CN101892248A

CN101892248A - 禽流感h5ha抗原的单克隆抗体

Info

Publication number: CN101892248A
Application number: CN 201010158886
Authority: CN
Inventors: 王世霞; 张春华; 张璐; 黄祖瑚; 卢山
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2010-04-29
Filing date: 2010-04-29
Publication date: 2010-11-24
Anticipated expiration: 2030-04-29
Also published as: CN101892248B

Abstract

本发明属于生物技术领域，公开了禽流感H5HA抗原的单克隆抗体。本发明提供了序列为SEQ ID NO.1的密码子优化的H5-VN HA基因，并利用该序列通过DNA免疫制备了禽流感H5-VN HA抗原的单克隆抗体3B2IIG8F6和4B10IIH4G12，以及分泌这两种单抗的杂交瘤细胞CGMCC No.3648和CGMCC No.3649。本发明所提供的密码子优化的H5-VN HA基因将可以提高HA基因的表达。此外，序列优化也使得mRNA更稳定，基因更易于进行转录和翻译。本发明制备得到的H5HA抗原的单克隆抗体，为禽流感病毒的研究和临床应用提供有利的工具。

Description

禽流感H5HA抗原的单克隆抗体

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及禽流感H5HA抗原的单克隆抗体，具体涉及通过DNA免疫制备禽流感H5HA抗原的单克隆抗体以及生成该抗体的杂交瘤细胞系。

背景技术

DNA免疫是近年发展起来的一种新型抗体制备法。DNA免疫克服了传统蛋白质免疫方法的缺陷，能更为有效地激活机体的体液和细胞免疫应答。尤其是在仅知DNA编码而不能获得目的蛋白，或获得的蛋白为低免疫性的情况下，蛋白免疫很难得到特异性的抗体，但通过DNA免疫可制备高效价特异性的抗体，这为单抗制备提供了一种简单易行的方法。同时DNA免疫制备单抗可以获得线性表位和构象表位，而往往具有中和抗体活性的是构象表位，DNA免疫制备单抗为疾病的诊断和治疗提供新的思路。

目前制备禽流感HA蛋白的单克隆抗体主要是通过免疫灭活病毒或免疫纯化的HA蛋白，但这两种方法均有一定的缺陷。免疫灭活病毒一方面需要获得活的病毒，限制了研究范围；同时变性灭活过程对抗原构象会造成损害，免疫后获得的功能性抗体减少。免疫纯化的HA蛋白需要繁琐的蛋白纯化过程，而且纯化过程也造成蛋白变性失活，原核表达的HA蛋白免疫后获得的多为无功能的抗体。DNA免疫制备禽流感HA蛋白的单克隆抗体则很好的避免了这些缺陷，DNA免疫因为存在体内抗原表达和递呈的过程，所以它最接近活病毒感染机体免疫反应过程并且很完整保存了抗原构象，能获得多种特性的单克隆抗体。但是，由于DNA免疫利用宿主的转录和翻译体系，而自然界生物体存在密码子的偏好性，从病原体来源的基因克隆在异源宿主体内可能难以有效表达，因此就不能有效的刺激宿主的免疫系统，使之产生较好的免疫应答。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术存在的缺陷提供一种密码子优化的H5-VN HA基因序列。

本发明的另一目的是提供利用此基因通过DNA免疫制备的单克隆抗体。

本发明的又一目的是提供分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞系。

本发明的目的通过如下技术方案实现：

密码子优化的H5-VN HA基因，序列为SEQ ID NO.1。

一种分泌抗H5-VN HA单克隆抗体的杂交瘤细胞系，保藏号为CGMCC No.3648。

其中，所述的杂交瘤细胞系是由序列为SEQ ID NO.1的密码子优化的H5-VN HA基因通过DNA免疫，经常规的细胞融合、筛选及单克隆化得到的。

所述的DNA免疫是将序列为SEQ ID NO.1的基因装入pJW4303载体中，构建成密码子优化的H5-VN HA基因的DNA疫苗，用该DNA疫苗免疫小鼠。

一种禽流感H5-VN HA抗原的单克隆抗体，由所述的保藏号为CGMCC No.3648的杂交瘤细胞系产生。

一种分泌抗H5-VN HA单克隆抗体的杂交瘤细胞系，保藏号为CGMCC No.3649。

其中，所述的杂交瘤细胞系是由序列为SEQ ID NO.1的密码子优化的H5-VN HA基因通过DNA免疫，经常规的细胞融合、筛选及单克隆化得到的，

一种禽流感H5-VN HA抗原的单克隆抗体，由保藏号为CGMCC No.3649的杂交瘤细胞系产生。

本发明以H5N1亚型禽流感病毒A/Viet Nam1203/04株HA(H5-VN HA)基因序列为研究模板，对该序列进行密码子优化处理，设计得到H5-VN HA基因序列SEQ ID NO.1，并将该优化后的序列装入pJW4303载体中，构建一密码子优化的H5-VN HA基因的DNA疫苗。用该DNA疫苗通过电穿孔免疫小鼠，经过常规细胞融合、筛选及单克隆化，建立稳定分泌抗H5-VN HA单克隆抗体的杂交瘤细胞株，经ELISA、免疫印迹等方法的鉴定，杂交瘤细胞所分泌的单克隆抗体能够特异性识别H5-VN HA蛋白，且其中2株杂交瘤细胞株分泌的抗体具有中和抗体活性。这对禽流感的诊断，治疗及疫苗制备等具有重要意义。

本发明的有益效果：

1、本发明所提供的密码子优化的H5-VN HA基因将HA基因中不常用的密码子换为哺乳动物细胞偏爱的密码子，可以提高HA基因的表达。此外，序列优化也使得mRNA更稳定，基因更易于进行转录和翻译。

2、本发明利用人工合成的遗传密码子优化后的HA基因构建DNA疫苗，并将其免疫动物以获得单克隆抗体，这一手段避免了直接接触高致病性H5毒株，也无须制备大量用于免疫动物及研究免疫反应的HA抗原，为H5亚型禽流感HA抗原免疫原性和交叉反应的研究提供一种有效的工具。

3、本发明制备得到的H5HA抗原的单克隆抗体，为禽流感病毒的研究和临床应用提供有利的工具：

(1)H5-VN HA单克隆抗体可以用来研究HA抗原表位；

(2)利用该抗体分析表位，为禽流感表位疫苗的研究提供了物质基础；

(3)可以研究该抗体对其它H5亚型交叉保护性，获得具有广谱中和活性的单克隆抗体；

(4)利用该抗体作为试剂盒可以诊断禽流感病毒的感染；

(5)利用该抗体可进行动物实验研究；

(6)对该抗体进行人源化改造可以用来治疗人感染禽流感病毒。

生物材料保藏信息

1、杂交瘤细胞株SP2/0(3B2IIG8F6)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.3648，保藏日为2010年3月09日。

2、杂交瘤细胞株SP2/0(4B10IIH4G12)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.3649，保藏日为2010年3月09日。

附图说明

图1野生型和密码子优化H5-VN HA基因在哺乳动物细胞表达的偏好的比较(指数＞1为哺乳动物细胞所偏好)，纵坐标表示偏好指数，横坐标表示核苷酸序列位置。

图2HA-VN.tPA的Western blot分析结果

1.pJW4303转染293T细胞的上清，2.pJW4303转染293T细胞的细胞裂解液，3.H5-VN.tPA转染293T细胞的上清，4.H5-VN.tPA转染293T细胞的细胞裂解液。

图3单克隆抗体与H5-VN HA蛋白结合情况的Western Blot免疫印迹检测结果a为单抗3B2G8F6 Western Blot免疫印迹检测结果，b为单抗2C10D2E6 Western Blot免疫印迹检测结果，c为单抗4B10H4G12 Western Blot免疫印迹检测结果。

具体实施方式

实施例1.H5-VN HADNA疫苗的构建

用MacVector 7.2软件分析Influenza A virus(A/Viet Nam/1203/2004(H5N1)(按已发表基因库资料)，发现源自A/VietNam1203/04的HA基因喜爱使用的密码子与哺乳动物细胞自身基因所喜爱使用的密码子有很大不同，因而设计了密码子优化后的H5-VN HA基因，序列为SEQ ID NO.1。密码子优化后H5-VN HA基因中哺乳动物细胞偏爱的密码子频率高于野生型H5-VN HA基因(图1)。该DNA序列较之野生型有所变化，但HA蛋白质氨基酸序列不变。将设计好的序列交德国geneart公司合成，装入质粒pUC18，构建成重组质粒pUC18/H5-VN。经测序证实合成的序列正确。

根据以往的研究结果，与HA蛋白自身的信号肽相比，人组织纤维蛋白溶酶原激活剂(human tissue plasminogen activator，tPA)信号肽更易于提高蛋白在细胞中的表达，因此本发明以tPA信号肽取代H5-VN HA蛋白信号肽，tPA信号肽基因已包含在pJW4303质粒中，人工合成的但不包括原始信号肽的HA基因片段经PCR扩增后被连接在tPA信号肽基因下。设计引物，在引物两端分别引入Nhe I和BamH I酶切位点，以pUC18/H5-VN为模板PCR扩增纯化出经密码子优化的H5-VN HA后，经Nhe I和BamH I双酶切消化的H5-VN HA基因和pJW4303质粒连接构建成重组表达质粒pJW4303/H5-VN HA，将此替换信号肽后的重组质粒命名为HA-VN.tPA，即用于本实验的HA基因DNA疫苗。

PCR引物分别为：上游引物SEQ ID NO.3及下游引物SEQ ID NO.4，以重组质粒pUC18/H5-VN为模板，PCR扩增。反应条件是：94℃4min，94℃1min、56℃1min、72℃1.5min共25个循环，72℃7min。反应体系如下：

	unit(ul)
		DNA Template	0.5
Primer 1(10pmol/ul)	4
		Primer 2(10pmol/ul)	4
25mM MgSO4	6

2.5mM dNTP	6
		10X Buffer(Vent)	6
Vent DNA polymerase	2
		H2O	31.5
total	60

PCR后连入质粒pJW4303的H5-VN HA基因序列为：SEQ ID NO.2。

重组质粒经酶切鉴定正确。质粒的大量提取和纯化均严格按照QIAGEN Plasmid MegaKit使用说明书操作。

实施例2.细胞转染

293T细胞用含10％胎牛血清的含双抗DMEM高糖培养基37℃，5％CO₂饱和湿度培养箱内培养至对数生长期，用2.5g/L胰酶消化后，以1.0×10⁶个细胞(6mL)接种于60mm培养皿中，待生长至80％融合时开始转染。依据PEI转染方法进行细胞转染，取PEI 50μL，加入到930μL含双抗DMEM高糖培养基中，另取8.0μg H5-VN HA重组质粒HA-VN.tPA加入到上述培养液中，轻轻混匀，室温，孵育15min，然后将1ml PEI/DNA复合物加到培养瓶中并轻轻摇动使混合均匀，同时以pJW4303空质粒转染细胞作为阴性对照，10h后可更换不含血清含双抗的DMEM培养液。继续培养72h后进行Western blot分析。蛋白质印迹法分析结果显示，转染HA-VN.tPA的293T细胞的细胞裂解液中可检出相对分子质量85000、60000、25000左右的目的条带，分别为HA蛋白前体(HA0)、蛋白酶降解后的HA1和HA2亚单位(图2)

转染细胞收获：吸取细胞上清液，2500rpm，室温，离心10min，吸取上清-20℃冻存。用PBS(浓度10mM，pH7.2)将细胞从培养皿中洗脱，收集细胞悬液，2500rpm，室温，离心10min，弃上清，加入裂解液(50mM Tris-HCl Ph7.6，150mM NaCl，1％Triton，用前加入2％100mM PMSF(苯甲基磺酰氟))，冰上孵育20min，12000rpm，4℃，离心60min，收集上清液，-20℃冻存。

实施例3.杂交瘤细胞系的建立

步骤1：动物免疫

用实施例1制备的HA-VN.tPA疫苗免疫7只Balb/c小鼠。肌肉注射结合活体基因导入方式免疫，保证针头插入深度2mm，注入疫苗，观察注射局部隆起，注射后立即于注射部位用WJ-2002活体基因导入仪进行体内电转染(技术参数：电压50V，脉冲次数正反各3次，波宽60ms，频率30Hz)，以小鼠腿部肌肉发生抖动视为电转染有效。于第0、2、4、8周进行4次DNA免疫，第4次DNA免疫后采用腹腔注射H5-VN.tPA转染293T细胞，每只小鼠注射5x10⁶-1x10⁷cells。

步骤2：细胞融合

细胞加强免疫4天后，摘除免疫小鼠眼睛放血，留取血清作为ELISA的阳性对照。拉颈处死小鼠，75％酒精浸泡5min。在小鼠腹部剪一小口，撕开皮肤，剪开腹膜，镊取小鼠脾脏，剪下小鼠脾脏，除去脂肪和结缔组织，用RPMI 1640不完全培养基洗涤小鼠脾脏。将小鼠脾脏剪成4块，在不锈钢筛网(100目/cm²)上，用玻璃注射器针芯充分研磨小鼠脾脏，轻轻挤压出脾细胞。将研磨液经过不锈钢筛网(200目/cm²)过滤后，转移至离心管，1000rpm离心5min，弃上清。RPMI 1640不完全培养基洗涤细胞一次，再用RPMI 1640不完全培养基充分重悬细胞，进行细胞计数，置于孵育箱(37℃、5％CO₂)中待用。充分混匀免疫脾细胞10⁸个(25ml无血清培养基)和小鼠骨髓瘤SP2/0细胞(购自上海细胞所)2x10⁷个(25ml无血清培养基)悬液，200-400g离心5-10min，用吸管尽可能吸取上清，以免稀释PEG.。手指轻弹离心管使细胞沉淀较为松动，将离心管置于37℃水浴中，融合过程中离心管一直置于水浴中，1分钟内使用吸管将1ml 37℃水浴中预热的50％PEG1500加入到细胞沉淀中，边加边适度搅拌，加完后继续搅拌1-2min.1分钟内加1ml37℃水浴中预热的培养基到融合混合物中，如上述搅拌。3分钟内加3ml预热的培养基，持续搅拌，然后缓慢的加入10ml预热的培养基，离心沉淀细胞，弃上清，用选择性培养基(RPMI 1640，10％FBS，1x Glutamine/Pen/Strep，1xHAT medium)重悬细胞沉淀，按100μl/孔加入到96孔培养板，置于细胞孵育箱(37℃、5％CO₂)中培养。在融合后第5和第7天更换新鲜培养基，在第7天或第10天检测抗体分泌情况。

步骤3：间接酶联免疫吸附试验(ELISA)筛选阳性杂交瘤细胞

1)用HA-VN.tPA转染293T细胞的上清(1∶10稀释)作为抗原包被ELISA板(使用PBSpH7.2-7.4作为包被液)，每孔100μl，4℃，过夜。

2)弃包被液，用1XPBST洗板5次(PBST构成为10mMPBS和0.05％Tween-20)。

3)5％脱脂奶粉(PBS，0.05％Tween-20，5％脱脂奶粉)37℃，封闭1h，每孔200μl。

4)弃封闭液，用1XPBST洗板5次。

5)一抗为待检测融合细胞上清，每孔加入100μl，37℃，孵育1h。

6)弃一抗，用1XPBST洗板5次。

7)生物素标记的羊抗鼠IgG(浓度为1mg/ml，1∶1000)，每孔加入100μl，37℃，孵育1h。(二抗稀释液：4％乳清蛋白，0.5％Tween-20，PBS)。

8)弃二抗，用1XPBST洗板5次。

9)HRP标记链亲和素(浓度为1mg/ml，1∶2000)，每孔加入100μl，37℃，孵育1h。(稀释液：4％乳清蛋白，0.5％Tween-20，PBS)。

10)弃HRP标记链亲和素，用1XPBST洗板5次。

11)TMB显色(100ul/well)，室温，3.5min，50ul/well 1M的H₂SO₄终止显色。

12)酶标仪测定并记录各孔A450值。

步骤4：阳性杂交瘤细胞的克隆化-采用有限稀释法

将细胞悬液移至刻度离心管中连续倍数稀释。例如，先制备5x10³细胞悬液，将此细胞悬液经100倍稀释，即为50细胞/ml；再将50细胞/ml的细胞悬液经5倍稀释，即为10细胞/ml，最后将10细胞/ml的细胞悬液经2倍稀释，即为5细胞/ml。将3种稀释好的细胞悬液分别接种于96孔板中，每孔加100ul，。50细胞/ml加到A，B，C三排，细胞数为10个/ml加D、E、F三排。细胞数5个/ml，加G、H两排。约10天后检测抗体，筛选出抗体阳性最强的单克隆细胞。然后，再进行亚克隆培养，改用RPMI 1640完全培养基，直到所有含单个克隆的微孔均为抗体阳性为止，即获得单抗分泌株，大量扩增并冻存，长期传代培养后，以相同的方法再次克隆化鉴定，从何获得了3株稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株，分别为3B2G8F6、4B10H4G12和2C10D2E6，保藏待用。

实施例4体外培养法制备单抗

将实施例3建立的阳性杂交瘤细胞3B2G8F6、4B10H4G12和2C10D2E6在24孔板中扩大培养，待细胞长至80％融合时，停止换液，持续培养直至细胞全部死亡。收集培养上清1500rpm，离心10min，上清含有高浓度的单克隆抗体，-70℃保存备用。

实施例5单抗特性鉴定

步骤1：克隆抗体IgG亚型鉴定

取3株杂交瘤细胞培养上清，按照小鼠单克隆抗体同型检测试剂盒操作说明(HBT公司)进行操作。具体方法如下：

(1)加500ul缓冲液至检测管中；

(2)加500ul杂交瘤细胞培养上清至检测管中；

(3)完全浸润试纸条，并轻轻摇动；

(4)加入1ml大鼠抗小鼠κ链底物至检测管中，试纸条打印面朝下，与液体充分接触，轻轻摇动直至试纸条上出现两条带；

结果表明：3B2G8F6、2C10D2E6为IgG1，κ轻链免疫球蛋白；4B10H4G12为IgG2b，κ轻链免疫球蛋白。

步骤2：单克隆抗体的纯化

利用GE HiTrap protein A抗体纯化柱(5ml柱)进行单抗纯化，具体操作如下：

(1)将注射器中充满结合缓冲液，除去堵头并将注射器一滴一滴的连接在柱子上(使用提供的连接接头)，以避免出现气泡；

(2)除去柱子底部出口的堵头；

(3)使用至少5倍柱体积的结合缓冲液平衡柱子；

(4)使用注射器将样品上到柱子上去，为了获得良好的结果，推荐的流速为0.5～5ml/min；

(5)以7倍柱体积的缓冲液冲洗柱子，或直到没有物质从柱子中流出。在冲洗时保持流速为10ml/min。

(6)以10ml洗脱缓冲液洗脱蛋白，在洗脱时，保持流速为5ml/min。

(7)洗脱完毕后，用5倍的结合缓冲液冲洗柱子，这样柱子可以用于新的一轮纯化过程。

步骤3：单克隆抗体稳定性的测定

复苏杂交瘤细胞，收集不同传代次数的细胞上清，并用ELISA方法检测其效价。结果表明获得3株杂交瘤细胞株能够稳定的产生单克隆抗体。

步骤4：单克隆抗体的反应性

5.1间接ELISA方法(同实施例3步骤3)检测所获得单克隆抗体与H5-VN HA抗原反应的情况

ELISA结果表明，3株杂交瘤细胞株产生的单抗均能与HA抗原发生强烈的结合反应。

5.2Western Blot免疫印迹检测3株单克隆抗体与H5-VN HA蛋白的结合情况

(1)H5-VN HA DNA疫苗转染293T细胞的裂解液及上清，pJW4303转染293T细胞的裂解及上20ul，加入5x上样缓冲液5μl，100℃，煮沸10min；

(2)首先制备15％的分离胶(7.5ml 30％丙烯酰胺溶液，3.7ml 1MTris/Cl pH8.8，150μl10％SDS，150μl 10％过硫酸氨，6μl TEMED)，灌胶，液面顶端加入水，室温下聚合30min；

(3)倒弃水，再制备5％的积层胶(960μl 30％丙烯酞胺溶液，740μl 1MTris/Cl PH6.8，60μl10％SDS，60μl 10％过硫酸氨，5μl TEMED)，在积层胶上插入梳齿，待胶完全凝聚后，拔下梳齿；

(4)将上述处理好的样品加入15％胶中进行电泳，20mA，1h，40mA，2h；

(5)胶上的蛋白转到PVDF膜上，100v，1h；

(6)转好的膜用5％脱脂奶粉封闭，37℃，1h；

(7)用1xPBST洗膜两次；

(8)将膜浸在1∶500稀释的血清中，4℃，过夜；

(9)弃掉血清，用1xPBST洗膜6次，每次10min；

(10)弃掉洗液，加入1∶10000稀释HPR标记的羊抗小鼠IgG，37℃，1h；

(11)弃掉二抗，用1xPBST洗膜6次，每次10min；

(12)发光剂加到膜上，暗室显影。

Western Blot结果表明，其中杂交瘤细胞株3B2G8F6和2C10D2E6分泌的单抗能识别变性的HA蛋白，4B10H4G12分泌的单抗不能识别变性的HA蛋白(结果见图3)。

实施例6单克隆抗体与不同来源HA抗原交叉反应

步骤1：ELISA检测

参照实施例3步骤3，选择H1，H3，H7，H9，H5(包括BJ，HK，Anhui，Ind)HA抗原，看3株单抗与它们的交叉反应。结果如下：

	单抗3B2IIG8F6	单抗4B10IIH4G12	单抗2C10IID2E6
				H1-NewCal20/99	-	-	-
H3-Panama2007/99	-	-	-
				H7-HA-NL219	-	-	-
H9-HA-HK1703	-	-	-
				H5-Indonesia-5/05	-	+	+
H5-Anhui-1/05	-	+	+

H5-HK156/97	+	+	+
				H5-VN1203/04	+	+	+

注：“+”表示反应为阳性，“-”表示反应为阴性。

结果表明，3株单抗均与H1，H3，H7，H9反应为阴性，而其中单抗4B10IIH4G12和单抗2C10IID2E6与H5反应均为阳性，单抗3B2IIG8F6仅与自身抗原还有H5-HK HA反应为阳性，说明这3株单抗具有亚型特异性，这可用来制备禽流感H5亚型诊断试剂盒，为禽流感病毒感染的快速诊断提供可能。

步骤2：假病毒技术检测交叉反应

利用假病毒技术检测3株单抗与其它H5亚型病毒之间的中和抗体活性，具体步骤参照实施例6，结果如下：

结果表明4B10H4G12分泌的单抗具有广谱中和抗体活性，这对疫苗的制备还有HA抗原中和表位的研究具有重要意义。

实施例7单克隆抗体中和抗体活性检测

步骤1：制备H5-VN假病毒颗粒

(1)293T细胞接种到T-75细胞培养皿中，5x10⁶细胞/6ml完全培养基；

(2)第二天，293T细胞应达到75％单层，生长状态良好；

(3)应用三种质粒共同转染293T细胞，其中pNL 4-3.Luc.R-E-(13.43ug)、pHA(1.2ug)、pNA(300ng)，PEI是75ul。参照实施例2操作；

(4)转染后48小时收获培养液，0.45um滤器过滤，在滤液中加入FBS至20％浓度，分装后-80摄氏度冻存；

(5)应用荧光酶法检测TCID₅₀。

步骤2：检测单克隆抗体的中和抗体活性

(1)取空白96孔细胞培养板，梯度稀释培养上清(起始稀释度为1∶2)。Negative control指细胞培养基对照，还设有空细胞对照(293A细胞对照)、阳性对照和无关血清血清对照，每孔中加入100ul假型病毒(200TCID₅₀)，将96孔板放入细胞培养箱中，37℃1个小时，使病毒与培养上清充分反应；

(2)取100ul病毒与培养上清混合物加入到对应复孔中；

(3)将293A细胞胰酶消化，DMEM完全培养基洗涤，细胞计数，用DMEM完全培养基将细胞稀释至1x10⁵/ml，每孔加入1x10⁴个细胞/100ul；

(4)将96孔板放入细胞培养箱中，37℃，5％CO₂孵箱中培养；

(5)48hr后从细胞培养箱中取出96孔板，每孔吸弃100ul培养液，然后每孔加入100μlBright-GLo荧光素酶检测试剂(Promega)，反应至少2min；

(6)从每孔中吸出150μl液体，加于对应96孔白板中，于微孔板光度计读取发光值。

(7)计算抑制率＝[1-(样品组的发光强度值-空白对照值)/(阴性组的发光强度值-空白对照值)]×100％；

(8)根据Reed-Muench两氏法计算IC50。

实验结果如下：

单抗	IC50
		3B2G8F6	1∶35
4B10H4G12	1∶446
		2C10D2E6	-

注：“-”表示反应为阴性。

结果表明：其中杂交瘤细胞株3B2G8F6和4B10H4G12分泌的单抗具有中和抗体活性，2C10D2E6分泌的单抗不具有中和抗体活性。实施例5步骤2中纯化的抗体也进行中和抗体活性检测，结果表明纯化过程并未破坏抗体的活性，纯化后仍具有中和抗体活性。具有中和抗体活性，这对人用禽流感疫苗的开发具有重要的意义，同时可将这几种单抗进行人源化改造，这为人感染禽流感病毒的治疗提供很好的契机。将分泌单抗3B2G8F6、4B10H4G12的细胞株送交位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，杂交瘤细胞株3B2G8F6保藏号为CGMCC No.3648，保藏日期2010年3月9日，杂交瘤细胞株4B10H4G12保藏号为CGMCC No.3649。

序列表

<110>王世霞；张春华；张璐；黄祖瑚；卢山

<120>禽流感H5HA抗原的单克隆抗体

<160>4

<210>1

<211>1707

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>密码子优化的H5-VN HA基因序列

<400>1

atggaaaaga tcgtgctgct gttcgccatc gtgagcctgg tgaagagcga ccagatctgc 60

atcggctacc acgccaacaa cagcaccgag caggtggaca ccatcatgga aaagaatgtg 120

accgtgaccc acgcccagga catcctggaa aaaaagcaca acggcaagct gtgcgacctg 180

gacggcgtga agcccctgat cctgcgggac tgctccgtgg ccggctggct gctgggcaac 240

cccatgtgcg acgagttcat caacgtgccc gagtggagct acatcgtgga gaaggccaac 300

cccgtgaacg acctgtgcta ccccggcgac ttcaacgact acgaggaact gaagcacctg 360

ctgtcccgga tcaaccactt cgagaagatc cagatcatcc ccaagagcag ctggtccagc 420

cacgaggcca gcctgggcgt gagcagcgcc tgcccatacc agggcaagtc cagcttcttc 480

cggaacgtgg tgtggctgat caagaagaac agcacctacc ccaccatcaa gcggagctac 540

aacaacacca accaggaaga tctgctggtc ctgtggggca tccaccaccc caacgacgcc 600

gccgagcaga ccaagctgta ccagaacccc accacctaca tcagcgtggg caccagcacc 660

ctgaaccagc ggctggtgcc ccggatcgcc acccggtcca aggtgaacgg ccagagcggc 720

cggatggaat tcttctggac catcctgaag cccaacgatg ccatcaactt cgagagcaac 780

ggcaacttca tcgcccccga gtacgcctac aagatcgtga agaagggcga cagcaccatc 840

atgaagagcg agctggaata cggcaactgc aacaccaagt gccagacccc catgggcgcc 900

atcaacagca gcatgccctt ccacaacatc caccccctga ccatcggcga gtgccccaag 960

tacgtgaaga gcaacaggct ggtgctggcc accggcctgc ggaacagccc ccagcgggag 1020

cggcggagga agaagcgggg cctgttcggc gccatcgccg gcttcatcga gggcggctgg 1080

cagggcatgg tggacgggtg gtacggctac caccacagca atgagcaggg cagcggctac 1140

gccgccgaca aagagagcac ccagaaggcc atcgacggcg tcaccaacaa ggtgaacagc 1200

atcatcgaca agatgaacac ccagttcgag gccgtgggcc gggagttcaa caacctggaa 1260

cggcggatcg agaacctgaa caagaaaatg gaagatggct tcctggacgt gtggacctac 1320

aacgccgagc tgctggtgct gatggaaaac gagcggaccc tggacttcca cgacagcaac 1380

gtgaagaacc tgtacgacaa agtgcggctc cagctgcggg acaacgccaa agagctgggc 1440

aacggctgct tcgagttcta ccacaagtgc gacaacgagt gcatggaaag cgtgcggaac 1500

ggcacctacg actaccccca gtacagcgag gaagcccggc tgaagcggga ggaaatcagc 1560

ggcgtgaaac tggaaagcat cggcatctac cagatcctga gcatctacag caccgtggcc 1620

agcagcctgg ccctggccat catggtggcc ggcctgagcc tgtggatgtg cagcaacggc 1680

agcctccagt gccggatctg catctga 1707

<210>2

<211>1728

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR后连入载体pJW4303的密码子优化的H5-VN HA基因序列

<400>2

atggatgcaa tgaagagagg gctctgctgt gtgctgctgc tgtgtggagc agtcttcgtt 60

tcggctagcg accagatctg catcggctac cacgccaaca acagcaccga gcaggtggac 120

accatcatgg aaaagaatgt gaccgtgacc cacgcccagg acatcctgga aaaaaagcac 180

aacggcaagc tgtgcgacct ggacggcgtg aagcccctga tcctgcggga ctgctccgtg 240

gccggctggc tgctgggcaa ccccatgtgc gacgagttca tcaacgtgcc cgagtggagc 300

tacatcgtgg agaaggccaa ccccgtgaac gacctgtgct accccggcga cttcaacgac 360

tacgaggaac tgaagcacct gctgtcccgg atcaaccact tcgagaagat ccagatcatc 420

cccaagagca gctggtccag ccacgaggcc agcctgggcg tgagcagcgc ctgcccatac 480

cagggcaagt ccagcttctt ccggaacgtg gtgtggctga tcaagaagaa cagcacctac 540

cccaccatca agcggagcta caacaacacc aaccaggaag atctgctggt cctgtggggc 600

atccaccacc ccaacgacgc cgccgagcag accaagctgt accagaaccc caccacctac 660

atcagcgtgg gcaccagcac cctgaaccag cggctggtgc cccggatcgc cacccggtcc 720

aaggtgaacg gccagagcgg ccggatggaa ttcttctgga ccatcctgaa gcccaacgat 780

gccatcaact tcgagagcaa cggcaacttc atcgcccccg agtacgccta caagatcgtg 840

aagaagggcg acagcaccat catgaagagc gagctggaat acggcaactg caacaccaag 900

tgccagaccc ccatgggcgc catcaacagc agcatgccct tccacaacat ccaccccctg 960

accatcggcg agtgccccaa gtacgtgaag agcaacaggc tggtgctggc caccggcctg 1020

cggaacagcc cccagcggga gcggcggagg aagaagcggg gcctgttcgg cgccatcgcc 1080

ggcttcatcg agggcggctg gcagggcatg gtggacgggt ggtacggcta ccaccacagc 1140

aatgagcagg gcagcggcta cgccgccgac aaagagagca cccagaaggc catcgacggc 1200

gtcaccaaca aggtgaacag catcatcgac aagatgaaca cccagttcga ggccgtgggc 1260

cgggagttca acaacctgga acggcggatc gagaacctga acaagaaaat ggaagatggc 1320

ttcctggacg tgtggaccta caacgccgag ctgctggtgc tgatggaaaa cgagcggacc 1380

ctggacttcc acgacagcaa cgtgaagaac ctgtacgaca aagtgcggct ccagctgcgg 1440

gacaacgcca aagagctggg caacggctgc ttcgagttct accacaagtg cgacaacgag 1500

tgcatggaaa gcgtgcggaa cggcacctac gactaccccc agtacagcga ggaagcccgg 1560

ctgaagcggg aggaaatcag cggcgtgaaa ctggaaagca tcggcatcta ccagatcctg 1620

agcatctaca gcaccgtggc cagcagcctg gccctggcca tcatggtggc cggcctgagc 1680

ctgtggatgt gcagcaacgg cagcctccag tgccggatct gcatctga 1728

<210>3

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>上游引物

<400>3

gtcgctccgc tagcgaccag atctgcatcg gctac 35

<210>4

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>下游引物

<400>4

agtcacggat cctcagatgc agatccggca ctg 33

Claims

1.密码子优化的H5-VN HA基因，序列为SEQ ID NO.1。

2.分泌抗H5-VN HA单克隆抗体的杂交瘤细胞系，保藏号为CGMCC No.3648。

3.根据权利要求2所述的杂交瘤细胞系，其特征在于该杂交瘤细胞系是由权利要求1所述的密码子优化的H5-VN HA基因通过DNA免疫，经常规的细胞融合、筛选及单克隆化得到的。

4.根据权利要求3所述的杂交瘤细胞系，其特征在于所述的DNA免疫是将权利要求1所述的基因装入pJW4303载体中，构建成密码子优化的H5-VN HA基因的DNA疫苗，用该DNA疫苗免疫小鼠。

5.一种禽流感H5-VN HA抗原的单克隆抗体，其特征在于由权利要求2所述的保藏号为CGMCC No.3648的杂交瘤细胞系产生。

6.分泌抗H5-VN HA单克隆抗体的杂交瘤细胞系，保藏号为CGMCC No.3649。

7.根据权利要求6所述的杂交瘤细胞系，其特征在于该杂交瘤细胞系是由权利要求1所述的密码子优化的H5-VN HA基因通过DNA免疫，经常规的细胞融合、筛选及单克隆化得到的。

8.根据权利要求7所述的杂交瘤细胞系，其特征在于所述的DNA免疫是将权利要求1所述的基因装入pJW4303载体中，构建成密码子优化的H5-VN HA基因的DNA疫苗，用该DNA疫苗免疫小鼠。

9.一种禽流感H5-VN HA抗原的单克隆抗体，其特征在于由权利要求6所述的保藏号为CGMCC No.3649的杂交瘤细胞系产生。