BR0111830B1

BR0111830B1 - Método de produção de partículas semelhantes ao vírus da influenza (VLPs), VLPs da influenza, VLPs quiméricas, composições imunogênica e farmacêutica, e, usos de VLPs da influenza e de VLPs quiméricas

Info

Publication number: BR0111830B1
Application number: BRPI0111830-7A
Authority: BR
Inventors: Jose M Galarza; Theresa E Latham
Original assignee: Wyeth Corp
Priority date: 2000-06-23
Filing date: 2001-06-21
Publication date: 2014-12-02
Also published as: US20090239261A1; AU2001268662A1; US20050186621A1; EP1294892A2; KR100877019B1; WO2002000885A3; WO2002000885A9; AU2007201727B2; US7556940B2; AU2007201727A1; JP2004501647A; JP5008244B2; WO2002000885A2; EP1294892B1; DK1294892T3; PT1294892E; IL153290A0; CA2410297A1; CY1107835T1; DE60130987T2

Description

“MÉTODO DE PRODUÇÃO DE PARTÍCULAS SEMELHANTES AO VÍRUS DA INFLUENZA (VLPS), VLPS DA 1NFLUENZA, VLPS QUIMÉRICAS, COMPOSIÇÕES IMUNOGÊNICA E FARMACÊUTICA, E, USOS DE VLPS DA INFLUENZA E DE VLPS QUIMÉRICAS”.

CAMPO DA INVENÇÃO

Esta invenção diz respeito às partículas semelhantes ao vírus da influenza compostas somente da proteína matriz e podem ainda incluir qualquer uma das proteínas estruturais da influenza. FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

Os vírus da influenza consistem de subtipos designados A, B e C. Os vírus da influenza possuem um genoma de RNA de filamento negativo segmentado, único que codifica 10 polipeptídeos que são requeridos para o ciclo de vida do vírus. Cada um dos oito segmentos de RNA de um genoma completo é encapsidado com subunidades múltiplas da proteína de nucleocapsídeo (NP) e associado com umas poucas moléculas da polimerase trimérica (subunidades PB1, PB2 e PA), formando por meio destas o complexo de ribonucleoproteína (RNP) (Entrada bibliográfica 1). Circundando estas estruturas está uma camada da proteína matriz (Ml), que parece servir como um nexo entre o núcleo e o envelope viral. Este envelope derivado de célula hospedeira é guarnecido com as duas glicoproteínas de superfície viralmente codificadas principais, a hemaglutinina (HA) e a neuraminidase (NA) e uma quantidade muito menor de uma proteína pequena não glicosilada M2 (1,2). A glicoproteína HA é clivada por uma protease para formar HA1 e HA2. A infecção viral da influenza é iniciada pela ligação da hemaglutinina de superfície a um receptor celular contendo ácido siálico. Esta primeira interação vírus-célula induz a captação da partícula viral na célula pela endocitose mediada pelo receptor. Sob as condições de pH baixo do endossoma, a HA sofre um mudança conformacional que facilita a interação do domínio terminal NH2 hidrofóbico de HA2 e da membrana endossômica, resultando na fusão da membrana e na liberação subseqüente dos RNPs do núcleo e da proteína matriz (Ml) no citosol. A desassociação dos RNPs e das proteínas matriz ocorre no citosol antes que os RNPs sejam translocados para 0 núcleo onde a transcrição e a replicação do genoma completo ocorrem (3,4).

Seguindo-se a transcrição primária, as proteínas recentemente sintetizadas iniciam a replicação do genoma viral que sucessivamente aumenta a transcrição e a síntese de proteína. Neste ponto do ciclo de vida do vírus, as glicoproteínas de superfície HA e NA começam a acumular em áreas distintas da membrana plasmática de onde 0 vírus recentemente unido será liberado. A união de vírus é admitida começar por algum tipo de interação entre os domínios citoplásmicos e/ou de transmembrana das proteínas ancoradas à membrana e a proteína matriz subjacente (Ml), que sucessivamente mantém uma associação íntima com os RNPs (5,6). Coletivamente, HA, NA, Ml e M2 constituem as quatro proteínas estruturais viralmente codificadas. Os contatos entre a proteína matriz Ml e os complexos RNP, bem como 0 mecanismo pelo qual um conjunto completo de oito RNPs fica incorporado na partícula de virion madura, não foram bem definidos. Os contatos moleculares específicos entre os componentes estruturais são admitidos impor como 0 processo de morfogênese inicia e progride até 0 ponto da união e brotamento da partícula madura a partir da superfície da célula hospedeira. A complexidade do processo tem dado origem a problemas tais como: 1) A identificação de quais proteínas virais são requeridas para a união e brotamento. 2) Os tipos de interações de proteína-proteína e lipídeo-proteína entre a superfície e os componentes subjacentes que conduzem o processo de união e brotamento. 3) Os mecanismos pelos quais os RNPs são levados ao local de união, incorporados na partícula e separados de segmentos análogos. 4) A natureza e a estequiometria das interações e a regulagem da união e brotamento. Todos estes eventos ocorrem em um ambiente celular complexo onde algumas moléculas hospedeiras podem ou não realçar ou interferir com a progressão do processo de união e brotamento. Isto, sucessivamente, leva a questões de se as proteínas celulares estão de fato envolvidas na união viral e como as proteínas não virais são no geral excluídas da superfície das partículas brotadas.

Um grande número de estudos foram conduzidos para tratar alguns destes problemas com vírus de RNA envelopado de famílias diferentes (5), entretanto a maior parte destes problemas permanecem sem solução com respeito ao vírus da influenza. Estudos com famílias de vírus de RNA não -segmentado (tais como a Rhabdoviridae e Paramyxoviridae), que são um tanto morfológica e evolucionariamente relacionados com a influenza, têm mostrado que a proteína matriz (M) do vírus da estomatite Vesicular (VSV) Rabdovírus por si só é capaz de mover-se para fora (brotamento) a partir da superfície celular como partículas de membrana (7,8). Além disso, a importância das proteínas M no brotamento também é refletida no fato de que cópias dos vírus da raiva (um outro Rabdovírus) com uma supressão do gene que codifica a proteína de superfície G são ainda formadas e liberadas a partir das células infectadas (9). O trabalho mais recente com PIV-3 (um Paramyxovirus) também mostrou que as proteínas matriz juntas com a proteína de nucleocapsídeo (NP) são capazes de associarem-se em uma estrutura semelhante a vírus e brotar da superfície celular (10). Com respeito ao vírus da influenza entretanto, a expressão destas duas proteínas usando réplicons do vírus Semliki Forest não apresentam associação entre estas proteínas ou brotamento de vesículas de membrana (11).

Realizar a genética inversa do vírus da influenza foi um método útil para investigar as interações de proteína-proteína entre componentes estruturais. A importância do domínio citoplásmico das glicoproteínas na união da influenza foi recentemente estudada (12,13,14) e foi mostrado que a supressão da cauda HA reduziu a sua incorporação na partícula bem como a eficiência de brotamento, mas não afetou a morfologia do virion. Por outro lado, o vírus com uma cauda NA suprimida apresentou uma morfologia filamentosa e a incorporação de NA no envelope foi prejudicada. Além disso, as supressões duplas deram a impressão de diminuir a eficiência de brotamento bem como a infecciosidade e mudou a morfologia do virion, que foi distinguível daqueles com supressões de cauda e do vírus do tipo selvagem. Embora as supressões duplas de cauda pareceram afetar a eficiência de brotamento e a morfologia das partículas virais, elas não anulam completamente a união e a saída de partículas de virion. Isto sugeriu que a proteína Ml é capaz de direcionar a união viral e o brotamento (13).

Similarmente, as interações estabelecidas entre a proteína matriz e a membrana plasmática parecem ser crítica para a união e a liberação do vírus. Entretanto a natureza física desta associação, quer a proteína matriz esteja completamente embutida na membrana plasmática ou meramente ligada pela interação eletrostática, é um problema não resolvido. Um trabalho recente que trata esta questão sugeriu fortemente que a matriz e a membrana fossem associadas através de interações eletrostáticas, mas não pode ser excluído que uma certa quantidade de Ml possa ser embutida na membrana (15) . O papel chave das proteínas Ml e M2 na estrutura do virion maduro é refletido na morfologia esférica ou filamentosa das partículas quando substituições de aminoácido estão presentes em cada uma destas moléculas (16) .

Partículas semelhantes a vírus (VLPs) foram o assunto de muito interesse em anos recentes como candidatos potenciais para a inclusão em composições imunogênicas. Isto é porque as VLPs contêm uma ou mais proteínas de superfície desenvolvidas em uma conformação bastante similar à sua conformação nativa de modo que elas podem evocar uma resposta imune desejada. Ao mesmo tempo, as VLPs carecem do complemento do material genético requerido para produzir a prole viral em um hospedeiro. Portanto, ao contrário de um vírus do tipo selvagem, as VLPs não podem causar uma infecção com sintomas ou patologia de doença. Por exemplo, duas ou três proteínas de rotavírus (um vírus de RNA de filamento duplo) foram unidas nas VLPs que evocaram uma resposta imune (17).

Os sistemas de expressão de Baculovírus foram amplamente usados para investigar a morfogênese e a união de VLPs de víms não envelopados que se auto unem em estruturas icosaédricas (18, 19, 20, 21). Similarmente, a expressão em células de inseto das proteínas gag e/ou envelope de membros diferentes da família de retrovírus também foi usada para estudar a união e o brotamento da estrutura de núcleo de vírus envelopados (22,23,24,25).

Existe uma necessidade para estimar a capacidade do sistema de expressão de baculovírus para produzir VLPs da influenza. Em particular, existe uma necessidade para identificar o número mínimo de proteínas do vírus da influenza que agrupar-se-ão em VLPs e para avaliar a morfologia e a imunogenicidade destas VLPs.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Conseqüentemente, é um objetivo desta invenção identificar o número mínimo de proteínas do vírus da influenza que agrupar-se-ão em uma VLP. É um outro objetivo desta invenção gerar VLPs contendo proteínas de mais do que um subtipo de vírus da influenza. É ainda um outro objetivo desta invenção gerar VLPs quiméricas contendo uma proteína de uma fonte heteróloga, que não da influenza. É ainda um outro objetivo desta invenção formular composições imunogênicas e farmacêuticas contendo uma ou mais das VLPs anteriormente mencionadas.

Estes e outros objetivos da invenção como debatidos abaixo são alcançados pela união de VLPs da influenza que compreendam pelo menos uma proteína estrutural do vírus da influenza, onde as ditas VLPs sempre incluem Ml. Em uma forma de realização da invenção, as VLPs contêm apenas Ml (que pode incorporar a proteína de nucleocapsídeo (NP)). Tais VLPs são produzidas pela construção de uma molécula de DNA recombinante que codifica a Ml, transfectando, infectando ou de outro modo transformando uma célula hospedeira adequada com a dita molécula de DNA recombinante, cultivando a célula hospedeira sob condições que permitam a expressão de Ml, de modo que as VLPs sejam unidas dentro das células depois da expressão de Ml e purificando as VLPs a partir do sobrenadante da cultura.

Em uma outra forma de realização da invenção, as VLPs ainda compreendem pelo menos uma das proteínas estruturais da influenza selecionadas do grupo que consiste de HA, NA e M2. Tais VLPs são produzidas pela construção de uma ou mais moléculas de DNA recombinantes que codificam Ml mais pelo menos um de HA, NA e M2, transfectando, infectando ou de outro modo transformando uma célula hospedeira adequada com as ditas uma ou mais moléculas de DNA recombinantes, cultivando a célula hospedeira sob condições que permitam a expressão das ditas proteínas estruturais do vírus da influenza, de modo que as VLPs sejam unidas dentro das células depois da expressão das proteínas estruturais e purificando as VLPs a partir do sobrenadante da cultura. As VLPs contendo Ml apenas ou Ml mais pelo menos um de HA, NA e M2 são formuladas com um diluente ou veículo como uma composição imunogênica para imunizar vertebrados contra a infecção causada pelo vírus da influenza.

Ainda em uma outra forma de realização da invenção, pode ser desejável produzir VLPs contendo glicoproteínas de superfície de subtipos diferentes de vírus da influenza. Tais VLPs, que contêm HA de um subtipo e NA de um subtipo diferente, são formuladas com um diluente ou veículo como uma composição imunogênica bivalente para imunizar vertebrados contra infecção causada por estes dois subtipos de vírus da influenza. Já em uma outra forma de realização desta invenção, pode ser desejável produzir VLPs onde uma parte ou toda HA ou NA são substituídas por uma parte heteróloga não produzida pelo vírus da influenza, de modo a compreender VLPs quiméricas. Tais partes incluem, mas não são limitadas a, um peptídeo, polipeptídeo ou proteína. Onde apenas uma parte da HA ou NA deva ser substituída, uma parte da seqüência de DNA na molécula de DNA recombinante que codifica a HA ou NA é substituída por uma seqüência de DNA que codifica o peptídeo, polipeptídeo ou proteína que não da influenza. Onde a HA ou NA inteira devam ser substituídas, a seqüência de DNA inteira na molécula de DNA recombinante que codifica a HA ou NA é substituída por uma seqüência de DNA que codifica o peptídeo, polipeptídeo ou proteína que não da influenza.

Em um aspecto, tal peptídeo, polipeptídeo ou proteína que não da influenza é de um microorganismo patogênico. Estas VLPs quiméricas são formuladas com um diluente ou veículo como uma composição imunogênica para imunizar vertebrados contra a infecção causada por aquele microorganismo patogênico.

Em um outro aspecto, tal parte que não da influenza é uma parte farmaceuticamente ativa. Estas VLPs quiméricas são formuladas com um diluente ou veículo como uma composição farmacêutica e administradas em uma quantidade eficaz para tratar vertebrados com a dita tal parte que não da influenza.

Ainda em um outro aspecto, as VLPs unem e empacotam RNPs e ainda podem incorporar e expressar uma seqüência de nucleotídeo heteróloga.

Qualquer uma das composições imunogênicas e farmacêuticas anteriores ainda podem compreender um adjuvante.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DAS FIGURAS A Figura 1 representa um vetor de transferência de baculovírus quádruplo (quad estrutural) que carrega quatro genes da influenza cepa A/Udom/72 (R3N2). A transcrição dos genes da influenza HA e Ml é guiada pelo promotor da poliedrina (abreviada como “pH”), ao passo que a M2 e NA são guiadas pelo promotor plO. Este vetor foi transfectado junto com o DNA de baculovírus linearizado em células de inseto Sf9 para gerar o recombinante quádruplo (HA/Q). A Figura 2 representa a estrutura de uma quimera VSV-G/HA. Os 14 aminoácidos da cauda citoplásmica e os 29 aminoácidos do domínio de transmembrana da HA da influenza foram fundidos na matriz com o ectodomínio da glicoproteína de superfície VSV-G (SEQID NO: 1). A Figura 3 representa análises de western blot das proteínas G da influenza e YSV expressadas em células Sf9 infectadas pelos recombinantes de baculovírus quádruplo (HA/Q28 ou VSV-G/Q). Na Figura 3A, as proteínas HA, Ml e M2 da influenza foram detectadas no sobrenadante de células Sf9 infectadas com o HA/Q28 recombinante quádruplo (72 horas após a infecção), usando uma mistura de anticorpos monoclonais anti-HA, anti-Ml e M2 (linha 1); as HA e Ml também foram detectadas na pelota de célula (linha 2). As células MUCK infectadas com A/Udom/72 (H3N2) da influenza foram usadas como controle (linha 3). A Figura 3B representa a expressão da proteína G de VSV, bem como as proteínas Ml e M2 da influenza, em células Sf9 infectadas com VSV-GS/Q (G de comprimento completo). A expressão foi detectada nas pelotas de célula (linha 2) e no sobrenadante da cultura (linha 3), quando sondadas com uma mistura de anticorpos monoclonais anti-G, anti-Ml e M2. As células Sf9 não infectadas (linha 1), células BHR infectadas com VSV (linha 4) e células MUCK infectadas com A/Udom/72 (H3N2) da influenza (linha 5) foram usadas como controles negativo e positivo respectivamente. A Figura 4 representa a análise de imunofluorescência de células Sf9 infectadas com um recombinante de baculovírus quádruplo (HA/Q28). Culturas em caixa de células Sf9 foram infectadas com HA/Q28 a uma MOI de 1 e incubadas durante 72 horas. Neste tempo, caixas individuais foram fixadas com metanol-acetona e incubadas seqüencialmente com anticorpos primários e secundários. A expressão de HA (Figura 4A), Ml (Figura 4B) ou HA/M1 (Figura 4C) foi detectada usando os filtros apropriados. A Figura 5 representa a análise de imunofluorescência de células Sf9 infectadas com HA/Q28. As culturas em caixa foram infectadas com HA/Q28 a uma MOI de 1 e incubadas durante 72 horas. Neste tempo, caixas individuais foram fixadas com paraformaldeído e incubadas seqüencialmente com anticorpos primários e secundários. A expressão de HA (Figura 5A), NA (Figura 5B) ou HA/NA (Figura 5C) foi detectada usando os filtros apropriados. A Figura 6 representa a análise de imunofluorescência de células Sf9 infectadas com HA/Q28. As culturas em caixa de células Sf9 foram infectadas com HA/Q28 a uma MOI de 1 e incubadas durante 72 horas. Neste tempo, caixas individuais foram fixadas com paraformaldeído e incubadas seqüencialmente com anticorpos primários e secundários. A expressão de M2 foi detectada usando os filtros apropriados. A Figura 7 representa a análise de imunofluorescência de células Sf9 infectadas com VSV-G/Q (gene HA da influenza de comprimento completo em HA/Q28 substituída pelo gene G do VSV de comprimento completo). As culturas em caixa foram infectadas com VSV-G1/Q a uma MOI de 1 e incubadas durante 72 horas. Neste tempo, caixas individuais foram fixadas com metanol-acetona e incubadas seqüencialmente com anticorpos primários e secundários. A expressão de G do VSV foi detectada usando os filtros apropriados. A Figura 8 representa as análises de formação de VLP pela centrifugação em gradiente de Iodixanol. A Figura 8A representa os resultados quando frações de HA/Q28 foram sondadas pelo western blot com uma mistura de anticorpos monoclonais anti-HA e Ml. As Linhas de 1 a 8 representam frações coletadas do topo ao firndo dos tubos; a Linha 9 é um controle de MDCK infectado com A/Udom/72 (H3N2) da influenza. A Figura 8B representa os resultados quando frações de VSV-Gf/Q foram sondadas pelo western blot com uma mistura de anticorpos monoclonais anti-VSV-G, anti-Ml e anti-M2. As Linhas de 1 a 8 representam frações coletadas a partir do topo até o fundo do tubo; a Linha 9 é uma mistura de células MDCK infectadas pela influenza e BHK infectadas pelo VSV combinadas como um controle. A Figura 8C representa os resultados quando sobrenadantes concentrados de células Sf9 duplamente infectadas (recombinantes únicos Ml e NP) foram purificados e sondados com uma mistura de anticorpos anti-Ml e anti-NP. As Linhas de 1 a 8 representam frações de gradiente coletadas a partir do topo até o fundo dos tubos; a linha 9 são células MDCK infectadas pela influenza como controle.

A Figura 9 representa análises de western blot de sobrenadante das culturas de células Sf9 infectadas somente com Ml ou recombinantes de baculovírus únicos HA/Q28 mais NP. A Figura 9A representa a análise de frações derivadas do sobrenadante de infecção Ml única, que foram sondadas com anticorpo anti-Ml. As Linhas de 1 a 8 representam frações coletadas a partir do topo até o fundo do tubo; a linha 9 são células MDCK infectadas pela influenza como controle. A Figura 9B representa os resultados quando o sobrenadante de células Sf9 duplamente infectadas (recombinantes de baculovírus únicos HA/Q28 mais NP) foi purificado e sondado com uma mistura de anticorpos anti-HA, anti-Ml e anti-NP. As Linhas de 1 a 8 representam frações coletadas a partir do topo até o fundo do tubo; a linha 9 é o mesmo controle como na Figura 9A. A Figura 10 representa uma micrografia eletrônica de VLPs da influenza negativamente tingidas purificadas a partir do meio de cultura de células sf9 infectadas com um HA/Q28 recombinante quádruplo. A Figura 11 representa micrografias eletrônicas de VLPs da influenza rotuladas com imunoouro. Na Figura 11A (três vistas), as VLPs foram sondadas com um anticorpo monoclonal anti-HA e contra-tingidas com esferas de ouro ligadas a IgG anti-camundongo. Na Figura 11B, as VLPs foram sondadas com anticorpo monoclonal anti-NA e contra-tingidas como na Figura 11 A. A Figura 12 representa western blots de células infectadas com o vírus da influenza sondadas com agrupamentos dos soros de camundongos imunizados com VLPs HA/Q28. Na Figura 12A, os resultados são descritos a partir de soros reunidos a partir de um primeiro par de dois camundongos. Na Figura 12B, os resultados são descritos a partir dos soros agrupados a partir de um segundo par de dois camundongos. Em cada uma das Figuras 12A e B, a Linha 1: células MDCK não infectadas como controle; a linha 2: células MDCK infectadas com o vírus A da influenza. A sondagem de células MDCK não infectadas apresentou uma faixa não específica levemente acima daquela de Ml, que também estava presente NAS células infectadas PELA influenza. A Figura 13 representa manchas de células infectadas com VSV sondadas com agrupamentos de soros de camundongos imunizados com VLPs quiméricas VSV-G/Q. Na Figura 13A, os resultados estão descritos a partir de soros agrupados de: um primeiro par de dois camundongos. Na Figura 13B, os resultados estão descritos a partir de soros agrupados de um segundo par de dois camundongos. Em cada uma das Figuras 13A e B: a Linha 1: células BSK não infectadas como controle; a linha 2: células BSK infectadas com VSV; a linha 3: células MDCK não infectadas como controle; a linha 4: células MDCK infectadas com a influenza. A Figura 14 representa um vetor de transferência de baculovírus quádruplo que carrega quatro genes da cepa A/Udom/72 (H3N2) da influenza, incluindo os três genes que codificam as subunidades da polimerase e da nucleoproteína. A transcrição dos genes da influenza PB1 e PA, que são posicionados em orientações opostas, é guiada pelo promotor da poliedrina (abreviado como “promotor pH”), ao passo que a transcrição dos genes PB2 e NP, também nas orientações opostas, é guiada pelo promotor plO. Os quatro genes foram subclonados no vetor de transferência de baculovírus PAcAB4, depois co-transfectados com o DNA de baculovírus linearizado nas células de inseto Sf9 para gerar o recombinante quádruplo. A Figura 15 representa a medição da atividade de luciferase em unidades de luz relativas (RLUs) em células renais de hamster bebê (BHK) não infectadas (controle) e infectadas com VLP. A Figura 16 representa a expressão da proteína de fluorescência verde (GFP) em células BHK seguindo-se a infecção com VLPs que carregam o gene GFP. As setas indicam as células BHK que expressam GFP.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A união e liberação de partículas virais envelopadas a partir da superfície de células infectadas por vírus é um processo complexo e escalonado. Este requer as interações combinadas de proteínas glicosiladas e não glicosiladas codificadas por vírus com áreas distintas da membrana plasmática para iniciar a união da partícula de virion. Além destes componentes, os ácidos nucleicos encapsidados por proteína, que representam o material genético do vírus, também são incorporados na estrutura para completar o processo de morfogênese, que é completado pelo movimento para fora ou brotamento da partícula de virion madura a partir da superfície celular. As interações moleculares exatas e as contribuições dos diferentes componentes estruturais na união e liberação final de uma partícula de virion completa não são bem caracterizadas. A presente invenção descreve a união e a liberação de partículas semelhantes ao vírus da influenza (VLPs) a partir da superfície de células infectadas com vetores recombinantes que expressaram proteínas estruturais do vírus da influenza. Uma variedade de sistemas de expressão é adequada para a geração de VLPs. A invenção é exemplificada com células de inseto infectadas com recombinantes de baculovírus que expressaram proteínas estruturais do vírus da influenza.

De modo a definir as moléculas requeridas para a união e brotamento do vírus da influenza, uma série de recombinantes de baculovírus de gene único e de gene quádruplo foi construída. Os recombinantes expressaram quatro proteínas estruturais da influenza (HA, NA, Ml e M2) em células de Spodoptera frugiperda 9 (Sf9). As células Sf9 são uma linha de célula de inseto (Número de acesso no ATCC CRL 1711) que é uma derivada da linha de célula SF21. Embora um vetor de transferência que codifica todas as quatro proteínas estruturais seja descrito, o uso de dois a quatro vetores de transferência que coletivamente codificam estas quatro proteínas também está dentro do escopo desta invenção.

De modo a obter recombinantes quádruplos, um único vetor de transferência de baculovírus que codifica as quatro proteínas estruturais da cepa A/Udom/72 (H3N2) da influenza foi construído usando um método de vetor de transporte que facilitou a clonagem pela redução do tamanho do plasmídeo de trabalho e aumentando o número de sítios de restrição. No vetor de transferência final, os genes da influenza foram localizados a jusante dos promotores de baculovírus plO (NA e M2) e da poliedrina (HA e Ml), que foram posicionados para guiar a transcrição dos genes em direções opostas (Figura 1).

Os recombinantes de baculovírus quádruplo (HA, NA, Ml e M2) foram obtidos pela transfecção simultânea de células Sf9 com DNA viral linearizado e DNA de vetor de transferência. Umas poucas placas virais recombinantes foram selecionadas e ainda purificadas por duas rodadas adicionais de isolação de placa para placa. Com base no nível de expressão de proteína estimado por imunoblot, este vetor de transferência recombinante quádruplo, designado HA/Q28, foi selecionado para o uso em experimentos subseqüentes.

Uma característica proeminente desta construção foi que os sítios de junção de doador e aceptor no gene Ml foram mutados para impedir a junção do mRNA de Ml. De outro modo, o mRNA de Ml seria unido ao mRNA de M2, resultando em um nível reduzido de expressão da proteína Ml. O DNA de M2 foi introduzido no vetor de transferência como um gene independente.

De modo a investigar se a expressão destas quatro proteínas estruturais da influenza foi suficiente para guiar a união e brotamento das VLPs da influenza a partir da superfície de células de inseto Sf9 infectadas com o recombinante de baculovírus quádruplo HA/Q28, os sobrenadantes da cultura foram analisados pela western blot para averiguar a presença de proteínas Ml e HA. O meio de cultura foi colhido 72 horas após a infecção, clarificado a 4000 x g durante 30 minutos e o material em suspensão remanescente então concentrado pela centrifugação a 200000 x g durante duas horas. A análise de western blot do sobrenadante concentrado a partir das células infectadas sondadas com uma combinação de anticorpos monoclonais anti-HA, Ml e M2 demonstraram expressão significante das proteínas HA, Ml e M2 da influenza (Figura 3A). A proteína HA pareceu migrar em padrões diferentes do que a HA das células renais caninas de Madin-Darby (MDCK) infectadas com a A/Udom/72 (H3N2) da influenza, o que pode ser uma reflexão das várias formas de glicosilação desta proteína. Por outro lado, os padrões de migração das proteínas Ml e M2 foram similares àquelas expressadas nas células MDCK infectadas pela influenza (Figura 3A, linhas 1 a 3). A expressão das proteínas NI foi detectada pelo western blot com um anticorpo policlonal de camundongo que também reconheceu HA, Ml e M2 (dados não mostrados).

Os resultados debatidos abaixo demonstram que a expressão de quatro proteínas estruturais da influenza é suficiente para a união e brotamento de VLPs a partir da superfície de células de inseto Sf9. A expressão de proteína de nucleocapsídeo (NP), além destas quatro proteínas, levou à formação de VLPs que incorporaram a proteína NP dentro da partícula.

Além disso, a expressão da proteína Ml sozinha induziu a liberação de VLPs, que também podem incorporar o nucleocapsídeo NP quando co-expressadas com Ml. Além disso, a substituição do gene HA por uma proteína G de comprimento completo do vírus da estomatite vesicular ou um HA/G híbrido no recombinante quádruplo, induziu a união e liberação de VLPs quiméricas. Todas estas VLPs são obtidas por meios convencionais de purificação depois da secreção das VLPs no meio.

De modo a avaliar se glicoproteínas heterólogas, que não da influenza podem ser incorporadas na superfície das VLPs da influenza, dois recombinantes de baculovírus quádruplos quiméricos diferentes foram construídos. O primeiro, designado VSV-G/Q, substituiu a seqüência de DNA que codifica a proteína HA da influenza com uma seqüência de DNA que codifica a glicoproteína G de comprimento completo do vírus da estomatite vesicular (VSV). O segundo, designado VSV-G/HA-Q, carregou uma seqüência de DNA híbrida que codifica o ectodomínio da proteína G do VSV e o domínio de transmembrana e a cauda citoplásmica da proteína HA da influenza (ver a Figura 2). Ambos os recombinantes contiveram os genes para as três proteínas estruturais do vírus da influenza Ml, NA e M2.

Estas construções foram submetidas aos mesmos estudos de caracterização como as VLPs da influenza do tipo selvagem e os resultados indicaram que a infecção de células de inseto Sf9 com cada construção direcionou a união e a liberação das partículas semelhantes à influenza que carregam as proteínas G do VSV na sua superfície. Ambos destes vírus recombinantes foram capazes de guiar a expressão das quatro proteínas (Ml, M2, NA e G do VSV), que também foram secretadas no meio. A análise de western blot de células Sf9 infectadas com VSV-G/Q mostrou que a proteína G do VSV, bem como as proteínas Ml e M2 da influenza, foram expressadas 72 horas após a infecção (Figura 3B). Além disso, o sobrenadante concentrado de células infectadas apresentou um western blot positive quando sondado com anticorpos para a G do VSV e as Ml e M2 da influenza (Figura 3B, linha 3).

Os métodos há pouco descritos para a proteína G do VSV são facilmente aplicáveis à incorporação de outras glicoproteínas que não as da influenza de interesse biológico na superfície das VLPs, bem como a incorporação de uma parte não produzida pelo vírus da influenza. Tais partes incluem, mas não são limitadas a um peptídeo, polipeptídeo ou proteína. Como debatido abaixo, tais VLPs são usadas como composições imunogênicas, nos estudos de interação de receptor-ligando e/ou como um sistema para a liberação da parte que não a da influenza como parte de uma composição farmacêutica.

Para avaliar mais a expressão e a localização celular das proteínas da influenza em células Sf9, a análise imunofluorescente de células infectadas com a HA/Q28 recombinante de baculovírus purificada em placa foi conduzida. Estes experimentos mostraram que as quatro proteínas estruturais da influenza foram expressadas como mostrado pela imunofluorescência indireta (Figuras 4 a 6). Experimentos de tingimento duplo com anticorpos anti-HA e anti-NA demonstraram que estas glicoproteínas de superfície localizaram-se na periferia das células infectadas com um certo grau de sobreposição (Figura 5C). Estes resultados sugeriram que estas glicoproteínas principais se co-localizaram em áreas distintas na superfície das células de inseto infectadas, o que assemelha-se como é esperado em uma infecção pela influenza natural de células de mamífero.

Similarmente, o tingimento imunofluorescente duplo de células Sf9 infectadas com HA/Q28 com uma mistura de anticorpos monoclonais para HA e Ml mostrou que as proteínas de superfície e a matriz Ml deram aminoácido impressão de co-localizarem em áreas distintas da membrana celular (Figura 4C).

Por outro lado, a imunofluorescência de células Sf9 infectadas com recombinante de baculovírus Ml mostrou que a proteína Ml acumulou predominantemente no núcleo das células infectadas e apenas quantidades menores foram visualizadas na superfície celular (dados não mostrados). O padrão de distribuição da proteína Ml nas células infectadas não pareceu ser alterado se a Ml foi expressada como um gene único ou como um recombinante quádruplo junto com HA, NA e M2 (Figura 4). Além disso, a infecção simultânea de células Sf9 com recombinantes Ml e NP únicos não apresentou a redistribuição destas proteínas nas células quando comparada com as células Sf9 individualmente infectadas com recombinantes Ml ou NP (dados não mostrados).

Assim, o western blot e a análise imunofluorescente de células infectadas mostrou claramente que estas quatro proteínas não apenas estavam presentes nas células e nos sobrenadantes de célula, mas também co-localizadas em áreas distintas na membrana plasmática. Isto sugeriu uma associação potencial entre estas proteínas estruturais.

Os estudos de imunofluorescência de células Sf9 infectadas com um recombinante de YSV-C3/Q mostrou que a proteína G do VSV não é apenas expressada, mas também parece acumular na periferia das células infectadas.

Porque os estudos imunofluorescentes revelaram que estas proteínas co-localizaram na superfície celular, isto levou a uma avaliação de se estas quatro proteínas virais foram suficientes para guiar a formação e a liberação de VLPs a partir da superfície da célula infectada. Especificamente, de modo a investigar se estas proteínas foram liberadas a partir da célula como uma conseqüência do dano ou da morte celulares, ou porque elas se agruparam como as VLPs que brotaram a partir da superfície celular, sobrenadantes concentrados de células Sf9 infectadas com HA/Q28 foram submetidas à centrifugação de gradiente e velocidade com Iodixanol (26) (200000 x g durante 3,5 horas). Como individualmente especificado, as frações contendo as proteínas de interesse foram submetidas à purificação adicional em um gradiente de 20 a 60 % de sacarose. A análise de western blot das frações coletadas mostrou que a HA e a Ml co-migraram através do gradiente, atingindo uma concentração de pico na fração 2 (Figura 8A, linha 2). Estas proteínas também foram encontradas nas frações adjacentes 3 e 4, bem como nas frações 7 e 8 (Figura 8A). A detecção de HA e Ml nestas frações inferiores (voltadas para o fundo do gradiente) foi provavelmente devido à associação destas proteínas com o baculovírus, que sob estas condições se associa nas frações 7 e 8 (dados não mostrados).

Um experimento similar foi conduzido com as construções VSV-G/HA-Q (quimera) e VSV-G/Q (de comprimento completo). Como foi observado com a HA/Q28, a fração 2 de um gradiente de Iodixanol conteve as proteínas G do VSV e as Ml e M2 da influenza como mostrado pela análise de western blot (Figura 8B, linha 2). Quando as células Sf9 foram infectadas com um recombinante quad que carrega uma G de VSV de comprimento completo ao invés da HA, todas as proteínas sondadas (VSV-G, Ml e M2) também estavam presentes tanto no sobrenadante concentrado quanto nas frações 2 e 3 do gradiente de Iodixanol (Figura 3B, linha 3 e Figura 8B). Estes resultados sugeriram que a infecção de células Sf9 com quad VSV-G/HA-Q (quimera) ou VSV-G/Q (de comprimento completo) direcionou a união e a liberação das VLPs da influenza que carregam a proteína G do VSV na sua superfície.

Em vista do fato de que algumas das partículas HA/Q28 examinadas sob o microscópio eletrônico não mostraram pontas de superfície detectáveis (ver abaixo), surgiu a questão de se a proteína matriz da influenza por si só é suficiente para guiar a união e a liberação de partículas vesiculares. Para tratar esta questão, células de inseto Sf9 foram infectadas com um recombinante de baculovírus Ml durante 72 horas e os sobrenadantes das culturas concentrados foram submetidos à mesma análise como descrito acima. A análise de imunoblot de frações sobrenadantes de gradiente de Iodixanol demonstraram que a proteína matriz foi concentrada nas frações 2 e 3, similar ao padrão de migração das VLPs liberadas a partir das células Sf9 infectadas com HA/Q28 (Figura 9A).

Existe evidência forte (3) de que a proteína matriz (Ml) desempenhe um papel importante no transporte do complexo de ribonucleoproteína (RNPs) a partir do núcleo para a superfície celular, onde a união viral ocorre. A associação entre a matriz e as RNPs pode ser mediada através de contatos com a NP, RNA de virion ou ambos. Portanto, foi de interesse avaliar se a proteína de nucleocapsídeo (NP) foi incorporada na VLP quando as células Sf9 foram co-infectadas com o recombinante quádruplo HA/Q28 e um único baculovírus recombinante NP. A análise de Western blot da fração de gradiente 2 demonstrou que a proteína de nucleocapsídeo NP foi de fato incorporada nas VLPs resultantes (Figura 9B). Este resultado levantou a questão quanto a quais proteínas estabelecem contato com a NP de modo a permitir a incorporação da NP na partícula.

Para tratar esta questão, recombinantes de baculovírus únicos Ml e NP foram usados. A expressão simultânea de Ml e NP em células Sf9 produziram partículas de membrana compostas de ambas as proteínas, isto permitiu a avaliação das interações potenciais entre estas duas proteínas na ausência de RNA da influenza definido com términos precisos. A análise de western blot de partículas purificadas por gradiente derivadas de células Sf9 duplamente infectadas com Ml e NP recombinantes mostrou que a Ml e a NP co-localizaram-se nas mesmas frações (Figura 8C). Por outro lado, a infecção com uma NP recombinante sozinha não induziu a liberação da partícula e não demonstrou a presença de NP reativa em qualquer uma das frações (dados não mostrados). Estes resultados sugeriram uma interação entre Ml e NP que foi forte o bastante para levar a NP para dentro da partícula que continha a Ml mesmo na ausência de RNA.

Com base na localização da proteína NP no vírus da influenza e em outros estudos de união de partícula de proteína (10), é razoável supor que a proteína NP estabelece contato com a proteína matriz Ml e, como um resultado desta interação, fica incorporado dentro da VLP. Em células infectadas pela influenza, o transporte de RNPs a partir do núcleo para o local de união do vírus na membrana plasmática ocorre depois da associação com a proteína matriz por um mecanismo não bem caracterizado.

Foi mostrado (27) que a proteína NP não se liga apenas ao RNA da influenza, mas também pode ligar-se com afinidade mais baixa ao RNA não específico. Portanto, este resultado não exclui a possibilidade de que o RNA seja requerido para uma interação produtiva entre Ml e NP.

Portanto, é concluído que a proteína matriz não apenas inicia as interações moleculares levando à união e liberação de partículas, mas também é capaz de ligar e incorporar o nucleocapsídeo NP na partícula. Em células infectadas pela influenza, a proteína Ml se associa com as RNPs no processo de transporte e união virais. No caso de recombinantes Ml únicos, estas outras estruturas da influenza não estão presentes, embora o brotamento ainda ocorra. A NP pode associar-se com a Ml como monômeros ou oligômeros ou depois da ligação ao RNA celular, seja qual for a natureza da associação, está claro que a Ml e a NP expressadas em células de inseto ligam-se com afinidade suficiente para agruparem-se em uma vesícula, que é capaz de sair da célula.

Para caracterizar ainda mais a natureza da associação entre as proteínas da influenza que co-migraram nas frações 2 e 3, a avaliação por microscópio eletrônico do material presente nestas frações foi realizada. O exame microscópico eletrônico da fração 2 revelou a presença de uma alta concentração tanto de partículas vesiculares quanto não vesiculares guarnecidas com projeções de superfície que se pareceram enormemente com o vírus da influenza e com as subpartículas virais (Figura 10). A forma e as características estruturais das VLPs variaram dependendo das suas posições no gradiente. As pontas protuberantes a partir da superfície de algumas vesículas pareceram similares à HA e NA da influenza, em que elas espetaram para fora a partir da superfície das partículas como fazem a partir da superfície do vírus da influenza.

As projeções em algumas VLPs da fração 2 foram significantemente similares às pontas HA presentes no vírus da influenza (Figura 10). A morfologia de NA é menos distinta nas amostras contendo tal faixa ampla de entidades guarnecidas com pontas. A fração 3 conteve uma faixa similar de partículas em alta concentração, entretanto elas pareceram conter uma concentração mais alta de membranas agregadas do que a fração 2 (dados não mostrados).

As frações que apresentaram o número maior de VLPs da influenza sob o microscópio eletrônico também conteve as concentrações mais altas de proteínas Ml e HA como demonstrado pela análise de western blot. As VLPs, que foram cobertas com projeções de superfície e variaram no comprimento de cerca de 75 nm a 150 nm, se pareceram claramente com o vírus da influenza no tamanho e morfologia.

Para caracterizar ainda mais a estrutura das partículas Ml, estas duas frações do gradiente foram examinadas pelo microscópio eletrônico. O exame em microscópio eletrônico tingido de negativo mostrou um grande número de vesículas de formatos variáveis que não carregam pontas nas suas superfícies (dados não mostrados).

De modo a determinar se as células infectadas com baculovírus espontaneamente liberaram vesículas ou se a associação da proteína Ml na superfície celular foi suficiente para guiar a saída da partícula, frações gradientes similares de sobrenadantes concentrados de células Sf9 infectadas com baculovírus do tipo selvagem ou recombinante NP foram examinadas pelo microscópio eletrônico. Nenhuma das outras proteínas (NP, HA) foram detectadas nestas frações, quando o sobrenadante de células Sf9 infectadas com os recombinantes únicos correspondentes foi usado na análise. Estes resultados indicaram que a proteína matriz por si só foi suficiente para guiar a união e liberação das VLPs a partir da superfície das células de inseto. A composição protéica das pontas que se projetam a partir da superfície das VLPs foi investigada pelo microscópio eletrônico de antígenos de superfície rotulados com imunoouro que foram sondados com anticorpos monoclonais específicos para a HA e NA (que foram os mesmos como aqueles usados nos experimentos de imunofluorescência). Este exame mostrou que o antígeno de superfície principal da influenza HA estava de fato presente na superfície das VLPs, como indicado pela presença de pérolas de ouro (Figura 1 IA). Isto confirmou o que foi admitido a partir da avaliação estrutural das pontas visualizadas pelo tingimento negativo e microscópio eletrônico (Figura 10). Similarmente, a rotulação com imunoouro com anticorpo anti-NA e microscópio eletrônico também revelou a presença da glicoproteína NA na superfície das VLPs, embora com abundância mais baixa do que a HA (Figura 11B).

Tentativas foram feitas para detectar a presença das proteínas M2 na superfície da VLP pela rotulação de imunoouro usando um anticorpo policlonal de coelho incitado contra peptídeos que abrangem 18 aminoácidos do terminal amino da proteína M2. A proteína M2 não foi detectada na superfície da partícula, ainda que estivesse presente nas frações gradientes submetidas ao microscópio eletrônico com rotulação de imunoouro (IEM). Entretanto, isto não foi surpreendente, porque o IEM não é um sistema sensível o bastante para detectar proteínas menores e, mesmo com o vírus da influenza nativo, muito pouca M2 é produzida e é difícil de detectar.

Quando as VLPs quiméricas do VSV influenza foram purificadas e examinadas pelo microscópio eletrônico, descobriu-se que tinham uma morfologia similar às VLPs da influenza. Além disso, a análise pela rotulação com imunoouro revelou que elas furam as glicoproteínas de superfície que foram reativas com o anticorpo anti-G (dados não mostrados).

As partículas geradas com cada construção não pareceu mostrar quaisquer diferenças significantes na morfologia. O teor de proteínas G na superfície de ambas as partículas foi aparentemente similar. Isto sugeriu que a interação potencialmente favorável entre a parte HA da quimera G/HA e a Ml subjacente à membrana não realçou significantemente o nível de incorporação da G na partícula.

Para avaliar a imunogenicidade das VLPs da influenza do tipo selvagem e das VLPs quiméricas (contendo G do VSV), dois grupos de camundongos BALB/c foram imunizados pela via intramuscular com HA/Q28 ou VSV-G/Q, onde cada conjunto de VLPs foi formulado com fosfato de alumínio. Todos os camundongos em cada grupo receberam uma preparação e duas injeções de reforço em intervalos de duas semanas. Duas semanas depois da última imunização, as amostras de sangue foram obtidas e a presença de anticorpos contra o antígeno correspondente foi avaliada pelo western blot (para ambos os tipos de VLPs), a inibição de hemaglutinação (para a HA/Q28) e um teste de soro-neutralização (para VSV-G/Q). A análise de imunoblot demonstrou que os soros de camundongos imunizados com a HA/Q 28 reconheceram o vírus da influenza usado como o imunógeno de teste (predominantemente HA e Ml; Figuras 12A e B, linha 2). Similarmente, os soros de camundongos imunizados com as VLPs quimérica VSV-G/Q reconheceram a proteína G do VSV (Figura 13A e B, linha 2). O desempenho de uma inibição do teste de hemaglutinação do vírus da influenza (IHA) mostrou que os soros de camundongos imunizados com HA/Q28 tiveram um título de IRA de 96 IHAU, que foi mais do que duas vezes mais alto do que aquele obtido a partir dos camundongos ingênuos de controle (32 IHAU). Esta resposta foi quase igual ao título IHA de 128 IHAU evocados pelas duas imunizações intranasais (duas semanas de distância) com o influenza vivo A/Hong Kong (H3N2) (cortesia do Dr. Mbawuike, Baylor College of Medicine), que serviu como um controle positivo. A neutralização de VSV pelos soros de camundongos imunizados com VSV-G/Q mostrou que uma diluição tão alta quanto 1/64 neutralizou completamente um título padrão de VSV, impedindo desse modo a formação de quaisquer placas na monocamada de célula.

Estes resultados demonstraram que as VLPs da influenza evocaram uma resposta de anticorpo que não apenas reconheceu o vírus da influenza do tipo selvagem no western blot, mas também inibiu a hemaglutinação do vírus da influenza. Além disso, a imunização de camundongos com VLPs quiméricos que carregam a proteína G do VSV induziu uma resposta de anticorpo humoral que reconheceu a proteína G do vírus VSV do tipo selvagem em um western blot e também impediu a infecção pelo VSV em um teste de neutralização do soro.

Outros tipos de células hospedeiras além das células de inseto também podem ser usados com um ou mais vetores recombinantes que codificam proteínas estruturais do vírus da influenza (e, se desejado, uma proteína que não da influenza) de modo a produzir VLPs. Estudos com a proteína M de VSV demonstraram que esta propriedade foi mostrada tanto nos tipos de célula de inseto (8) quanto nos de mamífero (7). Além disso, a expressão das proteínas M e NP matriz do vírus da para-influenza (um outro vírus de RNA não segmentado, de filamento negativo) em células de mamífero levou à formação e liberação de partículas semelhantes a vírus (10).

Outros tipos de célula adequadas para o uso como células hospedeiras incluem as células hospedeiras de mamífero (tais como as do ovário do hamster chinês, fibroblastos do embrião de pinto, células BHK, células SW13 humanas) e levedura (tais como Pichia, Saccharomyces). O uso de células de mamífero ou levedura podem resultar na expressão de proteínas com glicosilação mais semelhante àquela das proteínas do tipo selvagem do que pode ser obtida com células de inseto.

Os vetores recombinantes adequados para a liberação de genes além dos baculovírus incluem, mas não são limitados a, vírus tais como o da vacínia e outros vírus da varíola, sindbis, adenovírus, o vírus da encefalite eqüina venezuelana e outros alfavírus, bem como DNA plasmídico.

Os vetores recombinantes devem incluir promotores e outros elementos reguladores (tais como um sinal de poliadenilação) eficazes para direcionar a expressão de proteínas da influenza (e qualquer uma que não da influenza) para produzir VLPs no tipo de célula hospedeira correspondente.

As células hospedeiras são transfectadas, infectadas ou de outro modo transformadas pelas técnicas convencionais conhecidas no ramo. Tais técnicas também incluem, mas não são limitadas a, transdução, eletroporação e lipofecção.

Como aqui descrito, a expressão por intermédio de um recombinante de baculovírus quádruplo das quatro proteínas estruturais da influenza (HA, NA, Ml, M2) foi suficiente para guiar a união e liberação de VLPs a partir da superfície de células de inseto Sf9. Este é o primeiro relato da formação das VLPs da influenza produzidas com apenas quatro proteínas estruturais. Na verdade, as VLPs podem compreender tão pouco quanto uma proteína estrutural, Ml. Portanto, esta invenção inclui VLPs compostas somente da Ml, da Ml mais uma ou duas de HA, NA e M2, bem como de todas as quatro destas proteínas estruturais.

As VLPs unidas se parecem estreitamente com o vírus da influenza do tipo selvagem no seu tamanho, morfologia de partícula e estrutura fina das pontas de superfície. Além disso, a formação de VLPs na ausência das RNPs da influenza indica que as RNPs não são necessárias para a união e liberação de partículas.

Este novo método pata unir as VLPs da influenza é de enorme importância para o planejamento de composições imunogênicas contra novas variantes da influenza. Uma característica importante deste sistema é a capacidade para substituir as glicoproteínas de superfície com subtipos diferentes de HA e/ou NA; isto permitirá a atualização de formulações com novas variantes antigênicas destas proteínas. Conforme as variantes antigênicas destas glicoproteínas são identificadas, as VLPs podem ser atualizadas para incluir estas novas variantes. Assim, mesmo as glicoproteínas de superfície extremamente nocivas tais como H1N1 (da gripe espanhola de 1918) ou uma combinação de HA, NA com potenciais pandêmicos podem ser incorporadas nas VLPs sem a preocupação a cerca das implicações de genes de liberação que não circularam em seres humanos por diversas décadas. Isto é porque as VLPs não são infecciosas, não replicam e não podem causar doença.

Além disso, a praticabilidade de se incorporar glicoproteínas heterólogas na superfície das VLPs faz com que este método seja atraente não apenas como um sistema de liberação, mas também permite o alvejamento de tipos de célula específicos (tropismo) com base nas glicoproteínas de superfície incorporadas em suas superfícies. Em uma forma de realização, as VLPs contêm a cauda citoplásmica e o domínio de transmembrana de HA e o domínio externo de uma glicoproteína que não da influenza, que facilita a geração de partículas quiméricas úteis para imunizações multivalentes.

Em resumo, foi mostrado que as partículas semelhantes ao vírus da influenza do tipo selvagem e quiméricas podem ser unidas e liberadas a partir da superfície de células Sf9 seguindo-se a expressão de apenas uma a quatro proteínas virais estruturais, contanto que a proteína matriz Ml seja sempre expressada. Também foi demonstrado que a Ml é capaz de guiar a liberação de partículas vesiculares que contêm NP quando as duas estão presentes juntas.

Em uma outra forma de realização da invenção, a formação e a encapsidação subseqüente de complexo de ribonucleoproteínas (RNPs) (contendo as três subunidades de polimerase, PA, PB1 e PB2, bem como a nucleoproteína, NP) nas VLPs foram alcançadas. Um segundo recombinante de baculovírus quádruplo foi gerado (Figura 14) que expressou simultaneamente nas células de inseto Sf9 as três subunidades de polimerase e a NP.

Para avaliar a formação e a encapsidação de RNP, um padrão de RNA de sentido negativo in vitro que codifica a luciferase na orientação anti-sentido foi sintetizado, flanqueado pelas regiões 3’ e 5’ conservadas e não codificadoras dos términos NP do vírus da influenza. A transfecção de células de inseto Sf9 com o RNA gerado in vitro e a co-infecção subseqüente com Q28 e o segundo recombinante quádruplo levou à união e liberação de VLPs que carregaram o gene repórter bem como a polimerase e NP. Os sobrenadantes concentrados de células Sf9 transfectadas/infectadas foram transferidos para uma monocamada de célula renal de hamster bebê (BHK), incubados e as células rompidas com um tampão de lise de ensaio de luciferase. Os lisados de células infectadas registraram atividade de luciferase 70 a 700 vezes aquela de células de controle não infectadas (Figura 15).

Similarmente, para avaliar a formação e a encapsidação de RNP, um padrão de RNA de sentido negativo in vitro que codifica a proteína de fluorescência verde (GFP) na orientação de anti-sentido foi sintetizado, flanqueado pelas regiões conservadas e não codificadoras 3’ e 5’ dos términos NP do vírus da influenza. A transfecção de células de inseto Sf9 com o RNA gerado in vitro e a co-infecção subseqüente com Q28 e o segundo recombinante quádruplo levou à união e liberação de VLPs que carregaram o gene repórter bem como a polimerase e NP. Quando os sobrenadantes concentrados de células Sf9 transfectadas/infectadas foram transferidos para uma monocamada de célula MDCK, a expressão de GFP foi detectada (Figura 16).

Estes resultados indicam que as partículas derivadas de baculovírus foram capazes de encapsidar as RNPs, que foram funcionais na transcrição primária, como demonstrado pela expressão da luciferase e GFP. Assim, as VLPs são capazes de unir e empacotar RNPs, bem como ainda incorporar e expressar uma seqüência de nucleotídeo heteróloga. Tal seqüência heteróloga expressada inclui, mas não é limitada a uma parte heteróloga não produzida pelo vírus da influenza, incluindo um peptídeo, polipeptídeo ou proteína de um microorganismo patogênico que não da influenza, como descrito abaixo. Tal seqüência heteróloga expressada ainda inclui um imuno modulador para aumentar e/ou alterar a resposta imune. Tais imuno moduladores incluem, mas não são limitados a, IL-12 (Genetics Instituto, Cambridge, MA) e GM-CSF (Immunex Corp., Seattle, WA). Entretanto ainda as seqüências heterólogas expressadas incluem anticorpos monoclonais que servem como partes alvejadoras e/ou de tratamento.

As VLPs desta invenção são usadas para formular composições imunogênicas ou farmacêuticas. Para assim fazê-lo, as VLPs são ajustadas até uma concentração apropriada e formuladas com qualquer adjuvante, diluente ou veículo adequado. Os meios fisiologicamente aceitáveis podem ser usado como veículos e/ou diluentes. Estes incluem, mas não são limitados a: água, um meio isotônico apropriado, glicerol, etanol e outros solventes convencionais, solução salina tamponada com fosfato e outros. Os adjuvantes adequados incluem, mas não são limitados a fosfato de alumínio, hidróxido de alumínio, MPL® (monofosforil lipídeo A 3-O-desacilado; RIBI ImmunoChem Research, Inc., Hamilton, MT, agora Corixa), análogos de lipídeo A sintéticos tais como 529 (Corixa), Stimulon® QS-21 (Aquila Biopharmaceuticals, Framingham, MA), IL-12 (Genetics Instituto, Cambridge, MA), polinucleotídeos sintéticos tais como oligonucleotídeos contendo um motivo CpG (Patente U.S. Número 6.207.646 (28)), a toxina instável ao calor da E. coli e a toxina do cólera (em uma forma do tipo selvagem ou mutante, por exemplo, onde o ácido glutâmico na posição de aminoácido 29 é substituído por um outro aminoácido, preferivelmente uma histidina, de acordo com o Pedido de Patente Internacional publicado Número WO 00/18434 (29)).

Em uma forma de realização desta invenção, a formulação incluindo as VLPs é intencionada para o uso como uma composição imunogênica. O vírus pode ser misturado com aditivos crioprotetores ou estabilizadores tais como proteínas (por exemplo, albumina, gelatina), açúcares (por exemplo, sacarose, lactose, sorbitol), aminoácidos (por exemplo, glutamato sódico), solução salina ou outros agentes protetores. Esta mistura é mantida em um estado líquido ou é depois dessecada ou liofilizada para transporte e armazenagem e misturada com água imediatamente antes da administração.

As formulações que compreendem as VLPs contendo apenas as proteínas estruturais do vírus da influenza são úteis para imunizar um paciente humano ou outro vertebrado para induzir proteção contra infecção pelo vírus da influenza. Assim, esta invenção ainda fornece um método de imunizar um paciente para induzir proteção contra a infecção pelo vírus da influenza pela administração ao paciente de uma quantidade imunizadora eficaz de uma formulação da composição imunogênica que incorpore VLPs contendo apenas as proteínas estruturais do vírus da influenza, geradas como descrito acima.

As formulações que compreendem as VLPs contendo glicoproteínas de superfície de subtipos diferentes do vírus da influenza, tais como HA de um subtipo e NA de um subtipo diferente, são formuladas com um diluente ou veículo como uma composição imunogênica bivalente para imunizar vertebrados contra a infecção causada por estes dois subtipos do vírus da influenza. Como debatido acima, cada um de HA e NA podem ser substituídos conforme as variantes antigênicas são identificadas. Assim, as VLPs atualizadas quiméricas são facilmente construídas de acordo com os métodos aqui descritos.

Altemativamente, as composições imunogênicas multivalentes são preparadas pela geração de um conjunto de VLPs de cada um cepa da influenza de interesse, misturando-se os conjuntos de VLPs em relações apropriadas e administrando a composição imunogênica resultante.

As formulações desta invenção também compreendem VLPs onde uma parte ou toda da HA ou NA são substituídas por uma parte heteróloga não produzida pelo vírus da influenza, de modo a compreender VLPs quiméricas. Tais partes incluem, mas não são limitadas a, um peptídeo, polipeptídeo ou proteína. Onde apenas uma parte da HA ou NA deva ser substituída, uma parte da seqüência de DNA na molécula de DNA recombinante que codifica a HA ou Ml é substituída por uma seqüência de DNA que codifica o peptídeo, polipeptídeo ou proteína que não da influenza. Onde a HA ou NA inteiras devam ser substituídas, a seqüência de DNA inteira na molécula de DNA recombinante que codifica a HA ou NA é substituída por uma seqüência de DNA que codifica o peptídeo, polipeptídeo ou proteína que não da influenza.

Altemativamente, uma parte heteróloga como descrita acima que não é produzida pelo vírus da influenza (ou um segmento do vírus da influenza tal como aquele que codifica NP) é incorporada dentro das VLPs. Isto é obtido co-infectando, co-transfectando ou de outro modo co-transformando uma célula hospedeira adequada com: (a) uma ou mais moléculas de DNA recombinantes que cada uma codifica pelo menos uma proteína estrutural do vírus da influenza, onde uma molécula de DNA recombinante que codifica Ml é sempre construída e (b) uma molécula de DNA recombinante que codifica a parte heteróloga (ou segmento do vírus da influenza), cultivando-se a célula hospedeira sob condições que permitam a expressão das ditas pelo menos uma proteína estrutural do vírus da influenza, de modo que as VLPs sejam unidas dentro das células depois da expressão do pelo menos uma proteína estrutural do vírus da influenza e purificando as VLPs a partir do sobrenadante da cultura. A parte heteróloga (ou proteína da influenza) é incorporada dentro das VLPs.

Onde tal peptídeo, polipeptídeo ou proteína que não da influenza é de um microorganismo patogênico, as VLPs quimérica resultantes são formuladas com um diluente ou veículo como uma composição imunogênica para imunizar vertebrados contra a infecção causada por aquele microorganismo patogênico (bem como o vírus da influenza). Mais tipicamente, a VLP quimérica inclui um antígeno de superfície de um microorganismo patogênico que não o da influenza.

Tais microorganismo patogênicos que não da influenza incluem, mas não são limitados àqueles de vírus, bactérias, fungos ou microorganismos parasíticos que infectam seres humanos e vertebrados não humanos. Outros tipos de partes que não da influenza incluem, mas não são limitadas àquelas de células cancerosas ou células de tumor, anticorpos monoclonais (usados, por exemplo, como partes alvejadoras e/ou de tratamento), alérgenos, proteína peptídica amilóide ou outros componentes macromoleculares.

Os exemplos de tais vírus incluem, mas não são limitados ao Vírus da imunodeficiência humana, Vírus da imunodeficiência símia, Vírus sincicial respiratório, Vírus da para-influenza tipos 1 a 3, Vírus simplex do herpes, Citomegalovírus humano, Vírus da hepatite A, Vírus da hepatite B, Vírus da hepatite C, Papilomavírus humano, poliovírus, rotavírus, calicivírus, Víms do sarampo, víms da caxumba, Víms da mbéola, adenovírus, víms da raiva, víms da cinomose canina, víms da peste bovina, parvovíms, parvovíms, víms da rinotraqueíte infecciosa, víms da leucemia felina, víms da peritonite infecciosa felina, víms da doença bursal infecciosa aviária, Vírus da doença de Newcastle, Víms da doença de Marek, víms da síndrome respiratória e reprodutiva porcina, víms da arterite eqüina e vários víms da encefalite.

Os exemplos de tais bactérias incluem, mas não são limitadas a, Haemophilus influenzae (tanto tipificável quanto não tipificável), Haemophilus somnus, Moraxella catarrhalis, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae, Streptococcus faecalis, Helicobacter pylori, Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae, Chlamydia trachomatis, Chlamydia pneumoniae, Chlamydia psittaci, Bordetella pertussís, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Salmonella choleraesuis, Escherichia coli, Shigella, Vibrio cholerae, Corynebacterium diphtheriae, Mycobacterium tuberculosis, complexo de Mycobacterium avium-Mycobacterium intracellulare, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, Staphylococcus aureus, Clostridium tetani, Leptospira iníerrogans, Borrelia burgdorferi, Pasteurella haemolyíica, Pasteurella multocida, Actinobacillus pleuropneumoniae e Mycoplasma gallisepíicum.

Os exemplos de tais fungos incluem, mas não são limitadas a, Aspergillis, Blastomyces, Candida, Coccidiodes, Cryptococcus e Histoplasma.

Os exemplos de tais parasitas incluem, mas não são limitados a, Leishmania major, Ascaris, Trichuris, Giardia, Schisiosoma, Cryptosporidium, Tríchomonas, Toxoplasma gondii e Pneumocystis carinii.

Os exemplos de tais células cancerosas ou células de tumor incluem, mas não são limitadas ao antígeno específico da próstata, antígeno carcino-embriônico, MUC-1, Her2, CAI25 e MAGE-3.

Os exemplos de tais alérgenos incluem, mas não são limitados àqueles descritos na Patente dos Estados Unidos Número 5.830.877 (30) e Pedido de Patente Internacional publicado Número WO 99/51259 (31), que são por meio deste incorporadas por referência e incluem pólen, venenos de inseto, escamas animais, esporos fúngicos e medicamentos (tais como penicilina). Tais componentes interferem com a produção de anticorpos IgE, uma causa conhecida de reações alérgicas. A proteína peptídica amilóide (APP) foi implicada em doenças aludidas de modo variado como doença de Alzheimer, amiloidose ou doença amiloidogênica. O peptídeo β-amilóide (também chamado de peptídeo Αβ) é um fragmento de 42 aminoácidos de APP, que é gerado pelo processamento de APP pelas enzimas β e γ secretase e tem a seguinte seqüência: Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Vai His His Gin Lys Leu Vai Phe Phe Ala Glu Asp Vai Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile Gly Leu Met Vai Gly Gly Vat Vai Ile Ala (SEQID NO: 2).

Em alguns pacientes, o depósito amilóide toma a forma de um peptídeo Αβ agregado. Surpreendentemente, foi agora descoberto que a administração do peptídeo Αβ isolado induz uma resposta imune contra o componente de peptídeo Αβ de um depósito amilóide em um hospedeiro vertebrado (32). Tais peptídeos Αβ também foram ligados a partes não relacionadas. Assim, as VLPs desta invenção incluem a expressão deste peptídeo Αβ no lugar de uma parte ou toda a HA ou NA do vírus da influenza, bem como fragmentos do peptídeo Αβ e anticorpos para o peptídeo Αβ ou fragmentos destes. Um tal fragmento do peptídeo Αβ é o peptídeo de 28 aminoácido tendo a seguinte seqüência (33): Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Vai His His Gin Lys Leu Vai Phe Phe Ala Glu Asp Vai Gly Ser Asn Lys (SEQID NO: 3).

Uma quantidade suficiente de uma composição imunogênica descritas acima em um número apropriado de doses é administrada ao paciente para evocar uma resposta imune. As pessoas habilitadas na técnica facilmente serão capazes de determinar tais quantidades e dosagens. A administração pode ser por qualquer forma eficaz convencional, tal como intranasal, parenteral, oral ou topicamente aplicada a qualquer superfície mucósica tal como a superfície intranasal, oral, ocular, pulmonar, vaginal ou retal, tal como por uma pulverização por aerossol. Os meios preferidos de administração é pela administração intranasal.

Tal peptídeo, polipeptídeo ou proteína que não da influenza também podem ser uma parte farmaceuticamente ativa. Tais partes incluem, mas não são limitadas a, proteínas terapêuticas, fatores de desenvolvimento, imuno moduladores, anticorpos monoclonais, bem como as partes listadas acima com respeito às composições imunogênicas. Estas VLPs quiméricas são formuladas com um diluente ou veículo como debatido acima como uma composição farmacêutica e administradas em uma quantidade eficaz para tratar vertebrados com os ditos tais peptídeo, polipeptídeo ou proteína que não da influenza. Uma quantidade eficaz é facilmente determinada pelas pessoas habilitadas na técnica.

As composições farmacêuticas precedentes podem ainda compreender um adjuvante como debatido acima.

Tal peptídeo, polipeptídeo ou proteína que não da influenza também podem ser um receptor ou ligando úteis nos estudos de receptor-ligando. Por exemplo, uma glicoproteína que não da influenza é incluída nas VLPs que são alvejadas a um receptor específico.

Em todas estas composições imunogênicas ou farmacêuticas, as VLPs são capazes de induzir uma resposta imune quando administradas a um hospedeiro vertebrado, mas não são capazes de causar sintomas de doença porque as VLPs não contêm nenhum material genético e não podem replicar no paciente vertebrado.

Todas as patentes e publicações aqui citadas são por meio deste incorporadas por referência.

De modo que esta invenção possa ser melhor entendida, os seguintes exemplos são apresentados. Os exemplos são apenas para o propósito de ilustração e não devem ser interpretados como limitantes do escopo da invenção. EXEMPLOS Exemplo 1 Clonagem do gene M2 da influenza no vetor de transferência de baculovírus pAcAB4 O gene M2 da influenza, que é um produto emendado do RNA de Ml, foi isolado pela RT-PCR a partir do mRNA poliadenilado extraído de células MDCK que foram infectadas com a cepa A/Udom/72 (H3N2) da influenza. O gene M2 foi clonado como um inserto de DNA em um vetor pGemT (Promega) e seqüenciado com iniciadores específicos usando uma reação de seqüenciamento de terminação de pigmento e um seqüenciador de DNA ABI377 automatizado (Applied Biosystems). 0 gene Μ2 foi liberado a partir do plasmídeo pGemT-M2 pela digestão com a enzima de restrição Eagl e preparado para a clonagem no vetor de transferência de baculovírus pAcA84 (PharMingen). Os fragmentos de M2-DNA foram inseridos com DNA polimerase (fragmento Klenow) e ligadores BgR\ foram incorporados nos términos pela ligação com T4 DNA ligase. Todas as enzimas e ligadores foram obtidos da New England Biolabs (NEB). O vector de transferência pAcA84 foi depois digerido com BglII e tratado com alcalino fosfatase intestinal bovina (CIP). O inserto M2 foi depois purificado em gel (Qiagen) e ligado no vetor de transferência em uma relação de 3:1. Um clone positivo foi selecionado pela análise de restrição e o DNA plasmídico foi preparado a partir de uma cultura de E. coli de 100 ml usando os conjuntos de purificação Qiagen Plasmid. Esta construção será agora chamada de pAcA84/M2.

Exemplo 2. Construção de um Vetor Intermediário (“Transportador”) Devido às limitações no número de sítios de restrição convenientes para clonar os genes da influenza no vetor de transferência pAcA84, um vetor de clonagem transportador foi gerado que carrega três promotores de baculovírus (duas poliedrinas e um plO) franqueados por sítios de restrição puros que foram adicionados pela PCR. Este vetor transportador foi construído como segue: pAcAB4M2. (do exemplo 1) foi digerido com Smal e dividido em duas amostras. Uma amostra pAcAB4/M2-5waI foi digerido com Xbal, que liberou um fragmento de DNA de 400 nucleotídeos de comprimento. Este DNA foi purificado em gel e amplificado pela PCR com dois iniciadores, um dos quais incorporou em uma extremidade do produto final os sítios PmeI (itálicos) e NotI (sublinhado): 5’ GTTTAAA CGÇGGÇÇGÇCGT ATTT AT AGGTTTTTTT ATT A 3’ (SEQ Π) NO: 4) 5’ TTTTATTACTAGTCCCGGGGATCTGTGATTGTAAAT 3' (SEQ K) NO: 5) A outra amostra pAcAB4/M2-Smd foi digerida com BamHI e o fragmento de DNA Smal/BamEl liberado foi purificado em gel e também amplificado pela PCR com dois iniciadores, um dos quais incorporou no produto de PCR final os sítios Saci (itálicos) e NheI (sublinhado): 5’ AAGAGCrCGCTAGCGTATTTATAGGTTTTTTTATTA 3’ (SEQID NO: 6) 5’ ACAATCACAGATCCCCGGGACTAGTAATAAAACCTAGA 3’ (SEQ D NO: 7) Estes dois produtos de PCR, que se sobrepõe nos términos não modificados, foram usados em uma outra reação de PCR com dois iniciadores externos específicos para os sítios de enzima de restrição recém incorporados: 5’ GTTTAAACGCGGCCGCCG 3’ (SEQ ID NO: 8) 5’ AAGAGCTCGCTAGCGTA 3’ (SEQ ID NO: 9) Este DNA de PCR foi depois digerido com Sacl/Pmel. O plasmídeo pNEB193 (Promega) também foi digerido com BaclIPmel e ligado com o DNA de PCR digerido com T4 ligase. Finalmente, este vetor transportador pNEB193 resultante carrega um fragmento de DNA contendo dois promotores da poliedrina e um promotor plO flanqueado pelos novos sítios de restrição que são usados na clonagem subseqüente dos genes da influenza HA, NA e Ml.

Exemplo 3 Clonagem dos Genes HA, NA e Ml da Influenza no Vetor Transportador Os genes da influenza HA, NA e matriz (Ml) foram recuperados pela RT-PCR de RNA genômico purificado do víms da influenza A/Udom/72 (H3N2). todos os três genes foram clonados como insertos de DNA nos vetores pGemT ou pGemTeasy (Promega) e seqüenciados com iniciadores específicos usando uma reação de seqüenciamento de terminação de pigmento e um seqüenciador de DNA ABI377 automatizado. Os dois sítios de junção doadores na extremidade 5’ do gene Ml foram mutados usando um Conjunto QuikChange da Stratagene (junção pGT-Ml) para impedir a junção potencial do mRNA de Ml nas células hospedeiras.

Estes três genes foram clonados no vetor transportador em três etapas: 1) Clonagem do gene Ml: O plasmídeo pGemT/Ml (junção) (pGemT que carrega o gene Ml) foi usado como o padrão em uma reação de PCR com iniciadores 5’ e 3’ que introduziram um sítio Nhel e um Saci, respectivamente, no DNA amplificado. Este DNA de PCR foi depois digerido com NheVSacl e purificado em gel. Similarmente, o vetor transportador pNEB 193 foi digerido com NheVSacl e purificado. O vetor transportador e o inserto (Ml PCR) foram ligados e amplificados na E. coli seguindo-se a transfecção. O gene Ml foi seqüenciado usando BigDye (Perkin Elmer). O gene Ml foi posicionado a jusante a partir do promotor da poliedrina. O plasmídeo resultante foi chamado de pNEB 193M1. 2) Clonagem do gene HA: O plasmídeo pGemT/HA (pGemT que carrega o gene HA) foi digerido com SaciI e inserido na extremidade. Ligadores Notl foram ligados no DNA digerido. O DNA foi depois digerido com Notl de modo que o inserto HA pôde ser liberado e ter sítios Notl em cada extremidade. O plasmídeo pNEB193Ml foi digerido com Notl, tratado com fosfatase intestinal bovina (CIP) e o inserto HA foi ligado nele com T4 DNA ligase (não direcional). A PCR foi usada para determinar a orientação do gene HA, que está sob o controle transcricional do promotor da poliedrina. O plasmídeo resultante foi chamado de pNEB193Ml/HA. 3) Clonagem do gene NA: O plasmídeo pGemT/NA3B (que carrega o gene NA) foi primeiro digerido com SfldI e inserido na extremidade com T4 DNA polimerase. Subseqüentemente, o gene NA foi liberado pela digestão com Spel e inserido com Klenow e o inserto de NA foi ligado na extremidade abrupta. Em seguida, o pNEB193Ml/HA foi digerido com Smal e o inserto de NA foi ligado na extremidade abrupta. A PCR foi usada para identificar o clone que carregou o gene NA na orientação correta. O gene NA foi posicionado a jusante a partir do promotor plO. O plasmídeo resultante foi chamado de pNEB193Ml/HA/NA.

Exemplo 4 Construção de um Vetor de Transferência Contendo os Genes M2, Ml, HA e NA da Influenza Depois de completar o processo descrito no Exemplo 3, o vetor transportador pNEB193Ml/HA/NA conteve os genes Ml, HA e NA posicionados sob o controle regulador de transcrição dos promotores de baculovírus. Para liberar estes três genes como um único pedaço de DNA, o vetor transportador foi digerido com Pmel/Sacl. Este fragmento de DNA foi ligado no pAcAB4M2 do Exemplo 1 (que já continha o gene M2), que foi modificado como segue: Novos sítios de restrição foram introduzidos no pAcAB4/M2 para facilitar a clonagem do fragmento de DNA contendo estes três genes a partir do vetor transportador. Este plasmídeo pAcAB4/M2 foi depois digerido com Xbal, inserido nos términos com DNA polimerase (fragmento Klenow) e os ligadores Pmel adicionados com T4-DNA ligase. Este DNA foi depois digerido com Pmel e religado ao sítio Pmel regenerado. Similarmente, o plasmídeo religado foi digerido com BamEl, inserido com DNA Polimerase (Klenow) e os ligadores «Saci foram ligados com T4 ligase. A digestão subseqüente com «Saci e a ligação restauraram o sítio Saci. O vetor pAcAB4/M2 resultante tem dois sítios novos, Pmel e Saci. O vetor foi preparado para a inserção dos genes adicionais da influenza pela digestão com Pmel/Sacl e purificação em gel. Todas as junções foram seqüenciadas para assegurar-se de que nenhuma mutação fosse introduzida durante a clonagem do pNEB193. A construção resultante foi designada HA/Q (ver a Figura 1), que é um vetor de transferência que carrega quatro genes da influenza (P AcAB4/M2/M 1 /HA/NA).

Exemplo 5 Geração de Vetores de Transferência Quiméricos A sequência codificadora para a proteína G do VSV foi recuperada a partir do VSV pela RT-PCR de RNA viral com iniciadores específicos para as extremidades 3’ e 5’ do gene G (5’ AACAGAGATCGATCTGT 3’ (SEQ ID NO: 10) e 5’ CATAAAAATTAAAAATTAAAATATAATTAAGG 3’ (SEQ ID NO: 11)) e clonada no plasmídeo pGemT (Promega). O clone pGemT-VSV resultante foi digerido com fedí e abruptamente terminado com T4 DNA Polimerase. Ela foi depois digerida com Spel e inserida na extremidade com Klenow. ligadores Notl foram adicionados com T4 ligase e depois redigeridos com Notl. Subseqüentemente, a seqüência codificadora de G do VSV foi ligada no vector Q28 que foi digerido com Notl para remover o gene HA. A orientação do gene foi confirmada pela PCR e seqüenciamento. esta construção foi designada vetor de transferência VSV-G.

Em uma forma de realização alternativa, apenas uma parte do gene G do VSV foi inserida. Um gene quimérico (ver Figura 2) contendo o ectodomínio da proteína G fundida na matriz com os domínios de transmembrana (29 aminoácidos) e citoplásmico (14 aminoácidos) de HA foi gerado pela PCR como segue: O domínio de transmembrana e a cauda citoplásmica do gene HA da influenza foram amplificados a partir do clone pGemT-HA pela PCR e purificados em gel. O ectodomínio do gene G do VSV também foi amplificado pela PCR e purificado em gel. Ambos destes fragmentos de DNA foram usados como padrões em uma reação de PCR com Pfu DNA polimerase (Stratagene, LaJolla, CA) dando origem a um iniciador correspondente á extremidade 5’ do gene G do VSV e a extremidade 3’ do gene HA. Um fragmento de DNA de 1620 pares de base foi purificado em gel e ligadores Notl foram adicionados com T4 ligase, seguido pela digestão com Notl. Este inserto foi ligado no vetor HA/Q que foi digerido com Notl para remover o gene HA. A construção resultante gerou o vetor de transferência VSV-G/HA (quimera).

Exemplo 6 Transfecção de Recombinantes de Baculovírus Quádruplo em Células de Inseto. Células Sf9 (ATCC CRL 1711) foram semeadas em placas de 60 mm a uma densidade de 2 x 106 células por placa. Aproximadamente 2 pg de vetor de transferência HA/Q foram misturados com 0,5 pg de BaculoGold DNA linearizado (PharMingen) e as células Sf9 foram transfectadas com o DNA usando o Conjunto de Transfecção BaculoGold (Pharmingen). Os baculovírus recombinantes foram selecionados e purificados por três rodadas de purificação de placa. Um tal recombinante purificado em placa foi designado HA/Q28 e foi selecionado para outros estudos.

Além disso, o DNA vetor de transferência quádruplo que carrega um VSV-G ou um VSV-G/HA (quimera) de comprimento completo foi transfectado com DNA BaculoGold linearizado em células Sf9 como descrito acima para gerar os VSV-G/Q e VSV-G/HA/Q recombinantes. Os vírus recombinantes foram selecionados como descrito acima para HA/Q28. Todos os recombinantes foram amplificados em células Sf9 até um título de 7 x 107pfu/ml.

Exemplo 7 Desenvolvimento de Células Sf9 de inseto e Infecção com Recombinantes de baculovírus Todas as culturas de célula Sf9 foram cultivadas em suspensão em meio isento de soro. As infecções com recombinantes de baculovírus foram realizadas a uma multiplicidade de infecção (MOI) de 5. Os vírus recombinantes foram inoculados nas monocamadas de célula em um volume pequeno, deixadas absorver durante 30 minutos na temperatura ambiente e depois incubadas a 28° C depois de adicionar meio fresco isento de soro. As células e o meio de cultura foram coletados 72 horas após a infecção, a menos que de outro modo especificado e usados para a análise de expressão de proteínas e formação de VLPs subseqüentes.

Exemplo 8 Clonagem de Genes da Influenza Únicos no Vetor de Transferência pBlueBac4.5 e Geração de Recombinantes de Baculovírus Únicos O gene Ml da influenza MJdom foi previamente clonado no pGemT (junção pGT-Ml, ver o Exemplo 1 acima). Para subclonar o gene Ml, o pGT-Ml foi digerido com Sacll, abruptamente terminado com T4 DNA polimerase e ligadores Saci foram adicionados às extremidades com T4 ligase. O plasmídeo foi depois digerido com Sacll SaR e a Ml liberada foi purificada em gel. O inserto foi ligado no pBlueBac4.5 (Invitrogen), que foi digerido com Sacll SaR e as células DH5a foram transformadas com a mistura de ligação.

Para subclonar o gene HA no pBlueBac4.5, o pGemT/HA (ver o Exemplo 3 acima) foi digerido com Sacll e abruptamente terminado com T4 DNA Polimerase. O DNA foi depois redigerido com SaR para remover o inserto e foi purificado em gel. O inserto HA foi ligado no pBlueBac 4.5 digerido com Nhel (abrupto)/ SaR e as células de E. coli competentes STBL2 foram transformadas com a mistura de ligação. O pGemT-ΝΑ (ver o Exemplo 3 acima) foi digerido com Sacll e abruptamente terminado com T4 DNA Polimerase. Este DNA foi depois digerido com Spel e purificado em gel. O inserto foi ligado em um vetor pBlueBac4.5 que foi digerido com Nhel/Smal e as células de E. coli competentes STBL2 foram transformadas.

Quando o DNA vetor de transferência foi descoberto estar correto pelo seqüenciamento, as células Sf9 foram transfectadas com 5 pg de cada clone pBlueBac e 10 pg de DNA Bac & Blue (Invitrogen). As células Sf9 foram cotransfectadas com estes DNAs pela transfecção mediada por lipossoma. As células foram incubadas durante cinco dias e o sobrenadante foi purificado em placa. As placas azuis únicas foram cultivadas e amplificadas em células Sf9 e a expressão da proteína foi avaliada pelos Western Blots. Os baculovírus recombinantes NP (contendo o gene NP da influenza) usados neste trabalho foram construídos como descrito por Galarza et al (27).

Exemplo 9 Análise de Imunoblot A análise de western blot foi usada para identificar proteínas em células Sf9 infectadas, nos sobrenadantes concentrados e nas frações gradientes. As amostras foram resolvidas em um gel de SDS-PAG a 10 % (a menos que de outro modo especificado) e transferidas sobre uma membrana de nitrocelulose. As manchas foram bloqueadas em uma solução de TBS (solução salina tamponada por tris) contendo 5 % de leite em pó desnatado e 0,1 % de Tween-20 e subseqüentemente sondadas com uma mistura de anticorpos monoclonais para as proteínas HA, Ml (matriz) e M2 da influenza. O anti-HA monoclonal de camundongo (clone 12CA5) foi obtido da Roche Molecular Biochemicals (Indianapolis, IN). O anti-Ml monoclonal de camundongo (clone GA2B) foi da Serotec (Raleigh, NC). O anti-M2 monoclonal de camundongo foi da Mt. Sinai Hybridoma Center (Nova Iorque, NY). Os antígenos foram visualizados em western blots com um anticorpo secundário IgG anti-camundongo conjugado à alcalino fosfatase (Promega). As análises de formação de VLP nas células Sf9 infectadas com uma combinação mono, dupla ou tripla de recombinantes de baculovírus de gene único foram realizadas de uma maneira similar. As análises de amostras contendo a proteína G do VSV foram sondadas com um anticorpo anti-G monoclonal de camundongo (clone PSD4; Roche Molecular Biochemicals) em combinação com os anticorpos para as proteínas Ml e M2 da influenza. Os resultados são mostrados na Figura 3.

Exemplo 10 Imunofluorescência de Células Sf9 Infectadas As células Sf9 foram cultivadas em oito câmaras quadradas (as culturas em caixa) e infectadas com recombinantes de baculovírus quádruplo ou de gene único a uma MOI de 1. A 72 horas após a infecção, caixas individuais de células Sf9 foram fixadas em metanol/acetona (2:1) ou paraformaldeído a 3 %. Como uma etapa de bloqueio, as células fixadas foram incubadas durante 30 minutos na temperatura ambiente em solução salina tamponada por fosfato (PBS) contendo 3 % de albumina de soro bovino (BSA). Subseqüentemente, cada lâmina foi incubada seqüencialmente com uma solução de anticorpos primários e secundários. Uma combinação de i anticorpos anti-HA de rato (Roche Molecular Biochemicals) / anti-Ml monoclonal de camundongo (ver o Exemplo 9) (como primário, diluição 1:100) e uma combinação de anticorpos de rodamina de cabra anti-rato conjugada (Molecular Probes) / FITC anti-camundongo de ovelha conjugada (Sigma) (como secundário) foram usados para examinar a expressão de HA e ! Ml. Uma combinação de anticorpos anti-HA monoclonal de rato / peptídeos anti-NA de coelho (feitos de encomenda pela Research Genetics) (como primário, diluição 1:100) e rodamina de cabra anti-rato conjugada (Molecular Probes)/FITC de ovelha anti-coelho conjugada (Sigma) (como secundário) foram usados para examinar a expressão de NA e HA. Como uma alternativa à ) rodamina, um anticorpo de cabra anti-rato conjugado a Cy3 (Sigma) pode ser usado. Cada reação de anticorpo foi incubada durante 30 minutos na temperatura ambiente e, entre as etapas, as lâminas foram enxaguadas três vezes com PBS. As moléculas de FITC e rodamina emitiram luzes verde e vermelha respectivamente quando excitadas em comprimentos de onda de 495 i nm e 552 nm, que foram discriminadas com filtros apropriados. Os resultados das análises de imunofluorescência estão mostrados nas Figuras 4 a 7.

Exemplo 11 Purificação de VLPs da Influenza η As células Sf9 foram semeadas a uma densidade de 7,5 x 10 Λ células por 150 cm de frasco de cultura de tecido e deixadas sedimentar na temperatura ambiente durante 30 minutos. As células foram infectadas com recombinantes de baculovírus (HA/Q28, VSV-G/Q, VSV-G/HA/Q quimera ou recombinante único) a uma MOI de 5 e a infecção foi deixada processar durante 72 horas a 28° C. Quando completa, o meio de cultura foi colhido e submetido à centrifugação de baixa velocidade (30 minutos a 4o C e 2000 x g). O sobrenadante foi depois pelotizado por rotação a 200000 x g durante 90 minutos. Dependendo do número de células inicialmente infectadas, as pelotas resultantes foram recolocadas em suspensão em 50 μΐ ou 500 μΐ de IX PBS, homogeneizadas por uma sonicação breve e depois carregadas no topo de um gradiente de Iodixanol (Optiprep, Hycomed/Sigma) (densidade de 1,08 g/ml a 1,32 g/ml). O gradiente foi girado a 200000 x g durante 3,5 horas e as frações foram coletadas por gravidade a partir do fundo do tubo usando um tubo micro-capilar na forma de U. As alíquotas destas frações foram analisadas pela western blot depois SDS-PAGE. As western blots estão mostradas nas Figuras 8 e 9. Para purificar ainda mais as partículas, as frações contendo as VLPs foram submetidas a uma segunda centrifugação de gradiente de sacarose. Para a centrifugação de gradiente em equilíbrio de sacarose, a fração previamente selecionada foi dialisada com PBS e disposta em camada sobre um gradiente de 20 a 60 % (p/p) de sacarose (em NTE) e centrifugada durante 22 horas a 4o C e 150000 x g. Depois da centrifugação, frações de 0,5 ml foram coletadas a partir do fundo do tubo, como descrito acima e analisadas pela western blot depois SDS-PAGE.

As frações contendo as VLPs foram depois examinadas pelo microscópio eletrônico e uma rotulação com Imunoouro (ver Exemplo 12). Exemplo 12 Microscópio Eletrônico: Tingimento Negativo e Rotulação com Imunoouro Para o tingimento negativo e a rotulação com imunoouro, as VLPs foram concentradas a partir do sobrenadante da cultura e purificadas por duas centrifugações de gradiente de densidade consecutiva (ver o Exemplo 11). As alíquotas das amostras foram colocadas em grades revestidas com plástico/carbono descarregadas incandescentes frescas, lavadas suavemente com umas poucas gotas de água destilada, tingidas negativo com fosfotungstato de sódio a 2 %, pH 6,5 e visualizadas com um microscópio eletrônico. Uma micrografia eletrônica de VLPs da influenza negativamente tingidas está representada na Figura 10.

As amostras para a rotulação com imunoouro dos antígenos de superfície que decoram as VLPs foram pré fixados em glutaraldeído a 0,5 % durante cinco minutos, colocadas sobre as grades como descrito acima e lavadas com umas poucas gotas de água destilada. Subseqüentemente, elas foram seqüencialmente incubadas voltadas para baixo no topo de volumes de 100 μΐ das seguintes soluções: anticorpos primários diluídos em PBS-1 % de BSA durante 30 minutos; três vezes com PBS-1 % de BSA durante cinco minutos cada; a suspensão de esferas de ouro revestidas com anticorpo contra IgG de camundongo diluído em PBS-1 % de BSA (1:10) durante 30 minutos; três vezes com PBS-1 % de BSA, durante cinco minutos cada um. Finalmente, elas foram lavadas com umas poucas gotas de água destilada, tingidas com acetato de uranila a 2 %, secadas ao ar e examinadas no microscópio eletrônico.

As micrografías eletrônicas de VLPs da influenza rotuladas com imunoouro sondadas com anticorpos monoclonais anti-HA ou anti-NA e contra-manchadas com esferas de ouro ligadas à IgG anti-camundongo estão descritas na Figura 11.

Exemplo 13 Incorporação da Nucleoproteína (NP) da influenza nas VLPs Células Sf9 foram co-infectadas com recombinantes de baculovírus únicos HA/Q28 e NP ou NP e Ml. Os sobrenadantes concentrados das células co-infectadas foram purificados de acordo com o Exemplo 11. Uma western blot da fração contendo tanto HA quanto NP como expressada por estas células co-infectadas está representada na Figura 9B. Uma western blot da fração contendo NP e Ml como expressada por estas células co-infectadas está representada na Figura 8C.

Exemplo 14 Imunogenicidade de VLPs em Camundongos Dois grupos de camundongos Balb/c (de 4 a 5 semanas de idade) foram imunizados pela via intramuscular com VLPs HA/Q28 (aproximadamente 1 pg de HA) ou VLPs VSV-G/Q (aproximadamente 1 pg de G), onde cada conjunto de VLPs foi formulado com fosfato de alumínio (200 pg/dose). Todos os camundongos em cada grupo recebeu uma preparação e duas injeções de reforço em intervalos de duas semanas. Duas semanas depois da última imunização, amostras de sangue foram obtidas e a presença de anticorpos contra o antígeno correspondente foi avaliada pela western blot (para ambos os tipos de VLPs), o ensaio de inibição de hemaglutinação (IHA) (para a HA/Q28) e um teste de neutralização de soro (para a VSV-G/Q). as western blots estão descritas na Figura 12 (para HA/Q28) e na Figura 13 (para VSV-G/Q). os títulos de IHA foram medidos em unidades de IHA (IHAU) e foram como segue: Camundongos ingênuos: 32 IHAU* Controle positivo: 128 IHAU [influenza A/Hong Kong] Soros agrupados de HA/Q28: 96 IHAU * Os camundongos ingênuos apresentaram um título de inibição, que pode ser devido às aglutininas não específicas. Todas as amostras foram tratadas com caulim e aquecidas a 56° C durante 30 minutos em um esforço para inativar os inibidores não específicos e/ou aglutininas não específicas.

Para o teste de neutralização do soro, diluições crescentes dos soros de camundongos imunizados com VSV-G/Q foram colocadas em cima de uma monocamada de célula contendo VSV, incubadas e analisadas quanto a capacidade para inibir o vírus, como visto pela prevenção da formação de qualquer placa na monocamada de célula. Foi descoberto que uma diluição tão alta quanto 1/64 dos soros neutralizou completamente um título padrão de VSV (1 x 106 PFU/ml).

Exemplo 15 Empacotamento de Complexos de Ribonucleoproteína (RNPs) Nas VLPs da Influenza e a Expressão de Genes Repórteres Polimerase (Subunidades PB1, PB2 e PA) e Construção do Baculovírus NP (Recombinante de Vetor de Transferência Quádruplo) Os três genes que codificam as subunidades da polimerase (proteínas PB1, PB2 e PA) e a nucleoproteína NP do vírus da influenza da cepa A/Udom/72 (H3N2) foram subclonados em um único vetor de transferência de baculovírus PAcAB4. Os genes PB1 e PA foram posicionados nas orientações opostas sob o controle transcricional do promotor da poliedrina de baculovírus, ao passo que os genes PB2 e NP, também em orientações opostas, estavam sob o controle transcricional do promotor de baculovírus plO. A co-transfecção de células de inseto Sf9 com DNA vetor de transferência purificado, que carrega os genes da polimerase e NP, e o DNA de baculovíms genômico linearizado, permitiu a recombinação homóloga. Isto resultou na transferência dos genes da polimerase e NP no DNA de baculovírus. Este evento de recombinação intracelular gerou o recombinante de baculovírus quádruplo (Figura 14) que foi liberado no meio de cultura. Três etapas de purificação/amplifícação de placa consecutivas foram realizada para selecionar os recombinantes de vetor de transferência de baculovírus quádruplo. A PCR usando os iniciadores específicos de gene foi realizada para confirmar a presença dos quatro genes nos recombinantes quádruplos purificados. Os ensaios de western blot com anticorpos policlonais específicos anti-PBl, anti-PB2, anti-PA e anti-NP foram realizados para avaliar a expressão das três subunidades de polimerase e NP (dados não mostrados).

Construções de Gene Repórter Plasmídeos de DNA foram gerados que contiveram os genes da luciferase ou da proteína de fluorescência verde (GFP) flanqueados pelos términos 3’ e 5’ conservados do vírus da influenza. Estas seqüências são requeridas para a transcrição/replicação e empacotamento do genoma da influenza em uma infecção do vírus do tipo selvagem. Além das seqüências conservadas, os términos 3’ e 5’ precisos são essenciais para um genoma funcional. De modo a obter estas extremidades precisas, um promotor T7 alterado foi adicionado ao término 5’ da seqüência da influenza; depois disso, a transcrição com T7 RNA polimerase gerou términos 5’ da influenza precisos nos transcritos de RNA. Além disso, um sítio de restrição Bsal foi engendrado na extremidade 3’ da seqüência da influenza. A digestão do plasmídeo com esta enzima de restrição produziu padrões de DNA com projeções em 5’, que no decorrer das reações de transcrição da T7 RNA polimerase, gerou moléculas de RNA com os términos 3’ da influenza parecidos. Estes genes repórteres da influenza modelo foram depois usados para estudar a atividade da polimerase, a encapsidação de RNA e o empacotamento de RNA em partículas semelhantes ao vírus da influenza. Empacotamento de VLP do Gene Repórter da Luciferase Células de inseto Sf9 foram simultaneamente infectadas (MOI: 5) com os vectores recombinantes de baculovírus Q28 (HA, NA, Ml, M2) e de transferência quádruplo (PB1, PB2, PA, NP). A infecção foi deixada processar durante 48 horas e neste tempo, 30 pg de um RNA sintetizado in vitro contendo o gene da luciferase na orientação reversa flanqueado pelas seqüências de términos 3’ e 5’ do genoma da influenza, foram transfectados em células Sf9 usando o reagente de transfecção LT1 (Panvera, Madison, WI). As células infectadas/transfectadas foram incubadas por um adicional de 24 horas. 0 sobrenadante da cultura foi depois colhido, clarificado pela centrifugação em baixa velocidade e as VLPs concentradas pela centrifugação durante duas horas a 2000 x g. As VLPs foram recolocadas em suspensão no meio de cultura e aplicadas sobre uma monocamada nova de células renais de hamster bebê (BHK). Depois de 48 horas de incubação, as células BHK foram rompidas com tampão de lise de ensaio de luciferase e a atividade de luciferase medida no extrato celular. A atividade de fundo da luciferase foi determinada em células BHK não infectadas (controle) usando um luminômetro e as leituras variaram de 50 a 500 unidades de luz relativa (RLUs). Os lisados de células BHK infectadas com VLP registraram uma leitura de atividade de luciferase de 36.000 RLUs (Figura 15).

Empacotamento de VLP do Gene Repórter da Proteína de Fluorescência Verde (GFP) Experimentos de empacotamento de RNPs em VLPs similares foram realizados usando o gene da proteína de fluorescência verde (GFP) como um repórter. As células de inseto Sf9 foram infectadas/transfectadas seguindo-se os parâmetros descritos acima. As moléculas de KNA transfectadas foram construídas que contiveram a seqüência codificadora para a GFP em uma orientação de anti-sentido flanqueada pelos términos 3’ e 5’ do RNA viral da influenza. Células BHK e células MDCK foram infectadas durante 24 horas com VLPs e a expressão de GFP foi depois monitorada usando um microscópio Zeiss e filtros de isotiocianato de fluoresceína (FITC). Um número pequeno de células verdes estavam presentes sugerindo que as VLPs foram capazes de transferir o gene GFP, resultando desse modo na expressão da proteína de fluorescência verde (Figura 16).

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Claims

1. Método de produção de partículas semelhantes ao vírus da influenza (VLPs), caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: (i) construir uma molécula de DNA recombinante que em termos de proteínas do vírus da influenza codifica somente a proteína estrutural de matriz do vírus da influenza (Ml); (íi) transformar uma célula hospedeira adequada com a dita molécula de DNA recombinante, cultivando a célula hospedeira sob condições que permitam a expressão da dita proteína estrutural do vírus da influenza, de modo que as VLPs sejam unidas dentro das células depois da expressão da proteína estrutural do vírus da influenza; e (iii) purificar as VLPs a partir do sobrenadante da cultura.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de ainda compreender construir uma segunda molécula de DNA recombinante codificando uma proteína estrutural da influenza selecionada do grupo que consiste de hemaglutinina (HA), neuraminidase (NA) e o produto do splicing do mRNA de Ml (M2).

3. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a HA é de um subtípo de vírus da influenza selecionado do grupo consistindo dos subtipos A, B e C; e NA é de um subtipo de vírus da influenza selecionado do grupo consistindo dos subtipos A, B e C; em que o subtipo selecionado de PIA é diferente do subtipo selecionado de NA.

4. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a sequência de DNA na molécula de DNA recombinante que codifica a HA ou NA é trocada por uma sequência de DNA que codifica uma porção não produzida por vírus da influenza, de modo a produzir VLPs quimérícas.

5. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado, pelo fato de que a seqüência de DNA na molécula de DNA recombinante que codifica a HA é substituída por um seqüência de DNA que codifica a proteína G do vírus da estomatite vesicular (VSV).

6. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a seqüência de DNA em uma molécula de DNA recombinante codifica os domínios de transmembrana e citoplásmico de HA, mas a região codificadora remanescente de HA é substituída por uma seqüência de DNA que codifica o ectodomínio da proteína G do VSV.

7. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que ainda compreende co-transfectar, co-infectar ou co-transformar a célula hospedeira com uma molécula de DNA recombinante que codifica uma proteína da influenza, de modo que a proteína da influenza seja incorporada dentro das VLPs.

8. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a molécula de DNA recombinante que codifica a proteína de nucleocapsídeo (NP) da influenza.

9. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que ainda compreende co-transfectar, co-infectar ou co-transformar a célula hospedeira com uma molécula de DNA recombinante que codifica uma parte não produzida pelo vírus da influenza, de modo que a parte que não da influenza seja incorporada dentro das VLPs.

10. VLPs da influenza, caracterizadas pelo fato de que consistem da proteína estrutural Ml do vírus da influenza.

11. VLPs da influenza, caracterizadas pelo fato de que consistem da proteína estrutural Ml do vírus da influenza e uma proteína estrutural do vírus da influenza selecionada do grupo que consiste de HA, NA e M2.

12. VLPs da influenza de acordo com a reivindicação 11, caracterizadas pelo fato de que a HA é de um subtipo de vírus da influenza selecionado do grupo consistindo dos subtipos A, B e C; e NA é de um subtipo de vírus da influenza selecionado do grupo consistindo dos subtipos A, B e C; em que o subtipo selecionado de HA é diferente do subtipo selecionado de NA.

13. VLPs da influenza quiméricas, caracterizadas pelo fato de que consistem da proteína estrutura Mie uma proteína estrutural da influenza selecionada do grupo consistindo de HA, NA e M2, em que a sequência de DNA codificando a HA e NA foi substituída por uma sequência de DNA codificando uma porção não produzida pelo vírus da influenza, de forma a compreender VLPs quiméricas.

14. VLPs quiméricas de acordo com a reivindicação 13, caracterizadas pelo fato de que a sequência de DNA codificando HA ou NA é substituída por uma sequência de DNA codificando um peptídeo, polipeptídeo ou proteína produzidos por um microorganismo patogênico.

15. VLPs quiméricas de acordo com a reivindicação 14, caracterizadas pelo fato de que a HA é substituída pela proteína G do VSV.

16. VLPs quiméricas de acordo com a reivindicação 14, caracterizadas pelo fato de que os domínios de transmembrana e citoplásmico de HA estão presentes, mas a região remanescente de HA é substituída pelo ectodomínio da proteína G do VSV.

17. VLPs da influenza de acordo com a reivindicação 10, caracterizadas pelo fato de que uma proteína da influenza é incorporada dentro das VLPs.

18. VLPs da influenza de acordo com a reivindicação 17, caracterizadas pelo fato de que a proteína da influenza incorporada dentro das VLPs é a NP.

19. VLPs da influenza de acordo com a reivindicação 10, caracterizadas pelo fato de que uma parte não produzida pelo vírus da influenza é incorporada dentro das VLPs.

20. Composição imunogênica, caracterizada pelo fato de que compreende as VLPs de acordo com a reivindicação 10, juntas com um diluente ou veículo.

21. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 20, caracterizada pelo fato de que ainda compreende um adjuvante.

22. Composição imunogênica, caracterizada pelo fato de que compreende as VLPs como definidas na reivindicação 11, juntas com um diluente ou veículo.

23. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 22, caracterizada pelo fato de que ainda compreende um adjuvante.

24. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende as VLPs como definidas na reivindicação 13, juntas com um diluente ou veículo.

25. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 24, caracterizada pelo fato de que ainda compreende um adjuvante.

26. Composição imunogênica, caracterizada pelo fato de que compreende as VLPs como definidas na reivindicação 14, juntas com um diluente ou veículo.

27. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 26, caracterizada pelo fato de que ainda compreende um adjuvante.

28. Composição imunogênica, caracterizada pelo fato de que compreende as VLPs como definidas na reivindicação 17, juntas com um diluente ou veículo.

29. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 28, caracterizada pelo fato de que ainda compreende um adjuvante.

30. Composição imunogênica, caracterizada pelo fato de que compreende as VLPs como definidas na reivindicação 19, juntas com um diluente ou veículo,

31. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 30, caracterizada pelo fato de que ainda compreende um adjuvante.

32. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende as VLPs como definidas na reivindicação 19, juntas com um diluente ou veículo.

33. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 32, caracterizada pelo fato de que ainda compreende um adjuvante.

34. Uso de VLPs da influenza como definidas na reivindicação 10, caracterizado pelo fato de ser para a preparação de uma composição imunogênica para imunizar um mamífero contra a infecção causada pelo vírus da influenza, dita composição ainda compreendendo um diluente ou veículo.

35. Uso de VLPs da influenza como definidas na reivindicação 11, caracterizado pelo fato de ser para a preparação de uma composição imunogênica para imunizar um mamífero contra a infecção causada pelo vírus da influenza, dita composição ainda compreendendo um diluente ou veículo.

36. Uso de VLPs quiméricas como definidas na reivindicação 14, caracterizado pelo fato de ser para a preparação de uma composição imunogênica para imunizar um mamífero contra a infecção causada por um microorganismo patogênico diferente do vírus da influenza, dita composição ainda compreendendo um diluente ou veículo.

37. Uso de VLPs da influenza como definidas na reivindicação 19, caracterizado pelo fato de ser para a preparação de uma composição imunogênica para imunizar um mamífero contra a infecção causada por um microorganismo patogênico diferente do vírus da influenza, dita composição ainda compreendendo um diluente ou veículo.

38. VLPs da influenza de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 19, caracterizadas pelo fato de que unem e empacotam complexos de ribonucleoproteína.

39. VLPs da influenza de acordo com a reivindicação 38, caracterizadas pelo fato de que ainda expressam uma seqüência de nucleotídeo heteróloga.

40, VLPs da influenza de acordo com a reivindicação 39, caracterizadas pelo fato de que a seqüência de nucleotídeo heteróloga na expressão é uma parte não produzida pelo vírus da influenza.