KR100527070B1 - 치주염의진단및치료용포르피로모나스긴기발리스항원 - Google Patents

치주염의진단및치료용포르피로모나스긴기발리스항원 Download PDF

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Abstract

Porphyromonas gingivalis에 대한 면역반응을 일으키는 데에 사용되는 조성물에 관한 것이다. 상기 조성물은 적절한 애쥬번트 및/또는 허용가능한 캐리어 및 하나의 실질적으로 정제된 P. gingivalis 면역원을 포함한다. 면역원은 항원 1, 항원 2, 항원 4 및 그 분획을 함유하는 에피토프로 구성되는 군에서 선택되며, 상기에서
항원 1은 P. gingivalis의 항원이고 내부 아미노산 서열: 을 가지며,
항원 2는 P. gingivalis의 항원이고 내부 아미노산 서열: 를 가지며,
항원 3은 P. gingivalis의 항원이고 내부 아미노산 서열: 를 가지며,
항원 4는 P. gingivalis의 항원이고 내부 아미노산 서열:

Description

치주염의 진단 및 치료용 포르피로모나스 긴기발리스 항원
본 발명은 박테리아성 치주질환 및 심장혈관계 질환에 관련된 포르피로모나스 긴기발리스(Porphyromonas gingivalis)의 발병 작용의 억제에 사용되는 구강용 조성물 및 면역원성 조성물에 관한 것이다. 또한 본 발명은 잇몸내 플라크(subgingival plaque) 시료에서 Porphyromonas gingivalis의 존재 및 P. gingivalis 항원에 대한 특이적 항체에 대한 진단 테스트에 관한 것이다. 이 조성물은 Porphyromonas gingivalis의 특이적 항원의 단백질, 펩티드 또는 올리고펩티드 또는 펩티드 키메라(chimera)를 포함한다. 또한 재조합 DNA 및/또는 생화학적 기술을 이용하여 항원, 펩티드 성분 및 펩티드 키메라를 제조하는 방법도 개시되어 있다. 상기와 관련된, 특이적 항원을 엔코딩하는 DNA 서열, 및 주요한 에피토프를 포함하는 항원 구조체를 발현시키는 데에 유용한 재조합 벡터도 개시되어 있다. 또한 상기한 재조합 벡터로 형질전환된 호스트 세포도 개시되어 있다. 단백질, 펩티드, 올리고펩티드 및 펩티드 키메라는 면역반응을 일으키는 데에 사용되는 제형의 면역원으로서 유용하고, 수동면역화에 유용한 단백질-특이성 및 펩티드-특이성 항혈청을 생성하기 위하여 사용하고 진단 분석의 시약으로 사용될 수 있다. 개시된 뉴클레오티드 서열은 P. gingivalis 유전물질이 검출되고 및 유전적 백신 제형으로서 사용하기 위한 발현 벡터로 혼입되는 진단 분석의 시약으로 사용될 수 있는, 해당 올리고뉴클레오티드의 합성을 위하여 제공된다.
치주질환은 치아의 지지조직의 박테리아-관련 염증성 질환이고, 잇몸 조직의 비특이적이고 가역적인 염증으로 상대적으로 병세가 경미한 형태의 치은염(gingivalis)으로부터 치아 지지 조직의 파괴를 특징으로 가지는 더욱 중대한 형태의 치주염(periodontitis)까지의 범주를 모두 포함한다. 치주염은 특이적인 그램-음성 박테리아 군집의 잇몸내 전염과 관련이 있으며, 이것은 치주조직을 파괴하여 주요한 공중 건강 문제로 대두된다. 가장 관심을 끄는 박테리아는 Porphyromonas gingivalis로서, 성인 치주염의 병변에서 이 미생물의 회수율이 잇몸내의 혐기적으로 배양되는 생물적 기생균(floral)의 50%까지 도달할 수 있고, 반면에, 건강한 부위에서는 P. gingivalis가 낮은 비율로 거의 회수되지 않는다. 잇몸내 플라크(plaque)에서 P. gingivalis 레벨이 비례적으로 증가하는 것은 치주염 통증의 증가와 관련이 있으며, 배양가능한 잇몸내의 미생물 집단에서 이 미생물을 박멸하는 것은 이들 질환의 분석에 의하여 달성된다. 인간이 아닌 영장류 동물에서의 치주염 병변의 진행은 P. gingivalis의 잇몸내의 이식으로 해명되었다. 동물 및 인간 모두의 이러한 발견은 성인 치주염의 발생에 있어서 P. gingivalis의 주요한 역할을 시사한다. 아테로마성(atheromatous) 플라크에서의 P. gingivalis가 존재하는 것은 심장혈관계 질환의 발병과 관련되어 있다.
P. gingivalis는 흑색으로 착색되며, 혐기성, 비당분해성(asaccharolytic), 단백분해성(preteolytic)의 그램-음성 간균(rod)으로, 특정 아미노산의 대사로부터 에너지를 얻는다. 이 미생물은 철에 대한 절대적인 성장요구인자를 가지며, 바람직하게는 헴(heme) 또는 그 Fe(Ⅲ) 산화생성물인 헤민(hemin)의 형태이며, 과잉의 헤민의 조건하에서 성장할 때는 실험동물 내에서 강한 독성을 띤다. 많은 독성 인자는 캡슐, 부착인자(adhesin), 세포독소(cytotoxin) 및 세포외 가수분해효소를 포함한 P. gingivalis의 병원(病原)에 포함될 수 있다. P. gingivalis 콜론화(colonisation)를 방지하는 효능이 있고 안전한 백신을 개발하기 위하여, 중화 항체를 생성하는 면역원으로서 유용한 독성과 관련된 단백질 항원을 동정하는 것이 필요하다.
본 발명자들은 DNA 프로브 분석에서 나타난 바와 같이 잇몸내 플라크에 P. gingivalis가 잠복한 건강한 피검체의 혈청을 이용하여 4개의 주요한 P. gingivalis 항원을 정화하고 특정하였다. 항원(Ag1, Ag2, Ag3 및 Ag4)은 하기와 같이 나타내었다.
따라서, 본 발명의 제1양태에서, Porphyromonas gingivalis에 직접 대항하는 면역 반응을 일으키는데 사용되는 조성물로 이루어지는 것으로, 상기 조성물은 적절한 애쥬번트 및/또는 수용가능한 캐리어 및 실질적으로 정화된 P. gingivalis 면역원을 포함하는 것으로, 상기 면역원은 항원 1, 항원 2, 항원 3, 항원 4 및 그의 분획을 함유하는 에피토프로 이루어진 군에서 선택되는 것이다. 조건적으로, 상기 조성물은 적어도 하나의 추가의 정화된 P. gingivalis 면역원을 추가로 포함할 수 있고, 상기 면역원은 항원 1, 항원 2, 항원 3, 항원 4 및 그의 분획을 함유하는 에피토프로 이루어진 군에서 선택되는 것이다.
본 발명의 제2 양태에서는, 실질적으로 정화된 P. gingivalis 항원 또는 그의 분획을 함유하는 에피토프로 이루어지는 것으로, 항원은 다음과 같은 내부 아미노산 서열을 가진다:
. 도 1에 도시된 바와 같은 아미노산 서열을 가지는 항원이 바람직하다.
본 발명의 제3 양태에서, 실질적으로 정화된 P. gingivalis 항원 또는 그의 분획을 함유하는 에피토프로 이루어지는 것으로, 항원은 다음과 같은 내부 아미노산 서열을 가진다: .
본 발명의 제4 양태에서, 실질적으로 정화된 P. gingivalis 항원 또는 그의 분획을 함유하는 에피토프로 이루어지는 것으로, 항원은 다음과 같은 내부 아미노산 서열을 가진다: . 상기 항원이 다음과 같은 아미노산에 해당하는 변질 프로브로 하이브리다이징하는 AGAL에 수탁번호 NM 97/04974로 기탁된 클론의 오픈리딩프레임에 의하여 엔코딩되는 아미노산 서열을 포함하는 조성물 것이 바람직하다:
.
본 발명의 제4양태에서, 실질적으로 정화된 P. gingivalis 항원 또는 그의 분획을 함유하는 에피토프로 이루어지는 것으로, 항원은 다음과 같은 내부 아미노산 서열을 가진다: .
본 발명의 다른 양태에서, Ag1, Ag2, Ag3 및 Ag4를 엔코딩하는 뉴클레오티드 서열 및 이들 서열로 하이브리다이징하는 프로브로 이루어진다.
Ag1을 엔코딩하는 뉴클레오티드 서열 및 헴 수용체 단백질 Ag1의 아미노산 서열은 도 1에 도시되어 있다. 이 뉴클레오티드 서열의 개시는 변질 균등성의 범위 내를 포함하고 P. gingivalis W50 의 항원적인 판단에 해당하는 아미노산 서열에 대해서 계속적인 코팅을 포함한다.
Ag3에서 뉴클레오티드 서열을 함유하는 클론인 DnaK 클론 #6은 부다페스트 조약에 따라서 1997년 3월 25일에 오스트레일리아 NSW 핌블 수아킨 스트리트 1의 오스트렐리아 정부 분석 연구소(Australian Government Analytical Laboratory)에 기탁되었고, 수탁번호 NM 97/04974로 번호가 책정되었다. 따라서, 이 항원의 추가적인 뉴클레오티드 서열은 이 기탁을 수탁하여 얻어질 수 있다. 이 기탁물을 수탁하는 것은 부다페스트 조약하에서 가능하다. 이 기탁물에 대한 적용가능한 수탁은 독립적인 전문가에 제한된다(EPC Rule 28(4). AU Reg.3.25(3)).
본 발명의 다른 양태는 본 발명의 항원에 대항하여 발생되는 항체로 이루어진다.
상기 항원에 대한 항체는 이 항원을 중성화하는 치약 및 세구제와 같은 구강용 조성물에 사용될 수 있으므로, 질병을 예방한다. 항원 특이적 항체는 진단용 분석에 의해서 잇몸내 플라크에서 P. gingivalis의 조기 진단을 가능하도록 사용될 수도 있다. 이들 항원에 기초한 백신 및 적당한 애쥬번트는 코의 스프레이, 구강으로, 또는 주사로 투여되어 이들 항원에 대한 특이적 면역반응을 일으켜서 P. gingivalis의 콜론화 및 독성화를 감소하거나 질병을 감소한다. 본 발명의 항원 단백질 및 항원 펩티드(본 명세서에서는 "펩티드"로 칭함) 및 항원 올리고펩티드(본 명세서에서는 "올리고펩티드"로 칭함), 및 다른 에피토프와 용융된 하나의 항원 에피토프를 함유하는 항원 키메릭 펩티드(본 명세서에서는 "키메릭펩티드"로 칭함)들이 프로필락틱 및/또는 치료용 백신제제에서 면역원; 또는 P. gingivalis 특이적 항체의 혈청 타이터에서 증가량을 측정하여 P. gingivalis 감염의 측정을 하는 진단용 면역분석에서 항원으로 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 항원 단백질, 펩티드, 올리고펩티드 및 키메릭 펩티드는 수동 면역치료에 유용할 수 있는 항원특이적 항체를 생산하는 데 사용될 수 있고, 잇몸내의 플라크 시료와 같은 의학적 표본에서 P. gingivalis의 존재를 탐지하는 진단분석용 시약으로 사용할 수 있다. 펩티드, 올리고펩티드 또는 키메릭 펩티드는 화학적 합성, P. gingivalis 배양물에서 정제로 얻어지거나 본 명세서에서 개시되는 핵산 서열을 사용한 재조합 벡터 발현 시스템에서 생산될 수 있다.
따라서, 본 발명의 다른 양태는 항원 Ag1, Ag2, Ag3 및 Ag4의 어느 하나 또는 조합물에 대해서 발생되는 항원을 포함하는 치약 및 세구제를 포함하는 구강용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 양태는 항원 Ag1, Ag2, Ag3, 및 Ag4의 어느 하나 또는 조합에 대해 발생되는 진단 분석용 항원을 포함하는 P. gingivalis의 조기진단법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태는 본 명세서에서 P. gingivalis 항원의 어느 하나에 대한 혈청 타이터에서 증가량의 측정을 포함하는 P. gingivalis 감염의 검사방법을 제공한다.
본 발명의 다른 양태는 항원 구조물 및 플라스미드 DNA와 인간 바이러스, 동물 바이러스, 곤충 바이러스와 같은 바이러스 DNA 또는 발현된 단백질 또는 펩티드가 정제될 수 있는 것으로부터 적절한 호스트 세포에서 항원 단백질, 펩티드, 올리고펩티드 또는 키메라 펩티드의 발현에 사용될 수 있는 박테리오파지를 포함하는 벡터를 포함하는 신규한 DNA 서열의 구조에 관한 것이다. 본 발명의 또 다른 양태는 항원 Ag1, Ag2, Ag3 및 Ag4를 엔코딩하는 유전자 및 항원 펩티드 또는 올리고펩티드 또는 키메라 펩티드를 엔코딩하는 유전자 분획의 분자클로닝 방법을 제공한다. 본 발명의 핵산 서열은 증폭 및 증폭된 핵산을 검출하는 데에 프라이머 및/또는 프로브로 사용하기 위한 항원 서열-특이성 올리고뉴클레오티드의 합성을 포함하는 핵산 하이브리다이제이션을 통한 P. gingivalis 유전물질의 분자 진단 분석에 사용될 수 있다. 또한, 항원 단백질, 펩티드, 올리고펩티드, 키메라 펩티드 및 에피토프를 포함하는 항원성 구조물은 면역원이 P. gingivalis로부터 화학적으로 합성되고, 정제되거나 재조합 발현 벡터 시스템으로부터 정제되었든지 아니든지, P. gingivalis의 병원성 균주에 대한 예방 및/또는 치료 백신 제형에서 면역원으로서 사용될 수 있다. 선택적으로 항원을 엔코딩하는 유전자 또는 펩티드 또는 올리고펩티드 또는 키메라 펩티드를 엔코딩하는 하나 또는 그 이상의 유전자 분획은 그 자체에 의한 각 항원의 하나 또는 그 이상의 면역원성 에피토프, 또는 다른 항원 또는 다른 병원성 미생물의 면역원성 에피토프와의 조합을 생성하도록 가공된 재조합 박테리아 또는 바이러스를 포함하는 박테리아 또는 바이러스 백신으로 합체될 수 있다. 게다가 항원 또는 펩티드 또는 올리고펩티드 또는 키메라 펩티드를 엔코딩하는 하나 또는 그 이상의 유전자 분획을 엔코딩하는 유전자는 방어적인 면역 반응을 유도하도록 항원을 관련시키는 단백질, 펩티드, 올리고펩티드 또는 키메라 펩티드를 발현하도록 인간에 직접 도입될 수 있다. 또한 백신은 적절한 벡터로 합체되고, 벡터를 포함하는 적절한 형질전환된 호스트(예를 들면, E. coli, Bacillus subtilis, Saccharomyces cerevisiae, COS 세포, CHO 세포 및 HeLa 세포)에서 발현되는 돌연변이 항원의 재조합 성분을 기초로 할 수 있다. 백신은 항원을 발현하는 재조합형의 박테리아가 구강의 공생체 서식처인 경구내 재조합 박테리아 백신을 기초로 할 수 있다. 전체 P. gingivalis 세포 또는 다른 이전에 제조한 항원과는 달리, 여기에 기재된 4개의 항원은 P. gingivalis-관련 치주질환의 방지용 백신의 제조에 대하여 안전하고 효과적인 항원이다.
본 발명의 다른 양태는 Porphyromonas gingivalis에 대한 면역반응을 일으키는 데에 사용되는 조성물로 구성되며, 조성물은 적절한 애쥬번트 및/또는 허용가능한 캐리어 및 하나의 P. gingivalis 면역원을 엔코딩하는 서열을 포함하는 DNA 분자를 포함하고, 상기한 면역원은 항원 1, 항원 2, 항원 3, 항원 4 및 그 분획을 포함하는 에피토프로 이루어진 군에서 선택된다. P. gingivalis는 헴의 형태가 바람직한 Fe을 절대적인 성장 요건으로 가진다. 상기한 Ag1이 특별한 관심의 대상으로 특이성 항체에 의한 이 헴 수용체의 중화는 헴 업테이크를 방지하여 성장 및 독성을 방지한다. 헴이 제한된 성장한 P. gingivalis는 동물 모델에서 덜 독성이 있다.
선모(fimbriae)는 가늘고, 세포를 완전하게 덮거나 막대기상 중 하나의 사상 구조로 되어 있다. 적어도 두 개의 섬모 형태가 확인되었다: 접합 브리지의 형성에 의한 유전물질의 전달에 관계된 것과 연조직 및 경조직에의 점착에 관계된 것이다. 접합에 관계된 이 선모는 성모(sex pili)라고 칭한다. 이들 모는 유전적으로 양립할 수 있는 수령 박테리아에 부착시키기 위한 특이적 수용체를 가지고 있다. 두 번째 선모 형태로, 특이하거나 일반적인 형태의 선모는 진성세균의 진핵세포에 대한 공응집(coaggregation) 및 점착과 관계가 있으며, 흔히 식균작용(phagocytosis)의 방비 및 호스트 조직의 침략에 중요한 역할을 한다. Enterobacteriaceae에서, 선모는 약 17 내지 21kDa의 단백질의 반복되는 서브유니트로 구성된다. 또한 소수 단백질도 선모 구조의 부분이다. 특이한 선모 결합 단백질(부착인자)은 흔히 28 내지 31kDa이고 선모의 끝 또는 주기적으로 길이 방향을 따라서 위치한다.
요시무라 등(Yoshimura et al.)은 P. gingivalis 상의 선모의 존재를 논증한 최초의 사람 중의 하나로 그들은 다른 그램-음성 박테리아의 선모와 아미노산 서열 상동성이 없는 43kDa의 핌브릴린(fimbrilin)을 정제하였다. 젠코(Genco)와 공동연구자들은 43kDa 선모 단백질 및 핌브릴린의 C-말단에 해당하는 합성 펩티드가 타액으로 코팅된 히드록시아파티트(hydrozyapatite)에 대한 P. gingivalis 381의 점착성을 감소시킨다는 것을 밝혀내었다. 그 이후의 연구에서 그들은 재조합 핌브릴린이 스타더린(statherin) 및 프롤린이 풍부한 타액 단백질에 특이적으로 결합한다는 것을 밝혀내었다. 43kDa 단백질로 레트를 면역화하는 것은 P. gingivalis 381에 감염되어 유도된 치주 조직의 파괴를 방지하였다. 더욱이, P. gingivalis 381과 착생으로 불활성된 43kDa의 핌브릴린을 엔코딩하는 fimA 유전자의 동질유전자형(isogenic) 돌연변이는 야생형 균주와 비교할 때 레트 모델에서 치주 조직 파괴를 상당히 적게 생성할 수 있었다. 그러나 본 연구에서 fimA 돌연변이체가 여전히 모의 감염된 동물에서 발생한 것보다 크게 치주 조직 파괴를 생성한다는 것에 주목해야 한다. fimA 돌연변이체는 타액으로 코팅된 히드록시아파티트와의 결합이 감소된다고 하더라도 다른 경구 박테리아와 적혈구의 공응집물을 응집(agglutinate)시키는 능력을 손상시키지 않았다. 독립적인 연구에서 하마다 등(Hamada et al.)도 삽입적으로 불활성된 유전자의 동종 재조합에 의하여 P. gingivalis ATCC 33277의 fimA 돌연변이체를 생성하였으며, 돌연변이체가 긴(0.5 내지 1.0㎛) 선모를 발현시키지 못하더라도, 전자 현미경에 의하여 2차 선모 형태의 존재를 시사하는 가늘고 짧은 선모 구조를 여전히 관찰할 수 있다는 것을 언급하였다.
43kDa의 핌브릴린의 동정 및 43kDa 단백질과 관련된 독성 및 면역화 연구는 P. gingivalis 균주 381 및 ATCC 33277로 수행하였다. 이들 균주는 비침략성으로 분류되었으며, 동물 모델의 감염 과정에 기초한 침략성 균주보다 덜 독성인 것으로 여겨진다. 비침략성 균주는 공격된 부위에 국부적인 종기를 생성하는 데에 반하여 동일한 접종물의 침략성 균주는 먼 부위까지 퍼지고 다수의 종기를 생성한다. 더욱이, 선드퀴비스트 등(Sundqvist et al.)은 비침략성 균주(381 및 ATCC 33277)는 탐식(phagocytose)되며 다형핵 백혈구(polymorphonuclear leukocyte)에 의하여 많이 사멸되는 데에 반하여 침략성 균주 W50 및 W38은 불충분하게 탐식되며 사멸된다. 나이토 등(Naito et al.)이 침략성 및 비침략성 P. gingivalis 균주의 선모에 차이가 있다는 것은 주목할 만하다. 이들 연구자들은 비침략성 균주의 선모는 콜라겐으로 코팅된 히드록시아파티트(HA)의 다수가 결합된 반면에 침략성 균주에서 얻은 선모는 콜라겐으로 코팅된 HA에 약하게 결합되어 있다. P. gingivalis 침략성 균주 W50, W83 및 AJW5는 동물 모델에서 매우 독성이나, 면역세포화학(immunocytochemistry) 및 웨스턴 블롯 분석에서 나타난 바와 같이 43kDa의 핌브릴린을 발현하지 않는다. 그러나 정교한 음성 염색에서 W50 및 W83은 다른 균주보다 덜 조밀하게라도 채상화(fimbriated)된다. 이것은 W50 및 W83이 43kDa 핌브릴린의 부족의 원인이 되는 불활성 fimA 유전자를 소유하나 이들 균주들은 여전히 독성이고 43kDa의 핌브릴린이 부족함에도 불구하고 비침략성이다.
Ag2는 P. gingivalis의 2차 선모 구조 또는 주요 부착인자이다. P. gingivalis W50의 세포 표면 단백질 항원을 정제하고 특성부여하는 연구의 일 부분으로서, 본 발명자는 DNA 프로브 분석에 나타난 바와 같이 P. gingivalis가 잇몸내에 잠복되어 있는 건강한 피검체에서 혈청과 혈청반응하는 46kDa의 선모 단백질(Ag2)의 30kDa 분획을 정제하였다. 30kDa 분획의 내부 아미노산 서열은 Dichelobacter(이전에는 Bacteroides) nodosus의 선모 단백질과 상당히 큰 상동성(48% 동일성)을 보여주었다.
P. gingivalis의 30kDa 분획 DNPDENPLEGDITQTHTEKYVLAED...
D. nodosus 선모 단백질 KGPDANPASGVVGNKDTGKYVLAEI...
D. nodosus 선모 단백질은 Bacteroides spp., Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Acinetobacter calcoaceticus, Eikenella corrodens, Moraxella bovis, Moraxella nonliquefaciens 및 P. aeruginosa를 포함하는 몇 종의 Pseudomonas를 포함하는 일군의 그램-음성 박테리아의 일반적인 선모 형태인 Ⅳ형 또는 mePhe 필린(pilin)으로 분류된다(Elleman, 1988). P. gingivalis의 30kDa 분획은 D. nodosus A-세트 또는 클래스Ⅰ 선모(혈청형 A, B, C, E, F 및 G를 포함)의 중앙 도메인의 보존된 아미노 아실 잔기와 가장 높은 상동성을 보여준다. Ⅳ형 선모의 특성은 그들이 진핵세포 및 적혈구 응집물에 점착한다는 것이다. P. gingivalis의 46kDa 선모 단백질에 존재하는 보존된 헥사펩티드 모티프-KYVLAE-은, 이들 잔기에 대한 항혈청이 이종 모에 의해서조차도 진핵세포에 박테리아의 부착을 방지하고 진핵세포에 결합된 더 큰 펩티드 분획을 침전시키기 때문에 임균성(gonococcal) 모의 수용체 결합 부위에 집중되거나 그 근처에 존재하였다. 그것은 중앙 도메인의 보존된 잔기가 병립(juxtaposed)될 때 진핵세포의 표면 당단백질의 탄수화물 부분과 특이적으로 상호작용하는 열구를 형성한다는 것을 시사하였다.
D. nodosus는 양의 전염성 질환, 지간 피부염(interdigital dermatitis) 또는 부제증(footrot)의 병인학 제제이고, Ⅳ형 선모는 주요한 혈청학 및 면역보호성 독성 인자이다. 부제증 백신은 고도로 특이한 DNA 선모 재조합 백신에 대한 간단한 세균백신(bacterin)에서 나왔다. 초기 전체 세포 백신은 단기의 면역성 및 제한된 혈청형의 합체로 인하여 성공적이지 못하였다. 많은 수의 항원을 검사하였으며, 주요한 방어적 면역원은 Ⅳ형 선모 서브유닛 단백질이었다. 재조합 선모에 기초한 1가의 백신은 장기간 유지되는 면역성을 유발하는 절대적이다. P. gingivalis의 46kDa 선모 단백질 및 D. nodosus 면역보호성 선모 사이의 상동성은 P. gingivalis 단백질(Ag2)이 P. gingivalis에 관련된 치주염을 위한 진단 및 면역예방성 생성물로 사용했다는 것을 시사한다.
세포의 열충격 또는 스트레스 반응은 세포 단백질을 변성시킬 수 있는 온도 상승과 같은 환경적인 스트레스에서 세포가 생존할 수 있게 하는 항상성(homeostatic) 메카니즘이다. 단백질의 DnaK 계통군은 변성되고 부정확하게 접힌 단백질에 결합하고 원래의 구조 및 기능에 대한 재생(refolding)을 용이하게 한다. DnaK 또는 열충격단백질(Heat Shock Protein, HSP) 70은 구성성 세포 단백질의 1-5%을 포함하는 박테리아 및 진핵세포에 공통적인 고도로 보존된 분자 체퍼로닌(chaperonin)으로, 소포(vesicle)와 결합된 E. coli의 DnaK의 15%를 가진다. 스트레스를 가하는 동안 DnaK는 과 발현되어 총 세포 단백질의 30%까지 구성하여 이 단백질을 민감한 면역진단 테스트에 대하여 이상적이 되도록 할 수 있다. 나병(leprosy) 및 결핵에 대한 특이성 진단 테스트는 개별의 DnaK 단백질 동족체를 기초로 개발되었다. DnaK의 모든 종류의 동족체는 C-말단의 반에서 분자의 종-특이성 영역을 가진 단백질의 N-말단의 반에서 고도로 보존된다. 그러므로, P. gingivalis DnaK 동족체(Ag3) P. gingivalis에 관련된 치주염을 위한 진단 및 면역예방성 생성물로 사용하였다.
확인된 4개의 항원(Ag1, Ag2, Ag3 및 Ag4)은 중화 항체를 포함하고 백신 개발에 의한 경구 조성물을 통하여 수동 면역성에 의한 진단 및 중화를 위하여 특별히 관심의 대상이 된다. 특히 내부-경구 재조합 박테리아 백신의 개발을 위하여, 재조합 박테리아가 항원을 발현시키는 곳은 구강의 유전적으로 가공된 공생체 서식처이다. 이들 4개의 항원이 종래에 개시된 P. gingivalis 항원에 대하여 우월한 것은 이들이 주요한 독성-결합된 인자이고, 침략성 균주의 보존된 에피토프를 포함하여 진단 및 면역예방성 생성물의 개발에 이상적이 되도록 한다는 것이다.
이하 하기한 매우 바람직한 실시예를 참고로 하여 상세하게 기술하는데, 실시예는 본 발명을 제한하는 것이 아니라 본 발명의 한 양태를 실시하는 방법을 나타내는 것이다.
4개의 항원 Ag1, Ag2, Ag3, 및 Ag4는 P. gingivalis 세포를 클로로포름 추출, 음이온 교환, 겔 여과 및 역상 크로마토그래피를 실시하여 정제할 수 있다. 그리고 나서 정제된 항원은 표준 기술을 사용하여 다클론성 또는 단클론성 항체를 생성하는 데에 사용된다. 항체 생성에 사용되는 동물은 마우스, 토끼, 염소, 닭, 양, 말, 소등일 수 있다. 항원에 대한 높은 항체 역가가 면역측정법에 의하여 검출 될 때 동물들이 채혈되거나 달걀 또는 우유가 수집되고 혈청이 제조되고 및/또는 표준 기술에 의하여 항체가 정제되고 또는 표준 기술을 사용하고 골수종 세포를 가진 융합 비장 세포에 의하여 단클론성 항체가 생성된다. 항체(면역글로불린 분획)는 배양물 또는 복수액, 혈청, 우유 또는 달걀에서 염석, 겔 여과, 이온 교환 및/또는 친화 크로마토그래피 등에 의하여 분리할 수 있는데, 그 중에서 염석이 바람직하다. 염석 법에서 항혈청 또는 우유를 황산암모늄으로 포화시켜 침전을 얻고, 침전물을 생리식염수로 투석하여 특이성 항체를 가진 정제된 면역글로불린 분획을 얻는다. 바람직한 항체를 말 항혈청 및 송아지 항혈청 및 우유에서 얻는다. 본 발명에서 동물을 항원으로 면역화함으로써 얻은 항혈청 및 우유를 포함하는 항체를 경구 조성물로 혼합된다. 이 경우에 항혈청으로부터 분리되고 정제된 항체뿐만 아니라 항혈청 및 우유도 사용될 수 있다. 이들 물질 각각은 단독 또는 두 개 이상이 조합되어 사용될 수 있다. 항체는 치약 및 세구제(mouthwash)와 같은 경구 조성물에 사용되어 P. gingivalis를 중화시켜 질환을 방지한다. 항체는 잇몸내 플라크 시료에서 의자측 ELISA에 의하여 P. gingivalis 의 초기 검출에 사용될 수 있다.
경구 조성물에서 투여되는 상기한 항체의 양은 0.00 1~50g/Kg/일인 것이 바람직하고, 상기한 항체의 함량은 조성물의 0.0002~10중량%이고, 바람직하게는 0.002~5중량%이다. 상기에서 언급한 혈청 또는 우유 항체를 포함하는 본 발명의 경구 조성물은 치약, 치마제 및 액체 치분(dentifrice), 세구제, 트로치(troch),츄잉검, 치과용 페이스트, 잇몸 마사지 크림, 가글정, 낙농품 및 다은 식료품을 포함하는 치분과 같이 입에 활용할 수 있는 다양한 형태로 제조되고 사용될수 있다. 본 발명에 따른 경구 조성물은 특정 경구 조성물의 유형 및 형태에 따른 잘 알려진 부가의 성분을 더욱 포함할 수 있다.
본 발명의 매우 바람직한 형태에서 경구 조성물은 세구제 또는 린스제와 같이 실질적으로 특성상 액체일 수 있다. 상기한 조제에서 비히클은 전형적으로 물-알코올 혼합물로 바람직하게는 하기에 언급할 습윤제를 포함한다. 일반적으로 알코올에 대한 물의 중량비는 약 1:1 내지 약 20:1의 범위에 있다. 이와 같은 유형의 조제에서 물-알코올 혼합물은 전형적으로 조제의 약 70 내지 약 99.9%의 범위에 있다. 알코올은 전형적으로 에탄올 또는 이소프로판올이다. 에탄올이 바람직하다.
본 발명에 의한 상기한 액체 또는 다른 조제의 pH는 일반적으로 약 4.5 내지 약 9의 범위에 있으며, 전형적으로는 약 5.5내지 8이다. pH는 바람직하게는 약 6 내지 약 8.0의 범위에 있으며, 7.4인 것이 바람직하다. pH는 산(곧, 시트르산 또는 벤조산) 또는 염기(곧, 수산화나트륨) 또는 (시트르산나트륨, 벤조에이트, 탄산염, 또는 중탄산염, 인산수소이나트륨(disodium hydrogen phosphate), 인산이수소나트륨(disodium hydrogen phosphate)으로의 버퍼액으로 조절할 수 있다.
본 발명의 다른 바람직한 형태에서 경구 조성물은 치마제, 치과용 정제 또는 치약(치과용 크림) 또는 겔 치분인 치분과 같은 실질적으로 특성상 고상이거나 페이스트상일 수 있다. 이러한 고상 또는 페이스트상의 경구 조제의 비히클은 일반적으로 치과용으로 허용되는 광택물질을 포함한다. 광택물질의 예로는 수불용성 메타인산나트륨, 메타인산칼륨, 인산삼칼슘, 인산칼슘 이수산화물, 인산이칼슘 무수물, 피로인산칼슘, 오르토인산마그네슘, 인산삼마그네슘, 탄산칼슘, 알루미늄수산화물, 알루미늄생석회(calcined alumina), 규산알루미늄, 규산지르코늄, 이산화규소(silica), 벤토나이트(bentonite), 및 그 혼합물이 있다. 다른 적절한 광택물질은 멜라민-, 페놀릭, 및 요소-포름알데히드, 및 교차결합된 폴리에폭사이드 및 폴리에스테르와 같은 미립자 열경화성 레진을 포함한다. 바람직한 광택물질은 약 5미크론까지의 입자크기, 약 1.1미크론까지의 펑균입자크기 및 약 50,000㎠/gm까지의 표면적을 갖는 이산화규소 결정체, 실리카겔 조는 이산화규소 콜로이드, 및 비정질 알칼리금속 알루미노규산염 복합체를 포함한다.
외관상 투명한 겔이 사용될 때, SYLOID 상표의 Syloid 72 및 Syloid 74 또는 SANTOCEL 상표의 Santocel 100 상품과 같은 이산화규소, 콜로이드의 광택제, 알칼리금속 알루미노규산염 복합체는 일반적으로 치분에 사용되는 겔화제-액체(물 및/또는 습윤제를 포함) 시스템의 굴절률에 가까운 굴절률을 가지고 있기 때문에 특히 유용하다.
이른바 "수불용성" 광택물질의 다수가 특성상 음이온성이고 또한 소량의 용해성 물질을 포함한다. 그리하여 불용성 메타인산나트륨은 토르페의 응용화학사전(Thorpe's Dictionary of Applied Chemistry, Volume 9, 4th Edition, pp.510-511)에 나타낸 것과 같이 적절한 방식으로 형성될 수 있다. 매드렐염(Madrell's salt) 및 쿠롤염(Kurrol's salt)으로 알려진 불용성 메타인산나트륨의 형태는 적절한 물질의 다른 예이다. 이들 메타인산염은 물에서 미소한 용해성만을 나타내어 일반적으로 불용성 메타인산염(IMP)이라고 불린다. 불순물로서 소량의 용해성 인산염 물질이 대개 최고 4중량%의 소량으로 존재한다. 불용성 메타인산염의 경우에 용해성 삼메타인산나트륨을 포함하는 것으로 알려진 용해성 인산염 물질의 양은, 원한다면 물로 세척하여 감소시키거나 제거시킬 수 있다. 불용성 알카리금속메타인산염은 그 물질의 단지 1%만이 37미크론보다 큰 입자 크기의 분말 형태로 전형적으로 사용될 수 있다.
광택물질은 일반적으로 고상 또는 페이스트상 조성물에 약 10% 내지 약 99중량%의 농도로 존재한다. 바람직하게 치약에서는 약 10 내지 약 75%의 양, 치마제에서는 약 70% 내지 약 99%의 양으로 존재한다. 치약에서는 광택물질이 천연산 규질(silicious)일 때, 일반적으로 약 10~30중량%의 양으로 존재한다. 다른 광택물질은 전형적으로 약 30~75중량%의 양으로 존재한다.
치약에서는, 액체 비히클은 전형적으로 조제의 약 10 내지 약 80중량%의 양의 물 및 습윤제를 포함한다. 글리세린, 프로필렌, 글리콜, 소르비톨 및 폴리프로필렌글리콜이 적절한 습윤제/캐리어의 예이다. 물, 글리세린 및 소르비톨의 액체 혼합물도 유리하다. 굴절률이 중요하게 고려되는 투명 겔에서는 약 2.5~30%w/w의 물, 0 내지 약 70%w/w의 글리세린 및 약 20~80%w/w의 소르비톨이 바람직하게 사용된다.
치약, 크림 및 겔은 전형적으로 약 0.1 내지 약 10, 바람직하게는 약 0.5 내지 5%w/w의 천연 또는 합성 증점제(thickener) 또는 겔화제를 포함한다. 적절한 증점제는 합성 헥토리트(hectorite), 합성 콜로이드 마그네슘알카리금속규산염 복합체 점토, 예를 들어 Laporte Industries Limited Laponite에 의하여 판매되는 Laponite(예를 들면, CP, SP 2002, D)이다. Laponite D는 약 58.00중량% SiO2, 25.40중량%MgO, 3.05중량% Na2O, 0.98중량% Li2O, 및 상당한 물 및 소량의 금속이다. 그 진비중(true specific gravity)은 2.53이고, 겉보기부피밀도는 8% 수분에서 1.0g/㎖이다.
다른 적절한 증점제는 아일랜드 이끼, 이오타카라기난(iota carrageenan), 검 트래거캔스(gum tragacanth), 녹말, 폴리비닐피롤리돈, 히드록시에틸프로필셀룰오스, 히드록시부틸메틸셀룰로오스, 히드록시에틸셀룰로오스(곧, Natrosol를 이용), 소디움카르복실메틸셀룰로오스, 및 미세하게 연마한 Syloid(곧, 244)와 같은 콜로이드 이산화규소를 포함한다. 용해제는 프로필렌글리콜, 디프로필렌글리콜 및 헥실렌글리콜과 같은 습윤제 폴리올, 메틸셀로솔브 및 에틸셀로솔브와 같은 셀로솔브(cellosolve), 식물성 오일 및 올리브오일과 같은 직쇄에서 적어도 약 12개의 탄소를 포함하는 왁스, 비버(castor) 오일 및 석유, 및 아밀아세테이트, 에틸아세테이트 및 벤질벤조에이트와 같은 에스테르도 포함할 수 있다.
종래에서처럼 경구 조제가 판매되거나 적절한 라벨 달린 상품으로 배포될 수 있다. 그리하여 세구제(mouthrinse)의 병은 실질적으로 세구제 및 세구제로서 그 사용법을 기재한 라벨을 가지며, 치약, 크림 또는 겔은 일반적으로 접을 수 있는 튜브 형태로서, 전형적으로는 내용물을 계량하기 위한 알루미늄, 선 납 또는 플라스틱, 또는 다른 압착, 펌프 또는 압입한 디스펜서(dispenser)로 실질적으로 치약, 겔 또는 치과용 크림으로서 기재된 라벨을 가진다.
유기 표면-활성제는 본 발명의 조성물에 사용되어 증가된 예방(prophylactic) 작용을 얻고, 이 활성제를 구강 전체에 완전하게 분산하는 것을 도와주고, 본 발명의 조성물을 화장용으로 허용가능하게 한다. 유기 표면-활성제는 바람직하게는 본 발명의 항체를 변성시키지 않는 사실상 음이온성, 비이온성 또는 양성(ampholytic)이고, 표면-활성제로서 항체를 변성시키지 않음과 동시에 세정 및 거품성을 상기 조성물에 부여하는 세정(detersive)물질을 바람직하게 사용한다. 음이온성 계면활성제의 적절한 예로는 코코넛 오일 지방산 수소화물의 모노설페이티드 모노글리세라이드의 나트륨염과 같은 고급지방산 모노글리세라이드 모노설페이트, 소디움라우릴설페이트와 같은 고급 알킬설페이트, 소디움도데실벤젠설포네이트와 같은 알킬아릴설포네이트, 고급 알킬설포-아세테이트, 1,2-디히드록시프로판설포네이트의 고급 지방산 에스테르 및 지방산, 알킬 또는 아실 라디칼내에 12 내지 16개의 탄소를 갖는 것과 같은 저급 지방족 아미노 카르복실산 화합물의 실질적으로 포화된 고급 지방족 아실아미드 등의 수용성 염이다. 상기에 언급한 아미드의 예는 N-라우로일살코신(N-lauroyl sarcosine), 나트륨, 칼륨, 및 비누 또는 유사한 고급 지방산 물질이 없는 N-라우로일, N-미리스토일(N-myristoyl), 또는 N-팔미토일(N-palmitoyl) 살코신의 에탄올아민염이다. 이를 살코나이트(sarconite) 화합물을 본 발명에 따르는 구강용 조성물에서 사용하는 것은 이들 물질이 산용액의 치아 에나멜의 용해성 감소에 영향을 미치는 것에 더하여 탄수화물 붕괴로 인하여 구강에서의 산 형성을 저해하는 데에 장기간에 걸쳐 현저한 효과를 나타내기에 특히 유리하다. 항체에 사용하기에 적절한 수용성 비이온성 계면활성제의 예로는 에틸렌옥사이드와, 소수성 장쇄(예를 들면, 약 12 내지 20개의 탄소의 지방족 사슬)와 반응하는 다양한 반응성 수소-함유 화합물의 축합물로서, 상기 축합물("에톡사머(ethoxamer)")은 지방산, 지방알코올, 지방아미드, 폴리히드릭알코올(예를 들면, 소르비탄 모노스테아레이트) 및 폴리프로필렌옥사이드(예를 들면, 플루로닉(Pluronic) 물질)와 폴리(에틸렌옥사이드)의 축합물과 같은 친수성 폴리옥시에틸렌 부분을 포함한다.
표면 활성제는 전형적으로 약 0.1~5중량%의 양으로 존재한다. 표면 활성제가 본 발명의 항체의 용해를 도와주어 필요한 용해성 습윤제의 양을 감소시키는 것은 주목할만하다.
다양한 다른 물질로는 미백제(whitening agent), 방부제, 규소, 엽록소 화합물 및 또는 요소, 인산디암모늄, 및 그 혼합물과 같은 암모니아 화합물 물질을 본 발명의 구강용 조제에 혼합할 수 있다. 이들 애쥬번트가 존재할 경우, 실질적으로 바람직한 성질 및 특성에 역으로 영향을 미치지 않는 양으로 혼합할 수 있다.
적절한 향미료 또는 감미료 물질도 사용할 수 있다. 적절한 향미료 성분은 녹양박하(spearmint) 오일, 박하(peppermint), 노루발풀(wintergreen) 사사프라스(sassafras), 정향(clove), 세이지(sage), 유카리나무(eucalyptus), 마요나라(marhoram), 계피(cinnamon), 레몬 및 오렌지와 같은 향미오일 및 메틸살리실산염이 있다. 적절한 감미제는 슈크로스, 락토오스, 말토오스, 소르비톨, 크실리톨, 소듐 사이클라메이트(sodium cyclamate), 페릴라틴(perillartine), AMP(아스파르틸페닐알라닌(asparthyl phenyl alanine), 메틸에스테르, 사카린(saccharine) 등을 포함한다. 적절하게는 향미료 및 감미제는 각각 또는 함께 조제의 약 0.1% 내지 5% 이상 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시예에서 발명의 조성물을 포함하는 세구제 또는 치분과 같은 본 발명에 따른 경구 조성물은 바람직하게는 검 및 치아에 매일 또는 매 2 또는 3일에 한 번 또는 바람직하게는 매일 1 내지 3회로, 약 4.5내지 약 9의 pH, 일반적으로는 약 5.5 내지 약 8, 바람직하게는 약 6 내지 8, 적어도 2주 내지 8주에서 평생동안 규칙적으로 사용할 수 있다.
본 발명의 조성물은 정제(lozenge) 또는 따뜻한 검 베이스에 교반하거나 검 베이스의 외표면에 코팅함으로써 츄잉검 또는 다른 제품으로 제조될 수 있으며, 이를 설명하면 바람직하게는 종래의 가소제 또는 연화제, 설탕 또는 다른 감미제 또는 글루코스, 소르비톨 및 유사물과 같은 것들을 포함하는 젤루통(jelutong), 고무라텍스, 비닐라이트레진 등을 언급할 수 있다.
본 발명의 다른 중요한 형태는 4개의 항원 및 적절한 애쥬번트 및 또는 캐리어를 기초로 한 P. gingivalis에 대한 면역 반응을 일으키는 데에 사용하는 조성물이다. 이것은 많은 경로, 예를 들면 비내 분무, 경구 또는 주사에 의하여 전달되어 항원에 대한 특이적 면역반응을 일으키고, 이로써 P. gingivalis의 콜로니 형성을 감소시키고 독성을 감소시켜 질환을 방지할 수 있다. 쉽게 이해되듯이, 조성물은 적절한 벡터로 병합되고 벡터를 포함하는 적절한 형질전환된 호스트(예를 들면, E.coli, Bacillus subtilis, Saccharomyces cerevisiae, COS 세포, CHO 세포 및 HeLa 세포)에서 발현된 재조합 항원을 기초로 할 수 있다. 전체 P. gingivalis 세포 또는 과거에 제조된 다른 항원과는 달리, 여기에 기재된 항원 또는 펩티드, 올리고펩티드 또는 키메라 펩티드는 P. gingivalis와 관련된 치주질환의 방지용 백신의 제조에 대하여 안전하고 효과적인 항원이다. 본 발명의 항원성 단백질, 펩티드, 올리고펩티드 및 키메라 펩티드는 여기에서 언급한 것과 같이 재조합 DNA 방법을 사용하여 생산할 수 있거나, 본 발명에서 개시된 아미노산 서열로부터 화학적으로 합성될 수 있다. 또한, 본 발명에 따라서, 항원성 단백질 및 이와 생산된 관련 펩티드 또는 키메라는 치주질환 및 P. gingivalis에 의한 감염에 대한 수동 면역화를 위하여 유용한 P. gingivalis 항혈청을 생성하는 데에 사용될 수 있다.
항원 그 자체를 면역반응을 일으키는 데에 사용하는 것과는 반대로, 항원의 하나 또는 분획을 포함하는 에피토프에서 엔코딩하는 서열을 포함하는 DNA 분자를 투여함으로써 이루어진다.
본 발명은 분리된 유전자로부터 추론된 아미노산 서열뿐만 아니라 항원을 엔코딩하는 유전자의 뉴클레오티드 서열을 더욱 제공한다. 본 발명의 특별히 바람직한 일 실시예에 따라서, 재조합 DNA 기술을 이용하여 항원을 엔코딩하는 유전자 또는 하나 또는 그 이상의 펩티드를 엔코딩하는 유전자 분획 또는 면역원성 에피토프를 가지는 키메라가 발현벡터로 합체되고, 재조합 벡터는 적절한 호스트 세포에 도입되어 특정한 호스트 세포 내에서 이들 서열이 발현되게 한다. 호스트 세포로 도입된 재조합 벡터를 포함하는 발현 시스템은 (a) 백신 제형에서 면역원으로서 사용하기 위하여 정제될 수 있는 항원성 단백질, 관련 펩티드, 올리고펩티드 및 키메라를 생성하고; (b) 진단 면역분석용 또는 치료학적 및/또는 진단적 가치가 있는 P. gingivalis-특이성 항혈청을 생성용 항원으로서 사용하기 위한 항원성 단백질, 관련 펩티드, 올리고펩티드 및 키메라를 생성하고; (c) 또는 재조합 발현 벡터가 우두 바이러스와 같은 생바이러스라면, 벡터 그 자체로 항원 또는 면역원성 펩티드 또는 올리고펩티드 또는 키메라 펩티드의 발현을 위한 호스트 세포로 도입되도록 생 또는 불활성 백신 조제로 사용할 수 있고, (d) 생 약독화 박테리아 세포 또는 항원성 단백질, 관련 펩티드 또는 올리고펩티드 또는 키메라를 발현시켜 개체에 백신접종하기 위하여 사용되는 유전적으로 가공된 공생 경구내 박테리아로 도입하고; (e) 또는 개체에 직접 도입하여 엔코딩되고 발현된 항원성 단백질, 관련 펩티드 또는 올리고펩티드 또는 키메라에 대하여 면역시키는데 사용될 수 있다. 특히 백신으로 동물의 치주질환을 방지하고자 하면, 재조합 박테리아 백신은 인간 구강 또는 동물의 공생 서식처를 기초로 할 수 있다. 항원을 발현시키는 재조합 박테리아 백신은 구강, 잇몸외(supragingival) 또는 잇몸내 플라크에서 콜로니를 형성하는 데에 상용할 수 있다. 경구내 박테리아는 치주염 환자로부터 분리되고 항원, 펩티드 또는 키메라를 발현하기 위하여 유전적으로 가공될 수 있다. 구강 내에서의 P. gingivalis 항원의 생산은 경구 점막 조직에 비독성이다. 그러나 발현된 항원은 점막-관련 임파성 조직(MALT)을 자극하여 P. gingivalis의 독성을 중화시키고 감소시키는 특이 항체를 생성한다.
하기한 실시예는 본 발명의 성질을 더욱 예시하기 위한 것이고 본 발명이 여기에 제한하고자 하는 것은 아니다. 여기 및 청구항에서 언급되는 모든 함량 및 비율은 특별히 언급하지 않는 한 중량에 의한 것이다.
실시예 1
항원 1의 제조
Ag1의 추출 및 정제
P. gingivalis 세포를 4℃에서 5,000×g에서 20분동안 원심분리시킴으로써 O.D.650nm 0.18에서 수득하였다. 세포 펠렛을 원 배양물의 리터 당 50㎖의 버퍼A(50mM NaCl, 10mM Tris, 10mM EDTA, pH 8.0)와 함께 상온에서 15분동안 온화하게 흔들면서 원 세포 배양물의 L당 100㎖의 클로로포름에서 배양시켰다. 시료를 6,000×g에서 20분동안 원심분리하여 상을 분리하였다. 수계 상을 제거하고 10,000×g에서 30분동안 더욱 원심분리하여 오염 세포 부스러기를 제거하였다. 상청액을 4℃에서 FPLCTM 시스템(Pharmacia)을 이용하여 Q 세파로즈 음이온 교환 크로마토그래피 칼럼(XK16/10)에 적용시키기 전에 0.22㎛의 필터를 통과시켰다. 10mM Tris, 10mM EDAT, pH 8.0에서 50mM NaCl에서 500mM NaCl의 180분동안 2㎖/min으로의 선형 NaCl 구배를 이용하여 단백질을 칼럼으로부터 용출시켰다. 용출은 280㎚에서 감지되었다. 6㎖의 분획을 수집하고, 그 항원성을 검사하기 위하여 이들을 SDS-PAGE 및 ELISA에 의하여 건강한 피검체의 혈청을 사용하여 분석하였다. 가장 많은 항원성 분획을 슈퍼로즈 12(Pharmacia) 사이즈 배제 칼럼에 적용시키기 전에 10,000 NMWCO 센트리콘 농축기를 이용하여 200㎕로 농축시켰다.
사이즈 배제 칼럼을 평형화시키고 150mM MaCl, 20mM Tris, 10mM EDAT, pH 8.0에서 0.3㎖/min의 유속으로 분리를 실시하였다. 표준 단백질은 시료의 결과 피크와 비교할 수 있는 크기로 실시하였다. 용출은 280㎚에서 감지하였다. 500㎕의 분획들을 모으고 이들을 SDS-PAGE 및 ELISA로 분석하였다. 60kDa에서 용출된 피크는 P. gingivalis가 잠복하는 피검체의 혈청을 가짐으로써 항원성인 것으로 나타났으나 치주염의 징후는 보이지 않았다. 이 분획을 역상 크로마토그래피에 의하여 더욱 정제하였다.
c8RP300 칼럼(Applied Biosystems) 및 0.1%의 TFA에서 0%~80% 아세토니트릴의 40분동안의 선형 구배를 이용하여 역상 크로마토그래피(RP-HPLC)를 실시하였다. SDS_PAGE 분석상에서 단일밴드를 포함하는 용출된 단일 피크는 28kDa의 Mr를 가지고 있었다. 이 피크는 휴렛패커드(Hewlett Packard) 1005A 자동 단백질 서열기를 사용한 N-말단 서열 분석으로 특성을 부여하였다.
서열 분석으로 이 항원은 P. gingivalis의 헴 수용체인 것으로 나타나며, 하기한 N-말단 아미노산 서열을 가진다:
SDS-PAGE 분석
12% 분리겔 및 4%의 저장겔로 이루어진 불연속 시스템을 사용하여 SDS-PAGE 분석을 실시하였다. 시료 버퍼는 4% SDS 및 70mM β-메르캅토에탄올을 함유하였다. 표준 단백질(Pharmacia)은 크기 비교를 위하여 각 겔 상에 포함시켰다. 전 염료(dye-front)가 저장겔의 하부에 가까워질 때까지 러닝버퍼에서 160볼트의 일정한 전압에서 시료를 흐르게 하였다. 단백질을 쿠마시 브릴리언트 블루 R-250m으로 가시화시키고 물에서의 40%MeOH, 7% HAC에서 탈염시켰다.
웨스턴 블롯 분석
웨스턴 블롯을 실시하여 DNA 분석에서 나타난 바와 같이 P. gingivalis가 잇몸내에 잠복한, 치주질환(D50) 및 건강한(H10) 피검체의 혈청 항체에 의하여 인지된 단백질을 동정하였다. 블롯팅한 단백질을 전-염색된 표준물질(BioRad)이 이동의 완결을 결정할 수 있도록 포함된 것을 제외하고는 상기한 SDS-PAGE 과정에 따라 분리시켰다. SDS-PAGE를 실시한 후에 겔장치를 분해하고 겔, PVDF 멤브레인(ProBlott. Applied Biosystems), 블롯팅 페이퍼 및 섬유 패드를 이동버퍼(10% CAPS, 10% MeOH)에서 5분동안 평형화시켰다. SDS-PAGE 겔 내의 단백질을 60볼트의 일정한 전압에서 90분동안 PVDF 멤브레인 상으로 이동시켰다. 이동 후에 PVDF 멤브레인을 5%의 탈지분유로 상온에서 1시간동안 블록킹시켰다. 그리고 나서 멤브레인을 제1 항체(TN 버퍼(25mM Tris, 0.5M NaCl, pH 7.5)에서 1/10으로 희석시킨 인간 혈청 H10 또는 1/50으로 희석시킨 D50)로 철야 4℃에서 인큐베이션시켰다. 멤브레인을 10분동안 각 TN 버퍼에서 3회 세척시키고 2차 항체(염소 항-인간 IgG으로 접합되고 TN 버퍼로 1/1000희석된 양고추냉이 퍼옥시다제)로 상온에서 2시간동안 인큐베이션시켰다. 다시 멤브레인을 각각 10분동안 TN 버퍼에서 3회 세척하였다. 항원성 단백질에 염소 항-인간 IgG의 결합을 6mg의 4-클로로-1-나프톨, 2㎖의 MeOH, 10㎖의 TN 버퍼 및 6㎕의 H2O2로 가시화시켰다. 효소 반응을 물로 종결시켰다.
웨스턴 불롯 분석은 28kDa의 항원이 건강한 피검체(H10)에 의하여 인식되나 치주염 환자(D50)에 의하여는 인식되지 않는 것을 보여주었다.
ELISA
DNA분석에서 나타난 바와 같이 P. gingivalis가 잇몸내에 잠복한, 치주질환(D50) 및 건강한(H10) 피검체의 혈청 항체를 이용하여 ELISA를 실시하였다. 미량 정량 플레이트를 50mM Tris, 200mM NaCl, pH 7.4(TBS)로 희석시킨 28kDa의 단백질 또는 음성 대조군용 2% w/v의 탈지분유로 코팅하였다. 플레이트를 0.05% w.v 트윈-20(TBST) 및 2% w/v 탈지분유를 포함하는 TBS를 첨가함으로써 블록킹시켰다. 웰을 TBST로 3회 세척시키고 2% w/v 폴리비닐-피롤리돈-40 및 1% w/v N (항체 희석 버퍼, ADB)을 포함하는 TBST으로 1/500 희석시킨 인간 혈청으로 2시간동안 상온에서 인큐베이션시켰다. 웰을 TBST으로 3회 세척시키고 나서 ADB로 1/3000 희석시킨 염소 항-인간 IgG-양고추냉이 퍼옥시다제로 2시간동안 상온에서 인큐베이션시켰다. 항-인간 Ig-HRP와 P. gingivalis 세포-표면 단백질의 결합을 0.1M의 아세트산나트륨/시트르산 버퍼 pH 6.0 및 0.004% w/v H2O2로 1:100 희석시킨 디메틸설폭사이드에서 용해된 10mg/㎖의 3,3´,4,4´ 테트라메틸벤지딘으로 가시시켰다.
28kDa의 항원이 건강한 피검체(H10)에 의하여 인식되나 치주염 환자(D50)에 의하여는 인식되지 않는 것을 ELISA로 확인하였다.
실시예 2
Ag1 유전자의 클로닝 및 서열 분석
P. gingivalis 게놈 DNA를 소화시킨 BamH I의 람다 GEM 12 라이브러리를 28kDa 항원(Ag1)의 N-말단 서열로부터 유래된 변질 올리고뉴클레오티드 프로브를 이용하여 스크리닝하였다. 프로브-양성 클론을 확인하고 4.6kbp의 P. gingivalis게놈 DNA를 삽입시켰다. 이 삽입된 것을 페놀 추출로 정제하고 pUCc18로 서브클로닝시켰다. 유전자의 DNA 서열은 오픈리딩프레임이 예측된 mas 32,709의 단백질을 엔코딩하는 것을 밝혀내었다. 생거(Sanger) 디데옥시 방법 및 뉴 클레오티드 서열 및 도 1에 도시된 Ag 1의 추론된 아미노산 서열을 이용하여 서열을 결정하였다. 추론 아미노산 서열로 단백질의 분자량은 32,709이었다.
실시예 3
Ag1 유전자를 이용한 DNA 백신의 구조
P. gingivalis DNA 4.6kbp를 포함하는 플라스미드를 32kDa 항원(Ag1)을 PCR에 의한 유전자 엔코딩의 증폭용 템플레이트로 사용하여 실시하였다. PCR을 하기한 서열을 가진 특이적 올리고뉴클레오티드를 사용하여 실시하였다.
N-말단
올리고 A 5´ CAA GCA ACA ACA AGG ATT TGC 3´
C-말단
올리고 B 5´ TTG CAT ATC CGC CCG TCC 3´
PCR 혼합물은 템플레이트 DNA 100ng, MgCl2 1mM, 올리고 A: 800ng, 올리고 B: 800ng, 250mM dNTP, 3U 울트마 폴리머라제(Perkin Elmer)를 포함하였다. 온도사이클은 다음과 같다: 변성 94℃, 30s, 어닐링 52℃, 30s 및 연장 70℃, 60s.
특이성 올리고뉴클레오티드 프로브를 이용한 서던 블롯 분석으로 정확한 앰플리콘(amplicon)을 확인하였다. 이 밴드를 페놀 추출에 의하여 1.0% 아가로즈겔로부터 분리하였다. 증폭된 분획을 Sma1로 pUC18로 블런트-엔드 결찰시키고 항원1의 전체 길이의 서열을 엔코딩하는 유전자(Ag1)의 존재를 서열 분석으로 확인하였다. 그리고 나서 유전자를 pcDNA 3(Invitrogen)으로 서브클로닝하였다. 클론은 전체 길이의 Ag1 유전자(949개의 염기쌍)를 포함하였다. 약 2㎍의 정제된 pcDNA3(Invitrogen) 플라스미드 및 pUC18 클론 2.2 DNA를 멀티코어 버퍼(Promega)내의 HindⅢ(Promega) 및 EcoR I (Promega) 제한효소로 37℃에서 1시간동안 소화시켰다. 소화된 플라스미드 DNA를 1%의 뉴시브 저융점 아가로즈 상에 흐리게 하고 겔로부터 P. gingivalis 인서트(insert) DNA를 전달하고 제조업자의 지시에 따라서 브레사클린 키트(Bresaclean kit, Bresatech)를 이용하여 정제하였다. 정제된 인서트 DNA를 TE 버퍼 20㎕에서 재현탁시켰다. pUC 클론으로부터 정제된 인서트 DNA를 TE 버퍼 20㎕에서 재현탁시켰다. pUC 클론으로부터 정제된 인서트 DNA를 T4 리가제(Promega)를 이용한 종래 기술에 의하여 절단된 pcDNA 벡터로 상온에서 2시간동안 결찰시켰다. 결찰된 pcDNA3을 앰피실린이 포함된 아가 플레이트 상에 플레이팅된 Top10F´ E. coli 세포(Invitrogen)로 형질전환시켰다. 얻은 클론을 3㎖의 배양물로 확대시키고, 플라스미드를 정제하고 제한효소 소화 및 1% 아가로즈겔 상의 전기영동에 의하여 적절한 크기의 분획 삽입을 위하여 스크리닝하였다.
정확한 인서트 크기의 클론을 선택하여 인서트를 확인하기 위하여 추가 제한효소 소화를 정확하게 실시하였다. 이는 제한효소 HindⅢ 단독, HindⅢ 및 EcoR Ⅰ같이 및 Nde Ⅰ 단독으로 클론을 소화시키는 것으로 이루어졌다. 전체 길이의 Ag1 유전자를 포함하는 5.1의 한 클론을 선택하였다. Sp6 및 T7 일반적인 프라이머를 이용한 부분 DNA 서열 분석과 이어서 종래기술에 의하여 클론을 확인하였다. 하기와 같은 5´ 및 3´ 말단의 DNA 서열 분석에 의하여 클론 5.1 내의 pcDNA3-Ag1 구조물을 확인하였다.
N-말단
C-말단
볼드체 염기 = 인서트
비볼드체 염기 = 벡터
플라스미드 DNA의 대규모(1L) 조제는 클론 5.1 및 어떠한 인서트 없는 pcDNA3으로부터 제조하였다. 퀴아겐 메가 프렙(Qiagen Mega Preps)을 이용하여 150㎍/㎖의 앰피실린을 포함한 터리픽 브로스(Terrific broth)에서 철야 배양시킨 Top 10F' E. coli 세포의 배양물로부터 플라스미드 DNA를 분리하였다. 분리한 플라스미드 DNA를 제한효소 분석에 의하여 인서트 크기 및 DNA의 순도를 확인하였다. 280㎚/260㎚ 에서의 흡광도를 결정함으로써 DNA/RNA의 농도를 분광광도분석에 의하여 계산하였다.
인서트(5.1) 및 pcDNA3(인서트 없음)을 가진 pcDNA3-Ag1 클론으로부터 분리한 플라스미드 DNA를 살균수에서의 0.9% NaCl에서 희석시켜 동물 투여용 0.5㎎/㎖의 DNA를 얻었다.
실시예
쥐과 병변 모델에서 P. gingivalis 공격에 대한 Ag1 DNA 백신 구조물의 보호능
상기에 기재된 (테스트 그룹) Ag1 유전자를 포함하는 pcDNA3-Ag1 구조물을 10마리의 마우스에 투입하였으며, 다른10마리의 마우스에게는 pcDNA3 벡터(대조군 그룹)를 투입하였다. 25㎍의 DNA를 20마리의 6주짜리 Balb/c 마우스 암컷의 경골근(tibialis muscle)(총 50㎍의 DNA/마우스)에 주사하였다. 그리고 한달 후에 각 경골근 내로 25㎍의 DNA 증가분을 주사하였다. 3.4×109cfu의 P. gingivalis W50을 꼬리의 기부로부터 약 3.5㎝의 지점인 마우스의 등에 피하주사하였다.
14일 동안 매일 마우스를 체중 손실, 병변 크기 및 반응을 감지하였다. 이 기간 끝에 14일 동안 20% 이상의 체중 손실을 가진 모든 마우스를 희생시켰다. 희생물의 혈청을 심장주사에 의해 모은 혈액으로부터 얻었다. 각 마우스의 병변 크기 데이터를 14일 동안 매일 모으고 도 2에 나타내었다. 2개의 그룹의 동물(테스트군 및 대조군)의 병변 크기를 ANOVA(단일 인자) 및 만-휘트니(Mann-Whitney) 비파라메트릭 통계테스트에 의하여 분석하였다. 이것은 테스트군 및 대조군 사이의 병변 크기의 차이점이 현저하다(p=0.027 및 p=0.019)는 것을 검사한 두 테스트를 사용하여 나타내었다. 이들 결과는 Ag1 유전자를 포함하는 DNA 백신 구조물이 P. gingivalis W50의 투입에 대하여 마우스를 보호한다는 것을 보여주었다.
실시예 5
항원 1의 C-말단 영역에 대응하는 합성 펩티드의 면역원성
Ag1의 C-말단 영역에 대응하는 다음의 합성 펩티드, CIRNIWLKHMKATSAR을 예측된 B-세포 에피토프의 존재를 기초로 하여 제조하였다. 디프테리아 독소에 접합된 16mer 펩티드로 면역화시킴으로써 다클론성 항혈청을 2마리 네덜란드산 토끼 및 1마리의 뉴질랜드산 화이트 토끼에서 성장시켰다.
토끼를 TBS(50mM Tris, 200mM NaCl, pH 7.4)에서 용해시킨 펩티드 78㎍으로 면역화시키고 프로인트 불완전 애쥬번트의 동량으로 에멀전화시켰다. 조제를 등의 4개의 위치에 피하주사하였다. 4주 후 이 과정을 반복하고 2주 후에 테스트 출혈을 실시하고 혈청 반응을 펩티드의 비오틴화된 형태에 대한 형태에 대한 ELISA에 의하여 관찰하였다. 2주 후에 토끼를 동일한 과정을 통하여 다시 면역화시켰다. 최종 면역화 2주 후에 토끼에 심장 주사를 실시하여 출혈시키고 ELISA를 및 웨스턴 블롯에 의하여 혈청 반응을 결정하였다.
비오틴화된 16mer에 대한 다클론성 항혈청을 사용하여 ELISA를 실시하였다. 미량정량 플레이트를 2.54㎍/㎖의 스트렙타비딘(streptabidin)으로 코팅하였다. 웰을 TBS(50mM Tris HCl pH 7.4 200mM NaCl)로 3회 세척시키고 TBS로 희석시킨 펩티드와 접합시킨 비오틴 0.2㎍/㎖으로 4℃에서 철야로 인큐베이션시켰다. 다음 날 웰을 0.05% v/v 트윈20(TBST)을 포함하는 TBS로 3회 세척시키고 상온에서 2% w/v 탈지분유로 1시간동안 블록킹시켰다. 웰을 TBST로 3회 세척시키고 항체 희석 버퍼(ADB)[2% w/v 탈지분유를 포함하는 TBST] 1/100에서 5배 희석시킨 다클론성 항혈청으로 상온에서 2시간동안 인큐베이션시켰다. 웰을 TBST로 3회 세척시키고 ADB에서 1/3000으로 희석시킨 염소 항-토끼 IgG에 접합시킨 양고추냉이 퍼옥시다제로 상온에서 2시간동안 인큐베이션시켰다. 웰을 TBST로 3회 세척시키고 P. gingivalis 단백질과 항혈청의 결합을 상기와 같이 가시화시켰다. 특이성 반응은 특이성 항-펩티드 항체가 생성되었다는 것을 논증하였다. P. gingivalis 세포-표면 단백질을 이용하여 실시된 ELISA 역시 펩티드가 P. gingivalis의 세포 표면 항원 1을 인식할 수 있는 항체를 생성한다는 것을 가리키는 특이성 반응을 일으켰다.
웨스턴 블롯을 실시하여 항 펩티드 항체에 의하여 인식되는 P. gingivalis 세포 표면 추출물의 성분을 확인하였다. P. gingivalis 세포-표면 추출물의 SDS-PAGE 후에, 단백질을 PVDF 멤브레인으로 이동시키고 상기에 언급한대로 블록킹시켰다. 멤브레인을 TN 버퍼에서 1/100 희석시킨 항혈청으로 4℃에서 철야로 인큐베이션시켰다. 다음날, 멤브레인을 TN 버퍼로 3회 세척시키고 TN 버퍼에서 1/1000으로 희석시킨 염소 항-토끼 IgG에 접합시킨 양고추냉이 퍼옥시다제로 상온에서 2시간동안 인큐베이션시켰다. 멤브레인을 TN 버퍼로 3회 세척시키고 혈청 항체와 P. gingivalis 세포-표면 단백질 추출물의 성분과의 결합을 상기에서와 같이 가시화시켰다. 30, 33.9, 37, 40.1, 45.9, 48.8, 51.8, 56.8 및 60.3kDa의 밴드래더를 얻었다.
이들 결과는 항-펩티드 항체가 특이적으로 P. gingivalis의 항원 1을 인식하고 항원은 LPS와의 결합이 가능한 복합적인 형태의 P. gingivalis의 표면상에 존재한다는 것을 나타낸다.
실시예 6
항원 2,3 및 4(Ag2, Ag3 및 Ag4)의 제조
P. gingivalis W50은 37℃의 용해된 말의 혈액 아가 및 1 ㎍/㎖ 헤민을 포함하는 변형 BM 배지에서 혐기적으로 성장하였다. 박테리아는 용해된 말의 혈액 플레이트 상에서 일반적인 계대(<10개의 계대)에 의하여 유지시키고 회분배양에 접종하기 위하여 사용하였다. 브레인하트 인퓨젼배지(Brain Heart Infusion Medium)에서의 회분배양성장을 부광계(295E, Perkin-Elmer)를 사용하여 650㎚에서 조사하였다. 배양물의 순도는 그램 스테인, 현미경 검사 및 다양한 생물화학적 테스트에 의하여 정기적으로 체크하였다. 스톡은 동결건조된 배양물로 유지되었다. P. gingivalis의 배양물은 후기 대수상으로 성장하였으며, 세포는 원심분리(5,000×g, 20분, 4℃)로 수확하였다. 세포 펠렛에 클로로포름을 첨가하고 온화하게 혼합한 후에 현탁액을 상온에서 15분동안 방치하였다. 클로로포름으로 처리한 후에 50mM NaCl를 포함하는 TMC 버퍼[20mM Tris-HCl pH 8.0 및 50mM 2-메르캅토에탄올 및 5mMCaCl2]를 첨가하고 온화하게 혼합하였다. 혼합물을 원심분리(100,000×g, 30분, 4℃)하고, 상층액을 음이온-교환 FPLC 하기 전에 여과하였다(0.22㎛). 클로로포름 추출물을 50㎖ 슈퍼루프(Pharmacia-LKB)를 사용하여 다중 주입으로 음이온-교환 칼럼(Hiload XK 16/10 Q Sepharose, Pharmacia-LKB)에 적용시키고 4℃로 냉각시켰다. 시료는 90분동안 0~100% 버퍼 B의 선형 구배를 사용하여 용출 시켰다. 버퍼 A는 50mM NaCl을 포함하는 TMC 버퍼이고, 버퍼 B는 500mM NaCl을 포함하는 TMC버퍼이다. 음이온-교환 분획을 세척시키고 나서 150mM NaCl을 포함하는 TNC 버퍼에서 농축시켰다. 그리고 나서 150mM NaCl을 포함하는 TMC 버퍼를 사용하여 분획들을 겔 여과(슈퍼로즈 12) 칼럼에 적용시켰다. 용출액을 280㎚에서 감시하고 피크를 수집하였다. 용출액 피크값 Mr 은 분자량 고저 분자량 겔여과 표준(Pharmacia-LKB)을 사용하여 결정하였다. 그리고 나서 수집된 피크의 아세토니트릴 구배로 용출하는 C8 RP-300 브라운리(Brownlee) 칼럼을 사용한 역상(RP) HPLC를 실시하였다. 분획 및 정제된 시료의 단백질 농도는 BSA를 표준물질로 하는 브래드포드(Bradford) 단백질분석(Biorad)을 이용하여 결정하였다. 크로마토그래피 분획 및 정제된 단백질을 DNA 프로브 분석에서 보여준 것과 같이 잇몸내에 P. gingivalis를 가진 피검체의 혈청을 이용한 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯팅으로 분석하였다. 혈청 H10은 P. gingivalis를 잇몸내에 잠복시킨 피검체로부터 얻은 것이나 치주 질환의 아무런 임상 징후를 보이지 않았다. 혈청 D50은 잇몸내 플라크 시료에 P. gingivalis가 잠복된 치주염 환자의 것이다. 음이온 교환, 겔여과 및 역상 HPLC의 크로마토그래피 분획의 ELISA 및 웨스턴 블롯 분석의 조합으로 H10 혈청에 의해서는 인식되나 D50에 의하여 약하게 또는 전혀 인식되지 않는 3개의 정제된 항원이 확인되었다. 제1 항원은 하기한 N-말단 아미노산 서열을 가진 30kDa의 단백질이었다;
이 항원은 약 46kDa의 분자량을 가진 거대 단백질(하기와 같음)의 분획이고, P. gingivalis 부착인자 또는 추정 선모 서브유닛 단백질의 서열 상동성에서 나온다.
제2 항원은 하기한 N-말단 아미노산 서열을 가진 30kDa의 단백질이었다:
이 항원은 서열 상동성에서 나온 P. gingivalis 70kDa DnaK 동족체의 C-말단 분획이다.
제3 항원은 H10 혈청에 의하여 인식되고, 약 10kDa의 분자량을 가지며, 하기한 N-말단 아미노산 서열을 가진다;
서열 상동성으로부터 이 단백질은 P. gingivalis S-층 단백질로 여겨진다.
실시예 7
Porphyromonas gingivalis 의 Ag3(DnaK)을 엔코딩하는 유전자의 클로닝 및 서열 분석
박테리오파지 벡터 람다GEM-12로 구성한 부분 BamH1 P. gingivalis 게놈 하이브러리(W50 균주)를 Ag3의 아미노아실 서열로부터 유래한 올리고뉴클레오티드 혼합물로 스크리닝하였다. 게놈 하이브러리를 Ag3에 대한 정제된 단백질 서열의 세그먼트로 만든 변질 올리고뉴클레오티드와 70kDa DnaK 동족체 GIETMGG의 혼합물로 원장소에서 하이브리다이제이션에 의하여 스크리닝하였다.
39℃의 6× SSC, 5×덴하르트 용액, 50㎍ 청어(herring) 장자 DNA, 1% SDS, pH 7.0에서 철야로 하이브리다이제이션을 실시하였다. 필터를 39℃의 2×SSC,0.1% SDS으로 세척시키고 -80℃에서 철야로 아머삼 X-선 하이퍼필름(Amersham X-ray Hyperfilm)에 노출시켰다. 박테리오파지 DNA를 단일 양성 파지 클론에서 플레이트 용해산물 방법(Amersham's cDNA Cloning System-λgt 프로토콜 소책자)에 의하여 제조하였다. 양성적으로 하이브리다이징시킨 제한분획을 플라스미드 pUC18로 서브클로닝시켰다. 그리고 나서 이중 스트랜드 플라스미드 DNA를 디데옥시-사슬 종결 방법(Bresatec 및 USB의 키트)을 사용하는 시퀀싱 템플레이트로 사용하였다.
Ag3(DmaK 클론 #6)을 엔코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 클론은 분리되었고 오스트렐리아 정부 분석 연구소(Australian Government Analytical Laboratory)에 수탁번호 NM/04974로 기탁되었다.
실시예 8
항원 2의 내부 서열에 대응하는 합성 펩티드의 면역원성(선모 펩티드)
Porphyromonas gingivalis 균주 W50으로부터 얻은 항원 2(선모 단백질)의 펩티드 H-DNPDENPLEGDITQTHTEKYVLAEDC-NH2 (DNP-EDC)를 합성하였고 티오에스테르 결합을 형성하는 6-말레이미도카프로익 아실 N-히드록시숙신이미드 에스테르(6-maleimidocaproic acy1 N-hydroxysuccinimide ester)를 사용하여 파상풍 독소(tetanus toxoid, TT)에 커플링시켰다. 네덜란드의 화이트 토끼를 단백질 캐리어에 커플링된 펩티드100㎎을 4개의 부위에 피하주사하고 불완전 프로인트 애쥬번트로 에멀젼화시켰다. 1차 주사 후 35일째 되는 날, 토끼에게 2차 주사하였다. 1차 주사 10일째 및 84일째 되는 날, 토끼의 귀 가장자리 정맥을 채혈시켰다. 수집한 토끼의 항혈청을 ELISA 및 웨스턴 블롯 분석을 위하여 사용하였다.
ELISA에 의한 선모 펩티드 특이성 항체의 검출
TBS의 선모 펩티드 용액(펩티드 5㎕㎖-1에서 50㎕)사용하여 바닥이 평평한 폴리비닐 미량정량 플레이트(Microtiter, Dynatech laboratories, VA, U.S.A)의 웰을 습기찬 분위기의 상온에서 철야로 코팅시켰다. 코팅 용액을 제거한 후에 0.05% 트윈20(TBST)을 포함하는 TBS 내의 1%의 젤라틴 용액(250㎕)을 첨가하여 코팅되지 않은 잔여의 플라스틱을 블록킹시켰다. 1.5시간 후에 37℃에서 플레이트를 TBST로 4회 세척시켰다. 0.5% 젤라틴을 포함하는 TBS내에서 관련 항체를 1/100으로 희석시키고 이어서 플레이트를 가로질러 희석시키고 습윤한 분위기의 37℃에서 3시간동안 인큐베이션시켰다. 플레이트를 6회(TBST) 세척시키고 양고추냉이 퍼옥시다제(HRPO) 염소 면역 글로불린(Ig)의 1/4000의 희석액 중 50㎕를 토끼 Ig(BioRak, USA)에 대하여 실시하였다. 1.5시간 후에 37℃에서 자유 항체-HPRO 접합체를 플레이트를 6회 세척(TBST)함으로써 제거하였다. 100㎕의 기질(DMSO내의 0.01%의 49mM 테트라메틸 벤지딘 및 0.004%의 H2O2를 포함하는 0.1M 아세테이트 버퍼 pH 6)을 첨가함으로써 결합된 항체를 검출하였다. 455㎚에서의 광학밀도(O.D.)를 바이오라드 플레이트 리더(BioRad, USA)를 사용하여 측정하였다.
DNP-EDC-접합체에 대하여 양육된 항 혈청과 DNP-EDC 펩티드에 결합된 플레이트의 결합을 검사하였다. 전-면역 혈청은 선모 펩티드에 결합하지 않으나 DNP-EDC-접합체로 면역화된 토끼의 항혈청은 항-펩티드 항체의 높은 역가를 유도하였다. 이것은 펩티드 서열 SNP-EDC내에 하나 또는 그 이상의 B-세포 에피토프가 존재한다는 것을 나타낸다.
항-DNP-EDC(선모 펩티드) 항체로 프루빙된 P. gingivalis 균주 W50 세포 음파처리물의 웨스턴 블롯 분석
저분자량 표준물질(Amrad-Pharmacia, Australia), 전염색된 저분자량 표준물질(BioRad, USA) 및 Porphyromonas gingivalis W50 세포 음파처리물(20㎍)을 포함하는 SDS-폴리아크릴아미드 겔을 준비시키고 ProBlott(ABI, USA)로 하기한 기술을 이용하여 이동시켰다. ProBlott를 메탄올로 수초간 적시고 일렉트로블롯팅 버퍼(10% 메탄올 함유 10mM 3-[시클로헥실아미노]-1-프로판술폰산, pH 11)가 들어있는 트레이에 놓았다. Porphyromonas gingivalis W50 세포 음파처리물의 SDS-폴리아크릴아미드 겔도 역시 5분간 일렉트로블롯팅 버퍼에 침지시켰다. 트랜스블롯팅 샌드위치를 조립하여 60볼트의 일정 전압에서 90분동안 일렉트로블롯팅시켰다. ProBlott를 제거하고 염색하기 전에 밀리-Q 워터로 세척시켰다. ProBlott를 메탄올에 수초간 침지시키고, 표준물질을 1%의 아세트산을 포함하는 40% 메탄올 수용액의 0.1% 쿠마시 블루 R-250으로 염색시켰다. ProBlott를 50% 메탄올 수용액으로 탈염시키고 밀리-Q 워터로 세척시켰다.
비특이적 결합을 방지하기 위하여 ProBlott를 4℃의 0.5M NaCl, pH 7.5 내의 25mM Tris/HCl(TN 버퍼)의 5%(w/v) 탈지 분유에 철야로 침지시켰다. 웨스턴 블롯을 상온에서 TN 버퍼로 1/200 희석시킨 항혈청과 함께 2시간동안 인큐베이션시켰다. 그리고 나서 0.1% 트리톤 X-100(TNT 버퍼)을 포함하는 TN 버퍼로 웨스턴 블롯을 4회 세척시키고 염소 항-토끼 IgG에 접합된 양고추냉이 퍼옥시다제(BioRad, USA)의 1/2000 희석된 것과 함께 TN 버퍼에서 1시간동안 인큐베이션시켰다. 그후에 웨스턴 블롯을 TNT 버퍼로 4회 세척시키고 단백질 밴드를 TN 버퍼 내의 0.05% 4-클로로-1-나프톨, 16.5% 냉각 메탄올 및 0.05% H2O2로 검출하였다. 탈이온성으로 색전개를 중단시키고 두 개의 필터 페이퍼 사이에서 웨스턴 블롯을 공기로 건조시켰다.
P. gingivalis의 완전한 선모 단백질(부착인자)을 선모 펩티드-접합체에 대하여 길러진 항혈청을 사용한 면역염색에 의하여 검출하였다. 분자량 41 및 46kDa의 단 2개의 밴드가 검출되었다. 이것은 P. gingivalis W50의 완전한 선모 단백질(부착인자)이 46kDa의 분자량을 가지며, 41kDa 밴드는 46kDa 단백질의 절단된(truncated) 형태라는 것을 보여준다.
실시예 9
항체의 제조
혈청 항체는 말, 토끼, 양 또는 젖소를 Ag(1-4)으로 면역화시킴으로써 얻을 수 있다.
표준 과정을 이용하여 면역화를 실시하였다. 초기 면역화는 항원 및 프로인트 불완전 애쥬번트의 혼합물로 하였다. 표준 과정을 이용하여 동물 혈청 또는 우유로부터 항체를 회수할 수 있었다.
실시예 10
본 실시예는 항원 또는 그 부분을 엔코딩하는 뉴클레오티드 서열이 삽입되거나 파지 벡터 및 플라스미드를 포함하는 다양한 벡터에 의하여 발현될 수 있다는 것을 시사한다. 단백질 및 펩티드의 성공적인 발현은 유전자 또는 유전자 분획 또는 벡터 그 자체를 포함하는 인서트 어느 하나가 양립할 수 있고 발현에 사용된 특정한 호스트 시스템에 의하여 인식되는 전사 및 전위에 필요한 요소를 포함하는 것을 필요로 한다. 항원, 관련 펩티드 또는 올리고펩티드 또는 키메라 펩티드를 엔코딩하는 DNA는 여기에서 기술한 방법 및 서열을 사용하여 합성되거나 분리되거나 시퀸싱될 수 있다. 박테리아파지벡터, 플라스미드 벡터 또는 코스미드 DNA로 형질전환된 박테리아, 이스트 벡터를 함유하는 이스트, 진균 벡터를 함유하는 진균류, 바이러스로 감염된 곤충 세포주(예를 들면, 바큘로바이러스) 및 플라스미드 또는 바이러스 발현 벡터로 감염되거나 재조합 바이러스로 감염된 포유류 세포주(예를 들면, 우두 바이러스, 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, 레트로바이러스 등)를 포함하나, 여기에 제한되지 않는 항원, 관련 펩티드 또는 올리고펩티드 또는 키메라를 발현시키기 위하여 다양한 호스트 시스템이 이용될 수 있다.
상기에 기재된 방법을 포함한, 분자생물학에서 잘 알려진 방법을 이용하여 다양한 프로모터 및 인헨서는 항원 아미노산 서열의 발현을 증가시키기 위하여 항원 아미노산 서열, 관련 펩티드 또는 올리고펩티드 또는 키메라를 엔코딩하는 벡터 또는 DNA 서열 내로 합체되어 아미노산 서열의 증가된 발현이 사용된 특정한 호스트 세포 시스템과 양립할 수 있다(예를 들면, 비독성)는 것을 제공할 수 있다. 그리하여 중대하게는 DNA 서열은 항원을 엔코딩하는 유전자, 또는 어떠한 세그먼트 또는 단백질의 기능적인 에피토프를 엔코딩하는 유전자의 결합된 세그먼트로 구성 될 수 있다. 더욱이, DNA가 다른 박테리아 외부 멤브레인 단백질 또는 다른 박테리아, 진균, 기생체 또는 바이러스 항원과 같은 다른 항원을 엔코딩하는 DNA로 융합되어 향상된 백신 조성물로서 사용하기 위한 유전적으로 융합된(고통 펩티드 결합을 공유하는) 다가 항원을 생성할 수 있다. 프로모터의 선택을 사용되는 발현 벡터에 따른다. 프로모터는 세기, 즉 전사를 용이하게 하는 능력에 따라 변한다. 일반적으로, 클론된 유전자를 발현하기 위한 목적으로 높은 레벨의 유전자의 전사 및 유전자 생성물로의 발현을 얻기 위하여 강한 프로모터를 사용하는 것이 바람직하다. 예를 들면, E. coli를 포함하는 호스트 세포 시스템에서 높은 레벨의 전사가 관찰되는 기술에서 알려진 박테리아, 파지 또는 플라스미드로는 lac 프로모터, trp 프로모터, rec A 프로모터, 리보솜의 RNA 프로모터, PR 및 PL 프로모터, lacUV5, ompF, bla, lpp 등이며, 항원 아미노산 서열을 엔코딩하는 삽입된 DNA 서열의 전사를 제공하기 위하여 사용될 수 있다.
또한, 항원, 관련 펩티드 또는 올리고펩티드 또는 키메라가 호스트 세포에 치명적이거나 해로울 수 있다면, 호스트 세포 균주/주 및 발현 벡터는 특이적으로 유도될 때까지 프로모터의 작용이 저해되도록 선택될 수 있다. 예를 들면, 어떤 오페론에 특이성 유도인자를 첨가하는 것이 삽입된 DNA의 효율적인 전사를 위하여 필요하다(예를 들면, lac 오페론은 락토오즈 또는 이소프로필티오-베타-D-갈락토사이드의 첨가에 의하여 유도된다). trp 오페론과 같은 다양한 오페론은 다른 조절 메커니즘을 가진다. trp 오페론은 성장 배지 내에 트립토판이 없을 때에 유도된다. PL 프로모터는 감온성 람다 리프레서를 포함하는 호스트 세포의 온도 상승에 의하여 유도될 수 있다. 이와 같이, 프로모터-정방향 전사의 95% 이상이 유도되지 않은 세포에 의하여 저해될 수 있다. 그리하여 항원 아미노산 서열을 엔코딩하는 삽입된 DNA로부터 발현을 조절하는 프로모터가 유도되지 않도록 하는 조건하에서 형질전환되거나 트랜스펙션된 세포를 배양함으로써 재조합 항원상 단백질, 관련 펩티드 또는 올리고펩티드 또는 키메라의 발현을 조절할 수 있으며, 세포가 성장 배지에서 적절한 밀도에 도달할 때, 삽입된 DNA의 발현을 위하여 프로모터가 유도될 수 있다.
효율적인 유전자 전사 또는 메시지 번역을 위한 다른 조절 요소는 인헨서 및 조절 신호를 포함한다. 인헨서 서열은 근처 유전자에 대한 위치 및 방향이 비교적 독립적인 방식으로 전사 효율성을 증가시키는 것으로 보이는 DNA 요소이다. 그리하여, 사용된 호스트 세포 발현 벡터 시스템에 의존하여, 인헨서는 전사의 효율성을 증가시키시기 위하여 항원성 아미노산 서열을 엠엔딩하는 삽입된 DNA 서열의 상부 또는 하부 중 하나에 위치될 수 있다. 본 실시예의 상기에서 기술한 바와 같이, 다른 특이성 조절 서열은 항원 및 관련 펩티드 또는 키메라를 엔코딩하는 유전자의 발현에 영향을 미치는 것으로 확인되었다. 전사 또는 번역 개시 신호와 같은 이들 또는 다른 조절 부위는 항원을 엔코딩하는 유전자 또는 그 유전자 분획의 발현을 조절하기 위하여 사용될 수 있다. 이러한 조절 요소는 DNA 서열의 삽입을 위해서 상기에 기재된 재조합 DNA 방법을 이용하여 항원성 아미노산 서열을 엔코딩하는 DNA 서열 또는 근처 벡터 DNA 서열에 삽입될 수 있다.
따라서, 항원, 관련 펩티드 또는 올리고펩티드 또는 키메라를 엔코딩하는 영역을 포함하는 P. gingivalis 뉴클레오티드 서열은 재조합 벡터가 호스트 세포로 도입될 때, P. gingivalis-특이성 DNA 서열이 호스트 세포에서 발현될 수 있도록 벡터의 프로모터, 제어 및 조절 요소와 관련된 발현 벡터의 특정 부위로 결찰될 수 있다. 예를 들면, 자신의 조절 요소를 포함하는 항원-특이성 DNA 서열은 하나 이상의 항원의 공발현을 허용하는 벡터 프로모터 및 제어 요소와 관계하거나 그 방향으로 발현 벡터로 결찰될 수 있다. 그리고 나서 재조합 벡터는 적절한 호스트 세포로 도입될 수 있고, 호스트 세포는 선택되고, 재조합 벡터를 포함하는 세포에 대하여 스크리닝된다. 선택 및 tm크리닝은 플라스미드 내에 존재하는 마커 유전자(예를 들면, 약제 내성 마커) 발현의 검출, 특이성 항원으로 생성된 항혈청을 이용한 특이성 에피토프 생성의 면역스크리닝 및 하나 또는 그 이상의 올리고뉴클레오티드를 이용하여 항원-특이성 뉴클레오티드 서열에 대한 호스트 세포의 DNA의 프루빙 및 여기에 기재된 방법을 포함하는 방법에 의하여 실시될 수 있다.
유전공학기술도 엔코딩된 항원성 펩티드 또는 단백질의 특성을 부여하고, 변형 및/또는 적응시키는 데에 사용될 수 있다. 예를 들면, 보호성 도메인의 외부영역에서 단백질을 변형시키는 부위-정방향 돌연변이 생성은 보다 용이하게 정제하고 안전하게 사용하도록 하는 하분획의 안정성 및 용해성을 증가시키시 위하여 바람직하다. 또한, 유전공학기술은 항원의 아미노산 서열의 부분을 엔코딩하는 DNA 서열을 생성하기 위하여 사용될 수 있다. 얻은 펩티드 he는 올리고펩티드 또는 키메라의 면역효능(immunopotency)을 소실시키지 않도록 제한효소는 선택될 수 있다. 단백질의 항원성 부위는 크기가 변하나 약 7 내지 약 14개의 아미노산으로 수정될 수 있다. 그리하여, 항원성 단백질은 많은 분리된 항원성 부위를 포함할 수 있으므로, 많은 부분 유전자 서열은 항원성 에피토프를 엔코딩할 수 있다. 그리하여 서열은 일정한 다중 에피토프로 구성될 수 있고, 발현 시스템에서 고도의 항원성 키메라 펩티드 또는 올리고펩티드 또는 단백질을 생성하기 위하여 사용될 수 있다. 두 개 또는 그 이상의 단백질 또는 펩티드의 조합은 면역원성을 증가시킬 수 있다. 항원의 조합을 사용할 경우, 이들 항원은 관련이 있을 수 있다(곧, 동일한 유전자서열 또는 동일한 유기체의 근접하게 관련된 유전자). 선택적으로, 항원은 관련된 유기체(곧, 잇몸내 플라크에 존재하는 또 하나의 경구 박테리아) 또는 더 멀리 관련된 유기치로부터 생성될 수 있다. 특히 항원-관련 유전자 및 구조물을 포함하는 벡터를 위한 호스트 유기체는 구강의 공생체 서식처, 예를 들면, 잇몸내 플라크, 윗잇몸 플라크 또는 경구 점막에 관련된 박테리아의 서식처가 될 수 있다. 공생체의 경구내 박테리아의 예는 Streptococcus 종 및 Actinomyces 종, 예를 들면, Streptococcus salivarus, Streptococcus sanguis, Streptococcus gordonii, Actinomyces naeslundii이다. 이들 유기체는 치주염 환자에서 분리되고 나서, P. gingivalis 항원, 펩티드 또는 키메라를 발현시키기 위해 유전적으로 처리될 수 있다. 항원, 펩티드 또는 키메라를 엔코딩하는 DNA는 이들 공생체 경구내 박테리아의 세포외 단백질의 리더 서열을 엔코딩하는 DNA에 연결될 수 있다. 항원, 펩티드 또는 키메라를 엔코딩하는 DNA도 분비된 융합 단백질을 생성하기 위하여 세포외 단백질을 엔코딩하는 DNA와 연결되거나 삽입될 수 있다. 항원, 펩티드 또는 키메라를 가진 융합 단백질을 생성하기 위하여 사용될 수 있는 세포외 단백질의 예는 글루코실트랜스퍼라제(glucosyltransferase, GTF) 또는 프룩토실트랜스퍼라제(fructosyltransferase, FTF)일 수 있다. 재조합 유기체는 환자의 구강으로 재도입되고 일단 콜로니가 형성된 경구 점막 또는 치아는 중화 항체를 생성하기 위한 점막 관련 임파성 조직을 자극하기 위하여 P. gingivalis 항원, 펩티드, 키메라 또는 융합체를 발현시킨다.
항원을 엔코딩하는 DNA 분획은 발현 및/또는 정제 과정을 향상시키기 위하여 다른 DNA 서열로 융합될 수 있다(곧, 벡터 pTrxFus로 클로닝된 DNA 서열은 E. coli 단백질 티오레독신으로의 융합처럼 발현된다). 이 결합은 융합 단백질에 일반적으로 단백질을 발현시키지 못하거나 발현시키지 못하는 발현을 가능하게 하는 티오레독신의 성질을 갖게 한다. 정제 후에, 엔테로키나제(enterokinase)로 소화시켜 전체 티오레독신을 제거함으로써 고유한 단백질이 방출된다. 게다가, 발현된 단백질 또는 펩티드가 면역원성이 아니라면, 다른 서열로 융합시킴으로써 면역원성을 증가시킬 수 있는 합텐(hapten)으로서 항원이 사용될 수 있다. 선택적으로, 벡터로 클로닝된 인서트 DNA 서열은 유전자의 고유한 프로모터 서열을 포함할 수 있다. 그러므로, 관심 있는 단백질 또는 펩티드는 주로 벡터 서열 자체 내에 포함된 프로모터보다는 인서트 내에 포함된 프로모터로부터 전사된다.
기재된 플라스미드 발현 시스템은 Invitrogen의 pUC-유래된 pTrcHis 발현 벡터를 사용한다. 이 벡터는 (lac 프로모터의 -10 영역과 함께 Trp 프로모터의 -35영역을 포함하는) Trc 프로모터 및 rrnB 항-터미네이터 요소의 존재에 의하여 고레벨의 DNA 서열이 발현되게 한다. pTrcHis 벡터도 lac 리프레서 단백질을 엔코딩하는 lac1q 유전자의 복제를 포함한다. 그러므로 재조합 단백질/펩티드의 발현은 로그상의 중앙으로 성장한 E. coli에 1mM IPTG(억제해소(de-repression)를 첨가함으로써 유도된다. DNA 분획이 N-말단 융합 펩티드를 엔코딩하는 서열을 가진 프레임 하부 및 내에 위치한 다중 클로닝 부위 내로 삽입된다. N-말단 융합펩티드는 (5'에서 3'으로) ATG 번역개시코돈, 변역된 단백질에서 금속-결합 도메인으로 기능하는 일련의 6 히스티딘 잔기, 파지 T7의 유전자 10으로부터 유전자를 안정화시키는 트랜스크립트(transcript) 및 엔테로키나제 절단 인식 서열을 엔코딩한다. P. gingivalis 항원, 펩티드, 올리고펩티드 또는 키메라를 엔코딩하는 DNA 분획은 발현 벡터 pTrcHis로 결찰된다. 재조합이 아닌 벡터의 재구성을 방지하기 위하여 벡터는 송아지 장의 포스파타제로 미리 처리되었다. 열충격 형질전환 과정에 의하여 E. coli 균주 TOP10을 형질전환시키기 위하여 결찰 혼합물이 사용되었다. 재조합 벡터 플라스미드를 잠복시킨 세포가 앰피실린 함유 LB 배지 상에서 선택되었다. 앰피실린-내성 콜로니로부터 정제된 플라스미드 DNA는 항원-특이성 올리고뉴클레오티드 및 DNA 분획을 프로브로 사용하는 DNA 제한분석 및 하이브리다이제이션 기술에 의하여 재조합 인서트의 존재를 위하여 분석되었다. 융합 펩티드의 금속-결합 도메인은 고정화된 금속 친화성 크로마토그래피(Immobilised Metal Affinity Chromatography)에 의한 재조합 단백질의 일단계 정제를 허용한다. 재조합 플라스미드를 잠복시킨 세포의 세포 배양 용해액 내의 재조합 항원은 ProbondJ 레진(Invitrogen)으로의 고친화성 결합에 의하여 정제된다. ProbondJ는 폴리-히스티딘 결합 도메인을 포함하는 재조합 단백질을 정제하기 위하여 사용되는, 니켈이 전하를 띤 세파로즈 레진이다. 결합된 단백질은 ProbondJ 레진으로부터 저 pH 버퍼로 또는 이미다졸 또는 히스티딘의 경쟁에 의하여 용출된다. 폴리-히스티딘 리더 펩티드는 엔테로키나제를 가진 발현된 재조합 단백질의 소화에 의하여 실질적으로 제거될 수 있다. 엔테로키나제는 벡터에서 폴리-His 친화성 표식(tag) 및 다중 클로닝 부위 사이에서 흥미 있는 단백질로부터 떨어져 폴리-His 테일(tail)이 절단되도록 처리되는 엔도펩티다제 인식 서열을 인식한다. 그리고 나서 정제된 재조합 항원은 기재한 항체, 백신 및 진단 분석의 제형의 생성에 사용될 수 있다.
실시예 11
P. gingivalis의 검출을 위한 분자적 진단 분석에서 항원-특이성 뉴클레오티드 서열을 이용하는 방법, 여기에 기재된 항원을 엔코딩하는 유전자의 보존 때문에, 본 발명의 핵산 서열은 P. gingivalis 유전물질을 검출하기 위한 분자적 진단 분석에 사용될 수 있다. 특히 항원 서열-특이성 올리고뉴클레오티드는 P. gingivalis의 핵산을 증폭하고, 증폭된 핵산을 검출하는 데에 프라이머 및/또는 프로브로 사용하기 위하여 합성될 수 있다. 최근의 분자 생물학의 발전은 핵산 서열을 효소에 의하여 증폭하는 몇 수단을 제공하였다. 현재, 가장 일반적으로 사용되는 방법인 PCRTM(폴리머라제 연속반응, Cetus Corporation)는 프라이머로 알려진 서열의 택 폴리머라제를 사용하고, 가열 사이클로 데옥시리보뉴클레익에시드(DNA)스트랜드를 분리하고 흥미 있는 유전자를 지수적으로 증폭시킨다. 현재 개발중인 다른 증폭 방법으로는 DNA 리가제 및 증폭될 DNA 서열과 상보적인 2개의 DNA 세그먼트 반으로 구성되는 프로브를 이용하는 LCRTM(리가제 연속반응, BioTechnica International), 상보적인 RNA의 지수적인 생성을 위한 DNA 템플레이트를 제조하는 데에 사용되는 복제될 DNA에 상보적인 프로브에 부착되는 리보뉴클레익에시드(RNA)서열 템플레이트 및 효소 QB 리플리카제(Gene-Trak Systems), 증폭될 핵산 서열로서 RNA 또는 DNA 상에서 실시될 수 있는 NASBATM(뉴클레익에시드를 기초로 한 증폭, Cangene Corporation)가 있다.
특이성 유전자 서열로 하이브리다이제이션시킬 수 있는 핵산 프로브는 표본당 103~104 유기체에 가까운 레벨의 민감성을 가진 생물학상 표본에서 특정한 병원체를 검출하는 데에 성공적으로 사용되어왔다(1990, Gene Probes for Bacteria, eds. Macario and deMacario, Academic Press). 특이성 목적 DNA 서열의 증폭을 허용하는 방법과 결합하여, 종-특이성 핵산 프로브는 임상표본에서 유기체를 검출하는 데에 민감도를 높일 수 있다. 이들 프로브의 사용으로 종래의 배양물 및/또는 종래의 생물학적 확인 기술에 의존하지 않고 직접적으로 검출할 수 있다. 본 발명의 이 실시예는 여기에 기재된 P. gingivalis의 주요한 항원을 엔코딩하는 유전자의 종-특이성 서열을 증폭하는 프라이머, 및 이들 증폭된 DNA 분획로 특이적으로 하이브리다이징시킨 프로브에 관한 것이다. 본 발명의 핵산 서열을 사용하고 본 발명의 방법에 따라서, 하나 만큼의 P. gingivalis 유기체는 외래 DNA 10㎍/㎖의 존재하에 검출될 수 있다.
본 실시예는 P. gingivalis DNA의 서열, 존재한다면, 잇몸내 플라크, 타액, 혈액, 종기 및 증폭이 일어났는지를 부가적으로 결정하는 다른 유체를 포함하는 임상 표본으로부터 축출된 DNA로부터 서열을 증폭하는 데에 사용될 수 있는 종-특이성 올리고뉴클레오티드에 관한 것이다. 본 발명의 일 실시예에서 한 쌍의 P. gingivalis-특이성 DNA 올리고뉴클레오티드 프라이머는 임상 표본으로부터 추출된 DNA 내에 존재할 수 있는 P. gingivalis 게놈 DNA로 하이브리다이징시키고, 효소에 의한 합성 및 온도 사이클링을 이용하여 2개의 측면 프라이머 사이에서 게놈 DNA의 특이성 세그먼트를 증폭시키는 데에 사용된다. 프라이머의 각 쌍은 이중 스트랜드 DNA의 각 스트랜드에 상보적으로 합성된 본 발명의 P. gingivalis 뉴클레오티드 서열만으로 하이브리다이징되도록 디자인되어 있다. 그리하여 이형 DNA의 마이크로그램 양의 존재에서도 반응은 특이하다. 본 발명을 기술하기 위하여, DNA의 양성(유전자) 스트랜드의 서열로부터 유래한 프라이머는 "양성 프라이머"라고 칭하고, 음성 (상보적인 스트랜드의 서열로부터 유래한 프라이머는 "음성 프라이머"라고 칭한다.
상업적으로 이용가능한 방법 중 하나에 의하여 DNA를 증폭시킬 수 있다. 예를 들면, 폴리머라제 연속반응을 이용하여 DNA를 증폭시킬 수 있다. 프라이머가 목적 DNA의 반대 스트랜드에 하이브리다이징되면, 열안정성 DNA 폴리머라제에 의하여 2개의 프라이머 사이의 영역을 가로질러 DNA의 특이성 세그먼트가 복제되도록 온도는 상승한다. 그리고 나서 각 사이클에서 2개의 프라이머 사이에서 서열을 나타내는 DNA의 양이 2배가 되고, 존재하는 경우에는 P. gingivalis DNA 서열의 특이성 증폭이 생기도록 반응을 열순환된다. P. gingivalis DNA로부터 유래된, 증폭된 DNA 분획은 액상 하이브리다이제이션에 의하여 부가적으로 확인될 수 있다. 이 테스트는 P. gingivalis DNA의 증폭된 세그먼트에 특이적으로 하이브리다이징시키는 프로브로서 하나 또는 그 이상의 라벨링된 올리고뉴클레오티드를 이용한다. 서열-특이성 증폭된 DNA의 존재는 자동 방사선사진술을 이용한 겔지연분석(gel retardation assay)과 같은 알려진 몇 방법중의 하나를 사용하여 검출될 수 있다. 그리하여, 본 발명의 뉴클레오티드 서열은 P. gingivalis 검출용 진단 키트에서 상업적으로 활용하는 올리고뉴클레오티드의 합성에 대한 기초를 제공한다. 관련된 실시예에서, 프라이머로 사용된 올리고뉴클레오티드는 직접 라벨링되거나, 합체 라벨로 합성될 수 있다. 사용된 라벨에 따라서, 친화성 매트릭스 상에서 결합한 후에 동위원소 또는 비색 검출을 이용하여 증폭 생성물이 검출될 수 있다.
DNA는 P. gingivalis를 포함하는 임상 표본에서 기술상 알려진 방법을 사용하여 추출될 수 있다. 예를 들면, 표본에 함유된 세포를 TE 버퍼로 세척시키고 원심분리에 의하여 펠렛화시킬 수 있다. 그리고 나서 세포를 세척제 및 프로테인아제 K를 포함하는 증폭 반응 버퍼 100㎕에서 재현탁시킬 수 있다. 폴리머라제 연속반응을 사용하여, 얻은 시료는 10mM Tris pH 8.3, 50mM KCl, 1.5mM MgCl2, 0.01%젤라틴, 0.45% NP40TM, 0.045% 트윈20TM, 및 60㎍/㎖ 프로테인아제 K에서 세포를 구성할 수 있다. 시료를 55℃의 수조에서 1시간동안 인큐베이션시켰다. 인큐베이션 후에, 프로테인아제 K를 열로 불활성화시키기 위하여 시료를 95℃에서 1시간동안 인큐베이션시켰다. 그리고 나서 하기한 바와 같이 폴리머라제 연속반응의 프로토콜에 따라서 증폭시킬 수 있다.
P. gingivalis DNA는 폴리머라제 연속반응에 의하여 핵산을 증폭시키는 몇 프로토콜 중의 하나를 사용하여 증폭시킬 수 있다. 본 실시예의 한 형태에서 DnaK를 엔코딩하는 유전자는 하기와 같은 조건에서 임상적으로 분리된 P. gingivalis에서 증폭시킬 수 있다. 증폭될 DNA(게놈 DNA 1㎍)는 0.5㎖의 마이크로퓨즈 튜브로 분배되고, 0.2mM dNTPs(dATP, dCTP, dGTP, dTTP), 각 양성 및 음성 올리고뉴클레오티드 프라이머의 0.25㎍, Taq Ⅰ 폴리머라제 1유니트, Taq Ⅰ 10×버퍼(5㎕), 1mM MgCl2(최종 농도), 및 살균 증류수를 포함하는 반응 혼합물을 가하여 50㎕로 총 부피를 조절하였다. Taq Ⅰ 폴리머라제를 반응 혼합물에 첨가하고, 사용하기 전에 볼텍싱하지 않고 약하게 혼합하였다. 약 2방울의 미네랄 오일 층을 각 튜브에 첨가하고나서 튜브를 온도사이클러에 놓았다. 박테리아 DNA 증폭을 위해서는 30 내지 15사이클이 일반적으로 충분하다. 1사이클은 95℃에서 1분, 37℃에서 1분동안 이루어진다. 제1 사이클은 완전하게 변성시키기 위하여 95℃에서 12분동안 인큐베이션시키는 과정을 포함한다.
P. gingivalis의 DnaK을 엔코딩하는 유전자에 특이적으로 하이브리다이징시키고 DNA 증폭 및/또는 검출에 사용되는 프라이머 또는 프로브로서 유용한 올리고뉴클레오티드는 본 발명에 개시된 뉴클레오티드 서열로부터 기술상 알려진 방법을 사용하여 생화학적으로 합성될 수 있다. P. gingivalis의 올리고뉴클레오티드의 특이성은 각 개별 서열을 위한 젠뱅크 데이터베이스(Genvank)에 의하여 감사될 수 있다. 일반적으로, 올리고뉴클레오티드는 낮은 G-C 함량으로 선택되어야 한다. 검출을 목적으로 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 방사선 동위원소로 말단에 라벨링될 수 있다. 유전자 서열의 증폭용으로 사용된 2개의 프라이머 내부의 프로브 서열은 T4 폴리뉴클레오티드 키나제 및 감마 32P ATP를 사용하여 말단에 라벨링될 수 있다. 키나제 버퍼(50mM Tris, pH 7.6 10mM MgCl2, 5mM 디티오트레이톨, 0.1mM 스퍼미딘-HCl, 0.1mM EDTA, pH 8.0) 내의 프로브 DNA 20pmol를 감마 32P ATP 120μ Ci와 혼합시키고 37℃에서 1시간동안 인큐베이션시켰다. 라벨링된 프로브를 상온의 Tris Borate EDTA(TBE)에서 200볼트에서 1시간동안 진행시킨 8% 아크릴아미드겔 상의 비합체된 라벨로부터 분리시켰다. 3분동안 X-선 풀림으로 아크릴아미드겔을 노출시킴으로써 라벨링된 프로브를 우선위치시켰다. 그리고 나서 얻은 자동 방사선사진을 겔 아래에 놓고, 라벨링된 프로브를 포함하는 밴드를 겔로부터 절제하였다. 겔 조각을 1밀리리터의 살균된 증류수에서 분쇄시키고, 37℃에서 철야로 쉐이커 인큐베이션시킴으로써 프로브를 용출시켰다. 용출된 프로브를 크로마토그래피 프렙 칼럼을 이용한 원심분리에 의하여 겔 분획로부터 분리시켰다. 액체 신틸레이션에 의하여 유리섬유 필터 상의 라벨링된 프로브 1마이크로리터를 카운팅하여 프로브의 방사능을 결정하였다. 이러한 프로브 서열은 본 발명에 개시된 바람직한 뉴클레오티드 서열의 증폭에 사용되는 2개의 프라이머 내부에 있는, 여기에 개시된 프로브 서열 중 하나에서 선택될 수 있다.
본 발명의 조성물 및 방법에 따라서 증폭된 목적 서열의 검출을 향상시키기 위하여 기술상 알려진 방법이 선택되어 사용될 수 있다. 서열을 액상 하이브리다이제이션시킴으로써 증폭된 DNA 서열 검출의 민감도를 향상시킬 수 있다. 겔 전기영동 및 서던 하이브리다이제이션 및 자동 방사선사진술과 함께 실시하는 겔 전기영동에 외에, 본 발명의 조성물 및 방법에 따라 기술상 알려진 검출 방법으로 선택 될 수 있는 방법으로는 겔 전기영동으로 실시하는 제한효소소화, 라벨링된 올리고뉴클레오티드 프로브로 실시하는 슬롯-블롯 하이브리다이제이션, 방사선 동위원소로 라벨링된 올리고뉴클레오티드 프로브로 실시하는 증폭, 겔 전기영동, 서던 하이브리다제이션 및 자동 방사선사진술을 이용한 방사선 동위원소로 라벨링된 프라이머로 실시하는 증폭, 도트 블롯 및 자동 방사선사진술을 이용한 방사선 동위원소로 라벨링된 프라이머로 실시하는 증폭, 친화성 표식을 포함하는 올리고뉴클레오티드로 실시하는 증폭(예를 들면, 비오틴, 또는 비오틴을 합체하는 하나의 프라이머 및 DNA 결합 단백질에 특이한 서열을 가진 다른 프라이머) 후에 친화성을 기초로 한 분석(예를 들면 ELISA)에 의한 검출, 및 형광체를 포함하는 올리고뉴크레오티드로 실시하는 증폭 후에 형광 검출하는 방법이 있다.
비동위원소의 검출의 일 실시예는 본 발명의 올리고뉴클레오티드 프라이머로 비오틴을 합체화시키는 것과 관계 있다. 프라이머의 5'-아미노기는 설포-NHS-비오틴으로 비오틴화될 수 있거나 비오틴은 비오틴으로 라벨링된 dNTPs 의 존재하에서 프라이머를 합성함으로써 프라이머로 직접 합체될 수 있다. 그리고 나서 비동위원소로 라벨링된 프라이머는 임상 시료의 DNA를 증폭시키는 데에 사용된다. 증폭된 목적 서열의 존재 또는 부재의 검출은 그것에 아비딘(avidin)을 가진 친화성 매트릭스를 결합시키고 나서, 이어서 일어나는 기실 현상으로 복합체를 가시화시키는 데에 사용될 수 있는 효소를 포함하는 아비딘 접합체로 인큐베이션시켜 증폭된 목적을 포함함으로써 이루어진다. 선택적으로 증폭된 목적 서열의 매트릭스 상으로 부착되는 대응하는 프로브로 하이브리다이제이션시킴으로써 고정시킬 수 있다. 이어서 일어나는 기질 현상으로 복합체를 가시화시키는 데에 사용될 수 있는 효소를 포함하는 아비딘 접합체를 이용하여 검출이 이루어질 수 있다.
실시예 12
진단 면역측정법에서 항원성 단백질, 펩티드 또는 키메라 펩티드를 사용하는 방법.
여기에 기술된 P. gingivalis 항원, 관련 펩티드, 올리고펩티드 또는 키메라는 백신 제형에서 면역원, 진단 분석용 또는 치료 및/또는 진단적인 가치가 있는 P. gingivalis-특이성 항혈청 생성용 항원으로서 사용되기 위하여 정제될 수 있다. 발현 벡터 시스템으로부터 생성된 P. gingivalis의 항원 또는 그 올리고펩티드 또는 펩티드 또는 키메라 또는 재조합 단백질, 재조합 펩티드 또는 재조합 올리고펩티드는 세척제 추출, 크로마토그래피(예를 들면, 이온 교환, 치환성, 면역친화성, 또는 초여과 및 사이징 칼럼), 미분 원심분리, 미분 용해도, 또는 단백질의 정제를 위한 다른 표준 기술을 포함하는 기술상 알려진 방법으로 정제시킬 수 있다.
본 실시예의 다른 실례에서, 재조합 Ag1 또는 gpa 수용체 단백질(HRP)을 폴리히스티딘 발현 플라스미드로부터 정제시킬 수 있다. 이 방법으로 재조합 HRP를 정제시키기 위하여 HRP를 엔코딩하는 유전자(도 1)를 플라스미드 pRSETA(Invitrogen Corporation)과 같은 폴리히스티딘 발현 벡터로 클로닝시켜, 발현시 몇 개의 히스티딘 잔기("폴리히스트딘 테일")가 HRP의 아미노 말단으로 부착되도록 하였다. HRP를 엔코딩하는 유전자를 포함하는 분획이 적절한 엔도뉴클레아제로 이전에 제한되고 이어서 송아지 장의 포스파타제로 처리된 발현 벡터로 결찰되었다. 결찰 혼합물은 E. coli 균주 BL21(DE3) 세포를 일렉트로포레이션시키는 데에 사용되었고, 형질전환체는 플라스미드 프로모터에 대하여 적절한 배양으로 HRP를 엔코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드를 위하여 분석되었다. 이러한 한 클론을 분리시키고 또한 E. coli 호스트 균주로 도입될 때 HRP를 발현시키는 것으로 나타났다.
재조합 HRP는 하기와 같이 정제되었다. 돌연변이체를 포함하는 돌연변이체 배양물 15㎖를 37℃의 LB 앰피실린 브로스내에서 철야로 성장시켰다. 다음날 아침에 브로스 135㎖을 철야로 배양한 배양물에 접종시키고 37℃에서 1시간동안 성장시켰다. 4℃에서 5,000×g로 10분동안 원심분리하여 세포를 제거하였다. 상청액을 10kDa 차단 멤브레인을 이용한 초여과법으로 10㎖으로 농축시키고 나서 레진상의 니켈을 지나 재조합 HRP의 폴리히스티딘 테일과 결합한 1.6㎖의 레진(예를 들면, ProBondTM, Invitrogen)과 상온에서 10분간 혼합시켰다. 그리고 나서 레진을 원심분리에 의하여 분리시켰다. 레진을 변성 세척 버퍼(8M 우레아, 20mM 소디움 클로라이드 pH8.0) 4㎖로 2회 우선 세척하여 레진으로부터 HRP를 용출시켰다. 그리고 나서 pH 6.0의 변성 세척 버퍼 4㎖로 2회 세척시켰다. pH 4.0의 변성 세척 버퍼 4㎖로 칼럼을 2회 세척시켰다. 1㎖의 분획을 각각 수집하고 세척제(0.1% 트리톤 X-100)를 포함하는 포스페이트-버퍼 살라인(PBS)에 대하여 투석시켰다. 용출된 단백질을 겔 전기영동 및 쿠마시 블루 염색으로 분석하였더니 단일 밴드가 나타났다. 이 방법으로 95% 정제된 단백질을 얻었다는 것이 추측된다. 얻은 정제된 재조합 HRP는 고유 단백질을 인식하는 항체와 면역반응성을 가진다.
명세서를 걸쳐 사용된 바와 같이, 항원 올리고펩티드는 여기에서의 항원의 아미노산 서열의 부분에 대응하는 일련의 펩티드로 정의되며, 하나로 합성되거나 화학적으로 결합된 첨부된 서열로 개시된다. 이러한 펩티드 또는 올리고펩티드는 터셔리 부틸옥시카르보닐(terbutyloxycarbonyl) 아미노산을 이용(Mitchell et al., 1978, J. Org. Chem. 43:2845-2852), 폴리아미드 지지체 상의 9-플루오레닐메틸옥시카르보닐 아미노산을 이용(Dryland et al., 1986, J. Chem. So. Perkin Trans. I, 125-137)한 표준 고상 펩티드 합성, 펩스칸(pepscan) 합성(Geysen et al., 1987, J. Immunol. Methods 03:259; 1984, Proc. Natl. Acad. Sic. USA 81;3998), 표준 액상 펩티드 합성 또는 재조합 발현 벡터 시스템을 포함하는 기술상 알려진 펩티드 합성의 몇몇 방법 중의 하나를 사용하여 합성될 수 있다.
펩티드 또는 올리고펩티드의 면역학적 성질을 실질적으로 떨어뜨리지 않기 위하여, 아미노산의 삭제 및 치환 (및 아미노산의 연장 및 부가를 포함) 및 다른 방식에 의한 것과 같이 펩티드 또는 올리고펩티드가 변형될 수 있다. 특히, 여기에 기술된 항원의 아미노산 서열, 또는 그 펩티드 또는 올리고펩티드 또는 키메라는 하나 또는 그 이상의 아미노산을 기능적으로 동등한 아미노산으로 대체시켜 단백질, 펩티드 또는 올리고펩티드 또는 키메라의 물리화학적 작용에서는 차이점이 관철되지 않는 변화로 변경될 수 있다. 기능적으로 동등한 아미노산은 유사한 극성 또는 전하와 관련되고 및/또는 가지는 아미노산으로서 기술상 잘 알려져 있다. 그리하여 실질적으로 서열 리스팅(Sequence Listing)에 기술된 아미노산 서열인 아미노산 서열은 단백질, 펩티드, 또는 올리고펩티드 또는 키메라의 우선적인 생물학적 기능을 변화시키지 않고 기증적으로 동등한 아미노산과 치환된 것을 포함하는 아미노산을 언급하는 것이다.
선모 단백질(FP) 및 HRP의 에피토프를 포함하는 키메라 펩티드를 생성하는 한 실례에서 각 유전자의 규정된 영역이 구조물 내에서 결찰되고 나서, 플라스마드 발현 벡터(pGEX2T)가 글루타티온-S-트랜스퍼라제(GST), Schistosoma japonicum의 26킬로달톤 단백질을 가진 융합 펩티드로서 E. coli내에서 외래 폴리펩티드가 합성되게 하는 발현 시스템 내에서 발현될 수 있다. 이러한 유형의 P. gingivalis DNA를 템플레이트로 사용하는 실시예에서 FP-HRP를 엔코딩하는 유전자의 선택된 영역은 선택된 올리고뉴클레오티드를 사용하는 폴리머라제 연쇄반응에 의하여 증폭될 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 얻은 증폭된 유전자 분획이 결찰 후에 그 5' 말단에 BamH I의 제한부위를 포함하고 3' 말단에 EcoR I 제한부위를 포함하여 증폭된 키메라 분획이 pGEX2T로 정방향적으로 클론될 수 있도록 디자인된다. 각 재조합 플라스미드의 서열을 디데옥시 시퀀싱에 의하여 확인된다. 각 재조합 펩티드를 정제시키기 위하여, 키메라 유전자 분획을 포함하는 각 재조합 플라스미드를 E. coli JM109로 형질전환시킨다. 브로스 360㎖에 철야로 배양시킨 배양물 40㎖을 첨가하고 흔들면서 37℃에서 1.5시간동안 인큐베이션시킴으로써, 돌연변이체를 25㎍/㎖의 앰피실린을 포함하는 LB 브로스 400㎖에서 성장시켰다. IPTG를 0.01mM에 첨가시키고 배양물을 3시간 더 인큐베이션시켰다. 세포를 5000×g에서 원심분리시키고 세포 펠렛을 PBS 5㎖에서 재현탁시켰다. 세포를 음파처리시키고 혼합물을 10,000×g로 10분동안 원심분리시켰다. 상청액을 미리 팽창시킨 글루타티온-아가로즈 비드 0.5㎖와 혼합시켰다. 2분동안 상온에서 혼합시킨 후에, (글루타티온과 결합된 융합 펩티드를 가진) 비드를 1% 트리톤-X-100을 포함하는 PBS로 2회 더 세척시켰다. 그리고 나서 비드를 0.05M Tris, pH 8.0에서 1회 세척시켰다. 글루타티온-S-트랜스퍼라제로부터 FP-HRP 키메라 펩티드를 절단시키기 위하여, 세척된 비드를 상온의 Tris 버퍼 내의 0.25%(최종 농도) 인간 트롬빈에서 1시간동안 인큐베이션시켰다. 그리고 나서, 프로테아제 저해제인 PMSF를 100㎍/㎖의 농도가 되도록 첨가하였다. 원심분리하여 비드를 제거하고 정제된 FP-HRP 키메라 펩티드를 상청액에 포함시킨다. 면역블롯 분석으로 융합 펩티드가 면역반응성이며, Ag1- 및 Ag2-특이성 토끼 다클론성 항혈청이라는 것을 확인하였다.
정제된 항원, 펩티드, 올리고펩티드 및 키메라는 P. gingivalis에 의하여 감염된 것으로 의심되는 개체의 체액(body fluid)내에 존재하는 P. gingivalis-특이성 항혈청의 검출을 위한 면역측정법의 항원으로 사용될 수 있다. 면역측정법에서 Ag(1-4) 또는 관련된 펩티드를 검출하는 것은 기술상 알려진 어떠한 면역측정법을 포함하나, 방사선 면역측정법, ELISA, "샌드위치" 분석, 침강소 반응, 응집 분석, 형광체 면역측정법, 및 켐일루미네센스(chemiluminescence)를 기초로 한 면역측정법에 제한되는 것은 아니다.
실시예 13
Ag(1-4) 및 관련된 펩티드 및 키메라와 관련된 백신 제형을 위한 방법 및 화합물
본 발명의 본 실시예는 P. gingivalis에 대하여 방어하거나 P. gingivalis에 의한 감염을 처리하는 활성 면역화를 위한 예방 및/또는 치료학적 조성물로서 사용될 항원 및/또는 그 펩티드 또는 올리고펩티드 또는 키메라에 관한 것이다. 백신의 제조를 목적으로 박테리아 단백질을 포함하는 P. gingivalis의 항원은 면역원성이고, P. gingivalis의 균주 중에서 보존된, 완전한 박테리아 상에 하나 또는 그 이상의 표면이 노출된 에피토프로 정방향된 기능적인 항체를 유도해야 한다.
본 발명의 한 실례에서, 백신 항원, 단백질에 바람직한 성질을 가진 Ag4는 실시예 6에 기재된 방법을 사용하여 P. gingivalis로부터 정제될 수 있다. 애쥬번트(20㎍ QS21)로 4주 간격으로 2회로 하여, 정제된 Ag4 단백질(25㎍)로 마우스가 면역화된다. 면역화된 마우스의 혈액을 최종 면역화 후, 32일에 뽑고, 면역 혈청을 저류시켰다. 저유된 면역 혈청을 전체 박테리아(P. gingivalis 균주 W50)에 대하여 ELISA를 이용하여 분석하였다. 전체 세포 ELISA를 위하여 철야로 배양한 박테리아 배양물을 면봉으로 수확하고 600㎚에서 0.1의 흡광도를 가지도록 PBS에 현탁시켰다. 박테리아 현탁액 수적(100㎕)을 96개의 웰 마이크로타이터 플레이트의 웰에 첨가시키고 상온에서 철야로 건조시켰다. 플레이트를 PBS내의 0.1%(w/v) 젤라틴 100㎕으로 블록킹시켰다. 이것 및 모든 잔여의 인큐베이션은 상온에서 1시간동안 실시하였다. 블록킹 용액을 제거하고 0.1%(w/v) 젤라틴을 가진 PBS에서 희석시킨 면역 혈청 100㎕를 웰에 첨가하고 인큐베이션시켰다. PBS로 3회 세척시킨 후에 재조합 단백질 G에 접합된 알칼리 포스페이트[0.1%(w/v) 젤라틴을 가진 PBS에서 1:1500] 100㎕로 인큐베이션시켜 결합된 항체를 검출하였다. 플레이트를 세척시키고 p-니트로페닐 포스페이트(디에탄올아민내의 2㎎/㎖)의 100㎕/웰을 첨가하여 칼라 현상이 용이하게 하고, 30분 후에, 3M NaOH 50㎕를 첨가하여 반응을 종결시켰다. 흡광도는 ELISA 리더를 이용하여 492㎚에서 읽었다. 블랭크 웰의 흡광도보다 큰 흡광도에서 희석도의 역수를 종점 역가로 결정하였다.
바람직한 백신 항원의 성질을 가진 W50의 항원을 더욱 기술하자면, 균주 W50에 대하여 일으킨 저유된 면역 혈청은 이형 균주와 교차-반응성을 가지는 것으로 나타났다.
백신 개발을 위하여 항원-특이성 아미노산 서열은 항원 또는 관련된 펩티드 또는 키메라를 발현시키는 재조합 벡터를 포함하는 호스트로부터 정제될 수 있다. 이러한 호스트는 박테리아 형질전환체, 이스트 형질전환체, 사상성 진균 돌연변이체, 및 항원 아미노산 서열을 엔코딩하는 벡터로 감염되거나 트랜스펙션된 것 중 하나의 배양된 세포를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 항원의 부분에 대응되는 펩티드 또는 올리고펩티드 또는 키메라는 항원의 화학적 또는 효소적 절단, 화학적으로 제조될 수 있거나 기술상 알려진 방법 및 참고로 항원을 엔코딩하는 유전자의 뉴클레오티드 서열로부터 추론된 아미노산 서열을 사용하여 화학적으로 합성될 수 있다. 선택적으로 펩티드는 재조합 벡터로부터 제조될 수 있다. 단백질, 펩티드 또는 올리고펩티드 또는 키메라 면역원은 백신 제형 및 치료학적으로 효과적인 양으로 면역반응을 일으키는 관련 면역원성 물질로 포함될 수 있다. 백신 접종할 인간 또는 동물로 백신 제형을 도입하는 것에 대하여 많은 방법이 알려져 있다. 이들은 피부내(intradermal), 근육내, 복강내(intraperitoneal), 정맥내, 피하, 안구의(ocular), 비내, 및 경구 투여를 포함하나, 이것에 제한되는 것은 아니다. 백신은 용액, 폴리머 또는 리포솜과 같은 생리적 캐리어 및 애쥬번트 또는 그 결합을 더욱 포함할 수 있다.
다양한 애쥬번트가 백신 제형과 관련하여 사용된다. 애쥬번트는 면역반응을 조절하고, 소량의 백신 항원 또는 백신 항원이 단독으로 투여될 경우에는 더 적은 용량을 사용함으로써 더욱 영구적이고 높은 레벨의 면역성을 얻는 것을 돕는다. 애쥬번트의 예로는 불완전 프로인트 애쥬번트(OFA), 애쥬번트 65(땅콩오일, 만니드 모노올레산염(mannide monooleate) 및 알루미늄 스테아르산염(aluminium monostearate)을 포함), 오일에멀젼, 리비(Ribi) 에쥬번트, 플루로닉 폴리올, 폴리아민, 아브리딘(Avridine), 퀼 A(Quil A), 사포닌, MPL, QS-21, 및 알루미늄염과 같은 메네랄겔을 포함한다. 다른 실례로는 SAF-1, SAF-0, MF59, Seppic ISA720과 같은 수성 에멀젼 내의 오일, 및 ISCOMs 및 ISCOM 매트릭스와 같은 다른 미립자 애쥬번트가 있다. 광범위하나 소모적이지 않은 다른 애쥬번트의 실례 리스트가 Cox and Coulter 1992(In: Wong WK (ed.) Animals parasite control utilising technology. Bocca Raton; CRC press, 1992; 49-122)에 기재되어 있다. 애쥬번트에 더하여 백신은 종래의 제약적으로 허용가능한 캐리어, 의약품첨가물(excipient), 충전제(filler), 버퍼 또는 희석제를 적절하게 포함할 수 있다. 애쥬번트를 포함하는 백신의 1회 또는 그이상의 용량을 예방할 목적으로 투여하여 치주염을 방지하고 이미 존재한 치주염을 치료할 수 있다.
본 발명의 이와 같은 형태의 또 다른 실시예는 합텐, 즉 면역반응을 그 자체에 의하여 일으키지 못하는 분자로서 항원-특이성 아미노산 서열의 생성에 관한 것이다. 이러한 경우에, 합텐은 면역 시스템에 노출될 때 커플링된 합텐에 면역원성을 주는 캐리어 또는 다른 면역원성 분자에 공유결합될 수 있다. 그리하여 캐리어 분자에 결합된 이러한 항원-특이성 합텐은 백신 제형에서 면역원이 될 수 있다.
본 실시예의 다른 형태로는 P. gingivalis에 의한 감염에 대하여 보호하는 생 재조합 바이러스 백신, 재조합 박테리아 백신, 재조합 약독화 박테리아 백신, 또는 불활성 재조합 바이러스 백신 중 하나를 제공한다. 우두(vaccinia) 바이러스는 다른 유기체로부터 유래한 백신 항원을 발현하기 위하여 가공된 전염성 바이러스 중에서, 기술상 가장 잘 알려진 예이다. 약독화되거나 아니면 그 자체가 질환을 일으키지 않도록 처리된 재조합 생 우두 바이러스는 호스트를 면역하기 위하여 사용된다. 재조합 바이러스의 호스트 내에서의 부가복제는 Ag(1-4) 단백질, 관련된 펩티드 또는 키메라와 같은 백신 항원으로 면역시스템에 계속적인 자극을 제공하여 장기간 견디는 면역성을 제공한다.
다른 생백신 벡터는 아데노바이러스, 거대 세포봉입체바이러스(cytomegalovirus)를, 바람직하게는 우두와 같은 폭스바이러스(Poxvirus) (Paoletti and Panicali, 미국특허 제4,603,112호) 및 약독화된 Salmonella 균주(Stocker 등의 미국특허 제5,210,035호, 제 4,837,151호 및 제4,735,801호, 및 Curtiss 등의 1988, Vaccine 6:155-160)를 포함한다. 생백신은 실질적으로 장기간 견디는 면역성을 부여할 수 있는 면역 시스템을 계속적으로 자극하기 때문에 특히 유리하다. 면역 반응이 부가의 P. gingivalis 감염에 대한 보호성일 때, 생백신 그 자체는 P. gingivalis에 대한 예방용 백신으로 사용될 수 있다. 특히, 생백신은 구강의 공생체 서식처인 박테리아에 기초할 수 있다. 이 박테리아는 재조합 Ag(1-4), 펩티드, 올리고펩티드 또는 키메라 펩티드를 운반하는 벡터에 형질전환될 수 있고, 그 후에 특히 구강에서, 특히 경구 점막의 콜로니 형성하는 데에 사용된다. 일단 경구 점막에 콜로니가 형성되면, 재조합 단백질, 펩티드 또는 키메라의 발현이 점막 관련 임파성 조직을 자극하여 중화 항체를 생성한다.
실시예 12에서 설명된 것과 같은 분자생물학적 기술을 사용한, 이와 같은 형태의 본 발명을 더욱 기술하면, Ag(1-4)를 엔코딩하는 유전자 또는 하나 또는 그 이상의 펩티드 또는 키메라를 엔코딩하는 유전자 분획을 유두 바이러스 게놈 DNA의 에피토프를 발현시키나 유두 바이러스 벡터의 성장 또는 복제에 부정적으로 영향을 미치지 않는 부위에 삽입시킬 수 있다. 재조합 바이러스 결과물은 백신 제형에서 면역원으로 사용될 수 있다. 동일한 방법을 사용하여 면역원으로 사용하기 전에 발현된 면역원에 실질적으로 영향을 끼치지 않고, 기술상 알려진 화학적 수단에 의해서처럼 재조합 바이러스가 불활성되는 것을 제외한 불활성된 재조합 바이러스 백신 제형을 제조할 수 있다. 다른 에피토프를 발현시키는 불활성된 바이러스의 혼합물은 다가의 불활성된 백신의 제형에 사용될 수 있다. 그 중 한 경우에서 불활성된 재조합 백신 또는 불활성된 바이러스의 혼합물은 백신 항원에 대한 면역 반응을 강화시키기 위하여 적절한 애쥬번트와 함께 제형화될 수 있다.
변화된 다른 실시예에서는 유전물질이 직접 백신 제형으로서 사용된다. 하나 또는 그 이상의 조절 요소에 효과적으로 연결된 Ag(1-4), 관련 펩티드 또는 올리고펩티드 또는 키메라를 포함하는 핵산(DNA 또는 RNA)을 직접 도입하여 병원성 P. gingivalis 균주에 대하여 개체에게 백신접종("직접 유전자 전달(direct gene transfer)")시킬 수 있다. 주요한 기관 조직뿐만 아니라 혈관내피세포와 같은 백신접종된 개체 세포에 의한 유전물질의 발현을 일으키는 백신접종된 개체의 직접 유전자 전달은 발현 플라즈마, 양이온성 리포솜 복합체(Zhu et al., 1993, Science 261:209-211)를 정맥내로 주사하는 것과 같은 기술에 의하여 논증되었다. 벡터 DNA를 목표세포로 전달하는 다른 효과적인 방법은 기술상 알려져 있다. 한 실시예에서, 바이러스 유전자를 포함하는 정제된 재조합 플라스미드 DNA는 백신의 접종(양친으로, 점막으로 또는 유전자-총(gene-gun) 면역화)에 사용되어 보호면역반응을 유도한다(Fynan et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:11478~11482). 다른 실시예에서 개체로부터 제거된 세포는 기술상 알려진 표준 과정에 의하여 트랜스펙션되거나 엘렉트로포레이팅되어 재조합 벡터 DNA를 목적세포로 도입시킬 수 있다. 그 후에 재조합 벡터 DNA를 포함하는 세포를 벡터내에서 발현된 선택마커와 같은 기술로 알려진 방법을 사용하기 위하여 선택되고, 선택된 세포는 개체에 재도입되어 항원성 단백질, 관련 펩티드 또는 올리고펩티드 또는 키메라를 발현시킨다.
유전물질로 백신 접종하는 한 바람직한 방법은 개체에 하나 또는 그 이상의 Ag(1-4), 관련 펩티드 또는 올리고펩티드 또는 키메라를 엔코딩하고, 발현에 필요한 하나 또는 그 이상의 조절 서열에 효과적으로 연결된 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자를 투여하는 공정을 포함한다. 핵산 분자는 직접 투여되거나 바이러스 벡터로 우선 도입되고 벡터를 통하여 투여될 수 있다. 핵산분자는 제약적으로 허용 가능한 캐리어 또는 희석제로 투여되거나 백신의 효율성을 증가시킬 수 있는 화합물을 포함시킬 수 있다. 이들 부가의 화합물은 면역반응을 강화시키는 애쥬번트, 면역반응을 조절하는 화합물, 예를 들면, 시토킨, 집합적으로 총괄하여 "면역 조절자"로 지칭되는 것들, 또는 세포에 의한 핵산의 업테이크를 증가시키는, "핵산 업테이크 인헨서"로 지칭되는 다른 화합물을 포함하나, 이것들에 제한되는 것은 아니다. 부모의 루트(정맥내, 복강내, 피내, 피하 또는 근육내)를 통하거나, 또는 비인두(nasopharynx), 기관(trachea), 또는 위장관의 점막 표면과 접촉하여 핵산 분자로 면역화시킬 수 있다.
활성 면역화 대신에, 면역화는 수동적, 즉 Ag(1-4) 에피토프에 대한 항체를 포함하는 정제된 면역글로불린의 투여를 포함하는 면역화일 수 있다.
실시예 14
하기는 항-Ag1 항체를 포함하는 치약 제형의 제안된 실시예이다.
성분 중량%
디칼슘 포스페이트 디하이드레이트 50.0
글리세롤 20.0
소디움 카르복실메틸 셀룰로오스 1.0
소디움 라우릴 설페이트 1.5
소디움 라우로일 사코니세이트 0.5
향미료 1.0
소디움 사카린 0.1
클로르헥시딘 글루코네이트 0.01
덱스트라나제 0.01
항-Ag1 함유 염소혈청 0.2
물 밸런스
실시예 15
하기는 치약 제형의 제안된 실시예이다.
성분 중량%
디칼슘 포스페이트 디하이드레이트 50.0
소르비톨 50.0
글리세롤 10.0
소디움 카르복실메틸 셀룰로오스 10.0
소디움 아우릴 설페이트 1.0
소디움 라우로일 사코니세이트 1.5
향미료 0.5
소디움 사카린 0.1
소디움 모노플루오로포스페이트 0.3
클로르헥시딘 글루코네이트 0.01
덱스트라나제 0.01
항-Ag2 포함 송아지혈청 0.2
물 밸런스
실시예 16
하기는 치약 제형의 제안된 실시예이다.
성분 중량%
디칼슘 포스페이트 디하이드레이트 50.0
소르비톨 10.0
글리세롤 10.0
소디움 카르복실메틸 셀룰로오스 1.0
라우로일 디에탄올아미드 1.0
수크로즈 모노라우레이트 2.0
향미료 1.0
소디움 사카린 0.1
소디움 모노플루오로포스페이트 0.3
크로즈헥시딘 글루코네이트 0.01
덱스트라나아제 0.01
항-Ag1 포함 송아지우유 Ig 0.1
물 밸런스
실시예 17
하기는 치약 제형의 제안된 실시예이다.
성분 중량%
소르비톨 22.0
아일랜드 이끼 1.0
수산화나트륨(50%) 1.0
간트레즈(Gantrez) 19.0
물(탈이온화됨) 2.69
소디움 모노플루오로포스페이트 0.76
소디움 사카린 0.3
피로포스페이트 2.0
알루미나 수산화물 48.0
향미 오일 0.95
단클론성 항-Ag1 마우스 0.3
소디움 아우릴 설페이트 2.00
실시예 18
하기는 액상 치약 제형의 제안된 실시예이다.
성분 중량%
소디움 폴리아크릴레이트 50.0
소르비톨 10.0
글리세롤 20.0
향미료 1.0
소디움 사카린 0.1
소디움 모노플루오로포스페이트 0.3
클로르헥시딘 글루코네이트 0.01
에탄올 3.0
항-Ag2 함유 말의 Ig 0.2
리놀릭에시드 0.05
물 밸런스
실시예 19
하기는 세구제 제형의 제안된 실시예이다.
성분 중량%
에탄올 20.0
향미료 1.0
소디움 사카린 0.1
소디움 모노플루오로포스테이트 0.3
클로드헥시딘 글루코네이트 0.01
라우로일 디에탄올아미드 0.3
항-Ag1 포함 토끼 Ig 0.2
물 나머지
실시예 20
하기는 세구제 제형의 제안된 실시예이다.
성분 중량%
간트레즈 S-97 2.5
글리세린 10.0
향미 오일 0.4
소디움 모노플루오로포스페이트 0.05
클로르헥시딘 글루코네이트 0.01
라우로일 디에탄올아미드 0.2
단클론성 마우스 항-Ag2 0.3
물 밸런스
실시예 21
하기는 정제 제형의 제안된 실시예이다.
성분 중량%
슈가 75-80
옥수수 시럽 1-20
향미 오일 1-2
NaF 0.01-0.05
단클론성 마우스 항-Ag1 0.3
Mg 스테아레이트 1-5
물 밸런스
실시예 22
하기는 잇몸마사지 크림 제안된 실시예이다.
성분 중량%
백색 광유(white petrolatum) 8.0
프로필렌 글리콜 4.0
스테아릴 알코올 8.0
폴리에틸렌 글리콜 4000 25.0
폴리에틸렌 글리콜 400 37.0
슈크로즈 모노스테아레이트 0.5
클로르헥시딘 글루코네이트 0.1
단클론성 마우스 항-Ag2 0.3
물 밸런스
실시예 23
하기는 츄잉 검 제형의 제안된 실시예이다.
성분 중량%
검 베이스 30.0
칼슘 카보네이트 2.0
소르비톨 결정 53.0
글리세린 0.5
향미오일 0.1
단클론성 마우스 항-Ag1 및 항-Ag2 0.3
물 밸런스
특정 실시예에서처럼 많은 변형 및/또는 수정이 광범위하게 기재된 본 발명의 사상 또는 범위로부터 이탈됨 없이 제조될 수 있을 것이 당업자에 의하여 인식될 것이다. 그러므로 본 실시예는 모든 점에서 단지 제한적인 것이 아니고 단지 설명하고자 하는 것으로 인식되어져야 한다.

Claims (17)

  1. Porphyromonas gingivalis 감염 치료용 조성물로서, 상기 조성물은 적절한 애쥬번트, 허용가능한 캐리어, 또는 이들 모두, 및 정제된 P. gingivalis 면역원을 포함하고, 상기 면역원은 도 1에 도시된 아미노산 서열을 가지는 항원 1인 것을 특징으로 하는 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 적어도 하나의 부가적인 정제된 P. gingivalis 면역원을 추가로 포함하고, 상기 면역원은 항원 2, 항원 3 및 항원 4로 이루어지는 군에서 선택되며,
    상기 항원 2는 P. gingivalis의 항원이고 내부 아미노산 서열 을 가지며,
    상기 항원 3은 P. gingivalis의 항원이고 내부 아미노산 서열 을 가지며,
    상기 항원 4는 P. gingivalis의 항원이고 내부 아미노산 서열 을 가지는 것을 특징으로 하는 조성물.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 항원 3은 AGAL에 수탁번호 NM 97/04974로 기탁된 클론의 오픈리딩프레임에 의하여 엔코딩되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  4. 정제된 P. gingivalis 항원으로서, 상기 항원은 도 1에 도시된 아미노산 서열을 가짐을 특징으로 하는 정제된 P. gingivalis 항원.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 항원은 AGAL에 수탁번호 NM 97/04974로 기탁된 클론의 오픈리딩프레임에 의하여 엔코딩되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 정제된 P. gingivalis 항원.
  6. 제1항, 제2항 또는 제3항에 의한 조성물 또는 제5항 또는 제9항에 의한 항원에 대하여 발생되는 항체를 포함하는 항체 제제.
  7. 제6항의 항체 제제를 포함하는, Porphyromonas gingivalis의 감염을 겪는 대상을 치료하기 위한 조성물.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 항제 제제가 세구제 또는 처분으로 투여되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  9. 제1항 내지 제3항에서 정의한 바와 같은 면역원을 포함하는, 개체의 P. gingivalis의 감염의 예증을 감소시키기 위한 조성물.
  10. Porphyromonas gingivalis 감염 치료용 조성물로서, 상기 조성물은 적절한 애쥬번트, 허용가능한 캐리어, 또는 이들 모두, 및 하나의 P. gingivalis 면역원을 엔코딩하는 서열을 포함하는 DNA 분자를 포함하고, 상기 면역원은 도 1에 도시되는 아미노산 서열을 가지는 항원 1인 것을 특징으로 하는 조성물.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 DNA 분자는 AGAL에 수탁번호 NM 97/04974로 기탁된 클론의 오픈리딩프레임에 존재하는 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  12. 분리된 DNA 분자로서, 상기 DNA 분자는 도 1에 도시된 아미노산 서열을 엔코딩하는 서열을 가지는 분리된 DNA 분자.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 분리된 DNA 분자는 도 1에 도시된 서열을 가지는 분리된 DNA 분자.
  14. 뉴클레오티드 프로브로서, 상기 프로브는 제12항 내지 제13항의 DNA 분자에 특이적으로 하이브리다이징하는 서열을 가지는 뉴클레오티드 프로브.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 프로브가 라벨링된 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드 프로브.
  16. 재조합 호스트 세포로서, 상기 호스트 세포는 호스트 세포가 적어도 하나의 면역원을 발현하도록 조절 서열에 작동가능하게 결합된 적어도 하나의 P. gingivalis 면역원을 엔코딩하는 DNA 서열(들)로 형질전환되며, 상기 면역원은 도 1에 도시되는 아미노산 서열을 가지는 항원 1인 것을 특징으로 하는 재조합 호스트 세포.
  17. 제 16항에 있어서,
    상기 호스트 세포는 경구 공생체인 것을 특징으로 하는 재조합 호스트 세포.
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