物を有するワクチンを接種するとすれ
ば、1000年間（1015人）にわずか１人が有毒な復
帰株にさらされることになる。 弱毒化突然変異の選択 この発明による復帰の問題の解決における重要
な局面は、すべての突然変異が、宿主の正常な生
理的環境下では正常に戻ることができないよう
に、菌の機能に影響を与えるということである。
このような突然変異株には、潜在的に、次のよう
なものが含まれる。(1)宿主体内では毒素をつくら
ないもの。(2)宿主体内では通常存在しない物質が
なければ増殖できないもの。(3)宿主の体温下では
持続的に増殖できないもの。 第１番目のグループ、すなわち、宿主内で毒素
をつくらないもの、はどのような環境下でも、又
は宿主の生理的環境下では機能的な毒素をつくる
ことができない突然変異株であると定義できる。
このような突然変異株には、例えば、毒性はない
が免疫原性のある毒素断片のみを生産するもの、
宿主の体温下では毒をつくらないもの、あらゆる
環境下で毒をつくることができないもの等が含ま
れる。このような突然変異株にはまた、組織侵入
に必要な要素をつくることができない菌株も含ま
れるであろう。このような突然変異株にはまた、
動物細胞に接着するために必要なピリ繊毛（コロ
ニー化要素）をつくることができない菌株も含ま
れるであろう。ただし、このようなワクチン用菌
株はそれによつて重要な抗原を失い、必要な抗体
生産を誘導することができなくなる場合があるこ
とに留意しなければならない。 第２番目のグループは２つのクラスに分けるこ
とができる。１つは原核生物に固有な中間代謝物
を合成することができない突然変異株である。１
つの例としてジアミノピメリン酸がある。この化
合物は真核生物中には見出されないが、多くの細
菌では細胞壁の生合成には必須の中間体である。
ジアミノピメリン酸の存在しない環境下ではこの
ような菌株は細胞増殖の結果溶解されてしまう。
もう１つは、代謝はされないが増殖に必須なある
化合物を必要とする突然変異株である。ストレプ
トマイシンを必要とする突然変異株はこのクラス
に入る。 第３番目のグループは、宿主の体温下では持続
的に増殖することができない異常性を有する温度
感受性突然変異株である。この異常性が転写や翻
訳や転移などの必須の機能に直接影響を与えてい
る場合には、温度以外のどのような環境要素によ
つても正常に増殖することはできない。それ故
に、必須の機能に影響を与えている温度感受性突
然変異は、増殖要素に依存する突然変異（第２番
目のグループ）に比べてきわだつて優れた点を有
する。なぜなら宿主のフロラ又は宿主に投与され
る他の医薬などによつて、微生物に固有な代謝物
が供給される可能性が常に存在するからである。 具体的には、温度感受性突然変異は次の４つの
クラスに分けることができる。(1)非許容的な温度
下に移されると直ちに増殖が止まるもの。(2)非許
容的な温度では増殖速度が制限されるもの。(3)増
殖し溶解するもの。(4)抑制的な温度下では直ちに
増殖をやめることはないが、いくつもの細胞分裂
の後に増殖が止まるもの。第１番目のクラスの菌
株では、個々の被接種者体内での微生物の数を精
密にコントロールできるけれども、接種の直後に
増殖が止まるのでワクチンの免疫原性が危うくな
る。なぜなら病気感染の初期の過程がまねられな
いからである。温度感受性突然変異の第２番目の
クラスは、抑制的な温度下でゆつくりと増殖する
ことができるものであり、長期間微生物の抗原に
さらすことができるが、このような菌株は無限に
自己を複製していくことができ、被接種者が有毒
な復帰株にさらされる可能性を排除することがで
きない。温度感受性突然変異の第３番目のクラス
は抑制的な温度下ではやがて溶解されるものであ
るが、宿主内での免疫的な反応が始まる前にワク
チン微生物がいなくなつてしまう場合がある。温
度感受性突然変異の第４番目のクラスは、抑制的
な温度下に移されても初めは「正常」に自身を複
製するが、被接種者体内での持続的な複製は完全
に止められるというものであり、これは接種に際
し正常な感染の過程を開始することはできるが病
気を引き起こすことはできないワクチン用菌株を
生産することに利用できる。 ここで述べられている方法で最も本質的な特徴
は、１つの菌株に与えられたすべての突然変異が
同一表現型を発現するということである。この特
徴は組合わされたすべての突然変異が共働するこ
とを保証する重要なものである。これによつて、
効果的な復帰頻度が、個々の突然変異の復帰頻度
の積として常に保証されている。この点をさらに
念入りに説明すると、この発明の細菌性ワクチン
は、多重（すなわち２以上の）突然変異を有して
おり、これらは互いに独立しており、しかも同一
の表現型を発現するということである。このよう
に、例えばこの発明の一態様において細菌が37℃
以上で増殖できない２つの温度感受性突然変異、
ts1及びts2を有しているとする。この得られた微
生物は37℃以上では増殖することができない。特
定の理論によつて裏付けられているわけではない
が、発明者はこの異なる２つの突然変異は増殖に
必須な２つの異なるタンパク質、すなわちタンパ
ク質１及びタンパク質２に影響を与えているもの
と考える。多重突然変異株では37℃又はそれ以上
の温度下では両方のタンパク質とも機能的でない
が、37℃より低い温度下では両方とも機能的であ
る。もしts1突然変異が自然に復帰したとすると、
生産されるタンパク質１は37℃において機能的な
ものになる。しかしながらts2が復帰していない
のでタンパク質２は37℃において依然非機能的で
あるので、この復帰株の増殖及び複製は37℃にお
いて依然抑制されたままである。ts1及びts2の両
方が復帰しない限り細胞は機能的なタンパク質１
及び２をつくることができず、37℃で増殖する能
力を再取得することはできない。同じモデルが抗
生物質異存性突然変異やその他の突然変異にも適
用できる。この要件（同一の表現型）を満たすこ
とは実際に困難な場合がある。例えばストレプト
マイシン要求性の多重突然変異において、すべて
の突然変異が同一の遺伝子に載つている場合等で
ある。このような菌株は、つくることが技術的に
困難なだけでなく、細胞内での遺伝的に組み換え
に際して小さなDNAが断片が組入れられること
によつてすべてのこれらの突然変異による異常性
が排除されてしまう。温度感受性突然変異は、複
製の突然変異が遺伝物質全体に散らばつているの
でこのような制限はない。それ故に、異常性が正
常化される確率は、個々の突然変異が細胞内で遺
伝的に正常化される確率によつて抑えられてい
る。広範に散らばつた突然変異についてこのこと
（細胞内での遺伝的組換え）が生ずる確率は問題
とするに足らない程低い（カーテイスAnn.Rev.
Microbiol.30：507、1976）。 突然変異株の分離 弱毒化突然変異を有する菌株は自然に突然変異
を起こしたものでもよいし、突然変異誘発処理を
行つたものでもよい。突然変異誘発処理は生物全
体に対して行つても良いし、関連する遺伝情報を
含んだDNAに対して行つてもよい。（ただし、引
き続きそのDNAが生物に組入れられる場合に限
る）。その突然変異が選択可能な表現型を与える
場合には、その突然変異株から複製された菌株は
標準的な遺伝学的方法で分離できる。突然変異が
特殊な技術によらなければ検出できない表現型を
与える場合には、それらの技術を採用することに
よつて同定できる（例えば、マース（Mass）ら、
Proc.Nat.Acad.Sci.75：1384、1978を参照）。複
製が温度感受性である突然変異株の分離について
の詳細な説明は次のセクシヨンにおいて示す。 多重突然変異株の製造 この発明の重要な特徴は、単一のワクチン用菌
株に組合わされた多重突然変異が同一の表現型を
発現するということである。それぞれの突然変異
が同一の表現型を発現するので多重突然変異株を
直接選び出すことはできない。なぜなら単突然変
異株と多重突然変異株とを識別する簡単な方法が
存在しないからである。我々は、単一の弱毒化突
然変異を有する突然変異株を分離し、それからこ
れらの突然変異を単一の菌株に伝達する（遺伝的
伝達及び組換えによつて）ことによつてこの問題
を解決した。望ましい弱毒化突然変異を組入れた
菌株の検出を容易にするため、用いられるそれぞ
れの弱毒化突然変異は一般に容易に選出、記録で
きる非弱毒化対立遺伝子と連鎖している。菌株作
製において、連鎖した標識が選び出され、次に、
同時に組入れられた望ましい弱毒化突然変異がそ
の選び出された組換え体について調べられる。こ
のような菌株作製に利用される表現型には次の２
つの種類がある。(1)栄養要求−アミノ酸又は他の
栄養素の厳しい要求、及び(2)染色体的耐性−特定
の薬剤等（例えば抗生物質、コリシン、バクテリ
オフアージ等）に耐性な突然変異。 上記２つの表現型を発現する突然変異体は簡単
な方法で分離でき、確実に遺伝的選別に用いるこ
とができる（例えば、原栄養要求−特定の栄養素
要求が「治癒」されたこと、又は耐性−殺菌性物
質の存在下で増殖することができること）。弱毒
化された突然変異株は栄養要求株又は野生株から
分離される。適当な選別可能な標識がマツピイン
グ操作の一部として導入される。選別可能な標識
と連鎖した弱毒化突然変異を含む菌株はさらに、
必要な菌株作製に用いられる。潜在的に弱毒化突
然変異を組入れた組換え体は、先ず連鎖した選別
可能な標識を選別することによつて同定される。
うまく付随伝達された弱毒化突然変異は組換え体
の突然変異の再分離によつて確認される（この操
作に関する詳細な説明は次のセクシヨンにおいて
行う）。 遺伝的伝達及び組換えの機構 この発明のワクチン製造に利用できる、１つの
細菌細胞から別の細菌細胞に遺伝子（DNA）を
伝達するための認められた機構には次の４つがあ
る。(1)形質転換−細胞「Ａ」から裸のDNAが細
胞「Ｂ」によつて捕獲され、細胞「Ｂ」の染色体
の中に組込まれる（アレキサンダー（Alexande）
とレイデイ（Leidy）J.Ex.Med.97：17（1953））。
(2)形質導入−細胞ＡのDNAを含むウイルス粒子
が細胞「Ｂ」に付き、そのDNAを細胞「Ｂ」内
に「注入」し、そのDNAが細胞「Ｂ」の染色体
に組込まれる（レノツクス）（Lennox）、
Virology1：190、1955）。(3)接合−細胞「Ａ」と
細胞「Ｂ」が接着し、細胞ＡのDNAが細胞「Ｂ」
にランダムに渡され、細胞「Ｂ」の染色体に組込
まれる（ウオールマン（Wollman）らCold
Spring Harbor Symp.Quant.Biol.21：113、
1964）。(4)融合−細胞「Ａ」と細胞「Ｂ」が化学
的に処理され、これら２細胞の融合が起こり、組
換えが起こる前に細胞「Ａ」及び細胞「Ｂ」の
DNAが一時的に同一の細胞に存在する（フオー
ダー（Fodor）とアルフオデイ（Aufodi）、Proc.
Natl.Acad.Sci.73：2147、1976）。細胞外での遺
伝情報の組換えは、DNAを分離し、酵素切断に
よつて細胞「Ａ」のDNAを細胞「Ｂ」のDNAに
挿入し、それからそのハイブリツドDNAによつ
て形質転換が行われることによつて成し遂げるこ
とができる。これらのどの機構でも細菌同志の間
で遺伝子を移動させることができる。 この発明の細菌性ワクチンを製造する他の方法
には、特定のDNA分子の細胞外での突然変異生
成（バウツーフリーゼ（Bautz−Freese）とフリ
ーゼ（Freese）Virology13：19、1961）、新たな
遺伝子合成（コラナ（Khorana）、Science203：
614、1979）、及びDNA組換え技術による突然変
異遺伝子の作製がある。これらの方法はまだ未発
達ではあるが、DNAレベルでの２以上のはつき
りした塩基置換を持つ遺伝子を選択的、特異的に
作製できる可能性を予想できる。このようにはつ
きり特徴づけられる遺伝子は細菌の染色体に組込
まれ、その結果はつきり特徴づけられる突然変異
体をつくることができる。もし２以上の塩基置換
が同一の表現型を発現する２以上の異なる突然変
異を引き起こすように選ばれたなら、その得られ
た細菌はこの発明の範囲に入る。 マスター菌株の優れた点 この発明の１つの大きな優れた点は、この方法
が、同一表現型の多重突然変異を例えば肺炎双球
菌の「ラフ」変異株に導入し、次にそれぞれの臨
床的に意義のある抗原型（少なくとも14種ある）
の莢膜遺伝子によつて「マスター」菌株を形質転
換し、それぞれのワクチン用菌株をつくることに
適用できるということである。事実、この発明に
よる多重突然変異株はインフルエンザ菌の「ラ
フ」変異株であり、この菌株はそれ自身がこのよ
うな「抗原型に分類できない」インフルエンザ菌
による感染（例えば、幼ない子供の中耳カタルは
ほとんどインフルエンザ菌のラフ変異株によつて
引き起こされる。）から守るためのワクチンとし
て使用できるだけでなく、ｂ抗原型の莢膜遺伝子
による形質転換によつて、インフルエンザ菌性髄
膜炎に対するワクチンとしてふさわしいものに変
えることができる。 貯 蔵 この発明の優れた点の１つは、ワクチンが簡単
に製造でき、ガラスびん中で不活性で無毒な適当
な担体（後述）の存在下で凍結乾燥でき、その能
力を失うことなく室温で貯蔵できるということで
ある。冷蔵や他の特殊な貯蔵装置を必要としな
い。 品質管理 ワクチンの組成は知られなければならず、終始
一貫していなくてはならない。このことは、製造
に当つて、品質管理された特定量の化学的及び生
物学的成分を用いることによつて達成される。化
学物質の品質管理の方法はこの分野において確立
されており、ここでは述べない。ワクチンの化学
的純粋さは、毒性老廃物又は細胞破砕物、並びに
妨害性及び類似の免疫原性物質がないことである
と定義できる。この純粋さは純粋培養（他の細胞
やウイルスがワクチン用菌株中に存在しない）を
用い及び培養細胞を増殖の対数期（自己消化酵素
の合成前）に回収することによつて保証される。
物理的方法（遠心）による培地からの回収及び洗
浄によつて、低分子の不純物は上清に残される。 この発明にはワクチンの生物的物質の品質管理
に関して優れた点がある。ワクチンの一般的な生
物学的純度（混入ウイルスや細菌が存在しないこ
と）の監視には標準的な方法が使用できる。保た
れなければならないもう１つの生物学的純粋さ、
すなわち遺伝的な純粋さに関してこの発明は特に
優れている。遺伝的に弱毒化されたワクチン用菌
株の培養増殖における遺伝的純粋さの保持にとつ
て最も重要な要素は、弱毒化突然変異の選択であ
る。ワクチンの保持、パイロツト規模又は大規模
生産に用いられるあらゆる条件下において、この
ような突然変異はその増殖速度を制限するもので
あつてはならない。このことは、復帰株が現われ
たとしてもそれらはワクチン用菌株に比べて増殖
に関して選択的な優位性を持たず、従つて許容条
件下でのワクチン用菌株のあらゆる培養期におい
てもそれらが異常増殖（その結果ワクチン用菌株
が復帰株に置き換わる）しないことを保証する。
復帰株の出現は、培養細胞の１部を非許容的条件
下でプレート培養することによつて監視できる。
ワクチン用菌株に組込まれた弱毒化突然変異の存
続は、ワクチンから取られたサンプルの細胞の突
然変異を利用してチエツクすることができる。 投 与 この発明によるワクチンは、病原性の微生物の
感染に対し感受性である、あらゆる温血及び冷血
動物に投与できる。ヒト及びヒト以外の動物が宿
主として恩恵を受けることができる。 投与は非経口的に行つても良いが、好ましくは
自然の感染ルートに依存して経口又は鼻腔内投与
を行うのが良い。例えば家畜では、ワクチンをえ
さや飲用水の中に混ぜて投与することができる。
投与量は被接種者の年令、健康状態、体重や、も
しあれば同時に行われる処理（他の施薬等）の種
類、及び微生物の性質等に依存する。一般的に、
活性な成分の投与量は宿主当り１回の投与での細
胞数が約10個ないし約1010個である。鼻腔内投与
において好ましい投与量は一般的に約106個の微
生物であり、0.05mlないし0.1mlの免疫学的に不
活性な担体に懸濁して行われる。この発明で記載
された方法によつてつくられたワクチン用菌株、
例えばチフス菌の経口投与では、たぶん106個な
いし108個の微生物が必要であり、１mlないし２
mlの例えばスキムミルクに懸濁して行われる。ワ
クチンは、経口投与のためにはカプセル、溶液、
懸濁液、又はエリキシル等の形態をとり得るし、
非経口的、鼻腔内、又は局所的（例えば、外傷や
やけど）な投与のためには、溶液や懸濁液をつく
るための純粋溶液の形態をとることができる。不
活性な免疫学的に採用することができる、塩水や
リン酸バツフアー塩化ナトリウム溶液やスキムミ
ルク等のような担体が好ましく利用される。 適 用 感染性の病気を引き起こすことができるあらゆ
る微生物はこの発明の方法によつて弱毒化され、
有用で安全なワクチンにすることができる。これ
らのうち、細菌、ウイルス、寄生虫は最も一般的
な微生物である。この発明は特に細菌の突然変異
に関している。なぜなら、望む（組換え）突然変
異株をつくることが容易であるからである。第１
表には一般的な細菌性感染病及びそれを引き起こ
す微生物が掲載されている。適用は第１表に掲載
されたものに限られることはなく、第１表は単に
多くの細菌のうちこの発明が利用できるものを例
示しているにすぎない。宿主はヒト及びすべての
ヒト以外の動物である。 一般的にこの発明を記載してきたが、より完全
な理解のためにある特定の実施例を述べる。これ
は単なる例示であつて他に明示ない限り、これに
限られるものではない。
【表】
インフルエンザ菌に対するワクチンの製造
インフルエンザ菌ｂ型は他方流行性の子供の髄
炎膜の主因であり（ハガーテイ（Haggerty）と
ジアイ（Ziai）、Adv.Ped.13：129、1964；ウエ
ルレ（Wehrle）ら、Pediatrics44：991、1968；
スミス（Smith）とヘイネス（Haynes）．
Pediatrics50：723、1972）、そして子供及び成人
の致命的エピトウロテイテイス（epitlottitis）、
閉鎖性気管支炎、中耳カタル、敗血病性関節炎、
喉頭炎、蜂巣炎及び肺炎の重要な原因である。米
国ではインフルエンザ菌ｂ型による髄膜炎が少な
くとも１年間に10000件発生している。迅速な診
断及びアンピシリンやクロラムフエニコールによ
る治療で通常回復している。しかしながら、死亡
率は５％ないし10％であり、回復した人のかなり
の人（30％ないし50％）は一生神経の損傷によつ
て苦しめられている。 最近インフルエンザ菌ｂ型のプラスミド薬剤耐
性因子が出現し、これが出現した地域では抗生物
質による治療では回復しない危険性がある
（Center for Disease Control、Morbidity and
Mortality Weekly Rep.23：77、1974）。過去の
例から見ても、このようなプラスミドは迅速に世
界中に広まるので、抗生物質によるインフルエン
ザ菌感染病の治療はもうすぐ効果がなくなるであ
ろう。インフルエンザ菌ｂ型が薬剤耐性となり、
その一生続く神経的な後遺症の発生率が高いとい
うことを合わせて考えると、この菌による感染病
を防ぐ新たな方法を開発することが絶対に必要で
ある。 現在利用されているインフルエンザ菌に対する
ワクチンは精製された多糖類であり、これは、こ
の菌に対して最も弱いであろう非常に幼い子供に
対しては効果がない。それ故にインフルエンザ菌
に対する効果的で安全なワクチンが早急に必要で
ある。 この発明に記載された方法によつて、同一表現
型を発現する３つの温度感受性突然変異を有する
インフルエンザ菌の組換え菌が形質転換を利用し
て作製された。 材料及び方法 以下のインフルエンザ菌感染病に対するワクチ
ンの製造に関する記載全体を通じて、次の短縮形
を用いる。 Ａ／ｂ、抗生物質 BHI、脳、心臓混和物 cfu、コロニー形成単位 DMSO、ジメチルスルホキシド DNA、デオキシリボ核酸 En R,S、エリスロマイシン−耐性、−感受性 ｇ、グラム Kn R,S、カナマイシン−耐性、−感受性 、リツトル mg、ミリグラム mlミリリツトル NAD、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド NalR,S、ナリジキシン酸−耐性、−感受性 NbR,S、ノボビオシン−耐性、−感受性 NG、ニトロソグアニジン、Ｎ−メチル−N′−ニ
トロ−Ｎ−ニトロソグアニジン PRP、ポリボフオスフエート RifR,S、リフアマイシン−耐性、−感受性 RR、復帰率 Sn R,S、ストレプトマイシン−耐性、−感受性 ts、温度感受性 μ、ミクロン μｇ、マイクログラム μ、マイクロリツトル Vn R,S、ヴアイオマイシン−耐性、−感受性 細 菌 この実施例ではインフルエンザ菌の基本的な２
種の菌株を用いた。すなわち、ｂ型のラフ変異株
（001菌株）と抗生物質En、Kn、Nb、Sn、Vn及
びNalに耐性な誘導菌株（EKNSVNal菌株）と
である。001菌株（American Type Culture
Collection（ATCC）、菌株No.31517）及び
EKNSVNalは両方ともバージエイの細菌分類表
（第７版、1957）の406−408ページに記載された
インフルエンザ菌の特徴を持つている。すなわ
ち、それらはグラム陰性の桿状体で0.2〜0.3μ×
0.5〜2.0μ大であり、単独でも２個体集まつてで
も生息し、時には短い鎖状になつていることもあ
る。それらは増殖するためにNADとヘミンを必
要とする。EKNSVNalはATCCに寄託してあ
り、番号は31514である。 増殖培地 インフルエンザ菌は20μｇ／mlのヘミン及び
10μｇ／mlのNADを補充したブレイン・ハー
ト・インフユージヨン（BHI）（2.5％ｗ／ｖ）寒
天又はチヨコレート寒天で常法により継代培養し
た。補充BHI培地上に培養菌液が生成した。選
別のためのプレート培養は適当な抗生物質を含ん
だ補充BHI寒天上で行つた。 突然変異生成、濃縮及び分離 インフルエンザ菌（001及びEKNSVNal）のts
突然変異株に分離するためのプロトコールの概略
が第１図に示されている。宿主の免疫機構を反応
させるために、少なくとも一時的には、ワクチン
用菌株が気管支上部でロニーを形成することが必
要なので、２つの型のts突然変異を探した。古典
的な、非許容的温度下に移されると直ちに複製を
停止する突然変異株（以下厳格突然変異株とい
う）は第１図に示された操作によつて常法により
分離した。抑制的な温度下に移されても２、３回
分裂する突然変異株（以下惰性突然変異株とい
う）は抗生物質を遅らせて加えることによつて分
離した。また、増殖抑制温度が32℃ないし36℃の
突然変異株を、濃縮時の温度を変えることによつ
て探した。 突然変異株の一次的特徴づけ 上述の操作によつて分離されたts突然変異株の
増殖抑制温度を決定するために、チヨコレート寒
天プレート上に線条接種し、それぞれのプレート
を27℃、30℃、32℃、34℃及び36℃で培養した。
線条に沿つて増殖するが単一のコロニーを形成す
るに至らない突然変異株を惰性突然変異株とし
た。古典的な厳格突然変異株は増殖抑制温度以上
の温度下ではもちろん全く増殖できない。 １×103ないし２×109個の細胞をチヨコレート
寒天培地にまき、抑制的な温度下で培養すること
によつて、それぞれの突然変異株の復帰率を決定
した。培養液中の惰性突然変異株は必らずプレー
トに接種する直前に１時間抑制的な温度下で培養
した。 惰性突然変異株が非許容的な温度下で増殖を続
ける能力を、培養液中で、非許容的な温度下に移
されてから増殖した細胞を600nｍの吸光度を測
定することによつて監視しcfuを定量することに
よつて決定した。 遺伝地図の作製。 インフルエンザ菌における、ts突然変異の染色
体上の位置を、一連の形質転換によつて決定し
た。採用する一般的な方法の概略を第２図に示
す。EKNSVNal菌株のDNAによつてts001菌株
を形質転換し、形質転換された菌を適当な抗生物
質を含んだ補充BHI寒天上で選別した。抗生物
質耐性組換え体を２枚のプレートに線条接種し、
それぞれのプレートを非許容的及び許容的温度下
で培養した。もしts001菌株のts突然変異が、例え
ばSn R遺伝子を獲得することによつて治癒された
とすれば、そのts突然変異部位はSn R遺伝子と連
鎖していると推測できる。 逆の実験もまた必ず行つた。すなわち、
EKNSVNal菌株のDNAによつてts001菌株を形
質転換し、ts +表現型を選択した。次に適当な抗
生物質を含んだ補充BHI寒天培地にそのts +組換
え体をレプリカプレートすることによつて、抗生
物質耐性遺伝子を獲得しているかどうかを記録し
た。 同様に、001菌株のDNAによつてts
EKNSVNal突然変異株を形質転換し、ts +表現型
が復帰した組換え体について、それに伴う抗生物
質耐性の消失を調べた。tsEKNSVNal菌株によ
つて001菌株を形質転換し、27℃において抗生物
質耐性菌を選別し、その選別された組換え体につ
いて温度感受性を調べた。 形質転換 ジユニ（Juni）によつて開発され、（Appl.
Microbiol.27：16、1974）クラーク（Clark）ら
によつて修飾された（Abstracts、A.S.M.
Annual Meeting、1977）プレート技術を、この
技術が27℃という低温においても有効であるとい
うことを予備実験で確めてから、すべての形質転
換に用いた。DNAは、0.02％のSDSを含む補充
BHI培養液に懸濁した細胞（１−２×109個／ml）
を溶かして得、これを60℃で15分間殺菌した。一
夜プレート培養したDNAを受容させる細胞を新
しいチヨコレート寒天プレートに塗りつけ、0.1
mlのピペツトによる１滴のDNAと完全に混ぜ合
わせた。それらのプレートは30℃で３時間（ts +
組換え体を探す場合）又は７ないし18時間（抗生
物質耐性組換え体を探す場合）培養し、それらの
形質転換株をチヨコレート寒天プレート又は適当
な抗生物質を含んだBHI寒天プレートに線条接
種した。線条接種プレートは前者の場合には36℃
で、後者の場合には27℃で培養した。 突然変異対立遺伝子の精製 NGはすぐれた突然変異誘発物質であるが、問
題の遺伝子と近く連鎖した部位にも、遠く離れた
部位にも余計な突然変異を引き起こす性質があ
り、問題を引き起こす（アデルバーグ
（Adelberg）ら、Biochem.Biophys.Res.
Comm.18：788、1965及びヒロタ（Hirota）ら、
J.Mol.Biol.35：175、1968）。それ故に一旦選ば
れた突然変異が適わしいと考えられたなら、それ
を突然変異誘発されたきたない菌株からきれいな
菌株に伝達するのが好ましい。従つて、ts突然変
異が位置づけられ、抗生物質耐性標識との連鎖が
確認された後、その遺伝子によつて001菌株を形
質転換した。EKNSVNal菌株中に発生したts突
然変異株のDNAによつて001菌株を形質転換し、
その形質転換株を適当な抗生物質を含んだ補充
BHI寒天プレート上にプレートした。抗生物質
耐性組換え体は次に、ts遺伝子が存在しているか
否かを調べ、ts突然変異の復帰率を確めた。ts突
然変異部位が抗生物質耐性遺伝子の近くに位置し
ているts001菌株を、まずきれいなEKNSVNal菌
株の適当な抗生物質耐性標識によつて抗生物質耐
性とし、ts突然変異を維持しているかどうかを調
べた。そのＡ／bR−ts遺伝子によつて次にきれい
な001菌株を形質転換した。このように、連鎖し
たＡ／bR−ts遺伝子の両側のNG処理によつてで
きた余計な突然変異を排除した。 最終菌株の作製 きれいなts遺伝子を持つた001菌株を、適当な
抗生物質を選別標識として形質転換によつて組合
わせた。二重組換え体はまず復帰率の減少につい
て調べた。第二のts遺伝子の存在は、もう１度形
質転換によつてts +菌株をつくる、再分離によつ
て確認した。三重組換え体は３つのts遺伝子を
別々に再分離することによつてのみ確認できる。 結 果 分離された突然変異株 第１図に示した方法によつて、適当な復帰率と
増殖抑制温度を持つた、選択可能な標識と連鎖し
た惰性ts突然変異を持つた３種類の菌株を選ん
だ。それらの性質を第２表に示す。
炎膜の主因であり（ハガーテイ（Haggerty）と
ジアイ（Ziai）、Adv.Ped.13：129、1964；ウエ
ルレ（Wehrle）ら、Pediatrics44：991、1968；
スミス（Smith）とヘイネス（Haynes）．
Pediatrics50：723、1972）、そして子供及び成人
の致命的エピトウロテイテイス（epitlottitis）、
閉鎖性気管支炎、中耳カタル、敗血病性関節炎、
喉頭炎、蜂巣炎及び肺炎の重要な原因である。米
国ではインフルエンザ菌ｂ型による髄膜炎が少な
くとも１年間に10000件発生している。迅速な診
断及びアンピシリンやクロラムフエニコールによ
る治療で通常回復している。しかしながら、死亡
率は５％ないし10％であり、回復した人のかなり
の人（30％ないし50％）は一生神経の損傷によつ
て苦しめられている。 最近インフルエンザ菌ｂ型のプラスミド薬剤耐
性因子が出現し、これが出現した地域では抗生物
質による治療では回復しない危険性がある
（Center for Disease Control、Morbidity and
Mortality Weekly Rep.23：77、1974）。過去の
例から見ても、このようなプラスミドは迅速に世
界中に広まるので、抗生物質によるインフルエン
ザ菌感染病の治療はもうすぐ効果がなくなるであ
ろう。インフルエンザ菌ｂ型が薬剤耐性となり、
その一生続く神経的な後遺症の発生率が高いとい
うことを合わせて考えると、この菌による感染病
を防ぐ新たな方法を開発することが絶対に必要で
ある。 現在利用されているインフルエンザ菌に対する
ワクチンは精製された多糖類であり、これは、こ
の菌に対して最も弱いであろう非常に幼い子供に
対しては効果がない。それ故にインフルエンザ菌
に対する効果的で安全なワクチンが早急に必要で
ある。 この発明に記載された方法によつて、同一表現
型を発現する３つの温度感受性突然変異を有する
インフルエンザ菌の組換え菌が形質転換を利用し
て作製された。 材料及び方法 以下のインフルエンザ菌感染病に対するワクチ
ンの製造に関する記載全体を通じて、次の短縮形
を用いる。 Ａ／ｂ、抗生物質 BHI、脳、心臓混和物 cfu、コロニー形成単位 DMSO、ジメチルスルホキシド DNA、デオキシリボ核酸 En R,S、エリスロマイシン−耐性、−感受性 ｇ、グラム Kn R,S、カナマイシン−耐性、−感受性 、リツトル mg、ミリグラム mlミリリツトル NAD、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド NalR,S、ナリジキシン酸−耐性、−感受性 NbR,S、ノボビオシン−耐性、−感受性 NG、ニトロソグアニジン、Ｎ−メチル−N′−ニ
トロ−Ｎ−ニトロソグアニジン PRP、ポリボフオスフエート RifR,S、リフアマイシン−耐性、−感受性 RR、復帰率 Sn R,S、ストレプトマイシン−耐性、−感受性 ts、温度感受性 μ、ミクロン μｇ、マイクログラム μ、マイクロリツトル Vn R,S、ヴアイオマイシン−耐性、−感受性 細 菌 この実施例ではインフルエンザ菌の基本的な２
種の菌株を用いた。すなわち、ｂ型のラフ変異株
（001菌株）と抗生物質En、Kn、Nb、Sn、Vn及
びNalに耐性な誘導菌株（EKNSVNal菌株）と
である。001菌株（American Type Culture
Collection（ATCC）、菌株No.31517）及び
EKNSVNalは両方ともバージエイの細菌分類表
（第７版、1957）の406−408ページに記載された
インフルエンザ菌の特徴を持つている。すなわ
ち、それらはグラム陰性の桿状体で0.2〜0.3μ×
0.5〜2.0μ大であり、単独でも２個体集まつてで
も生息し、時には短い鎖状になつていることもあ
る。それらは増殖するためにNADとヘミンを必
要とする。EKNSVNalはATCCに寄託してあ
り、番号は31514である。 増殖培地 インフルエンザ菌は20μｇ／mlのヘミン及び
10μｇ／mlのNADを補充したブレイン・ハー
ト・インフユージヨン（BHI）（2.5％ｗ／ｖ）寒
天又はチヨコレート寒天で常法により継代培養し
た。補充BHI培地上に培養菌液が生成した。選
別のためのプレート培養は適当な抗生物質を含ん
だ補充BHI寒天上で行つた。 突然変異生成、濃縮及び分離 インフルエンザ菌（001及びEKNSVNal）のts
突然変異株に分離するためのプロトコールの概略
が第１図に示されている。宿主の免疫機構を反応
させるために、少なくとも一時的には、ワクチン
用菌株が気管支上部でロニーを形成することが必
要なので、２つの型のts突然変異を探した。古典
的な、非許容的温度下に移されると直ちに複製を
停止する突然変異株（以下厳格突然変異株とい
う）は第１図に示された操作によつて常法により
分離した。抑制的な温度下に移されても２、３回
分裂する突然変異株（以下惰性突然変異株とい
う）は抗生物質を遅らせて加えることによつて分
離した。また、増殖抑制温度が32℃ないし36℃の
突然変異株を、濃縮時の温度を変えることによつ
て探した。 突然変異株の一次的特徴づけ 上述の操作によつて分離されたts突然変異株の
増殖抑制温度を決定するために、チヨコレート寒
天プレート上に線条接種し、それぞれのプレート
を27℃、30℃、32℃、34℃及び36℃で培養した。
線条に沿つて増殖するが単一のコロニーを形成す
るに至らない突然変異株を惰性突然変異株とし
た。古典的な厳格突然変異株は増殖抑制温度以上
の温度下ではもちろん全く増殖できない。 １×103ないし２×109個の細胞をチヨコレート
寒天培地にまき、抑制的な温度下で培養すること
によつて、それぞれの突然変異株の復帰率を決定
した。培養液中の惰性突然変異株は必らずプレー
トに接種する直前に１時間抑制的な温度下で培養
した。 惰性突然変異株が非許容的な温度下で増殖を続
ける能力を、培養液中で、非許容的な温度下に移
されてから増殖した細胞を600nｍの吸光度を測
定することによつて監視しcfuを定量することに
よつて決定した。 遺伝地図の作製。 インフルエンザ菌における、ts突然変異の染色
体上の位置を、一連の形質転換によつて決定し
た。採用する一般的な方法の概略を第２図に示
す。EKNSVNal菌株のDNAによつてts001菌株
を形質転換し、形質転換された菌を適当な抗生物
質を含んだ補充BHI寒天上で選別した。抗生物
質耐性組換え体を２枚のプレートに線条接種し、
それぞれのプレートを非許容的及び許容的温度下
で培養した。もしts001菌株のts突然変異が、例え
ばSn R遺伝子を獲得することによつて治癒された
とすれば、そのts突然変異部位はSn R遺伝子と連
鎖していると推測できる。 逆の実験もまた必ず行つた。すなわち、
EKNSVNal菌株のDNAによつてts001菌株を形
質転換し、ts +表現型を選択した。次に適当な抗
生物質を含んだ補充BHI寒天培地にそのts +組換
え体をレプリカプレートすることによつて、抗生
物質耐性遺伝子を獲得しているかどうかを記録し
た。 同様に、001菌株のDNAによつてts
EKNSVNal突然変異株を形質転換し、ts +表現型
が復帰した組換え体について、それに伴う抗生物
質耐性の消失を調べた。tsEKNSVNal菌株によ
つて001菌株を形質転換し、27℃において抗生物
質耐性菌を選別し、その選別された組換え体につ
いて温度感受性を調べた。 形質転換 ジユニ（Juni）によつて開発され、（Appl.
Microbiol.27：16、1974）クラーク（Clark）ら
によつて修飾された（Abstracts、A.S.M.
Annual Meeting、1977）プレート技術を、この
技術が27℃という低温においても有効であるとい
うことを予備実験で確めてから、すべての形質転
換に用いた。DNAは、0.02％のSDSを含む補充
BHI培養液に懸濁した細胞（１−２×109個／ml）
を溶かして得、これを60℃で15分間殺菌した。一
夜プレート培養したDNAを受容させる細胞を新
しいチヨコレート寒天プレートに塗りつけ、0.1
mlのピペツトによる１滴のDNAと完全に混ぜ合
わせた。それらのプレートは30℃で３時間（ts +
組換え体を探す場合）又は７ないし18時間（抗生
物質耐性組換え体を探す場合）培養し、それらの
形質転換株をチヨコレート寒天プレート又は適当
な抗生物質を含んだBHI寒天プレートに線条接
種した。線条接種プレートは前者の場合には36℃
で、後者の場合には27℃で培養した。 突然変異対立遺伝子の精製 NGはすぐれた突然変異誘発物質であるが、問
題の遺伝子と近く連鎖した部位にも、遠く離れた
部位にも余計な突然変異を引き起こす性質があ
り、問題を引き起こす（アデルバーグ
（Adelberg）ら、Biochem.Biophys.Res.
Comm.18：788、1965及びヒロタ（Hirota）ら、
J.Mol.Biol.35：175、1968）。それ故に一旦選ば
れた突然変異が適わしいと考えられたなら、それ
を突然変異誘発されたきたない菌株からきれいな
菌株に伝達するのが好ましい。従つて、ts突然変
異が位置づけられ、抗生物質耐性標識との連鎖が
確認された後、その遺伝子によつて001菌株を形
質転換した。EKNSVNal菌株中に発生したts突
然変異株のDNAによつて001菌株を形質転換し、
その形質転換株を適当な抗生物質を含んだ補充
BHI寒天プレート上にプレートした。抗生物質
耐性組換え体は次に、ts遺伝子が存在しているか
否かを調べ、ts突然変異の復帰率を確めた。ts突
然変異部位が抗生物質耐性遺伝子の近くに位置し
ているts001菌株を、まずきれいなEKNSVNal菌
株の適当な抗生物質耐性標識によつて抗生物質耐
性とし、ts突然変異を維持しているかどうかを調
べた。そのＡ／bR−ts遺伝子によつて次にきれい
な001菌株を形質転換した。このように、連鎖し
たＡ／bR−ts遺伝子の両側のNG処理によつてで
きた余計な突然変異を排除した。 最終菌株の作製 きれいなts遺伝子を持つた001菌株を、適当な
抗生物質を選別標識として形質転換によつて組合
わせた。二重組換え体はまず復帰率の減少につい
て調べた。第二のts遺伝子の存在は、もう１度形
質転換によつてts +菌株をつくる、再分離によつ
て確認した。三重組換え体は３つのts遺伝子を
別々に再分離することによつてのみ確認できる。 結 果 分離された突然変異株 第１図に示した方法によつて、適当な復帰率と
増殖抑制温度を持つた、選択可能な標識と連鎖し
た惰性ts突然変異を持つた３種類の菌株を選ん
だ。それらの性質を第２表に示す。
【表】
組換え菌株
３つのts突然変異が、連続した形質転換によつ
て１つの菌株に組込まれた。先ずA214をＡ／３
のDNAによつて形質転換し、KmR組換え体を選
び、減少した復帰率を分析した。Kn Rと連鎖した
ts突然変異部位の存在は、その組換え体のDNA
によつて001菌株を形質転換することによつて確
めた。Sn Rと連鎖したts突然変異部位の存在も同
様にして確めた。 C2／13菌株のDNAによつてA214−Ａ／３組換
え体を形質転換してEn Rとした。すべての、３つ
のts突然変異部位の存在は、001菌株のそれらに
よる別々の形質転換における再分離によつて確認
した（上述の通り）。これらの菌株の復帰率を第
３表に示す。 二重及び三重の組換え菌株は両方ともATCCに
寄託してあり、菌株番号はそれぞれ31515と31516
である。これらの寄託菌株がもとの菌株と同一で
ある証拠は次のような変異である。すなわち、増
殖最適温度が29℃であり、34℃で増殖が阻害さ
れ、36℃では２回しか分裂することができず、抗
生物質カナマイシン、ストレプトマイシン、及び
エリスロマイシンに耐性である。
て１つの菌株に組込まれた。先ずA214をＡ／３
のDNAによつて形質転換し、KmR組換え体を選
び、減少した復帰率を分析した。Kn Rと連鎖した
ts突然変異部位の存在は、その組換え体のDNA
によつて001菌株を形質転換することによつて確
めた。Sn Rと連鎖したts突然変異部位の存在も同
様にして確めた。 C2／13菌株のDNAによつてA214−Ａ／３組換
え体を形質転換してEn Rとした。すべての、３つ
のts突然変異部位の存在は、001菌株のそれらに
よる別々の形質転換における再分離によつて確認
した（上述の通り）。これらの菌株の復帰率を第
３表に示す。 二重及び三重の組換え菌株は両方ともATCCに
寄託してあり、菌株番号はそれぞれ31515と31516
である。これらの寄託菌株がもとの菌株と同一で
ある証拠は次のような変異である。すなわち、増
殖最適温度が29℃であり、34℃で増殖が阻害さ
れ、36℃では２回しか分裂することができず、抗
生物質カナマイシン、ストレプトマイシン、及び
エリスロマイシンに耐性である。
【表】
マスター菌株の〓膜形成
この組換え菌株はマスター菌株ということがで
き、これ自身で抗原型に分類できないインフルエ
ンザ菌の菌株に対してワクチンとして使用するこ
とができるし、また、莢膜形成に関する情報を持
つたDNAによつてこれを形質転換することによ
つて、インフルエンザ菌の６種類のすべての抗原
型に対するワクチン用菌株にそれぞれ変化させる
ことができる。このマスター菌株の変化は、莢膜
を持つ菌株のDNAによつて上述のようにマスタ
ー菌株を形質転換することによつて行うことがで
きる。その組換え体を適当な莢膜多糖類に対する
抗体を含んだ補充BHI寒天にプレートし、形質
転換によつて莢膜を持つようになつた菌株はコロ
ニーの回りに抗原抗体反応の沈澱による「輪」が
できるので、同定することができる。 インフルエンザ菌の２重の温度感受性（ｔｓ）変
異体の免疫原性評価 ６ないし７日齢のSprague−Dawleyラツトを
２群に分け、それぞれ噴霧室に30分間入れてイン
フルエンザ菌温度感受性変異体Ａ−17または生理
食塩水（対照）を1.5×109cfu（コロニー形成ユニ
ツト）／ml含むエアロゾルを用いて免疫した。
各々のラツトは肺１個当り２〜４×104cfuを吸引
した。11日後、これらのラツトに野生型菌株２×
109cfu／mlを含むエアロゾルを吸引させた。ラツ
トの半分は吸引直後（T0）に死亡し、残りも４
時間後（T4）死亡した。死亡したラツトから肺
を摘出し、秤量し、減菌した水５ml中でホモジナ
イズして存在するインフルエンザ菌を定量的に培
養した。T4まで残つたラツトの肺１ｇ当りのcfu
をT0で死亡したラツトのそれと比較し、残存菌
比（uncleared bacteria ratio）を算出した。結
果を第４表に示す。第４表から明らかなように、
免疫されたラツトでは、菌の肺クリアランスが高
められていることがわかる。
き、これ自身で抗原型に分類できないインフルエ
ンザ菌の菌株に対してワクチンとして使用するこ
とができるし、また、莢膜形成に関する情報を持
つたDNAによつてこれを形質転換することによ
つて、インフルエンザ菌の６種類のすべての抗原
型に対するワクチン用菌株にそれぞれ変化させる
ことができる。このマスター菌株の変化は、莢膜
を持つ菌株のDNAによつて上述のようにマスタ
ー菌株を形質転換することによつて行うことがで
きる。その組換え体を適当な莢膜多糖類に対する
抗体を含んだ補充BHI寒天にプレートし、形質
転換によつて莢膜を持つようになつた菌株はコロ
ニーの回りに抗原抗体反応の沈澱による「輪」が
できるので、同定することができる。 インフルエンザ菌の２重の温度感受性（ｔｓ）変
異体の免疫原性評価 ６ないし７日齢のSprague−Dawleyラツトを
２群に分け、それぞれ噴霧室に30分間入れてイン
フルエンザ菌温度感受性変異体Ａ−17または生理
食塩水（対照）を1.5×109cfu（コロニー形成ユニ
ツト）／ml含むエアロゾルを用いて免疫した。
各々のラツトは肺１個当り２〜４×104cfuを吸引
した。11日後、これらのラツトに野生型菌株２×
109cfu／mlを含むエアロゾルを吸引させた。ラツ
トの半分は吸引直後（T0）に死亡し、残りも４
時間後（T4）死亡した。死亡したラツトから肺
を摘出し、秤量し、減菌した水５ml中でホモジナ
イズして存在するインフルエンザ菌を定量的に培
養した。T4まで残つたラツトの肺１ｇ当りのcfu
をT0で死亡したラツトのそれと比較し、残存菌
比（uncleared bacteria ratio）を算出した。結
果を第４表に示す。第４表から明らかなように、
免疫されたラツトでは、菌の肺クリアランスが高
められていることがわかる。
【表】
緑膿菌の温度感受性変異体の免疫原性評価
コーストする緑膿菌のts変異体（coasting ts
mutant）の変異原性を測定した。ここでコース
トとは、ワクチン中において限定された複製を行
なうことが可能であることを言い、このような特
性を有する株をコースター（coaster）と呼ぶ。
適量のts変異体の１種を腹腔内投与して免疫され
たICRマウスは、５週間後に接種された猛毒の親
株100LD50に対しても完全な抵抗性を示した。ま
た、緑膿菌の第2ts変異体を含むエアロゾルによ
つて免疫されたDBA／2Jマウスは、生理食塩水
処理した対照よりも迅速に免疫株および野生型親
株を肺から除去した。さらに、穏やかな、および
過激なコースターの免疫原性能力を比較した場合
には、過激なコースターの方がより少ない投与量
で100％の保護を得ることができた。 緑膿菌のｔｓ変異体を鼻腔内および口腔に投与す
ることによる免疫 ts変異体Ｄ／１／８（タイト表現型）および
Ｅ／９／９（コースター）５×108CFUまたは生
理食塩水４×106CFUをそれぞれ含有する懸濁液
を口腔もしくは鼻腔内投与することにより、メス
DBA／2Jマウス（３〜４週齢、Jackson
Laboratories、Bar Harbor、Me.）を免疫した。
ここで、タイト表現型とは、許容されざる温度に
移るや否や複製を停止する表現型を指す。２ない
し３週間後に、これらのマウスを野生型緑膿菌の
エアロゾルで処理し、公知のモデルを用いてマウ
スの肺が４時間で免疫原を除去する能力を評価し
た。その結果を第６図に示す。この図から明らか
なように、タイト（tight）な、およびコースト
する変異体によつて鼻腔内または口腔投与のいず
れかで免疫されたマウスは、野生型親株のエアロ
ゾルに対してもクリアランスが高められている。
また、コーストする変異対Ｅ／９／９を鼻腔内投
与するとにより免疫されたマウスは、タイトな変
異対Ｄ／１／８で免疫されたマウスよりも肺に残
存する菌が効果的に減少しているように見え、口
腔投与による免疫の場合にはこの逆である。 これとは別に、５匹のICRマウスからなる群に
108CFUのＤ／１／８またはＥ／９／９のいずれ
かを腹腔内投与して免疫した。これらのマウスお
よび免疫から３週間後の生理食塩水を接種した対
照から血清を採取し、公知の固相酵素免疫測定法
（ELISA）で、緑膿菌イムノタイプ１に対して特
異性を有するIgGの存在を分析した。その結果を
第７図に示す。この図から明らかなように、タイ
トな、またはコーストするts変異体のいずれかを
腹腔内投与することにより免疫されたマウスは、
ELISAの測定により、対照よりも有意に高い血
清抗体力価を有する。第７図には示していない
が、ts変異体を鼻腔内投与することにより免疫さ
れたマウスでは血清抗体は検出されなかつた。 緑膿菌変異体の免疫原性 この実験においては、緑膿菌Fisher−Devlin−
Gnabasikイムノタイプ１、およびニトロソグア
ニジンを用いた変異誘発の後に単離された２種の
ts誘導体Ｄ／１／８（タイト表現型）およびＥ／
９／９（コースター）を使用した。また、免疫動
物としては、３〜５週齢のメスICR（Harlan
Farms、Rockville、Md.）および８週齢の
DBA／2Jマウス（Jackson Laboratory、Bar
Harbor、Maine）を用いた。 まず、６匹のICRマウスからなる群を、２種の
表現型を種々の投与量で腹腔内投与することによ
り免疫した。２週間後、致死量の野生型親株
（wt）を投与し、死亡率を記録した。結果を第５
表に示す。この表から明らかなように、等しい投
与量（1.8×108〜２×108CFU）で、コーストす
る変異体はタイトな変異体よりも有意に高い保護
を誘発する（対照値と比較した場合に、それぞれ
Ｐ＝0.0080対Ｐ＝0.7909である）。
mutant）の変異原性を測定した。ここでコース
トとは、ワクチン中において限定された複製を行
なうことが可能であることを言い、このような特
性を有する株をコースター（coaster）と呼ぶ。
適量のts変異体の１種を腹腔内投与して免疫され
たICRマウスは、５週間後に接種された猛毒の親
株100LD50に対しても完全な抵抗性を示した。ま
た、緑膿菌の第2ts変異体を含むエアロゾルによ
つて免疫されたDBA／2Jマウスは、生理食塩水
処理した対照よりも迅速に免疫株および野生型親
株を肺から除去した。さらに、穏やかな、および
過激なコースターの免疫原性能力を比較した場合
には、過激なコースターの方がより少ない投与量
で100％の保護を得ることができた。 緑膿菌のｔｓ変異体を鼻腔内および口腔に投与す
ることによる免疫 ts変異体Ｄ／１／８（タイト表現型）および
Ｅ／９／９（コースター）５×108CFUまたは生
理食塩水４×106CFUをそれぞれ含有する懸濁液
を口腔もしくは鼻腔内投与することにより、メス
DBA／2Jマウス（３〜４週齢、Jackson
Laboratories、Bar Harbor、Me.）を免疫した。
ここで、タイト表現型とは、許容されざる温度に
移るや否や複製を停止する表現型を指す。２ない
し３週間後に、これらのマウスを野生型緑膿菌の
エアロゾルで処理し、公知のモデルを用いてマウ
スの肺が４時間で免疫原を除去する能力を評価し
た。その結果を第６図に示す。この図から明らか
なように、タイト（tight）な、およびコースト
する変異体によつて鼻腔内または口腔投与のいず
れかで免疫されたマウスは、野生型親株のエアロ
ゾルに対してもクリアランスが高められている。
また、コーストする変異対Ｅ／９／９を鼻腔内投
与するとにより免疫されたマウスは、タイトな変
異対Ｄ／１／８で免疫されたマウスよりも肺に残
存する菌が効果的に減少しているように見え、口
腔投与による免疫の場合にはこの逆である。 これとは別に、５匹のICRマウスからなる群に
108CFUのＤ／１／８またはＥ／９／９のいずれ
かを腹腔内投与して免疫した。これらのマウスお
よび免疫から３週間後の生理食塩水を接種した対
照から血清を採取し、公知の固相酵素免疫測定法
（ELISA）で、緑膿菌イムノタイプ１に対して特
異性を有するIgGの存在を分析した。その結果を
第７図に示す。この図から明らかなように、タイ
トな、またはコーストするts変異体のいずれかを
腹腔内投与することにより免疫されたマウスは、
ELISAの測定により、対照よりも有意に高い血
清抗体力価を有する。第７図には示していない
が、ts変異体を鼻腔内投与することにより免疫さ
れたマウスでは血清抗体は検出されなかつた。 緑膿菌変異体の免疫原性 この実験においては、緑膿菌Fisher−Devlin−
Gnabasikイムノタイプ１、およびニトロソグア
ニジンを用いた変異誘発の後に単離された２種の
ts誘導体Ｄ／１／８（タイト表現型）およびＥ／
９／９（コースター）を使用した。また、免疫動
物としては、３〜５週齢のメスICR（Harlan
Farms、Rockville、Md.）および８週齢の
DBA／2Jマウス（Jackson Laboratory、Bar
Harbor、Maine）を用いた。 まず、６匹のICRマウスからなる群を、２種の
表現型を種々の投与量で腹腔内投与することによ
り免疫した。２週間後、致死量の野生型親株
（wt）を投与し、死亡率を記録した。結果を第５
表に示す。この表から明らかなように、等しい投
与量（1.8×108〜２×108CFU）で、コーストす
る変異体はタイトな変異体よりも有意に高い保護
を誘発する（対照値と比較した場合に、それぞれ
Ｐ＝0.0080対Ｐ＝0.7909である）。
【表】
また、DBA／2Jマウス（各群12匹）を、３×
106ないし４×106CFUのＤ／１／８もしくはＥ／
９／９、109個のホルマリンで殺したwt細胞、ま
たは生理食塩水を１週間に３回の間隔で10ulずつ
鼻腔内投与することにより免疫した。これらのマ
ウスを、免疫の１週間後、我々の研究室内に設置
したチヤンバー内に入れて毒性の強いイムノタイ
プ１のエアロゾルに30分間さらし、４時間にわた
つて肺からこれらの菌を除去する能力を生理食塩
水で免疫したマウスのそれと比較した。すなわ
ち、エアロゾルにさらした直後および４時間後に
マウスの群を犠牲にし、肺を無菌で摘出して
Potter−Elvehjemガラスグラインダーにおいて
無菌蒸留水５ml中でホモジナイズすることにより
エアロゾル化した菌に対する肺クリアランスを測
定した（A.H.Thomas、Philadelphia、Pa.）。こ
の測定は、適当に希釈した、肺ホモジネートの試
料を塗布して36℃でインキユベートし、生育可能
な細胞を定量することのより行なつた。得られた
結果を第８図に示す。この図から明らかなよう
に、免疫群では対照群よりも効果的に肺から菌が
除去されている。Ｄ／１／８で免疫面されたマウ
スとＥ／９／９で免疫されたマウスとの間の差異
は示唆はされるものの有意ではなかつた。しかし
ながら、ホルマリンで殺したwt細胞で免疫した
マウスと比較した場合には、変異体Ｅ／９／９で
免疫したマウスのwt細胞に対するクリアランス
は有意に高められていた。さらに、Ｄ／１／８お
よびＥ／９／９の使用量は、ホルマリンで殺した
wt細胞を用いた免疫における使用量よりも2log
低い。 これとは別に、タイトな変異体（Ｄ／１／８）
もしくはコーストする変異体（Ｅ／９／９）８×
107CFUを腹腔内もしくは鼻腔内のいずれかを投
与することによりマウスを免疫し、免疫前および
免疫の３週間後にマウスの眼窩後部から採取した
血清試料を用いて、固相酵素免疫測定法
（ELISA）により、免疫イムノタイプ１および無
関係なイムノタイプ４および５な特異的なIgGの
検定を行なつた。マウスから採取した血液試料
は、試験に供するまで−20℃で保存した。免疫し
ていないマウスから採取した血清を対照として、
公知の手順で試験を行なつた。結果を第９図に示
す。第９図において、白抜きのシンボルは鼻腔内
投与によつて免疫されたマウスに由来する血清
IgGを示し、黒塗りのシンボルは腹腔内投与によ
つて免疫されたマウスに由来するIgGを示す。こ
の図から明らかなように、Ｅ／９／９で免疫した
マウスから採取した血清は、等量の変異体Ｄ／
１／８で免疫したマウスから採取した血清より
も、イムノタイプ１の表面抗原に特異的なIgGの
レベルが有意に高い。イムノタイプ４および５に
よつて供される抗原に対するELISA抗体は示さ
れていない。２種の変異体を鼻腔内投与すること
により免疫したマウスから採取した血清には、検
出し得る、緑膿菌に対する抗体は含まれていな
い。 チフス菌の３重のｔｓ変異体の免疫原性能力の評
価 上述の変異誘発方法によつて得られたチフス菌
の３重の変異体ts51−１の変異原性能力を評価し
た。 まず、ts51−１を腹腔内投与して免疫し、４週
間後に５％ムチン中の野生型チフス菌ty2
100LD50を腹腔内に接種したマウスの生存と抗体
産生を調べた。結果を第６表に示す。
106ないし４×106CFUのＤ／１／８もしくはＥ／
９／９、109個のホルマリンで殺したwt細胞、ま
たは生理食塩水を１週間に３回の間隔で10ulずつ
鼻腔内投与することにより免疫した。これらのマ
ウスを、免疫の１週間後、我々の研究室内に設置
したチヤンバー内に入れて毒性の強いイムノタイ
プ１のエアロゾルに30分間さらし、４時間にわた
つて肺からこれらの菌を除去する能力を生理食塩
水で免疫したマウスのそれと比較した。すなわ
ち、エアロゾルにさらした直後および４時間後に
マウスの群を犠牲にし、肺を無菌で摘出して
Potter−Elvehjemガラスグラインダーにおいて
無菌蒸留水５ml中でホモジナイズすることにより
エアロゾル化した菌に対する肺クリアランスを測
定した（A.H.Thomas、Philadelphia、Pa.）。こ
の測定は、適当に希釈した、肺ホモジネートの試
料を塗布して36℃でインキユベートし、生育可能
な細胞を定量することのより行なつた。得られた
結果を第８図に示す。この図から明らかなよう
に、免疫群では対照群よりも効果的に肺から菌が
除去されている。Ｄ／１／８で免疫面されたマウ
スとＥ／９／９で免疫されたマウスとの間の差異
は示唆はされるものの有意ではなかつた。しかし
ながら、ホルマリンで殺したwt細胞で免疫した
マウスと比較した場合には、変異体Ｅ／９／９で
免疫したマウスのwt細胞に対するクリアランス
は有意に高められていた。さらに、Ｄ／１／８お
よびＥ／９／９の使用量は、ホルマリンで殺した
wt細胞を用いた免疫における使用量よりも2log
低い。 これとは別に、タイトな変異体（Ｄ／１／８）
もしくはコーストする変異体（Ｅ／９／９）８×
107CFUを腹腔内もしくは鼻腔内のいずれかを投
与することによりマウスを免疫し、免疫前および
免疫の３週間後にマウスの眼窩後部から採取した
血清試料を用いて、固相酵素免疫測定法
（ELISA）により、免疫イムノタイプ１および無
関係なイムノタイプ４および５な特異的なIgGの
検定を行なつた。マウスから採取した血液試料
は、試験に供するまで−20℃で保存した。免疫し
ていないマウスから採取した血清を対照として、
公知の手順で試験を行なつた。結果を第９図に示
す。第９図において、白抜きのシンボルは鼻腔内
投与によつて免疫されたマウスに由来する血清
IgGを示し、黒塗りのシンボルは腹腔内投与によ
つて免疫されたマウスに由来するIgGを示す。こ
の図から明らかなように、Ｅ／９／９で免疫した
マウスから採取した血清は、等量の変異体Ｄ／
１／８で免疫したマウスから採取した血清より
も、イムノタイプ１の表面抗原に特異的なIgGの
レベルが有意に高い。イムノタイプ４および５に
よつて供される抗原に対するELISA抗体は示さ
れていない。２種の変異体を鼻腔内投与すること
により免疫したマウスから採取した血清には、検
出し得る、緑膿菌に対する抗体は含まれていな
い。 チフス菌の３重のｔｓ変異体の免疫原性能力の評
価 上述の変異誘発方法によつて得られたチフス菌
の３重の変異体ts51−１の変異原性能力を評価し
た。 まず、ts51−１を腹腔内投与して免疫し、４週
間後に５％ムチン中の野生型チフス菌ty2
100LD50を腹腔内に接種したマウスの生存と抗体
産生を調べた。結果を第６表に示す。
【表】
＊ マイクロタイター・システムによつ
て測定された、チフス菌 ty2のVi、O、H
抗原に対する平均凝集抗体力価
また、種々の量のts51−１を腹腔内投与した後
４週間での抗体産生を第７表に示す。
て測定された、チフス菌 ty2のVi、O、H
抗原に対する平均凝集抗体力価
また、種々の量のts51−１を腹腔内投与した後
４週間での抗体産生を第７表に示す。
【表】
の凝集
次に、ts51−１を経口投与して免疫したマウス
に由来するリンパ球の抗菌活性を調べた。前処理
なしの場合の結果を第８表に、抗生物剤で前処理
した場合の結果を第９表にそれぞれ示す。
次に、ts51−１を経口投与して免疫したマウス
に由来するリンパ球の抗菌活性を調べた。前処理
なしの場合の結果を第８表に、抗生物剤で前処理
した場合の結果を第９表にそれぞれ示す。
【表】
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 毒性細菌菌株に、この毒性菌株を免疫原性を
保つたまま無毒化する同一表現型の少なくとも２
つの突然変異を導入することによつて誘導され
た、遺伝的に弱毒化されかつ安定な無毒の細菌菌
株の免疫原として有効な量、及び不活性で薬理学
的に許容できる担体から成るワクチン組成物。 ２ 表現型が温度感受性表現型である特許請求の
範囲第１項記載のワクチン組成物。 ３ 細菌菌株が同一表現型の３つの温度感受性突
然変異を含む特許請求の範囲第２項記載のワクチ
ン組成物。 ４ 温度感受性の表現型が、通常のヒトの体温下
において菌株の複製を抑制するものである特許請
求の範囲第２項記載のワクチン組成物。 ５ 表現型が、増殖要素の非存在下で菌株の複製
を抑制するものである特許請求の範囲第１項記載
のワクチン組成物。 ６ 増殖要素が抗生物質及び宿主の代謝経路外の
物質から選ばれた特許請求の範囲第５項記載のワ
クチン組成物。 ７ 増殖要素が抗生物質である特許請求の範囲第
６項記載のワクチン組成物。 ８ 表現型が菌株の毒素形成を抑制するものであ
る特許請求の範囲第１項記載のワクチン組成物。 ９ 表現型が菌株の侵入性を抑制するものである
特許請求の範囲第１項記載のワクチン組成物。 １０ 細菌がインフルエンザ菌である特許請求の
範囲第１項記載のワクチン組成物。 １１ インフルエンザ菌菌株が同一の温度感受性
表現型を発現する少なくとも２つの異なる突然変
異を含んだ特許請求の範囲第１０項記載のワクチ
ン組成物。 １２ 温度感受性表現型が、通常のヒトの体温下
でインフルエンザ菌菌株の増殖を抑制するもので
ある特許請求の範囲第１１項記載のワクチン組成
物。 １３ 細菌菌株がインフルエンザ菌A214−Ａ／
３である特許請求の範囲第１０項記載のワクチン
組成物。 １４ 細菌菌株がインフルエンザ菌A214−Ａ／
３−C2／13である特許請求の範囲第１０項記載
のワクチン組成物。 １５ 表現型が、細菌が非許容的な温度下に移さ
れた後にも最大７回まで分裂し続けることができ
るものである特許請求の範囲第２項記載のワクチ
ン組成物。 １６ 表現型が、細菌が非許容的な温度に移され
た後にも３回分裂することができる特許請求の範
囲第１５項記載のワクチン組成物。 １７ 同一表現型の少なくとも２つの異なる突然
変異を含み、免疫原性を保つたままで無毒化され
た細菌菌株。 １８ 表現型が、通常のヒトの体温下で増殖を抑
制する温度感受性表現型である特許請求の範囲第
１７項記載の菌株。 １９ 細菌がインフルエンザ菌である特許請求の
範囲第１７項または第１８項に記載の菌株。 ２０ 細菌がインフルエンザ菌A214−Ａ／３で
ある特許請求の範囲第１７項記載の菌株。 ２１ 細菌がインフルエンザ菌A214−Ａ／３−
C2／13である特許請求の範囲第１７項記載の菌
株。 ２２ 同一の表現型を発現する２以上の突然変異
を導入することによつて有毒な細菌菌株を免疫原
性を保つたまま無毒に変化させ、それによつて該
菌株を遺伝的に弱毒化することから成る細菌性ワ
クチンの製造方法。 ２３ 表現型が温度感受性表現型である特許請求
の範囲第２２項記載の方法。
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US06/041,896 US4337314A (en) | 1979-05-23 | 1979-05-23 | Genetically attenuated bacterial vaccines with multiple mutations of the same phenotype |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS56500612A JPS56500612A (ja) | 1981-05-07 |
| JPH0440330B2 true JPH0440330B2 (ja) | 1992-07-02 |
Family
ID=21918924
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP55501359A Expired - Lifetime JPH0440330B2 (ja) | 1979-05-23 | 1980-05-23 |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4337314A (ja) |
| EP (1) | EP0024956B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0440330B2 (ja) |
| AU (1) | AU536370B2 (ja) |
| DE (1) | DE3071115D1 (ja) |
| DK (1) | DK161492C (ja) |
| IE (1) | IE50598B1 (ja) |
| NZ (1) | NZ193815A (ja) |
| WO (1) | WO1980002504A1 (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5643771A (en) * | 1980-05-19 | 1997-07-01 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Non-reverting live bacterial vaccines |
| US4837151A (en) * | 1980-05-19 | 1989-06-06 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University, Stanford University | Live vaccines comprising two mutations and foreign antigen |
| US4550081A (en) * | 1980-05-19 | 1985-10-29 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Jr. University | Non-reverting salmonella |
| US4735801A (en) * | 1982-09-07 | 1988-04-05 | Board Of Trustees Of Leland Stanford Jr. University | Novel non-reverting salmonella live vaccines |
| US5137721A (en) * | 1981-03-09 | 1992-08-11 | Cetus Corporation | Employing strains of E. coli expressing non-indigenous adhesins and toxoids of E. coli |
| NZ199866A (en) * | 1981-03-09 | 1984-11-09 | Cetus Corp | Vaccine for prevention of gastroenteric disease:non-pathogenic strain genetically engineered to comprise genes for adhesin and/or toxoids |
| US4559306A (en) * | 1981-04-17 | 1985-12-17 | Norden Laboratories, Inc. | Modified Pasteurella multocida bacteria |
| US4554159A (en) * | 1981-11-12 | 1985-11-19 | Institute Merieux | Vaccine and method of immunizing against herpes simplex virus (types 1 and 2) |
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| US4857318A (en) * | 1983-11-07 | 1989-08-15 | Syntex (U.S.A.) Inc. | Bordetella bronchiseptica pilus subunit protein vaccine effective against bordetella pertussis |
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| JPS62502262A (ja) * | 1985-03-27 | 1987-09-03 | ブロンコスタット・プロプライアタリー・リミテツド | アジユバントを含有しないワクチン |
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| US5811105A (en) * | 1987-12-23 | 1998-09-22 | Glaxo Wellcome, Inc. | Vaccines containing bacteria attenuated by mutations in two genes of the aromatic amino acid biosynthetic pathway |
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| DE60303810D1 (de) * | 2002-09-01 | 2006-04-27 | Univ St Louis | Kontrollierte bakterielle lyse zur verabreichung von dna vakzinvektoren und impfantigen |
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Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| US4058599A (en) * | 1973-02-24 | 1977-11-15 | Bayer Aktiengesellschaft | Ethyleneimine inactivated organisms |
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| IL52815A (en) * | 1977-08-24 | 1983-03-31 | Israel State | Fowl cholera vaccine and process for producing an attenuated non-virulent strain of pasteurella multocida |
| US4133875A (en) * | 1978-02-23 | 1979-01-09 | Forsyth Dental Infirmary For Children | Method of controlling dental caries with streptococcus mutans mutant strains |
-
1979
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1980
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- 1981-01-21 DK DK026081A patent/DK161492C/da not_active IP Right Cessation
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| DK161492B (da) | 1991-07-15 |
| IE801073L (en) | 1980-11-23 |
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