JP5469785B2

JP5469785B2 - ポルフィロモナスジンジバリス試薬

Info

Publication number: JP5469785B2
Application number: JP2004031432A
Authority: JP
Inventors: 野々村友佑
Original assignee: 有限会社ミクロデント
Priority date: 2004-02-06
Filing date: 2004-02-06
Publication date: 2014-04-16
Anticipated expiration: 2024-02-06
Also published as: JP2005218396A

Description

本発明は、成人性歯周病における最も病原性の高い細菌であるポルフィロモナスジンジバリス（Porphyromonas gingivalis）を培養、同定、あるいは病原性を検査する試薬に関する技術である。（ここでいう試薬は、培地を含む。）

従来には、ポルフィロモナスジンジバリスのみを識別培養する選択培地はなく、またポルフィロモナスジンジバリスのみを同定する試薬もなく、さらに病原性を検査する試薬もなかった。

従来のポルフィロモナスジンジバリスの選択培地は、羊血液にペプトンを基礎としてナリジクス酸１５ｍｇ、バシトラシン１０ｍｇ、コリスチン硫酸塩１０ｍｇによる培地しかなくこのいわゆるＢＧＡ培地は、ポルフィロモナスジンジバリスの選択性もわるく、かつこの培地に生える他の細菌コロニーとの鑑別もできていなかった。またポルフィロモナスジンジバリスからのトリプシン酵素を同定する試薬はあったが、他の菌すなわちトレポネーマ（Treponema）からのトリプシン酵素の量が大きくポルフィロモナスジンジバリスのみを選択同定するものではなかった。さらにキャプノサイトファーガ（Capnocytophaga）からも前記酵素は発生するのでポルフィロモナスジンジバリスのみの選択同定にはほど遠いものであった。

１〔請求項１の手段〕
請求項１のポルフィロモナスジンジバリスを培養する培地を備えるポルフィロモナス
ジンジバリス培地において、
前記培地は、糖を含まないことを特徴とし、かつ馬溶血液を２パーセントから３パーセントのいずれかの濃度で備える事を特徴とする。
２〔請求項２の手段〕
請求項２のポルフィロモナスジンジバリスを培養する培地を備え、この培地で培養され
た培養物の培養状態からポルフィロモナスジンジバリスの検出を行うポルフィロモナス
ジンジバリス試薬において、
前記培地は、糖を含まないことを特徴とし、かつ馬溶血液を２パーセントから３パーセント
のいずれかの濃度で備える事を特徴とする。
３〔請求項３の手段〕
請求項３のポルフィロモナスジンジバリス培地またはポルフィロモナスジンジバリス
試薬において、
前記培地は、当該培地で培養される培養物の選択性を高める抗菌剤を含むことを特徴と
する。

１〔請求項１の作用および効果〕
請求項１のポルフィロモナスジンジバリスを培養する培地を備えるポルフィロモナスジンジバリス培地において、
前記培地は、糖を含まないことを特徴とし、かつ溶血液を２パーセントから３パーセントのいずれかの濃度で備える事を特徴とする。

ゆえに培地が糖を含まないことで、ジンジバリス以外の菌の繁殖が抑えられ、ジンジバリスの繁殖の選択性が向上する。そして、培地が溶血液を含むことで、ジンジバリスの培養効果が高まるとともに、培養されたジンジバリスが特有の色変化（黒色変化）を起こすことで、ジンジバリスの「効率的な育成」と「検出」とを行うことができ

ゆえに培地が糖を含まないことで、ジンジバリス以外の菌の繁殖が抑えられ、ジンジバリスの繁殖の選択性が向上する。そして、培地が溶血液を含むことで、ジンジバリスの培養効果が高まるとともに、培養されたジンジバリスが特有の色変化（黒色変化）を起こすことで、ジンジバリスの「効率的な育成」と「検出」とを行うことがでる。
さらに２〜３％、とくに２．５％の溶血液濃度にて発育、選択性が最適化される。

２〔請求項２の作用および効果〕
請求項２のポルフィロモナスジンジバリスを培養する培地を備え、この培地で培養された培養物の培養状態からポルフィロモナスジンジバリスの検出を行うポルフィロモナスジンジバリス試薬において、

ゆえに培地が糖を含まないことで、ジンジバリス以外の菌の繁殖が抑えられ、ジンジバリスの繁殖の選択性が向上する。そして、培地が溶血液を含むことで、ジンジバリスの培養効果が高まるとともに、培養されたジンジバリスが特有の色変化（黒色変化）を起こすことで、ジンジバリスの「効率的な育成」と「検出」とを行うことができ

前記培地は、糖を含まないことを特徴とし、かつ溶血液を２パーセントから３パーセントのいずれかの濃度で備える事を特徴とする。
ゆえに培地が糖を含まないことで、ジンジバリス以外の菌の繁殖が抑えられ、ジンジバリスの繁殖の選択性が向上する。そして、培地が溶血液を含むことで、ジンジバリスの培養効果が高まるとともに、培養されたジンジバリスが特有の色変化（黒色変化）を起こすことで、ジンジバリスの「効率的な育成」と「検出」とを行うことがでる。
さらに２〜３％、とくに２．５％の溶血液濃度にて発育、選択性が最適化される。

３〔請求項３の作用および効果〕
請求項３のポルフィロモナスジンジバリス培地またはポルフィロモナスジンジバリス試薬において、
前記培地は、当該培地で培養される培養物の選択性を高める抗菌剤を含むことを特徴とするので、
さらにポルフィロモナスジンジバリスの選択性が高まる。

本発明のポルフィロモナスジンジバリス試薬（Porphyromonas gingivalis 試薬）を実施例または変形例に基づき説明する。
生体、特に口腔内よりのポルフィロモナスジンジバリス（Porphyromonas gingivalis）の定性、定量、同定、鑑別、病原性、活動性のいづれかまたはその組み合わせを計測、検査する事を実施の形態とする。本発明の処方は、特にことわりなければ１リットル（１ｌ、/ｌまたは１０００ｍｌ）中の量である。

〔実施例の構成〕
一例として基礎処方として栄研化学の糖無添加（ブドウ糖、可溶性でんぷん無添加）ＡＢＣＭ処方の試薬（培地）を使用する。（栄研マニュアルに組成が記載されている。）その試薬に溶血液などを混入する。またはＡＢＣＭ処方の試薬から糖を除き、溶血液を添加しても良いし、適度なペプトンと酵母を添加したものに適度なＮａとＫを添加したものを使用しても良い。

そして前記ＡＢＣＭ処方試薬においてヘミンを５ｍｇ追加し総量で１０ｍｇとするとさらによい。（元処方ではヘミンは５ｍｇである。）またビタミンＫ_１を１０ｍｇ追加するとさらに良い。ここでヘミン、ビタミンＫ（Ｋ_１，Ｋ_２，またはＫ_３のいづれかまたは、その組み合わせ）は、１０ｍｇ程度から２０ｍｇ未満がよい。さらにビタミンＫに関して、Ｋ_３は不安定だが発育に良好であるが、Ｋ_１が安定していて使いよいのでＫ_１を主に使用する。また酵母は、３ｇ程度から８ｇ程度がよい。

以上具体的には、基礎試薬処方として
植物エキス２ｇ
酵母エキス５ｇ
肉エキス３ｇ
ペプトン１０ｇ
とりペプトン１０ｇから/または１５ｇ
ソイペプトン３ｇ
塩化ナトリウム２ｇ
Ｌ−システイン塩酸塩０．３ｇ
チオグリコール酸ナトリウム０．３ｇ
ヘミン１０ｍｇ
ビタミンＫ_１１０ｍｇ
などを使用する。

ここで添加溶血液において具体的には、溶血液を馬由来とし、その添加量を１０００ｍｌ（１リットル）中に２５ｍｌ、すなわち２．５％とする。ここで、溶血液は、馬溶血液２％（２０ｍｌ）程度から３％（３０ｍｌ）程度が望ましい。

すなわちここで、前記糖なしＡＢＣＭ処方試薬にヘミン５ｍｇ添加、ビタミンＫ_１を１０ｍｇ添加、すなわちヘミン、ビタミンＫを総量で１０ｍｇとした培地（寒天は総量で１５ｇとした。）を基礎培地として、この培地に馬溶血液添加量を１％、２．５％、３％、５％、１０％とし、各培地にポルフィロモナスジンジバリス（Porphyromonas gingivalis）をマックファーランド＃３から、順次１／１０づつ希釈した菌液を滴下するミスラー法によるコロニーの発育、コロニーの黒色化実験を行うと、２．５％が発育が良い。また適度な黒色化を有している。

１％は、黒色化が弱い。３％は、２日あるいは３日目での発育が２．５％よりやや劣る。黒色化は、２．５％より若干良い程度で誤差範囲内である。５％、１０％は、発育が非常に悪い。菌液の濃度が濃いものに関しては黒色化が良いが、特に菌液濃度が少量の場合に発育が悪い（＃３の1/100以下程度の場合特に）。

つまりポルフィロモナスジンジバリス試薬は、馬溶血液を２．５パーセントの濃度で備える事を特徴とするポルフィロモナスジンジバリス試薬を使用してもよい。

ここで、黒色化は、識別、鑑別、同定に大きな情報を与えるものである。

この実験での結果は、２．５％馬溶血液添加がポルフィロモナスジンジバリスの発育において最も良く、かつ黒色化も良好であった。総合的に次に良かったのは、３％馬溶血液添加である。黒色化を期待しなければ１％程度以下でも２．５％についで良い場合がある。

さらにまた、溶血液をウサギ由来とすると５％、２．５％で発育、黒色化は同等であり、馬溶血液２．５％とウサギ溶血液２．５％の比較では、格段に馬溶血液２．５％が発育、黒色化において勝っている。

ここで、寒天の添加は、試薬１０００ｍｌ中に０ｇから１５ｇ程度の範囲で目的にあわせて添加する。ここでは、総量で１５ｇとした。

抗生剤の添加は、一例としてナリジクス酸１５ｍｇ（Nalidixic acid）、バシトラシン１０ｍｇ（Bacitracin）、コリスチン硫酸塩１０ｍｇ（Colistin sulfate）を使用する。

［動作］
口腔内の歯周ポケットの入り口付近の歯垢を綿球などで除去し、ペーパーポイントを歯周ポケットに挿入する。そしてそのポイントを前記試薬（培地）の上にのせて、背直探針などで塗布する。（採取手段あるいは採取方法に関しては、特願２００２ー１３７８４１健康計測診査装置に詳細が記載されている。）

一例として、その後アネロ嫌気パックなどの嫌気剤とともに嫌気ジャーに入れ、その嫌気ジャーをインキュベーターに入れ、一例として３７度Ｃ４８時間などで培養する。この培養時間は、結果が観察されればどのような時間でもよいのはいうまでもない。

すると試薬（培地）表面に黒色コロニーが観察できる。このコロニーを通常のコロニー判定を行う画像処理装置をコロニー判定手段としてもよいし、また白色コロニーが生じた場合、黒色コロニーと白色コロニーの比率を計測し、その比率が大きいほどリスク大と表示する表示手段を採用してもよい。前記コロニー判定手段を使用し、前記採取手段の採取量とを、既知の検量線による定量手段などをはじめとした既知の定量化手段を使用し、歯周ポケット内のポケット内定量手段を採用しても良い。

ここで、特願２００２ー１３７８４１健康計測診査装置の培養計測手段を使用してもよい。

１定性、
本試薬（培地）に生じる黒色コロニーは、高確率でポルフィロモナスジンジバリス（Porphyromonas gingivalis）であるので定性計測ができる。

２定量、前記コロニー判定手段やポケット内定量手段を本試薬（培地）に使用すれば歯周ポケットのポルフィロモナスジンジバリス（Porphyromonas gingivalis）の定量ができる。

３同定、本試薬（培地）に生じる黒色コロニーは、高確率でポルフィロモナスジンジバリス（Porphyromonas gingivalis）であるので、前記精度での同定となる。

４鑑別、本試薬（培地）に生じる黒色コロニーは、高確率でポルフィロモナスジンジバリス（Porphyromonas gingivalis）であるので他の菌との鑑別ができる。

５病原性、本試薬により多くのポルフィロモナスジンジバリス（Porphyromonas gingivalis）が生えれば、より高い病原性を有することがわかる。
さらに羊血液を採用すれば、溶血菌との共生、拮抗状態が把握できるので、さらに病原性の精度があがる。ここで羊血液は、前記２．５％馬溶血液添加試薬（培地）に０より多く、５％程度までぐらいの範囲を添加する。（２．５％程度の添加がほどよいようである。）

６活動性
本試薬に生えるポルフィロモナスジンジバリス（Porphyromonas gingivalis）の、コロニーの数、大きさなどによるコロニー発育速度が活動性の値と比例するので、歯周ポケット内でのポルフィロモナスジンジバリス（Porphyromonas gingivalis）の活動性がわかる。

さらに羊血液を採用すれば、溶血菌との共生、拮抗状態が把握できるので、さらに活動性の精度があがる。ここでポルフィロモナスジンジバリスは、溶血環をつくらない程度の溶血性であるが、他の溶血菌、特にベータ溶血（β溶血）菌の溶血を利用できる場合がある。ここでいう共生とは、ポルフィロモナスジンジバリスが、この溶血を利用できる場合、この溶血菌を共生菌とし、利用できない場合の菌を拮抗菌とする。
具体的な一例として、スタフィロコッカスStaphylococcus（オーレウスなど（Staphylococcus aureus））などの溶血環上のポルフィロモナスジンジバリスコロニーは、黒色化できるが、エンテロコッカスEnterococcus（フェカーリスなど（Enterococcus faecalis ））などでは、その溶血環内のポルフィロモナスジンジバリスコロニーを黒色化することができない。

［効果］
ポルフィロモナスジンジバリス（Porphyromonas gingivalis）の定性、定量、同定、鑑別、病原性、活動性のいづれかまたはその組み合わせを計測、検査することができる。

［変形例］
培地として寒天を使用してもよいし、また液体（ブロス）としてもよい。液体とした場合、培地というより試薬という名称がなじみやすい。

添加抗菌剤は、
Ａ：ナリジクス酸１５ｍｇ、バシトラシン１０ｍｇ、コリスチン硫酸塩１０ｍｇにバンコマイシン（Vancomycin）（０＜バンコマイシン量＜５ｍｇ）。ここでバンコマイシン量は、１ｍｇ程度が好ましい場合が多い。ここで、バシトラシンをのぞき、バンコマイシンを１ｍｇ程度から１０ｍｇ程度添加しても良い。

Ｂ：ナリジクス酸１５ｍｇ、バシトラシン１０ｍｇ、コリスチン硫酸塩１０ｍｇにカナマイシン（Kanamycin）、ゲンタマイシン（Gentamycin）、あるいはアミカシン（Amikacin）などのアミノグルコシド系抗生剤（０＜添加量＜２０ｍｇ）。を添加してもよい。

Ｃ：ナリジクス酸１５ｍｇ、バシトラシン１０ｍｇ、コリスチン硫酸塩１０ｍｇにアモキシリン（Amoxicillin）、アンピシリン（Ampicillin）、バクアンピシリン（Bacampicillin）（バキャンピシリン）、レナンピシリン（Lenampicillin）などのペニシリン系抗菌剤（０＜添加量＜２０ｍｇ）。を添加してもよい。

Ｄ：エノキサシン（Enoxacin）（０＜エノキサシン量＜２０ｍｇ）のみを抗菌剤として使用してもよい。

Ｅ：Ａ、Ｂ、Ｃまたはナリジクス酸１５ｍｇ、バシトラシン１０ｍｇ、コリスチン硫酸塩１０ｍｇにエノキサシン（０＜エノキサシン量＜２０ｍｇ）
などを使用しても良い。

ガス計測手段との併用：
図１にしめされるガス計測手段に、赤外線を通過させ、その吸収度を計測し、ポルフィロモナスジンジバリス（Porphyromonas gingivalis）の定性、定量計測としても良い。

ガス計測手段１は、試薬（培地）を入れる嫌気ジャー２のチャンバーの一部に計測ビームを通過させるためのガス計測手段１が設けられている。ここで嫌気ジャーとガス計測手段は、外気と完全に遮断されており、密閉状態であり、ジャー内部にはポルフィロモナスジンジバリスを培養するための嫌気手段により嫌気状態となっている。
具体的には、ＢａＦ_２などの計測ビームに対して容易に透過する窓３が設けられたチューブが嫌気ジャー２と交通し取り付けられている。窓は、計測波長のビームが通過すればどのようなものでもよい。ここで、嫌気ジャー２とガス計測手段１とは、既知のガス選択膜などによる特定ガス選択手段にて選択交通させても良いし、全透過性（孔など）としてもよい

そして試薬にポルフィロモナスジンジバリスを投与し嫌気ジャー内にて培養すると嫌気ジャー２および前記計測手段１の内部を細菌産生ガスが充満する。

このガスを前記窓ごしに計測する。具体的には、赤外分光分析手段からの計測ビームを前記窓に通過させ、後述の波長における吸収率を計測するなどである。

ここで嫌気雰囲気を作り出す既知の嫌気手段（アネロパックなど）からのガスを計測しておき、その値を差し引く既知の基線補正手段を使用してもよい。

ここで、嫌気ジャーの内部の嫌気度を確認するために酸素インジケータを挿入しても良い。

ガス計測にて本試薬を計測する場合は、ポルフィロモナスジンジバリス（Porphyromonas gingivalis）の前記計測が迅速、高精度にできる。

具体的には、強度基準を窓３の基本透過率（計測波長での透過率など）を基準として赤外線の波数にして２３６１ｃｍ^−１の吸収ピークを計測しても良い。さらに具体的な一例としてはＢａＦ_２ウインドウの基線を基準として前記吸収ピークの吸収値を表示しても良い。（計測波長が複数の場合は、それぞれの比率、差分を比較したり、また基準強度を計測波長における窓材の透過強度としたりしてもよい。）

また赤外線の波数にして２３６１ｃｍ^−１の吸収ピークをＢａＦ_２窓（フッ化バリウム窓）に塗布した既知の標準物質やガス計測手段１内部のガスなどの吸収ピークとの比率を算出する解析手段を使用して定性、あるいは定量計測してもよい。ここで、ガス計測手段１内部のガスは、前記嫌気手段（アネロパックなど）からのＣＯ_２（濃度）を基準としてもよい。
さらにまたビームの基準強度を基準として前記吸収ピークの吸収値を表示してもよい。（無計測時のビーム強度を基準としても良い。）

他例として具体的には、赤外線の波数にして２３３６ｃｍ^−１と２３６１ｃｍ^−１の吸収値を除算手段（割り算）に入力し、その値を表示手段に表示するなどである。さらにここで、その値に多重に閾値を設けたレベル判定手段にて複数以上のレベル値にして表示してもよい。
一例として、
Ａその値が１．０程度ならリスク大と表示する相対リスク表示手段や、
Ｂ２３６１ｃｍ^−１の吸収が大きければリスク大と表示する特定リスク表示手段や、
ＡとＢの値を加減乗除した各値を採用する複合リスク表示手段などを採用してもよい。
もちろんこれらの値を、他の機器に供給するためにＵＳＢ、１３９４、またはその他の規格インターフェィスに出力する出力手段を設けても良い。

ガスクロマトグラフィーにてガスを計測してフェニール酢酸（Phenyl-acetic acid）を定性あるいは、定量してポルフィロモナスジンジバリス（Porphyromonas gingivalis）の定性、定量計測としてもよい。

上記手段、試薬、方法などは、術者や製造者が取捨選択し使用、製造する。

〔総合変形例〕
前記実施例においては、寒天を１３〜１５ｇ程度添加して培地形状としたものを開示したが、液体の状態で使用してもよいし、半流動の状態でもよい。

ガス計測手段の使用波長は、７００ｃｍ^−１，７５０ｃｍ^−１，８３０ｃｍ^−１、９００ｃｍ^−１、１０３０ｃｍ^−１，１０７０ｃｍ^−１，１１８０ｃｍ^−１，１２２５ｃｍ^−１、１２８０ｃｍ^−１，１３３０ｃｍ^−１，１４００ｃｍ^−１，１４４０ｃｍ^−１，１４９０ｃｍ^−１、１６７０ｃｍ^−１、１９３０ｃｍ^−１，２３３６ｃｍ^−１、２３６１ｃｍ^−１、２６００ｃｍ^−１，３０００ｃｍ^−１などのいずれかまたはその組み合わせピークを使用してもよい。またフェニール酢酸（phenyl-acetic acid）の紫外、可視、赤外ピークを計測してもよい。さらにまたガスクロを使用してフェニール酢酸（phenyl-acetic acid）を計測してもよい。

上記実施例または変形例は単独で実施しても良いし、また組み合わせて実施しても良い。また他の用途に使用しても良い。また上記手段に関しても、術者や製造者が取捨選択し使用、製造するなど単独あるいはどのような組み合わせの構成をなしてもよい。

一例として、前記基礎培地（試薬）は、栄研化学ＡＢＣＭ培地を基礎としたが、アミノ酸あるいはタンパクを基礎として、添加物として酵母、無機塩、ｐＨ調整剤、ナトリウム（Ｎａ），カリウム（Ｋ）、還元剤、寒天、ヘミン、ビタミンＫ（Ｋ１，Ｋ２，Ｋ３のいづれかひとつまたはその組み合わせ）のいづれかひとつまたはその組み合わせを有する試薬（培地）を採用してもよいなどである。。

リン酸２カリウムと/またはリン酸２ナトリウムを２．５ｇ程度または０＜添加量＜１０ｇ程度添加してもよい。ここでＮａとＫの比をポルフィロモナスジンジバリス（Porphyromonas gingivalis）試薬において調節し最適な発育比としてもよい。

コリスチン硫酸塩と併用あるいは、コリスチン硫酸塩の代わりとしてポリミキシンＢ（Polymyxin B）を０＜添加量＜＝２０ｍｇ程度添加してもよい。

前記抗菌剤として抗グラム陽性菌抗菌剤としてバンコマイシン、バシトラシンを開示したが、タゴシッド（Ｔｅｉｃｏｐｌａｎｉｎ）やグラマイシン（Gramicidin）などを抗グラム陽性菌抗菌剤として０＜添加量＜＝２０ｍｇ程度添加してもよい。抗グラム陽性菌抗菌剤は、バンコマイシンとバシトラシンを複添加してもよいし、バンコマイシン、タゴシッドをバシトラシンの代わりに添加するような抗グラム陽性菌抗菌剤添加分として単独添加でもよい。

抗菌剤としてバクシダールを０＜添加量＜＝２０ｍｇ程度、併用または単独で添加してもよい。

一例としてｐＨ指示薬を本試薬に添加したり、添付してｐＨ値計測手段を組み合わせて
し使用しても良い。

また一例として特願２００２ー１３７８４１健康計測診査装置の各手段のいづれかを使用してもよいなどである。

本ポルフィロモナスジンジバリス（Porphyromonas gingivalis）試薬は、生体、特に口腔内よりのポルフィロモナスジンジバリス（Porphyromonas gingivalis）の定性、定量、同定、鑑別、病原性、活動性などの計測、検査などが可能となる。

ガス計測手段の一例。

符号の説明

１ガス計測手段
２嫌気ジャー
３窓（一例としてＢａＦ_２ウインドウ）

Claims

ポルフィロモナスジンジバリスを培養する培地を備えるポルフィロモナスジンジバ
リス培地において、
前記培地は、糖を含まないことを特徴とし、かつ馬溶血液を２パーセントから３パーセントのいずれかの濃度で備える事を特徴とするポルフィロモナスジンジバリス培地。
ポルフィロモナスジンジバリスを培養する培地を備え、この培地で培養された培養物
の培養状態からポルフィロモナスジンジバリスの検出を行うポルフィロモナスジンジ
バリス試薬において、
前記培地は、糖を含まないことを特徴とし、かつ馬溶血液を２パーセントから３パーセントのいずれかの濃度で備える事を特徴とするポルフィロモナスジンジバリス試薬。
請求項１または請求項２のいずれかに記載のポルフィロモナスジンジバリス培地また
はポルフィロモナスジンジバリス試薬において、
前記培地は、当該培地で培養される培養物の選択性を高める抗菌剤を含むことを特徴と
するポルフィロモナスジンジバリス培地またはポルフィロモナスジンジバリス試薬。