HUT77048A - Neisseria-eredetű hemoglobin-receptorok - Google Patents
Neisseria-eredetű hemoglobin-receptorok Download PDFInfo
- Publication number
- HUT77048A HUT77048A HU9701963A HU9701963A HUT77048A HU T77048 A HUT77048 A HU T77048A HU 9701963 A HU9701963 A HU 9701963A HU 9701963 A HU9701963 A HU 9701963A HU T77048 A HUT77048 A HU T77048A
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- hemoglobin receptor
- receptor protein
- hemoglobin
- meningitidis
- protein
- Prior art date
Links
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 title claims description 166
- 102000001554 Hemoglobins Human genes 0.000 title claims description 119
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 81
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 70
- 241000588653 Neisseria Species 0.000 claims description 60
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 57
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 45
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 44
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 claims description 44
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 claims description 44
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 42
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 39
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 39
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims description 35
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 claims description 26
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 22
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims description 20
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 18
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 16
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 16
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 16
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 14
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 claims description 13
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 13
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 claims description 12
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 12
- 241000894007 species Species 0.000 claims description 10
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 9
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 9
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 8
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 claims description 7
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 claims description 6
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 claims description 4
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 claims description 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 4
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 claims description 3
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000003053 immunization Effects 0.000 claims description 3
- 108091010989 hemoglobin binding proteins Proteins 0.000 claims description 2
- 102000036073 hemoglobin binding proteins Human genes 0.000 claims description 2
- 238000002649 immunization Methods 0.000 claims description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 3
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 claims 2
- 241000588650 Neisseria meningitidis Species 0.000 description 120
- 101710183906 Bacterial hemoglobin Proteins 0.000 description 92
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 88
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 74
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 74
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 74
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 66
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 57
- BTIJJDXEELBZFS-QDUVMHSLSA-K hemin Chemical compound CC1=C(CCC(O)=O)C(C=C2C(CCC(O)=O)=C(C)\C(N2[Fe](Cl)N23)=C\4)=N\C1=C/C2=C(C)C(C=C)=C3\C=C/1C(C)=C(C=C)C/4=N\1 BTIJJDXEELBZFS-QDUVMHSLSA-K 0.000 description 43
- 229940025294 hemin Drugs 0.000 description 43
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 41
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 37
- 241000588652 Neisseria gonorrhoeae Species 0.000 description 33
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 27
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 25
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 24
- 206010018612 Gonorrhoea Diseases 0.000 description 21
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 21
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 19
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 18
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 18
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 18
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 18
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 16
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 16
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 16
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 14
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 13
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 12
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 12
- 238000007899 nucleic acid hybridization Methods 0.000 description 12
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 12
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 11
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 11
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 11
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 11
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 10
- 108010036302 hemoglobin AS Proteins 0.000 description 10
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 10
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 10
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 9
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 9
- 108020004711 Nucleic Acid Probes Proteins 0.000 description 9
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 9
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 9
- 239000002853 nucleic acid probe Substances 0.000 description 9
- 102100032241 Lactotransferrin Human genes 0.000 description 8
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 8
- 101150090235 aroB gene Proteins 0.000 description 8
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 8
- 101150112623 hemA gene Proteins 0.000 description 8
- CSSYQJWUGATIHM-IKGCZBKSSA-N l-phenylalanyl-l-lysyl-l-cysteinyl-l-arginyl-l-arginyl-l-tryptophyl-l-glutaminyl-l-tryptophyl-l-arginyl-l-methionyl-l-lysyl-l-lysyl-l-leucylglycyl-l-alanyl-l-prolyl-l-seryl-l-isoleucyl-l-threonyl-l-cysteinyl-l-valyl-l-arginyl-l-arginyl-l-alanyl-l-phenylal Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 CSSYQJWUGATIHM-IKGCZBKSSA-N 0.000 description 8
- 229940078795 lactoferrin Drugs 0.000 description 8
- 235000021242 lactoferrin Nutrition 0.000 description 8
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 7
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 7
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 7
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 7
- 150000004032 porphyrins Chemical class 0.000 description 7
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 7
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 7
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108010063045 Lactoferrin Proteins 0.000 description 6
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 6
- 101100226309 Vibrio cholerae serotype O1 (strain ATCC 39315 / El Tor Inaba N16961) exbB1 gene Proteins 0.000 description 6
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 6
- 230000003385 bacteriostatic effect Effects 0.000 description 6
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 6
- 101150080665 exbB gene Proteins 0.000 description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 6
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 6
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 6
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 6
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 6
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 5
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 5
- 102000004338 Transferrin Human genes 0.000 description 5
- 108090000901 Transferrin Proteins 0.000 description 5
- 108010033576 Transferrin Receptors Proteins 0.000 description 5
- 102000007238 Transferrin Receptors Human genes 0.000 description 5
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 5
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 5
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 5
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 5
- 210000001322 periplasm Anatomy 0.000 description 5
- 101150080758 tonB gene Proteins 0.000 description 5
- 239000012581 transferrin Substances 0.000 description 5
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 4
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 4
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 4
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 4
- 206010062212 Neisseria infection Diseases 0.000 description 4
- 241000047957 Neisseria meningitidis 8013 Species 0.000 description 4
- -1 acetic Chemical class 0.000 description 4
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 4
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 4
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 4
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 4
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 4
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 4
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 4
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 4
- 150000003278 haem Chemical class 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 4
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 4
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 4
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 4
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 4
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 4
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 4
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 4
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 4
- 150000003839 salts Chemical group 0.000 description 4
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 3
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010041986 DNA Vaccines Proteins 0.000 description 3
- 229940021995 DNA vaccine Drugs 0.000 description 3
- VTLYFUHAOXGGBS-UHFFFAOYSA-N Fe3+ Chemical compound [Fe+3] VTLYFUHAOXGGBS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101710168840 Hemin receptor Proteins 0.000 description 3
- 102000008133 Iron-Binding Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108010035210 Iron-Binding Proteins Proteins 0.000 description 3
- 241000921898 Neisseria meningitidis serogroup A Species 0.000 description 3
- 241000293871 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhi Species 0.000 description 3
- 241000293869 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium Species 0.000 description 3
- 206010040047 Sepsis Diseases 0.000 description 3
- 239000000589 Siderophore Substances 0.000 description 3
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 3
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 3
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 3
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 3
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 3
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 3
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 3
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 3
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 3
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 3
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 3
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 3
- 108010071397 lactoferrin receptors Proteins 0.000 description 3
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 3
- 102000006240 membrane receptors Human genes 0.000 description 3
- 108020004084 membrane receptors Proteins 0.000 description 3
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 3
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 3
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 3
- JQXXHWHPUNPDRT-WLSIYKJHSA-N rifampicin Chemical compound O([C@](C1=O)(C)O/C=C/[C@@H]([C@H]([C@@H](OC(C)=O)[C@H](C)[C@H](O)[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)\C=C\C=C(C)/C(=O)NC=2C(O)=C3C([O-])=C4C)C)OC)C4=C1C3=C(O)C=2\C=N\N1CC[NH+](C)CC1 JQXXHWHPUNPDRT-WLSIYKJHSA-N 0.000 description 3
- 229960001225 rifampicin Drugs 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 3
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 3
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 3
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- ZGXJTSGNIOSYLO-UHFFFAOYSA-N 88755TAZ87 Chemical compound NCC(=O)CCC(O)=O ZGXJTSGNIOSYLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- 208000031729 Bacteremia Diseases 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 208000037487 Endotoxemia Diseases 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 2
- 206010027202 Meningitis bacterial Diseases 0.000 description 2
- 206010027249 Meningitis meningococcal Diseases 0.000 description 2
- 201000010924 Meningococcal meningitis Diseases 0.000 description 2
- QPCDCPDFJACHGM-UHFFFAOYSA-N N,N-bis{2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl}glycine Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(=O)O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O QPCDCPDFJACHGM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000588677 Neisseria meningitidis serogroup B Species 0.000 description 2
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- 241001504519 Papio ursinus Species 0.000 description 2
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 2
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 2
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 2
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 2
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 2
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108091053403 TonB-dependent receptor family Proteins 0.000 description 2
- 241000607626 Vibrio cholerae Species 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 241000607447 Yersinia enterocolitica Species 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 2
- 210000000436 anus Anatomy 0.000 description 2
- 210000003567 ascitic fluid Anatomy 0.000 description 2
- 201000009904 bacterial meningitis Diseases 0.000 description 2
- 239000003899 bactericide agent Substances 0.000 description 2
- 239000000022 bacteriostatic agent Substances 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 2
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 2
- IDDIJAWJANBQLJ-UHFFFAOYSA-N desferrioxamine B mesylate Chemical compound [H+].CS([O-])(=O)=O.CC(=O)N(O)CCCCCNC(=O)CCC(=O)N(O)CCCCCNC(=O)CCC(=O)N(O)CCCCCN IDDIJAWJANBQLJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 2
- 239000003651 drinking water Substances 0.000 description 2
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 2
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 208000001786 gonorrhea Diseases 0.000 description 2
- BTIJJDXEELBZFS-UHFFFAOYSA-K hemin Chemical compound [Cl-].[Fe+3].[N-]1C(C=C2C(=C(C)C(C=C3C(=C(C)C(=C4)[N-]3)C=C)=N2)C=C)=C(C)C(CCC(O)=O)=C1C=C1C(CCC(O)=O)=C(C)C4=N1 BTIJJDXEELBZFS-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 2
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 2
- 238000007901 in situ hybridization Methods 0.000 description 2
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 238000011694 lewis rat Methods 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L magnesium stearate Chemical compound [Mg+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 230000013011 mating Effects 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 208000037941 meningococcal disease Diseases 0.000 description 2
- 244000000010 microbial pathogen Species 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 239000006179 pH buffering agent Substances 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 2
- 229960003330 pentetic acid Drugs 0.000 description 2
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 2
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 2
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 2
- 210000000582 semen Anatomy 0.000 description 2
- 229940124530 sulfonamide Drugs 0.000 description 2
- 150000003456 sulfonamides Chemical class 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 2
- GETQZCLCWQTVFV-UHFFFAOYSA-N trimethylamine Chemical compound CN(C)C GETQZCLCWQTVFV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000009736 wetting Methods 0.000 description 2
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 2
- FFTVPQUHLQBXQZ-KVUCHLLUSA-N (4s,4as,5ar,12ar)-4,7-bis(dimethylamino)-1,10,11,12a-tetrahydroxy-3,12-dioxo-4a,5,5a,6-tetrahydro-4h-tetracene-2-carboxamide Chemical compound C1C2=C(N(C)C)C=CC(O)=C2C(O)=C2[C@@H]1C[C@H]1[C@H](N(C)C)C(=O)C(C(N)=O)=C(O)[C@@]1(O)C2=O FFTVPQUHLQBXQZ-KVUCHLLUSA-N 0.000 description 1
- PIINXYKJQGMIOZ-UHFFFAOYSA-N 1,2-dipyridin-2-ylethane-1,2-dione Chemical compound C=1C=CC=NC=1C(=O)C(=O)C1=CC=CC=N1 PIINXYKJQGMIOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WIIZWVCIJKGZOK-IUCAKERBSA-N 2,2-dichloro-n-[(1s,2s)-1,3-dihydroxy-1-(4-nitrophenyl)propan-2-yl]acetamide Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@@H](CO)[C@@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- MIJDSYMOBYNHOT-UHFFFAOYSA-N 2-(ethylamino)ethanol Chemical compound CCNCCO MIJDSYMOBYNHOT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZSLUVFAKFWKJRC-IGMARMGPSA-N 232Th Chemical compound [232Th] ZSLUVFAKFWKJRC-IGMARMGPSA-N 0.000 description 1
- 241000606748 Actinobacillus pleuropneumoniae Species 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 244000105975 Antidesma platyphyllum Species 0.000 description 1
- 241001550224 Apha Species 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 108020000946 Bacterial DNA Proteins 0.000 description 1
- 108700003860 Bacterial Genes Proteins 0.000 description 1
- 108010077805 Bacterial Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108020004513 Bacterial RNA Proteins 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 241000224483 Coccidia Species 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 108010073254 Colicins Proteins 0.000 description 1
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 1
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 description 1
- 101100284769 Drosophila melanogaster hemo gene Proteins 0.000 description 1
- 206010014824 Endotoxic shock Diseases 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241001646716 Escherichia coli K-12 Species 0.000 description 1
- 102000008857 Ferritin Human genes 0.000 description 1
- 108050000784 Ferritin Proteins 0.000 description 1
- 238000008416 Ferritin Methods 0.000 description 1
- 241000549135 Gyminda latifolia Species 0.000 description 1
- 241000606768 Haemophilus influenzae Species 0.000 description 1
- 101000798114 Homo sapiens Lactotransferrin Proteins 0.000 description 1
- 101000766306 Homo sapiens Serotransferrin Proteins 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 101710172804 K protein Proteins 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 101100038261 Methanococcus vannielii (strain ATCC 35089 / DSM 1224 / JCM 13029 / OCM 148 / SB) rpo2C gene Proteins 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 241000711408 Murine respirovirus Species 0.000 description 1
- 102000008300 Mutant Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010021466 Mutant Proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000000112 Myalgia Diseases 0.000 description 1
- 108700039768 Neisseria meningitidis HmbR Proteins 0.000 description 1
- 241000947238 Neisseria meningitidis serogroup C Species 0.000 description 1
- 241001212279 Neisseriales Species 0.000 description 1
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 1
- 101710116435 Outer membrane protein Proteins 0.000 description 1
- 241000283903 Ovis aries Species 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 108010087702 Penicillinase Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 108010002747 Pfu DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 229920002534 Polyethylene Glycol 1450 Polymers 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 108020004518 RNA Probes Proteins 0.000 description 1
- 239000003391 RNA probe Substances 0.000 description 1
- 238000010240 RT-PCR analysis Methods 0.000 description 1
- 101710146873 Receptor-binding protein Proteins 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 108091081062 Repeated sequence (DNA) Proteins 0.000 description 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 206010040070 Septic Shock Diseases 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- 229910052776 Thorium Inorganic materials 0.000 description 1
- 102000010912 Transferrin-Binding Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010062476 Transferrin-Binding Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000607598 Vibrio Species 0.000 description 1
- 241000607734 Yersinia <bacteria> Species 0.000 description 1
- 230000003187 abdominal effect Effects 0.000 description 1
- VYTBPJNGNGMRFH-UHFFFAOYSA-N acetic acid;azane Chemical compound N.N.CC(O)=O.CC(O)=O.CC(O)=O.CC(O)=O VYTBPJNGNGMRFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 229960002749 aminolevulinic acid Drugs 0.000 description 1
- 229960003022 amoxicillin Drugs 0.000 description 1
- LSQZJLSUYDQPKJ-NJBDSQKTSA-N amoxicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=C(O)C=C1 LSQZJLSUYDQPKJ-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 229940124350 antibacterial drug Drugs 0.000 description 1
- 238000011203 antimicrobial therapy Methods 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 1
- 108010058966 bacteriophage T7 induced DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 239000003782 beta lactam antibiotic agent Substances 0.000 description 1
- 102000006635 beta-lactamase Human genes 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 1
- 230000008499 blood brain barrier function Effects 0.000 description 1
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 1
- 210000001218 blood-brain barrier Anatomy 0.000 description 1
- 235000012206 bottled water Nutrition 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940087373 calcium oxide Drugs 0.000 description 1
- FPPNZSSZRUTDAP-UWFZAAFLSA-N carbenicillin Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)C(C(O)=O)C1=CC=CC=C1 FPPNZSSZRUTDAP-UWFZAAFLSA-N 0.000 description 1
- 229960003669 carbenicillin Drugs 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 1
- OEUUFNIKLCFNLN-LLVKDONJSA-N chembl432481 Chemical compound OC(=O)[C@@]1(C)CSC(C=2C(=CC(O)=CC=2)O)=N1 OEUUFNIKLCFNLN-LLVKDONJSA-N 0.000 description 1
- XMEVHPAGJVLHIG-FMZCEJRJSA-N chembl454950 Chemical compound [Cl-].C1=CC=C2[C@](O)(C)[C@H]3C[C@H]4[C@H]([NH+](C)C)C(O)=C(C(N)=O)C(=O)[C@@]4(O)C(O)=C3C(=O)C2=C1O XMEVHPAGJVLHIG-FMZCEJRJSA-N 0.000 description 1
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 1
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012411 cloning technique Methods 0.000 description 1
- FDJOLVPMNUYSCM-UVKKECPRSA-L cobalt(3+);[(2r,3s,4r,5s)-5-(5,6-dimethylbenzimidazol-1-yl)-4-hydroxy-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] [(2r)-1-[3-[(2r,3r,4z,7s,9z,12s,13s,14z,17s,18s,19r)-2,13,18-tris(2-amino-2-oxoethyl)-7,12,17-tris(3-amino-3-oxopropyl)-3,5,8,8,13,15,18,19-octamethyl-2,7, Chemical compound [Co+3].N#[C-].C1([C@H](CC(N)=O)[C@@]2(C)CCC(=O)NC[C@@H](C)OP([O-])(=O)O[C@H]3[C@H]([C@H](O[C@@H]3CO)N3C4=CC(C)=C(C)C=C4N=C3)O)[N-]\C2=C(C)/C([C@H](C\2(C)C)CCC(N)=O)=N/C/2=C\C([C@H]([C@@]/2(CC(N)=O)C)CCC(N)=O)=N\C\2=C(C)/C2=N[C@]1(C)[C@@](C)(CC(N)=O)[C@@H]2CCC(N)=O FDJOLVPMNUYSCM-UVKKECPRSA-L 0.000 description 1
- 230000001332 colony forming effect Effects 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- WZHCOOQXZCIUNC-UHFFFAOYSA-N cyclandelate Chemical compound C1C(C)(C)CC(C)CC1OC(=O)C(O)C1=CC=CC=C1 WZHCOOQXZCIUNC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000007123 defense Effects 0.000 description 1
- 229960001425 deferoxamine mesylate Drugs 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 230000002939 deleterious effect Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 229940099217 desferal Drugs 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 235000020188 drinking water Nutrition 0.000 description 1
- 238000009510 drug design Methods 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 101150012763 endA gene Proteins 0.000 description 1
- 230000006862 enzymatic digestion Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 1
- 235000020774 essential nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 229960004887 ferric hydroxide Drugs 0.000 description 1
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 1
- 108060003196 globin Proteins 0.000 description 1
- 101150013736 gyrB gene Proteins 0.000 description 1
- 235000009424 haa Nutrition 0.000 description 1
- 229940047650 haemophilus influenzae Drugs 0.000 description 1
- 108010071602 haptoglobin-hemoglobin complex Proteins 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150085823 hsdR gene Proteins 0.000 description 1
- 102000050459 human LTF Human genes 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 230000000951 immunodiffusion Effects 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 230000001759 immunoprophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 150000007529 inorganic bases Chemical class 0.000 description 1
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 1
- 150000002506 iron compounds Chemical class 0.000 description 1
- IEECXTSVVFWGSE-UHFFFAOYSA-M iron(3+);oxygen(2-);hydroxide Chemical compound [OH-].[O-2].[Fe+3] IEECXTSVVFWGSE-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- NPFOYSMITVOQOS-UHFFFAOYSA-K iron(III) citrate Chemical compound [Fe+3].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NPFOYSMITVOQOS-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- JJWLVOIRVHMVIS-UHFFFAOYSA-N isopropylamine Chemical compound CC(C)N JJWLVOIRVHMVIS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 238000007834 ligase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 210000002751 lymph Anatomy 0.000 description 1
- ZLNQQNXFFQJAID-UHFFFAOYSA-L magnesium carbonate Chemical compound [Mg+2].[O-]C([O-])=O ZLNQQNXFFQJAID-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000001095 magnesium carbonate Substances 0.000 description 1
- 229910000021 magnesium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019359 magnesium stearate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 150000007522 mineralic acids Chemical class 0.000 description 1
- 229960004023 minocycline Drugs 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 210000000214 mouth Anatomy 0.000 description 1
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 1
- 210000003097 mucus Anatomy 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 230000035781 nonspecific defense system Effects 0.000 description 1
- 235000021231 nutrient uptake Nutrition 0.000 description 1
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- 150000007530 organic bases Chemical class 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- LSQZJLSUYDQPKJ-UHFFFAOYSA-N p-Hydroxyampicillin Natural products O=C1N2C(C(O)=O)C(C)(C)SC2C1NC(=O)C(N)C1=CC=C(O)C=C1 LSQZJLSUYDQPKJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150012629 parE gene Proteins 0.000 description 1
- 230000008807 pathological lesion Effects 0.000 description 1
- 229950009506 penicillinase Drugs 0.000 description 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- 210000003800 pharynx Anatomy 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006187 pill Substances 0.000 description 1
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 1
- 229920002492 poly(sulfone) Polymers 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229920001515 polyalkylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 1
- 238000009117 preventive therapy Methods 0.000 description 1
- MFDFERRIHVXMIY-UHFFFAOYSA-N procaine Chemical compound CCN(CC)CCOC(=O)C1=CC=C(N)C=C1 MFDFERRIHVXMIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004919 procaine Drugs 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 1
- NQLVQOSNDJXLKG-UHFFFAOYSA-N prosulfocarb Chemical compound CCCN(CCC)C(=O)SCC1=CC=CC=C1 NQLVQOSNDJXLKG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 1
- XNSAINXGIQZQOO-SRVKXCTJSA-N protirelin Chemical compound NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H]1NC(=O)CC1)CC1=CN=CN1 XNSAINXGIQZQOO-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 1
- 238000011158 quantitative evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000011552 rat model Methods 0.000 description 1
- 101150079601 recA gene Proteins 0.000 description 1
- 239000000018 receptor agonist Substances 0.000 description 1
- 229940044601 receptor agonist Drugs 0.000 description 1
- 238000001525 receptor binding assay Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 238000009877 rendering Methods 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 1
- 101150085857 rpo2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150090202 rpoB gene Proteins 0.000 description 1
- CVHZOJJKTDOEJC-UHFFFAOYSA-N saccharin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)NS(=O)(=O)C2=C1 CVHZOJJKTDOEJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 108010089727 siderophore receptors Proteins 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 229960000268 spectinomycin Drugs 0.000 description 1
- UNFWWIHTNXNPBV-WXKVUWSESA-N spectinomycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](NC)[C@@H](O)[C@H]([C@@H]([C@H]1O1)O)NC)[C@]2(O)[C@H]1O[C@H](C)CC2=O UNFWWIHTNXNPBV-WXKVUWSESA-N 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 238000010189 synthetic method Methods 0.000 description 1
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 229960004989 tetracycline hydrochloride Drugs 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 231100000041 toxicology testing Toxicity 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 1
- 208000030218 transient fever Diseases 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 150000003626 triacylglycerols Chemical class 0.000 description 1
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 1
- UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N triphosphoric acid Chemical compound OP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010087967 type I signal peptidase Proteins 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 210000000626 ureter Anatomy 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 229940118696 vibrio cholerae Drugs 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000002132 β-lactam antibiotic Substances 0.000 description 1
- 229940124586 β-lactam antibiotics Drugs 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/22—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Neisseriaceae (F)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/82—Proteins from microorganisms
- Y10S530/825—Bacteria
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Oncology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
Neisseria-eredetű hemoglobin-receptorok
A találmány tárgyát bizonyos baktérium fajokból, elsősorban a Neisseria baktérium fajaiból származó hemoglobinreceptor-gének és az ezekben kódolt fehérjék képezik. A találmány tárgyát közelebbről olyan hemoglobinreceptor-gének, polipeptidek és peptidek képezik, amelyek felhasználhatóak vakcina és antitest előállításra a Neisseria ellen, valamint eljárások és módszerek ezen peptidek és polipeptidek in vitro előállítására.
A találmány tárgyát képezik továbbá diagnosztikai és terápiás eljárások és reagensek is, melyek felhasználhatóak Neisseria fertőzés felismerésében és kezelésében, valamint módszerek új és hatásos anti-Neisseria hatóanyagok kidolgozására .
A találmány szerinti megoldás előnyösen alkalmazható
Neisseria-eredetű fertőzések kimutatására és kezelésére.
A jelen szabdalmi bejelentés állami támogatás, a
National Institute of Health által biztosított R01
AI32493 és R01 AI22933 pályázatokra kapott anyagiak segítségével készült. Ennek megfelelően az USA Kormánya igényt tarthat bizonyos jogokra jelen találmánnyal kapcsolatban.
A Neisseria baktérium nemzetségben két Gram-negatív, emberekben patogén gennykeltő kokkusz található: Neisseria
Aktaszámunk: 85607-9223/PÁ meningitidis és Neisseria gonorrhoeae. A N. meningitidis az egyik fő oka a bakteriális agyhártyagyulladásnak emberek között, különösen a gyerekeknél. A betegség jellemzően terjed a baktériumnak a tünetmentes garatba való bejutásától a vérpályák és a gerincvelői folyadék inváziójáig arra fogékony egyénekben.
Neisseria meningitidis az egyik fő oka a bakteriális agyhártyagyulladásnak a gyerekek és egészséges felnőttek között szerte a világban. A betegség súlyosságára jellemző, hogy a meningokokkusz képes egyébként egészséges egyének halálát okozni 24 órán belül. A N. meningitidis polizaharid kapszuláját alkotó antigén jellegű poliszaharid molekulák változatossága miatt tíz különböző szerocsoportot különböztetünk meg. Ezek közül az A csoportba tartozó törzsek a klasszikus járványkeltők, a B és C csoportok általában endemikus törzsek, de a C csoportba tartozók néha járványkitörést okoznak. Az összes ismert A csoportba tartozó törzs külső membránján ugyanazok a fehérje antigének vannak, míg a B csoport törzseinek egy tucat szerotípusa vagy a külső membránon elhelyezkedő főbb fehérje antigének szerinti csoportosítása ismert (ellentétben a poliszaharidokkal).
Egy olyan patogén, mint a N. meningitidis túlélése a gazdaszervezetben attól a képességétől függ, hogy felül tud-e kerekedni a gazdaszervezet lépcsőzetes védelmi rendszerén. Az egyik nemspecifikus védelmi rendszer a mikrobiális behatolók ellen a vas elérhetőségének korlátozása a szövetekben [Weinberg: Physiological. Rév. 64, 65 (1984)] , mert a vas létfontosságú tápanyag a legtöbb • · · ···· ·· · · · mikrobiális patogén számára. A vas túlnyomó többsége egy felnőtt emberben sejten belül található hemoglobin (76%) vagy ferritin (23%) formában. A maradék megtalálható a sejten kívül a gazdaszervezet vaskötő fehérjéihez, mint például a transzferrinhez és a laktoferrinhez kapcsolódva, [ Ottó és mtsai.: Crit. Rév. Microbiol. 18, 217 (1992)] .
A patogén baktériumok ehhez a vas-korlátozó környezethez nagymértékben specifikus és hatásos vasfeldolgozó rendszerek kifejlesztésével alkalmazkodtak. Ezen baktériumok között nagy számban találunk olyanokat, melyek sziderofórokat, kis, nem-fehérje vas kelátorokat választanak ki amelyek a nagy vas(III) affinitásuk következtében összegyűjtik a környezetükben elenyésző koncentrációban jelenlevő vasat(III), és visszaszállítják a vasat a baktérium sejthez [Baggs és Neilands: Microbiol. Rév. 51, 509 (1987); Braun és Hantke: Handbook of Microbial írón Chelates, 107 (1991)] ·
Ezzel szemben más patogén baktériumok mint a Neisseriae fajok [ Archilbald és DeVoe: FEMS Microbiol.
Lett. 6, 159 (1979); Mickelson és mtsai.: Infect. Immun.
35, 915 (1982); Dyer és mtsai.: Infect. Immun. 55, 2171 (1987)], Haemophilus influenzáé [ Coulton és Pang: Curr. Microbiol. 9, 93 (1983); Schryvers: Mól. Microbiol. 2, 461 (1988); Jarosik és mtsai.: Infect. Immun. 62, 2470 (1994)], Vibrio cholerae [ Stoebner és Payne: Infect. Immun. 5 6, 2891 (1988); Henderson és Payne: J. Bacteriol. 176, 3269 (1994)] , Yersiniae [ Stojiljkovic és Hantke: EMBO J. 11 4359 (1992)] és Actinobacillus pleuropneumoniae [ Gerlach és • · · mtsai.: Infect. Immun. 60, 3253 (1992)] még kifinomultabb módszereket fejlesztettek ki, hogy vasat vonjanak el a gazdaszervezettől. Ezek a patogének képesek megkötni a gazdaszervezet vaskötő fehérjéit, mint a laktoferrint, transzferrint és a hemet tartalmazó egyéb vegyületeket, és ezeket használják fel, mint a vas egyedüli forrását.
A vas fontosságát a N. meningitidis fertőzőképességében állati modell rendszeren, egereken végrehajtott in vivő kísérletekben mutatták be [Calver és mtsai.:
Can. J. Microbiol. 22, 832 (1976); Holbien és mtsai.:
Infect. Immun. 34, 120 (1981)] . A Neisseriae speciális vasszabályozott külső membrán receptorairól kimutatták, hogy részt vesznek a laktoferrin- és transzferrin-vas megkötésében és felhasználásában [ Schryvers és Morris: Infect. Immun. 56, 1144 (1988) és Mól. Microbiol. 2, 281 (1988);
Legrain és mtsai.: Gene 130, 81 (1993); Pettersson és mtsai.: Infect. Immun. 61, 4724 (1993) és J. Bacteriol.
176, 1764 (1994)] . Ezen receptorok aminosav szekvenciája és így nagy valószínűséggel a vasfelvétel mechanizmusa sok hasonlóságot mutat más Gram-negatív baktériumok sziderofór és B12 vitamin receptoraival [Cornelissen és mtsai.: J.
Bacteriol. 174, 5788 (1993)] . Ezzel szemben, a mechanizmus, amivel a Neisseriae felhasználja a hemoglobin- és heminvasat, valamint az ebben résztvevő komponensek még nem ismertek.
Nemrég több hemoglobin-kötő és/vagy hemin-kötő aktivitású fehérjét azonosítottak vas-korlátozott N. meningitidis és N. gonorrhoeae teljes membrán frakciójában.
• · «
Lee és Hill számolt be a N. meningitidis izolált külső membránjaiban megfigyelhető specifikus hemoglobin kötésről [Lee és Hill: J. gén. Microbiol. 138 2647 (1992)] .
Martek és Lee közölte, hogy a N. meningitidis hem vas felvételéhez nem szükségesek meningokokkusz eredetű transzferrin-kötő fehérjék [Martek és Lee: Infect. Immun.
700 (1994)] .
Lee irta le a N. meningitidis-ből származó hemin-kötő fehérjék biokémiai izolálását és jellemzését [Lee: Microbiol. 140 1473 (1994)] .
A pontos szerepe ezeknek a fehérjéknek a hemin és/vagy hemoglobin felhasználásában egyenlőre még nem tisztázott, de valószínűleg ezek a fehérjék a N. meningitidis heminfelhasználó rendszerének a részei.
A Neisseria szaporodásának függése a gazdaszervezet vastartalékaitól egy potenciálisan kiaknázható út lehet új és hatásos terápiás beavatkozási stratégiák kifejlesztéséhez. A múltban mind a N. meningitidis és N. gonorrhoeae fertőzéseket kemoprofilaktikusan szulfonamid gyógyszerekkel kezelték. Azonban a szulfonamid-rezisztens törzsek kialakulásával szükségessé vált más kezelési módok alkalmazása, mint például az antibiotikumos kezelés. Legújabban a választott gyógyszeres kezelés magában foglalja a nagytisztaságú penicillin adagolását. Azonban a antimikrobiális kezelés eredményessége csökken, ha a terápiát nem röviddel a fertőzés után kezdik meg.
Gonokokkusz fertőzés kezelésére szintén használtak penicillint, ampicillint vagy amoxicillint, tetraciklin• · hidrokloridot és spectinomicint. A penicillináz termelő baktériumoknak betudhatóan a fertőzések előfordulása emelkedett, és így sajnálatosan több új, drágább β-laktám antibiotikumot használtak a kezelésekben. Annak ellenére, hogy a jelenlegi antibiotikumok csökkentették a gonorrea súlyos következményeit, használatuk nem csökkentette a fertőzések előfordulását a népesség széles körében.
A meningokokkusz okozta betegség kivédésére kémiai- és immun-profilaktikus kezeléssel próbálkoznak. Jelenleg rifampin és minociklin van használatban, de csak a fertőzött személlyel szoros kapcsolatban álló embereknél, mert ennek a kezelésnek számos hátránya ismert. A meningokokkusz okozta agyhártyagyulladás elleni egyetlen kereskedelemben hozzáférhető vakcina fő komponense a baktérium poliszaharid burka. Ez a vakcina védelmet nyújt az A, C, Y és W135 szerocsoportok ellen felnőttekben. Hatástalan a Bszerocsoport ellen és gyermekekben a C szerocsoport ellen is. N. gonorrhoeae ellen mindmostanáig nem volt hozzáférhető immunológiai megelőző kezelés.
Szükségünk van tehát jobb megelőző terápiákra a meningokokkusz okozta agyhártyagyulladás és a gonorrea kezelésében, amely magába foglalja a hatásosabb, hosszabban ható vakcinákat amelyek védelmet nyújtanak a N. meningitidis összes szerocsoportja ellen és a N. gonorrhoeae összes szerotípusa ellen. Továbbá jobb módszerekre van szükségünk a menígokokkuszos és a gonokokkuszos fertőzések kezelésére.
·· • ·
A jelen találmány tárgyát bakteriális hemoglobinreceptor fehérjéket kódoló gének klónozása, expressziója és funkcionális jellemzése képezik. Speciálisan a találmány a Neisseria fajokból, különösen Neisseria meningitidis és N. gonorrhoeae törzsekből származó hemoglobin-receptor fehérjéket kódoló génekre vonatkozik. A találmány tárgyát képezik olyan nukleinsav féleségek, amelyek nukleotid szekvenciája újszerű bakteriális hemoglobin-receptor fehérjéket kódol. A találmány tárgyát képezik továbbá az ezekből a bakteriális génekből levezetett, rokonszerkezetű hemoglobin-receptor fehérjék aminosav szekvenciái is.
A találmány tárgyát képezik olyan nukleinsavak, nukleinsav hibridizációs próbák, rekombináns expressziós konstrukciók melyek képesek expresszálni a találmány szerinti hemoglobin-receptor fehérjét transzformált sejtek, előnyösen baktérium sejtek tenyészetében, valamint azok a transzformáit sejt tenyészetek, amelyek a találmány szerinti hemoglobin-receptor fehérjéket expresszálják. A találmány tárgyát képezik továbbá olyan gén kikapcsoló (knockout) vektorok, amelyek sejtekben, különösen a Neisseria faj sejtjeiben, a hemoglobinreceptor-gén inaktiválásához vezetnek például homológ rekombináción és más mechanizmusokon keresztül. A találmány tárgyát képezik továbbá az ilyen hemoglobin-receptor fehérjében hiányos mutáns sejtek tenyészetei is.
A találmány tárgyát képezik még a találmány szerinti bakteriális hemoglobin-receptor fehérjék homogén preparátumai, valamint antitestek a hemoglobin-receptor fehérje el• · len és ezen fehérje epitópjai. A találmány tárgyát képezik módszerek és eljárások ezen receptor fehérje jellemzésére, valamint módszerek és eljárások a receptorral kapcsolatba hozható, farmakoiógiai célra felhasználható hatóanyagok kifejlesztéséhez, különös tekintettel a baktericid és bakteriosztatikus felhasználásokra.
A találmány további megvalósítási módjait jelentik olyan diagnosztikai módszereket és reagenseket, melyek a találmány szerinti hemoglobin-receptor fehérje Neisseria ellenes antitesteinek felhasználásán alapulnak. A találmány további itt ismertetett megvalósítási módjai olyan terápiás módszerek és reagensek, amelyek a találmány szerinti hemoglobin-receptor fehérje Neisseria ellenes antitesteinek használatán alapulnak. A találmány további megvalósítási módjai olyan diagnosztikai módszerek és reagensek, amelyek a találmány szerinti Neisseria hemoglobin-receptor fehérjét kódoló nukleinsavak, mint érzékeny próbák használatán alapulnak, és alkalmasak a Neisseria fertőzés kimutatására nukleinsav hibridizációs technikák és/vagy in vitro amplifikációs módszerek használatával. A találmány egy még további megvalósítási módja magába foglalja azokat a terápiás módszereket és reagenseket, melyek a találmány szerinti Neisseria hemoglobin-receptor fehérjét kódoló nukleinsavak használatán alapulnak, beleértve az úgy megszerkesztett rekombináns expressziós konstrukciókat amelyek a Neisseria hemoglobinreceptor-gén vagy annak fragmensei értelmetlen átírását eredményezi, továbbá beleértve a találmány szerinti rekombináns kikapcsoló vektorokat. A találmány tárgya továbbá a Neisseria hemoglobin-receptor fehérje és ennek epitópjai felhasználása mint vakcinák alkotórészei, melyeket betegséghez nem kapcsolódó immunitás kialakítására felhasználható a Neisseria fajba tartozó baktériumok által kiváltott fertőzés ellen.
Első megközelítésben, a találmány tárgya egy olyan nukleinsav, melynek nukleotid szekvenciája egy bakteriális hemoglobin-receptor fehérje gént kódol. A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, a bakteriális hemoglobinreceptor-gént a Neisseria fajba tartozó baktériumokból izoláljuk. A találmány egy különösen előnyös megvalósítási módja szerint a hemoglobin-receptor fehérje gént Neisseria meningitidis C szerotípusából izoláljuk. Ennek a megvalósításnak egy speciális példájában a nukleinsav a N. meningitidis genomi DNS-ének egy 3,3 kilobázis (kb) nagyságú BamHI/HindlII fragmensét jelenti. Ebben a megvalósításban, a nukleotid szekvencia a N. meningitidis genomi DNSének 2376 nukleotidból álló nyílt leolvasási fázisa, 792 aminosavat kódolva, amely tartalmazza a hemoglobinreceptorgént. A találmány ezen megvalósítási módja szerint a N. meningitidis hemoglobinreceptor-génjének nukleotid szekvenciája a 2. ábrán bemutatott szekvencia (SEQ ID No:l). Egyértelmű, hogy az itt közölt N. meningitidis gén a szükséges mértékben az általa kódolt fehérje aminosav szekvenciájával jellemezhető. A fentnevezett aminosav szekvenciát a 2. ábrán mutatjuk be (szekv. az. sz.: 2). Az is egyértelmű, hogy a 2. ábrán bemutatott nukleotid szekvencia (szekv. az. sz.:
1) csak egy a hemoglobin-receptor fehérjét kódoló ekviva10 ·· ·· · ·· • · · · · • ··· ·· ··· • · ······ · ··«· ·· · · lens nukleotid szekvenciák közül a genetikai kód degeneráltsága következtében. Az összes ilyen eltérő, ekvivalens nukleotid szekvencia kifejezetten beleértendő a találmány szerinti, itt közölt nukleotid szekvenciába. A találmány tárgyát képezi még ennek a nukleotid szekvenciának bármely mutáns vagy alléi változata, legyenek természetes eredetűek vagy in vitro kémiai vagy genetikai módosítás eredményei. Kijelenthetjük, hogy minden ilyen variáns alapvetően ugyanazzal a nukleotid szekvenciával rendelkezik, mint a megfelelő N. meningitidis hemoglobin-receptor fehérje itt közölt nukleotid szekvenciája.
A találmány ezen megközelítésének egy másik különösen előnyös megvalósítási módja szerint a hemoglobin-receptor fehérje gént a Neisseria meningitidis A-szerocsoportjából izoláljuk. Ennek a megvalósításnak egy speciális példájában a nukleinsav a N. meningitidis A-szerocsoportja genomi DNSének egy 2373 bázispár nagyságú polimeráz láncreakció amplifikált (PCR) fragmensét jelenti. A találmány e megvalósítási módja szerint a nukleotid szekvencia a N. meningitidis genomi DNS-ének 2373 nukleotidból álló nyílt leolvasási fázisa, 790 aminosavat kódolva, amely tartalmazza a hemoglobinreceptor-gént. A találmány ezen megvalósítása szerint a N. meningitidis hemoglobinreceptor-génjének nukleotid szekvenciája a 7. ábrán bemutatott szekvencia (SEQ ID No: 3) . Egyértelmű, hogy az itt közölt N. meningitidis gén a szükséges mértékben az általa kódolt fehérje aminosav szekvenciájával jellemezhető. A fentnevezett aminosav szekvenciát a 7. ábrán mutatjuk be (szekv. az.
sz.: 4). Az is egyértelmű, hogy a 7. ábrán bemutatott nukleotid szekvencia (szekv. az. sz.: 3) csak egy a hemoglobin-receptor fehérjét kódoló ekvivalens nukleotid szekvenciák közül a genetikai kód degeneráltsága következtében. Az összes ilyen eltérő, ekvivalens nukleotid szekvencia kifejezetten beleértendő a találmány szerinti, itt közölt nukleotid szekvenciába. A találmány tárgyát képezi még ennek a nukleotid szekvenciának bármely mutáns vagy alléi változata, legyenek természetes eredetűek vagy in vitro kémiai vagy genetikai módosítás eredményei. Kijelenthetjük, hogy minden ilyen variáns alapvetően ugyanazzal a nukleotid szekvenciával rendelkezik, mint a megfelelő N. meningitidis hemoglobin-receptor fehérje itt közölt nukleotid szekvenciája.
A találmány ezen megközelítésének egy másik különösen előnyös megvalósítási módja szerint a hemoglobin-receptor fehérje gént a Neisseria meningitidis B-szerocsoportjából izoláljuk. Ennek a megvalósításnak egy speciális példájában a nukleinsav a N. meningitidis A-szerocsoportja genomi DNSének egy 2376 bázispár nagyságú polimeráz láncreakció amplifikált (PCR) fragmensét jelenti. Ebben a megvalósításban, a nukleotid szekvencia a N. meningitidis genomi DNSének 2373 nukleotidból álló nyílt leolvasási fázisa, 791 aminosavat kódolva, amely tartalmazza a hemoglobinreceptorgént. A találmány ezen megvalósítása szerint a N. meningitidis hemoglobinreceptor-génjének nukleotid szekvenciája a 8. ábrán bemutatott szekvencia (SEQ ID No:5). Egyértelmű, hogy az itt közölt N. meningitidis gén a szükséges • · mértékben az általa kódolt fehérje aminosav szekvenciájával jellemezhető. A fentnevezett aminosav szekvenciát a 8. ábrán mutatjuk be (szekv. az. sz.: 6). Az is egyértelmű, hogy a 8. ábrán bemutatott nukleotid szekvencia (szekv. az. sz.:
5) csak egy a hemoglobin-receptor fehérjét kódoló ekvivalens nukleotid szekvenciák közül a genetikai kód degeneráltsága következtében. Az összes ilyen eltérő, ekvivalens nukleotid szekvencia kifejezetten beleértendő a találmány szerinti, itt közölt nukleotid szekvenciába. A találmány tárgyát képezi még ennek a nukleotid szekvenciának bármely mutáns vagy alléi változata, legyenek természetes eredetűek vagy in vitro kémiai vagy genetikai módosítás eredményei. Kijelenthetjük, hogy minden ilyen variáns alapvetően ugyanazzal a nukleotid szekvenciával rendelkezik, mint a megfelelő N. meningitidis hemoglobin-receptor fehérje itt közölt nukleotid szekvenciája.
A találmány egy másik előnyös megvalósítási módja szerint a hemoglobin-receptor fehérje gént a Neisseria gonorrhoea-ból izoláljuk. Ennek a megvalósításnak egy speciális példájában a nukleinsav a N. gonorrhoea genomi DNS-ének egy 2378 bázispár nagyságú polimeráz láncreakció amplifikált (PCR) fragmensét jelenti. Ebben a megvalósításban, a nukleotid szekvencia a N. gonorrhoea genomi DNS-ének 2373 nukleotidból álló nyílt leolvasási fázisa, 791 aminosavat kódolva, amely tartalmazza a hemoglobinreceptor-gént. A találmány ezen megvalósítása szerint a N. gonorrhoea hemoglobinreceptor-génjének nukleotid szekvenciája a 9. ábrán bemutatott szekvencia (SEQ ID No:7). Egyértelmű, hogy az itt közölt N. gonorrhoea gén a szükséges mértékben az általa kódolt fehérje aminosav szekvenciájával jellemezhető. A fentnevezett aminosav szekvenciát a 9. ábrán mutatjuk be (szekv. az. sz.: 8). Az is egyértelmű, hogy a 9. ábrán bemutatott nukleotid szekvencia (szekv. az. sz.: 7) csak egy a hemoglobin-receptor fehérjét kódoló ekvivalens nukleotid szekvenciák közül a genetikai kód degeneráltsága következtében. Az összes ilyen eltérő, ekvivalens nukleotid szekvencia kifejezetten beleértendő a találmány szerinti, itt közölt nukleotid szekvenciába. A találmány tárgyát képezi még ennek a nukleotid szekvenciának bármely mutáns vagy alléi változata, legyenek természetes eredetűek vagy in vitro kémiai vagy genetikai módosítás eredményei. Kijelenthetjük, hogy minden ilyen variáns alapvetően ugyanazzal a nukleotid szekvenciával rendelkezik, mint a megfelelő N. gonorrhoea hemoglobin-receptor fehérje itt közölt nukleotid szekvenciája.
A találmány tárgyát képezik továbbá a bakteriális hemoglobin-receptor fehérjék is. A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint a bakteriális hemoglobin-receptor fehérjét a Neisseria fajhoz tartozó baktériumokból izoláljuk. A találmány egy különösen előnyös megvalósítási módja szerint a hemoglobin-receptor fehérjét Neisseria meningitidis-ből izoláljuk. Ennek a megvalósításnak egy speciális példájában a fehérje a N. meningitidis C szerocsoportjából származik, és 792 aminosavból álló aminosav szekvenciával rendelkezik. A találmány ezen megvalósítása szerint a N. meningitidis C szerocsoportjának hemoglo14 ···· bin-receptor fehérjéjének aminosav szekvenciája a 2. ábrán bemutatott szekvencia (SEQ ID No:2). Ennek a megvalósításnak egy másik példájában a fehérje a N. meningitidis Aszerocsoportjából származik, és 790 aminosavból álló aminosav szekvenciával rendelkezik. A találmány ezen megvalósítása szerint a N. meningitidis A-szerocsoportjának hemoglobin-receptor fehérjéjének aminosav szekvenciája a 7. ábrán bemutatott szekvencia (SEQ ID No:4) . Ennek a megvalósításnak egy további példájában a fehérje a N. meningitidis Bszerocsoportjából származik, és 791 aminosavból álló aminosav szekvenciával rendelkezik. A találmány ezen megvalósítása szerint a N. meningitidis B-szerocsoportjának hemoglobin-receptor fehérjéjének aminosav szekvenciája a 8. ábrán bemutatott szekvencia (SEQ ID No:6) . A találmány tárgyát képezi még a N. gonorrhoea-ból származó hemoglobin-receptor fehérje is. A találmány egy megvalósítása szerint a fehérje
791 aminosavból álló aminosav szekvenciával rendelkezik és a N. gonorrhoea hemoglobin-receptor fehérjéjének aminosav szekvenciája a 9. ábrán bemutatott szekvencia (SEQ ID No:8). Kifejezetten a találmány tárgyát képezik a rokonszerkezetű bakteriális hemoglobin-receptor fehérjék is, különösen a Neisseria fajokból izolált ilyen típusú fehérjék, melyeknek alapvetően azonos aminosav szekvenciájuk van és lényegében véve azonos biológiai tulajdonságokkal rendelkeznek mint a bemutatott N. meningitidis és N. gonorrhoeae nukleotid szekvenciák által kódolt hemoglobin-receptor fehérjék.
·· ·* · ·* · • « · · · · * « ·#« 9 · ··· * · 999999 9 9 ···· ·· · * ··
Egy másik megközelítésben a találmány tárgyát képezi a körülbelül 85,5 kiloDalton (kD) nagyságú bakteriális hemoglobin-receptor fehérjének vagy származékának homogén preparátuma, amely méretet, mint a fehérje bármely poszttranszlációs módosulása előtti méretet értelmezzük. Szintén a találmány tárgyát képezi a receptor egy, redukáló körülmények között nátrium dodecil szulfát/poliakrilamid gél elektroforézissel 90 kD méretűnek adódó megvalósulása. A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, a bakteriális hemoglobin-receptor fehérjét a Neisseria fajokhoz tartozó baktériumokból izoláljuk. A találmány egy különösen előnyös megvalósítási módja szerint a hemoglobin-receptor fehérjét Neisseria meningitidis-ből izoláljuk. A találmány ezen megközelítésének egy megvalósítási módja szerint a fehérjét a N. meningitidis C szerotípusából izoláljuk, és a bakteriális hemoglobin-receptor fehérje vagy származékának aminosav szekvenciája előnyösen megegyezik a 2. ábrán bemutatott hemoglobin-receptor fehérje aminosav szekvenciájával (SEQ ID No:2). A találmány ezen megközelítésének egy másik megvalósítási módja szerint a fehérjét a N. meningitidis A szerotípusából izoláljuk, és a bakteriális hemoglobinreceptor fehérje vagy származékának aminosav szekvenciája előnyösen megegyezik a 7. ábrán bemutatott hemoglobinreceptor fehérje aminosav szekvenciájával (SEQ ID No:4). A találmány ezen megközelítésének egy harmadik megvalósítási módja szerint a fehérjét a N. meningitidis B szerotípusából izoláljuk, és a bakteriális hemoglobin-receptor fehérje, vagy származékának aminosav szekvenciája előnyösen megegye16 • » · • · · · • · · ···« ·· zik a 8. ábrán bemutatott hemoglobin-receptor fehérje aminosav szekvenciájával (SEQ ID No:6). A találmány tárgyát képezi továbbá N. gonorrhoea-ból izolált bakteriális hemoglobin-receptor fehérje homogén preparátuma is. A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint a bakteriális hemoglobin-receptor fehérje, vagy származékának aminosav szekvenciája előnyösen megegyezik a 9. ábrán bemutatott hemoglobin-receptor fehérje aminosav szekvenciájával (SEQ ID No:8).
A találmány tárgyát képezik még nukleotid próbák is, amelyeket az itt közölt nukleotid szekvenciákból származtathatunk. A találmány tárgyát képezik a komplementer DNSből, (cDNS) a bakteriális hírvivő RNS (mRNS) másolataiból, vagy a bakteriális genomi DNS-ből (gDNS) izolált próbák is , éppúgy, mint az itt közölt szekvencia információ felhasználásával szintetikusan, vagy in vitro amplifikációs technikákkal előállított próbák. A találmány tárgya kifejezetten vonatkozik de nem korlátozódik oligonukleotid, nicktranslated, random prímed vagy in vitro amplifikált próbákra amelyeket a találmány tárgyát képező cDNS vagy genomi kiónok felhasználásával állítunk elő, valamint vonatkozik olyan oligonukleotid és más szintetikus próbákra amelyeket a találmány tárgyát képező cDNS vagy genomi kiónok nukleinsav szekvencia információja alapján kémiai szintézissel állítunk elő.
A találmány tárgyát képezik továbbá az ilyen nukleinsav hibridizációs próbák előállítása a Neisseria fajhoz, különösen a N. meningitidis és N. gonorrhoea fajokhoz tar17 ·»>» «υ* · « ··» • 9 999· Λ 9
9 9 9 tozó baktériumo kimutatására biológiai mintákból, emberek Neisseria fertőzésének diagnosztizálása során. A fentnevezett biológiai minta előnyösen magába foglalja a vért és vizeletet, továbbá az ondót, nyálkát, gerincvelői folyadékot, a hashártyai és a hasűri folyadékokat, valamint a sejteket tartalmazó keneteket a száj, húgyvezeték, végbélnyílás, végbél epitéliumából, és más szervekből.
Továbbá a jelen találmány tárgyát képezik olyan peptidek, amelyeket a találmány szerinti nukleinsav szekvenciák kódolnak. A találmány tárgyát képezik a hemoglobinreceptor fehérjére specifikus antitestek előállításánál antigénként felhasználható természetes vagy szintetikus peptidek is. A találmány tárgyát képezik még az ilyen antitestek, előnyösen momoklonális antitestek, és az ezen antitesteket előállító sejtek és sejtkultúrák is.
Ily módon a találmány tárgyát képezik a találmány szerinti bakteriális hemoglobin-receptor fehérjék elleni antitestek, valamint a receptor fehérjék epitópjai is. A jelen találmány tárgyát képezik olyan antitestek, amelyek immunológiailag reagálnak a találmány szerinti bakteriális hemoglobin-receptor fehérjékkel. A találmány egy speciális tárgyát képezik a találmány szerinti bakteriális hemoglobinreceptor fehérjék elleni monoklonális antitestek. A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint a találmány szerinti antitesteket a Neisseria fajokból izolált hemoglobin-receptor fehérje ellen termeljük. A találmány egy különösen előnyös megvalósítási módja szerint fentnevezett antitestek specifikusak a Neisseria meningitidis A, B, vagy C szerotípusaiból izolált hemoglobin-receptor fehérjére. A találmány egy további különösen előnyös megvalósítási módja szerint fentnevezett antitestek specifikusak a Neisseria gonorrhoeaea-ból izolált hemoglobin-receptor fehérjére.
A találmány tárgyát képezik továbbá a fentnevezett antitesteket termelő hibridóma sejtvonalak is. Elképzelés szerint a találmány szerinti hibridóma sejtvonalak fúzióval állíthatóak elő egy immunoglobulint nem termelő egér mielóma sejtvonalból és lépsejtekből, amely lépsejteket tisztított hemoglobin-receptor fehérjével, vagy a találmány szerinti bakteriális hemoglobin-receptor epitópjaival illetve antigént kifejező sejttel immunizált egérből nyerünk. A jelen találmány tárgyát képezik továbbá a fentnevezett antitesteket termelő sejtvonalak, amelyek élő egérbe injektálhatóak és ez úton fenti antitesteket tartalmazó hasűri folyadék nyerhető. A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint a találmány szerinti antitesteket a Neisseria fajokból izolált hemoglobin-receptor fehérje ellen termeljük. A találmány egy különösen előnyös megvalósítási módja szerint fentnevezett antitestek specifikusak a Neisseria meningitidis A, B, vagy C szerotípusaiból izolált hemoglobin-receptor fehérjére. A találmány egy további különösen előnyös megvalósítási módja szerint fentnevezett antitestek specifikusak a Neisseria gonorrhoeaea-ból izolált hemoglobin-receptor fehérjére.
A találmány további tárgyát képezik a találmány szerinti bakteriális hemoglobin-receptor fehérjéknek immunológiailag aktív epitópjai is. A találmány oltalmi körébe be19 leértendők a találmány szerinti bakteriális hemoglobinreceptor fehérjékkel szemben immunológiailag reaktív kiméra antitestek is. A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint a Neisseria fajokból izolált bakteriális hemoglobin-receptor fehérje ellen termeljük a fentemlített antitesteket, illetve ebből a fehérjéből származtatjuk a fent említett epitópokat. A találmány egy különösen előnyös megvalósítási módja szerint az ilyen antitestek és epitópok specifikusak a Neisseria meningitidis A, B, vagy C szerotípusából izolált hemoglobin-receptor fehérjére. A találmány további különösen előnyös megvalósítási módja szerint az ilyen antitestek és epitópok specifikusak a Neisseria gonorrhoeae-ből izolált hemoglobin-receptor fehérjére .
A találmány tárgyát képezik továbbá azok a rekombináns expressziós konstrukciók is amelyek bakteriális hemoglobinreceptor fehérjét kódoló nukleinsavat tartalmaznak, ahol a konstrukció képes a konstrukcióval transzformált sejttenyészetekben a genetikai kód szerinti hemoglobin-receptor fehérjét kifejezni. A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint a fentemlített konstrukciók tartalmazzák a N. meningitidis C szerotípus 2. ábrán bemutatott hemoglobinreceptor-génjét (SEQ ID No.:l), és ezen konstrukciók képesek a konstrukcióval transzformált sejtekben a genetikai kód szerinti bakteriális hemoglobin-receptor fehérjét kifejezni. A találmány egy további előnyös megvalósítási módja szerint a fentemlített konstrukciók tartalmazzák a N. meningitidis A szerotípus 7. ábrán bemutatott hemo• · ··· globinreceptor-génjét (SEQ ID No.:3), és ezen konstrukciók képesek a konstrukcióval transzformált sejtekben a genetikai kód szerinti bakteriális hemoglobin-receptor fehérjét kifejezni. A találmány egy még további előnyös megvalósítási módja szerint a fentemlített konstrukciók tartalmazzák a N. meningitidis B szerotípus 8. ábrán bemutatott hemoglobinreceptor-génjét (SEQ ID No.:5), és ezen konstrukciók képesek a konstrukcióval transzformált sejtekben a genetikai kód szerinti bakteriális hemoglobin-receptor fehérjét kifejezni. A találmány tárgyát képezik még a N. gonorrhoeae-ból izolált hemoglobin-receptor fehérjét kódoló rekombináns expressziós konstrukciók is. A találmány egy különösen előnyös megvalósítási módja szerint a fentemlített konstrukciók tartalmazzák a N. gonorrhoeae 9. ábrán bemutatott hemoglobinreceptor-génjét (SEQ ID No.:7), és ezen konstrukciók képesek a konstrukcióval transzformált sejtekben a genetikai kód szerinti bakteriális hemoglobinreceptor fehérjét kifejezni.
A találmány tárgyát képezik még sejttenyészetek, előnyösen bakteriális sejtekből, amelyeket a találmány szerinti rekombináns expressziós konstrukciókkal transzformáltak, és minden ilyen tenyészet képes kifejezni és ténylegesen is kifejezi a transzformáló konstrukcióban genetikailag kódolt bakteriális hemoglobin-receptor fehérjét.
A találmány tárgyát képezik továbbá a találmány szerinti rekombináns expressziós konstrukciókkal transzformált prokarióta sejtkultúrákból származó prokarióta sejtmembránok fehérje preparátumai, melyek tartalmazzák a találmány • · · · · · szerinti bakteriális hemoglobin-receptor fehérjét.
A találmány tárgyát képezik továbbá még diagnosztikai reagensek és az ezen reagensek felhasználására szolgáló módszerek a Neisseria fajok baktériumai által okozott emberi fertőzés kimutatására. A találmány egy előnyös megvalósítási módjában fentemlített diagnosztikai reagensek a bakteriális hemoglobin-receptor fehérjével immunológiailag reaktív antitesteket tartalmaznak. A találmány egy előnyös megvalósítási módjában ezen antitesteket a Neisseria fajok baktériumaiból izolált hemoglobin-receptor fehérje ellen termeljük. A találmány egy különösen előnyös megvalósítási módjában ezen antitestek specifikusak a Neisseria meningitidis k, B, vagy C szerotípusából izolált hemoglobin-receptor fehérjére. A találmány egy további különösen előnyös megvalósítási módjában ezen antitestek specifikusak a Neisseria gonorrhoeae-ból izolált hemoglobin-receptor fehérjére .
A találmány ezen megközelítésének egy további megvalósítási módja szerint megadjuk a diagnosztikai reagenseket és a módszereket ezen reagensek használatára, ahol a fentnevezett reagensek nukleinsav hibridizációs próbák, amelyek a bakteriális hemoglobinreceptor-gént tartalmazzák. A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, a bakteriális hemoglobinreceptor-gént a Neisseria fajba tartozó baktériumokból izoláljuk. A találmány egy különösen előnyös megvalósítási módja szerint a hemoglobin-receptor fehérje gént Neisseria meningitidis-ból izoláljuk. Ennek a megvalósításnak egy speciális példájában a nukleinsav próbák a N.
• · meningitidis C szerotípusának genomi DNS-ének egy 3,3 kilobázis nagyságú BamHI/HindlII fragmensének specifikusan hibridizáló fragmensét jelentik. Ebben a megvalósításban, a nukleotid szekvencia a N. meningitidis genomi DNS-ének 2376 nukleotidból álló nyílt leolvasási fázisa, 792 aminosavat kódolva, amely tartalmazza a hemoglobinreceptor-gént, vagy ennek specifikusan hibridizáló fragmense. A találmány ezen megvalósítási módja szerint a N. meningitidis C szerotípus hemoglobinreceptor-génjének nukleotid szekvenciája a 2. ábrán bemutatott szekvencia (SEQ ID No:l). Ennek a megvalósításnak egy másik példájában a nukleinsav próbák a N. meningitidis A-szerocsoportja genomi DNS-ének egy 2373 bázispár nagyságú polimeráz láncreakció amplifikált (PCR) fragmensének egy specifikusan hibridizáló fragmensét jelentik. A találmány ezen megvalósítási módja szerint a nukleotid szekvencia a N. meningitidis genomi DNS-ének 2370 nukleotidból álló nyílt leolvasási fázisa, 790 aminosavat kódolva, amely tartalmazza a hemoglobinreceptor-gént, vagy ennek egy specifikusan hibridizáló fragmense. A találmány ezen megvalósítási módja szerint a N. meningitidis A szerocsoporjának hemoglobinreceptor-génjének nukleotid szekvenciája a 7. ábrán bemutatott szekvencia (SEQ ID No: 3) . Ennek a megvalósításnak egy még további példájában a nukleinsav próbák a N, meningitidis B-szerocsoportjának genomi DNS-ének egy 2376 bázispár nagyságú polimeráz láncreakció amplifikált (PCR) fragmensének egy specifikusan hibridizáló fragmensét jelentik. A találmány ezen megvalósítási módja szerint a nukleotid szekvencia a N.
·· ·· · · · · • · · · · · • · · · ·· ··· · • · ······ · · ··· ·· · · ··· meningitidis genomi DNS-ének 2373 nukleotidból álló nyílt leolvasási fázisa, 791 aminosavat kódolva, amely tartalmazza a hemoglobinreceptor-gént, vagy ennek egy specifikusan hibridizáló fragmense. A találmány ezen megvalósítási módja szerint a N. meningitidis B-szerocsoportjának hemoglobinreceptor-génjének nukleotid szekvenciája a 8. ábrán bemutatott szekvencia (SEQ ID No:5). A találmány tárgyát képezik még nukleinsav hibridizációs próbák, melyek a N. gonorrhoeae-'boi izolált bakteriális hemoglobinreceptor-gént tartalmazzák. A találmány ezen megközelítésének egy előnyös megvalósítási módja szerint a nukleinsav próbák a N. gonorrhoea genomi DNS-ének egy 2378 bázispár nagyságú polimeráz láncreakció amplifikált (PCR) fragmensének egy specifikusan hibridizáló fragmensét jelentik. A találmány e megvalósítási módja szerint a nukleotid szekvencia a N. gonorrhoea genomi DNS-ének 2373 nukleotidból álló nyílt leolvasási fázisa, 791 aminosavat kódolva, amely tartalmazza a hemoglobinreceptor-gént, vagy ennek egy specifikusan hibridizáló fragmense. A találmány ezen megvalósítási módja szerint a N. gonorrhoea hemoglobinreceptor-génjének nukleotid szekvenciája a 9. ábrán bemutatott szekvencia (SEQ ID No:7). A technika állása szerint a specifikusan hibridizáló kifejezés ha egy bakteriális hemoglobinreceptor-gént kódoló nukleinsav fragmens jellemzésére használjuk, azt jelenti, hogy ezen fragmens nukleinsav hibridizációja stabilis nagymértékben sztringens hibridizációs és mosási körülmények között; a nagymértékban sztringens kifejezés egyértelmű a molekuláris biológiában járatosak számára.
• · • · · · · ·· • ··· ·· ··· t — 9 ú — ♦·········
A találmány tárgyát képezik még terápiás hatóanyagok és módszerek ezen hatóanyagok használatára a Neisseria fajokhoz tartozó baktériumok által emberekben okozott fertőzés kezelésére. A találmány előnyös megvalósítási módjai szerint ezen hatóanyagok a bakteriális hemoglobin-receptor fehérjével immunológiailag reaktív antitesteket tartalmaznak. A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint ezen antitesteket a Neisseria fajokhoz tartozó baktériumokból izolált bakteriális hemoglobin-receptor fehérje ellen termeljük. A találmány egy különösen előnyös megvalósítási módja szerint ezen antitestek specifikusak a Neisseria meningitidis A, B, vagy C szerotípusából izolált hemoglobin-receptor fehérjére. A találmány további előnyös megvalósítási módjai szerint ezen antitestek specifikusak a Neisseria gonorrhoeae-ból izolált hemoglobin-receptor fehérjére. A találmány ezen megközelítéséhez tartozó terápiás hatóanyagok fentemlített antitesteket egy farmakológiailag elfogadható hordozóban tartalmazzák, a megfelelő adjuvánsokkal és hasonlókkal. A találmány további megvalósítási módjai szerint fentemlített antitestek kovalensen kapcsolódnak egy baktericid vagy bakteriosztatikus hatóanyaghoz, mely hatásos a Neisseria fajokhoz tartozó baktériumok ellen, előnyösen a N. meningitidis és N. gonorrhoeae ellen.
A találmány ezen megközelítésében a találmány tárgyát képezik a találmány szerinti terápiás reagensek és az azokat használó módszerek, ahol a fentemlített reagensek a találmány szerinti rekombináns expressziós konstrukciókat, • « · • « · vagy azok homológjait tartalmazzák, ahol a homológok a hemoglobin-receptort kódoló nukleinsavat antiszensz irányításban fejezik ki. A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, a bakteriális hemoglobinreceptor-gént a Neisseria fajokba tartozó baktériumokból izoláljuk. A találmány egy különösen előnyös megvalósítási módja szerint a hemoglobin-receptor fehérje gént Neisseria meningitidis-ből izoláljuk. Ennek a megvalósításnak egy speciális példájában a nukleinsavak a N. meningitidis C szerotípusának genomi DNS-ének egy 3,3 kilobázis nagyságú BamHI/Hindii! fragmensének egy specifikusan hibridizáló fragmensét jelentik. Ebben a megvalósításban, a nukleotid szekvencia a N. meningitidis genomi DNS-ének 2376 nukleotidból álló nyílt leolvasási fázisa, 792 aminosavat kódolva, amely tartalmazza a hemoglobinreceptor-gént, vagy ennek specifikusan hibridizáló fragmense. A találmány ebben a megvalósításában a N. meningitidis C szerotípus hemoglobinreceptor-génjének nukleotid szekvenciája a 2. ábrán bemutatott szekvencia (SEQ ID No:l). Ennek a megvalósításnak egy másik példájában a nukleinsav próbák a N. meningitidis A szerotípusának genomi DNS-ének egy 2373 bázispár nagyságú polimeráz láncreakció amplifikált (PCR) fragmensének egy specifikusan hibridizáló fragmensét jelentik. A találmány ezen megvalósítása szerint a nukleotid szekvencia a N. meningitidis genomi DNS-ének 2370 nukleotidból álló nyílt leolvasási fázisa, 790 aminosavat kódolva, amely tartalmazza a hemoglobinreceptor-gént, vagy ennek egy specifikusan hibridizáló fragmense. A találmány ezen megvalósítási módja sze26 • · · rint a N. meningitidis A szerotípusának hemoglobinreceptorgénjének nukleotid szekvenciája a 7. ábrán bemutatott szekvencia (SEQ ID No:3). Ennek a megvalósításnak egy még további példájában a nukleinsav próbák a N. meningitidis B szerotípusának genomi DNS-ének egy 2376 bázispár nagyságú polimeráz láncreakció amplifikált (PCR) fragmensének egy specifikusan hibridizáló fragmensét jelentik. A találmány e magvalósítási módja szerint a nukleotid szekvencia a N. meningitidis genomi DNS-ének 2373 nukleotidból álló nyílt leolvasási fázisa, 791 aminosavat kódolva, amely tartalmazza a hemoglobinreceptor-gént, vagy ennek egy specifikusan hibridizáló fragmense. A találmány ezen megvalósítási módja szerint a N. meningitidis B szerotípusának hemoglobinreceptor-génjének nukleotid szekvenciája a 8. ábrán bemutatott szekvencia (SEQ ID No:5). A találmány tárgyát képezik még a találmány szerinti rekombináns expressziós konstrukciók, vagy ezek homológjai melyek a hemoglobin-receptort kódoló nukleinsavat antiszensz irányítottságban fejezik ki, ahol a nukleinsav a N. gonorrhoeae-ból izolált bakteriális hemoglobinreceptor-gént kódolja. A találmány ezen megközelítésének egy előnyös megvalósítási módja szerint a nukleinsav próbák a N. gonorrhoea genomi DNS-ének egy 2378 bázispár nagyságú polimeráz láncreakció amplifikált (PCR) fragmensének egy specifikusan hibridizáló fragmensét jelentik. A találmány e magvalósítási módja szerint a nukleotid szekvencia a N. gonorrhoea genomi DNS-ének 2373 nukleotidból álló nyílt leolvasási fázisa, 791 aminosavat kódolva, amely tartalmazza a hemoglobinreceptor-gént, vagy • · • ··« ·· · ·« • · ······ • · · · ·» · · ennek egy specifikusan hibridizáló fragmense. A találmány ezen megvalósítási módja szerint a N. gonorrhoea hemoglobinreceptor-génjének nukleotid szekvenciája a 9. ábrán bemutatott szekvencia (SEQ ID No:7).
A találmány tárgyát képezi továbbá egy, a találmány szerinti bakteriális hemoglobin-receptor fehérje biokémiai aktivitásának gátlására, segítésére vagy módosítására képes vegyületek szűrővizsgálatára alkalmas módszer is, amely módszer a hemoglobin-receptor fehérjére specifikus új agonista és antagonista vegyületek valamint új baktericid és bakteriosztatikus hatóanyagok in vitro szkrínvizsgálatára felhasználható. A találmány előnyös megvalósítási módjai szerint a találmány szerinti rekombináns expressziós konstrukcióval sejteket transzformálunk és a fentemlített vegyületekkel összehozzuk, és a vegyület kötőképességét értékeljük, úgyszintén a vegyület más, ismert hemoglobin-receptor agonista, mint hemoglobin vagy hemin illetve antagonista kötőképességére való hatását értékeljük. További előnyös megvalósítások módok szerint a fentemlített hatások mennyiségi kiértékelését is elvégezzük .
Szintén a jelen találmány tárgyát képezi felhasználása egy bakteriális hemoglobin-receptor fehérje, előnyösen a Neisseria fajhoz tartozó baktériumból származó fehérje, még előnyösebben a N. meningitidis-ből izolált fehérje, ismert vagy ismeretlen baktericid és/vagy bakteriosztatikus analógjának, agonistája vagy antagonistájának kimutatására, akár a fentnevezett vegyületek természetes előfordulásúak, ·· · · vagy gyógyszerként ismertek.
A találmány tárgyát képezik továbbá a Neisseria fajokhoz tartozó patogén baktériumok által emberben okozott fertőzések elleni immunizálásra alkalmas vakcinák is, amely vakcinák a találmány szerinti hemoglobin kötő fehérjéket, vagy azok antigénként viselkedő fragmenseit tartalmazzák. A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint a találmány szerinti vakcinák a találmány szerinti hemoglobinreceptor kötőfehérjét vagy annak egy antigénként viselkedő fragmensét kifejező sejtet tartalmaznak, előnyösen a fentemlített sejtek az emberben szaporodó sejtek legyengített variációi, t.i. a fentemlített sejtek nem patogének és nem okoznak bactermiát, endotoxémiát vagy szepszist. Az ilyen legyengített sejtvariációk alatt értendők a Salmonella fajok legyengített törzsei, például Salmonella typhi és Salmonella typhimurium, valamint más legyengített baktérium fajok. A találmány tárgyát képezik továbbá a fentiekben közölt rekombináns expressziós konstrukciók amelyek önmagukban is használhatóak vakcinaként, azaz egy állatfajba bevihetőek és az általuk kódolt bakteriális hemoglobinreceptor fehérje antigének ellen immunológiai válasz váltható ki.
A jelen találmány szerinti egyes előnyös megvalósításokat a következőkben részletesebben ismertetett bizonyos előnyös megvalósítási módokon keresztül, és a szabadalmi igénypontokon át tesszük egyértelművé.
A jelen találmány eddig említett és további témái, azok különböző tulajdonságai, és a találmány maga jobban ·· «· · «· · • · · · · · · « ·«· · « ··« · • · ···<«·· · · • · · · ·· · * ··· megérthető a következő leírást kísérő ábrákkal együtt átolvasva, amely ábrák a következőket mutatják be:
Az 1. ábra a N. meningitidis kozmid kiónjának és a 2. példában leírtak szerinti szubklónjainak restrikciós enzim emésztési térképének vázlatos leírása.
A 2. ábra a N. meningitidis hemoglobin-receptor fehérjéjének egy 3,3 kb BamHI/HindlII DNS fragmensen kódolt nukleotid (SEQ ID No.:l) és ebből levezetett aminosav (SEQ ID No.:2) szekvenciáját mutatja be.
A 3. ábra egy festett 10%-os SDS/PAGE elektroforézis gél fényképe, amely a N. meningitidis hemoglobinreceptorgén termék in vitro expressziójának eredményét mutatja be. Az ábrán látható körülbelül 90 kilodalton nagyságú fehérje felel meg a gén termékének; a 30 kilodalton körüli molekulatömegű β-laktamáz fehérje mint standard szerepel.
A 4. ábra a N. meningitidis Tbpl transzferrin receptorának (SEQ ID No.:9), a N. meningitidis LbpA laktoferrin receptorának (SEQ ID No.:10) és a N. meningitidis HmbR hemoglobin-receptorának (SEQ ID No.:2) egyes részeinek aminosav szekvenciáját hasonlítja össze.
Az 5. ábra a N. meningitidis 8013 és az MC8013hmhR mutáns kromoszómális DNS-ének Southern-hibridizációs analízisét ábrázolja. Az analízishez a hmb gén BamHI-Sall fragmensét használtuk próbának, amit DIG nem-radioaktív DNS jelölő és detektáló reagens készlettel jelöltünk meg (Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis, IN) . Az első sáv a N. meningitidis MC8013 törzs DNS Clal-es emésztése; a második sáv az MC8013hmbR DNS Clal-es emésztése; a • · ··« ·· ·· · harmadik sáv az MC8013 DNS emésztése BamHI és Sáli enzimekkel; és a negyedik sáv az MC8013hmbR DNS emésztése BamHI és
Sáli enzimekkel.
A 6. ábra egy grafikon, amely a fertőzés előrehaladását mutatja be N. meningitidis vad típusa (MC8013) és hmbR mutáns törzsek esetén egy in vivő újszülött patkány modellen. Mindegyik törzset intraperitoneálisan injektáltuk (2 x 106 CFU) három újszülött beltenyésztett Lewis patkányba. Az eredmények két hasonlóan végzett kísérlet átlagai.
A 7. ábra a N. meningitidis A szerotípus hemoglobinreceptor fehérjéjének nukleotid (SEQ ID No.:3) és a levezetett aminosav (SEQ ID No.:4) szekvenciáját mutatja be, egy 2373 bp nagyságú polimeráz láncreakció amplifikált DNS fragmensen kódolva.
A 8. ábra a N. meningitidis B szerotípus hemoglobinreceptor fehérjéjének nukleotid (SEQ ID No.:5) és a levezetett aminosav (SEQ ID No.:6) szekvenciáját mutatja be, egy 2376 bp nagyságú polimeráz láncreakció amplifikált DNS fragmensen kódolva.
A 9. ábra a N. gonorrhoea hemoglobin-receptor fehérjéjének nukleotid (SEQ ID No.:7) és a levezetett aminosav (SEQ ID No.:8) szekvenciáját mutatja be, egy 2376 bp nagyságú polimeráz láncreakció amplifikált DNS fragmensen kódolva .
A 10. ábra a N. meningitidis A (SEQ ID No.:3), B (SEQ ID No.:5) és C (SEQ ID No. : 1) szerotípusaiból és a N. gonorrhoeae-ből származó hemoglobin-receptor fehérjék nukleinsav szekvenciáinak összehasonlítása, ahol a gének
| - 31 - | ·· · *· • · · · · • ··· · · ··« • · ···»♦· ··♦· ·· » * | • • · • • · ·· · | |
| transzkripciója a nyilak irányába halad, és a | következő | rö- | |
| vidítések | utalnak a restrikciós endonukleáz | hasítási | he- |
| lyekre: H | megfelel HindlII-nak, N megfelel | Notl-nek, | Bg |
megfelel BglI-nek, Bs megfelel BssHI-nek, Nr megfelel Nrulnek, Cl megfelel Clal-nek, P megfelel Pstl-nek, Sa megfelel Sacl-nek, Av megfelel Aval-nek, B megfelel BamHI-nek, S megfelel Sall-nek, EV megfelel BcoRV-nek, Sh megfelel Sphlnek és Sy megfelel Styl-nek.
A 11. ábra összehasonlítja a N. meningitidis A (SEQ ID No.:4), B (SEQ ID No.:6) és C (SEQ ID No.:2) szerotípusából és N. gonorrhoeae-ből származó hemoglobin-receptor fehérjék aminosav szekvenciáit.
A bakteriális hemoglobin-receptor kifejezés alatt olyan bakteriális fehérjéket értünk, amelyek a Gram-negatív baktériumok külső membránjában helyezkednek el, és specifikusan közreműködnek a hemoglobinból és máshonnan származó hemin az ilyen baktériumok külső membránján való átjuttatásában, be a periplazmás térbe. A találmány szerinti hemoglobin-receptor fehérjék elsődlegesen az aminosav szekvenciával jellemezhetőek, amely lényegében a 2. ábrán, (SEQ IDNo.:2), 7. ábrán, (SEQ ID No.:4), 8. ábrán, (SEQ ID
No.:6) és 9. ábrán, (SEQ ID No.:8) bemutatott szekvencia. A
Jé/1 találmány szerinti bakteriális hemoglobin-receptor fehérjék továbbá jellemezhetőek még a biológiai aktivitással, amely lényegében azonos a 2. ábrán, (SEQ ID No.: 2), 7. ábrán, (SEQ ID No.:4), 8. ábrán, (SEQ ID No.:6) és 9. ábrán (SEQ
ID No.:8) bemutatott szekvenciájú fehérjék biológiai aktivitásával. Ezzel a definícióval a természetben előforduló *· ·
9 9 · · · · ·····*·»« * • · ······ · ·
9999 99 9 9 99 9 variánsokat és mutáns fehérjéket, valamint az ember által genetikailag előállított variánsokat is egybe kívánjuk foglalni .
A jelen találmány szerinti klónozott, izolált és tisztított nukleinsav bármely eredetű Neisseria faj bakteriális hemoglobin-receptor fehérjéjét kódolhatja, legelőnyösebben beleértve a Neisseria meningitidis fajt és annak szerotípusait valamint a Neisseria gonorrhoeae fajt.
A találmány szerinti nukleinsav hibridizációs próbák DNS vagy RNS próbák, amely próbák a 2. ábrán, (SEQ ID No.:l), 7. ábrán, (SEQ ID No.:3), 8. ábrán, (SEQ ID No.:5) és 9. ábrán (SEQ ID No.:7) feltüntetett hemoglobin-receptor fehérje nukleotid szekvenciáját teljes egészében tartalmazzák; vagy annak egy specifikusan hibridizáló fragmensét, vagy bármilyen, a nukleinsav hibridizációban hatékony részét tartalmazzák. A fenti nukleinsav hibridizációs próbák keverékei szintén a találmány igényelt oltalmi körébe tartoznak. Az itt leírt nukleinsav próbák alkalmasak önmagukban a baktériumok jelenlétének kimutatására, egy fertőzés következtében emberben, fertőzött biológiai mintákban és preparátumokban, élelmiszerekben és ivóvízkészletekben, vagy bármilyen emberrel érintkező anyagban. A jelen értelmezésben a specifikus hibridizáció azt jelenti, hogy a találmány szerinti nukleinsav próbák képesek stabilan, specifikusan hibridizálni baktériumokból származó DNS-hez vagy RNS-hez nagymértékben sztringens körülmények között, ahol a nagymértékben sztringens kifejezés egyértelmű a szakmában járatosak számárat lásd például: Sambrook és ·* «e · ·» t • * » * » · » • «·· · · ··« · • · · ···· · · · ·· e* ·· · t> · mtsai.: Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., valamint Hames és Higgins (szerk.) Nucleic Acid Hybridization (1985), IRL Press, Oxford, U.K.] . A hibridizációt ismert technikákkal hozzuk létre, amelyek magukban foglalják de nem korlátozottak a következőkre: Southernblot hibridizáció, Northern-blot hibridizáció, in situ hibridizáció és Southern-hibridizáció polimeráz láncreakcióból nyert DNS-ekhez. Ebben az értelmezésben a találmány tárgyát képezik olyan oligonukleotidok, pontosabban oligonukleotid párok, amelyek primerként felhasználhatóak a bakteriális hemoglobinreceptor-gének és hírvivő RNS másolataik in vitro amplifikációjára.
A technika állása szerint génsebészeti módszerekkel történő fehérje - például bakteriális hemoglobin-receptor fehérje - előállítása klónozott génekből a technika állása szerint jól ismert. Ennek megfelelően az alábbi ismertetés csupán a terület áttekintése és nem kívánjuk a technika állását teljes terjedelmében ismertetni. A következőkben bemutatjuk, hogy a találmány szerinti bakteriális hemoglobinreceptor fehérje gének különösen előnyösek, mert a találmány szerinti fehérje expresziója baktériumban, beleértve a nem Neisseria fajokhoz tartozó baktériumokat is, komplementálhatja ezen transzformált baktériumok bizonyos auxotróf mutánsait amelyek életképtelenek amennyiben a táptalajhoz nem adagolunk vasat(III).
A bakteriális hemoglobin-receptor fehérjét kódoló DNS
- a jelen leíróban adott kitanítás szerint - előállítható ff • 4 • <# · * »»» • * ««Ζ· ·· » * » s» ··* • ••9 * kémiai szintézissel, a megfelelő sejtekből származó hírvivő RNS reverz transzkriptjeinek szkrínelésével, a megfelelő sejtek, genomi klóntárai szkrínelésével, avagy ezen eljárások kombinációival az alább ismertetett módon. Genomi DNS vagy hírvivő RNS szkrínelése oligonukleotid próbákkal hajtható végre, amely próbákat az itt közölt bakteriális hemoglobin-receptor fehérje nukleinsav szekvenciája alapján terveztünk. A próbákat jól kimutatható csoporttal, úgymint fluoreszcens csoporttal, radioaktív izotóppal vagy kemilumineszcens csoporttal jelölhetjük ismert eljárásokat alkalmazva és a próbákat a hagyományos hibridizációs vizsgálati eljárásokban használjuk, ahogy azt bővebben kifejtjük a későbbi példákban. Egy másik megoldás szerint a bakteriális hemoglobin-receptor fehérjéket kódoló nukleinsavak előállíthatóak a polimeráz láncreakció (PCR) módszer használatával, megfelelő PCR oligonukleotid primer párok használatával, amelyek a találmány szerinti bakteriális hemoglobin-receptor fehérjéből nyert nukleinsav szekvencia információ felhasználásával készültek [ lásd Mullis és mtsai.:
U.S. Szabadalom No. 4.683.195 és Mullis U.S. Szabadalom No.
4.683.202] , részletesen ismertetve a 9. példában. Ismét másik megoldás szerint a bakteriális hemoglobin-receptor fehérjét kódoló nukleinsavakat a bakteriális hemoglobinreceptor fehérje génnel transzformált auxotróf sejtekből izolálhatjuk, amely sejtek a transzformáció eredményeképpen megszabadultak a komplexbe nem kötött vas (III) függőségüktől .
·* w »· »
C · v « w ·· • »·· · « »·τ> · v · * »··· · » · «?··» ·· » * ««·
A találmány szerinti bármely bakteriális hemoglobinreceptor fehérje szintetizálható egy olyan rekombináns expressziós konstrukcióval transzformált gazdasejben, amely konstrukció egy bakteriális hemoglobin-receptor fehérjét kódoló nukleinsavat tartalmaz. Az ilyen rekombináns expressziós konstrukciók egy olyan vektorból is állhatnak, ami replikálható DNS konstrukció. A leírás szerint a vektorokat a bakteriális hemoglobin-receptor fehérjét kódoló DNS amplifikációjára és/vagy a bakteriális hemoglobin-receptor fehérjét kódoló DNS expressziójára használjuk. A találmány szerinti, a rekombináns expressziós konstrukció egy replikálható DNS konstrukció amelyben egy bakteriális hemoglobin-receptor fehérjét kódoló nukleinsav funkcionálisan kapcsolódik a megfelelő szabályozó szekvenciákhoz, amelyek képesek befolyásolni a bakteriális hemoglobin-receptor fehérje expresszióját egy megfelelő gazdasejtben.
Az ilyen irányító szekvenciák szükségessége függ a választott gazdasejttől és transzformációs módszertől. Általában a bakteriális szabályozó szekvenciák tartalmaznak egy transzkripciós promotert, egy opcionális operátor szekvenciát a transzkripció szabályozására, a megfelelő hírvivő RNS riboszómális kötődési helyeket kódoló szekvenciát (a Shine-Delgarno szekvenciát), és olyan szekvenciákat, amelyek a transzkripció és a transzláció befejezését szabályozzák. Az ampiifikációs vektoroknak nincs szüksége expresszió szabályozó doménekre. Az egyetlen szükséges dolog a gazdaszervezetben való replikációs képesség amelyet egy replikációs origó biztosít, és egy szelekciós gén a transzformált sejtek felismerésének megkönnyítésére, [lásd:
Sambrook és mtsai. ibid. (1989)] .
A jelen találmány megvalósításában felhasználható vektorok lehetnek plazmidok és víruseredetű konstrukciók is, fágokat és különösen bakteriofágokat, valamint beépíthető DNS-fragmenseket is beleértve (például a homológ rekombinációval a gazdasejt genomjába beépülő fragmensek). A vektor a gazdasejt genomjától függetlenül replikálódik és működik, vagy bizonyos esetekben beépülhet magába a genomba. A megfelelő vektorok a kívánt expressziós gazdasejttel kompatibilis fajból származó replikon és szabályozó szekvenciákat tartalmaznak. Egy ilyen előnyös vektor a pLAFR2 [ Riboli és mtsai.: Microb. Pathogen. 10 393 (1991)] .
Transzformált gazdasejtek azok a sejtek, amelyeket rekombináns DNS technikákkal készült rekombináns expressziós konstrukciókkal transzformáltak vagy transzfektáltak, és az expressziós konstrukciók egy, bakteriális hemoglobin-receptor fehérjét kódoló nukleinsavat tartalmaznak. Előnyös gazdasejtek a Neisseria fajok sejtjei, különösen a N. meningitidis, éppúgy a Salmonella typhi és Salmonella typhimurium fajok sejtjei is, valamint az Escherichia coli auxotróf mutáns sejtjei (hemA aroB). A transzformált gazdasejtek expresszálhatják a bakteriális hemoglobin-receptor fehérjét, de a nukleinsav hibridiziációs próba DNS klónozására vagy amplifikációjára transzformáltak esetében nem szükségszerű a receptor fehérje expressziója. Expresszió esetén a találmány szerinti bakteriális hemoglobin-receptor fehérje tipikusan a gazdasejt • · külső membránjában lesz található [ Sambrook és mtsai.:
ibid.] .
A rekombináns bakteriális hemoglobin-receptor fehérje szintéziséhez az előnyös gazdasejtek a baktérium sejttenyészetek, különösen a Neisseria fajokból, és bizonyos E. coli mutánsokból. Alapvetően, bármilyen baktérium sejt amely auxotróf a komplexbe nem kötött vasra(III), felhasználható a bakteriális hemoglobin-receptor fehérjével transzformált sejtek szelektív tenyésztésére. Erre a célra előnyösen a jól jellemzett auxotróf sejtvonalak, mint az E. coli hemA aroB mutánsok használhatóak.
A találmány tárgyát képezik a fentiek szerint transzformáit sejtek által előállított bakteriális hemoglobinreceptor fehérje homogén kompozíciói. A találmány szerinti bármely ilyen homogén kompozíció bakteriális hemoglobinreceptor fehérjét tartalmaz, ahol a fehérjetartalom legalább 90%-a receptorfehérje az ilyen homogén kompozícióban. A találmány tárgyát képezik még membrán preparátumok olyan sejtekből, amelyek az itt leírtak szerint, a találmány szerinti rekombináns expressziós konstrukcióval történt transzformáció eredményeképpen expresszálják a bakteriális hemoglobin-receptor fehérjét.
A jelen találmány szerinti bakteriális hemoglobinreceptor fehérjék, és azok peptid fragmensei, valamint az ilyen fehérjéket expresszáló sejtekből származó membránok felhasználhatóak hatékony vakcina előállításra olyan bakteriális emberi fertőzések ellen, ahol a fertőzést a bakteriális hemoglobin-receptor fehérjéket expresszáló patogén • · mikroorganizmusok okozzák. Az ilyen vakcinák előnyösen felhasználhatóak a Neisseria fajhoz tartozó baktériumok elleni immunválasz létrehozásában, legelőnyösebben a N. meningitidis és a N. gonorrhoeae törzsek ellen. A találmány tárgyát képező vakcinákon belül értendők még az olyan itt leírt rekombináns expressziós konstrukciók is, amelyek egy állatba bejuttatva önmagukban felhasználhatóak mint vakcinák, kiváltva a bennük kódolt bakteriális hemoglobinreceptor fehérje antigén elleni immunválaszt.
A technika állása szerint jól ismert a polipeptid vagy polinukleotid szekvenciákat mint aktív összetevőket tartalmazó vakcinák előállítása. Tipikusan az ilyen vakcinákat injektálható formában állítjuk elő, folyadékként, mint oldat vagy szuszpenzió. Azonban, szilárd formák is elképzelhetőek amelyeket felhasználás előtt folyadékban oldunk vagy szuszpendálunk. A preparátum lehet emulzió is. Az aktív immunogén összetevőt gyakran keverjük össze farmakológiailag elfogadható, az aktív összetevővel kompatibilis segédanyagokkal. Megfelelő segédanyagok lehetnek például a következők: víz, dextróz, glicerin, etanol, fiziológiás sóoldat, vagy hasonlók és ezek kombinációi. Igény szerint a vakcina tartalmazhat kismennyiségben további kiegészítő anyagokat, mint nedvesítő vagy emulgeáló szereket, pH pufferoló anyagokat, vagy adjuvánsokat, amelyek a vakcina hatásosságát javítják. A vakcinákat hagyományosan parenterálisan adjuk be, például injekcióban intramuszkulárisan vagy szubkután. További készítmények lehetnek a más módon beadhatóak, amelyek közé tartoznak a végbélkúpok és néhány esetben az orális készítmények is. Végbélkúpoknál a hagyományos kötő- és vivőanyagok alatt értjük például a polialkalén glikolokat vagy triglicerideket, ilyen végbélkúpokat készíthetünk olyan keverékekből, amelyek az aktív összetevőt 0,5-10,0 százalékban, előnyösen 1-2 százalékban tartalmazzák. Az orális készítmények olyan általánosságban használt kötőanyagokat tartalmazhatnak, mint például farmakológiai tisztaságú mannitolt, laktózt, keményítőt, magnézium-sztearátot, nátrium-szacharint, cellulózt, magnéziumkarbonátot és más hasonlókat. Ezek a készítmények oldat, szuszpenzió, tabletta, pirula, kapszula, lassú kioldódású készítmény, vagy por alakjában készíthetőek el és az aktív összetevőből 10-95 százalék mennyiséget, előnyösen 25-70 százalék közötti mennyiséget tartalmaznak.
A találmány szerinti polipeptidek természetes vagy só formájában alakíthatók vakcinává. A farmakológiailag elfogadható sók közé értendők a savaddíciós sók (amelyek a peptid szabad aminocsoportjaival képezhetőek) és amelyek szervetlen savak, mint például sósav és foszforsav, illetve szerves savak, mint például ecetsav, borkősav, mandulasav és más hasonlók hozzáadásával képezhetőek. A szabad karboxi csoportokkal képezhető sók levezethetőek szervetlen bázisokból, mit például nátrium-, kálium-, ammónium-, kálciumvagy ferri-hidroxidból valamint olyan szerves bázisokból, mint izopropilamin, trimetilamin, 2-etilamino etanol, hisztidin, prokain és más hasonlók.
Egy másik megvalósítási mód szerint olyan vakcinák készíthetőek, ahol a bakteriális hemoglobin-receptor fehérje • · vagy annak fentiek szerinti peptid fragmense a fentiek szerinti fehérjéket expresszáló sejtek intakt sejtmembránjában van jelen. Előnyös megvalósítások szerint a fenti megvalósításokra használható sejtek emberben való növekedéshez alkalmazkodott legyengített sejtek. A legelőnyösebben megvalósítási mód szerint fentnevezett sejtek emberben való növekedésre alkalmazkodott legyengített sejtek ti. ahol nevezett sejtek nem okoznak nyilvánvaló betegséget vagy más patológiai elváltozást úgymint baktermiát, endotoxémiát vagy szepszist. A találmány szempontjából legyengített sejteknek értelmezendők azok a prokarióta és eukarióta sejtek, amelyek nem okoznak fertőzést, betegséget, szepszist, endotoxikus sokkot, lázkeltő sokkot, vagy más komoly és káros tünetet a vakcina beadásával szemben, állatban vagy leginkább emberben, amennyiben fentnevezett sejteket az állati szervezetbe juttatjuk életképes, élő, hő-, kémiaivagy genetikailag legyengített vagy inaktivált vagy elölt állapotban. Ebben a tudományban járatosak számára elfogadott, hogy a vakcinálás bizonyos csekély mellékhatásai, úgymint rövid ideig tartó láz, izomfájdalom, általános gyengeség és más, a különböző védőoltások beadása során fellépő jól ismert mellékhatások elvárhatóak, mint kísérő jelenség az állati szervezet és előnyösen az ember vakcinálásakor, a találmány szerinti vakcinák felhasználása során. Az ilyen akut, rövid ideig tartó és nem életveszélyes mellékhatások a találmány szerinti vakcinák közvetlen jellegéből adódóan bennfoglaltatnak, és az ilyen mellékhatásokat okozó vakcinák a fent körülírt legyengített defi• · · · · • · · · · nícióba beleértendők. Az ilyen legyengített sejtek kiemelt példái közé tartoznak a Salmonella fajok legyengített variációi, előnyösen a Salmonella typhi és Salmonella typhimurium más legyengített baktériumfajokkal együtt. Specifikusan kiemelendő, hogy a találmány szerinti vakcinák fenti megvalósítása felöleli az ún. élő legyengített sejtkészítményeket, éppúgy mint hővel vagy kémiailag inaktivált sejtkészítményeket.
A találmány más megvalósítási módjai szerint DNS vakcinákat hozunk létre, amelyek a találmány szerinti nukleinsavakat olya rekombináns expressziós konstrukcióban tartalmazzák, amelyek állati szervezetbe való bejuttatás esetén képesek a hemoglobin-receptor fehérjék közvetlen expressziójára. Előnyös megvalósítási módok szerint az ilyen DNS vakcinák olyan rekombináns expressziós konstrukciót tartalmaznak, ahol a találmány szerinti hemoglobinreceptort kódoló nukleinsavak működőképesen promóter elemekhez kapcsolódnak, legelőnyösebben a citomegalovírus korai gén promóteréhez, vagy a simian 40 vírus korai gén promóteréhez. A találmány szerinti DNS vakcinákat előnyösen intramuszkuláris injekció formájában lehet beadni, de bármely megfelelő beadási módszer, mint orális, transzdermál, rektális, nazális, aeroszol bejuttatás a tüdőbe, vagy bármely más klinikailag elfogadható beadási mód alkalmazható a technika állása szerint.
Általánosságban, a találmány szerinti vakcinákat a dozirozással kompatibilis módon juttatjuk be olyan mennyi42 ségben, amely terápiásán hatásos és immunogén. A beadandó mennyiség függ a kezelendő alanytól az alany immunrendszerének antitest szintetizáló kapacitásától és a kívánt védettség fokától. A bejuttatásra kerülő aktív hatóanyag pontos mennyisége a gyakorló orvos megítélésétől és az egyéni jellegzetességektől függ. Nagyságrendileg azonban a megfelelő dózistartomány egyénenként néhány száz mikrogramm aktív hatóanyag. A kezdeti beadás és a megerősítő injekciók rendszere szintén változó, de tipikusan egy kezdeti beadást egy-két heti időtartammal követ a megerősítő injekció vagy más beadási forma.
A jelen találmány szerinti rekombináns expressziós konstrukciók továbbá felhasználhatóak a molekuláris biológiában normál körülmények között hemoglobin-receptor fehérjét nem expresszáló bakteriális sejtek transzformációjára, hogy ezután ezt a receptort expresszálják. Az ilyen sejtek többek között felhasználhatóak köztitermékként, receptor kötéserősségi vizsgálati eljárásokhoz, vakcina előállításhoz és más hasonlókhoz sejtmembrán preparátumok készítésére; és adott megvalósítási módok szerint önmagukban is, többek között mint vakcinák, vagy a fent leírtak szerinti vakcina komponensek. A jelen találmány szerinti rekombináns expressziós konstrukciók tehát előnyösen alacsonyabb költségű módszert biztosítanak potenciális baktericid és bakteriosztatikus gyógyszerek szkrínvizsgálatához mint a hagyományos szkríneljárások. Bár a találmány szerinti konstrukciók és tenyészetek nem teszik teljesen feleslegessé a végső in vivő aktivitási és toxikológiai vizsgálato- 43 kát, fontos első szkrínt biztosítanak az évente nagy menynyiségben szintetizált, felfedezett vagy természetes forrásokból kivont potenciális baktericid és bakteriosztatikus gyógyszernek. Továbbá, az így kiválasztott baktericid és bakteriosztatikus gyógyszerek egy, az ilyen típusú baktériumokban a virulens fertőzésekhez kapcsolódó tápanyagfelvevő utat használnak ki, ahogy az alábbiakban ezt részletesebben bemutatjuk. Ily módon az in vivő súlyos fertőzésekhez társuló baktériumokat a módszer szelektíven célozza meg.
Úgyszintén a találmány tárgyát képezik mind a működőképes bakteriális hemoglobin-receptor fehérjék, membránok, amelyek ilyen fehérjéket tartalmaznak, sejtek, amelyek ilyen fehérjéket expresszálnak és a fentnevezett fehérjék aminosav szekvenciái. Ennek következtében ez a leírás elegendő szerkezeti, és működési aktivitás információt tartalmaz, hogy a jelenleg hozzáférhető technikák felhasználásával lehetővé tegye újszerű, terápiásán aktív antibakteriális gyógyszerek ésszerű gyógyszertervezését (lásd Walters: Computer-Assisted Modeling of Drugs, Pharmaceutical Biotechnology (szerk. Klegerman és Groves), 165-174, (1993) Interpharm Press: Buffalo Grove, IL).
A jelen találmány szerinti nukleinsavak és oligonukleotidok diagnosztikai eszközként felhasználhatóak emberekben egy, Neisseria fajba tartozó hemoglobin-receptor fehérjét expresszáló patogén organizmus okozta bakteriális fertőzés fellépésének kimutatására. Az ilyen diagnosztikai reagensek a találmány szerinti nukleinsav hibridizációs próbákból állnak és a fent leírtak szerinti oligonukleotid • ·
PCR primer párokat tartalmazzák. A találmány szerinti módszerek magukba foglalnak biot hibridizációt, in situ hibridizációt és in vitro amplifikációs tecnikákat a patogén baktériumok biológiai mintában való jelenlétének kimutatására. Az itt leírt módszerekkel előnyösen szkrínelhető megfelelő biológiai minták alá értendőek a plazma, szérum, nyirok, gerincvelői folyadék, ondó, nyálkahártya minta, biopszia minta és más, a bakteriális fertőzés lehetséges helyéről vett minta. Azt is elképzelhetőnek tartjuk, hogy a találmány szerinti módszerek ivóvíz, élelmiszer, gyógyszer és más potenciális fertőzésforrás vizsgálatára felhasználhatóak . ·
Szintén a találmány tárgyát képezik a találmány szerinti bakteriális hemoglobin-receptor fehérjével, vagy annak epitópjaival immunológiailag reaktív antitestek is. A találmány szerinti antitestek termelhetóek állatokban a technika állása szerint, bakteriális hemoglobin-receptor fehérjét vagy annak epitópjait expresszáló sejtekkel való oltással; vagy az ilyen sejtekből származó membránok illetve nyers, vagy a technika állása szerinti módszerekkel tisztított membránpreparátumok bejuttatásával; tisztított fehérje készítmények bejuttatásával, beleértve a fúziós fehérjéket, különösen olyan fúziós fehérjéket, ahol egy, a találmány szerinti bakteriális hemoglobin-receptor fehérje epitopot fuzionálunk heterológ fehérjéhez és azokat génsebészeti módszerekkel baktérium, élesztő, vagy eukarióta sejtekben expresszáljuk és a fentnevezett fehérjéket fenti sejtekből hagyományos biokémiai módszerekkel különböző mér-
tékű tisztításban izoláljuk. A találmány szerinti antitestek előállítási módszerei közé értendők még az ismert szintetikus módszerekkel in vitro előállított szintetikus peptidek, és azok tetszés szerinti heterológ aminosav szekvenciához való konjugátumának felhasználása is az antitest termelésben. A fenti beoltásokhoz felhasználható állatok az alábbi fajok egyedei közül kerülhetnek ki: szarvasmarha, juh, sertés, egér, patkány, nyúl, hörcsög, kecske és a főemlősök. Az oltásokhoz előnyösen felhasználható állatok a rágcsálók (beleértve egerek, patkányok, hörcsögök) és a nyulak. A legelőnyösebben használható állat az egér.
A fenti oltásokhoz, vagy a találmány szerinti bármely más értelemben felhasználható sejtek magukba foglalnak bármely sejtet, amely a találmány szerinti bakteriális hemoglobin-receptor fehérjét természetes körülmények között expresszálja; vagy bármely sejtet vagy sejtvonalat, amely molekuláris, vagy genetikai manipulációk eredményeképpen expresszálja a találmány szerinti bakteriális hemoglobinreceptor fehérjét illetve annak epitópját; vagy bármely sejtet, amelyben fizikai, biokémiai vagy genetikai kezelés eredményeképpen megnövekedett az endogén vagy heterológ bakteriális hemoglobin-receptor fehérje expresszió. Előnyösen használható sejtek az E. coli auxotróf mutáns hemA aroB sejtek, amelyeket a találmány szerinti rekombináns expressziós konstrukcióval transzformálunk és heminnel vagy hemoglobinnal, mint kizárólagos vas (III) forrással kiegészített táptalajon növesztünk, valamint a Neisseria fajokhoz tartozó sejtek.
• · ·« · · · « tf · · · • ··« ·· ··· • · ·*···· ·
Szintén a jelen találmány tárgyát képezik monoklonális antitestek, amelyek immunológiailag reagálnak a fentebb leírt sejtek, előnyösen E. coli sejtek felületén elhelyezkedő, a találmány szerinti bakteriális hemoglobin-receptor fehérje epitópjaival vagy a fehérje fragmensével. Fentemlített antitestek a technika állása szerint jól ismert módszerekkel és technikákkal állíthatók elő. A jelen találmány tárgyát képező monoklonális antitestek előállíthatok hibridóma sejtvonalakból amelyek szintén a találmány tárgyát képezik és a technika állása szerint ismert módszerekkel állíthatók elő [lásd Harlow és Lane: Antibodies: A
Laboratory Manual, (1988) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.] .
A hibridóma sejtvonalak egy mielóma sejtvonal egyes sejtjeinek és immunizált állatokból származó lépsejteknek a fúziójával állíthatók elő, ahol az állat immunizálására egy bakteriális hemoglobin-receptor fehérje homogén preparátumát, a membránokat beleértve; vagy fenti fehérjéket expresszáló sejteket; vagy egy bakteriális hemoglobinreceptor fehérje epitópjait használunk önmagukban, vagy a fentebb leírtak szerinti heterológ vagy fúziós fehérje konstrukció formájában. A találmány megvalósítási módja szerint használt mielóma sejtvonalak magukba foglalják az egér, patkány, hörcsög, főemlős és humán eredetű mielómákból származó sejtvonalakat. Az előnyösen használható mielóma sejtvonalak egér eredetűek és a legelőnyösebb egér mielóma sejtvonal a P3X63-Ag8.653 jelzésű sejtvonal. Az állatok, amelyekből immunizálás után lép nyerhető a patká• · · · . · « ··· ·· · ·· * · ······ · ···· ·· · · * nyok, egerek és hörcsögök, előnyösen az egerek, legelőnyösebben a Balb/c egerek. A lépsejteket és a mielóma sejteket a technika állása szerint jól ismert számos módszerrel fúzionáltatjuk, beleértve, de nem korlátozva ezekre, az inaktivált Sendai vírussal történő inkubálást és a polietilén-glikol (PEG) jelenlétében történő inkubálást. A legelőnyösebb módszer a sejtfúzióra a 45 %-os (vegyes %) PEG-1450 oldat jelenlétében történő inkubálás. A hibridóma sejtvonalak által termelt monoklonális antitestek in vitro növekvő sejtek felülúszójából gyűjthetők be, avagy hibridóma sejtek szubkután és/vagy peritoneálisan injektálhatóak egy állatba, legelőnyösebben egérbe és a monoklonális antitestek a vérből vagy a hasvízből kinyerhetőek.
A jelen találmány szerinti monoklonális antitestek előállíthatóak még a technika állása szerint jól ismert rekombináns genetikai módszerekkel is és a jelen találmány tárgyát képezik az ilyen módon előállított antitestek, amelyek immunológiailag reagálnak egy, a találmány szerinti bakteriális hemoglobin-receptor fehérje egyik epitópjával. A jelen találmány tárgyát képezik továbbá a nevezett antitestek fragmensei - beleértve, de nem korlátozva ezekre az F(ab) és F(ab)2 fragmenseket. A fragmensek bármely módszerrel elkészíthetőek, beleértve, de nem korlátozva olyanokra, mint proteolitikus hasítás, kémiai szintézis vagy a fentnevezett fragmensek génsebészeti technikával történő előállítása. A jelen találmány tárgyát képezik olyan, a technika állása szerint ismert módszerekkel előállított egyláncú antitestek is, amelyek egy bakteriális hemoglobin• · « ·** · · · • ··»··· • · « ·· « · receptor fehérje epitópjával immunológiailag reagálnak.
A találmány szerinti antitestek és fragmensek különböző technikák felhasználásával előnyösen radioaktívan jelölhetőek. A biológiailag aktív molekulák jelölhetőek még radionukleotiddal, a dietilén-triamin-pentaecetsav (DPTA) ciklikus anhidridjével vagy brómacetil-aminobenziletilamin-diamin-tetraecetsavval (BABÉ) végrehajtott konjugáció útján. A jelölési technikák további leírását lásd: [ Hnatowich és mtsai.: Science 220 613 (1983)] és [ Meares és mtsai.: Anal. Biochem. 142 68 (1984)], mindkét irodalmi referencia része a kitanításnak.
A jelen találmány tárgyát képezi továbbá a találmány szerinti bakteriális hemoglobin-receptor fehérje olyan epitópja, amely a receptor molekulában jelen levő szekvenciát és/vagy a szekvenciák egy adott térbeli elrendeződését tartalmazza. Ez az epitóp lehet természetesen előforduló, vagy származhat a receptor molekula proteolitikus hasításából és az epitópot tartalmazó peptid izolálásából, vagy előállítható egy, az epitópot tartalmazó peptid szintézisével, a technika állása szerint jól ismert módszereket használva. A jelen találmány tárgyát képezik még génsebészeti technikák eredményeként, genetikailag manipulált prokarióta vagy eukarióta sejtek által szintetizált epitóp peptidek is.
A találmány tárgyát képezik még kiméra antitestek is, amelyek bakteriális hemoglobin-receptor fehérjéből származó epitóppal immunológiailag reagáló könnyű és nehéz lánc peptidekből állnak. A jelen találmány szerinti kiméra anti«ί ν'· · -* • · » 9 • ··4 « « ·· ’ « · ·»···· · »» «· ·· · * testek egyaránt magukba foglalnak természetesen előforduló antitestekből származókat, és a technika állása szerint jól ismert genetikai manipulációs technikákkal előállított kiméra antitesteket is.
A jelen találmány tárgyát képezik még diagnosztikai és terápiás módszerek is az emberi fertőzések kimutatására és kezelésére, ahol a patogén organizmus bakteriális hemoglobin-receptor fehérjét expresszál. A fenti módszerek során felhasználandó diagnosztikai reagensekhez értendők a találmány szerinti antitestek, előnyösen a monoklonális antitestek. Fenti antitestek felhasználhatóak hagyományos immunológiai technikákban, beleértve, de nem korlátozva olyanokra, mint enzim-kapcsolt immunoszorbens vizsgálati eljárás (ELISA), radioimmun vizsgálati eljárás (RIA), Westernblot vizsgálat, immunológiai titrálásos vizsgálati eljárás, immunológiai diffúziós vizsgálati eljárás (mint az Ouchterlony-féle vizsgálati eljárás) és mások, amelyek a technika állása szerint ismertek. A találmány tárgyát képezi továbbá a találmány szerinti bakteriális hemoglobinreceptor fehérjéből származó, a fenti antitestekkel immunológiai keresztreakciót adó epitópok felhasználása a fentebb leírt bármely immunológiai technikában.
További diagnosztikai vizsgálati eljárások magukba foglalják a találmány szerinti nukleinsavak, vagy azok specifikusan hibridizáló fragmensének felhasználásán alapuló nukleinsav hibridizációs vizsgálati eljárásokat, a bakteriális genomi DNS és/vagy hírvivő RNS érzékeny kimutatására. Az ilyen kimutatások közé értendők különböző biot ·· · ·· • · 9 I - · • J* * · · »*<
9 9 ···· · * ··*» * * · * * vizsgálati eljárások, mint Southern-blot, Northern-blot, dot-blot, slot-blot és más hasonlók, éppúgy, mint az in vitro amplifikációs vizsgálati eljárások, mint a polimeráz láncreakciós vizsgálati eljárás (PCR), reverz transzkriptáz-polimeráz láncreakciós vizsgálati eljárás (RT-PCR), ligáz láncreakciós vizsgálati eljárás (LCR) és más, a technika állása szerint ismert technikák. Az igényelt oltalmi körbe tartozik még a restrikciós fragmens kapcsolt polimorfizmus vizsgálattal (RFLP) analóg, a találmány szerinti bármely módszer segítségével detektált diagnosztikus fragmens specifikus restrikciós endonukleázos emésztése is.
A találmány tárgyát képezik továbbá a találmány szerinti bakteriális hemoglobin-receptor fehérjét expresszáló mikroorganizmus - legelőnyösebben egy Neisseria fajhoz tartozó baktérium - okozta emberi fertőzések kezelésére alkalmas terápiás módszerek és reagensek is. A fenti módszerekben felhasználható terápiás reagensek magukba foglalják a találmány szerinti antitesteket, legelőnyösebben a monoklonális antitesteket, akár önmagukban, akár baktericid vagy bakteriosztatikus gyógyszerhez, vagy más, a fertőző mikroorganizmus ellen hatásos antibiotikus vegyülethez konjugálva. A találmány ezen megvalósítási módja szerint a találmány szerinti antitestek szerepelhetnek gyógyszer összetételekben és magukba foglalhatnak további megfelelő, farmakológiailag elfogadott hordozókat és adjuvánsokat, vagy szükség esetén más kiegészítő anyagokat. Megfelelő hordozóknak tekinthető például a víz, fiziológiás sóoldat, dextróz, glicerin, etanol vagy hasonlók és ezek kombinációi.
• · · ·
Továbbá, ha szükséges, a gyógyszerformák tartalmazhatnak kismennyiségű segédanyagot, mint nedvesítő- és emulgeálószereket, pH pufferoló anyagokat, vagy más vegyületeket, amelyek az antitest hatékonyságát növelik. A jelen megvalósítási módok szerint a találmány szerinti terápiás hatóanyagok a fertőző baktérium megcélzását szolgálják, akár immunológiailag a találmány szerinti antitesttel megjelölve azokat, hogy az emberi immunrendszer citotoxikus sejtjei felismerjék, vagy hogy a bakteriális hemoglobin-receptor fehérjén keresztül specifikusan a fertőző mikroorganizmushoz irányítsanak egy antimikrobiális gyógyszert.
A további terápiás reagensek magukba foglalják a találmány szerinti nukleinsavakat, vagy azok fragmenseit, különösen nevezett nukleinsavak antiszensz megtestesüléseit.
A fentnevezett antiszensz nukleinsavak felhasználhatóak önmagukban, vagy az antiszensz expresszióra specifikus rekombináns expressziós konstrukcióban, ahol a konstrukció úgy van genetikailag megszerkesztve, hogy egy baktériumvírus, előnyösen egy, a fertőzésért felelős bakteriális patogént fertőző bakteriofág, genomjának egy része kiegészüljön. Ezen megvalósítási módok szerint a találmány szerinti antiszensz nukleinsav bevitele a baktériumsejtbe gátolja, legyengíti vagy megszünteti a bakteriális hemoglobin-receptor expresszióját és így a bakteriális fertőzés virulenciáját csökkenti és hatásosabb antibakteriális beavatkozást tesz lehetővé. További megvalósítási módok szerint a bakteriofág a bakteriális hemoglobinreceptor-gén knockout példányait hordozza, amitől a fág a fertőző bak• · r-O ··♦♦*····· — oz — ...... · · ··· tórium endogén hemoglobinreceptor-génjének genetikai mutációját hozza létre, például a bakteriális hemoglobinreceptor-gén exogén knockout példánya és a fertőző mikroorganizmus endogén hemoglobinreceptor-génje közötti homológ rekombinációval.
Az itt következő példák a találmány egyes megvalósítási módjait és azok felhasználását mutatják be. Ezek a példák csak magyarázatul szolgálnak, igényünket azonban nem korlátozzuk az ismertetettekre.
1. példa
Plazmidok, baktériumok és táptalajok
A példák bemutatása során használt plazmidok és baktériumok az 1. táblázatban kerültek felsorolásra. Az E. coli törzseket rutinszerűen 5-amino levulinsavval és szükség szerint 50 mg/L hemin-kloriddal kiegészített Luria-Bertani (LB) táptalajon növesztettük. A N. meningitidis 8013 törzs egy, a klinikumból származó C szerocsoport izolátum [ Nassif és mtsai.: Mól. Microbiol. 8_ 719 (1993)] . A meningokokkuszokat rutinszerűen GCB (Difco) agaron növesztettük, Kellogg módszere szerint kiegészítve [ Kellogg és mtsai.: J. Bacteriol. 85 1274 (1963)] 5% CO2 tartalmú atmoszférában 37 °C-on inkubálva. A meningokokkuszok transzformálását Nassif [Nassif és mtsai.: Mól. Microbiol. 6 591 (1992)] módszere szerint végeztük. E. coli esetén szükség szerint a következő antibiotikumokat használtuk: 100 mg/L rifampicin; 15 mg/L tetraciklin; 30 mg/L kanamicin, 20 mg/L klóramfenikol és 100 mg/L karbenicillin. Neisseria-hoz.
•» ♦ szükség szerint 100 mg/L kanamicint használtunk.
2. példa
Neisseria meningitidis hemoglobinreceptor-gén auxotróf kiegészítéses klónozása.
A hemin és/vagy hemoglobin vas felvételében résztvevő N. meningitidis külső membrán receptor(ok) azonosítása céljából egy auxotróf kiegészítéses klónozási stratégiát használtunk, a korábban Y. enterocolitica és V. cholerae hemin receptorok azonosítási módszeréhez hasonlóan [lásd Stojiljkovic és Hantke: EMBO J. 11 4359 (1993); Henderson és Payne: J. Bacteriol. 17 6 3269 (1994)] . Ez a stratégia azon a tényen alapszik, hogy a Gram-negatív baktériumok külső membránja a hemin számára átjárhatatlan [ Mc Conville és Charles: J. Microbiol. 113 165 (1979)] és ezért az E.
coli porfirin bioszintézis mutánsok nem növekednek kívülről biztosított hemin jelenlétében. A N. meningitidis külső membrán hemin receptor génnel rendelkező E. coli porfirin mutáns ezzel szemben képes felhasználni a hozzáadott hemint, mint porfirin forrást.
Egy N. meningitidis 8013 klón 6 DNS kozmid bankot készítettünk hagyományos kozmid klónozási technikák felhasználásával [Sambrook és mtsai.: ibid (1989)] . Ezt a kozmid bankot az E. coli hemA aroB Rif' fogadó törzsbe vittük egy pRK2013::Tn9 konjugáló plazmid segítségével, hármas párosodás triparental mating útján. A párosítási elegyet szelektív lemezekre szélesztettük, amelyek 50 mg/L heminkloridot, 0,1 mM 2,2' -dipiridilt és 100 mg/L rifampicint • · · · ··· ·· · · · • **···· · · ·· · · ··· tartalmaztak. Éjszakán át tartó inkubálás után számos külső heminforrásból növekedésre képes kiónt izoláltunk.
1. táblázat
| Törzs | Genotípus |
| E. coli K12 | |
| EB53 | hemA, aroB, rpoB |
| KP1041 | MC4100tonB::Kmr |
| H1388 | exbB::Ύη10 Alac pro |
| TSM348 | endA, hsdR, pro, supF, pRK2013::Tn9 |
| IR754 | EB53, tonB::Kmr |
| IR736 | EB53, exbB:;Tnl0 |
| DH5a | recA, gyrB |
| N. meningitidis | |
| ATCC 13077 | A szerotípus |
| B szerotípus* | |
| MC8013 | Klón 6, vad típus |
| MChmbR | hmbR::aphA-3 |
| N. gonorrhoeae MS11A | |
| PLAZMIDOK | |
| pSUSK | pA15 replikon, klóramfenikolr |
| pHEM22 | pLAFR2, hemoglobin hasznosító kozmid |
| pHEM44 | pLAFR2, hemin hasznosító kozmid |
| pIRS508 | 6kb Clal, pSUSK |
| PIRS523 | 3kb BamHI/Sall, pUC19 |
| pIRS525 | l,2kb aphA-3 a pIRS523 NotI helyén |
| pIRS527 | 4kb BamRI/Clal, pBluescript |
| pIRS528 | 0,7kb Wotl/BamHI, pBluescript |
| pIRS692 | 3,3kb BamHI/HindiII, SU(SK) |
* laboratóriumi gyűjteményből • «
- 55 - ..........
Ezeknek a transzformáltaknak a hemin hasznosító fenotípusát a kozmidok eredeti E. coli hemA aroB sejtekbe való újrabevitelével teszteltük, a hemin-kiegészített lemezeken való növekedés megfigyelésével. Az E. coli törzsek hem illetve hemoglobin, mint egyedüli vasforrás, felhasználó képességét a korábban közölteknek megfelelően ellenőriztük [Stojiljkovic és Hantke: ibid. (1992)] . A sejteket 50μΜ deferoxamin-meziláttal (egy vas kelátkötő anyag, beszerezve a Sigma Chemical Co.-tól, St.Louis, MO) kiegészített LB agaron növesztettük. A tesztvegyülettel átitatott filtert [ 1/4 hüvelyk (kb. 6 mm), Schleicher & Schüll Inc. Keene, NH] az agarlemezekre helyeztük. A tesztvegyületekből általában 20-20 μΒ-t használtunk az 5 mg/mL-es törzsoldatokból (amennyiben ettől eltérően nem jelezzük). A lemezeket éjszakán át növesztettük 37 ''C-on 5% CO2 atmoszférában és a filter körüli növekedési zónát vizsgáltuk. A vizsgálatok során kipróbált vaskötő fehérjék (az összesét a Sigma Chemical Co.-tól szereztük be) a következők voltak: humán, pávián, marha és egér eredetű hemoglobin, marha hemin, humán laktoferrin (90 %-os vastelítettséggel) és humán transzferrin (90 %-os vastelítettséggel, a Boehringer Mannheim Biochemical, Indianapolis, IN cégtől beszerezve). Ezzel a módszerrel összesen hat , hemin hasznosító, pozitív kiónt kaptunk. A fenti kísérletek eredményeit a 2. táblázatban tüntetjük fel.
• ·
2. táblázat
| Törzs | Fenotípus | Hemin vas | Porfirin | Hb vas |
| N. meningitidis | ||||
| MC8013 | vad típus | +++ | N.T. | +++ |
| MChmbR | HbR mutáns | +++ | N.T. | - |
| E. coli | ||||
| EB53 | vas hasznosítás | - | - | - |
| EB53 (pIRS508) | tonB+, exbB*, hmbR* | +++ | +++ | + |
| IR754 (pIRS508) | tonB , exbB*, hmbR* | - | - | - |
| IR736 (pIRS508) | tonB*, exbB , hmbR* | - | - | - |
jelmagyarázat:
N.T. nem tesztelt nincs növekedés + 10 mm-nél kisebb növekedési zóna a filter körül +++ ±15 mm növekedési zóna a filter körül
A hemin/hemoglobin felhasználását, mint porfirin forrást az egyes törzsek hemin filter(5 mg/mL) környezetében vagy hemoglobin filter(10 mg/mL E. coli esetén; 5 mg/mL N. meningitidis esetén) környezetében való növekedésével teszteltük LB lemezeken. A hemin/hemoglobin felhasználását, mint vas forrást hasonlóképpen teszteltük, de 50 gL 5 g/L delta-amino-levulinsavval kiegészített NBD lemezeket használva, illetve N. meningitidis esetében 50 μΜ Desferal-lal kiegészített GCB lemezeket használva.
• · · · · · • · · · • ·
3. példa
A hemin hasznosító pozitív kozmidok restrikciós enzimes térképezése.
A 2. példa szerint nyert hat hemin hasznosító pozitív kozmidból származó DNS-t Clal-gyel emésztettük és a kapott fragmenseket Clal emésztett pSU(SK) vektorba klónoztuk (Stratagene, LaJolla, CA). Az egyik szubklónról, amely egy a cos22 kozmidból származó 6kb Clal fragmenst tartalmaz (az így kapott plazmid jelölése pIRS508) a 2. példa szerinti módszerrel vizsgálva megállapítottuk, hogy az E. coli hemA aroB törzs hemin és hemoglobin hasznosítását lehetővé teszi. Egy másik ilyen kiónról, amely a cos44-kozmidból származó 11 kb Clal fragmenst tartalmazza, szintén megállapítottuk, hogy ezekben az auxotróf mutáns sejtekben lehetővé teszi a hemin hasznosítást. A restrikciós analízis és a
Southern-hibridizáció arra utalt, hogy a cos22-ből és a cos44-ből származó DNS fragmensek egymástól függetlenek.
ApIRS508-kozmid kiónból származtatható restrikciós enzim emésztési térképet az 1. ábrán mutatjuk be. A pIRS508plazmid képessé tette az E. coli hemA aroB törzset arra, hogy mind hemint és marha hemoglobint vasforrásként hasznosítson, bár hemoglobinon a növekedés némiképp gyengébb volt, mint hemin esetében (2. táblázat). További szubklónozás a hemin/hemoglobin hasznosító tartományt az inzert BamHI/Hindi II fragmensén lokalizálta. A hemoglobinreceptor-gént kódoló szekvenciák mellett (jelölése hmbR) agy Neisseria inszerciós elem szekvenciát
IS1106) és egy Neisseria kisméretű ismétlődő elem szekven58 cia részletet (IR1) is feltüntettünk az ábrán.
• · · *·*« • · · · · · ·
4. példa
Egy Neisseria hemoglobinreceptor-gént kódoló kozmid klón nukleotid szekvencia analízise.
A hmbR gént és annak promoter régióját hordozó 3,3 kb BamHI-HindlII DNS-fragmens nukleotid szekvenciáját a dideoxi láncterminációs módszerrel határoztuk meg Sequenase 2,0 reagens készletet (beszerezve U.S. Biochemicals-tól, Cleveland, OH) és analízisre BioRad elektroforézis rendszert, AutoRead reagens készletet (Pharmacia, Uppsala,
Svédország), és ALF-370 automata szekvenátort (szintén Pharmacia) használva. A szekvenáláshoz a plazmid szubklónokat nested deléciós megközelítéssel, Erase-aBase reagens készlettel (Promega Biotech, Madison, WI) állítottuk elő, a hmbR génen belül különböző restrikciós hasító helyeket használva. A hmbR gén nukleotid szekvenciáját és a belőle következő aminosav szekvenciát a 2. ábrán mutatjuk be.
A N. meningitidis C szerotípus hemoglobin-receptor fehérjét kódoló nyílt leolvasási fázis (ORF) a szekvencia 470-es helyén kezdődik és egy 792 aminosavból álló, a számítások szerint 85,5 kDa molekulatömegű fehérjét kódol. A 460-as helyen Shine-Delgarno (SD) szekvencia található. A HmbR receptor fehérje a 22-24 aminosavaknál szignál peptidáz I felismerő szekvenciát tartalmaz (aláhúzva) ami alátámasztja funkcióját, mint külső membrán fehérje.
A hmbR gén promoter régiójában egy tipikus Für kötő nukleotid szekvencia található (elnevezése Für box; 2.
ábra) . Ismert, hogy a Yersiniae és Vibrio nemzetségek hemin hasznosításához hasonlóan a hemin és hemoglobin hasznosítás Neisseria-ban szintén vas-indukálható fenotípus [ West és Sparling: Infect. Immun. 47 388 (1985); Dyer és mtsai.: Infect. Immun. 55 2171 (1987)] . Gram-negatív baktériumokban sok, vas hasznosításhoz szükséges gén feltételes expresszióját a Für represszor szabályozza, amely a Furrepresszált gének promoter régiójában egy 19 bp hosszúságú hibás diád ismétlést (Fur-box) ismer fel. Újabban leírtak egy genetikai szkrínt (FÚRTA) a különböző Gram-negatív baktériumokból származó Fur-szabályozott gének azonosítására [ Stojiljkovic és mtsai.: J. Mól. Bioi. 236 531 (1994)] és ezt a módszert használtuk annak eldöntésére, hogy vajon a hmbR expresszió is így szabályozott-e.
E. coli törzset (H1717) transzformálunk a Fur-box szekvenciát tartalmazó plazmiddal amely kromoszómán hordoz egy Fur-szabályozott lac fúziót. Normál körülmények között ennek expressziója represszált. A nagy kópiaszámú Fur-box szekvencia bevitele a plazmidon leköti a hozzáférhető Für represszor helyeket és így lehetővé teszi a Fur-regulált lac fúzió expresszióját (ezt a fenotípust nevezzük FÚRTA pozitívnak). Ezt a szkrínt használva a pIRS508-kozmidból származó legkisebb inzert fragmens amely FÚRTA pozitív eredményt adott a 0,7 kb BamHI-NotI DNS-fragmens volt a pIRS528-plazmidon (ld. 1. ábra). Ez az eredmény jelzi, hogy a 0,7 kb BamHI-Nofcl DNS-fragmens a pIRS528-plazmidon tar• · • · · • ···· · talmaz Fur-boxot, így tehát a hmbR promóterről induló génexpressziót egy fur-típusú operon szabályozza.
A N. meningitidis C szerotípus hemoglobin-receptor fehérjét a Promega Biotech (Madison, WI) E. coli S30 extrakt rendszer segítségével in vitro expresszáltuk. Az in vitro expresszált 3,3 kb BamHI-HindlII fragmens egy 90 kDa móltömegű fehérjét kódol, amely méret megfelel a HmbR receptor közvetlenül transzláció utáni (processzálatlan) számított móltömegének. A 3. ábra mutatja be a 10 %-os SDSPAGE analízis alapján megállapított 90 K relatív móltömegű fehérje sávot.
Leolvasási irányban a hmbR gén mellett közvetlenül (2. ábra, pozíciók 2955-3000) egy rövid nukleotid szekvenciát találtunk, amely 99 %-ban azonos a N. gonorrhoeae PlII génjének határoló szekvenciájával [Gotschlich és mtsai.: J. Exp. Med.: 165 471 (1987)] . A szekvencia első 25 bázispárja megfelel a N. gonorrhoeae kisméretű ismétlődő szakaszának inverted repeat-je (IR1) felének. Ez a szakasz mind a N. meningitidis-ben, mind a N. gonorrhoeae-ban körülbelül 20 példányban található meg [ Correia és mtsai.: J. Bioi.
Chem.: 263 12194 (1988)] . A nukleotid szekvencia analízise a 3027-es pozíciótól a 3984-as Clal restrikciós helyig (a 2. ábrán csak a BamHI (1) Hindui (3370) pozíciók közötti nukleotid szekvenciát tüntetjük fel) egy IS1106 szakasz jelenlétét mutatja [ Knight és mtsai.: Mól. Microbiol. 6 1565 (1992)] . Érdekes módon az IR1 szakasz és az IS1106 homológ szakasz kezdete között nem találtunk az IS1106 inverted repeat-hoz hasonló nukleotid szekvenciát.
··
Ezek az eredmények alátámasztják, hogy egy új N. meningitidis eredetű hemoglobin-receptor fehérje gént sikerült klónozni és azonosítani, amely a N. meningitidis genomi eredetű DNS egy 3,3 kb nagyságú BamHI/Hindi 11 fragmensen található.
5. példa
A N. meningitidis hemoglobin-receptor fehérje és a
Neisseria laktoferrin és transzferrin receptor fehérjék aminosav szekvenciájának összehasonlítása
A 4. ábrán hasonlítjuk össze a N. meningitidis transzferrin [ Tbpl; Legrain és mtsai.: Gene 130 81 (1993)], laktoferrin [ LbpA; Pettersson és mtsai.: Infect. Immun. 61 4724 (1993) és J. Bacteriol.: 176 1764 (1994)] és hemoglobin (HmbR) receptorokat. Az összehasonlítást a PC/GENE programcsomag CLASTAL programjával végeztük (Intelligenetics, Palo Alto, CA) . A fehérjéknek csak az amino-terminális és karboxi-terminális részeit mutatjuk be. A csillag jel aminosav szintű azonosságot, a pont hasonlóságot jelent. A laktoferrin és transzferrin receptorok aminosav szekvenciája 44,4 % azonosságot mutat. Ezzel szemben ezek és az itt leírt hemoglobin-receptor közötti homológia lényegesen kisebb (22 % aminosav szekvencia azonosság a laktoferrin, és 21 % a transzferrin receptorral).
• ···· · • · · ·
6. példa
A N. meningitidis hemoglobin-receptor hemin transzport
TonB/ExbBD függése
Ismert, hogy a vasat tartalmazó sziderofórok, néhány kolicin és a B12 vitamin transzportja az E. coli külső membránján keresztül három, a citoplazmában elhelyezkedő membrán fehérjétől függ: TonB, ExbB és ExbD [ Postle: Mól. Microbiol. 133 891 (1992); Braun és Hantke Handbook of
Microbial írón Chelates (szerk.: Winkelmann) CRC Press,
Boca Raton, Fia., 107-138 old. (1991)] . Yersinia és Hemophilus törzsekben kimutatták, hogy a hemin felvétel TonB függő folyamat [ Stojiljkovic és Hantke: ibid. (1992);
Jarosik és mtsai.: Infect. Immun. 62 2470 (1994)] . A külső membrán receptorok és a TonB citoplazmában elhelyezkedő rendszer közötti közvetlen kölcsönhatáson keresztül a receptorhoz kötött szubsztrát bekerül a periplazmás térbe [ Heller és mtsai.: Gene 64 147 (1988); Schoffler és Braun:
Molec. Gén. Génét.: 217 378 (1989)] . Ez a közvetlen kölcsönhatás a TonB rendszerrel kapcsolatban levő membrán fehérjék egy adott aminosav szekvenciájához rendelhető.
A Gram-negatív baktériumok összes TonB függő receptorának primer struktúrája számos, nagymértékben homológ régiót tartalmaz [Lundrigan és Kadner: J. Bioi. Chem.: 261 10797 (1986)] . Az 5. példa szerinti aminosav szekvencia összehasonlításban mindhárom fehérje feltételezhető TonBboxait aláhúztuk. A HmbR receptor karboxi-terminálisa tartalmazza a nagymértékben állandó fenilalanin végződést és a 782-es arginint, amelyekről feltételezik, hogy egy külső • · ·»···· · · ·*·» ·· » « «*· membrán felismerő szignál részei [ Struyve és mtsai.: J. Mól. Bioi.: 218 141 (1986); Koebnik: Trends Microbiol.: £ 201 (1993)] . Az érett HmbR fehérje 6-os aminosav maradéka körül egy szekvencia - ETTPVKA - szekvenciájában hasonló számos Gram-nagatív receptor úgynevezett TonB-boxához [ Heller és mtsai.: ibid. (1988)] . Érdekes módon a HmbR feltételezett TonB-boxa több homológiát mutat a N. gonorrhoeae transzferrin receptor TonB-boxával [ Cornelissen és mtsai.: J. Bacteriol. 174 5788 (1992)] , mint az E. coli sziderofór receptorok TonB-boxaival. Amikor a HmbR receptor szekvenciát összehasonlítottuk más TonB függő receptorokkal·, a legnagyobb hasonlóságot a Y. enterocolitica HemR receptor mutatta, bár a hasonlóság elmaradt a Neisseria receptorok mögött .
A N. meningitidis C szerotípus hemoglobin-receptor TonB függő természetének bizonyítására az EB53 jelű E. coli exbB és tonB mutánsába bejuttattuk a hmbR-t és vizsgáltuk a törzsek hemin és hemoglobin, mint porfirin és vas forrás, hasznosító képességét. A vizsgálati eljárásokban mindkét EB53 E. coli mutáns képtelen volt a hemint akár porfirin akár vas forrásként hasznosítani működőképes hmbR jelenlétében (2. táblázat) . A hemoglobin, mint vas forrás hasznosítása szintén károsodott (2. táblázat). Ezek az eredmények alátámasztják, hogy a találmány szerinti N. meningitidis hemoglobin-receptor fehérje, a hmbR gén terméke, TonB függő, hiszen a 2. példa szerinti kísérletekben ennek a génnek az expressziója vad típusú TonB E. coliban segítette a hemin és hemoglobin, mint egyedüli vas forrás hasznosítá• · «· · • · · · · • ··« ·· ··· • 9 ····** a ···· ·· · · ·· sát.
7. példa
A hmbR gén terméke azonos a N, meningitidis hemoglobinreceptor fehérjével - funkcionális bizonyítás
A 2. táblázatban bemutatott adatok alapján E. coliban expresszálva, a hmbR mind a hemin, mind a hemoglobin hasznosítást befolyásolja, de a hemoglobin hasznosítás kevésbé erőteljes mint a hemin hasznosítás. Annak eldöntésére, hogy a HmbR receptor N. meningitidis-ben azonos specificitással rendelkezik-e, a hmbR-t egy 1,2 kb kanamicin kazettával [aphA-3; Nassif és mtsai.: ibid. (1991)] inaktiváltuk és vad típusú 8013 klón 6 (C szerotípus) N. meningitidis sejtekbe transzformáltuk. A Km-rezisztens transzformánsok kromoszómális hmbR példányának inaktiválását Southernhibridizációval bizonyítottuk (5. ábra). Látható az 5. ábrából, hogy a vad típusú N. meningitidis genomi eredetű DNS csupán egy példányban tartalmazza a hmbR gént (1. és 3. sávok) . A Kmr transzformánsokban a vad típusú gént tartalmazó DNS-fragmens mérete 1,2 kb-tal nőtt, ami megfelel a Kan kazetta méretének (5. ábra, 2. és 4. sávok) . Különböző vastartalmú vegyület hasznosító képességüket vizsgálva megállapítottuk, hogy ezek a mutáns sejtek a fajtól (humán, pávián, marha, egér) függetlenül képtelenek a hemoglobinban kötött vasat felhasználni. Nem vizsgáltuk a mutánsok képességét hemoglobin-haptoglobin hasznosításra, mert a vad típusú N. meningitidis törzs képtelen a haptoglobinhemoglobin komplexet, mint vas forrást hasznosítani. Azon<.· · bán a mutáns továbbra is képes volt hemin vas, laktoferrinés transzferrin-kötött vas, valamint citrát-vas felhasználására (2. táblázat). Mivel a hemoglobin vasat tartalmazó komponense a hemin, a hemoglobin-receptorról feltételezhető, hogy képes legyen hemint szállítani a periplazmába. Valóban, az itt közölt klónozási stratégia a klónozott meningokokkusz receptornak az E. coli periplazmájába történő heminszállító képességén alapszik. Ezek az eredmények nagymértékben valószínűsítik, hogy a N. meningitidis-nek legalább két, a hemin tartalmú vegyületek hasznosításában szerepet játszó működőképes receptora van. Az egyik az itt közölt hemoglobin-receptor, amely mind a hemin, mind a hemoglobin hasznosítását lehetővé teszi vas forrásként. A másik feltételezhető receptor a N. meníngitidis-ben egy hemin receptor, amely csak a hemin hasznosítását teszi lehetővé.
Ezt az elképzelést alátámasztja a számos kozmid klón izolálása, amely mind lehetővé teszi az EB53 E. coli hemin hasznosítását. Az ezekből a kozmidokból származó DNS nem hibridizál a mi hmbR próbánkkal, ami arra utal, hogy ezek a kiónok egy szerkezetileg távolálló receptor fehérjét kódolnak, amely képes hemin transzportra a N. meningitidis sejtek periplazmájába.
8. példa
N. meningitidis hmbR mutáns sejtek virulenciájának csökkentése in vivő
A N. meningitidis hemoglobin és hemin begyűjtő rendszere fontosságának ellenőrzésére a N. meningitidis C «fc · • » · 9 · · · * «·· · · ··» · /-/- · · · «··· · · ·
- 6o - ♦*·· ·· · · w·· szerotípus hmbR mutáns és vad típusú törzseket 5 napos újszülött patkányokba oltottuk és követtük a vérből és a gerincvelői folyadékból visszanyert baktériumok számának alakulását. Ezekben a kísérletekben a N. meningitidis C szerotípus virulens képesség értékelő módszer lényegében megegyezett azzal, amit Nassif és mtsai. leírtak [Nassif és mtsai.: ibid. (1992)] újszülött beltenyésztett Lewis patkányokat használva (Charles River, Saint Aubin les Elbeufs, Franciaország). Lényegében a 8013-as törzset 3 állatrólállatra átoltással újraaktiváltuk. A harmadik átoltás után a baktériumot kis részletekben -80 °C-on lefagyasztva tároltuk. Annak elkerülésére, hogy a fertőzés során fellépő módosulások egy spontán avirulens variáns kiszelektálódásához vezessenek az állatokon átoltott, lefagyasztott 8013 törzsanyag egy részletét hmbR mutánsból kapott kromoszómális DNS-sel transzformáltuk és az így kapott Kanr transzformánsokat további tisztítás nélkül egyesítettük és -80 °C-on lefagyasztva tároltuk. Mindegyik kísérlethez azonos alomból származó újszülött patkányokat használtunk. A N. meningitidis 8013-t éjszakán át növesztettük és az újszülött patkányokba 2x 10° baktériumot injektáltunk intraperitoneálisan. Mindegyik meningokokkusz törzshöz három-három patkányt használtunk. A fertőzés menetét 24 órán át követtük és a jelzett időpontokban vért vettünk. A 24 óra leteltével a patkányokat feláldoztuk, gerincvelői folyadékot (CSF) gyűjtöttünk és meghatároztuk a kolónia képző egységek (CFU) számát. Mindegyik kísérletet megismételtük és mindkétszer hasonló eredményeket kaptunk.
-« «
A kísérletek eredményét a 6. ábra mutatja be. A hmbR törzset, amely képtelen hemoglobint hasznosítani vas forrásként, a vad típushoz képest jelentősen kisebb mennyiségben sikerült a fertőzött állatok véréből visszanyerni. Mind a mutáns és a vad típusú törzs még képes volt a vér-agy gát átlépésére, ahogy ezt a gerincvelői folyadékból izolált baktériumok bizonyítják. Az eredmények azt jelzik, hogy a hemoglobin fontos vas forrás a N. meningitidis in vivő növekedéséhez .
9. példa
N._meningitidis szerotípusok és N._gonorrhoeae hemoglobinreceptor-gén j einek_polimeráz_láncreakciós amplifikációj a
A hmbR gént és annak promoter régióját hordozó 3,3 kb BamHI-HindlII DNS-fragmens nukleotid szekvenciája alapján specifikus oligonukleotid primereket határoztunk meg a N. meningitidis A és B szerotípus, valamint az MS11A N. gonorrhoeae törzs homológ hemoglobin-receptor fehérjéjének in vitro amplifikációjához az alábbiak szerint.
A következő oligonukleotid primereket fejlesztettük ki a polimeráz láncreakción alapuló amplifikációra [ PCR; Saiki és mtsai.: Science 230 1350 (1988)] :
5' -AAACAGGTCTCGGCATAG-3' SEQ ID No.:ll (szensz primer)
5' -CGCGAATTCAAACAGGTCTCGGCATAG-3' SEQ IDNo.:12 (antiszensz primer) • · · ·· • · · · · • · • ♦ · az A szerotípusú N. meningitidis hemoglobin-receptor fehérje amplifikálására;
5' -CGCGAATTCAAAAACTTCCATTCCAGCGATACG- 3' (szensz primer)
5' -TAAAACTTCCATTCCAGCGATACG-3'
SEQ ID No.:13
SEQ ID No.:14 (antiszensz primer) a B szerotípusú N. meningitidis hemoglobin-receptor fehérje amplifikálására;
5' -AAACAGGTCTCGGCATAG-3' (szensz primer) vagy
5' -CGCGAATTCAAACAGGTCTCGGCATAG-3' (szensz primer) és
5' -CGCGAATTCAAAAACTTCCATTCCAGCGATACG-3' (antiszensz primer) vagy
5' -TAAAACTTCCATTCCAGCGATACG-3'
SEQ ID No.:15
SEQ ID No.:16
SEQ ID No.:17
SEQ ID No.:18 (antiszensz primer) a MS11A N. gonorrhoeae törzs hemoglobin-receptor fehérje amplifikálására.
A N. meningitidis A és B szerotípusokból vagy a N. gonorrhoeae fajokból az ismert technikák felhasználásával állítottunk elő genomi eredetű DNS-t (lásd Sambrook és mtsai.: ibid.) amelyek magukba foglalják a baktérium sejtfal enzimes emésztését, a protoplaszt lízisét, proteáz és
RN-áz emésztést, szerves oldószerrel, úgymint fenollal és/vagy kloroformmal történő extrakciót és alkoholos kicsapást. Felhasználtunk nyers DNS készítményeket is. Adott mennyiségű (jellemzően kb. 0,1 μg) genomi eredetű DNS-t használtunk az egyes amplifikációs reakciókhoz. Egy tipikus amplifikációs reakcióhoz Pfu polimerázt (Stratagene, LaJolla, CA) és/vagy Taq polimerázt (Boehringer Mannheim, Németország) használtunk a megfelelő pufferben, ami tartalmazott még kb. 20 pikomólt mindegyik amplifikációs primerből és 200-200 nanomólt mindegyik deoxinukleotidtrifoszfátból. Az amplifikációs reakciókat a következő felállásban hajtottuk végre:
| Első ciklus | 5 perc 95 °C-on |
| 2 perc 51 '’C-on | |
| 6 perc 72 ’C-on | |
| Ciklusok 2-13 között | 45 másodperc 95 °C-on |
| 35 másodperc 49 °C-on | |
| 10 perc 72 C-on | |
| Ciklusok 14-30 között | 25 másodperc 95 °C-on |
| 35 másodperc 47 uC-on | |
| 10 perc 72 ’C-on |
Az amplifikációs reakció befejezése után a DNSfragmenseket vagy tompa véggel klónoztuk, vagy EcoRI emésztés után EcoRI emésztett pSUKS vagy pWKS30-vektorokba • · π π ,·»······
- / υ — .........
klónoztuk és baktériumba transzformáltuk. A pozitív szelektált kiónokat a rekombináns inszert jelenlétére analizáltuk és a 4. példában leírtak szerint szekvenáltűk.
A kísérletek eredményeként három, a N. meningitidis A és B szerotípusokból és a N. gonorrhoeae MS11A törzsből származó hemoglobinreceptor-gént kódoló kiónt nyertünk és meghatároztuk a gének szekvenciáját. A gének nukleotid szekvenciája a 7. ábrán, (N. meningitidis A szerotípus), a
8. ábrán, (N. meningitidis B szerotípus), és a 9. ábrán, (N. gonorrhoeae MS11A) látható. A különböző N. meningitidis szerotípusokból és a N. gonorrhoeae MS11A törzsből klónozott hemoglobin-receptorok homológiájának mértékét a nukleinsav és az aminosav szekvencia összehasonlítása alapján határoztuk meg az 5. példában leírtak szerint. Az öszszehasonlítás eredményeit a 10. és a 11. ábrán mutatjuk be, fentieknek megfelelően. A három N. meningitidis szerotípusból és az MS11A N. gonorrhoeae-ből származó hemoglobinreceptor-gének 86,5-93,4 % közötti homológiát mutatnak, a legközelebb álló nukleinsavak a N. meningitidis B és C szerotípusból származóak, és a legtávolibbak a N. meningitidis B szerotípus és a N. gonorrhoeae MSllA-ból származóak (10. ábra és 3. táblázat).
• ·
3. táblázat
| törzsek | A | B | C | MS11 |
| A | 92,2% | 93,0% | 90,4% | |
| B | 93, 3% | 93,4% | 86,5% | |
| C | 93, 2% | 93, 0% | 90,4% | |
| MS11 | 91, 1% | 86, 8% | 91,4% |
A táblázat felső negyedében szereplő számok (félkövéren szedve) a találmány szerinti különböző hemoglobinreceptor-gének közötti nukleinsav szekvencia homológiát jelzik, míg az alsó negyed számai a különböző hemoglobin-receptor fehérjék közötti aminosav szekvencia homológiát reprezentálják.
Mind a négy Neisseria fajból származó hemoglobinreceptor fehérje nagyfokú homológiát mutatott a csoport többi tagjával. A hemoglobin-receptor fehérjék közötti homológra 87 százaléktól (N. gonorrhoeae MS11A és N. meningitidis B szerotípus között) 93 százalékig változott (N. meningitidis B és C szerotípus között), (11. ábra). Az összehasonlítás szerint mind a négy receptor aminosav szekvenciája 84,7 százalékban azonos és 11,6 százalékban hasonló (ti. az aminosav szekvencián belül a homológ helyeket kémiailag hasonló aminosavak töltik be) . A megváltozott aminosavak az aminosav szekvencia olyan régióiban csoportosulnak, amelyek a hemoglobin-receptor fehérje előrejelezhe72 • · · · tő térszerkezetében a külső hurkokat alkotják.
Felhívjuk a figyelmet arra, hogy a megelőzőekben ismertetettek csupán a találmány egyes speciális megvalósítási módjait emelik ki és a fentiekkel egyenértékű módosítások illetve változtatások nem térnek el a találmányi gondolattól és a csatolt szabadalmi igénypontok által meghatározott igényelt oltalmi körön belülinek tekintendők.
Claims (23)
- SZABADALMI IGÉNYPONTOK1. Izolált és tisztított rekombináns nukleinsav, amely a Neisseria fajból származó hemoglobin-receptor fehérjét kódol.
- 2. Az 1. igénypont szerinti izolált és tisztított rekombináns nukleinsav, amely 2., 4., 6. vagy 8.azonosítószámú aminosav szekvenciájú hemoglobin-receptor fehérjét kódol.
- 3. Neisseria fajból származó hemoglobin-receptor fehérje homogén preparátuma.
- 4. A 3. igénypont szerinti hemoglobin-receptor fehérjepreparátum, amely 2., 4., 6. vagy 8. azonosítószámú aminosav szekvenciájú fehérjét tartalmaz.
- 5. Rekombináns expressziós konstrukció, amely Neisseria fajból származó hemoglobin-receptor fehérjét kódoló nukleinsavat tartalmaz.
- 6. Az 5. igénypont szerinti rekombináns expressziós konstrukció, amely 2., 4., 6. vagy 8. azonosítószámú aminosav szekvenciájú fehérjét kódoló nukleinsavat tartalmaz.
- 7. Transzformált sejttenyészet, amely 5. vagy 6. igénypont szerinti rekombináns expressziós konstrukciót tartalmaz.
- 8. Antitest vagy ennek antigénkötő fragmense, amely immunológiailag reaktív a Neisseria fajból származó hemoglobin-receptor fehérje epitópjával.egy antigénként viselkedőΊ4
- 9. A 8. igénypont szerinti antitest vagy antigénkötő fragmens, amely immunológiailag 2., 4., 6. vagy 8. azonosítószámú aminosav szekvenciájú fehérjével vagy annak antigénként viselkedő epitópjavai szemben reaktív.
- 10. A 8. vagy a 9. igénypont szerinti antitest vagy annak antigénkötó fragmense, amelyek monoklonális eredetűek.
- 11. Neisseria fajból származó hemoglobin-receptor fehérje antigénként viselkedő epitópja.
- 12. A 11. igénypont szerinti antigénként viselkedő epitóp, amely 2., 4., 6. vagy 8. azonosítószámú aminosav szekvenciájú hemoglobin-receptor fehérjéből származik.
- 13. Diagnosztikai reagens emberek Neisseria fajba tartozó baktérium által okozott betegségi állapotának kimutatására, amely 8., 9. vagy 10. igénypont szerinti antitestet vagy 1. illetve 2. igénypont szerinti nukleinsavat tartalmaz .
- 14. Terápiás hatású anyag Neisseria fajba tartozó baktérium által okozott emberi betegségek kezelésére, amely: 1. vagy 2. igénypont szerinti nukleinsavat vagy annak antiszensz homológját; vagy a hemoglobin-receptort kódoló nukleinsavat antiszensz irányításban expresszáló 5. vagy 6. igénypont szerinti rekombináns expressziós konstrukciót vagy ennek homológját; vagy 8., 9. vagy 10. igénypont szerinti antitestet vagy ennek antigénkötő fragmensét tartalmazza .
- 15. Sejtvonal amely 8., 9. vagy 10. igénypont szerinti monoklonális antitestet termel.• · ·
- 16. A 14. igénypont szerinti terápiás hatású anyag alkalmazása Neisseria fajhoz tartozó baktérium okozta emberi megbetegedés kezelésére szolgáló gyógyszerkészítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy a 14. igénypont szerinti terápiás hatású anyagot egy farmakológiailag elfogadott hordozóval keverjük össze.
- 17. Eljárás a Neisseria fajhoz tartozó baktérium okozta emberi megbetegedés diagnosztizálására, azzal jellemezve, hogy kimutathatóan megjelölt 13. igénypont szerinti diagnosztikai reagens adott mennyiségét emberből származó biológiai mintával érintkeztetjük a diagnosztikai reagens Neisseria fajhoz tartozó baktériumhoz történő specifikus kötődésére alkalmas körülmények között, majd mérjük a reagens biológiai mintához történő specifikus kötődésiét.
- 18. Vakcina emberek Neisseria fajokba tartozó baktériumok okozta fertőzés elleni hatékony immunizálására, amely hemoglobin kötő fehérjét, vagy ennek antigénként viselkedő fragmensét tartalmazza.
- 19. A 18. igénypont szerinti vakcina, amely 3. vagy 4. igénypont szerinti hemoglobin-receptor fehérjét, vagy annak11. vagy 12. igénypont szerinti, antigénként viselkedő epitópját tartalmazza.
- 20. A 18. igénypont szerinti vakcina, amely Neisseria fajok hemoglobin-receptor fehérjéjét vagy annak antigénként viselkedő fragmensét kódoló nukleinsavat tartalmaz.
- 21. A 20. igénypont szerinti vakcina, amely 1., 2., 5. vagy a 6. igénypont szerinti nukleinsavat tartalmaz.
- 22. A 18. igénypont szerinti vakcina, amely 7. igénypont szerinti transzformált sejttenyészet sejtjeit tartalmazza, adott esetben legyengített formában.
- 23. A 22. igénypont szerinti vakcina, amely Salmonella sejteket tartalmaz.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US08/326,670 US5698438A (en) | 1994-10-18 | 1994-10-18 | Bacterial hemoglobin receptor gene |
| US08/537,361 US6121037A (en) | 1994-10-18 | 1995-10-02 | Bacterial hemoglobin receptor genes |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HUT77048A true HUT77048A (hu) | 1998-03-02 |
Family
ID=26985503
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU9701963A HUT77048A (hu) | 1994-10-18 | 1995-10-17 | Neisseria-eredetű hemoglobin-receptorok |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US6121037A (hu) |
| JP (1) | JPH10508469A (hu) |
| AU (1) | AU705509B2 (hu) |
| CA (1) | CA2203116A1 (hu) |
| FI (1) | FI971634A (hu) |
| HU (1) | HUT77048A (hu) |
| NO (1) | NO971768L (hu) |
| WO (1) | WO1996012020A2 (hu) |
Families Citing this family (18)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ES2279511T3 (es) * | 1994-02-09 | 2007-08-16 | Epitopix Llc | Inmunizacion activa utilizando una proteina receptor de sideroforo. |
| US5830479A (en) * | 1994-02-09 | 1998-11-03 | Willmar Poultry Company, Inc. | Active immunization using a siderophore receptor protein |
| US6121037A (en) | 1994-10-18 | 2000-09-19 | Stojiljkovic; Igor | Bacterial hemoglobin receptor genes |
| FR2751000B1 (fr) | 1996-07-12 | 1998-10-30 | Inst Nat Sante Rech Med | Adn specifiques des bacteries de l'espece neisseria meningitidis, leurs procedes d'obtention et leurs applications biologiques |
| US6914131B1 (en) | 1998-10-09 | 2005-07-05 | Chiron S.R.L. | Neisserial antigens |
| EP1900818A3 (en) * | 1997-11-06 | 2008-06-11 | Novartis Vaccines and Diagnostics S.r.l. | Neisserial antigens |
| GB9808866D0 (en) * | 1998-04-24 | 1998-06-24 | Smithkline Beecham Biolog | Novel compounds |
| GB9810276D0 (en) * | 1998-05-13 | 1998-07-15 | Smithkline Beecham Biolog | Novel compounds |
| FR2785293B1 (fr) * | 1998-10-30 | 2002-07-05 | Pasteur Merieux Serums Vacc | Acides nucleiques et polypeptides specifiques des souches pathogenes du genre neisseria |
| WO2000042193A1 (en) * | 1999-01-15 | 2000-07-20 | Smithkline Beecham Biologicals S.A. | Neisseria meningitidis antigen |
| EP2163628A3 (en) | 1999-03-12 | 2010-06-02 | GlaxoSmithKline Biologicals S.A. | Neisseria meningitidis antigenic polypeptides, corresponding polynucleotides and protective antibodies |
| GB9911683D0 (en) * | 1999-05-19 | 1999-07-21 | Chiron Spa | Antigenic peptides |
| ES2543736T3 (es) * | 1999-10-29 | 2015-08-21 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Péptidos antigénicos de Neisseria |
| GB0011108D0 (en) * | 2000-05-08 | 2000-06-28 | Microscience Ltd | Virulence gene and protein and their use |
| NZ526786A (en) * | 2001-01-03 | 2006-02-24 | Willmar Poultry Co Inc | Methods for removal of lipopolysaccharides (LPS) from vaccines for non-human animals |
| US8329192B2 (en) | 2003-09-19 | 2012-12-11 | Epitopix Llc | Campylobacter polypeptides and methods of use |
| CN102300585A (zh) * | 2008-12-17 | 2011-12-28 | 诺华有限公司 | 包含血红蛋白受体的脑膜炎球菌疫苗 |
| US10166280B2 (en) | 2016-06-08 | 2019-01-01 | Epitopix, Llc | Polypeptides and immunizing compositions containing Bacillus polypeptides and methods of use |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4683195A (en) * | 1986-01-30 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences |
| US4683202A (en) | 1985-03-28 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying nucleic acid sequences |
| US5223409A (en) * | 1988-09-02 | 1993-06-29 | Protein Engineering Corp. | Directed evolution of novel binding proteins |
| US5304487A (en) | 1992-05-01 | 1994-04-19 | Trustees Of The University Of Pennsylvania | Fluid handling in mesoscale analytical devices |
| US6121037A (en) | 1994-10-18 | 2000-09-19 | Stojiljkovic; Igor | Bacterial hemoglobin receptor genes |
-
1995
- 1995-10-02 US US08/537,361 patent/US6121037A/en not_active Expired - Fee Related
- 1995-10-17 JP JP8513482A patent/JPH10508469A/ja active Pending
- 1995-10-17 WO PCT/US1995/013623 patent/WO1996012020A2/en not_active Application Discontinuation
- 1995-10-17 HU HU9701963A patent/HUT77048A/hu unknown
- 1995-10-17 CA CA002203116A patent/CA2203116A1/en not_active Abandoned
- 1995-10-17 AU AU40073/95A patent/AU705509B2/en not_active Ceased
-
1997
- 1997-04-17 FI FI971634A patent/FI971634A/fi unknown
- 1997-04-17 NO NO971768A patent/NO971768L/no not_active Application Discontinuation
-
2000
- 2000-09-19 US US09/665,358 patent/US7026157B1/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| FI971634A0 (fi) | 1997-04-17 |
| AU705509B2 (en) | 1999-05-27 |
| NO971768L (no) | 1997-06-03 |
| US7026157B1 (en) | 2006-04-11 |
| WO1996012020A2 (en) | 1996-04-25 |
| AU4007395A (en) | 1996-05-06 |
| NO971768D0 (no) | 1997-04-17 |
| US6121037A (en) | 2000-09-19 |
| JPH10508469A (ja) | 1998-08-25 |
| FI971634A (fi) | 1997-06-16 |
| WO1996012020A3 (en) | 1996-05-23 |
| CA2203116A1 (en) | 1996-04-25 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR100802198B1 (ko) | 신규한 스트렙토코커스 항원 | |
| HUT77048A (hu) | Neisseria-eredetű hemoglobin-receptorok | |
| Burnette et al. | Direct expression of Bordetelia pertussis toxin subunits to high levels in Escherichia coli | |
| JP2016054739A (ja) | 分類不能型インフルエンザ菌の中耳炎単離物の遺伝子 | |
| JPH11137267A (ja) | 新規化合物 | |
| KR20090071551A (ko) | 면역원성 ｐｃｐａ 폴리펩티드 및 이의 용도 | |
| WO1996012020A9 (en) | Hemoglobin receptors from neisseriae | |
| PT728200E (pt) | Genes de receptores de transferrina de haemophilus | |
| US5698438A (en) | Bacterial hemoglobin receptor gene | |
| RU2252224C2 (ru) | Пептид со свойствами антигена neisseria meningitidis, кодирующий его полинуклеотид, вакцина для лечения или предотвращения заболеваний или состояний, вызванных neisseria meningitidis, (варианты), антитело, связывающееся с указанным пептидом | |
| JP4302784B2 (ja) | アデニルシクラーゼ − ヘモリジン（ＡＣ−Ｈｌｙ）の防護エピトープ、およびそのボルデテラ菌感染の治療もしくは予防への応用 | |
| US20040096973A1 (en) | Environmentally regulated genes of Streptococcus suis | |
| US5731151A (en) | Regulator of contact-mediated hemolysin | |
| US6277382B1 (en) | Hemoglobin receptors from neisseriae | |
| JPH11266880A (ja) | 新規ｄｂｐＡ | |
| JPH11192091A (ja) | ＳｅｃＡ | |
| JP2000000098A (ja) | 新規ｅｒａ | |
| JPH11337548A (ja) | 新規ＤｂｐＢ | |
| JP2002517199A (ja) | モラクセラ・カタラーリス（Ｍｏｒａｘｅｌｌａｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）由来のＢＡＳＢ０２７タンパク質およびＢＡＳＢ０２７遺伝子、抗原、抗体、ならびに使用 | |
| JPH11253170A (ja) | ＦｔｓＹ | |
| JPH11137277A (ja) | 新規ｇｒｅＡ | |
| JP3516688B2 (ja) | トランスフェリン受容体遺伝子 | |
| JPH11318469A (ja) | 新規ｆｏｌＣ | |
| JPH11253175A (ja) | 新規ｐｈｏＨ | |
| JPH11262392A (ja) | 新規ＭｕｒＥ |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| DFD9 | Temporary protection cancelled due to non-payment of fee |