DK161492B - Fremgangsmaade til fremstilling af en genetisk svaekket bakterievaccine samt bakteriestamme til brug ved fremgangsmaaden - Google Patents

Description

i

DK 161492 B

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til fremstilling af en bakterievaccine omfattende genetisk svækkede stammer og bakteriestammer til brug ved fremgangsmåden.

5 Brugen af bakterielle og virale vacciner har været meget vellykket til forebyggelse af infektionssygdomme hos mennesker og dyr. Der er forskellige fremgangsmåder til fremstilling af vacciner ud fra virus eller bakterier. De grundlæggende krav til enhver vaccine og til en fremgangsmåde til fremstilling af 10 en vaccine er, at (1) den fremkomne vaccine indeholder de nødvendige antigene determinanter til at i nducere dannelse af antistoffer i værten, (2) vaccinen har høj immunogen ydeevne, (3) den fremkomne vaccine er sikker nok til at kunne administreres uden fare for klinisk infektion, enten for modtageren 15 eller enhver af modtagerens kontakter, og at risikoen, der er forbundet med vaccination, bliver minimal, om ikke helt fjernet, (4) den fremkomne vaccine er uden nogen giftige bivirkninger, f.eks. feber fra endotoksin, som findes i dræbte eller ekstraherede celler, (5) den fremkomne vaccine er egnet til 20 administration ad en effektiv vej, f.eks. oral, intranasal, topisk eller parenteral, (6) den fremkomne vaccine og dens administrationsmåde nøje efterligner omstændighederne ved naturlig infektion, (7) den fremkomne vaccine er stabil under betingelser for lang tids oplagring, og at denne lange tids 25 opbevaring er ved stuetemperatur, og (8) den fremkomne vaccine er forenelig med de sædvanlige indifferente bærestoffer for vacc i ner.

30 35

DK 161492B

2

Tidligere kendte fremgangsmåder, der har tilstræbt at opfylde et eller flere af de førnævnte krav, indbefatter vacciner,indeholdende dræbte hele celler, rensede eller delvis rensede udvalgte antigene komponenter og levende : 5 kemisk eller genetisk svækkede mikroorganismer.

Brugen af dræbte hele celler som vacciner er blevet beskrevet af Switzer m.fl. i amerikansk patentskrift nr. 4.016.253, som anvendte en sådan fremgangsmåde til fremstilling af en vaccine mod Bordetella bronchiseptica infektion hos svin.

10 Dræbte hele celler er også blevet anvendt til at fremstille en vaccine mod kronisk bronchitis, forårsaget af Haemophilus influenzae (Brown & Wilseon, Br.Med.J. 1:263,. 1969). Brugen af dræbte celler er imidlertid i reglen ledsaget af et tab af immunogen ydeevne, da dræbningsprocessen i reglen 15 ødelægger eller ændrer mange af de overfladeantigene determinanter, som er nødvendige for at inducere specifikke antistoffer i værten. Antistofferne, som produceres som reaktion over for sådanne ændrede antigener, er ikke så specifikke for molekylstrukturerne på overfladen af den levende 20 organisme og er derfor ikke så effektive mod det indtrængende patogen.

Antigenkomponenter, isoleret og renset fra mikroorganismer, har også været anvendt som vacciner. Dette repræsenteres f.eks. ved anvendelsen af renset, indkapslet polysaccharid-25 materiale af H. influenzae type b som vaccine mod den meningitis, der forårsages af denne organisme hos mennesker (Parke m.fl., J.Inf.Dis. 136 (Suppl.) :S51, 1977, Anderson m.fl., J.Inf.Dis.136 (Suppl.):S63, 1977, Makelam.fi., J.Inf .Dis. 136 (Suppl.):S43, 1977) . Denne metode lider dog 30 også af ulemper, idet den kræver isolerings-og rensningsteknik, der alvorligt kan kompromittere det detaljerede tredimensionale rumlige arrangement af antigenet ved frigørelse af det fra dets stilling i den hele celle. Den iboende immunogenicitet af antigenerne,ekstraheret af hele celler, 35 kan også formindskes, et tab, der kan bidrage til det forholdsvis dårlige resultat med sådanne vacciner til meget 3

DK 161492 B

små børn (referencer, supra: Davies, J.Immunol.33:1, 1937, og Monto m.fl., J.Inf.Dis.127:394, 1973). Immunisering af større børn og voksne med renset, indkapslet polysaccha-rid fra H.influenzae type b inducerer faktisk humoral anti-5 stof, medens de meget små (mindre end 14-18 måneder), som er mest følsomme for sygdommen, ikke kan opvise en kendelig varig reaktion (referencer, supra). Lignende vanskeligheder har vist sig, når rensede, indkapslede polysaccharid-vacciner fremstilles af Streptococcus pneumoniae og Neis-10 seria meningitidis og anvendes til at immunisere små børn (Davies, J.Immunol. 33:1, 1937, Monto m.fl., J.Inf.Dis. 127:394, 1973).

Kemisk svækkede levende mikroorganismer har også været anvendt som vacciner i den kendte teknik. Denne fremgangs-15 måde til fremstilling af vacciner repræsenteres f.eks. af arbejdet af Wilson i amerikanske patentskrifter nr. 3.907.987 og 3.975.517. Wilson fremstillede en levende bakterievaccine mod coliform enteritis hos dyr af udvalgte stammer af Escherichia coli, der blev behandlet med fortyndet forma= 20 lin for at gøre dem mindre virulente. Bauer m.fl., amerikansk patentskrift nr. 4.058.599, beskriver fremstillingen af inaktive, men immunogene mikroorganismer, som blev behandlet med ethylenimin og derfor gjort mindre smitsomme. Den kemiske behandling af hele mikroorganismer kan alvorligt 25 skade deres immunogene ydeevne og kan i mange tilfælde ikke nedsætte virulensen så meget som ønsket.

En anden teknik til at svække virulensen af levende mikroorganismer, samtidig med at de får lov at bevare immunogen ydeevne, er udviklingen af avirulente eller langsomt vok-30 sende stammer eller mutanter, som er ude af stand til vedvarende gendannelse i værten. Sådanne mutanter vil, hvis de er godt valgt, bevare den fulde integritet af celleoverfladens bestanddele, som er nødvendig til specifik antistof-induktion, men vil alligevel være ude af stand 35 til at forårsage sygdom, fordi de 1) ikke kan producere virulensfaktorer, 2) vokser for langsomt eller 3) slet 4

DK 16149 2 B

ikke vokser i værten. Mange forskellige af sådanne genetiske varianter er blevet anvendt til at fremstille bakterielle og virale vacciner. ·

Smith (amerikansk patentskrift nr. 3.364.117), Hillman (amerikansk 5 patentskrift nr. 4.133.875) og Germanier (amerikansk patentskrift nr.

3.856.935) har alle beskrevet vaccinestammer, der har tabt | evnen til at forårsage sygdom, formodentlig på grund af j mutationer i gener, der er ansvarlige for produktionen af | virulensfaktorer. Den af Smith (supra) beskrevne vaccine j 10 omfattede en "grov" variant af Salmonella cholerasuis, som var dårligt karakteriseret med undtagelse af dens tab af virulens i svin. Da mutanten er grov, er overfladeegenskaberne ændret og er derfor ikke virkeligt repræsentative for antigenerne af den patogene form. Hillman (supra) be-15 skrev en godt karakteriseret mutantstamme af Streptococcus mutans, som har en mutation på et enkelt punkt i det strukturelle gen som koder for enzymet L(+)-laktat dehydrogenase. Denne mutantstamme producerer en lav mængde syre og kan potentielt erstatte den normale Streptococcus mutans, 20 der producerer en høj mængde syre, i den orale flora for at nedsætte forekomsten og alvoren af tandcaries hos mennesker. Germanier (supra) beskrev en mutantstamme af Salmonella typhi, som bærer en enkelt mutation (karakteriseret som en udsletning), der dybtgående påvirker udtrykket af 25 gener,som indkoder de galaktose-metaboliserende enzymer.

Disse genér findes i en klynge i en enhed, gal operon, som indkoder oplysningen til syntese af 3 enzymer, uridin di= phosphorgalaktose-4-epimerase, galaktose-l-phosphat uridy= lytransferase og galaktokinase. Udsletningen i denne stam-30 me er forekommet i epimerasegenet, som forhindrer produktionen af ethvert funktionelt epimerase-enzym. Karakteristisk udøver en sådan udsletning også stærke polære virkninger på de distale gener i operon (Martin m.fl., Cold Spring Harbor Symp., Quant.Biol. 31:215, 1966), hvorfor 35 niveauerne af galaktokinase og galaktose-l-phosphat uridy= ly1-transferase er kendeligt reduceret i denne stamme. Udsletninger er i reglen stabile, og der er ikke påvist no- 5

DK 161492 B

gen revertanter af denne stamme. Sådanne galE-mutationer forårsager imidlertid ændringer i overflade-egenskaberne ved at forhindre den fuldstændige dannelse af lipopoly= saccharid-sidekæderne. Selve de strukturer, der er an- 5 svarlige for at inducere type-specifikke antistoffer, kompromitteres derfor. Desuden kan galE-mutationer resultere i autolyse og derved kompromittere evnen hos vaccinestammen til at producere forlænget immunologisk stimulering.

10 Influenza-og åndedræts-syncytiale virus-mutantstammer, der formerer sig langsomt ved menneskets legemstemperatur (37°C), og som derfor er ude af stand til at forårsage sygdom, er blevet fremstillet (Murphym.fi., J.Inf.Dis. 128:479, 1973, og Chanock m.fl., Pediatr.Res. 11:264, 1977). Disse enkel-15 te mutationsstammer har vist sig at producere så mange virulente revertanter i vaccinen, at de ikke er praktiske.

Der findes ingen rapporter om langsomt voksende bakteriemutantstammer, der er egnede til brug som vacciner, men de samme begrænsninger, som gælder for de langsomt voksende 20 virusstammer, ville også gælde for dem.

To klasser mutanter har været anvendt til at fremstille vaccinestammer, som overhovedet ikke formerer sig i værten. Den første klasse indbefatter stammer, der er afhængige af usædvanlige næringsstoffer eller vækstfaktorer (forbindel-25 ser uden for vaccinens biokemi) for at kunne formere sig, som beskrevet af Levine (J.Inf.Dis. 133:424, 1976) og Reitman (J.Inf.Dis. 117:101, 1967). Disse forskere beskriver stammer af Salmonella typhi og Salmonella typhosa, der kræver streptomycin for at vokse. Formodentlig er struk-50 turen af ribosom-proteiner i disse stammer modificeret, således at streptomycin kræves for at give rigtig ribosom-funktion. Disse stammer har dog ikke tilstrækkeligt genetisk stabilitet til at gøre dem virkeligt sikre som vacciner.

DK 161492 B

6

Den anden klasse indbefatter stammer, der er ude af stand til at formere sig over visse temperaturer, som beskrevet af Fahey & Cooper (Infeet.Immun. 1:263, 1970), Maheswaran (amerikansk patentskrift nr. 3.885.408) og Helms m.fl. (J.lnf.Dis.

5 135:582, 1977). Temperaturfølsomme stammer af Salmonella j enteritidis, Pasteurella multocida og Streptococcus pneumoniae blev isoleret og delvis karakteriseret af disse forskere. Stammerne var ude af stand til at vokse ved legemstemperaturen hos de dyr, hvori de blev afprøvet, men var ud- 1 10 mærkede immunogener, da overflade-egenskaberne af cellerne var uændrede. Betydelig reversion til virulens har dog udelukket deres anvendelse til mennesker og andre dyr.

Reversions-problemet, der står i forbindelse med forsøg på at anvende temperaturfølsomme stammer som vacciner, synes 15 at være en naturlig begrænsning for denne metode. Dette er, fordi dens mutationer er et resultat af enkelte base-ændringer og derfor udviser betydelig spontan reversion.

På lignende måde har reversion (til virulens) også givet et problem med hensyn til sikkerheden ved at anvende ge-20 netisk svækkede virale stammer som vacciner (Henderson m.fl., J.A.M.A. 190:41, 1964, Chanock ml.fl. Pediatr.Res. 11:264, 1977, og Murphy m.ml., J.lnf.Dis. 128:479, 1973).

For at overvinde dette problem har den kendte teknik undersøgt ydeevnen som vaccine af virusstammer, der indeholder 25 to vækstsvækkende mutationer (Murphy m.fl., Virology 88:231, 1978, og Murphy m.fl.. Infect.Immun. 23:249, 1979). I disse stammer var to mutationer af forskellig fænotype kombineret med forventning om, at hyppigheden af reversion ville aftage.

30 To metoder har været anvendt til at kombinere multiple ts (temperaturfølsomme) mutationer i én stamme. Først mutageniserede Chanockm.fi. (Pediatr.Res. 11:264, 1977) en stamme af åndedræts-syncytial-virus, som allerede indeholdt en anden ts læsion. Den første mutation blokerede næsten fuldstændigt virusformering 7

DK 161492 B

ved 39°C; den anden mutation begrænsede alvorligt formering ved 37°C, og derfor kunne den dobbelte mutantstamme kendes.

En anden metode under anvendelse af neutral in vivo rekom-binering blev beskrevet af Murphy m.fl. (Virology 88:231, 5 1978). De konstruerede en dobbelt ts stamme af influenza virus ved at coinficere celler med to virusstammer, den ene indeholdende en mutation med en afskæringstemperatur på 37°C, og den anden indeholdende en mutation i et andet gen med en afskæringstemperatur på 38°C, og isolere rekombi-10 nerede virusser blandt afkommet. Den logiske begrundelse for fremstilingen af disse stammer var, at de fremkomne isolater ville indeholde to vækstbegrænsende mutationer, den oprindelige mutation som alvorligt begrænser formering ved 38 eller 39°C, og en anden mutation, som alvorligt be-15 grænser formering ved eller over 37°C. Ved temperaturer på 39°c eller derover begrænser begge mutationer alvorligt virusformering, og revertanter er yderst sjældne (som antydet ovenfor). Ved 37°C, den normale menneskelige legemstemperatur, vil imidlertid kun én af de to mutationer be-20 grænse væksten, og virusen vil fænotypisk kun udtrykke én mutation, hvilket resulterer i en reversionsfrekvens, der er lig med den for 37°C-mutationen alene. Dobbelt-ts mutantstammer, hvor temperaturafskæringspunkterne ikke er de samme, kan også producere betydelige antal revertanter af en 25 af ts mutationerne, hvis de formeres ved temperaturer nær ved den nedre afskæringstemperatur. Disse temperaturer er semi-betingende og giver et stærkt selektivt tryk for revertanters overvækst af den oprindelige stamme.

Anvendelse af multiple mutationer har ikke været anvendt 3° til fremstilling af en bakteriel vaccinestamme, men Curtiss har konstrueret en stamme af Escherichi coli, som er svækket ved inkorporering af multiple mutationer af forskellig fænotype, til gen-kloning (Ann.Rev.Microbiol. 30:507, 1976). Den vigtige faktor i dette arbejde var at producere en stam- O c J me, som ikke kunne overleve uden for et specialiseret miljø, tilvejebragt i laboratoriet. Mindst én af mutationerne

DK 161492B

8 indført i stammen/ forårsager faktisk selvødelæggelse af cellen, når den forsøger at vokse uden for det definerede specialiserede miljø. Curtiss har foreslået, at denne stamme kunne anvendes til at klone genet eller ge-5 nerne til et bakterielt toxin, som så kunne masseproduceres til vaccineanvendelse (ibid, side 510, linie 26-28).

Endvidere beskriver britisk patentbeskrivelse 1.516.458, offentliggjort den 5.juli 1978 i England, denne mikroorga- j nisme, Escherichia coli K-12 1776,og de mange mutationer, '

X

10 som er blevet indført i den for at gøre den sikker til produktion i stor målestok af prokaryotiske eller eukary-otiske proteiner (f.eks. cholera toxin eller insulin) eller organiske syrer (f.eksi ravsyre eller mælkesyre, produceret ved forgæring af glukose). Patentbeskrivelsen 15 beskriver på side 4 brugen af mikroorganismer, der er blevet udelukket fra vækst eller kolonisering i naturlige økologiske nicher. Hovedvægten af patentbeskrivelsen er imidlertid rettet mod konstruktion af bakteriestammer, indeholdende forskellige mutationer, der medfører mange for-20 skellige fænotyper i én stamme. Ulempen ved at anvende en sådan metode til konstruktion af vaccinestammer diskuteres nedenfor.

Kombination af to mutationer af forskellig fænotype i en enkelt stamme vil kun være effektiv til at nedsætte revertant-25 frekvensen, når begge mutationer samtidig er restriktive.

Dette argument er lige så anvendeligt på temperaturfølsomme vækstfaktor- eller virulensfaktor-mutationer, alene eller i kombination. For at opnå nedsat reversionsfrekvens ved at kombinere to eller flere mutationer i en enkelt stamme 30 skal mutationerne ideelt bibringe identiske fænotyper for at sikre, at de altid arbejder sammen.

9

DK 161492B

Det er derfor et formål med fremgangsmåden ifølge opfindelsen at tilvejebringe en sikker vaccine, baseret på levende, genetisk svækkede bakterielle mikroorganismer. Dette opnås ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen ved ændring af en virulent 5 bakteriestamme ved indføring deri af to eller flere mutatio ner, som overfører samme temperaturfølsomme fænotype, som undertrykker vækst ved normal legemstemperatur, således at stammen svækkes genetisk ved, at stammen gøres avirulent, samtidig med at stammen får lov at bevare immunogenicitet.

10

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen kan være baseret på stammer, der indeholder to eller flere temperaturfølsomme mutationer, som har identisk afskærings- eller restriktiv temperatur, eller på stammen, der vedligeholder antigen integritet og for- 15 bliver intakte efter administration, eller på stammer, som er i stand til i det mindste begrænset formering i værten for at efterligne igangsætningen af normal infektion.

Opfindelsen angår endvidere en bakteriestamme til brug ved 20 fremgangsmåden ifølge opfindelsen, hvilken stamme er ejendommelig ved, at den indeholder mindst to forskellige mutationer af samme temperaturfølsomme fænotype, der undertrykker vækst ved normal legemstemperatur, hvilken stamme er gjort avirulent under bevarelse af immunogenic itet.

25

En mere fuldstændig forståelse af opfindelsen og mange af de ledsagende fordele derved kan let fås, når denne bedre forstås under henvisning til følgende detaljerede beskrivelse, betragtet i forbindelse med tegningerne, hvor 30 fig. 1 beskriver trinene i fremgangsmåden, der anvendes til at isolere ts mutanter af H. influenzae, fig. 2 beskriver den almene strategi, der anvendes til at 35 lokalisere og karakterisere ts læsioner i muterede stammer af H. influenzae, fig. 3 beskriver vækstkurverne for den multiple mutantstamme DK 161492 Βίο- A214-A/3-C2/13 (o) og den vilde type 001 (n) ved 29°C, fig. 4 beskriver vækstkurverne for den multiple mutantstamme A214-A/3-C2/13 (o) og den vilde type 001 (®) efter temperaturskift fra 29°C til 34°C, 5 fig. 5 beskriver vækstkurverne for den multiple mutantstamme A214-A/3-C2/13 (o) og den vilde type 001 (n) efter temperaturskift fra 29°C til 36°C.

BEDSTE FREMGANGSMÅDE TIL UDFØRELSE AF OPFINDELSEN.

De væsentlige egenskaber af vacciner er, at de: (1) effek-10 tivt inducerer beskyttende immunitet i den vaccinerede, (2) ikke frembringer sygdom og (3) ikke har giftige bi virkninger. Andre ønskelige egenskaber af vacciner indbefatter: (1) manglende evne til at etablere bærertilstande for kommunieerbare patogener, (2) billig og enkel frem- 15 stilling, (3) stabilitet og (4) let administration. Vaccinepræparaterne, der er beskrevet i den foreliggende opfindelse, tilfredsstiller alle disse krav, idet de: (1) an vender hele celler, hvis overfladeantigener er identiske med dem af patogenet, mod hvilket der søges immunitet, hvor-20 for de har høj immunogen ydeevne og derfor gør lave doser effektive og formindsker de dosisafhængige giftige bivirkninger, (2) anvender genetisk svækkede, levende celler, der ikke kan forårsage sygdom hos den vaccinerede, (3) er væsentligt fri for virulente former af patogenet 21 25 (mindre end én virulent celle pr. sekstillion [10 ] vaccine organismer) og (4) kan dyrkes, oplagres og administreres ved standard-mikrobiologiske og-immunologiske metoder.

Specielt beskriver opfindelsen en fremgangsmåde til fremstilling af sikre, effektive, levende vaccinestammer. Dette 30 er blevet opnået ved at kombinere multiple, svækkende mutationer af identisk fænotype i på anden måde normale patogene stammer, således at stammen gøres avirulent i den normale vært.

11

DK 161492B

FORDELE VED LEVENDE, GENETISK SVÆKKEDE VACCINER.

En fordel ved at arbejde med levende mutant-mikroorganismer i modsætning til isolerede antigene komponenter er, at det, i det mindste for mutationer, som ikke påvirker celleoverflade og ekstra-cellulære antigene komponenter, giver sik-5 kerhed for tilstedeværelse af alle væsentlige strukturelle træk, der er nødvendige til vellykket induktion af antistofsyntese i værten. Det er velkendt, at det detaljerede, tredimensionale arrangement af det antigen-kombinerende sted er højst specifikt og nødvendigt for antistofs.moleky-10 lære genkendelse af antigen. (Rabat, Structural Concepts in

Immunology and Immunochemistry, Holt, Rinehart & Winston, Inc., 1968, kapitel 6). Hvis det tredimensionale,molekylære arrangement af den antistof-inducerende vaccine ikke er så nært som muligt ved det molekylære arrangement af antigener-15 ne fra den inficerende mikroorganisme, vil de antistoffer, der dannes mod den inducerende vaccine, ikke være meget vellykkede over for udfordringen. Disse antistoffers begærlighed efter de "naturlige" antigener vil med andre ord være lille. Hvis vaccinen er antigent identisk med mikro-20 organismerne, som vil frembyde den endelige smitte, er begærligheden hos antistofferne, dannet mod vaccinen og derfor også mod patogenets antigener, tilsvarende meget høj.

Vaccinerne fremstillet ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen giver også den specielle fordel at vedligeholde den naturligt 25 iboende hjælpeevne af hele celler. Styrkelsen af immunogenici-teten af visse antigener . (f.eks. polysaccharider) med andre cellekomponenter er vel-dokumenteret. Den foreliggende opfindelse udnytter denne egenskab maksimalt.

En anden særlig fordel ved den foreliggende opfindelse er, 30 at vacciner, fremstillet af stammer med de rigtige svækken de mutationer, kan vokse i modtageren og efterligne naturlig infektion.

DK 161492 B

12 SÆRLIGE TRÆK VED OPFINDELSEN.

Det vigtigste element i opfindelsen er, at mikroorganismerne har multiple mutationer af samme fænotype i samme stamme. Dette træk skaber, en beskyttelse mod reversion i af den muterede stamme til den virulente form. Dette gi-5 ver også en løsning på det længe erkendte behov for genetisk svækkende, bakterielle vacciner. Den genetiske ustabilitet af virale· og bakterielle mutanter har længe været en af de alvorligste forhindringer for vidtstrakt anvendelse af genetisk svækkede stammer som vacciner. Den fore-10 liggende opfindelse har opnået et gennembrud i denne henseende og åbner døren for omfattende brug af mutantstammer som vacciner. Den overvinder problemet med reversion i muterede stammer ved at reducere den effektive reversions- frekvens af sådanne stammer til uanselige niveauer (mindre -20 15 . end 10 ). Dette er blevet opnået ved at inkorporere multiple uafhængige mutationer,som bibringer samme fænotype/ i en enkelt stamme. De to eller flere uafhængige mutationer, der anvendes, gør stammen ude af stand til at forårsage sygdom i værten. Reversionsgraden af én stamme, inde-20 holdende multiple mutationer af samme fænotype, er produktet af reversionsfrekvenserne af de individuelle mutationer.

Hvis tre mutationer, hver med en reversionsfrekvens på ca.

—7 10 , kombineres, vil der fås en stamme med en reversions- -21 grad på 10 . Dette betyder, at hvis hver mand, kvinde 25 og barn, dér i øjeblikket findes på jorden, og alle fremtidige generationer blev immuniseret med en sådan vaccine under anvendelse af en dosis på en million organismer pr.

vaccine, ville kun ét individ i de næste 10 millioner år 15 (10 mennesker) blive udsat for en virulent revertant.

13

DK 161492 B

VALG AF SVÆKKENDE MUTATIONER.

En vigtig side ved løsningen af reversionsproblemet, som den foreliggende opfindelse frembyder, er, at alle mutationerne påvirker funktioner, som ikke kan korrigeres under værtens normale fysiologiske tilstande. Potentielt 5 indbefatter sådanne mutanter (1) dem, der ikke producerer virulensfaktorer i værten, (2) dem, der afhænger af tilstedeværelsen af vækstfaktorer, der normalt ikke findes i værten, og (3) dem, der er ude af stand til at opretholde formering ved legemstemperaturen hos værten.

10 Den første gruppe, de der ikke producerer virulensfaktorer i værten, kan defineres som mutanter, der er ude af stand til at frembringe funktionelle virulensfaktorer under nogen betingelser eller under værtens fysiologiske betingelser. Sådanne mutanter kan f.eks. kun producere ugiftige, men im-15 munogene fragmenter af et toxin, men ikke producere noget toxin ved værtens legemstemperatur eller kan være ude af stand til at producere toxin under nogen betingelser. Sådanne mutanter ville også indbefatte stammer, der er ude af stand til at producere faktorer, der er nødvendige til vævs-20 invasion. Sådanne mutanter ville også indeholde stammer, der er ude af stand til at producere pili, der kræves til vedhængning ved dyreceller (kolonisationsfaktorer), omend det må erkendes, at sådanne vaccinestammer derved kan lide tab af vigtige antigener og miste evnen til at overleve 25 i det område, der er nødvendigt for at alarmere immunsystemet.

Den anden gruppe kan deles i to klasser: Først de mutanter, der er ude af stand til at syntetisere mellemliggende meta-boliter, der er unikke for prokaryotiske organismer. Et eksempel er diaminopimelinsyre (DAP), en forbindelse, der 30 ikke findes i eukaryotiske organismers biokemi, men som er et væsentligt mellemprodukt i biosyntesen af cellevægmateriale hos mange bakterie-arter. I fravær af DAP lyser sådanne stammer som følge af cellevækst. For det andet de mu- 14

DK 161492B

tanter, som kræver visse forbindelser, der ikke metaboli-seres, men er væsentlige for vækst. Mutantstammer, som kræver streptomycin, falder i denne klasse.

Den tredie gruppe, temperaturfølsomme (ts) mutanter, inde-5 holder læsioner, som ikke tillader vedligeholdt formering af organismen ved værtens legemstemperatur. Når disse læsioner direkte påvirker væsentlige funktioner såsom transskription, translation eller transport, kan de ikke korrigeres af andre miljøfaktorer end temperatur. Temperaturfølsom-1° me mutationer, der påvirker væsentlige funktioner, har derfor en klar fordel fremfor vækstfaktor-afhængige mutationer, da der altid er en chance for, at unikke mikrobielle meta- j boliter kunne tilføres af værtsfloraen eller ved iatrogen j mellemkomst.

15 Specielt kan temperaturfølsomme mutationer deles i fire klasser: (1) de, der bevirker, at væksten standser "øjeblikke ligt" ved overførsel til den ikke-betingende temperatur, (2) de, der begrænser væksthastigheden ved den ikke-betingende temperatur, (3) de, der vokser og lyser, og (4) de, der 20 ikke har nogen eller kun ringe umiddelbar virkning på vækst, men afslutter vækst efter et antal celledelinger ved den restriktive temperatur. Den første klasse tillader nøjagtig kontrol med antallet af organismer, der anvendes til at vaccinere detenkelte individ, men da væksten "straks"afsluttes 25. efter vaccination, kan den immunogene ydeevne af vaccinen kompromitteres, fordi tidligere trin i sygdomsprocessen ikke kan efterlignes. Den anden klasse af ts mutationer, de der tillader langsom vækst ved den restriktive temperatur, kan give længere tids eksponering for de mikrobielle antigener, 20 men da sådanne stammer kan formere sig ad infinitum ved den· restriktive temperatur, findes der ingen måde til at eliminere den mulighed, at den vaccinerede vil blive udsat for virulente revertanter. Den tredie klasse af ts mutationer, de der bevirker lyse ved den restriktive temperatur, kan 35 forårsage fjernelse af vaccine-organismerne, før immunsyste- 15

DK 161492 B

met har en chance for at reagere på deres tilstedeværelse.

Den fjerde klasse af ts mutationer, de der i begyndelsen tillader "normal" formering efter overførsel til den restriktive temperatur, men fuldstændigt blokerer vedlige-5 holdt formering i den vaccinerede, kan anvendes til at producere vaccinestammer, som efter vaccination kan igangsætte normale infektionsprocesser, men som ikke kan forårsage sygdom.

Det væsentligste træk ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen er, at alle mutationerne i en given stamme bibringer samme fænotype. Dette træk er vigtigt, fordi det giver sikkerhed for, at alle de inkorporerede mutationer samarbejder. Der er derfor garanti for, at den effektive reversionsfrekvens altid er produktet af reversionsfrekvenserne af de individuals elle læsioner. For yderligere at udvikle dette punkt bærer de bakterielle vacciner fremstillet ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen multiple (d.v.s. to eller flere) mutationer, hvor hver uafhængig mutation bibringer .samme fænotype. I en udførelsesform ifølge opfindelsen kan en bakterie f.eks. bære to 37°C ts læsioner, 20 ts.^ og ts2< Den fremkomne mikroorganisme er ude af stand til at vokse ved 37UC eller højere temperaturer. Uden at være bundet til nogen speciel teori menes det, at en sådan bakterie sandsynligvis har to forskellige mutationer, der påvirker to forskellige proteiner, der er væsentlige for vækst, 25 protein^ og protei^. I den multiple mutantstamme er intet af proteinerne funktionelt ved 37°C eller højere temperaturer, men begge proteiner er funktionelle ved lavere temperaturer. Hvis ts^ mutationen skulle revertere spontant, ville det producerede protein^ være funktionelt ved 37°C. Da ts2 ikke har 30 reverteret, forbliver protein2 imidlertid ufunktionelt ved 37°C, og væksten og formeringen af revertanten er derfor stadig begrænset ved 37°C. Først når t^ og t2 begge har reverteret, vil cellen producere funktionelt protein-^ og protein2 og genvinde evnen til vækst ved 37°C. Den samme model kan 35 anvendes på andre mutationer såsom antibiotika-afhængige mutationer eller lignende. Opfyldelsen af dette krav (identiske fænotyper) kan være praktisk vanskelig, f.eks. med mul-

DK 161492B

16 tipie streptomycin-afhængige mutationer, når alle læsionerne skulle ligge i samme gen. En sådan stamme ville ikke blot være teknisk vanskelig at konstruere, men i tilfælde af j in vivo genetisk ombytning kunne inkorporering af et lille 5 stykke DNA også eliminere alle mutationerne. Der er ikke nogen sådan begrænsning for temperaturfølsomme mutationer, da 1 multiple læsioner kan fordeles bredt i det genetiske materiale. Sandsynligheden for korrektion af læsionerne reduceres derfor med produktet af sandsynlighederne for in vivo 10 genetisk korrektion af hver individuel læsion. Sandsynligheden for, at dette sker (in vivo genetisk rekombinering) med vidt adskilte mutationer er så ringe, at den ikke udgør noget problem (Curtiss, Ann.Eev.MiSrobiol. 30:507, 1976).

ISOLERING AF MUTANTSTAMMER.

15 Stammer indeholdende svækkende mutationer kan opstå, enten som spontane derivater eller efter mutagen behandling. Mutagen behandling kan anvendes, ikke blot på· hele organismer, men også på DNA, som indeholder relevant genetisk information (forudsat at DNAet derpå inkorporeres i den hele orga-20 nisme). Når mutationen bibringer en selekterbar fænotype, kan mutantderivaterne isoleres og identificeres ved standardgenetisk teknik. Mutationer, som bibringer en fænotype, der kun kan spores ved specialiseret teknik, kan identificeres ved__at anvende en sådan teknik (se f.eks. Maas m.fl., Proc.

25 Nat.Acad.Sci. 75:1384, 1978). Detaljerede beskrivelser til isolering af mutantstammer, hvis formering er temperaturfølsom, gives i næste afsnit.

KONSTRUKTION AF MULTIPLE MUTANTSTAMMER.

Et vigtigt træk ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen er, at de mul-30 tipie mutationer, som kanbineres i en vaccinestamme, bibringer samme fænotype. Den omstændighed, at hver mutation udviser identisk fænotype, udelukker direkte selektion af multiple mutantstammer, da der ikke er nogen simpel måde til at skelne mellem enkelte 17

DK 161492B

og multiple mutant-isolater. Opfindelsen har løst dette problem ved at isolere individuelle mutant-stammer indeholdende enkelte svækkende mutationer og derpå overføre disse mutationer i en enkelt stamme (ved genetisk overføring 5 og rekombinering). For at lette påvisningen af stammer, som har inkorporeret den eller de ønskede svækkende mutationer, bliver hver anvendt svækkende mutation genetisk bundet til en let selekterbar og mærkbar (d.v.s. som kan forsynes med mærke) "ikke-svækkende" allel. De bundne 10 markører selekteres i stammekonstruktionerne, og derpå afprøves den samtidige inkorporering af den eller de ønskede svækkende mutationer blandt rekombinanterne.

To klasser fænotype egner sig til udnyttelse til en sådan stammekonstruktion: (1) auxotrofi - et strengt krav til 15 en aminosyre eller næringsfaktor og (2) kromosomal modstandsevne - mutationer som overfører modstandsevne mod udvalgte midler (f.eks. antibiotika, coliciner eller bak-teriofag).

Mutanter, der repræsenterer begge de ovennævnte fænotyper, 20 kan isoleres på simpel måde og anvendes til positiv genetisk selektion (f.eks. prototrofi - behovet for en næringsfaktor er "kureret", eller modstandsevne - evnen til at vokse i nærværelse af et baktericidt middel). Svækkede mutanter isoleres af auxotrofe eller vilde stammer. Passende 25 selekterbare markører indføres som en del af kortlægningsproceduren. Stammer med svækkende mutationer bundet til selekterbare markører anvendes til de følgende konstruktioner. Rekombinanter, som har potentielt inkorporeret de svækkende mutationer, identificeres først ved selektion 30 af den bundne selekterbare markør. Vellykket ledsagende overføring af den svækkende mutation bekræftes ved udvinding af mutationen af rekombinanten (se det følgende afsnit med henblik på detaljeret beskrivelse af sådanne fremgangsmåder) .

DK 161492 B

18 MEKANISMER TIL GENETISK OVERFØRING OG REKOMBINATION.

Der er fire anerkendte mekanismer til overføring af gener (DNA) fra én bakteriecelle til en anden, der kan anvendes til 5 at fremstille vacciner ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen: (1) transformation - nøgen DNA fra celle "A" optages af celle "B" og inkorporeres i kromosomet i celle "B" (Alexander & Ldidy, J.Ex.Med. 97:17, 1953), (2) transduktion - viruspar tikler indeholdende DNA fra celle "A" slutter sig til celle 10 "B" og "injicerer" DNA i celle "B", hvor det inkorporeres i kromosomet i celle "B", hvor det inkorporeres i kromosomet i celle "B" (Lennox, Virology 1:190, 1955), (3) konjugation - celle "A" og celle "B" kommer sammen, og DNA fra celle "A" går ensrettet fra celle "A" ind i celle "B" og inkorporeres i kro-15 mosomet i celle "B" (Wollman m.fl., Cold Spring Harbor Symp.

Quant Biol. 21:112, 1964) og (4) fusion - celler "A" og "B" behandles kemisk, der sker fusion af de to celler, og DNA fra "A" og "B" befinder sig forbigående i samme celle, før der sker rekombinering (Fodor & Alfodi, Proc.Natl.Acad.Sci.

20 73:2147, 1976). In vitro rekombinering af genetisk information kan opnås ved isolering af DNA'er, enzymatisk spaltning og indsætning af "A" i "B" og derpå omdannelse af celler med hybridet DNA. Enhver af eller alle disse mekanismer kan anvendes til at flytte gener blandt bakterier.

25

Andre fremgangsmåder ifølge opfindelsen til fremstilling af de bakterielle vacciner er in vitro mutagenese af specifikke DNA-molekyler (Bautz-Freese & Freese, Virology 13:19, 1961), de novo gen-syntese (Khorana, Science 203:614, 1979) og konst-ruk-30 tion af muterede gener ved rekombi nerende DNA-teknologi. Selv om disse metoder er i deres barndom, er det muligt at forudse selektiv og specifik fremstilling af et gen med to eller flere veldefinerede base-ændringer på DNA-niveauet. Et sådant godt karakteriseret gen kan så genindføres i bakteriekromosomet og 35 derved resultere i skabelse af en veldefineret mutant. Hvis to eller flere baseændringer vælges således, at de producerer to eller flere forskellige mutationer af samme fænotype, vil den

DK 161492 B

19 fremkomne bakterie være blandt dem, der omfattes af fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse.

FORDELE VED HOVEDSTAMMEN.

5

En af de større fordele ved den foreliggende opfindelse er, at teknikken kan anvendes til at indføje multiple mutationer af samme fænotype i en "grov" stamme af f.eks. Streptococcus pneumoniae, og derefter kan de indkapslede gener for hver kli-10 nisk betydningsfuld serotype (og der er mindst fjorten) omdannes til "hoved"-stammen til fremstilling af en vaccinestamme for hver. Den multiple mutantstamme fremstillet ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen er faktisk en "grov" variant af H. influenzae, og det forudses, at denne stamme ikke blot kan an-15 vendes som vaccine til at beskytte mod infektion med en sådan "ikke-typificerbar" H. influenzae (de fleste tilfælde af otitis media i små børn forårsages således af "grov" H. influenzae), men at den også kan modificeres ved omdannelse med de indkapslede gener for b-serotypen og gøre den egnet som en 20 vaccine til beskyttelse mod influenzal meningitis.

OPLAGRING.

En af fordelene ved fremgangsmåden ifølge den foreliggende op-25 findelse er, at vaccinen let kan fremstilles, lyofiliseres i nærværelse af passende indifferente, ugiftige bærere beskrevet i det følgende i medicinflasker og lagres ved stuetemperatur uden tab af styrke. Der kræves intet køleudstyr eller specielt 1 age.rudstyr.

30 KVALITETSKONTROL.

Sammensætningen af vaccinepræparater skal være kendt og konsekvent. Dette opnås ved at anvende nærmere angivne mængder af 35 kval itetskontrollerede kemiske og biologiske bestanddele til deres fremstilling. Fremgangsmåder til kvalitetskontrol af kemiske komponenter er velkendt og vil ikke blive diskuteret 20

DK 161492B

her. Kemisk renhed i vaccinepræparater defineres som frihed for giftige spildprodukter eller cellenedbrydningsprodukter og generende eller falske immunogene materialer. Dette sikres ved at arbejde med rene kulturer (vaccinestammen fri for andre 5 celler eller virus) og høste cellerne, medens kulturen er i den logaritmiske fase af væksten (før syntese af autolytiske enzymer). Opsamling og vask af cellerne fra mediet ved fysiske metoder (centrifugering) ville efterlade lavmolekylære urenheder i den overliggende væske.

10

Fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse har visse fordele med hensyn til kvalitetskontrol af de biologiske komponenter af vaccinen. Standard-teknik kan anvendes til at overvåge den generelle biologiske renhed af præparater (frihed 15 for forurenende virus eller bakterier). De særlige fordele ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen vedrører det andet niveau af biologisk renhed, som må opretholdes - genetisk renhed. Den vigtigste faktor for opretholdelse af genetisk renhed ved formering af genetisk svækkede vaccinestammer er valget af svæk-20 kede mutationer. Det er væsentligt, at sådanne mutationer ikke begrænser hastigheden eller omfanget af vækst af stammerne under alle betingelser, der anvendes til vedligeholdelse, forsøgsproduktion eller produktion i stor målestok. Dette sikrer, at når der opstår revertanter, vil de ikke have nogen selektiv 25 vækstfordel frem for vaccinestammen og vil derfor ikke vokse mere end vaccinestammen i nogen fase af deres dyrkning under betingede omstændigheder. Fremkomsten af revertanter kan overvåges ved at udplade en del af kulturen under ikke-betingede forhold. Vedligeholdelsen af de svækkede mutationer inkorpore-30 ret i vaccinestammen kan kontrolleres ved at redde disse mutationer fra en prøve af celler, taget fra et vaccinepræparat.

35 21

DK 161492 B

ADMINISTRATION.

Vaccinerne fremstillet ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen kan administreres til ethvert varm- eller.koldblodet dyr, der er udsat for infektion med patogene mikroorganismer. Mennesker og dyr kan have fordel heraf som værter.

5 Administration kan være parenteral, men fortrinsvis oral eller intranasal, afhængende af den naturlige infektionsvej. Til husdyr f.eks. kan vaccinen administreres oralt ved inkorporering af vaccinen i foder eller drikkevand.

Den dosis, som administreres, kan være afhængig af alder, 10 helbred og vægt af modtageren, arten af en eventuel ledsagende behandling og karakteren af organismen. I almindelighed vil en dosering af aktiv bestanddel være fra ca.

10^ til 10^ celler pr. applikation pr. vært. Den foretrukne dosis til intranasal administration ville i almindelig- g 15 hed være ca. 10 organismer, suspenderet i 0,05 - 0,1 ml af en immunologisk indifferent bærer. Peroral administration af en vaccinestamme af f.eks. Salmonella typhi, udviklet i overensstemmelse med fremgangsmåden ifølge opfindel- 6 8 sen, ville sandsynligvis kræve 10 - 10 organismer, suspen- 20 deret i 1 - 2 ml af f.eks. skummet mælk. Vaccinerne kan anvendes i doseringsformer som kapsler, flydende opløsninger, suspensioner eller eliksirer til oral administration eller steril væske til præparater såsom opløsninger eller suspensioner til parenteral, intranasal eller topisk anven-25 delse. Fortrinsvis benyttes en indifferent, immunologisk acceptabel bærer såsom saltopløsning, saltopløsning med phosphatstødpude eller skummetmælk.

APPLIKATION.

Enhver bakterie, der er i stand til at frembringe infektions-30 sygdom, kan svækkes genetisk ved fremgangsmåderne ifølge opfindelsen og give en nyttig og sikker vaccine.

22

DK 161492 B

Den foreliggende opfindelse angår bakterielle mutationer, da det er let at konstruere de ønskede (rekombinerede) mutantstammer. Tabel 1 viser almindelige bakterieinfektioner og de mikroorganismer, der forårsager dem. Listen skal ikke 5 betragtes som værende udtømmende, men er blot eksempler på det store antal bakterier, der kan udnyttes. Værterne kan være mennesker eller dyr.

10 TABEL 1.

Nogle almindelige bakterieinfektioner.

Sygdom Bakterie

Meningitis Haemophilus influenzae

Neisseria meningitidis

Tuberkulose Mycobacterium tuberculosis 15 Fjerkrækolera Pasteurella multocida

Pertussis Bordetella pertussis

Pest Pasteurella pestis

Miltbrand Bacillus anthracis

Septicemia, lungebetændelse Pseudomonas aeruginosa 20 Tyfus Salmonella typhi

Lungebetændelse Streptococcus pneumoniae

Mycoplasma pneumoniae Staphylococcus aureus

Coliform enteritis Escherichia coli

Dental caries Streptococcus mutans

Kolera Vibrio cholerae " \ 25 Gonorrhé Neisseria gonorrheae

Efter denne generelle beskrivelse af opfindelsen kan en mere fuldstændig forståelse opnås under henvisning til de efterfølgende eksempler.

30

DK 161492 B

23 FREMSTILLING AF EN VACCINE MOD H.INFLUENZAE-INFEKTION. Baggrund.

Haemophilus influenzae type b er hovedårsagen til endemisk meningitis hos børn (Haggerty & Ziai, Adv.Ped. 13:129, 1964, 5 Wehrle m.fl., Pediatrics 44:991, 1958, og Smith & Haynes, Pediatrics 50:723, 1972) og en betydende årsag til fatal epiglottitis, obstruktiv bronchiolitis, otitis media, septisk arthritis, laryngitis, cellulitis og lungebetændelse hos både børn og voksne. H.influenzae forårsager også me-10 ningitis hos voksne. Mindst 10.000 tilfælde af meningitis,der skyldes H.influenzae type b, forekommer årligt i U.S.A. Hurtig diagnose og behandling med ampicillin eller chloramphe= nicol fører i reglen til helbredelse. Dødeligheden er imidlertid forblevet på 5 - 10%, og et betydeligt antal (30 - 50%) 15 af dem, der helbredes, lider permanent neurologisk skade.

Den nylige fremkomst af et plasmid, der formidler lægemiddelmodstandsdygtighed hos H.influenzae type b, har kompromitteret terapi med antibiotika i de områder, hvor det er fremkommet (Center for Disease Control, Morbidity and Mortality 20 Weekly Rep. 23:77, 1974). Forudgående tilfælde af hurtig spredning af sådanne plasmider verden over viser, at antibiotika i løbet af kort tid ikke længere vil være effektive til bekæmpelse af H.influenzae - infektioner. Spektret af totalt antibiotika-resistent H.influenzae type b sammen med 25 den store forekomst af alvorlige permanente neurologiske følger gør det bydende nødvendigt at udvikle nye fremgangsmåder til bekæmpelse af infektioner ved denne organisme.

De i øjeblikket til rådighed stående rensede polysaccharid-vacciner til H.influenzae er ikke effektive til meget små 20 børn - de der mest sandsynligt vil bukke under for denne organisme. Behovet for en effektivt sikker vaccine mod H.influenzae er derfor akut.

DK 161492 B

24

En rekombineret stamme af H.influenzae, indeholdende tre ts mutationer, der overfører samme fænotype, blev fremstillet under anvendelse af transformation, som beskrevet i den foreliggende opfindelse.

5 Materialer og metoder.

)

De følgende forkortelser anvendes i den følgende beskrivelse af fremstillingen af en vaccine mod H.influenzae-infektion.

-A/b, antibiotikum BHI, hjerne-, hjerte-infusion 10 cfu, koloni-dannende enhed DMSO, dimethylsulfoxid

DNA, desoxyribonukleinsyre R S

Em 7 , erythromycin-resistent, -følsom g, gram R c 15 Km 7 , kanamycin-resistent, -følsom 1, liter mg, milligram ml, milliliter

NAD, nikotinamid-adenin-dinukleotid R S

20 Nal 7 , naladixinsyre-resistent, - følsom

R S

Nb 7 , novobiocin-resistent., -følsom NG, nitrosoguanidin, N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin

PRP, polyribophosphat R S

Rif 7 , rifamycin-resistent, -følsom 25 RR, reversionshastighed

R S

Sm 7 , streptomycin-resistent, -følsom ts, temperatur-følsom.

μ, mikron μg, mikrogram 30 μΐ, mikroliter

R S

Vm 7 , viomycin-resistent, -følsom

DK 161492 B

25

Bakterier. To grundstammer af H.influenzae blev anvendt til dette arbejde. Den grove type d-stamme (stamme 001) og et derivat, der er resistent mod antibiotikaene Em, Km, Nb,

Sm, Vm og Nal (stamme EKNSVNal). Stamme 001 (ATCC nr. 31517) 5 og EKNSVNal udviser begge de egenskaber, der er beskrevet for H.influenzae i Bergey's Manual of Determinative Bacteriology (7.udgave, .1957), side 406-408 - de er gramnegative stænger, 0,2-0,3 x 0,5-2,0 mikron, der forekommer enkeltvis og i par, lejlighedsvis i korte kæder. De kræver vækst-10 faktorerne nikotinamid -adenin-dinukleotid og hemin. EKNSVNal er blevet deponeret i ATCC og har nr. 31514.

Vækstmedier. H.influenzae blev passeret rutinemæssigt på hjerne/hjerteinfusion (BHI) (2,5% w/v)agar, suppleret med hemin (20 ug/ml) og NAD (10 yg/ml) eller chokolade-agar. Fly-15 dende kulturer blev dyrket i suppleret BHI-suppe. Selektive udpladninger skete på suppleret BHI-agar, indeholdende det ønskede antibiotikum.

Mutagenese, berigelse og isolation. Fremgangsmåden, der blev fulgt til isolering af ts mutanter af H.influenzae (001 og 20 EKNSVNal) er vist på figur 1. Da det kan være nødvendigt at kolonisere den øvre åndedrætskanal med vaccinestammen, i det mindste forbigående, for at alarmere immun-systernet, blev der søgt to typer ts mutant. Den klassiske "tætte" mutant, der ophører med formering umiddelbart efter over-25 føring til den ikke-betingende temperatur, blev rutinemæssigt isoleret ved at følge den fremgangsmåde, der er beskrevet på figur 1. Mutanter, der "overlever" i 2 eller 3 generationer efter overføring til den restriktive temperatur, blev isoleret ved at udsætte tilsætningen af antibiotikum.

30 Mutanter med afskærings-temperaturer på 32 - 36°C blev også søgt ved at variere temperaturerne, ved hvilke berigelserne blev udført.

26

DK 161492 B

Indledende karakterisering af mutanter. Ts mutanterne, isoleret ved de ovenfor beskrevne fremgangsmåder, blev undersøgt for at bestemme temperatur-afskæringspunkterne ved at danne stregkulturer på chokolade-agarplader og inkubere ved 5 27, 30, 32, 34 og 36°C. De mutanter, som voksede langs den primære streg, men som var ude af stand til at danne enkelte kolonier ved den restriktive temperatur, blev betegnet som "overlevere". Klassiske "tætte" mutanter var naturligvis ude af stand til overhovedet at vokse over deres 10 temperatur-afskæringspunkt.

Reversionshastighederne af de enkelte mutantstammer blev be-stemt ved at udsprede 1-2 x 10 celler på chokolade-agarplader, der blev inkuberet ved den restriktive temperatur. "Overlevere" i væskekultur blev altid inkuberet ved den re-15 striktive temperatur i en time før udpladning.

"Overlevernes" evne til at fortsætte vækst efter overføring til den ikke-betingende temperatur blev undersøgt i væske-kultur, og "overlevelse" og endelig standsning blev overvåget ved absorbans ved 660 nm og kvantisering af koloni-dannen-20 de enheder.

Genetisk kortlægning. Lokalisering af ts mutationerne på H.in-fluenzae-kromosomet blev udført ved en række transformationer. Den alment anvendte strategi er vist på figur 2. DNA fra stammen EKNSVNal blev anvendt til at omdanne nye ts 001-25 derivater, og transformanter blev udvalgt på suppleret BHI- agar, indeholdende det ønskede antibiotikum. Antibiotikum resistente rekombinanter blev derpå udstreget på duplikerede plader, som blev inkuberet ved de betingende og ikke-betingende temperaturer. Hvis ts mutanten i en 001-mutant 30 blev "kureret" ved erhvervelse af et gen, der bibringer f. eks. Sm-resistens, blev mutanten antaget at være bundet til Sm-resistens-genet.

Det omvendte forsøg blev også udført - EKNSVNal DNA blev an-vendt til at omdanne ts 001-stammer, og ts fænotypen blev

DK 161492B

27 + udvalgt. Ts rekombinanterne blev så masrket for erhvervelse af antibiotikum-resistens-gener ved kopieret udpladning på suppleret BHI-agar, indeholdende de ønskede antibiotika.

På lignende måde blev ts EKNSVNal-mutanter omdannet med 001-5 DNA, og genskabelse af ts fænotypen i rekombinanterne blev overvåget for ledsagende tab af antibiotikum-resistens. DNA fra ts EKNSVNal-stammer blev anvendt til at omdanne 001, der blev selekteret for antibiotikum-resistens ved 27°C, og rekombinanter blev sorteret for temperatur-følsomhed.

10 Transformation. Pladeteknikken, der er udviklet af Juni (Appl.Microbiol. 27:16, 1974) og modificeret af Clark m.fl. (Abstracts, A.S.M. Annual Meeting, 1977), blev anvendt til alle omdannelser, efter at indledende forsøg bestemte, at fremgangsmåden var effektiv ved temperaturer så lave som 27°C.

g 15 DNA blev fremstillet ved at lyse celler (1-2 x 10 /ml), suspenderet i suppleret BHI-suppe, indeholdende 0,02% SDS, og præparatet blev steriliseret ved opvarmning til 60°C i 15 minutter. Natgamle pladekulturer af de modtagende bakterier blev udsmurt på frisk chokolade-agar og grundigt 20 blandet med én dråbe DNA, afgivet fra en 0,1 ml pipette. Pladerne blev inkuberet i 3 timer (når ts+ rekombinanter blev søgt) eller 7-18 timer (når der ønskedes antibiotikum-resistente transformanter) ved 30°C, og transformanter blev udstreget på chokolade-agar eller suppleret BHI-agar, 25 indeholdende det ønskede antibiotikum. Disse plader blev så inkuberet ved 36°C i førstnævnte tilfælde og ved 27°C i sidstnævnte tilfælde.

Rensning af mutant-alleler. Selv om NG er et udmærket mutagen, kan dets tendens til at inducere yderligere muta-30 tioner, både tæt bundet til og fjernt fra det gen, der har interesse (Adelbergm.fi., Biochem.Biophys.Res.Comm. 18:788, 1965, og Hirota m.fl., J.Mol.Biol. 35:175, 1968), forårsage problemer. Det er derfor ønskeligt, at, når først den udvalgte mutation er blevet anset for egnet, overføres den 28

DK 161492 B

fra den mutageniserede "snavsede" stamme til en "ren" baggrund. Når ts mutationerne var blevet kortlagt, og binding etableret til antibiotikum-resistens-markører, blev generne derfor transformeret i 001. DNA fra ts mutanterne, ud-5 viklet i EKNSVNal, blev anvendt til at omdanne 001 og transformanterne udpladet på suppleret BHI-agar, indeholdende det ønskede antibiotikum. Antibiotikum-resistente rekombinanter blev derpå sorteret for tilstedeværelse af ts genet. Reversionshastighederne af ts mutationen blev 10 bekræftet. De ts derivater af 001, hvis mutanten var'blevet lokaliseret nær ved antibiotikum-resistens-genet, blev først gjort antibiotikum-resistente ved at transformere den egnede markør-form, den "rene" EKNSVNal til stammen, og overvåge bevarelse af temperaturfølsomhed. Det A/b -ts 15 bundne gen blev så transformeret til den "rene" 001-stamme.

På denne måde blev begge sider af de antibiotikum-resistens-bundne ts gener renset for "forurenende" mutationer, induceret af nitrosoguanidin-behandling.

Endelig stammekonstruktion. 001-stammerne, som bærer de "rene" 20 ts gener, blev kombineret ved transformation under anvendelse af de ønskede antibiotika til selektion. Dobbelt-rekombinanter blev først undersøgt for en reduktion i reversionshastighed. Tilstedeværelse af det andet ts gen blev bekræftet ved at udvinde det ved en anden transformation til en ts+ stamme.

25 Tredobbelte rekombinanter kunne kun undersøges ved udvinding af de tre ts gener i adskilte transformationer.

Resultater.

Enkelte mutant-isolater. Ved at følge det på figur 1 viste skema blev der selekteret tre stammer, som indeholdt "over-30 levende" ts mutationer, bundne til selekterbare markører, og som udviste passende reversionsfrekvenser og afskæringstemperaturer. Deres egenskaber er anført i tabel 2.

DK 161492 B

29 TABEL 2.

Mutant-derivater af stammer 001 og EKNSVNal.

Afskærings- Reversions-

Nr. temperatur Binding hastighed A/3 34°C KmR 6 x 10~8 5 A214 34°C SmR 1 x 10"8 C2/13 34°C EmR 1 x ΙΟ-7

Rekombinantstammer. De tre ts mutanter blev kombineret i en enkelt stamme ved transformationer i rækkefølge. A214 blev først transformeret med A/3 DNA, Km -rekombinanter blev ud- 1° valgt og analyseret for nedsatte reversionsfrekvenser. Til-

R

stedeværelsen af ts mutanten bundet til Km blev bekræftet ved at anvende DNA fra rekombinanten til at transformere 001. Vedligeholdelse af ts mutanten bundet til Sm blev bekræftet på lignende måde. DNA fra stammen C2/13 blev an- vendt til at transformere rekombinant-A214~A/3-stammen £ til Em . Tilstedeværelsen af alle tre ts mutanter blev bekræftet ved at udvinde dem i separate transformationer af 001 (som ovenfor beskrevet). Reversionshastighederne af disse stammer er anført i tabel 3.

20 Både den dobbelte og den tredobbelte rekombinantstamme er blevet deponeret i American Type Culture Collection som henholdsvis stamme nr. 31515 og 31516. Stammernes vidnesbyrd er identisk med det af udgangsstammerne med følgende ændringer: Vækst er optimal ved 29°C, hæmmet ved 34°C og begrænset til 25 to afdelinger ved 36°C. Stammen er resistent over for antibiotikaene kanamycin, streptomycin og erythromycin.

Claims (8)

1. Fremgangsmåde til fremstilling af en bakterievaccine, ; 25 kendetegnet ved ændring af en virulent bakteriestamme ved indføring deri af to eller flere mutationer, som overfører samme temperatur-følsomme fænotype, som undertrykker vækst ved j normal legemstemperatur, således at stammen svækkes genetisk I ved, at stammen gøres avirulent, samtidig med at stammen får DK 161492 B lov at bevare immunogenicitet.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at stammen er H. influenzae. 5

3. Fremgangsmåde ifølge Krav 1 eller 2, kendetegnet ved, at stammen er H , influenzae A 214- A/3, ATCC 31515.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 1-3, kendetegnet 10 ved, at stammen er H. influenzae A 214 - A/3 - C2/13, ATCC 31516.

5. Bakteriestamme til brug ved fremgangsmåden ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den indeholder mindst to for- 15 skellige mutationer af samme temperatur-følsomme fænotype, der undertrykker vækst ved normal legemstemperatur, hvilken stamme er gjort avirulent under bevarelse af immunogenicitet.

5 A/3 6 x 10"8 - I C2/13 1 x 10“7 -_16 A214-A/3 3 x 10” 9 6 x 10 A214-A/3-C2/13 3 x 10“9 6 X 10-23 Indkapsling af hovedstammen. Rekombinantstammen udgør en 10 hovedstamme, der er egnet til brug som vaccine over for ikke- typificerbare stammer af H.influenzae,og kan ved transformation med DNA, der indkoder generne, der er ansvarlige for kapseldannelse, modificeres til at producere vaccinestammer j mod enhver og alle de seks serotyper af H.influenzae. Denne ! 15 modifikation af hovedstammen kan opnås ved at fremstille DNA af en indkapslet stamme, anvende dette DNA i en transformationsblanding som ovenfor beskrevet og udplade rekombi-nanterne på suppleret BHI-agar, indeholdende antiserum for det ønskede indkapslede polysaccharid - de indkapslede re-20 kombinanter kan identificeres ved tilstedeværelsen af en "ring" af antigen/antistof-udfældning omkring kolonierne. Patentkrav . \

6. Stamme ifølge krav 5, kendetegnet ved, at bak-20 terien er H. influenzae.

7. Stamme ifølge krav 5 eller 6, kendetegnet ved, at bakterien er H. influenzae A 214 - A/3, ATCC 31515.

8. Stamme ifølge krav 5-7, kendetegnet ved, at bakterien er H. influenzae A 214 - A/3 - C2/13, ATCC 31516. 30 35