MXPA96005615A

MXPA96005615A - Vacuna para moraxella catarrhalis

Info

Publication number: MXPA96005615A
Application number: MXPA/A/1996/005615A
Authority: MX
Inventors: F Murhpy Timothy; Bhushan Reva
Original assignee: Research Foundation Of State University Of New York
Priority date: 1994-05-17
Filing date: 1995-01-20
Publication date: 1998-10-23

Abstract

La presente invención describe composiciones que comprenden proteína"E"de membrana externa, y péptidos y oligopéptidos de la misma, de Moraxella catarrhalis. Adicionalmente, se describen las secuencias de nucleótidos que codifican la proteína, péptido o oligopéptido, asícomo vectores recombinantes que contienen estas secuencias. La proteína, péptido u oligopéptido, se pueden producir a partir de sistemas de células huésped que contienen estos vectores recombinantes. Los péptidos y oligopéptidos también pueden ser sintetizados químicamente. Se describen los usos de la proteína, péptidos y oligopéptidos como antígenos para formulaciones de vacuna, y como antígenos en inmunoanálisis de diagnóstico. Las secuencias de nucleótidos sonútiles en la construcción de vectores para utilizarse como vacunas, para inserciones en bacterias atenuadas con el fin de construir una vacuna bacteriana recombinante y para insertarse en un vector viral en la construcción de una vacuna viral recombinante. También se describen el uso de secuencias de nucleótidos relacionados al gen que codifica E como iniciadores y/o sondas en análisis de diagnósticos moleculares para la detección de M. catarrhalis.

Description

VACUNA PARA MORAXELLA CATARRHALIS Esta invención fue realizada con el apoyo del gobierno bajo la concesión A128304 autorizada por los Institutos Nacionales de Salud, y el apoyo por el Departamento de Asuntos Veteranos El gobierno tiene ciertos derechos en la invención Campo de la Invención La presente invención se refiere a composiciones que comprenden una proteína, y péptidos y oligopéptidos de las mismas, asociados con la membrana externa de Moraxella catarr alis (denominada previamente como Branhamella catarrhalis) Mas particularmente, la invención está dirigida a composiciones de una proteína, péptidos, y oligopéptidos de la misma, denominados como una proteína de membrana externa, "E", la cual es una protema que se modifica al calor de M catarrhalis, que tiene una masa molecular aparente de aproximadamente 35,000 daltons a 25°C También se describen métodos para preparar E, péptidos de E, y o gopeptidos de E utilizando ADN recombmante y/o técnicas bioquímicas Relacionado con lo mismo, se describe la secuencia de ADN que codifica E, y vectores útiles para dirigir ia expresión de E, peptidos de E, y oligopeptidos de E, y las células huésped transformadas con dichos vectores Las proteínas, peptidos, y oligopeptidos, se pueden utilizar como inmunógenos en formulaciones de vacunas para inmunización activa, y se pueden utilizar para generar antisueros específicos para proteínas y específicos para peptidos, utiies para la inmunización pasiva, y como reactivos para análisis diagnósticos Las secuencias de nucleotidos descritas, proveen la síntesis de oligonucleotidos correspondientes que se pueden utilizar como reactivos en análisis de diagnósticos dirigidos a la detección de material genético de M catarrhalis Antecedentes de la Invención Moraxella catarrhalis (también conocida como una Branhamella catarrhalis) es un patógeno importante del tracto respiratorio en humanos M catarrhalis es la tercera causa mas común de otitis media en infantes y niños, después del Streptococcus pneumomae y Haemophilus mfluenzae no determinable, como es documentado en los estudios en los cuales se ha utilizado timpanocentesis, para establecer el agente etiologico (Murphy, 1989, Pediatr Infect Dis J 8 S75-S77) M catarrhalis es una causa común de sinusitis y conjuntivitis tanto en niños como en adultos (Véase por ejemplo, Bluestone, 1986, Drugs 31 A132-S141, Brorson y otros, 1976, Scand J Infecí Dis 8 151-155, y Romberger y otros, 1987, South Med J 80926-928), y es una causa importante de infecciones del tracto respiratorio inferior en adultos con bronquitis crónica y enfermedad pulmonar obstructiva (Murphy y otros, 1992, Am Rev Respir Dis 146 1067-1083, Catlin, 1990, Clin Microbio! Rev 3293-320) Adicionalmente, M catarrhalis, puede causar neumonía endocarditis, septicemia, y meningitis en huespedes inmunocomprometidos (Cocchi y otros, 1968, Acta Paediatr Scand 57451-3, Douer y otros, 1977, Ann Intern Med 86 116-119, McNeely y otros, 1976, Am Rev Respir Dis 114 399-402) Dado que la otitis media recurrente esta asociada con la morbidez substancial, existe un ínteres para identificar las estrategias para evitar estas infecciones Uno de dichos enfoques es el desarrollo de vacunas Una vacuna efectiva para evitar la otitis media bacteriana, podría necesitar incluir antigenos que podrían generar protección contra la infección por S pneumomae, H influenzae no determinable y M catarrhalis Ademas, el desarrollo de la vacuna para el neumococo y H influenzae no determinable, son progresivos de tal manera que los antigenos potencialmente protectores han sido identificados y actualmente están siendo sometidos a pruebas (Véase por ejemplo, Murphy y otros, Patente de E U A No 5,173,294, y Vella y otros, 1992, Infecí Immun 604977-4983) Dado que estas vacunas se están desarrollando y utilizando mas ampliamente la importancia relativa de M catarrhaiis como una causa de otitis media, se incrementara en la siguiente decada Ademas de infantes y niños que se benefician de una vacuna para evitar la otitis media ocasionada por M catarrhalis, los adultos con enfermedad pulmonar obstructiva crónica, y ios niños y adultos inmunocomprometidos podrían beneficiarse con una vacuna para prevenir infecciones ocasionadas por M catarrhalis Los componentes bacterianos que han sido investigados como antigenos de vacunas potenciales incluyen pohsacapdos, lipopolisacapdos o modificaciones de los mismos, y las proteínas de membranas externas En general, como se ejemplifica por el pohsacapdo capsular de tipo b de H influenzae, se ha mostrado que los antigenos de polisacapdos son un inmunogeno pobre en niños menores a 18 meses de edad La inmunización activa con lipopolisacápdo (LPS) no es aceptable debido a su toxicidad inherente Los efectos patofisiologicos de LPS, pueden incluir fiebre, leucopenia, leucocitosis, la reacción de Shwarzman, coagulación intravascuiar diseminada, y en grandes dosis, choque y muerte En general, las proteínas son inmunogenicas en infantes de alrededor de tres meses de edad Por lo tanto, las membranas de proteínas externas están siendo investigadas como antigenos de vacunas posibles Mientras que los estudios recientes han empezado a enfocarse en las proteínas de membranas externas de M catarrhalis, se sabe poco acerca de la estructura antigenica y molecular de estas proteínas Los estudios de membranas externas purificadas por electroforesis de gel de poliacplamida de dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE) han revelado un patrón homogéneo entre las cepas de bacterias (Bartos y Murphy, 1988 J Infect Dis 158 761-765) Se han identificado ocho proteínas principales de membrana externa, designadas por las letras A-H, (Murphy y otros, 1989, Microbial Pathogen 6 159-174, Bartos y otros 1988 J Infecí Dis 158 761- 765). Los experimentos en los cuales fueron absorbidos 20 cepas de M. catarrhalis con antisueros desarrollados contra la cepa 25240 de M. catarrhalis, indican que la proteína E de la membrana externa contiene determinantes conservados antigénicamente que son expresados sobre ia superficie bacteriana (Murphy y otros, 1989, Infecí. Immun. 57:2938-2941). Por lo tanto, con el reconocimiento creciente de M. catarrhalís, como un patógeno bacteriano importante, existe la necesidad de una vacuna que sea inmunogénica en niños y adultos, Dicha vacuna podría tener que ser dirigida a un componente bacteriano que tiene un epítope expuesto a la superficie en bacterias intactas, en donde el epítope se conserva entre las cepas de M. caiarrhalis. Compendio de la Invención La presente invención se dirige a una proteína, péptidos y oligopéptidos relacionados con una proteína de membrana externa que tiene una masa molecular aparente de aproximadamente 35,000 daltons a aproximadamente 50,000 daltons de M. caiarrhalis, en donde la proteína parece ser una proteína modificable al calor, dando como resultado diferencias en la migración en genes de SDS, dependiendo de la temperatura de procesamiento de la muestra. La proteína E, y péptidos de la misma (en donde también se llaman "péptidos de E" u "oligopéptidos de E"), de la presente invención, se pueden utilizar como inmunogenos en formulaciones de vacunas profilácticas y/o terapéuticas; o como un antígeno en inmunoanálisis diagnósticos dirigidos a la detección de infección por M catarrhalis, midiendo un incremente en la titulación de suero de anticuerpo especifico para M catarrhalis También, la proteina E, peptidos de E y oligopeptidos de E de la presente invención, se pueden utilizar para generar anticuerpo especifico para E que puede ser útiles para la inmunización pasiva y como reactivos par análisis de diagnostico dirigidos a la detección de la presencia de M catarrhalis en especímenes clínicos Los peptidos de E u oligopeptidos de E, se pueden obtener mediante síntesis química, la purificación de M catarrhalis, o se pueden producir de sistemas de expresión de vector recombinante utilizando las secuencias de ácidos nucleicos descritas en la presente Una modalidad de la presente invención, se dirige a la construcción de secuencias de ADN y vectores novedosos incluyendo ADN de plasmidos, y ADN viral tales como virus de seres humanos, virus de animales, virus de insectos, o bacteriófagos que se pueden utilizar para dirigir la expresión de la proteina E, peptidos de E, u ohgopeptidos de E en células huésped apropiadas, a partir de las cuales se pueden purificar las proteínas o peptidos expresados Otra modalidad de la presente invención, provee métodos para clonación molecular del gen que codifica E, y provee composiciones que comprenden oligonucleotidos dentro de la secuencia de genes que codifica E Las secuencias de ácidos nucleicos de la presente invención, se pueden utilizar en análisis de diagnostico moleculares para material genético de M. catarrhalis a través de hibridación de ácidos nucleicos, e incluyendo la síntesis de oligonucléotidos específicos para la secuencia de E. para utilizarse como iniciadores y/o sondas en la amplificación, y detectar ácidos nucleicos amplificados. Adicionalmente, la proteína E, péptidos de E y oligopéptidos de E, se pueden utilizar como inmunógenos en formulaciones de vacunas profilácticas y/o terapéuticas contra cepas patogénicas de M. catarrhalis, ya sea que el inmunógeno sea sintetizado químicamente, purificado de M. catarrhalis, o purificado de un sistema de vector de expresión recombinante. Alternativamente, el gen que codifica E o uno o más fragmentos de genes que codifican péptidos de E u oligopéptidos de E, se pueden incorporar en una vacuna bacteriana o viral que comprende bacterias o virus recombinantes que son diseñados para producir uno o más epítopes inmunogénicos de E por sí mismos, o en combinación con los epítopes inmunogénicos de otros microorganismos patogénicos. Además, el gen que codifica E o uno o más fragmentos de genes que codifican péptidos de E u oligopéptidos de E, unidos operativamente a uno o más elementos reguladores, se pueden introducir directamente en humanos para expresar la proteína E, péptido de E, u oligopéptidos de E para producir una respuesta inmunoprotectora. Breve Descripción de las Figuras La Figura 1, es un perfil de hidrofobicidad de Kay-Doohttle de la proteína E de membrana externa de M catarrhalis como se determinó utilizando la secuencia de aminoácidos deducida de la secuencia de nucleótidos del gen que codifica E. Los valores positivos representan regiones hidrofóbicas y los valores negativos representan regiones hidrofílicas La Figura 2, representa geles de poliacplamida teñidos con brumuro de etidio y que contienen producto amplificado de ios genomas de diferentes cepas de M catarrhalis después de la digestión con varias enzimas de restricción La línea 1 representa tamaños normales de ADN, y las lineas 2-20 son productos amplificados de las cepas enumeradas en ei Cuadro 1, respectivamente. La Figura 2A, es un gel que muestra los productos amplificados restringidos con Sau96 I. La Figura 2B, es un gel que muestra los productos amplificados restringidos con Bs1 I. Descripción Detallada de la Invención La presente invención está dirigida a composiciones de una proteína de membrana bacteriana externa, y ios péptidos de la misma, de M. catarrhalis en donde la protema ha sido designada "E" El patrón de la migración de SDS-PAGE de la proteina E es característica de una proteína que se modifica al calor Es decir, el patrón de migración depende de la temperatura de procesamiento de la muestra anterior Por io tanto, si ia muestra que contiene ia proteína E se calienta a 25°C antes de SDS-PAGE, la masa molecular aparente es de aproximadamente 35,000 daltons, y si la muestra se calienta a 100°C, la masa molecular aparente es de aproximadamente 50,000 daltons Como se indica por la secuencia de nucleótidos de la presente invención (SEC ID NO 11), el gen que codifica E revela que la secuencia de aminoácidos predicha de la proteína E madura, tiene una masa molecular calculada de aproximadamente 47,030 daltons La proteína E, péptidos de E y oligopéptidos de E de la presente invención, se puede producir utilizando métodos de ADN recombinante como se ilustra en la presente, o se puede sintetizar químicamente a partir de ia secuencia de aminoácidos descritos en la presente invención Adicionalmente, los péptidos se pueden producir de la división enzimatica o química de la proteína madura La proteína E, peptidos de E, y oligopéptidos de E con epítope(s) ?nmunogén?co(s), se pueden utilizar como inmunógenos en varias formulaciones de vacunas para la prevención de otitis media, sinusitis, conjuntivitis, e infecciones del tracto respiratorio inferior ocasionadas por M catarrhalis Adicionalmente, de acuerdo con la presente invención, la proteina E, péptidos de E, y oligopéptidos de E producidos, se pueden utilizar para generan antisuero especifico contra M catarrhalis, útiles para inmunización pasiva contra infecciones ocasionadas por M catarrhalis La presente invención ademas provee la secuencia de nucleotidos del gen que codifica E, asi como la secuencia de aminoácidos deducida del gen aislado De acuerdo con una modalidad de la presente invención, el uso de técnicas de ADN recombinante, el gen que codifica E, o fragmentos de genes que codifican uno o más peptido de E que tienen ep?tope(s) ?nmunogén?co(s), se incorpora en un vector de expresión, y el vector recombinante se introduce en una célula huésped apropiada por lo que dirige la expresión de estas secuencias en la célula huésped particular El sistema de expresión, que comprende el vector recombinante introducido en la célula huésped, se puede utilizar (a) para producir proteína E, péptidos de E, u oligopeptidos de E, que se pueden purificar para utilizarse como un inmunogeno en formulaciones de vacunas, b) para producir protema E, peptidos de E, u oligopeptidos de E para ser utilizados como un antigeno para mmunoanalisis de diagnóstico o para generar antisueros específicos para M catarrhalis de valor terapéutico y/o diagnostico, c) o si el vector de expresión recombinante es un virus vivo tal como el virus de vaccinia, el vector por sí mismos, se puede utilizar como una preparación de vacuna viva o inactivada para ser introducido en las células huésped para la expresión de E o peptidos de E u oiígopeptidos de inmunogenicos, d) o si el vector de expresión de recombinantes se introduce en células de bacterias vivas atenuadas que se utilizan para expresar la proteina E, peptidos de E u oligopeptidos de E para vacunar individuos, e) o ser introducidas directamente en un individuo para inmunizarse contra la proteína E codificada y expresada, péptido de E u oligopéptido de E. Para los fines de la descripción, los métodos y compuestos de la presente invención serán ¡lustrados en las siguientes modalidades: Modalidad A - Clonación y secuenciación molecular del gen que codifica E, y vectores que expresa epítopes específicos para E; Modalidad B - Conservación del gen que codifica E entre cepas de M. catarrhalis-, Modalidad C - Métodos para utilizar secuencias de ?ucleótidos específicos para E en análisis de diagnóstico molecular para la detección de M. catarrhalis, Modalidad D - Métodos para preparar y utilizar E, péptidos de E, y oligopéptidos de E, en inmunoanálisis de diagnóstico; Modalidad E - Métodos y compuestos para formulaciones de vacunas relacionadas con E, péptidos de E, y oligopéptidos de E. Modalidad A La clonación y secuenciación molecular del gen que codifica E, y vectores que expresan epítopes específicos para E. La estrategia utilizada fue aislar ADN genómico de M. catarrhalis, dividir el ADN aislado en fragmentos, construir un banco genómico que comprende la inserción de los fragmentos en un vector de expresión, introducir los vectores recombinantes en la célula huésped apropiada, y tamizar clones de células huésped que contienen el gen que codifica E mediante hibridación por filtro con una familia de oligonucleótidos marcados, degenerados, que corresponden a la secuencia del amino terminai de la proteína E. Los oligonucleótidos sintetizado fueron tamizados previamente por mancha de Southern para ADN de M. catarrhalis, y E. coli como un control, para determinar cuál degenera los oligonucleótidos hibridizados fuertemente a ADN de M. catarrhalis. La cepa 25240 de Moraxella catarrhalis, obtenida de la Recolección de Cultivos de tipo Americano ("ATCC") se utilizó como la fuente de ADN genómico bacteriano. M. catarrhalis se desarrolló en placas de agar de chocolate a 37°C en CO2 al 5% o en caldo de infusión de cerebro y corazón. La Escherichia coli (E. coli) LE392, fue utilizada como la cepa huésped para el banco genómico de lambda de bacteriófagos (EMBL-3). Dependiendo de las circunstancias, E. coli fue desarrollada en caldo de triptona suplementado con la maltosa al 0.2% y 10 mN MgSO4; o para tamizar, en placas de agar de NZCYM conteniendo 50 µg/ml de ampicilina. Un banco genómico de EMBL3, se construyó con ADN genómico de M. catarrhalis 25240 utilizando métodos descritos previamente (Ausubel y otros, 1989, Current Protocols in Molecular Bioloqy, publicado por John Wiley and Sons). El ADN genómico de la cepa 25240 de M. catarrhalis, se purificó utilizando extracción de detergente, y tratamiento de proteinasa. El ADN genómico purificado, se digirió después parcialmente con la enzima de restricción Sau 3A para generar fragmentos que varían en tamaño. Los fragmentos de ADN fueron separados por centrifugación de gradientes de sacarosa sobre un gradiente de sacarosa del 10% al 40%. Las fracciones que contienen fragmentos de aproximadamente 9 a 23 kilobases (kb) en tamaño, fueron recopiladas, desfosforiladas utilizando fosfatasa intestinal de becerro, y subsecuentemente ligada a brazos de fagos y después empacadas en el fago. Una porción del banco EMBL-3 resultante, se sembró en piacas de NZCYM con E. coli LE392 como la cepa huésped. Las placas fueron transferidas en discos de filtro de nitrocelulosa y tamizadas por hibridación con una familia de oligonucleótidos radiomarcados degenerados (ejemplos representativos descritos en SEC ID NO: 1-SEC ID NO:8) que corresponden a la secuencia de amino termina de la proteína E de la membrana externa. Se tamizaron un total de aproximadamente 8100 placas y se identificaron seis clones positivos. Se recogieron ias placas positivas iniciales, se eluyeron en solución reguladora de pH, y después se purificaron para sembrar en placas a baja densidad y se volvieron a tamizar con los mismos oligonucleótidos hasta que fueron positivas todas ias placas de un retamizado. Los iisatos líquidos de los clones positivos, se utilizaron para aislar el ADN lambda que contiene el inserto. El ADN lambda aislado se digirió después con Sal I y se electroforaron los productos de la digestión en geles de agarosa para confirmar la presencia de insertos. Los tamaños de insertos de los clones positivos, estuvieron entre 12 kilobases (kb) y 17 kb El clon que contiene el inserto de 12 kb, se utilizo para localizar el gen que codifica E contenido dentro del inserto El ADN del clon, se corto con Sal I y el inserto de 12 kb se electroeluyo a partir de porciones de gel y se restringió con una o mas de varias enzimas diferentes (Nde i, Neo I, Hmd III, Sac I, Eco Rl, y Nde I y Neo I) Los productos de la digestión se electroforaron en geles de agarosa, y los fragmentos se analizaron por mancha de Southern con las sondas de ohgonucleótidos Un fragmento de Nde I - Sal i de 44 kb y un fragmento de Eco i - Sal I de 1 9, se seleccionaron y manipularlos para subclonarse en cualesquiera de los plasmidos PET22b+ o pGEMdzf" para facilitar la secuenciacion subsecuente Después de los intentos repetidos sin éxito para transformar £ co con los piasmidos recombinantes, y a pesar del éxito con ADN de control y controles de transformación, se concluyo que los fragmentos que contiene el gen que codifica E, o que contiene porciones del mismo, fueron toxicas para la £ coll Por io tanto, se tomó un enfoque alternativo para determinar la secuencia de nucleótidos Las secuencias de los extremos del fragmento de 1 9 kb, fueron determinadas mediante el método de Maxam-Gilbert El fragmento de 1 9 kb se digirió con Hmd lll y se purificaron dos fragmentos, un fragmento de 1 1 kb y un fragmento de 08 kb Estos fragmentos fueron marcados y después secuenciados utilizando el método de Maxam-Gilbert (1977, Proc Nati Acad Sci EUA 74 560-564) A partir de este análisis de secuencias, se sintetizaron dos oligonucleotidos adicionales (SEC ID NO-9 y SEC ID NO 10) Dos iniciadores (SEC ID NO 7 y SEC ID NO 10) se seleccionaron para amplificar un fragmento del inserto de ADN, del clon que tiene el inserto de 12 kb, utilizando la reacción en cadena de la pohmerasa Las reacciones fueron llevadas a cabo en un volumen de 50 µl con 025 µg de iniciadores y 1 5 mM dNTP Se realizó la predesnaturalización a 95°C durante 3 minutos La desnaturalización se realizó a 96°C durante 15 segundos, fijando a 62°C durante 1 minuto y polimerización durante 74°C durante 1 minuto, durante 15 ciclos en presencia de 3mM MgSO4 El resultado de la reacción en cadena de la polimerasa utilizando estos dos iniciadores, fue un producto amplificado de 06 kb El producto amplificado de 08 kb se purifico por electroforesis de gel de agarosa y electroelución, y después se subcionó en ei sitio de Eco Ri de M13mp8 Se preparo ADN M13 de un solo filamento, a partir del recombinante para determinar la secuencia de nucleótidos del producto de 0 8 kb mediante el método de terminación de cadena con didesoxi La porción restante dei gen que codifica E, se secuenció directamente a partir del inserto de 12 kb del clon lambda utilizando oligonucleotidos adicionales sintetizados para corresponder a la región del gen que codifica E De ia secuencia completa de nucieótidos (SEC ID NO 11), el gen que codifica E se define como un marco de lectura abierto de 1377 pares de base (codificando 460 aminoácidos) iniciando con el codón en la posición 154 y finalizando con TAA en la posición 1531 Un ribosoma potencial que se une al sitio GGAGA, se localizó cinco bases corriente arriba del codón de iniciación de traducción de ATG Treinta bases corriente abajo del codón de retén de TAA, fue la secuencia ATAAAAAATAGCTTGAATTTCAAGCTATTTTTTAT, un palindrome que pudo formar una sola estructura del bucle de soporte que sirve potencialmente como un terminador de transcripción El contenido global de guaina y citosma (G + C) del gen que codifica E, es 434% el cual es similar al contenido de G + C reportado de 41% para el genoma de M catarrhalis (Catlin, 1990, Clin Microbio! Rev 3:293-320) La secuencia de aminoácidos, deducida del marco de lectura abierto, definido E como una proteína de una masa molecular calculada de 49,334 daltons La secuencia de aminoácidos deducida para E, sugirió la presencia de un peptido de señalamiento con un sitio probable de división entre los aminoácidos 25 (Ala) y 26 (Ala) Los primeros 24 aminoácidos del sitio de división putativo, de la secuencia de aminoácidos deducida del marco de lectura abierto, corresponde precisamente a la secuencia de proteínas N-terminales determinada de la proteína E de membrana externa purificada Estas observaciones confirman además que el gen codifica E, y que E se sintetiza como un precursor que tiene un peptido de señalamiento compuesto de 25 residuos de aminoácidos In perfil de hidrofobicidad de la secuencia de aminoácido deducida (Fig 1), mostró una porción hidrofóbica fuerte que corresponde al péptido de señalamiento Los determinantes antigénicos predichos corresponden a las regiones hidrof i cas indicadas en la Figura 1 Esos determinantes antigénicos incluyen los aminoácidos 369 a 374; 29 a 34, y 294 a 299. La masa molecular predicha de la proteína madura es de 47,030 daltons, que se correlaciona bien con ia migración de la proteína E de membrana externa en SDS-PAGE de muestras que contienen M. catarrhalis. El análisis de la composición de aminoácidos de E, indicó que la alanina, glicina, leucina y valina, son más abundantes (escala 13%-18%) y que no están presentes los residuos de cisterna para determinar el sitio de iniciación transcripcional del gen que codifica E, se llevó a cabo el análisis de extensión del iniciador utilizando dos iniciadores diferentes específicos para E (SEC ID NO:12 y SEC ID NO. 13) hibpdizando a la región 5' del ARN mensajero correspondiente. El ARN total se extrajo mediante el método de tiocianato de guanidina de la cepa 25240 de M catarrhalis. Los iniciadores específicos para E, fueron extremos de 5' marcados con [3 P]ATP Para la extensión del iniciador, se fijaron 50 µg del ARN total con 100 fmoles de los iniciadores marcados y se incubaron a 55°C durante 45 minutos Esto fue seguido por la extensión con transcpptasa inversa en presencia de trifosfatos de desoxirpbonucleósido durante una hora a 42°C El producto de extensión del iniciador, se analizo en un gel de secuenciación de acriiamida de urea ai 8%. Las reacciones de secuenciación de nucleótidos de didesoxi que generan una escalera de secuencias y se inician con los mismos iniciadores, también se electroforaron en líneas adyacentes para evaluar la base exacta para la iniciación de la transcripción correspondiente a E. Los resultados indican que la transcripción empieza con un residuo de guanina en la posición 75 la cual está 78 bases corriente arriba del codón de ATG. El TAAGAT de potencial -10 o la caja de "Pribnow" (posición de nucleótido 63-68) se localizó seis bases corriente arriba del sitio de iniciación +1 de la transcripción. El TTGTT -35 (posición 40-45) se localizó diecisiete bases corriente arriba de la secuencia -10. Dos regiones de simetría de pares unidos con guiones, 5'-TTAATTTCATTTAA-3' y 5'TACAAATGTGTAAGACTTTTGTA-3', se identificó corriente abajo de la región -35 que puede jugar un papel en la regulación de expresión del gen que codifica E. Basado en la secuencia de nucleótidos del gen que codifica E, se sintetizaron tres series de iniciadores de oligonucleótidos, y se utilizaron para amplificar porciones del gen, mediante reacción en cadena de polimerasa, para subclonar y analizar la expresión. Dos iniciadores (SEC ID NO:14 SEC ID NO:15) se utilizaron para amplificar 1.573 kb del gen, el fragmento amplificado conteniendo el gen completo y la región del promotor. Otro grupo de iniciadores (SEC ID NO:16 y SEC ID NO:17) fueron utilizados para amplificar 1.391 kb del gen que contenía ia secuencia que codifica ei péptido líder junto con el resto dei gen. Un tercer grupo de iniciadores (SEC ID NO:17 y DEC ID NO:18) se utilizaron para amplificar 1.313 kb del gen que codifica a partir del primer aminoácido de la proteína madura al final del carboxi terminal. Los tres productos amplificados, 1.573 kb, 1.391 kg y 1.313 kg, fueron subclonados por separado en un vector, fagémido pCR-Script SK+, y se transformaron en £. coli utilizando protocolos normales. No tuvieron éxito los intentos para la transformación con el plásmido recombinante conteniendo el fragmento 1.573 kb, sugiriendo, de nuevo, que la expresión de la proteína E de M. catarrhalis en £. coli es tóxica para la bacteria transformada. Se identificó que los transformantes contenían plásmidos recombinantes con el inserto de 1.391 kb (toda el marco de lectura abierto sin el promotor) y el inserto de 1.313 kb (secuencia que codifica la proteína madura). La confirmación de los insertos, secuenciando los extremos de ios insertos, indicó que todos los clones identificados contenían las secuencias de genes en la orientación equivocada para la expresión de la proteína mediante ei promotor del plásmido; además existe la evidencia de que la expresión de la proteína E es tóxica para £. coli. Por lo tanto, esta modalidad ilustra que las secuencias de nucleótidos que codifican E o porciones de la misma se puede insertar en varios vectores incluyendo vectores de fagos y plásmidos. La expresión exitosa de la proteína y ios péptidos de la proteína E, requiere que cualquiera de ios insertos que comprenden el gen o fragmento del gen que codifica epítope de proteína E, o el vector mismo, contenga ios elementos necesarios para ia transcripción y traducción, ios cuales son compatibles con, y reconocidos por el sistema de huésped particular utilizado para la expresión. El ADN que codifica la proteina E, peptidos de E, u ohgopéptidos de E, se pueden sintetizar o aislar y secuenciar utilizando los métodos y secuencias de iniciadores como se ilustra de acuerdo con las modalidades A, B, y E en la presente. Una variedad de sistemas de huespedes, se puede utilizar para expresar la proteína E, los peptidos de E, u oligopéptidos de E, los cuales incluyen, pero no están limitados a las bacterias transformadas con un vector de bacepófagos, vector de plásmidos, o ADN de cósmido, levaduras que contienen vectores de levaduras, hongos que contienen vectores de hongos, líneas celulares de insectos infectadas con virus (v gr , baculovirus), y lineas celulares de mamíferos transfectadas con plasmidos o vectores de expresión viral, o infectadas con virus recombinante (v gr , virus vaccinia, adenovirus, adenovirus asociado, retrovirus, etc ) Utilizando métodos conocidos en la técnica de biología molecular, incluyendo métodos descritos antes, se pueden incorporar varios promotores e incrementadores en el vector o la secuencia de ADN que codifica secuencias de aminoácidos de E, es decir, proteína E de membrana externa de recombinantes, peptido de E u oligopeptido de E, para incrementar la expresión de secuencia de aminoácidos de E Por lo tanto, y de manera importante, la secuencia de ADN puede consistir del gen que codifica ia proteína E, o cualquier segmento del gen que codifica un epitope funcional de la proteina E Ademas, ei ADN puede ser fusionado a ADN que codifica otros antigenos, taies como otras proteínas bacterianas de membrana externa, u otros antigenos bacterianos, fúngicos, parasíticos, o virales, para crear un antígeno multivalente fusionado genéticamente (que comprarte una estructura de la base común de péptidos) para utilizarse como una composición de vacuna mejorada. La selección del promotor dependerá del sistema de expresión utilizado. Los promotores varían en resistencia, es decir, capacidad de facilitar la transcripción. Generalmente, para el propósito de expresar un gen cionado, es conveniente utilizar un promotor fuerte con el fin de obtener un alto nivel de transcripción del gen y expresión en el producto del gen. Por ejemplo, los promotores bacterianos, de fagos, o plásmidos conocidos en la técnica a partir de los cuales se ha observado un alto nivel de transcripción en un sistema de células huésped que comprenden £. coli, incluyen el promotor de lac, promotor de trp, promotor de recA, promotor de ARN ribosomal, los promotores de PR y PL, lacUV5, cmpF, bla, Ipo, y similares, se pueden utilizar para proveer ia transcripción de la secuencia de ADN insertado que codifica las secuencias de aminoácidos de E. Adicionalmente, si la proteína E, péptidos de E, u oligopéptidos de E pueden ser letales o dañinos para las céiuias huésped, la línea/cepa de células huésped y vectores de expresión pueden ser elegidos de tal forma que la acción del promotor sea inhibida hasta que sea inducida específicamente. Por ejemplo, en ciertos operones, la adición de inductores específicos es necesaria para la transcripción eficiente del ADN insertado (v.gr., el operon de lac es inducido por la adición de la lactosa o isopropiltio-beta-D- galactosido). Una variedad de operones tales como el operón de trp, están bajo diferentes mecanismos de control. El operón de trp es inducido cuando el triptofano está ausente en el medio de crecimiento. El promotor de PL se puede inducir mediante un incremento en ia temperatura de ias células huésped que contienen un represor lambda sensible a la temperatura. En esta forma, se puede inhibir la transcripción dirigida al promotor mayor al 95%, en las células no inducidas. Por lo tanto, la expresión del recombinante E, péptidos de E, u oligopéptidos de E, se puede controlar mediante el cultivo de células transformadas o transfectada bajo condiciones tales que no se induce el promotor que controla la expresión del ADN insertado que codifica aminoácidos de E, y cuando las células alcanzan una densidad adecuada en el medio de crecimiento, ei promotor se puede inducir para la expresión del ADN insertado. Otros elementos de control para la transcripción eficiente del gen o la traducción de mensaje, incluyen incrementadores y señales reguiadoras. Las secuencias incrementadoras son elementos de ADN que parecen incrementar la eficiencia transcripcionai en una forma relativamente independiente de su posición y orientación con respecto a un gen cercano. Por lo tanto, dependiendo del sistema del vector de expresión de las células huésped utilizado, se puede colocar un incrementador ya sea corriente arriba o corriente abajo de las secuencias de ADN insertadas que codifican aminoácidos de E para incrementar la eficiencia transcripcional. Como se ilustró previamente en esta modalidad, se han identificado otras secuencias reguladoras especificas las cuales pueden afectar la expresión del gen que codifica E Estos u otros sitios reguladores, tales como señales de iniciación de transcripción o traducción, se pueden utilizar para regular la expresión del gen que codifica E, o fragmentos dei gen de los mismos Dichos elementos reguladores se pueden insertar en secuencias de ADN que codifican aminoácidos de E o secuencias de ADN del vectores cercanos utilizando métodos de ADN recombinante descritos en la presente para la inserción de secuencias de ADN Consecuentemente, las secuencias de nucleotidos de M catarrhalis que contienen regiones que codifican para E, péptidos de E, u ohgopeptidos de E, se pueden ligar en un vector de expresión en un sitio especifico en relación con el promotor, control, y elementos reguladores de vectores de tai forma que cuando se introduce en ia célula huésped, las secuencias de ADN específicos para E de M catarrhalis, se pueden expresar en ia célula huésped Por ejemplo, las secuencias de ADN especifico para E que contienen sus propios elementos reguladores, se pueden ligar en un vector de expresión en una relación u orientación para ei promotor del vector y elementos de control los cuales permitirán la expresión de las secuencias de aminoácidos de E El vector recombinante se introduce después en las células huésped apropiadas, y las células huésped son seleccionadas, tamizadas para ias células que contienen el vector recombinante La selección y el tamizado pueden ser logrados mediante métodos conocidos en la técnica que incluyen la detección de ia expresión de un gen marcador (v gr , marcador de resistencia al fármaco) presentes en el plásmido, el inmunotamizado para la producción de los epítopes específicos para E que utilizan antisueros generados para los epítopes específicos para E, y que utilizan antisueros generados para los epítopes específicos para E, y que prueban el ADN de las células huésped para las secuencias de nucleótidos específicos para E que utilizan uno o mas oligonucleótidos y métodos descritos de acuerdo con la Modalidad C de la presente. Las técnicas de ingeniería genética, también se pueden utilizar para caracterizar, modificar y/o adaptar los péptidos de E o proteínas de E codificados. Por ejemplo, la mutagenesis dirigida al sitio para modificar un fragmento de proteína de membrana externa en regiones afuera de los dominios protectores, puede ser deseable para incrementar la solubilidad del subfragmento para permitir la purificación más fácil. Además, las técnicas de ingeniería genética se pueden utilizar para generar secuencias de ADN que codifican una porción de la secuencia de aminoácidos de E Por ejemplo, a partir de la secuencia descrita como SEC ID NO:11, se puede determinar cuál enzima de restricción o combinación de enzimas de restricción se pueden utilizar para generar secuencias que codifican peptidos de E u o gopéptidos de E La selección de enzimas de restricción, se puede hacer de tal manera que no destruya la inmunopotencia del péptido u ohgopéptido resultantes Los sitios antigénicos de una proteína, pueden variar en tamaño pero pueden consistir de aproximadamente 7 a aproximadamente 14 aminoácidos Por io tanto, una proteina del tamaño de E, puede contener muchos sitios antigenicos discretos, por lo tanto, varias secuencias de genes parciales, podrían codificar epitopes antigénicos de E Consecuentemente, utilizando la Figura 1 y SEC ID NO 11 como guias, se pueden utilizar combinaciones de enzimas de restricción para generar secuencias de AD, las cuales se pueden insertar en el vector apropiado, son capaces de dirigir la producción de secuencias de aminoácidos específicos para E (peptidos u oligopeptidos) que comprenden diferentes epitopes antigenicos Modalidad B La conservación del gen que codifica E entre las cepas de M catarrhalis Los estudios previos, utilizando experimentos de adsorción de anticuerpos, demostraron que uno o mas de ios determinantes expuestos a la superficie de M catarrhalis, fueron conservados antigenicamente entre la mayoría de las cepas (Murphy y otros, 1989, supra) Sin embargo, estos estudios no se dirigen a la conservación del gen que codifica E entre las cepas Para que las secuencias de nucleotidos de la presente invención, sean útiles en análisis de diagnósticos, el gen que codifica E, debe ser conservado altamente entre las cepas de M catarrhalis Ademas, un gen altamente conservado, indica que la secuencia de proteínas también es altamente conservada Para que una proteina o peptido bacterianos sea util como un antigeno en formulaciones de vacunas contra la infección ocasionada por M catarrhalis, la proteina o peptido deben contener epitopes que son tanto inmunogenicos como conservados entre las cepas de M catarrhalis Para determinar el grado de conservación del gen que codifica E entre las cepas de M catarrhalis, el ADN genómico se purificó y analizó a partir de 19 aislados recuperados de diversas fuentes clínicas y geográficas Primero, las secuencias de genes específicos para E del ADN purificado de los aislados, fueron amplificadas utilizando la reacción en cadena de la polimerasa e iniciadores (SEC ID NO 16 y SEC iD NO 17) El análisis del los productos amplificados, por electroforesis de gel de agarosa, mostraron que el gen que codifica E fue dei mismo tamaño (aproximadamente 1 4 kb) en todas las cepas probadas Adicionalmente, se analizaron ios polimorfismos de longitud dei fragmento de restricción, restringiendo los productos amplificados en fragmentos utilizando ya sea Hmd lll, Sau96 I, Bs1 I, o Bsg I, y visualizando los fragmentos mediante electroforesis sobre un gei de acplamida al 6% teñido con bromuro de etidio Ei patrón de bandas de los productos amplificados, no mostraron variación entre las cepas probadas con respecto a la presencia de los sitios de restricción y diferencias mínimas en el tamaño observado de los fragmentos (como se ilustra en Figura 2A para Sau96 I, y ia Figura 2b para Bs1 I) De ias cuatro enzimas diferentes, utilizadas en la restricción de los productos amplificados, tres de las enzimas se cortan en tres sitios diferentes dentro de los productos amplificados, y uno se corta en dos sitios diferentes. Por lo tanto, los resultados similares en todas las cepas, indican que las secuencias reconocidas en los once sitios, son idénticas entre ias cepas probadas. Las cepas listadas en el Cuadro I, son las cepas probadas para los polimorfismos de la longitud de fragmentos de restricción, en ei mismo orden en el que aparecen sobre los geles (mostrados en la Figura 2A y Figura 2B, empezando con la línea 2). Pueden existir diferencias en los patrones de restricción entre las cepas diferentes, pero no se vieron diferencias con estas enzimas de restricción particulares probadas. Cuadro 1 Aislados de Moraxella catarrhalis Estos hallazgos indican que el gen que codifica E, se conserva altamente entre las cepas de M. catarrhalis, y por lo tanto las secuencias de nucleótidos descritas en la presente, tienen aplicaciones para uso de diagnósticos y vacunas. Modalidad C Los métodos para utilizar secuencias de nucleótidos específicos para E en los análisis de diagnósticos moleculares para la detección de M. catarrhalis. Debido a la conservación del gen que codifica E, como se describió en la Modalidad B, las secuencias de ácidos nucleicos de la presente invención se pueden utilizar en análisis de diagnósticos moleculares para detectar material genético de M. catarrhalis. En particular, y como se ilustra por la SEC ID NO: 1 - SEC ID NO:10 y SEC ID NO:12 - SEC ID NO:18, los oligonucleótidos específicos para la secuencia de E, pueden ser sintetizados para usarse como iniciadores y/o sondas para amplificar y detectar ácidos nucleicos amplificados de M catarrhalis Los avances recientes en biología molecular, han provisto vanos medios para amplificar enzimaticamente secuencias de ácidos nucleicos Actualmente, el método mas comunmente utilizado, PCR™ (reacción en cadena de la polimerasa, Cetus Corporation) implica el uso de una Polimerasa de ADN termoestable, secuencias conocidas como iniciadores y ciclos de calentamiento que separan los filamentos de acido desoxirpbonucleico (ADN) de rep cacion, y amplifican exponencialmente un gen de ínteres Otros métodos de amplificación actualmente bajo desarrollo, incluyen LCR™ (reacción en cadena de la ligasa, BioTechnica International) la cual utiliza ligasa de ADN, y una sonda que consiste de dos mitades de un segmento de ADN que es complementaria a la secuencia del ADN que va a ser amplificada, rephcasa QB de la enzima (Gene-Trak Systems) y un molde de secuencias de acido ribonucleico (ARN) para una sonda de ARN complementario, y NASBA™ (amplificación basada en secuencias de ácidos nucleicos, Cangene Corporation) que puede ser realizada en ARN o ADN como la secuencia de acido nucleico que va a ser amplificada Las sondas de acido nucleico que son capaces de hibridación con secuencias de genes específicos, han sido utilizadas con éxito para detectar patógenos específicos en especímenes biológicos a niveles de sensibilidad alcanzando 103-104 organismos por espécimen (1990, Gene Probes for Bacteria, eds Macano y de Macario, Academic Press) Acoplado con un método que permite la amplificación de secuencias de ADN blanco específicas, ias sondas de ácidos nucleicos específicos para especies, pueden incrementar en gran parte el nivel de sensibilidad para detectar organismos en un espécimen clínico El uso de estas sondas puede permitir ia detección directa sin apoyarse en cultivos previos y/o técnicas bioquímicas de identificación, convencionales. Esta modalidad de la presente invención se dirige a iniciadores que amplifican secuencias específicas para especies dei gen que codifica E de M catarrhaiis, y a sondas que se hibpdizan específicamente con estos fragmentos de ADN amplificados Utilizando las secuencias de ácidos nucleicos de la presente invención y de acuerdo con los métodos de la presente invención, se pueden detectar tan poco como un organismo de M. catarrhalis, en presencia de 10 µg/ml de ADN extraño. Esta modalidad está dirigida a oligonucleótidos específicos para especies que se pueden utilizar para amplificar secuencias de ADN de M. catarrhaiis, si está presente, de ADN extraído de especímenes clínicos incluyendo fluido del oído medio, esputo, sangre, y fluidos de nasofapnge, ojos y adenoides, y para determinar subsecuentemente si ha ocurrido amplificación. En una modalidad de la presente invención, se utilizan un par de oligonucleótidos de ADN específicos para M catarrhalis, para hibpdizar al ADN genómico de M catarrhalis, que puede estar presente en ADN extraído de un espécimen clínico, y para amplificar ei segmento especifico del ADN genómico entre ios dos iniciadores de flanqueo utilizando síntesis enzimática y ciclos de temperatura. Cada par de iniciadores, está diseñado para hibridizar solamente para las secuencias de nucleótidos de M. catarrhalis, comprendiendo el gen que codifica E (es decir, dentro de la región del genoma que contiene SEC ID NO:11) para el cual se han sintetizado para el complemento; uno de cada filamento del ADN de doble filamento. Por lo tanto, la reacción es específica aún en presencia de cantidades en microgramos de AD heterólogo. Para los fines de esta descripción, el iniciador derivado de la secuencia del filamento (gen) positivo de ADN será denominado como el "iniciador positivo", y el iniciador derivado de la secuencia del filamento negativo (complementario) será denominado como el "iniciador negativo". La amplificación del ADN se puede lograr mediante cualquiera de los métodos comercialmente disponibles. Por ejemplo, la reacción en cadena de la poiimerasa, se puede utilizar para amplificar ei ADN. Una vez que los iniciadores son hibridizados para filamentos opuestos del ADN blanco, la temperatura se eleva para permitir la replicación del segmento específico de ADN a través de la región entre los dos iniciadores mediante una polimerasa de ADN Termoestable. Después la reacción se termocicla de tal manera que en cada ciclo, se duplica la cantidad de ADN que representa las secuencias entre los dos iniciadores, y se produce la amplificación específica de las secuencias de ADN de M. catarrhalis, si está presente. La identificación adicional del fragmento de ADN amplificado, por ser derivado del ADN de M. catarrhalis, puede lograrse mediante hibridación de líquidos. Esta prueba utiliza uno o más oligonucleotidos marcados como sondas para hibridizar específicamente el segmento amplificado de ADN de M. catarrhalis. La detección de la presencia del ADN amplificado específico para secuencias, se puede lograr utilizando cualquiera de varios métodos conocidos en la técnica, tal como un análisis de retardo de gel con autorradiografía. Por lo tanto, las secuencias de nucleótidos de la presente invención, proveen bases para la síntesis de oiigonucleótidos que tienen aplicaciones comerciales en equipos de diagnóstico para la detección de M. catarrhalis. En una modalidad relacionada, los oligonucleótidos utilizados como iniciadores, se pueden marcar directamente, o sintetizar para incorporar una etiqueta. Dependiendo de ia etiqueta utilizada, ios productos de amplificación se pueden detectar entonces, después de la unión en una matriz de afinidad, utilizando detección isotópica o colorimétrica.

El ADN se puede extraer de especímenes clínicos que pueden contener M. catarrhaiis que utiliza métodos conocidos en la técnica.

Por ejemplo, las células contenidas en el espécimen, pueden ser lavados en ia solución reguladora de pH de TE y formados en pellas mediante centrifugación. Las células se pueden resuspender después en 100 µl de solución reguladora de pH de reacción de amplificación, conteniendo detergentes y proteinasa K. Utilizando ia reacción en cadena de la polimerasa, la muestra resultante puede estar compuesta de las células en 10 mM de Tris, pH de 8.3, 50 mM de KCl, 1.5 mM de MgCI2, 0.01% de gelatina, 0.45% de NP40™, 0.045% de Tween 20™, y 60 µg/ml de proteinasa K. La muestra se incuba en un baño de agua a 55°C, durante 1 hora. Después de la incubación, la muestra se incuba a 95°C durante 10 minutos para inactivar con calor la proteinasa K. La muestra después se puede amplificar de acuerdo con el protocolo para la reacción en cadena de la polimerasa como se establece más adelante. El ADN de M. catarrhalis, se puede amplificar utilizando cualquiera de varios protocolos para amplificar ácidos nucleicos mediante la reacción en cadena de polimerasa. En un modo de esta modalidad, ei gen que codifica E, se amplificó de 19 aislados clínicos de B. catarrhalis, utilizando las siguientes condiciones. El ADN que será amplificado (aproximadamente 1 µg de ADN genómico) se distribuyó en 0.5 mi de tubos de microfugas y el volumen se ajustó a 50 µl añadiendo una mezcla de reacción que comprende 0.2 mM dNTPS (sATP, dCTP, dGTP, dTTP), 0.25 µg de cada iniciador de oligonucleótidos positivo y negativo, 1 unidad de polimerasa de ADN termoestable, polimerasa 10x de solución reguladora de pH (5 µl), 3mM de MgSO4 (concentración final), y agua destilada estéril para lograr el volumen total. La polimerasa de ADN se añade a ia mezcla de reacción justo antes de usarse y se mezcla suavemente, no se revuelve. Una capa de aceite mineral, aproximadamente 2 gotas, se añade a cada tubo y después los tubos se colocan en ei aparato de ciclos térmicos. De treinta a treinta y cinco ciclos, generalmente son suficientes para la amplificación de ADN bacteriano. Un ciclo consiste de 15 segundos a 96°C, 1 minuto a 62°C, y 1 minuto a 74°C.

El primer ciclo incluye una incubación de 3 minutos a 95C para asegurar la desnaturalización completa. Los oligonucleótidos útiles como iniciadores o sondas que se hibridizan específicamente para el gen que codifica E de M. catarrhalis y se utiliza en ia amplificación y/o detección de ADN, puede ser sintetizada bioquímicamente, utilizando métodos conocidos en la técnica, de las secuencias de nucleótidos descritas en la presente invención. La especificidad de los oligonucleótidos para M. catarrhalis, puede ser revisada mediante una investigación de base de datos de banco de genes (Banco de genes) para cada secuencia individual. En general, los oligonucleótidos se deben seleccionar del bajo contenido de G-C. Los pares de iniciadores que se han utilizado para esta modalidad con ei fin de amplificar ei gen entero que codifica E, incluye, SEC ID NO: 14 y SEC ID NO:15. Los pares de iniciadores utilizados para amplificar porciones del gen, incluyen SEC ID NO:16 y SEC ID NO: 17; y SEC ID NO:17 y SEC ID NO:18. Para fines de detección, los oligonucleótidos de la presente invención pueden ser marcados en el extremo con un radioisótopo. Las secuencias de sondas, internas para los dos iniciadores utilizados para amplificación de la secuencia de genes, puede ser marcada en un extremo utilizando cinasa de polinucleótidos T4 y 32P ATP gama. Veinte pmoles del ADN de la sonda en la solución reguladora de pH de quinasa (50 mM de Tris, pH 7.6, 10 mM de MgCI2, 5 mM de ditiotreitol, 0.1 mM de espermidina-HCI, 0.1 mM de EDTA, pH 8.0) se mezcla con 120 µCi de P ATP gama y se incuba a 37°C durante 1 hora La sonda marcada se separa de la etiqueta no incorporada en un gei de acrilamida al 8% tratado durante 1 hora a 200 voltios en solución reguladora de pH de Tris Borato EDTA (TBE) a temperatura ambiente. La sonda marcada se localiza primero exponiendo el gel de acrilamida a la película de rayos x durante tres minutos. El autorradiograma resultante se coloca después bajo ei gel, y la banda que contiene la sonda marcada se saca dei gel. La porción de gel se pulveriza en un milímetro de agua destilada estéril, y la sonda se eluye mediante incubación con agitación durante la noche a 37°C. La sonda eluida se separa de los fragmentos de gel mediante centrifugación utilizando una columna de preparación de cromatografía La radioactividad de la sonda se determina contando un microlitro de la sonda marcada sobre un filtro de fibra de vidrio, mediante centelleo de líquidos. Dichas secuencias de sondas se pueden elegir de cualquiera de las secuencias identificadas como SEC ID NO: 1 a SEC ID NO 10, y SEC ID NO:12 a SEC ID NO 18 siempre y cuando ia secuencia de la sonda sea interna a los dos iniciadores utilizados para amplificación de la secuencia de nucleotidos deseada descrita en la presente invención. Los métodos alternativos conocidos en la técnica, se pueden utilizar para mejorar la detección de secuencias blanco amplificadas de acuerdo con ias composiciones y métodos de la presente invención La sensibilidad de detección de las secuencias de ADN amplificado, se puede mejorar sometiendo las secuencias a hibridación de líquidos Los métodos alternativos de detección conocidos en la técnica, ademas de la electroforesis de gel y electroforesis de gel con la hibridación de Southern y autorradiografia, que se pueden utilizar con las composiciones y métodos de la presente invención, incluyen digestión de enzima de restricción con electroforesis de gel, hibridación de ranura-manchas con una sonda de oligonucleotidos marcada, amplificación con un iniciador radiomarcado con electroforesis de gel, hibridación de Southern y autorradiografía, amplificación con un iniciador radiomarcado con mancha por puntos y autorradiografía; amplificación con oligonucleótidos que contienen orejas de afinidad (ej biotina, o un iniciador que incorpora biotina y el otro iniciador con una secuencia específica para una proteína de unión de ADN) seguido por la detección en un análisis basado en afinidad (ej ELISA), y amplificación con oligonucleótidos que contienen fluoróforos seguido por detección de fluorescencia Una modalidad de detección no isotópica, implica la incorporación de biotina en los iniciadores de oligonucleotidos de la presente invención, El grupo 5'-am?no de los iniciadores se puede biotinilar con sulfo-NHS-biotma, o ia biotina se puede incorporar directamente en ei iniciador sintetizando el iniciador en presencia de dNTPs marcados con biotina Los iniciadores no isotópicos marcados, se utilizan después amplificando ADN de un espécimen clínico La detección para la presencia o ausencia de secuencias blanco amplificadas, se puede lograr capturando las secuencias blanco amplificadas utilizando una matriz de afinidad que tiene unida a la misma avidma, seguido por la incubación con un conjugado de avidina que contiene una enzima, la cual se puede utilizar para visualizar ei complejo con el desarrollo subsecuente del substrato Alternativamente, las secuencias blanco amplificadas, se pueden inmovilizar mediante hibridación a las sondas correspondientes de la secuencia blanco en donde las sondas se han fijado en una matriz La detección se puede lograr utilizando un conjugado de avidina que contienen una enzima que se puede utilizar para visualizar el complejo con el desarrollo subsecuente del substrato Modalidad D Métodos para hacer y utilizar E, péptidos de E, u oligopeptidos de E en inmunoanalisis de diagnóstico La proteina E, peptidos de E, y ohgopeptidos de E, se pueden purificar para utilizarse cono un inmunógeno en formulaciones de vacuna, y como un antigeno para análisis de diagnostico o para generar antisueros específicos de M catarrhalis de valor terapéutico y/o diagnostico La protema E de M catarrhahs o peptidos de la misma, o recombinante de proteína E, recombinante de peptidos de E, o recombinante de oligopeptidos de E producidos de un sistema de vector de expresión, se puede purificar con los métodos conocidos en la técnica incluyendo extracción de detergentes, cromatografía (v gr , intercambio iónico, afinidad, inmunoafinidad, o columnas de dimensionamiento), centrifugación diferencial, solubilidad diferencial, u otras técnicas normales para la purificación de proteínas. Por ejemplo, una preparación parcialmente purificada que contiene principalmente proteínas de membrana externa de bacterias, se pueden preparar como sigue. La bacterias que expresan E de 30 placas de agar de chocolate, se inocularon en 25 mi de PBS de pH 7.2, y se cultivaron por centrifugación a 12,000 x g durante 20 minutos a 4°C. La pella bacteriana se resuspendió en 10 mi de acetato de sodio 1 M-ß-mercaptoetanol 0.001 M (pH 4.9). Un volumen de 90 mi de una solución que contiene agente de Zwitter al 5% Z 3.14 (Calbiochem-Behring) y se añadió CaCl2 0.5% M, y la suspensión se mezcló durante 1 hora a temperatura ambiente. Los ácidos nucleicos, se precipitaron por la adición de 25 mi de etanol frío y centrifugación subsecuente a 17,000 x g durante 10 minutos a 4°C. Las proteínas restantes se precipitaron por la adición de 375 mi de etanol frío y se recogieron por centrifugación a 17,000 x g durante 20 minutos a 4°C. Las pellas se dejaron secar y se suspendieron después en 10 mi de solución reguladora de pH de detergente conteniendo agente de Zwitter al 0.05%, Tris 0.05M, EDTA 0.01M, pH 8.0, y se mezclaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Las proteínas de membrana exterior bacteriana, están presentes en la fracción soluble de la solución reguladora de pH del detergente después de la centrifugación a 12,000 x g durante 10 minutos a 4°C. La inmunopurificación de la proteína E de una preparación de proteína de membrana externa, se puede lograr utilizando métodos conocidos en la técnica para cromatografía de inmunoafinidad. Los anticuerpos monoclonales específicos de E, se pueden unir a una matriz de afinidad permitiendo que los anticuerpos se unan a E La matriz de afinidad se lava después para remover componentes no unidos y después se eluye E de ia matriz de afinidad dando como resultado una preparación purificada de la proteina E La E purificada se puede utilizar como un antigeno para análisis de diagnostico, o se puede dividir química o enzimaticamente en peptidos utilizando métodos conocidos por los expertos en la material Alternativamente, los peptidos u oligopeptidos de E, se pueden sintetizar químicamente utilizando la secuencia de aminoácidos deducida del gen que codifica E como una referencia La proteina E recombinante, se puede purificar utilizando métodos similares Los oligopéptidos de E, son definidos en la presente como una sene de peptidos que corresponden a una porción de la secuencia de aminoácidos de ia proteína E como se describe en la SEC ID NO 11 que se sintetizan como uno o son unidos químicamente Dichos peptidos u oligopeptidos, se pueden sintetizar utilizando uno de vanos métodos de la síntesis de peptidos conocidos en la materia incluyendo síntesis de péptidos solidos normales, utilizando aminoácidos de butoxicarboniio terciario (Mitcheli y otros, 1978, J Org Chem 432845-2852), utilizando aminoácidos de fluorenilmetiloxicarbonilo sobre un soporte de poliamida (Dryland y otros, 1986, J Chem So Perkm Trans I, 125-137), mediante ia síntesis de búsqueda de peptidos (Geysen y otros 1987 J Immunoi Methods 03259, 1984, Proc Nati Acad Sci EUA 81 3998), o mediante síntesis normal de peptidos en fase liquida La modificación de ios péptidos u oligopeptidos, tai como por supresión y substitución de aminoácidos (e incluyendo extensiones y adiciones a los aminoácidos) y en otras formas, se puede hacer de tal manera que no se aparte substancialmente de las propiedades inmunologicas del péptido u oligopéptidos En particular, ia secuencia de aminoácidos equivalente que da como resultado una alteración que es inactiva en términos de una diferencia observada en el comportamiento fisicoquímico de la proteina, péptido u oligopeptido La proteína E, péptidos de E, y oligopéptidos de E purificados, se pueden utilizar como antigenos en inmunoanalisis para la detección de antisuero especifico para Moraxella catarrhalis, presente en el fluido corporal de un individua que se sospecha que tiene una infección ocasionada por M catarrhalis Los fiuidos corporales incluyen, pero no está limitados a, fluido del oído medio, esputo, sangre, y fluidos de la nasofapnge, ojos, y adenoides La detección de E, peptidos de E, u ohgopeptidos de E, como un antígeno en inmunoanálisis, incluye cualquier inmunoanáiisis conocido en la técnica, incluyendo, pero no limitado a, radioinmunoanáhsis, análisis inmunoabsorbente unido a enzima (ELISA), análisis de 'emparedado", reacción de precipitma, análisis de aglutinación, inmunoanálisis fluorescente, e inmunoanaiisis basado en quimiolummiscencia Modalidad E Los métodos y compuestos para formulaciones de vacuna relacionadas con E, péptidos de E, y oligopéptidos de E. Esta modalidad de la presente invención, provee proteína E y/o péptidos de la misma, para ser utilizados como inmunógenos en una vacuna profiláctica y/o terapéutica para inmunización activa para proteger contra o tratar infecciones ocasionadas por M. catarrhalis. Para el desarrollo de la vacuna, las secuencias de aminoácidos específicos para E, que comprenden el imunogeno, se pueden purificar a partir de M. catarrhalis, o se pueden purificar a partir de un huésped que contiene un vector recombinante el cual expresa E, péptido de E, u oligopéptidos de E. Dichos huéspedes incluyen, pero no están limitados a, transformantes bacterianos, transformantes de levadura, transformantes fúngicos filamentosos, y células cultivadas que han sido tanto infectadas como transfectadas con un vector que codifica secuencias de aminoácidos de E. Los péptidos u oligopéptidos que corresponden a porciones de proteína E, se pueden producir a partir de división química o enzimática de proteína E, o se pueden sintetizar químicamente utilizando métodos conocidos en la materia y con la secuencia de aminoácidos deducida de la secuencia de nucleótidos del gen que codifica E como una referencia. Alternativamente, los péptidos de E u oiigopéptidos de E, se pueden producir de un vector recombinante. En cualquier caso, ei inmunógeno de proteína E, péptido de E, u oligopéptido de E, está incluido como el material inmunogénico relevante en la formulación de vacunas, y en cantidades terapéuticamente efectivas, para inducir una respuesta inmune. Se conocen muchos métodos para la introducción de formulación de vacunas en el ser humano o animal que será vacunado. Estos incluyen, pero no están limitados a, administración intradérmica, intramuscular, intraperitoneaí, intravenosa, subcutánea, ocular, intranasal, oral. Además, la vacuna puede comprender un vehículo fisiológico tal como una solución, un polímero o liposomas; y un adyuvante, o una combinación de los mismos. Se utilizan varios adyuvantes junto con ¡as formulaciones de vacunas. Los adyuvantes ayudan a obtener un nivel más durable y superior de inmmunídad que utiliza cantidades menores de antígeno de vacunas o dosis más pequeñas que si el antígeno de vacunas fuera administrado solo. El mecanismo de acción adyuvante, es complejo y no está completamente entendido. Sin embargo, puede implicar la inmunomodulación a través de la estimulación de producción de citoquina, fagocitosis y otras actividades del sistema reticuloendotelial, así como la liberación retardada y la degradación/procesamiento del antígeno para incrementar el reconocimiento inmune. Los ejemplos de adyuvantes incluyen el adyuvante de Freund incompleto, el Adyuvante 65 (conteniendo aceite de cacahuate, monooleato de manida y monoestearato de aluminio), emulsiones de aceite, adyuvante de Ribi, los polioles plurónicos, poiiaminas, Avidina, Quii A saponina, MPL, QS-21, y genes minerales tales como hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio, etc.

Otra modalidad de este modo de la invención, implica ia producción de secuencias de aminoácidos específicos para E como un hapteno, es decir, una molécula que no puede producir una respuesta inmune. En dicho caso, el hapteno puede estar unido covalentemente a un vehículo u otra molécula inmunogénica que conferirá inmunogenicidad al hapteno acoplado cuando se expone al sistema inmune. Por lo tanto, dicho hapteno específico para E, único a una molécula de vehículo, puede ser el inmunógeno en una formulación de vacuna. Otra forma de esta modalidad, provee ya sea una vacuna viral recombinante viva, vacuna bacteriana recombinante, vacuna bacteriana atenuada recombinante, o una vacuna viral recombinante inactivada, que se utiliza para proteger contra infecciones causadas por M. catarrhalis. El virus de vaccinia, es el mejor ejemplo conocido, en la técnica, de un virus infeccioso que es diseñado para expresar antígenos de vacunas derivados de otros organismos. El virus de vaccinia vivo recombinante, que está atenuado o de otra manera, tratado de tal forma que no ocasiona enfermedad por sí mismo, se utiliza para inmunizar al huésped. La replicación subsecuente del virus recombinante dentro del huésped, provee una estimulación continua del sistema inmune con los antígenos de vacunas tales como E, u péptido de E, proveyendo así inmunidad duradera. Otros vectores de vacunas vivos incluyen; adenovirus, citomegalovirus, y preferiblemente los posvirus tales como vaccinia (Paoletti y Panicali, Patente de E.U.A. No. 4,603,112) y cepas de Salmonella atenuada (Stocker y otros, Patentes de E.U.A. Nos. 5,210,035; 4,837,151; y 4,735,801; y Curtiss y otros, 1988, Vaccine 6:155-160). Las vacunas vivas son particularmente ventajosas dado que estimulan continuamente el sistema inmune que puede conferir substancialmente inmunidad duradera. Cuando la respuesta inmune protege contra infección de M. catarrhalis subsecuente, la vacuna viva por sí misma, se puede utilizar en una vacuna preventiva contra M. catarrhalis. Para ilustrar esta forma de la modalidad, utilizando técnicas biológicas moleculares tales como aquellas ilustradas en la Modalidad A, el gen que codifica E, o un fragmento de gen que codifica uno o más péptidos de E, se pueden insertar en el ADN genómico del virus de vaccinia en un sitio que permite la expresión de epitopes de E pero no afecta negativamente el crecimiento o replicación del vector del virus de vaccinia. Ei virus recombinante resultante, se puede utilizar como el inmunógeno en una formulación de vacuna. Los mismos métodos se pueden utilizar para construir una formulación de vacuna viral recombinante inactivada, excepto que el virus recombinante es inactivado, tal como mediante medios químicos conocidos en la técnica, antes de utilizarse como un inmunógeno y sin afectar substancialmente la inmunogenicidad del inmunogeno expresado. Una mezcla de los virus inactivados que expresan diferentes epitopes, se pueden utilizar en ia formulación de una vacuna inactivada multivalente. En cualquier caso, la vacuna recombinante inactivada o mezcla de virus inactivados, se pueden formular con un adyuvante adecuado con el fin de incrementar la respuesta inmunológica para los antígenos de vacuna. En otra variación de esta modalidad, el material genético se utiliza directamente como la formulación de vacuna. El ácido nucleico (ADN o ARN) que contienen secuencias que codifican E, péptido de E u oligopéptido de E, unidos operativamente a uno o más elementos reguladores se pueden introducir directamente para vacunar al individuo ("transferencia directa del gen") contra cepas patogénicas de M. catarrhalis. La transferencia directa del gen en un individuo vacunado, ando como resultado la expresión del material genético mediante las células del individuo vacunado tal como células endoteliales vasculares tales como células endoteliales vasculares, así como el tejido de los órganos principales, se ha demostrado mediante las técnicas en la materia tales como inyección intravenosa de un complejo de plásmido de expresión: liposoma catiónico (Zhu y otros, 1993, Science 261:209-211). Otros métodos efectivos para entregar ADN del vector en una célula blanco son conocidos en la materia. En un ejemplo, el ADN de plásmido recombinante purificado que contiene genes virales, se ha utilizado para inocular vacunas (ya sea parenteralmente, mucosalmente, o vía inmunización de gen-pistoia) para inducir una respuesta inmunoprotectora (Fynan y otros, 1993, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 90:11478-11482). En otro ejemplo, las células removidas de un individuo se puede transfectar o electroforar mediante procedimientos normaies conocidos en ia técnica, dando como resultado la introducción del ADN de vector recombinante en la célula blanco. Las células que contienen el ADN del vector recombinante, se pueden seleccionar para utilizar métodos conocidos en la técnica tales como vía una selección de marcador de selección expresado en el vector, y las células seleccionadas se pueden reintroducir después en el individuo para expresar la proteína E, péptido de E, u oligopéptido de E. Un método preferido de vacunación con material genético, comprende el paso de administrar al individuo la molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una o más de las proteína E, péptidos de E, u oligopéptidos de E, en donde la molécula de ácido nucleico está unida operativamente a una o más secuencias reguladoras necesarias para ia expresión. La molécula de ácido nucleico se puede administrar directamente, o introducir primero en un vector viral y administrarse vía el vector. La molécula de ácido nucleico ese puede administrar en un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable, y puede contener compuestos que pueden incrementar la efectividad de al vacuna. Estos compuestos adicionales incluyen, pero no están limitados a, adyuvantes, que modulan e incrementan la respuesta inmune, u otros compuestos que incrementan la absorción de ácido nucleico mediante ¡as células. La inmunización con la molécula de ácido nucleico, puede ser a través de cualquier ruta parenteral (intravenosa, intraperitoneal, intradérmica, subcutánea, o intramuscular) o vía contacto con superficies mucosas de la nasofaringe, traquea, o tracto gastrointestinal. Como una alternativa para la inmunización activa, tal como en donde un individuo inmunocomprometido, sufre de una infección que amenaza potencialmente la vida, ocasionada por M. catarrhalis, la inmunización puede ser pasiva, es decir, la inmunización que comprende la administración de inmunoglobulina purificada de seres humanos, que contiene anticuerpo contra epitopes de E. Se debe entender que mientras la invención se ha descrito en detalle en la presente, los ejemplos únicamente fueron para propósitos de ilustración. Otras modificaciones de las modalidades de la presente invención, que son obvias para los expertos en la material de biología molecular, diagnósticos médicos, y disciplinas relacionadas, se pretende que estén dentro del alcance de las reivindicaciones anexas.

LISTA DE SECUENCIAS (1) INFORMACIÓN GENERAL: (i) SOLICITANTES: Murphy, Timothy F. Bhushan, Reva (ii) TITULO DE LA INVENCIÓN: Vacuna para Moraxella catarrhalis (iií) NUMERO DE SECUENCIAS: 18 (IV) DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA: (A) DESTINATARIO: Hodgson, Russ, Andrews, Woods & Goodyear (B) CALLE: 1800 One M&T Plaza (C) CIUDAD: Buffalo (D) ESTADO: New York (E) PAÍS: Estados Unidos (F) ZP: 14203-2391 (v) FORMA QUE SE LEE EN COMPUTADORA: (A) TIPO DE MEDIO: Disquete, 3.5 pulgadas, almacenamiento de 1.44 kb (B) COMPUTADORA: compatible con IBM (C) SISTEMA OPERATIVO: MS-DOS/Microsoft Windows 3.1 (D) SOFTWARE: Wordperfect (vi) DATOS DE SOLICITUD ACTUAL: (A) NUMERO DE SOLICITUD: (B) FECHA DE PRESENTACIÓN: (vii) DATOS DE SOLICITUD Previa: (A) NUMERO DE SOLICITUD: U.S. Serie NO. 08/245,758 (B) FECHA DE PRESENTACIÓN: 17/05/94 (viii) INFORMACIÓN APODERADO/AGENTE: (A) NOMBRE: Nelson, M. Bud (B) NUMERO DE REGISTRO: 35,300 (C) NUMERO DE REFERENCIA/CASO: 11520.0063 (ix) INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN: (A) TELEFONO: (716) 856-4000 (B) TELEFAX: (716) 849-0349 (2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 1: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 20 nucleótidos (B) TIPO: ácido nucleico (C) No. FILAMENTOS: un filamento (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (iii) FUENTE INMEDIATA: sintetizada (iv) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Moraxella catarrhaiis (B) CEPA: 25240 (C) TIPO DE CÉLULA: bacteria (v) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO:1: CAAGATGGTA CATATGCGAA 20 (3) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 2: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 20 NUCLEÓTIDOS (B) TIPO: ácido nucleico (C) No. FILAMENTOS: un filamento (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (iii) FUENTE INMEDIATA: sintetizada (iv) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Moraxella catarrhalis (B) CEPA: 25240 (C) TIPO DE CÉLULA: bacteria (v) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO:2: CAAGATGGTA CGTATGCGAA 20 (4) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 3: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 20 NUCLEÓTIDOS (B) TIPO: ácido nucleico (C) No. FILAMENTOS: un filamento (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (iii) FUENTE INMEDIATA: sintetizada (iv) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Moraxella catarrhalis (B) CEPA: 25240 (C) TIPO DE CÉLULA: bacteria (v) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO:3: CAGATGGTA CTTATGCGAA 20 (5) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 4: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 20 NUCLEÓTIDOS (B) TIPO: ácido nucleico (C) No. FILAMENTOS: un filamento (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (iii) FUENTE INMEDIATA: sintetizada (iv) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Moraxella catarrhalis (B) CEPA: 25240 (C) TIPO DE CÉLULA: bacteria (v) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA:SEC ID NO:4: CAAGATGGTA CCTATGCGAA 20 (6) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 5: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 20 NUCLEÓTIDOS (B) TIPO: ácido nucleico (C) No. FILAMENTOS: un filamento (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (iii) FUENTE INMEDIATA: sintetizada (iv) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Moraxella catarrhalis (B) CEPA: 25240 (C) TIPO DE CÉLULA: bacteria (v) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO:5: CAAGATGGCA CATATGCGAA 20 (7) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 6: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 20 NUCLEÓTIDOS (B) TIPO: ácido nucleico (C) No. FILAMENTOS: un filamento (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (iii) FUENTE INMEDIATA: sintetizada (iv) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Moraxella catarrhalis (B) CEPA: 25240 (C) TIPO DE CÉLULA: bacteria (v) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO:6: CAAGATGGCA CGTATGCGAA 20 (8) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 7: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 20 NUCLEÓTIDOS (B) TIPO: ácido nucleico (C) No. FILAMENTOS: un filamento (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (iii) FUENTE INMEDIATA: sintetizada (iv) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Moraxella catarrhalis (B) CEPA: 25240 (C) TIPO DE CÉLULA: bacteria (v) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO:7: CAAGATGGCA CTATGCGAA 20 (9) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 8: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 20 NUCLEÓTIDOS (B) TIPO: ácido nucleico (C) No. FILAMENTOS: un filamento (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (iii) FUENTE INMEDIATA: sintetizada (iv) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Moraxella catarrhalis (B) CEPA: 25240 (C) TIPO DE CÉLULA: bacteria (v) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO:8: CAAGATGGCA CCTATGCGAA 20 (10) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 9: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 28 NUCLEÓTIDOS (B) TIPO: ácido nucleico (C) No. FILAMENTOS: un filamento (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (iii) FUENTE INMEDIATA: sintetizada (iv) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Moraxella catarrhalis (B) CEPA: 25240 (C) TIPO DE CÉLULA: bacteria (v) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO:9: GGCTTGGGC ACTTTGTCAT CACCCTCC 28 (11) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 10: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 30 NUCLEÓTIDOS (B) TIPO: ácido nucleico (C) No. FILAMENTOS: un filamento (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (iii) FUENTE INMEDIATA: sintetizada (iv) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Moraxella catarrhalis (B) CEPA: 25240 (C) TIPO DE CÉLULA: bacteria (v) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO:10: CTTGAATTCA CACCAGTTTG AAAATCCAAG 30 (12) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 11: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA (A) LONGITUD: 1650 NUCLEÓTIDOS (ß) TIPO: ácido nucleico (C) No. FILAMENTOS: doble filamento (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN| genómico (iii) Hipotética: si (iv) FUENTE INMEDIATA: (A) ORGANISMO: Moraxella catarrhalis (B) CEPA: 25240 (C) TIPO DE CÉLULA: bacteria (vi) ASPECTO: (A) LOCALIZACION: región del gen E, 154-1531 (v) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO:11 TAAACGCATA AAAATTGTAA GAAAATATAT ATATTTTACT TGTTTTGTGA 50 TTAAATTTCA TTTAAGATAC AAATGTGTAA GACTTTTGTA CTGTTCTATA 100 AAGAAGTATG GACAGTTTTA CATATTGTAA GGACTGACTT TTTGGAGAAA 150 GTG ATG AGC TTA AAA TTT GGA TAC AAA GCG CTG AGT TTG GCG 192 Met Ser Leu Lys Phe Gly Tyr Lys Ala Leu Ser Leu Ala 1 5 10 GTA TTT TCA ACC CTA ACC GCA ACC GCA GCA CAÁ GCA GCA GGC 234 Val Phe Ser Thr Leu Thr Ala Thr Ala Ala Gln Ala Ala Gly 15 20 25 CTG GAT CGC TCA GGG CAÁ GAT, GTG ACT GCT TIT TTA CAÁ GAT 276 Leu Asp Arg Ser Gly Gln Asp Val Thr Ala Phe Leu Gln Asp ' 30 "• 35 40 GGC ACT TAT GCC GAA ACC GTT TAT ACT TAT ATT GAT GCC AAT 318 Gly Thr Tyr Ala Glu Thr Val Tyr Thr Tyr He Asp Ala Asn 45 50 55 GTT ACC GGT AAA GAT ACC GCA GGC AAA GAT ACA GGT GAT ATT 360 Val Thr Gly Lys Asp Thr Ala Gly Lys Asp Thr Gly "Asp He 60 65 GCC GAA GCT TAT GAT TTT TTC CGT TAC GGT GTT AAA GCA GAC 402 Ala Glu Ala Tyr Asp Phe Phe Arg Tyr Gly Val Lys Ala Asp 70 75 80 ATC AAC GAC ACC TTT AGC ATC GGT GTG CTA TAT GAC GAG CCA 444 He Asn Asp Thr Phe Ser He Gly Val Leu Tyr Asp Glu Pro 85 90 95 TTT GGT GCA GCG GTT CA TAT GAC GGT AAT AGT AAT TTT GTG 486 Phe Gly Ala Ala Val Gln Tyr Asp Gly Asn Ser Asn Phe Val 100 105 110 GCA GAT AAA AAT GCA ACA GCA ACA ATT TTT GCC CAÁ GCT ATC 528 Ala Asp Lys Asn Ala Thr Ala Thr He Phe Ala Gln Ala He 115 120 125 AAT CAG GCT ACA AAA GCA CAÁ TTA AAC GAT AGC CTT GCT TAT 570 Asn Gln Ala Thr Lys Ala Gln Leu Asn Asp Ser Leu Ala Tyr 130 135 AAA TCA ATT AAG CCA GTT TTA GAC AGT GTT AAA TCA CCT CAG 612 Lys Ser He Lys Pro Val Leu Asp Ser Val Lys Ser Pro Gln 140 145 150 CGT GCT TTG GCA GTA GCA TCA ATC GTA GAA ACC AAT TCA GCA 654 Arg Ala Leu Ala Val Ala Ser He Val Glu Thr Asn Ser Ala 155 160 165 CAÁ GCC AAA CCC ATT GCT GAC CGA TTA AGA GCA GCG GCT GCA 696 Gln Ala Lys Pro He Ala Asp Arg Leu Arg Ala Ala Ala Ala 170 175 180 CAT GCA GAA GCA ACT GAC GGT CAÁ AAG ACT AAT GTC GAA ATT 738 His Ala Glu Ala Thr Asp Gly Gln Lys Thr Asn Val Glu He 185 190 195 CGC ACC AAC AAC CTA ACC ATG TTA GTC GGT GCC AAA TTG GGT 780 Arg Thr Asn Asn Leu Thr Met Leu Val Gly Ala Lys Leu Gly 200 205 GCT AAT AAA AAT TTC CAÁ ATC TAT GGC GGT CCT GTG GCT CAÁ 822 Ala Asn Lys Asn Phe Gln He Tyr Gly Gly Pro Val Ala Gln 210 215 1 220 AGA GTT AAG GGc' GAA GTG CAT TTG CGT GGT CCT GCT TAT CAÁ 864 Arg Val Lys Gly" G •>lu Val His Leu Arg Gly Pro Ala Tyr Gln 225 230 235 GTC ATG ACA GGT TAT GAT GCC AAA ATT GCA ACA GAT ACT CAÁ 906 Val Met Thr Gly Tyr Asp Ala Lys He Ala Thr Asp Thr Gln 240 245 250 TTG GGC TGG GCG GCA GGT TTG GCA TTT TAT AAA CCC GAA ATT 948 Leu Gly Trp Ala Ala Gly Leu Ala Phe Tyr Lys Pro Glu He 255 260 265 GCC CTA AAA GCC GCT TTG ACC TAT CGC TCT GAG ATT GAG CAT 990 Ala Leu Lys Ala Ala Leu Thr Tyr Arg Ser Glu He Glu His 270 275 GAC TCT GAA ATT GCC GAA ACC ATT CCT GTT ACG GCC TAT GCG .032 Asp Ser Glu He Ala Glu Thr He Pro Val Thr Gly Tyr Ala 280 285 290 GGT AAA AAG GAT TTT AAA GTT ACT TTG CCT GAC TCA TGG AAC 1074 Gly Lys Lys Asp Phe Lys Val Thr Leu Pro Asp Ser Trp Asn 295 300 305 TTA GAT TTT CAÁ ACT GGT GTG AAT CCA ACA ACG CTA TTA ACT 1116 Leu Asp Phe Gln Thr Gly Val Asn Pro Thr Thr Leu Leu Thr 310 315 320 GCC AAA GTA CGC TAT GTA CCA TGG TCT GAT TTT GAC ATT CGC 1158 Ala Lys Val Arg Tyr Val Pro Trp Ser Asp Phe Asp He Arg 325 330 335 CCA ACA CAG TAT ACA GAA ACC ACA AAA CTT CGT TAT CCA CAG 1200 Pro Thr Gln Tyr Thr Glu Thr Thr Lye Leu Arg Tyr Pro Gln 340 345 GGT TTA CCA ATC ATC AGC TAT GAC AAA GAC CAÁ TGG TCG GCT 1242 Gly Leu Pro He He Ser Tyr Asp Lys Asp Gln Trp Ser Ala 350 355 360 GAA GTT GGT TTG GGT AAG CGT GTT AGC GAT CGT TTG GCT GTT 1284 Glu Val Gly Leu Gly Lys Arg Val Ser Asp Arg Leu Ala Val 365 370 375 TCA GGT GCG GTA GGT TGG GAT AGT GGT GCA GGT AAC CCT GCA 1326 Ser Gly Ala Val Gly Trp Asp Ser Gly Ala Gly Asn Pro Ala 380 I 385 390 • • AGT AGC TTA GCT CCT ATC AAA GGC TAT TAT TCA TTG GGC TTA 1368 Ser Ser Leu Gly Pro He Lys Gly Tyr Tyr Ser Leu Gly Leu 395 400 405 GGT GCG CGG TAT AAT GTT ACA CCT GAA TGG TCG CTG TCT TTG 1410 Gly Ala Arg Tyr Asn Val Thr Pro Glu Trp Ser Leu Ser Leu 410 * 415 420 GGT GGT AAA TAC TTT AAA TTT GGA GAT GCT CAÁ GCA CAG CTA 1452 Gly Gly Lys Tyr Phe Lys Phe Gly Asp Ala Gln Ala Gln Leu 425 430 CCA ACC AAA GAT AAA GTA GGT AAC TTT GAT AGT AAT GAT GGC 1494 Pro Thr Lys Asp Lys Val Gly Asn Phe Asp Ser Asn Asp Gly 435 440 445 TAT GCC TTG GGC GTT AAG CTT GCT TAT CAC GCC AAA TAATCT 1536 Tyr Ala Leu Gly Val Lys Leu Ala Tyr His Ala Lys 450 455 460 CATGCTAAAT CATACAAAAA TGTCTAAATA TAAAAAATAG CTTGAATTTC 1586 AAGCTATTTT TTATTAGTTG GTTAAAAATT AACGAATCTC AACCGTCGCA 1636 CATTTCGATG ACAG 1650 (13) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 12: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 24 NUCLEÓTIDOS (B) TIPO: ácido nucleico (C) No. FILAMENTOS: un filamento (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (iii) FUENTE INMEDIATA: sintetizada (iv) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Moraxella catarrhalis (B) CEPA: 25240 (C) TIPO DE CÉLULA: bacteria (v) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO:12: CGCCAAACTC AGCGCTTTCT ATCC 24 (14) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 13: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 24 NUCLEÓTIDOS (B) TIPO: ácido nucleico (C) No. FILAMENTOS: un filamento (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (iii) FUENTE INMEDIATA: sintetizada (iv) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Moraxella catarrhalis (B) CEPA: 25240 (C) TIPO DE CÉLULA: bacteria (v) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO:13: GTCAGTCCTT CCAATATGTA AAAC 24 (15) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 14: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 35 NUCLEÓTIDOS (B) TIPO: ácido nucleico (C) No. FILAMENTOS: un filamento (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (iii) FUENTE INMEDIATA: sintetizada (iv) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Moraxella catarrhalis (B) CEPA: 25240 (C) TIPO DE CÉLULA: bacteria (v) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO:14: CGCTAAAAA TTGTAAGAAA ATATATATAT TTTAC 35 (16) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 15: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 38 NUCLEÓTIDOS (B) TIPO: ácido nucleico (C) No. FILAMENTOS: un filamento (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (iii) FUENTE INMEDIATA: sintetizada (iv) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Moraxella catarrhalis (B) CEPA: 25240 (C) TIPO DE CÉLULA: bacteria (v) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO:15: GCTATTTTTT ATATTTAGAC ATTTTTGTAT CATTTAGC 38 (17) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 16: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 35 NUCLEÓTIDOS (B) TIPO: ácido nucleico (C) No. FILAMENTOS: un filamento (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (iii) FUENTE INMEDIATA: sintetizada (iv) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Moraxella catarrhalis (B) CEPA: 25240 (C) TIPO DE CÉLULA: bacteria (v) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO:16: GTGATGAGCT TAAAATTTGG ATACAAAGCG CTGAG 35 (18) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 17: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 30 NUCLEÓTIDOS (B) TIPO: ácido nucleico (C) No. FILAMENTOS: un filamento (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (iii) FUENTE INMEDIATA: sintetizada (iv) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Moraxella catarrhalis (B) CEPA: 25240 (C) TIPO DE CÉLULA: bacteria (v) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO:17: GCATGAGATT ATTTGGCGTG ATAAGCAAGC 30 (19) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 18: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 34 NUCLEÓTIDOS (B) TIPO: ácido nucleico (C) No. FILAMENTOS: un filamento (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (iii) FUENTE INMEDIATA: sintetizada (iv) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Moraxella catarrhalis (B) CEPA: 25240 (C) TIPO DE CÉLULA: bacteria (v) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO:18: GCAGGCCTGG ATCGCTCAGG GCAAGATGTG ACTG 34

Claims

REIVINDICACIONES 1. Una formulación de vacuna que comprende una cantidad inmunológicamente efectiva de un péptido, oligopéptido, o proteína substancialmente puros, que tienen uno o más epitopes de E, en donde E es una proteína de membrana externa de Moraxella catarrhalis de una masa molecular aparente de aproximadamente 35,000 a aproximadamente 50,000 daltons por SDS-PAGE y teniendo una secuencia de aminoácidos substanciaimente como se describe en SEC ID NO:11 del residuo de aminoácidos 26 al 460.
2. La formulación de vacuna de acuerdo con la reivindicación 1, en la cual el péptido, oligopéptido, o proteína, fue producido recombinantemente de células cultivadas de un sistema de células huésped diseñadas genéticamente para incluir un vector que contiene una secuencia de nucleótidos que regula la expresión de secuencias de ADN que regulan la expresión de secuencias de ADN que codifican epítopes de E, dichos sistema de células huésped, se selecciona del grupo que consiste de bacterias, levaduras, hongos filamentosos, líneas celulares de insectos, y líneas celulares de mamíferos.
3. La formulación de vacuna de acuerdo con ia reivindicación 1, en la cual el péptido u oligopéptido se produce mediante división química o enzimática de la proteína E.
4. La formulación de vacuna de acuerdo con la reivindicación 1, en ia cuai el péptido u oiigopéptido se produce mediante síntesis química.
5. La formulación de vacuna de acuerdo con la reivindicación 1, que además comprende un vehículo farmacéutico.
6. La formulación de vacuna de acuerdo con la reivindicación 2, en la cual la célula cultivada es una bacteria.
7. La formulación de vacuna de acuerdo con la reivindicación 2, en la cual la célula cultivada es una levadura.
8. La formulación de vacuna de acuerdo con la reivindicación 2, en la cual la célula cultivada es un hongo filamentoso.
9. La formulación de vacuna de acuerdo con la reivindicación 2, en la cual la célula cultivada es una línea celular de insectos.
10. La formulación de vacuna de acuerdo con la reivindicación 2, en la cual la célula cultivada es una línea celular de mamíferos.
11. Un péptido, oligopéptido, o proteína, antigénico substancialmente puros, que tienen uno o más epítopes de E, en donde E es una proteína de membrana externa de Moraxella catarrhalis de una masa molecular aparente de aproximadamente 35,000 a aproximadamente 50,000 daitons por SDS-PAGE y que tienen una secuencia de aminoácidos substancialmente como se describió en la SEC ID NO.11 del residuo de aminoácidos 26 al 460.
12. El péptido, oligopéptido o proteína, de acuerdo con ia reivindicación 11, en el cual el péptido, oligopéptido, o proteína, fue producido recombinantemente de células cultivadas de un sistema de céluias huésped diseñadas genéticamente para incluir un vector que contiene una secuencia de nucleótidos que regula la expresión de secuencias de ADN que regulan la expresión de secuencias de ADN que codifican epítopes de E, dichos sistema de células huésped, se selecciona dei grupo que consiste de bacterias, levaduras, hongos filamentosos, líneas celulares de insectos, y líneas celulares de mamíferos.
13. El péptido, oligopéptido o proteína de acuerdo con la reivindicación 12, en el cual ia célula cultivada es una bacteria.
14. El péptido, oligopéptido o proteína de acuerdo con la reivindicación 12, en el cual la célula cultivada es una levadura.
15. El péptido, oligopéptido o proteína de acuerdo con la reivindicación 12, en el cual ia célula cultivada es un hongo filamentoso.
16. El péptido, oligopéptido o proteína de acuerdo con la reivindicación 12, en el cual la célula cultivada es una línea celular de insectos.
17. El péptido, oligopéptido o proteína de acuerdo con la reivindicación 12, en el cual la célula cultivada es una línea celular de mamíferos.
18. Un vector recombinante que comprende una secuencia de ADN que codifica uno o más determinantes o epítopes de E, en donde E es una proteína de membrana externa de Moraxella catarrhalis de una masa molecular aparente de aproximadamente 35,000 a aproximadamente 50,000 daitons por SDS-PAGE y que tienen una secuencia de aminoácidos substancialmente como se describió en la SEC ID NO:11 del residuo de aminoácidos 26 al 460.
19. El vector recombinante de la reivindicación 18, en el cual el vector se selecciona del grupo que consiste de un vector de plásmidos, vector de fagemido, vector de cósmido, y un vector viral.
20. Una composición útil para inmunizar pasivamente a individuos que sufren de una infección causada por M. catarrhaíis, dicha composición comprendiendo antisuero purificado que reconoce uno o más epitopes de E, en donde E, es una proteína de membrana externa de M. catarrhalis de una masa molecular aparente de aproximadamente 35,000 a aproximadamente 50,000 daitons por SDS-PAGE y que tienen una secuencia de aminoácidos substancialmente como se describió en la SEC ID NO:11 del residuo de aminoácidos 26 al 460.
21. Oligonucleotidos purificados útiles en la detección de M. catarrhalis, dichos oligonucleótidos consistiendo esencialmente de secuencias de ácidos nucleicos que complementan e hibridizan específicamente a regiones conservadas del gen que comprenden el marco de lectura abierto de 1377 pares de base, de la SEC ID NO:11 o su filamento complementario correspondiente.
22. Los oligonucleótidos de la reivindicación 21, en los cuales los oligonucleótidos consisten esencialmente de secuencias de ácidos nucleicos seleccionadas del grupo que consiste de SEC iD NO:1, SEC ID NO:2, SEC ID NO:3, SEC ID NO:4, SEC ID NO:5, SEC ID NO:6, SEC ID N0:7, SEC ID NO:8, SEC ID NO:9, SEC ID NO:10, SEC ID NO:11, SEC ID NO:12, SEC ID NO:13, SEC ID NO:14, SEC ID NO:15, SEC ID NO:16, SEC ID NO:17, SEC ID NO:18.
23. Un método para detectar la presencia o ausencia de Moraxella catarrhalis en un espécimen clínico, en donde el método comprende los pasos de: (a) Usar células de Moraxella catarrhalis en el espécimen para liberar material genético bacteriano; (b) poner en contacto el material genético con dos oligonucleótidos bajo condiciones adecuadas que permiten ia hibridación de los oligonucleótidos para el material genético, en donde un primer oligonucleótido se hibridiza a una región dentro de un gen que comprende el marco de lectura abierto de par de bases de 1377 de SEC ID NO:11, y un segundo oligonucleótido hibridiza a una región en el filamento complementario correspondiente; (c) amplificar enzimáticamente una región específica de secuencia del material genético que comprende el gen y su filamento correspondiente que utiliza los oligonucleótidos del paso (b); y (d) detectar la presencia de secuencias amplificadas del gen y su filamento correspondiente, en donde ia presencia de estas secuencias amplificadas correlacionadas a la presencia de M. catarrhalis en el espécimen.
24. El método de la reivindicación 23, en el cual la detección se facilita además por la hibridación de secuencias amplificadas con una sonda de oligonucleótidos marcados que consisten de una secuencia de nucieótidos que corresponden a una región en la secuencia amplificada, si está presente, dicha etiqueta es una etiqueta conocida que se va a incorporar en oligonucleótidos seleccionados particularmente de etiquetas radioactivas, tales como 32P, y etiqueta enzimática, tal como biotina.
25. El método de la reivindicación 23, en el cual el espécimen es un fluido corporal seleccionado del grupo que consiste de fluido del oído medio; esputo; sangre, y fluidos de la nasofaringe, u ojos , o adenoides.
26. Un método para la detección de Moraxella catarrhalis en un espécimen clínico, en el cual el método comprende los pasos de: (a) obtener un espécimen de fluido corporal; (b) usar células de Moraxella catarrhalis en ei espécimen para liberar material genético bacteriano; (c) poner en contacto el material genético con dos oligonucleótidos bajo condiciones adecuadas que permiten la hibridación de ios oligonucieótidos para el material genético, en donde un primer oligonucleótido se hibridiza a una región dentro de un gen que comprende el marco de lectura abierto de par de bases de 1377 de SEC ID NO:11, o su filamento complementario correspondiente bajo condiciones adecuadas que permiten la hibridación del oligonucleótido para el material genético; y (d) detectar la interacción entre el espécimen y la sonda, dicha interacción estando entre el material genético de M. catarrhalis y la sonda.
27. El método de la reivindicación 26, en el cual el espécimen es un fluido corporal seleccionado dei grupo que consiste de fluido del oído medio; esputo, sangre; y fiúidos de la nasofaringe, u ojos, o adenoides.
28. Un método para la detección de antisuero específico para M. catarrhalis en un fluido corporal de in individuo que comprende el uso de un péptido o proteína que tiene uno o más epítopes de E como un antígeno en un inmunoanáiisis para interactuar con y detectar antisueros específicos para M. catarrhalis en ei fluido corporal, en donde E es una proteína de membrana externa de Moraxella catarrhalis de un masa molecular aparente de aproximadamente 35,000 a aproximadamente 50,000 daltons por SDS-PAGE y que tiene una secuencia de aminoácidos substancialmente como se describe en SEC ID NO:11 del residuo de aminoácidos 26 ai 460.
29. El método de la reivindicación 28, en ei cual el inmuoanálisis es un análisis seleccionado del grupo que consiste de radioinmunoanálisis, análisis inmunoabsorbente unido a enzima, análisis de "emparedado", reacción de precipitina, análisis de aglutinación, inmunoanáiisis basado en fluorescencia, e ¡nmunoanálisis basado en quimiofluorescencia.
30. Un gen aislado o fragmentos del mismo, que codifica epítopes de proteína E de mem brana externa de Moraxella catarrhalis, que tiene una masa molecular aparente de aproximadamente 35,000 a aproximadamente 50,000 daltons por SDS-PAGE, en el cual dicho gen comprende el marco de lectura abierto del 1977 pares de base de ia SEC I D NO: 1 1 .
31 . U na formulación de vacuna que comprende una molécula de ácido nucleico la cual codifica la proteína E, o uno o más fragmentos de gen que codifican uno o más péptidos de E u oligopéptidos de E, dicha molécula de ácido n ucleico está unida operativamente a secuencias reg uladoras; y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.
32. Un microorganismo recombinante infeccioso, que contiene una molécula de ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácido de E seleccionada del grupo que consiste de proteína E, péptidos de E, y oligopéptidos de E, de M. catarrhalis, en el cual ei microorganismo recombinante expresa la secuencia de aminoácido de E bajo condiciones de crecimiento adecuadas.
33. Un microorganismo de la reivindicación 32 , el cual es un virus de vaccinia, adenovírus, o citomegalovirus.
34. U n microorganismo de la reivindicación 32 , el cual es una bacteria del género Salmonella. R ESUMEN Se describen composiciones que comprenden proteína "E" de membrana externa , y péptidos y oíigopéptidos de la misma, de Moraxella catarrhalis. Adicionalmente, se describen las secuencias de nucleótidos que codifican la proteína, péptido o oligopéptido, así como vectores recombinantes que contienen estas secuencias. La proteína, péptido u oiigopéptido , se pueden producir a partir de sistemas de células huésped que contienen estos vectores recombinantes. Los péptidos y oligopéptidos también pueden ser sintetizados químicamente. Se describen los usos de la proteína , péptidos y oligopéptidos como antígenos para formulaciones de vacuna, y como antígenos en ¡nmunoanálisis de diagnóstico. Las secuencias de nucleótidos son útiles en la construcción de vectores para utilizarse como vacunas , para inserciones en bacterias atenuadas con el fin de construir una vacuna bacteriana recombinante y para insertarse en un vector viral en la construcción de una vacuna viral recombinante. También se describe el uso de secuencias de nucleótidos relacionados al gen que codifica E como iniciadores y/o sondas en análisis de diagnósticos moleculares para la detección de M. catarrhalis.