PL205955B1 - Układ oparty na minimalnej liczbie plazmidów do wytwarzania infekcyjnych wirusów RNA o ujemnej nici, komórka gospodarza zawierająca taki układ, sposób wytwarzania wiriona wirusa RNA o ujemnej nici, sposób wytwarzania atenuowanego wirusa RNA o ujemnej nici, sposób wytwarzania zakaźnego wirusa o ujemnej nici do stosowania w szczepionkach i zastosowanie układu opartego na minimalnej liczbie plazmidów - Google Patents

Układ oparty na minimalnej liczbie plazmidów do wytwarzania infekcyjnych wirusów RNA o ujemnej nici, komórka gospodarza zawierająca taki układ, sposób wytwarzania wiriona wirusa RNA o ujemnej nici, sposób wytwarzania atenuowanego wirusa RNA o ujemnej nici, sposób wytwarzania zakaźnego wirusa o ujemnej nici do stosowania w szczepionkach i zastosowanie układu opartego na minimalnej liczbie plazmidów

Info

Publication number
PL205955B1
PL205955B1 PL366064A PL36606401A PL205955B1 PL 205955 B1 PL205955 B1 PL 205955B1 PL 366064 A PL366064 A PL 366064A PL 36606401 A PL36606401 A PL 36606401A PL 205955 B1 PL205955 B1 PL 205955B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
virus
plasmid
rna
influenza
viral
Prior art date
Application number
PL366064A
Other languages
English (en)
Other versions
PL366064A1 (pl
Inventor
Erich Hoffmann
Original Assignee
St Jude Childrens Res Hospital
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by St Jude Childrens Res Hospital filed Critical St Jude Childrens Res Hospital
Publication of PL366064A1 publication Critical patent/PL366064A1/pl
Publication of PL205955B1 publication Critical patent/PL205955B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5252—Virus inactivated (killed)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5254—Virus avirulent or attenuated
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2720/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsRNA viruses
    • C12N2720/00011—Details
    • C12N2720/00061—Methods of inactivation or attenuation
    • C12N2720/00063—Methods of inactivation or attenuation by chemical treatment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16151—Methods of production or purification of viral material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16161—Methods of inactivation or attenuation
    • C12N2760/16163—Methods of inactivation or attenuation by chemical treatment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16211—Influenzavirus B, i.e. influenza B virus
    • C12N2760/16222—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16211—Influenzavirus B, i.e. influenza B virus
    • C12N2760/16261—Methods of inactivation or attenuation
    • C12N2760/16263—Methods of inactivation or attenuation by chemical treatment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18611—Respirovirus, e.g. Bovine, human parainfluenza 1,3
    • C12N2760/18661—Methods of inactivation or attenuation
    • C12N2760/18663—Methods of inactivation or attenuation by chemical treatment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/24011—Flaviviridae
    • C12N2770/24211—Hepacivirus, e.g. hepatitis C virus, hepatitis G virus
    • C12N2770/24261—Methods of inactivation or attenuation
    • C12N2770/24263—Methods of inactivation or attenuation by chemical treatment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/106—Plasmid DNA for vertebrates
    • C12N2800/107—Plasmid DNA for vertebrates for mammalian
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/40—Systems of functionally co-operating vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/20—Vector systems having a special element relevant for transcription transcription of more than one cistron
    • C12N2830/205—Vector systems having a special element relevant for transcription transcription of more than one cistron bidirectional
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/34—Vector systems having a special element relevant for transcription being a transcription initiation element
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/36—Vector systems having a special element relevant for transcription being a transcription termination element
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/80—Vector systems having a special element relevant for transcription from vertebrates
    • C12N2830/85—Vector systems having a special element relevant for transcription from vertebrates mammalian

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Description

Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest układ oparty na minimalnej liczbie plazmidów do wytwarzania infekcyjnych wirusów RNA o ujemnej nici, komórka gospodarza zawierająca taki układ, sposób wytwarzania wiriona wirusa RNA o ujemnej nici, sposób wytwarzania atenuowanego wirusa RNA o ujemnej nici, sposób wytwarzania zakaźnego wirusa o ujemnej nici do stosowania w szczepionkach i zastosowanie układu opartego na minimalnej liczbie plazmidów.
Badania, które doprowadziły do tego wynalazku finansowane były przez Badawcze Granty (Public Health Research Grants) AI95357, AI29680, AI08831, AI29559 oraz AI29680 National Institute of Alergy and rodowego Instytutu Alergii i Chorób Zakaźnych. Jednocześnie, Rząd Stanów Zjednoczonych może mieć pewne prawa do wynalazku.
Niniejszy wynalazek dotyczy układu opartego na minimalnej liczbie plazmidów, wykorzystywanego do wytwarzania, na podstawie sklonowanego DNA, zakaźnych wirusów RNA, korzystnie wirusów grypy. W szczególności ten wieloplazmidowy układ ułatwia wytwarzanie wirusów zrekombinowanych jak i przearanżowanych.Cykl życiowy wirusów RNA
Genomy wirusów RNA są rozmaicie ukształtowane, mogą być jednocząsteczkowe lub posegmentowane; jednoniciowe o polaryzacji (+) lub (-) bądź dwuniciowe. Wirusy spełniają jednak dwa istotne i wspólne dla nich wymogi: (1) genomowe cząsteczki RNA muszą być wydajnie kopiowane do postaci, które mogą być efektywnie wykorzystywane do składania potomnych cząstek wirusa oraz (2) zachodzić musi synteza cząsteczek mRNA, mogących ulegać wydajnej translacji do białek wirusowych. Ogólnie, wirusy RNA (za wyjątkiem retrowirusów) kodują i/lub niosą polimerazę RNA zależną od RNA do katalizowania syntezy nowych genomowych RNA (do składania w cząstki potomne) i cząsteczki mRNA (do translacji w wirusowe białka).
Eukariotyczne komórki gospodarza typowo nie zawierają maszynerii do replikacji matrycy RNA lub do translacji peptydów z matrycy dwuniciowego lub (-)RNA, dlatego wirusy mające takie kwasy nukleinowe w składzie swojego genomu muszą przenosić białka polimerazy RNA w wirusowej cząstce. Z tej przyczyny, odbiałczone cząsteczki ujemnych jednoniciowych lub dwuniciowych wirusów RNA (pozbawionych towarzyszącej polimerazy RNA) są nieinfekcyjne, w przeciwieństwie do odbiałczanego RNA z genomu wirusa o dodatniej nici RNA, która jest typowo infekcyjna, ponieważ kodowane wirusowe białka podlegają translacji przez maszynerię komórkową gospodarza.
Genomowe wirusowe RNA musi być upakowane w wirusowe cząstki w celu przenoszenia wirusa. Niektóre kapsydy wirusów RNA są opłaszczone lipidową błoną pochodzącą od infekowanych komórek gospodarza, podczas gdy inne posiadają zewnętrzną pokrywę białkową bez podwójnej lipidowej warstwy. Pomimo tych różnic między wirusowymi kapsydami, proces montowania wirusowych cząstek potomnych i interakcje białko/białko, podczas montażu są podobne. Generalnie, wirusowe białka są klasyfikowane jako białka strukturalne i niestrukturalne. Zazwyczaj, niestrukturalne białka są zaangażowane w replikację genomową, regulację transkrypcji i pakowanie. Białka wirusowe strukturalne ogólnie pełnią trzy typy funkcji włączając w to: (1) wiązanie z genomowym RNA (np. białko nukleokapsydu wirusa grypy A), (2) wiązanie pomiędzy upakowanym RNA i zewnętrznym białkiem (np. białko macierzy) i (3) budowę zewnętrznej warstwy wirusowej (np. powierzchniowe białka takie jak hemaglutynina). Wmontowanie w cząstki wirusowe wymaga efektywnego przenoszenia RNA genomowego z jednej komórki do innej w obrębie pojedynczego gospodarza, lub pomiędzy różnymi organizmami gospodarzy.
Wirusy grypy
Wirus grypy typu A, Orthomyxoviridae, jest wirusem posiadającym ujemne RNA z segmentowanym genomem. Cząsteczki genomowego RNA zawierają jedną lub więcej otwartych ramek odczytu oflankowanych przez niekodujące sekwencje przy końcach 5' i 3' (Desselberger i wsp. Gene 1980,
8:315). Cząsteczki wirusowych RNA są połączone w wirionach z wirusową nukleoproteiną (NP) i białkami polimerazy (PB1, PB2 i PA) i w infekowanych komórkach tworzą kompleksy rybonukleoproteinowe (RNP). (Hsu i wsp. Proc. Natl. Acad, Sci. USA 1987, 84:8140). Genetyczna kompozycja wirusa umożliwia jego ewolucję dzięki zdolności rearanżacji segmentów genów pochodzących z różnych szczepów; takie rearanżowanie tworzy wciąż nowe warianty, wobec których nowo zakażony organizm nie rozwija anamnestycznej odpowiedzi immunologicznej. Spośród 15 hemaglutyninowych (HA) oraz neuraminidazowych (NA) podtypów grypy występujących u ptaków wodnych, o 3 podtypach - H1N1, H2N2 i H3N2 wiadomo, że zdolne są wywołać u ludzi pandemię (Webster i wsp., Microbiol. Rev. 1992, 56:152). Istnieją dowody na to, że świnie mogą być pośrednim gospodarzem („mixing vessel”), umożPL 205 955 B1 liwiającym wytworzenie nowych, patogennych dla ludzi, szczepów (Scholtissek i wsp., Virology 1985, 147:287). Wybuch grypy H5N1 typu A w 1987 r. w Hong Kongu pokazał, że silnie patogenne wirusy grypy typu A mogą być także przenoszone bezpośrednio z gatunków ptaków na ludzi (Claas i wsp., Lancet 1998, 351:472; Suarez i wsp., J. Virol. 1998, 72:6678; Subbarao i wsp., Science 1998, 279:393; Shortridge, Vaccine 1999, 17 (Suppl. 1): S26-S29). Potencjał, z jakim wirusy grypy typu A generują nowe patogenne szczepy spośród ogromnej liczby szczepów występujących w środowisku, wskazuje, że kontrola tej choroby wymaga ciągłej obserwacji wirusów i rozwijania ulepszanych środków terapii antywirusowych oraz szczepionek. Tempo, w jakim rozwijają się nowe szczepy, wymaga czujności w podję tym wysiłku monitorowania wirusa oraz wzmo ż enia wydajnoś ci współ czesnych technologii celem produkcji dostatecznej ilości szczepionek przeciw nowo stwierdzanym patogennym szczepom, mającym zapobiec epidemii bądź pandemii.
Układy odwrotnej genetyki pozwoliły na dokonywanie manipulacji w genomie wirusa grypy typu A (Palese i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996, 93:11354; Neuman i Kawaoka; Adv. Virus. Res. 1999, 53:265). W przeciwieństwie do wirusów o nici dodatniej (tj. poliowirusów), wirusowe cząsteczki ujemnego RNA (vRNAs) wirusa grypy typu A nie są zakaźne. Jedynie cząsteczki vRNA otoczone kapsydem złożonym z czterech białek kompleksu polimerazy (PB1, PB2, PA, NP) zdolne są do zapoczątkowania cyklu replikacji oraz transkrypcji wirusa. Po wniknięciu rybonukleoprotein (RNPs) do jądra komórki, białka towarzyszące rozpoczynają transkrypcję cząsteczek (-)vRNA do cząsteczek mRNA (mRNA) i dodatnich komplementarnych cząsteczek RNA (+), cRNA. Cząsteczki cRNA służą jako matryce do syntezy cząsteczek vRNA. Pierwszym układem odwrotnej genetyki powstałym dla celów pozyskiwania wirusa grypy typu A była metoda transfekcji RNA (Luytjes i wsp., Cell 1989, 59:1107; Enami i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1990, 87:3802). Po transkrypcji in vitro wirusopodobnej cząsteczki vRNA za pomocą polimerazy RNA T7 i odtworzeniu cząsteczek wirusowych rybonukleoprotein (vRNA), do komórek eukariotycznych wprowadzono metodą transfekcji genetycznie zmienione fragmenty RNP. Przez infekcję przeprowadzoną z użyciem pomocniczego (helper) wirusa grypy, uzyskano w efekcie wirusy zawierające gen pochodzący z klonowanej cząsteczki cDNA. Jednakże, obecność wirusa pomocniczego w RNA oraz metody transfekcji DNA mocno ograniczają wartość praktyczną tych metod, ponieważ konieczny jest efektywny system selekcji celem pozbycia się wirusa pomocniczego.
Metoda syntezy cząsteczek vRNA przeprowadzanej za pomocą polimerazy I RNA (pol I) in vivo umożliwiła wewnątrzkomórkową produkcję kompleksów RNA (Neumann i Hobom, Virology 1994, 202:477). W układzie tym pomiędzy sekwencje promotora i terminatora pol I wstawiono wirusopodobną cząsteczkę cDNA (Zobel i wsp., Nucl. Acids Res. 1993, 21:3607). W przeciwieństwie do transkryptów mRNA syntetyzowanych przez polimerazę RNA II (pol II), cząsteczki RNA wytworzone przez pol I pozbawione są zarówno czapeczki 5', jak i ogona poli (A) na końcu 3'. Funkcjonalne cząsteczki vRNP można tworzyć bądź przez infekcję wirusem pomocniczym, bądź kotransfekcję wyrażających białka plazmidów kodujących PB1, PB2, PA lub NP (Neumann i Hobom, jw.; Flick i wsp., RNA 1996, 2:1046; Pleschka i wsp., J. Virol. 1996, 70:4188; Zhou i wsp., Virology 1998, 246:83).
Ostatnie badania wykazały, że w wyniku przeprowadzonej za pomocą plazmidu ekspresji wszystkich ośmiu cząsteczek vRNA z promotora pol I oraz koekspresji białek kompleksu polimerazy, powstaje zakaźna forma wirusa grypy typu A (Neumann i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1999, 96:9345; Fodor i wsp., J. Virol. 1999, 73:9679). Ponieważ wytwarzanie wirusa grypy typu A całkowicie z plazmidów nie wymaga przeprowadzania infekcji wirusem pomocniczym, niepotrzebny jest również system selekcji; zatem techniczne ograniczenia nie stanowią już przeszkody w manipulacji wszystkimi fragmentami genu. W układzie stworzonym przez Neumanna i wsp. (jw.), osiem cząsteczek cDNA wstawiono pomiędzy sekwencję promotora ludzkiej pol I (407 bp), a sekwencję mysiego terminatora (174 bp). Ekspresję czterech białek kompleksu RNP przeprowadzono za pomocą promotora ludzkiego cytomegalowirusa. Wynikiem transfekcji komórek 293T w liczbie 106 12 plazmidami było odtworzenie wirusa w liczbie wię kszej niż 103 pfu; wydajność taka moż e ulec poprawie do 5 x 107 pfu po transfekcji 17 plazmidami. Fodor i wsp. (jw.) opracowali układ, w którym osiem cząsteczek cDNA zostało wstawionych pomiędzy sekwencję promotora ludzkiej polimerazy I (250 bp) i genomową sekwencję rybozymu wirusa delta zapalenia wątroby, w celu zapewnienia dokładnie określonego końca 3' vRNA. Aby uzyskać ekspresję genów kompleksu polimerazy, wykorzystano plazmidy zawierające główny późny promotor adenowirusa typu 2. Po wprowadzeniu 12 ekspresyjnych plazmidów do komórek Vero, odzyskano tylko jedną lub dwie cząstki wirusowe spośród 106 stransfekowanych komórek.
Układ nie wykorzystujący wirusów pomocniczych opisany przez Neumann i wsp. (jw.) zawierający promotory pol I i pol II z cDNA wirusa na różnych plazmidach, wymaga jednakże konstruowania
PL 205 955 B1 i kotransfekcji co najmniej 12 plazmidów w celu odzyskania wirusa i 17 plazmidów w celu wydajnego odzyskania wirusa. Transfekcja komórek tak dużą liczbą plazmidów może ograniczyć wykorzystanie tego układu do linii komórkowych charakteryzujących się wysoką wydajnością transfekcji. Aby można było odzyskiwać wirusa z różnych typów komórek, można zwiększyć wydajność wirusową przez wzmocnienie replikacji wirusa A grypy w tych komórkach oraz zwiększenie zakresu komórek odpowiednich do wytwarzania szczepionek (Govorkova i wsp., J. Virol. 1996, 70:5519).
Jest zatem w nauce potrzeba wydajniejszego wytwarzania zrekombinowanych wirusów grypy. Ponadto istnieje wymóg wydajnego wytwarzania przearanżowanych wirusów do produkcji szczepionek w odpowiedzi na nowo zidentyfikowany szczep wirusa. Niniejszy wynalazek wychodzi naprzeciw tym oraz innym potrzebom nauki poprzez dostarczanie układów, w których synteza zarówno segmentów ujemnej nici genomowego RNA wirusa (vRNA), jak i wirusowych mRNA zachodzi z jednej matrycy, zmniejszając tym samym liczbę plazmidów niezbędnych do wytwarzania wirusa i pozwalając na wydajną i przewidywalną rearanżację.
Wirusy Reoviridae
Wirusy z rodziny Reoviridae, wliczając w to wirusy z rodzaju Rotavirus, posiadają genom w postaci podwójnej nici segmentowanego RNA. Ludzki rotawirus jest najpowszechniejszym w USA czynnikiem wirusowym powodującym ciężką dziecięcą biegunkę, przyczyniającym się do około 50000 hospitalizacji i od 20 do 50 zgonów rocznie, o szacunkowym koszcie ponad 1 biliona $ w skali roku. Ustalono, że w krajach rozwijających się rotawirus odpowiedzialny jest za jedną trzecią spośród wszystkich hospitalizacji związanych z biegunką i powoduje około 850000 zgonów rocznie.
Z powodu neutralizującej odpowiedzi wywołanej przez dwa białka wirusowe (VP), VP7 i VP4 istnieje podwójny układ reporterowych serotypów rotawirusowych. Serotypy VP7 oznaczone są jako typ G, zaś serotypy pochodzące od VP4 jako typ P. Co najmniej 10 serotypów G i co najmniej 7 serotypów P znaleziono u ludzi. Ponieważ geny VP4 i VP7 segregują oddzielnie, nowe rotawirusy wytwarzane są na drodze rearanżacji. W Stanach Zjednoczonych najczęściej występują serotypy od P1 do P4 oraz G1 do G4; pozostałe kombinacje odnotowywano w takich krajach jak Indie czy Egipt. Pierwszą koncesjonowaną szczepionkę przeciw ludzkiemu rotawirusowi, szczepionkę przeciw rotawirusowi rezusa, wytworzono tak, aby uzyskać serotypowo-specyficzną ochronę przeciwko czterem powszechnie występującym serotypom od G1 do G4. Szczepionka ta została jednakże wycofana z powodu związku pomiędzy stosowaniem szczepień, a zwiększoną liczbą przypadków wgłobień (ang. intussusception) wśród osób poddanych szczepieniom. Istnieje zatem potrzeba produkcji szczepionki rotawirusowej obejmującej wszystkie podtypy G oraz P, nie wykazującej przy tym niepożądanych działań ubocznych. Niniejszy wynalazek dostarcza wektorów (korzystnie plazmidów), metod oraz komórek gospodarza, które można wykorzystać do wytwarzania rota wirusów w całości na podstawie sklonowanego cDNA.
Określono trzynaście podstawowych produktów genowych. W celu ograniczenia zamieszania oraz aby ułatwić porównywanie z białkami o podobnym działaniu pochodzącymi z innych gatunków należących do rodziny Reoviridae, zastosowano następujące nazewnictwo: zgodnie z analizą ich migracji w żelu SDS-PAGE, poczynając od największych, białkom strukturalnym dodano przedrosttek „VP”, a białkom niestrukturalnym przedrostek „NSP”, zaś funkcję każdego z białek umieszczono w nawiasach. Na przykład, skrót VP1(Pol) wskazuje, że największym białkiem spośród cząstek wirusa jest RNA zależna polimeraza RNA. Siedem białek strukturalnych tworzy cząstki wirusowe składające się z trzech warstw: (1) wewnętrzny rdzeń zawierający genom dsRNA i trzy związane z nim białka, spośród których dwa (VP1(Pol) oraz VP3(Cap)) są bezpośrednio związane z genomem, podczas gdy trzecie (VP2(T2)) stanowi powłokę rdzenia, (2) środkowa powłoka białkowa wiriona składa się z 780 cząsteczek białka VP6(T13) zorganizowanych w 260 trimerycznych jednostek oraz (3) białka VP4 i VP7 tworzą zewnętrzną powłokę. Białko kolca VP4 zawiera miejsce trawienia trypsyny, które jest istotne przy trawieniu prowadzącym do powstania VP5 oraz VP8, a proces ten wzmacnia infekcyjność. Podejrzewa się, że dwie formy białka VP7, pochodzące z różnie sformułowanych ramek odczytu, VP7(1) oraz VP7(2) wbudowane są do wirionów.
O wiele mniej wiadomo o działaniu sześciu białek niestrukturalnych. Podobnie do innych wirusów RNA, przypuszcza się, że białka niestrukturalne odgrywają istotną rolę w wirusowej replikacji, transkrypcji oraz translacji wirusowych RNA i pakowaniu. Rzeczywiście, w oparciu o analizy wirusów temperaturo-wrażliwych, wysunięto hipotezę, że występujące w segmencie 8 NSP2(ViP) pełni bezpośrednią rolę w wirusowej replikacji. Uważa się, że NSP3 łączy się z konserwowanymi sekwencjami na 3' końcu wirusowych mRNA i z komórkowym białkiem eIF4G łączącym się z czapeczką, a tym samym specyficznie zwiększa translację rotawirusowych mRNA posiadających struktury czapeczki na końcu 5',
PL 205 955 B1 ale nie posiadających ogonów poli-A. NSP1 okazał się nie odgrywać istotnej roli, ale przypuszczalnie pełni aktywną funkcję w replikacji rotawirusa w hodowli komórkowej. Uważa się, że NSP4 zaangażowany jest w proces morfogenezy wirusa. Dwa niestrukturalne białka NSP5 i NSP6 kodowane są przez dwie różne ramki odczytu z segmentu 11, ale ich funkcja w cyklu życiowym wirusa nie została poznana.
Cykl replikacyjny zostaje zakończony w przeciągu 10-12 godzin w 37°C. Aktualne dane sugerują, że wirus może dostać się do komórki na zasadzie endocytozy za pośrednictwem receptora, ale może istnieć alternatywny mechanizm dla tego procesu. Po przedostaniu się do komórki gospodarza, z zewnę trznej pow łoki wirusa, uwalniana jest, do cytoplazmy zainfekowanej komórki, transkrypcyjnie aktywna cząstka z podwójną osłonką. Enzymy związane z wirionem wytwarzają mRNA z czapeczką 5', nie posiadające ogona poliadenylowego, które są pełnymi długości transkryptami otrzymanymi z ujemnej nici każdego spośród segmentów genomu wirionowego. Wirusowe mRNA pochodzące z każdego segmentu pełnią dwie funkcje: po pierwsze ulega translacji w celu wytwarzania białek wirusowych kodowanych w danym segmencie, po drugie wirusowe mRNA odgrywają role matryc przy replikacji genomu. Montaż segmentu genomowego następuje przez selekcję różnych wirusowych mRNA wymaganych do kształtowania pierwotnego rdzenia RI. Po montażu 11 mRNA następuje synteza ujemnej nici występującej w „rdzeniu-RI” oraz VP6(T13)-RI obecnych w „wiroplazmie” znajdującej się w cytoplazmie zainfekowanej komórki. Następny etap morfogenezy potomnych wirionów jest specyficzny dla rotawirusów i obejmuje łączenie dwuwarstwowej cząsteczki z retikulum endoplazmatycznym z wykorzystaniem NSP4. W wyniku tego powstaje cząstka przejściowo posiadająca uzyskaną otoczkę, która jest tracona w czasie końcowych etapów dojrzewania, kiedy to dodawana jest zewnętrza powłoka wiriona VP4 i VP7.
Segmentowany genom, wysoko zorganizowana struktura genomowa i złożony cykl replikacyjny, stanowią główne wyzwania dla rozwoju układu odwrotnej genetyki do wytwarzania rotawirusów. Niniejszy wynalazek odpowiada na te i inne zapotrzebowania w stanie techniki.
Szczepionki grypowe
Szczepionki grypowe, aktualnie mające licencje wydane przez odpowiednie organy w dziedzinie zdrowia publicznego do użytku w USA i Europie, są szczepionkami z inaktywowanym wirusem grypy. Wirusy należące do typu A i B grypy, przedstawiające znaczenie epidemiologiczne, hodowane są w zarodkach kurzych, po czym cząstki wirusowe są oczyszczane i inaktywowane za pomocą środków chemicznych. Każdego roku WHO wybiera podtypy o największym prawdopodobieństwie występowania, obecnie są to dwa szczepy dla grypy A (H1N1) i (H3N2) oraz szczep B.
Dla celów produkcji bezpiecznej i skutecznej szczepionki ważne jest, aby wybrane szczepy były blisko spokrewnione ze szczepami krążącymi w populacji, co daje tym samym pewność, że przeciwciała obecne u zaszczepionej populacji zdolne są do neutralizacji wirusa podobnego pod względem antygenów. Nie wszystkie wirusy blisko spokrewnione nadają się jednak do produkcji szczepionki, ponieważ słabo rosną w hodowlach zarodkowych. Należy zatem podejmować próby takiego wytwarzania przearanżowanego wirusa o wysokim wzroście, aby połączyć wysoką wydajność wirusa szczepu laboratoryjnego (A/PR/8/34) (H1N1) z antygenową charakterystyką przewidywanego szczepu patogennego. Niestety, w wyniku koinfekcji dwoma wirusami grypy mającymi osiem segmentów powstaje teoretycznie 28=256 różnych wirusów potomnych. Aby uzyskać wirus o wysokim wzroście zawierający żądane antygeny glikoproteinowe, należy zastosować metodę selekcji celem pozbycia się odpowiadających segmentów genowych pochodzących z laboratoryjnego szczepu rodzicielskiego o wysokim wzroście. Procedura selekcji mająca w efekcie doprowadzić do uzyskania wirusa posiadającego odpowiednie glikoproteiny oraz weryfikacja wzajemnego ułożenia genów jest zadaniem niełatwym i pochłaniającym dużo czasu. Dobra metoda selekcji potrzebna jest nawet, pomimo że układ transfekcji RNP obniża możliwą liczbę wirusów potomnych (Luytjes i wsp., Cell 1989, 59:1107).
Szczepionka żywego, atenuowanego wirusa grypy podawana donosowo wzbudza miejscową odporność komórkową i humoralną w obszarze śluzówki. Przystosowany do warunków niskiej temperatury (cold-adapted, ca), przearanżowany (reassortment, CR) wirus zawierający sześć wewnętrznych genów czynnego, osłabionego wirusa grypy A/Ann Arbor/6/60 (H2N2) lub B/Ann Arbor/1/66, jak również hemaglutyninę (HA) oraz neuraminidazę (NA) współcześnie występujących wirusów grypy typu dzikiego, wydaje się być osłabiony w sposób niezawodny. Szczepionka ta okazała się skuteczna u dzieci oraz osób młodych. Jednakże, może być zbyt osłabiona, by stymulować dostateczną odpowiedź immunologiczną u ludzi starszych, stanowiących największą grupę spośród 20000-40000 osób umierających co roku w wyniku infekcji grypowej w USA. Pomimo doniesień dotyczących sekwencji wewnętrznych genów wirusów ca, nie udało się dotychczas określić udziału poszczególnych segmentów
PL 205 955 B1 w powstawaniu fenotypu atenuowanego. Informację tę moż na jedynie zdoby ć przez sekwencyjne wprowadzenie do wirusa specyficznej określonej atentującej mutacji. Pomimo, że metoda transfekcji RNP umożliwia wprowadzenie mutacji do genomu wirusa grypy, jej użycie w celach manipulacji genami wewnętrznymi ograniczone jest potrzebą stosowania systemu selekcji oraz trudnościami technicznymi związanymi z odtwarzaniem wirusowych RNP in vitro.
Istnieje zatem potrzeba uzyskania takich rekombinowanych szczepionek grypy, które pozwolą uniknąć konieczności stosowania wirusa pomocniczego, których wirusy dobrze rosną w hodowli (komórkowej bądź w jaju kurzym), niezawodnie umożliwiają wytwarzanie wirusów przearanżowanych, które mogą być namnożone do pozyskiwania nowych szczepionek, a także stanowiących materiał do mutacji mających na celu otrzymanie żywych atenuowanych szczepów wirusowych mogących posłużyć do szczepień donosowych. Niniejszy wynalazek jest odpowiedzią na te oraz inne potrzeby nauki.
Układ oparty na minimalnej liczbie plazmidów, według niniejszego wynalazku, do wytwarzania infekcyjnych wirusów RNA o ujemnej nici ze sklonowanego wirusowego cDNA, obejmuje zestaw plazmidów w którym każdy z plazmidów obejmuje wirusowy cDNA będący jednym wirusowym segmentem genomowym, wstawionemu pomiędzy sekwencję promotora polimerazy I RNA (pol I) i sekwencję terminatora, które są zdolne do kierowania syntezą vRNA, i które są wstawione pomiędzy promotor polimerazy II RNA (pol II) i sygnał poliadenylacji, które są zdolne do kierowania syntezą wirusowego mRNA.
Korzystnie sekwencja terminatora jest sekwencją terminatora polimerazy I RNA (pol I).
Korzystnie układ oparty na minimalnej liczbie plazmidów jest dwukierunkowym układem transkrypcyjnym cDNA.
Korzystnie w układzie opartym na minimalnej liczbie plazmidów promotor pol I jest położony w pobliżu sygnału poliadenylacji, a sekwencja terminatora pol I leży w pobliżu promotora pol II.
Korzystnie w wirus RNA jest ortomyksowirusem, korzystnie wirusem grypy, a bardziej korzystnie wirusem grypy jest wirus grypy typu A lub wirusem grypy jest wirus grypy typu B.
W przypadku wirusa grypy typu A korzystnie segment genomowy wirusa (i) koduje biał ko wybrane z grupy składającej się z białka kompleksu polimerazy wirusa, białka M i białka NS, i (ii) pochodzi ze szczepu dobrze przystosowanego do wzrostu w hodowli komórkowej bądź ze szczepu atenuowanego lub z obu źródeł.
Korzystnie tez wirusowy segment genomowy zawiera gen hemaglutyniny (HA) lub gen neuraminidazy (NA), przy czym geny te pochodzą z patogennego wirusa grypy.
Korzystnie układ ten zawiera jeden lub więcej plazmidów mających mapę wybraną z grupy składającej się z plazmidu kodującego PB2, plazmidu kodującego PB1, plazmidu kodującego PA, plazmidu kodującego HA, plazmidu kodującego NP, plazmidu kodującego NA, plazmidu kodującego M oraz plazmidu kodującego NS, przy czym geny pochodzą z patogennego wirusa grypy typu A.
Układ oparty na minimalnej liczbie plazmidów według wynalazku, pozwala na wytwarzanie zakaźnych wirusów RNA ze sklonowanego wirusowego cDNA. Układ taki składa się z zestawu plazmidów, spośród których każdy zawiera jeden autonomiczny wirusowy, genomowy segment wirusa RNA. Wirusowy cDNA, odpowiadający autonomicznemu genomowemu segmentowi wirusowemu, jest w każdym plazmidzie wstawiony pomiędzy sekwencję promotora polimerazy I RNA (pol I) i sekwencję i terminatora, które z kolei wstawione są pomię dzy promotor polimerazy II RNA (pol II) i sygnał poliadenylacji. Układ ten wykorzystuje zatem technologię plazmidu dwukierunkowego i umożliwia wydajną rearanżację celem wytworzenia wirusów RNA odpowiadających aktualnie występującym szczepom patogennym, np. pod względem genów NA i HA wirusa grypy, w szczepie podstawowym dobrze przystosowanym do wzrostu w hodowlach komórkowych szczepu lub ze szczepu atenuowanego bądź też obiema metodami. Korzystnie, wirusem jest wirus grypy typu A lub B.
Wynalazek dotyczy komórek gospodarza zawierających układ według wynalazku oparty minimalnej liczbie plazmidów służących do wytwarzania zakaźnych wirionów.
Korzystnie komórka gospodarza jest wybrana z grupy składającej się z komórki psiej nerki Madin-Darby (MDCK), komórki VERO, komórki CV1, komórki COS-1, komórki COS-7 i komórki BHK-1. Wynalazek dotyczy również sposobu wytwarzania wiriona wirusa RNA o ujemnej nici obejmującego hodowlę komórki gospodarza według wynalazku w warunkach pozwalających na wytwarzanie białek wirusowych oraz vRNA i cRNA, z wytworzeniem zakaźnego wirusa RNA o ujemnej nici.
Korzystnie wirus RNA jest patogenny.
PL 205 955 B1
Wynalazek dotyczy również sposobu wytwarzania atenuowanego wirusa RNA o ujemnej nici, który obejmuje:
(a) zmutowanie jednego lub więcej genów wirusowych w układzie opartym na plazmidzie według wynalazku i
b) oznaczenie czy zakaźne wirusy RNA o ujemnej nici wytwarzane przez układ oparty na plazmidzie po wprowadzeniu do odpowiedniej komórki gospodarza, są atenuowane.
Ponadto wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania zakaźnego wirusa o ujemnej nici do stosowania w szczepionkach, który obejmuje:
(a) hodowanie komórki gospodarza zawierającej układ oparty na plazmidzie według wynalazku do wytwarzania tego wirusa, i (b) oczyszczanie wirusa wytworzonego przez komórkę gospodarza.
Korzystnie we wszystkich trzech sposobach według wynalazku wirus RNA jest ortomyksowirusem, bardziej korzystnie wirusem grypy A lub wirusem grypy B.
Korzystnie we wszystkich trzech sposobach według wynalazku komórka gospodarza jest wybrana z grupy składającej się z komórki psiej nerki Madin-Darby (MDCK), komórki VERO, komórki CV1, komórki COS-1, komórki COS-7 i komórki BHK-1, a bardziej korzystnie komórką gospodarza jest komórka Vero.
We wszystkich trzech sposobach według wynalazku korzystnie co najmniej jeden plazmid w ukł adzie opartym na plazmidzie obejmuje segment genomowy wirusa szczepu grypy A/PR/8/34, lub szczepu grypy A/Ann Arbor/6/60 lub B/Ann Arbor/6/60.
Wynalazek dotyczy również zastosowania układu opartego na minimalnej liczbie plazmidów według wynalazku do wytwarzania leku do leczenia lub zapobiegania zakażeniu wirusowemu, przy czym zakażenie wirusowe jest zakażeniem wirusem grypy.
Układ oparty na plazmidzie, komórki gospodarza i metoda wytwarzania wirionów nadają się zwłaszcza do przygotowania szczepionki specyficznej względem wirusa RNA. Metody takie obejmują oczyszczanie wirionów. Oczyszczone wiriony mogą być inaktywowane bądź osłabiane (atenuowane). Szczepionki takie można stosować w szczepieniach przeciwko infekcji wirusem RNA. Na przykład ochronna dawka szczepionki, zawierająca inaktywowane wiriony, może być podana przez iniekcję domięśniową. Alternatywnie, ochronna dawka szczepionki zawierającej atenuowane wiriony może być podana drogą donosową.
Wynalazek dotyczy też sposobu wytwarzania atenuowanego wirusa RNA. Sposób ten obejmuje mutację jednego lub więcej genów wirusowych w układzie opartym na plazmidzie, a następnie oznaczania, czy zakaźne wirusy RNA wytworzone przez ten układ, uległy atenuacji. Takie atenuowane wirusy mogą być wykorzystane do opracowania szczepionek donosowych, w tym szczepionek donosowych o podwyższonej zdolności wywoływania ochronnej odporności w przypadku ludzi w podeszłym wieku bądź innych populacji, obejmujących osoby, które nie reagują na aktualne szczepionki z atenuowanym wirusem.
Opisy rysunków
Figura 1. Schematyczne przedstawienie układu transkrypcyjnego pol I-pol II do syntezy vRNA i mRNA. cDNA każdego spośród ośmiu segmentów wirusa grypy wstawiony jest pomiędzy promotor Ppl I (pIh) i terminator polI (tI). Taka transkrypcyjna jednostka pol I oflankowana jest przez sekwencje promotora pol II (pIICMV) ludzkiego cytomegalowirusa oraz sygnału poliadenylacji (aIIBGH) genu kodującego bydlęcy hormon wzrostu. Po przeprowadzeniu transfekcji ośmioma plazmidami ekspresyjnymi, syntetyzowane są dwa rodzaje cząsteczek. Z promotora ludzkiej pol I syntetyzowana jest ujemna cząsteczka vRNA za pomocą komórkowej pol I. Zsyntetyzowane vRNA zawiera niekodujący rejon (NCR) na końcach 5' i 3'. Transkrypcja z wykorzystaniem pol II dostarcza cząsteczek mRNA posiadających struktury czapeczki na 5' końcu i ogony poliA na 3' końcu; takie mRNA ulegają translacji do białek wirusowych. Kodon ATG wirusowego cDNA jest pierwszym kodonem ATG znajdującym się poniżej miejsca startu transkrypcji rozpoznawanego przez pol II.
Figura 2. Ośmioplazmidowy układ pol I-pol II do wytwarzania wirusa grypy typu A. Osiem plazmidów ekpresyjnych zawierających osiem wirusowych cząsteczek cDNA wstawionych pomiędzy promotor ludzkiej pol I i promotor pol II (patrz fig. 1) transfekowanych jest do komórek eukariotycznych. Ponieważ każdy plazmid zawiera dwa różne promotory, zarówno komórkowa pol I jak i pol II będą przeprowadzały transkrypcję na matrycy plazmidu, przypuszczalnie w różnych przedziałach jądrowych, czego wynikiem jest synteza wirusowych cząsteczek vRNA i mRNA. Po zsyntetyzowaniu kompleksu białkowego wirusowej polimerazy (PB1, PB2, PA, NP) rozpoczyna się wirusowy cykl replikacji. Osta8
PL 205 955 B1 tecznie, montaż wirusowych cząsteczek bezpośrednio (transkrypcja za pomocą pol II) lub pośrednio (transkrypcja za pomocą pol I i replikacja wirusowa) pochodzących z procesów komórkowej transkrypcji i translacji, skutkuje wzajemnym oddziaływaniem wszystkich zsyntetyzowanych cząsteczek (vRNP i biał ek strukturalnych HA, NA, M1, M2, NS2/NEP) z wytworzeniem zakaź nego wirusa A grypy.
Figury 3A-D. Schematyczne przedstawienie metody opracowanej w celu skonstruowania oraz transfekcji ośmiu plazmidów ekspresyjnych służących do uzyskania A/Teal/HK/W312/97 (H6N1). A. Wirusowe RNA ekstrahowano z cząstek wirusa. Przeprowadzono RT-PCR z użyciem starterów zawierających segmentowo specyficzne nukleotydy oraz sekwencje rozpoznawane przez endonukleazy restrykcyjne typu II - SsmBl lub Ssal. B. Osiem fragmentów wirusowego produktu PCR strawiono za pomocą enzymów BsmBl lub Bsal, po czym wstawiono do pHW2000 (linearyzowanego za pomocą SsmBl). Wstawienie takie spowodowało powstanie ośmiu konstruktów ekspresyjnych, w których wirusowe cDNA są dokładnie połączone z promotorem i terminatorem pol I (wirusowe sekwencje terminalne AGC...ACT pokazano dla segmentu PB2 w prostokątnych ramkach). C. Osiem plazmidów ekspresyjnych posiadających promotor Pol I oraz promotor pol II, zawiera jedną kopię każdego spośród wirusowych cDNA ośmiu segmentów. Otwarte ramki odczytu dla 10 białek wirusowych są oflankowane przez segmentowo-specyficzne rejony niekodujące (prostokąty zakropkowane). Ponieważ zastosowany promotor dla ludzkiej pol I wykazuje wysoką aktywność jedynie w liniach komórkowych uzyskanych z tkanek ludzkich bądź gatunków pokrewnych, hodowano razem ludzkie komórki 293T ze standardową linią komórkową stosowaną w badaniach nad grypą typu A (komórki MDCK). Wirusy produkowane w komórkach 293T po transfekcji, mogą następnie zakażać komórki MDCK i podlegać replikacji.
Figury 4A i 4B. Charakteryzacja uzyskanego wirusa metodą RT-PCR
A. RNA ekstrahowano z cząstek wirusa po dwóch pasażach supernatantu z transfekowanych komórek (patrz tab. 1 i 2) na komórkach MDCK. Przeprowadzono RT-PCR z zastosowaniem starterów specyficznych wobec segmentu genu NS oraz vRNA ekstrahowanego z wirionów. Wykorzystane startery NS nie były specyficzne względem szczepu; zatem umożliwiały amplifikację segmentu NS któregokolwiek wirusa grypy typu A. Produkty reakcji poddano procesowi elektroforezy w 2% żelu agarozowym. Aby upewnić się, że zamplifikowane fragmenty DNA pochodziły z vRNA, a nie z DNA plazmidu przeniesionego z transfekowanych komórek, przeprowadzono jedną reakcję bez odwrotnej transkryptazy (RT)(-). Ścieżki 1 i 2, rekombinowany A/Teal/HK/W312/97 (tab. 1); ścieżki 3 i 4, M-przearanżowane (tab. 2); ścieżki 5 i 6, NS-przearanżowane (tab. 2); ścieżki 7 i 8, rekombinowany wirus A/WSN/33 (tab. 1); ścieżki 9 i 10, poczwórnie-przearanżowany (tab. 2). B. Trawienie enzymem Ncol fragmentów pokazanych na fig. 4A. Tożsamość fragmentów NS weryfikowano także przez analizę sekwencji amplifikowanego produktu (wyniki nie przedstawione).
Figura 5. Jednokierunkowy układ transkrypcyjny RNA Pol l-pol II. W jednokierunkowym układzie transkrypcyjnym pol I-pol II wirusowy cDNA wstawiany jest w orientacji pozytywnej pomiędzy promotora ludzkiej pol I (plh) i sekwencje terminatora (tr). Ta całkowita jednostka transkrypcyjna pol I flankowana jest przez promotor pol II (pIICMV: wczesny promotor ludzkiego cytomegalowirusa) oraz miejsce poliadenylacji genu kodującego bydlęcy hormon wzrostu (aIIbgh). Po transfekcji, powinny być syntetyzowane dwa rodzaje transkryptu RNA, zsyntetyzowane przez pol I pozytywne cRNA posiadające grupę trifosforanową na swym 5' końcu oraz pozytywne mRNA zsyntetyzowane przez pol II posiadające strukturę 5'-czapeczki, a także ogon poli(A) na swym końcu 3'. Oba elementy mRNA wymagane są do efektywnej translacji.
Figura 6. Wektor klonujący pHW11 zawierający ułożone jeden za drugim promotory pol I i pol II. Plazmid zawiera promotor ludzkiej pol RNA I (pIh) o wielkości 225 bp oraz 33-bp terminator mysi (tr). Sekwencje promotora i terminatora PolI oflankowane są promotorem polimerazy RNA II (pIICMV) ludzkiego cytomegalowirusa i sygnałem poliadenylacji (allBGH) genu kodującego bydlęcy hormon wzrostu. W celu wstawienia wirusowego cDNA pomiędzy promotor polimerazy I i terminator, wprowadzono dwa miejsca cięcia dla SsmBl (zaznaczone przez podkreślenie). Trawienie wektora enzymem SsmBl prowadzi do powstania fragmentu wektora o lepkich, ale nie komplementarnie wystających końcach. Konstrukcja tego wektora umożliwia precyzyjne łączenie wirusowego cDNA w pozytywnej orientacji w stosunku do sekwencji promotora pol I i terminatora. W celu powielania się w E.coli, plazmid posiada miejsce rozpoczęcia replikacji (ori), a w celu selekcji na pożywce zawierającej ampicylinę, posiada gen betalaktamazy (bla).
Figura 7A i 7B. Układ podwójnego promotora do wytwarzania zakaźnych wirusów RNA. Ponieważ wirusy RNA funkcjonują jako pasożyty komórkowe, muszą optymalizować strategie wykorzystania komórek gospodarza do celu ekspresji ich informacji genetycznej. Wszystkie wirusy RNA muszą
PL 205 955 B1 syntetyzować mRNA, który może ulec translacji do białek. Zazwyczaj syntetyzowane białka wymagane są do replikacji, transkrypcji i wytwarzania nowych potomnych cząstek wirusowych. W celu wydajnej replikacji genomowego RNA, powstawać muszą transkrypty-RNA z dokładnymi końcami 5' i 3'.
Niniejszy układ zawiera zewnętrzną i wewnętrzną jednostkę transkrypcyjną. Wewnętrzna jednostka transkrypcyjna zawiera promotor (p(+RNA) lub p(-RNA)), promotor pol I. cDNA pochodzące z wirusów RNA składają się z jednej lub więcej otwartych ramek odczytu (ORF), które są oflankowane rejonami niekodującymi (NCR). Korzystnie, nie występują sekwencje mogące znajdować się pomiędzy wirusowym cDNA i promotorem. Brak sekwencji oddzielających jest istotny ponieważ końce 5' i 3' genomowego vRNA zwykle zawierają sekwencje rozpoznawane przez wirusowe białka niezbędne do transkrypcji i replikacji; dodanie niewirusowych sekwencji zazwyczaj hamuje skuteczne rozpoznawanie i replikację vRNA przez białka wirusowe. Brak sekwencji oddzielających pozwala na skuteczne wykorzystanie transkrybowanej (-) nici RNA (A) lub (+) nici RNA (B) przez wirusowe białka polimerazy. Zewnętrzna jednostka transkrypcyjna posiada promotor (p(mRNA)), korzystnie promotor pol II kierujący transkrypcją mRNA z cDNA; mRNA obejmuje sekwencje 5' (np. czapeczki 7-metylG) i sekwencje 3' (np. ogony poliA), które wymagane są do inicjacji translacji i wytwarzania białek wirusowych. Ponieważ na proces translacji nie wpływają dodatkowe sekwencje znajdujące się pomiędzy promotorem zewnętrznej jednostki transkrypcyjnej i wirusowym cDNA, obecność sekwencji oddzielających z wewnętrznej jednostki transkrypcyjnej nie ma znaczącego wpływu na translację mRNA.
Układ ten może ulec modyfikacji i ulepszeniu dla wirusów RNA innych niż wirusy grypy przez wykorzystanie różnych promotorów w wewnętrznej jednostce transkrypcyjnej (np. pol II, pol III, T3, SP6, T7 lub każdego innego promotora dla polimerazy RNA zależnej od DNA) oraz elementów terminatorowych lub rybozymów dla wewnątrzkomórkowych syntez wirusowego RNA z dokładnymi końcami 5' i 3' (omówione poniżej). Rybozymy typu hammerhead lub rybozym wirusa zapalenia wątroby delta (HDV) mogą być wykorzystane do wytworzenia wirusowego RNA z dokładnymi końcami (Schnell i wsp., EMBO J. 1994, 13:4195; Pleschka i wsp., J.Virol. 1996, 70:4188; Herold,J. i wsp., J.Virol 2000, 74(14):6394-400).
Zewnętrzna jednostka transkrypcyjna może zawierać promotor pol I lub pol III, promotor polimerazy RNA wirusa T7, promotor polimerazy RNA wirusa T3, promotor polimerazy RNA wirusa SP6 lub każdy inny promotor polimerazy RNA zależnej od DNA. Jeżeli promotor w zewnętrznej jednostce transkrypcyjnej kieruje syntezą transkryptu nie posiadającego czapeczki 7-metylG, może zostać wprowadzone wewnętrzne miejsce wejścia rybosomu (IRES) na końcu 5' cDNA kodującego sekwencję w celu ułatwienia inicjacji translacji (omówiono poniżej).
Należy zwrócić uwagę, że wektor pHW2000 posiada promotor T7 pomiędzy promotorem CMV a miejscem terminacji. Transkrypty pol II syntetyzowane są w jądrze komórkowym, zaś transkrypty T7 w cytoplazmie komórek, w których zachodzi ekspresja polimerazy RNA T7. Mogą być więc wytwarzane transkrypty pochodzące z więcej niż jednego promotora zewnętrznej jednostki transkrypcyjnej, czego skutkiem jest tworzenie różnych cząsteczek mRNA. Zatem plazmidy ekspresyjne uzyskane z pHW2000 umożliwiają szybką ocenę, czy promotor pol II lub T7, bądź też kombinacja ich obu są optymalne dla syntezy mRNA wirusów o pozytywnej nici, posiadających wewnętrzne miejsce wejścia rybosomu (IRES), jest.
Figura 8. Układ podwójnego promotora do wytwarzania wirusów posiadających nić (+) RNA. Niniejszy wynalazek można także dostosować do potrzeb produkcji wirusów zawierających nić pozytywną i genom jednocząsteczkowy, takich jak wirus żółtaczki typu C. W tym wykonaniu, cDNA zawierający genom wirusa żółtaczki typu C (w przybliżeniu 9500 nukleotydów) wstawiany jest do konstruktu, który umożliwia wewnątrz komórki wydajną transkrypcję cDNA do mRNA i pełnej długości ujemnego RNA (podejście dwukierunkowe), bądź do mRNA i pełnej długości dodatniego RNA (podejście jednokierunkowe). cDNA składa się z jednej otwartej ramki odczytu (ORF) flankowanej przez rejony niekodujące (NCR). Na rysunku przedstawiono plazmid ekspresyjny zawierający układ dwukierunkowy. Pełnej długości cDNA wstawiony jest pomiędzy sekwencje promotora (pI) oraz terminatora (tl) pol I, czego wynikiem, po procesie transfekcji, jest synteza pełnej długości (-) nić RNA.
Wewnętrzna jednostka transkrypcyjna flankowana jest przez zewnętrzną jednostkę transkrypcyjną posiadającą promotor (p(mRNA)) kierujący syntezą mRNA. Korzystnie, promotor ten jest promotorem pol II. Jednakże, jeśli syntetyzowane RNA posiada wewnętrzne miejsce wejścia rybosomu (IRES), promotor Pol II może być zastąpiony przez promotor pol I, Pol III, SP6, T7 czy T3 (zastosowanie promotorów T3 bądź T7 wymaga, aby białka polimerazy T3 bądź T7 były wyrażone albo w wyniku kotransfekcji plazmidu kodującego polimerazy, albo przez zastosowanie stabilnej linii komórek, w których
PL 205 955 B1 zachodzi ekspresja polimeraz). Aby zapewnić ogon poliA dla syntetyzowanego mRNA, na końcu 3' zewnętrznej jednostki transkrypcyjnej stosuje się sygnał poliA bądź wstawioną sekwencję poliA.
Powstały mRNA podlega translacji z wytworzeniem dużego prekursora poliproteinowego, który cięty jest w trakcie trwania translacji oraz podczas procesów posttranslacyjnych, celem dostarczenia osobnych strukturalnych i niestrukturalnych białek wirusowych.
Białka NS5a i NS5b polimerazy RNA zależnej od RNA nie pełniące funkcji strukturalnej wykorzystują nić (-) RNA zsyntetyzowaną przez wewnętrzną jednostkę transkrypcyjną, jako matrycę do rozpoczęcia cyklu wirusowej replikacji/transkrypcji. W ten sposób powstaje (+)RNA/mRNA wykorzystywany do procesu translacji w celu wytworzenia białka. Ostatecznie powstają zakaźne wirusy posiadające (+)RNA wraz z wirusowymi białkami strukturalnymi.
Figura 9. Układ Pol I-pol II do produkcji ludzkiego wirusa grypy rzekomej typu III. Niniejszy wynalazek może zostać zastosowany do produkcji wirusa grypy rzekomej typu III, którego genom ma postać ujemnej nici jednocząsteczkowego RNA. Wirusowy cDNA można wstawić do układu pol I-pol II w sensownej lub antysensownej orientacji. Na rysunku przedstawiony został układ jednokierunkowy. Promotor pol I kieruje syntezą cRNA, a promotor pol II syntezą mRNA. W tym wykonaniu promotor pol II wytwarza policistronowy mRNA, z którego pierwsza otwarta ramka odczytu podlega wydajnej translacji z wytworzeniem białka nukleokapsydu (NP). Białko to wymagane jest do replikacji. Plazmidy kodujące białka L i P, które są także istotne w procesie replikacji i transkrypcji (ale proces ich translacji z policistronowego mRNA nie jest wydajny), są przygotowane i podlegają kotransfekcji na oddzielnych plazmidach ekspresyjnych. System pol I-pol II ma kilka zalet w porównaniu z układem odwrotnej genetyki opracowanym przez Durbin, A.P. i wsp., Virology 1997, 235(2):323-332. Dzięki ekspresji NP z tego samego cDNA układ minimalnej liczby plazmidów wymaga skonstruowania i transfekcji tylko trzech zamiast czterech plazmidów w celu uzyskania wirusa III ludzkiej grypy rzekomej w całości ze sklonowanego cDNA. W przeciwieństwie do układów odwrotnej genetyki opartych na transkrypcji in vivo z promotora T7, układ pol I-pol II jest całkowicie kierowany przez występującą w każdej komórce polimerazię RNA zależną od DNA. Ponadto, zakażenie wirusem krowianki, w wyniku którego dochodzi do ekspresji polimerazy RNA T7, wymaga stosowania komórek podatnych na ten wirus (komórki HeLa lub ich pochodne takie, jak komórki Hep-2), lecz nieoptymalnych dla wzrostu ludzkiego wirusa grypy rzekomej, a tym samym ograniczających użyteczność tej metody wytwarzania wirusów zakaźnych. Niepożądane właściwości tego układu obejmują ciężkie cytopatologiczne skutki działania wirusa krowianki oraz środki ostrożności konieczne przy stosowaniu czynników zakaźnych. Zastosowanie układu pol I-pol II wyklucza konieczność infekcji wirusem i umożliwia wykorzystanie komórek LLC-MK2 do transfekcji i wzrostu ludzkiego wirusa grypy rzekomej typu III, dostarczając w ten sposób metody wytwarzania atenuowanych wirusów na drodze prostszej i bezpieczniejszej technologii.
Figura 10. Układ wytwarzania Rotawirusa z klonowanego cDNA oparty na zastosowaniu plazmidów. Układ ten może służyć do wytwarzania wirusów posiadających genom segmentowany, zbudowany z dwuniciowego RNA (np., Rotawirusów). Można go stosować, na przykład, przy produkcji wirusów należących do rodziny Reoviridae (10, 11, 12 segmentów dwuniciowego RNA) bądź Birnaviridae (2 segmenty dwuniciowego RNA). Istotne jest, że dla wirusów należących do rodziny Reoviridae brak jest dostępnych systemów odwrotnej genetyki. Figura ta ukazuje, w jaki sposób przy użyciu niniejszego wynalazku wytwarzać można rotawirusy posiadające 11 segmentów dwuniciowego RNA, choć układy podobne mogą być także wykorzystane do otrzymywania wirusów należących do rodzaju Orbivirus (10 segmentów dwuniciowego RNA) lub Orthoreoviruses (12 segmentów dwuniciowego RNA).
Poniższa dyskusja ilustruje wytwarzanie rotawirusa A/SA11 całkowicie z klonowanego cDNA. Określono wszystkie 11 segmentów zbudowanego z dwuniciowego RNA genomu rotawirusa małpiego. Cząsteczki RNA o podwójnej nici w genomie mają długość od 3302 bp do 663 bp, zaś rozmiar całkowity genomu wynosi 18,550 bp. Segmenty genomu ponumerowane są od 1-11 w porządku wskazującym wzrastającą ruchliwość zmierzoną za pomocą analizy PAGE (elektroforeza w żelu poliakryloamidowym). Wszystkie zasady azotowe w segmentach są sparowane, a dodatnia - sensowna nić zawiera na swym 5' końcu strukturę czapeczki (m7GpppGmGPy), lecz nie posiada sygnału poliadenylacji w pobliżu końca 3'. W skład wszystkich genomowych segmentów wchodzą krótkie, konserwowane fragmenty na końcach 5' oraz 3', wykazujące na końcu 5' 10- nukleotydową zgodność, zaś na końcu 3' zgodność 8 nukleotydową. Dośrodkowo, bezpośrednio względem tych rejonów końcowych, w każdym genie, leży drugi konserwowany rejon zawierający co najmniej 30-40 specyficznych segmentowo nukleotydów. Rejony nie podlegające translacji (NTR) na końcu 5' różnią się miedzy sobą długością, lecz wszystkie mają mniej niż 50 nukleotydów, a we wszystkich segmentach za sekwenPL 205 955 B1 cjami NTR znajduje się przynajmniej jedna długa otwarta ramka odczytu następująca po pierwszym kodonie AUG. Segmenty 9 oraz 11 kodują dwa białka. Sekwencje NTR na końcu 3' różnią się między sobą długością, która wynosi od 17 nukleotydów (segment 1) do 182 nukleotydów (segment 10).
cDNA rotawirusa jest klonowany do układu podwójnego promotora, korzystnie - układu pol I-pol II. Po transfekcji powstałych plazmidów do odpowiedniej komórki gospodarza następuje produkcja wirusowych cząsteczek RNA i białek, co z kolei powoduje powstawanie rotawirusa infekcyjnego. Korzystnie, do produkcji rotawirusów stosuje się jednokierunkowy układ transkrypcji. Wykorzystanie tego podejścia daje w wyniku wewnątrzkomórkową syntezę 11 cząsteczek (+) RNA rotawirusowego genomu, posiadających trifosforany na swym końcu 5'. Rezultatem ekspresji wiruso-podobnego mRNA jest wyrażanie wirusowych białek. Wirusowe białko VP3(cap), posiadające aktywność guanylotransferazy oraz metylotransferazy katalizuje przyłączenie struktur 5' - czapeczki do wszystkich 11 cząsteczek rotawirusowego (+)RNA (Chen D. i wsp., Virology 1999, 265:120-130). Istotnie, uprzednio wykazano, że oczyszczony VP4(cap), będący analogiem rotawirusowego VP3(cap) wirusa bluetogue (BTV), zdolny jest in vitro do przyłączania struktur czapeczki do wirusowego (+)RNA (Ramadevi N. i wsp. Proc Natl Acad Sci USA. 1998, 95(23):13537-42). Zapewne transkrypcja in vivo cDNA oraz wewnątrzkomórkowa ekspresja białka VP3(cap) powoduje wytwarzanie cząsteczek RNA wyposażonych w struktury czapeczki dla wszystkich 11 rotawirusowych segmentów genomu. Te mRNA podlegają translacji do białek wirusowych lub pakowane są do pierwotnego rdzenia-RI. Po utworzeniu cząstek VP6(T13)-RI, dodatnie mRNA wykorzystywany jest jako matryca do syntezy (-) RNA. Ostatecznie, uzupełnienie białkami VP4 i VP7 podczas morfogenezy kończy się powstawaniem infekcyjnych wirionów potomnych.
Ponieważ skuteczne zapoczątkowanie procesu replikacji oraz morfogenezy może zależeć od optymalnego stężenia każdego z białek wirusowych, korzystne może być wytworzenie oddzielnych plazmidów do syntezy RNA i ekspresji białek. Ponieważ jednak poziom ekspresji białek można optymalizować przez zmianę liczby plazmidów w komórce gospodarza bądź przez zastosowanie różnych promotorów do syntezy mRNA, użycie dwóch plazmidów dla jedenego segmentu nie wydaje się konieczne w przypadku większości genów. Ponieważ (+)RNA syntetyzowane jest na podstawie (-)RNA, wynikiem wewnątrzkomórkowej ekspresji (-)RNA i białka może być wytwarzanie replikacyjnie kompetentnych jednostek, produkujących wirusowy mRNA. Zatem, system podwójnego promotora umożliwia ustalenie układu o minimalnej liczbie plazmidów obejmującego znacząco mniejszą liczbę plazmidów niż 22, które byłyby niezbędne, gdyby dokonywana była ekspresja RNA i białka na oddzielnych plazmidach. Wytwarzanie rotawirusa można przeprowadzić w sposób podobny do zastosowanego do uzyskania wirusa A grypy.
Figury 11 A-D. Replikacja i synteza mRNA z genomów wirusów RNA.
(A) Białka wirusowej polimerazy syntetyzują mRNA podczas procesu infekcji wirusów posiadających nić (-): jedna lub dwie cząsteczki mRNA dla segmentowanych wirusów RNA bądź wiele cząsteczek mRNA dla wirusów o genomach jednocząsteczkowych. W wyniku działania mechanizmów antyterminacji następuje synteza pełnej długości nici (+), która może zostać skopiowana do genomowego (-)RNA.
(B) Segmentowane genomy wirusów ambisensownego RNA są kopiowane i powstaje jedna cząsteczka mRNA; druga cząsteczka RNA syntetyzowana jest na zasadzie komplementarności.
(C) W komórkach zakażonych wirusami dwuniciowego RNA, początkowo syntetyzowany mRNA może ulec translacji do białka bądź może służyć jako matryca do syntezy nici (-), czego skutkiem jest powstanie dwuniciowego genomowego RNA.
(D) Dla wirusów posiadających nić (+), genomowy RNA jest zarazem mRNA i może podlegać kopiowaniu do nici (-)RNA, która może zostać skopiowane do genomowego (+)RNA. mRNA niektórych wirusów (+)RNA nie zawiera ogona poli A. W pewnych rodzinach powstaje jedna lub więcej cząsteczek subgenomowego RNA.
Cykl życiowy wszystkich wirusów RNA obejmuje syntezę RNA i składanie cząstek wirusa po przeprowadzeniu syntezy białka; procesy te stanowią koncepcyjny szkielet dla układów opartych na odwrotnej genetyce według niniejszego wynalazku, które mogą być zastosowane do wytwarzania wirusów RNA z klonowanego cDNA. Niniejszy wynalazek upraszcza i poprawić aktualnie dostępne układy odwrotnej genetyki przez wytworzenie układu podwójnego promotora do celów wytwarzania wirusów segmentowanych o ujemnej nici (np. wirus grypy typu A, wirus grypy typu B, Bunyaviridae), wirusów RNA niesegmentowanych o ujemnej nici (np. Paramyxoviridae, Mononegavirales), wirusów RNA o podwójnej nici (np. Reoviridae, Birnaviridae) oraz wirusów RNA o nici dodatniej (Flaviviridae, Picornaviridae, Coronaviridae, Togaviridae). Ponieważ układ według niniejszego wynalazku wykorzystuje pojedyn12
PL 205 955 B1 czy wirusowy cDNA zarówno do syntezy białka jak i do syntezy genomowego RNA, zmniejsza on liczbę plazmidów wymaganych do produkcji wirusa i pozwala na szybkie i tanie uzyskanie szczepionek.
W celu zastosowania niniejszego wynalazku do wytworzenia wirusa o genomie w postaci segmentowanego RNA, wirusowy cDNA odpowiadający każdemu genowi w docelowym genomie, wstawiany jest do plazmidu ekspresyjnego w układzie według wynalazku. Wynalazek obejmuje dwukierunkowy plazmid stanowiący podstawę układu ekspresyjnego i plazmid jednokierunkowy stanowiący podstawę układu ekspresyjnego, w którym wirusowy cDNA wstawiony jest pomiędzy promotor polimerazy RNA I (pol I) i sekwencję terminatorową (wewnętrzna jednostka transkrypcyjna). Całkowita jednostka transkrypcyjna pol I flankowana jest przez promotor polimerazy RNA II (pol II) i miejsce poliadenylacji (zewnętrzna jednostka transkrypcyjna). W układzie jednokierunkowym promotory pol I i pol II położone są powyżej w stosunku do cDNA i wytwarzają nić cRNA o pozytywnej orientacji, bez czapeczki (z promotora pol I) oraz nić mRNA o pozytywnej orientacji z czapeczką (z promotora pol II). Promotor pol I, sekwencja terminatorową pol I, promotor pol II i sygnał poliadenylacji w układzie jednokierunkowym mogą być określane jako obejmujące orientację „upstream-to-downstream”. W układzie dwukierunkowym promotory pol I i pol II znajdują się po przeciwległych stronach cDNA, gdzie położony powyżej promotor pol II wytwarza mRNA o pozytywnej orientacji z czapeczką, a promotor pol I położony poniżej wytwarza wirusowy RNA o negatywnej orientacji bez czapeczki (vRNA). Takie układy pol I-pol II rozpoczynają od inicjacji transkrypcji dwóch komórkowych enzymów polimerazy RNA z własnych promotorów, przypuszczalnie w różnych przedziałach jądra. Promotor pol I i sekwencja terminatorowa pol I w układzie dwukierunkowym mogą być określane jako obejmujące orientację „downstream-to-upstream” podczas gdy promotor pol II i sygnał poliadenylacji w układzie dwukierunkowym mogą być określane jako obejmujące orientację „upstream-to-downstream”.
Jeśli wirus docelowy zawiera nić ujemną i segmentowany genom RNA, korzystnie, promotor pol I położony jest poniżej w stosunku do cDNA w wewnętrznej jednostce transkrypcyjnej (układ dwukierunkowy). W tym wykonaniu, ujemna nić RNA wytwarzana jest celem bezpośredniego wprowadzenia do nowego wirusa. W innym wykonaniu wirusy docelowe zawierające segmentowane genomy zbudowane z dodatniej nici RNA są wytwarzane z układem dwukierunkowym.
Niniejszy wynalazek można również stosować do wytwarzania wirusów zawierających infekcyjne bądź nieinfekcyjne niesegmentowane genomy zbudowane z RNA (o nici pojedynczej lub podwójnej). Na ogół proste wprowadzenie infekcyjnego genomowego RNA wirusa do komórki gospodarza jest wystarczające do zapoczątkowania cyklu życiowego wirusa w komórce i w końcu do produkcji kompletnych wirusów. Na przykład, proste wprowadzenie pikornawirusowego genomowego RNA do komórki gospodarza wystarcza, aby spowodować tworzenie kompletnych pikornawirusów. Zapoczątkowanie cyklu życiowego wirusa zawierającego nieinfekcyjny genomowy RNA wymaga zazwyczaj dodatkowego wprowadzenia innych wirusowych białek, które zwykle są przenoszone wewnątrz cząstki wirusa wraz z jego genomem. Na przykład, wirus grypy rzekomej typu III przenosi RNA-zależną polimerazę RNA, której obecność wymagana jest wewnątrz nowoinfekowanej komórki gospodarza do zapoczątkowania replikacji genomowego RNA wirusowego, a także transkrypcji wirusowych cząsteczek mRNA; przy braku polimerazy, genomowy RNA grypy rzekomej typu III nie jest infekcyjny. W wykonaniach niniejszego wynalazku, w których tworzone są wirusy zawierające infekcyjne, niesegmentowane cząsteczki genomowego RNA, proste wprowadzenie podwójnego plazmidu ekspresyjnego według wynalazku przenoszącego kwas nukleinowy obejmujący genom wirusa do odpowiedniej komórki gospodarza wystarcza, aby spowodować tworzenie kompletnych wirusów. W wykonaniach, w których wytwarzane są wirusy zawierające nieinfekcyjny, niesegmentowany, genomowy RNA, istnieje przypuszczenie, że koniecznym będzie wprowadzenie do komórki gospodarza dodatkowych plazmidów ekspresyjnych wraz z podwójnym plazmidem ekspresyjnym przenoszącym genom wirusa. Dodatkowy plazmid powinien wyrażać niezbędne dla zapoczątkowania wirusowego cyklu życiowego białko (białka), które w normalnych warunkach wprowadzane jest do komórki gospodarza w procesie infekcji (np., RNA - zależne polimerazy RNA).
Gdy wytwarzany jest pikornawirus zawierający infekcyjny, niesegmentowany genomowy RNA, do plazmidu ekspresyjnego, mającego podwójny promotor wprowadza się cDNA zawierający całkowity genom wirusa. Promotor położony powyżej w zewnętrznej jednostce transkrypcyjnej, korzystnie promotor pol II, kieruje produkcją dodatniej nici mRNA zawierającej całkowity genom wirusa - poliproteina podlega translacji z mRNA, a poszczególne białka są cięte i uwalniane z poliproteiny (np., przez proteazę znajdującą się wewnątrz poliproteiny). Ponieważ genom wirusa zawiera dodatnią nić RNA, drugi promotor położony powyżej w wewnętrznej jednostce transkrypcyjnej (układ jednokierunkowy), korzyPL 205 955 B1 stnie promotor pol I, kieruje produkcją kopii genomu zbudowanej z nici dodatniej. Gdyby genom wirusa zawierał ujemną nić RNA, drugi promotor położony w kierunku 3' wewnętrznej jednostki transkrypcyjnej (układ dwukierunkowy), korzystnie promotor pol I, kierowałby produkcją kopii genomu o ujemnej nici. Wykonania, w których za pomocą układu jednokierunkowego produkowane są wirusy posiadające niesegmentowane RNA o ujemnej nici, wchodzą w zakres wynalazku. Podobnie, wykonania, w których za pomocą układu dwukierunkowego produkowane są wirusy mające niesegmentowane RNA o dodatniej nici wchodzą w zakres wynalazku.
Wykorzystując niniejszy wynalazek można wytwarzać także wirusy mające niezakaźne genomy w postaci niesegmentowanego RNA, z których nie są produkowane poliproteiny. Niniejszy układ można na przykład zastosować do wytwarzania wirusów rhabdoviridae lub wirusów paramyxoviridae, korzystnie wirusa grypy rzekomej typu III, którego cykl życiowy obejmuje w normalnych warunkach wytwarzanie przez wirusową polimerazę RNA zależną od RNA licznych monocistronowych cząsteczek mRNA z genomowej ujemnej nici RNA; poszczególne białka ulegają ekspresji z monocistronowych cząsteczek mRNA. W tych wykonaniach zewnętrzna jednostka transkrypcyjna zawierająca promotor, korzystnie promotor pol II, kieruje wytwarzaniem dodatniej nici stanowiącej policistronową kopię wirusowego genomu, z której translacji ulega przeważnie tylko pierwszy gen (NP). Dodatkowo wewnętrzna jednostka transkrypcyjna zawierająca promotor, korzystnie promotor pol I, kieruje ekspresją kopii RNA genomu, w celu włączenia jej do nowych wirusów. Ponieważ genom wirusa grypy rzekomej typu III zawiera ujemną nić RNA, promotor wewnętrznej jednostki transkrypcyjnej, korzystnie, jest umiejscowiony w kierunku 3' względem cDNA (układ dwukierunkowy). Jeżeli genom wirusa zawiera dodatnią nić RNA, promotor wewnętrznej jednostki transkrypcyjnej, korzystnie, znajduje się w kierunku 5' względem cDNA (układ dwukierunkowy). Wynalazek obejmuje wykonania, w których wirusy zawierające genomy w formie dodatniej nici RNA wytwarzane są z zastosowaniem układu dwukierunkowego oraz postacie, w których wirusy zawierające genomy w formie ujemnej nici RNA wytwarzane są z zastosowaniem układu jednokierunkowego. Dla prawidłowego przebiegu wirusowej transkrypcji i replikacji (L i P) wymagane są dodatkowe białka wirusowe (inne niż białko ulegające ekspresji z policistronowego mRNA), a dostarczane one są indywidualnie na oddzielnych plazmidach ekspresyjnych.
Inne wykonania obejmują także wytwarzanie wirusów posiadających genomy w formie dwuniciowego, segmentowanego RNA. W takich wykonaniach, plazmid zawierający każdy gen z docelowego wirusowego genomu, wstawiany jest do ekspresyjnego plazmidu z podwójnym promotorem. Taki plazmid może być zarówno jednokierunkowy jak i dwukierunkowy. Promotor w zewnętrznej jednostce transkrypcyjnej, korzystnie promotor pol II, kieruje ekspresją transkryptu mRNA dla każdego genu podlegającego translacji do zakodowanego białka. Promotor w wewnętrznej jednostce transkrypcyjnej, korzystnie promotor pol I, kieruje transkrypcją bądź nici dodatniej (układ jednokierunkowy) bądź nici ujemnej (układ dwukierunkowy). Następnie, pierwsza nić jaka zostaje wytworzona, może służyć jako matryca do produkcji nici komplementarnej za pomocą wirusowej polimerazy RNA. Otrzymany produkt w postaci dwuniciowego RNA włączany jest do nowych wirusów.
Odzyskanie dwóch wirusów grypy typu A z układu opartego na minimalnej liczbie plazmidów, A/WSN/33 (H1N1) i A/Teal/HK/W312/97 (H6N1) ustaliło użyteczność niniejszego układu. Odzyskanie fenotypowo nierozróżnialnego szczepu A/PR/8/34 (H1N1), który standardowo wykorzystywany jest do produkcji szczepionek z inaktywowanym wirusem grypy typu A, powoduje przydatność niniejszego układu do pozyskiwania szczepionki. Siedemdziesiąt dwie godziny po transfekcji ośmiu plazmidów ekspresyjnych do wspólnej hodowli komórek 293T i MDCK, wydajność wirusa w supernatancie z transfekowanych komórek wynosiła od 2 x 105 do 2 x 107 zakaźnych wirusów na ml. Ten układ ośmiu plazmidów wykorzystywany był także do wytwarzania pojedynczych i poczwórnych przearanżowanych wirusów pomiędzy wirusami A/Teal/HK/W312/97(H6N1) i A/WSN/33 (H1N1) oraz produkcji wirusów A/WSN/33 z układu orientowanego tandemowo (wytwarzającego cRNA i mRNA).
Ponieważ układ pol I-pol II ułatwia projektowanie oraz otrzymywanie zarówno rekombinowanego, jak i przearanżowanego wirusa grypy typu A, nadaje się on także do uzyskiwania innych wirusów RNA całkowicie z klonowanego cDNA. Ponadto geny, których ekspresja zachodzi w układzie opartym na działaniu plazmidów według wynalazku można połączyć lub wyznakować innymi genami takimi, jak znaczniki oczyszczenia/detekcji (np., transferaza S-glutationu, polihistydyna, zielone białko fluoryzujące, znaczniki myc bądź FLAG). W ramach niniejszego wynalazku przewidziano również wykonania, w których do plazmidów wedł ug niniejszego uk ł adu stosuje się czą stkowe sekwencje genów.
PL 205 955 B1
Poniższa tabela zawiera niewyczerpującą listę wirusów o ujemnej nici RNA, które mogą być produkowane według niniejszego wynalazku:
Rząd Rodzina Podrodzina Rodzaj Odmiana gatunku
1 2 3 4 5
Mononegavirales Bornaviridae - Bornavirus Wirus choroby Borna
Mononegavirales Filoviridae - Wirus podobny do Ebola Wirus Ebola
Mononegavirales Filoviridae - Wirus podobny do Marburg Wirus Marburg
Mononegavirales Paramyxoviridae Paramyxovirinae Respirovirus Wirus 1 ludzkiej grypy rzekomej
Mononegavirales Paramyxoviridae Paramyxovirinae Morbillivirus Wirus odry
Mononegavirales Paramyxoviridae Paramyxovirinae Rubulavirus Wirus świnki
Mononegavirales Paramyxoviridae Pneumovirinae Pneumovirus Ludzki wirus oddechowy Syncitial
Mononegavirales Paramyxoviridae Pneumovirinae Metapneumovirus Indyczy wirus nieżytu tchawicy
Mononegavirales Rhabdoviridae - Vesiculovirus Wirus pryszczycy jamy ustnej Indiana
Mononegavirales Rhabdoviridae - Lyssavirus Wirus wścieklizny
Mononegavirales Rhabdoviridae - Ephemerovirus Bydlęcy wirus gorączki przelotnej
Mononegavirales Rhabdoviridae - Novirhabdovirus Zakaźny wirus martwicy hematopoetycznej
Mononegavirales Rhabdoviridae Cytorhabdovirus Wirus żółtej nekrozy sałaty (ang. Lettuce Necrotic Yellows virus)
Mononegavirales Rhabdoviridae - Nucleorhabdovirus Wirus żółtej karłowatości ziemniaka
Mononegavirales Orthomyxovirida - Wirus grypy A Wirus grypy typu A
Mononegavirales Orthomyxovirida - Wirus grypy B Wirus grypy typu B
Mononegavirales Orthomyxovirida - Wirus grypy C Wirus grypy typu C
Mononegavirales Orthomyxovirida - Togotowirus Wirus Togoto
Mononegavirales Bunyaviridae - Bunyawirus Wirus gorączki Bunyamwera
Mononegavirales Bunyaviridae - Hantawirus Wirus Hantaan
Mononegavirales Bunyaviridae - Nairowirus Wirus choroby owiec Nairobi
Mononegavirales Bunyaviridae - Plebowirus Wirus gorączki od much piaskowych
Mononegavirales Bunyaviridae - Tospowirus Wirus brązowej plamistości liści pomidora
Mononegavirales Bunyaviridae Tenuiwirus Wirus prążkowatości ryżu
PL 205 955 B1 cd. tabeli
1 2 3 4 5
Mononegavirales Bunyaviridae - Opiowirus Wirus psoriozy cytrusów
Mononegavirales Arenaviridae - Arenawirus Wirus limfocytowego zapalenia opon mózgowych
Mononegavirales Arenaviridae - Deltawirus Wirus zapalenia wątroby delta
Niniejszy wynalazek dalej oparty jest na rozwoju dwukierunkowego konstruktu transkrypcyjnego zawierającego wirusowe cDNA kodujące PB2, PB1, PA, HA, NP, NA, M lub NS flankowane przez rejon promotora polimerazy RNA I (pol I), odpowiedzialnego za syntezę vRNA oraz rejon promotora polimerazy RNA II (pol II), odpowiedzialnego za syntezę wirusowego mRNA. Przydatność tego podejścia jest dowiedziona przez wytworzenie wirusa po transfekcji konstruktem promotor polI/polII-PB1 wraz z konstruktami wyrażającymi vRNA oraz konstruktami wyrażającymi białko dla pozostałych siedmiu segmentów. Ponieważ takie podejście zmniejsza liczbę plazmidów koniecznych do wytworzenia wirusa, ogranicza zarazem pracę potrzebną do klonowania, podwyższa wydajność wytwarzania wirusa oraz zwiększa możliwość zastosowania układu odwrotnej genetyki o linie komórkowej, dla których nie można osiągnąć wydajnej kotransfekcji 17 plazmidów. Takie podejście dotyczy też jednokierunkowego konstruktu transkrypcyjnego zawierającego promotory pol I i pol II położone powyżej względem cDNA wirusowej sekwencji kodującej. Oba promotory mają taką samą orientację upstream-to-downstream w stosunku do genu. Pomimo, że w układzie dwukierunkowym uzyskiwane jest wyższe miano wirusa grypy typu A, układ jednokierunkowy przydatny jest do innych zastosowań (np., produkcji innych szczepów wirusów o ujemnych niciach).
Promotor, terminator lub sygnał poliadenylacji znajduje się „powyżej” w stosunku do genu, jeżeli położony jest bliżej początku genu (np. pierwszego kodonu) i dalej od końca genu (np. ostatniego kodonu). Promotor, terminator lub sygnał poliadenylacji znajduje się „poniżej” w stosunku do genu, jeżeli położony jest bliżej końca genu i dalej od jego początku. Funkcjonalnie związane z genem promotory, które znajdują się na plazmidach, zorientowane są w sposób umożliwiający przeprowadzenie transkrypcji z sensownej i antysensownej nici genu.
Pojęcie „plazmid ekspresyjny” odnosi się do wektora DNA zawierającego „wewnętrzną jednostkę transkrypcyjną” i „zewnętrzną jednostkę trnaskrypcyjną”. Jak to zostało przedstawione powyżej, plazmidy ekspresyjne mogą być zastosowane do otrzymywania dowolnego rodzaju wirusa RNA, korzystnie wirusów RNA o dodatniej lub ujemnej nici, wirusów z segmentowanym lub niesegmentowanym genomem w postaci RNA lub wirusów o podwójnej nici RNA. Zewnętrzna jednostka transkrypcyjna zawiera promotor, korzystnie promotor pol II, który kieruje transkrypcją z wirusowego cDNA na mRNA podlegającego translacji. Zewnętrzna jednostka transkrypcyjna może zawierać promotor polimerazy RNA wirusa T7, promotor polimerazy RNA wirusa T3, promotor polimerazy RNA wirusa SP6 lub dowolny promotor albo zestawienie elementów genetycznych zdolne do przeprowadzenia ekspresji produktu RNA podlegającego translacji. Zewnętrzna jednostka transkrypcyjna, może, na przykład, zawierać promotor pol I lub pol II jeżeli wirusowy cDNA, który ma ulegać ekspresji na plazmidzie, jest genetycznie zmodyfikowany tak, że zawiera sygnał poliadenylacji na 3' końcu transkrybowanego RNA. Można tego dokonać wstawiając ciąg nukleotydów A na 3' końcu cDNA kodującego sekwencję położoną bezpośrednio przed kodonem stop. Ponadto, wirusowy cDNA można zmodyfikować genetycznie tak, aby zawierał wewnętrzne miejsce wejścia rybosomu (IRES) na 5' końcu cDNA w celu ułatwienia inicjacji translacji z stranskrybowanego RNA. „Wewnętrzna jednostka transkrypcyjna” na plazmidach ekspresyjnych, znajduje się w granicach zewnętrznej jednostki transkrypcyjnej i promotor pol I, który może kierować transkrypcją wirusowego cDNA, który może ulegać replikacji przy pomocy mechanizmów wirusowych i może być inkorporowany do nowych wirusów. Korzystnie, promotor wewnętrznej jednostki transkrypcyjnej przeprowadza transkrypcję RNA, który nie zawiera nadmiaru niewirusowych sekwencji na końcach 5' i 3', korzystnie dzięki dokładnemu łączeniu wirusowego cDNA z promotorem pol I i sekwencją terminatorową. Jednakże w wynalazku ujawniono wykonania, w których wewnętrzna jednostka transkrypcyjna zawiera promotor, który kieruje wytwarzaniem transkryptów RNA zawierających 5' i 3' dodatkowe niewirusowe sekwencje (np. promotory pol II, promotory pol III, promo-tor polimerazy RNA wirusa T7, promotory polimerazy RNA wirusa T3 lub promotory polimerazy RNA wirusa SP6). W takich wykonaniach, dodatkowe sekwencje mogą znajdować się na plazmidzie ekspresyjnym, który
PL 205 955 B1 zapewnia, że RNA produkowany z wewnętrznej jednostki transkrypcyjnej nie zawiera nadmiaru niewirusowych sekwencji. Na przykład, plazmid ekspresyjny może być tak genetycznie zmodyfikowany, aby zawierał sekwencje rybozymowe na końcach transkryptów wytwarzanych z wewnętrznej jednostki transkrypcyjnej, w której części rybozymowe stranskrybowanego RNA rozdzielają transkrypt w taki sposób, że sekwencje końców 5' i 3' RNA wytwarzane są tak samo jak w wirusowym RNA. Ponadto, plazmidy ekspresyjne mogą być genetycznie zmodyfikowane tak, aby zawierały sekwencje terminatorowe, powodujące zakończenie transkrypcji na końcu wirusowej sekwencji kodującej cDNA, tym samym zabezpieczając przed inkorporacją nadmiaru nie ulegających translacji sekwencji na 3' końcu transkrybowanego RNA. Korzystnie, „plazmid ekspresyjny” jest wektorem DNA wykorzystującym układ pol I- pol II. Plazmid taki zawiera zatem promotor polimerazy RNA I (pol I) oraz sekwencje terminatorowe pol I, wstawione między promotor polimerazy RNA II (pol II) i sygnał poliadenylacji. W układzie dwukierunkowym, promotor polimerazy RNA I kontroluje ekspresję ujemnej nici genomowego RNA nie mającego czapeczki (określanego tu jako „vRNA”) z cDNA wstawionego w orientacji antysensownej pomiędzy promotor i terminator. Promotor polimerazy RNA II kontroluje ekspresję informacyjnego RNA; w wyniku wstawienia w położeniu „sensownym” wirusowego segmentu cDNA genowego pomiędzy promotor a sygnał poliadenylacji polimerazy II, zachodzi ekspresja dodatnio-sensownej cząsteczki wirusowego mRNA posiadającego strukturę czapeczki. W układzie jednokierunkowym wirusowy cDNA wstawiany jest w położeniu sensownym poniżej promotorów pol I i pol II. Promotor pol II przeprowadza ekspresję dodatnio-sensownej cząsteczki mRNA posiadającej strukturę czapeczki, a promotor pol I przeprowadza ekspresję dodatnio-sensownej cząsteczki wirusowego cRNA nieposiadającego czapeczki.
Plazmid może zawierać „zasadniczo całość” innego podstawowego plazmidu, jeśli obecne są wszystkie geny oraz funkcjonalne rejony niekodujące plazmidu podstawowego. Na przykład, plazmid skonstruowany na drodze zwykłego usunięcia części polilinkera i wstawienia obcego genu zawiera zasadniczo całość plazmidu podstawowego.
„Wirus RNA o nici ujemnej” to wirus, którego genom zbudowany jest z ujemnej nici RNA. Ujemna nić RNA jest komplementarna do mRNA i zasadniczo musi podlegać przepisaniu na komplementarną dodatnią nić cząsteczki mRNA, aby w wyniku translacji zostały uzyskane białka. Zazwyczaj, wirusy te podczas procesu infekcji komórki gospodarza pakują RNA-zależną polimerazę RNA, za pomocą której produkują mRNA. Do wirusów RNA posiadających, ale nie ograniczonych do nici ujemnej, zaliczają się wirusy z rodziny Orthomyxoviridae, Arenaviridae oraz Sunyaviridae i inne. Korzystnie, genom wirusowy pochodzi z wirusa należącego do rodziny Orthomyxoviridae i optymalnie posiada genom segmentowany. Do rodziny Orthomyxoviridae zaliczają się, między innymi, wirusy grypy typu A, grypy typu B, grypy typu C, togotowirusy, wirus odry i świnki (Paramyxowirus) czy też wirus Rhabies (Rhabdovirus).
„Wirus RNA o nici dodatniej” to wirus zawierający genom o dodatniej nici RNA. Przykłady wirusów o nici dodatniej obejmują wirusa Polio (Pikornawirus), Togawirusy oraz Flawiwirusy. Genomowe RNA tych wirusów ma taką samą sensowność jak mRNA i jako takie może działać. Wirusy te mogą zawierać genom segmentowany bądź niesegmentowany.
„Wirus RNA o podwójnej nici” zawiera genom zbudowany z podwójnej nici RNA. Wirusami RNA o podwójnej nici są reowirusy.
Genom wirusowy może być również segmentowany bądź niesegmentowany (jednocząsteczkowy). Genom segmentowany zawiera dwie lub więcej cząsteczek kwasu nukleinowego, z których każda koduje jeden lub więcej genów wirusowych. Korzystnie, genom segmentowany zawiera oddzielne cząsteczki kwasu nukleinowego dla każdego spośród genów wirusa. Do wirusów posiadających segmentowany genom RNA zalicza się Ortomyxowirusy (wirusy grypy typu A, B lub C), Bunyawirusy oraz Arenawirusy. Genom niesegmentowany składa się z pojedynczej cząsteczki kwasu nukleinowego obejmującej wszystkie geny wirusa. Do wirusów posiadających niesegmentowany genom RNA zalicza się wirusy Mononegawirusowe, rabdowirusy, wirusy z rodziny Flaviviridae, Picornaviridae, Coronaviridae, Togaviridae oraz paramyxowirusy.
Pojęcie cząsteczki RNA o podwójnej nici zastąpić można skrótem „dsRNA” (ang. double stranded RNA). Pojęcie cząsteczki RNA o nici pojedynczej zastąpić można skrótem „ssRNA” (ang. single stranded RNA). Pojęciu ujemnej nici RNA przydano skrót „-ssRNA”. Pojęciu pojedynczej dodatniej nici RNA przydano skrót „+ssRNA”.
„Wirusowy segment genowy” jest, korzystnie, sklonowanym cDNA odpowiadającym cząsteczce genomowego RNA danego wirusa. Termin ten może także odnosić się do jakiegokolwiek genu lub segmentu genowego (np. produktu PCR lub fragmentu restrykcyjnego) zawierającego gen pochodzący z wirusa RNA.
PL 205 955 B1 „Układ oparty na minimalnej liczbie plazmidów” jest układem w skład, którego wchodzi plazmid ekspresyjny zdefiniowany powyżej, zawierający każdy autonomiczny segment wirusowego genomu pochodzący z wirusa RNA. Zatem w układzie całkowita liczba plazmidów zawierających sekwencje wirusowego genomu nie będzie przekraczać całkowitej liczby segmentów genowych z danego wirusa RNA. W wynalazku ujawniono wykonania, w których inne plazmidy, które nie zawierają sekwencji wirusowych, mogą dowolnie być kotransfekowane do komórek gospodarza. Zapewnia to istotne korzyści, przez zmniejszanie całkowitej liczby plazmidów wymaganych do ustalenia układu w komórce gospodarza, eliminowanie potrzeby stosowania wirusów pomocniczych, zniesienie potrzeby procesu selekcji i umożliwienie wydajnego wytwarzania rearanżowanych wirusów.
W układzie opartym na minimalnej liczbie plazmidów według wynalazku, pewne geny wirusowe mogą pochodzić ze szczepu wirusowego, który jest dobrze przystosowany do wzrostu w hodowli komórkowej np. szczep PR/8/34 (H1N1) lub WSN/33 (H1N1) lub ze szczepu atentowanego, takiego jak A/Ann Arbor/6/60 (H2N2) lub ze szczepu wirusa grypy B/Ann Arbor/1/66. Korzystnie, atenuowany szczep jest także dobrze przystosowany do wzrostu w hodowli komórkowej. W szczególności, dla wirusa grypy typu A, preferowane segmenty genów wirusowych w układzie opartym na plazmidzie kodują zespół białek polimerazy wirusowej, białka M i/lub białka NS ze szczepu dobrze przystosowanego do wzrostu w hodowli komórkowej albo ze szczepu atenuowanego lub z obu. Białka te określane są jako „wewnętrzne białka wirusowe” lub wirusowe „nieglikoproteiny”.
Genom wirusa grypy typu A zazwyczaj koduje 10 różnych białek: PB2-prawdopodobnie transkryptaza, PB1-prawdopodobnie transkryptaza, PA-prawdopodobnie transkryptaza, HA-prawdopodobnie hemaglutynina, NP-prawdopodobnie białko jądrowe łączące się z RNA, NA-prawdopodobnie neuraminidaza, M1/M2 prawdopodobnie odpowiednio białko macierzy i integralne białko błonowe oraz NS1/NS2 prawdopodobnie białko niestrukturalne mogące wpływać na obróbkę i transport RNA. Białka PB 1, PB2, NP oraz PA przypuszczalnie są częścią zespołu transkrypcyjnego polimerazy wirusa grypy.
Wykorzystywane tu określenie „hodowla komórkowa” korzystnie odnosi się do akceptowanej na rynku metody rozmnażania wirusa do celów produkcji szczepionki, np. na zapłodnionych jajach kurzych, jak również hodowli komórkowej in vitro w komórkach gospodarza (patrz Furminger, w: Nicholson, Webster and May (wyd.) Textbook of Influeenza, rozdział 24, str. 324-332, szczególnie str. 328-329).
Podobnie, układ oparty na plazmidzie będzie obejmował segmenty genowe dla antygenów wymaganych do wytworzenia ochronnej odpowiedzi immunologicznej. „Ochronna odpowiedź immunologiczna” obejmuje składnik humoralny (przeciwciała) lub komórkowy albo oba, skuteczne w eliminacji wirionów i zakażonych komórek u osobnika zaimmunizowanego (zaszczepionego). Zatem ochronna odpowiedź immunologiczna może zapobiec lub zwalczyć zakażenie wirusem RNA, np. wirusem grypy. Korzystnie antygeny są „antygenami powierzchniowymi” tj. ulegającymi ekspresji na powierzchni wiriona lub na powierzchni zainfekowanej komórki. Korzystniej, antygenami powierzchniowymi są glikoproteiny. Dla wirusa grypy, podstawowym antygenem glikoproteinowym jest hemaglutynina (HA lub H) oraz neuraminidaza (NA lub N).
Użyte tu określenie „immunogenny” oznacza, że polipeptyd jest zdolny do wywołania humoralnej lub komórkowej odpowiedzi immunologicznej, a korzystnie ich obu. Jednostka immunogenna jest zarazem antygenem. Mieszanina immunogenna jest mieszaniną wywołującą komórkową lub humoralną odpowiedź komórkową albo obie, po przedostaniu się do organizmu zwierzęcia. Cząsteczkę określa się jako „antygenową”, jeżeli jest ona zdolna do specyficznego oddziaływania z cząsteczką układu immunologicznego rozpoznającą antygen, taką jak immunoglobulina (przeciwciało) lub receptor antygenowy limfocytów T. Polipeptyd antygenowy zawiera epitop składający się z co najmniej około pięciu, a korzystnie - co najmniej około 10 aminokwasów. Antygenowa część polipeptydu, zwana tu również epitopem, może stanowić fragment będący czynnikiem immunologicznie dominującym dla rozpoznawania przez przeciwciała lub receptory limfocytów T, czy też posłużyć do wytwarzania przeciwciał rozpoznających daną cząsteczkę przy wykorzystaniu metody sprzężenia części antygenowej z polipeptydem nośnikowym celem immunizacji. Cząsteczka antygenowa sama w sobie nie musi być immunogenna, tj. zdolna do wywoływania odpowiedzi immunologicznej przy braku nośnika.
Pojęcie „patogenny szczep wirusowy” przyjęto tutaj na określenie jakiegokolwiek szczepu wirusowego zdolnego do wywołania choroby; korzystnie - wirus powinien się znajdować na bieżącej liście potencjalnie krążących w populacji wirusów, sporządzonej przez Światową Organizację Zdrowia (WHO), Centres for Disease Control and Prevention (CDC) czy inne władze państwowe odpowiedzialne za zdrowie publiczne. Do wirusów tych można zaliczyć szczepy należące do rodzin wirusów żółtaczkowych, reowirusów, ortomyxwirusów, paramyxowirusow, rodziny filoviridae oraz bornaviridae, bunyavi18
PL 205 955 B1 ridae, arenaviridae i coronaviridae, a także rodziny poliowirusów bądź rabdowirusów. Wynalazek korzystnie ujawnia sposób wstawiania genów pochodzących z powyższych szczepów dla pierwszorzędowych antygenów do układu opartego na plazmidzie, w którym pozostałe geny wirusowe posiadają żądane cechy związane z hodowlą i/lub ich atenuacją, a zatem zapewniającego produkcję ilości wirusa o odpowiednim zestawie antygenowym dla celów wytwarzania szczepionki. Na przykład, geny należące do paramyxowirusow, ludzkiego wirusa grypy rzekomej typu 3 (gen nukleokapsydu, gen fosfoproteiny, gen macierzy, gen odpowiedzialny za fuzję, gen białka hemaglutyniny-neuraminidazy oraz wielki gen) mogą być w dogodny sposób umiejscowione w plazmidach układu opartego na minimalnej liczbie plazmidów według wynalazku celem produkcji wirionów grypy rzekomej typu 3.
Zatem, preferowany „rearanżowany” wirus to wirus, u którego segmenty genów kodujących białka antygenowe pochodzące z patogennego szczepu wirusowego związane są z segmentami genów kodującymi wirusowy kompleks polimerazy bądź inne podobne geny (np., geny dla nieglikoprotein, włączając w to geny M oraz NS) pochodzące z wirusów przystosowanych do wzrostu w hodowli (bądź wirusów osłabionych). Wirus rearanżowany jest zatem nośnikiem żądanych cech antygenowych w warunkach umożliwiających wydajną produkcję w komórce gospodarza, jak opisano powyżej. Taki rearanżowany wirus jest żądanym „wirusowym ziarnem” służącym do wytwarzania wirionów do produkcji szczepionek (patrz. Furminger, jw.).
Pojęcie „komórki gospodarza” oznacza dowolną komórkę dowolnego organizmu, która została wybrana, zmodyfikowana, stransformowana, poddana procesom wzrostu, czy użyta lub dowolnie zmanipulowana celem wytworzenia rekombinowanych wirionów RNA, a korzystnie - wirionów posiadających ujemną nić segmentowanego RNA. Przykładowe komórki gospodarza obejmują, ale nie wyłącznie komórki MDCK (Madin-Darby Canin Kidney), VERO, komórki CV1, COS-1 oraz COS-7 czy BHK-1, stanowiące komórki przykładowe lecz nie jedyne. W konkretnym wykonaniu, korzystna dla produkcji wirinów jest tymczasowa hodowla wspólna (co-culture). Pozwala ona na wydajną transfekcję komórki receptywnej, takiej jak komórka 293T, wraz z następczą infekcją komórki permisywnej dla wzrostu wirusowego takiej, jak komórka MDCK.
Pojęcie „wirionów wirusów RNA” odnosi się do cząstek wirusa, które wyprodukowane jako pierwsze, są w pełni infekcyjne, pochodzących z komórek transfekowanych bądź ko-transfekowanych z wykorzystaniem układu opartego na plazmidzie według wynalazku. Taki układ wytwarza vRNA oraz wirusowe białka (drogą translacji wirusowego mRNA), czego wynikiem jest powstanie zespołu infekcyjnych cząstek wirusowych (wirionów).
Użyte tu określenie „szczepionka specyficzna wobec wirusa RNA” odnosi się do szczepionki mogącej wywoływać ochronną odporność na wirusa RNA, po podaniu danemu osobnikowi. Określenie „szczepionka” odnosi się do szczepionki zawierającej wirus, wirus inaktywowany, wirus antenuowany, wirus rozszczepiony na części lub białko wirusowe tj. antygeny powierzchniowe, które mogą być zastosowane do wywołania ochronnej odporności u biorcy (patrz Furminger, powyżej). Należy zwrócić uwagę, że szczepionka uznawana jest za wydajną jeżeli może wywołać odporność u części populacji, a u niektórych osobników nie wywołuje silnej lub ochronnej odpowiedzi odpornościowej, albo w niektórych przypadkach jakiejkolwiek odpowiedzi. Niezdolność do wywołania odpowiedniej odpowiedzi może być spowodowana osobniczym tłem genetycznym lub wynikać z niedoboru odpornościowego (nabytego bądź wrodzonego) lub immunosupresji (np. traktowanie lekami immunosupresyjnymi w celu zapobieżenia odrzuceniu przeszczepionego organu lub supresji w przypadku schorzeń autoimmunologicznych). Wydajność można ustalić na modelach zwierzęcych.
„Dawka ochronna” szczepionki jest porcją samej szczepionki lub szczepionki z dodatkiem adiuwantu, która skutecznie wywołuje ochronną odpowiedź odpornościową u danego osobnika. Ochrona może także zależeć od sposobu podania np. domięśniowo (korzystnie dla szczepionki z inaktywowanym wirusem) lub donosowo (korzystnie dla szczepionki z atenuowanym wirusem).
Użyte tu określenie „osobnik” odnosi się do zwierzęcia zakażonego wirusem RNA włączając, ale nie wyłącznie, ptactwo wodne, kury, świnie i ludzi. W szczególności określenie dotyczy ludzi.
„Adiutant” jest cząsteczką lub mieszaniną wzmacniającą odpowiedź odpornościową na immunogen. Adiuwant „nadaje się do użycia u ludzi” jeżeli jest dopuszczalny farmaceutycznie, jak to zostało zdefiniowane poniżej. Przykłady adiuwantów podane zostały poniżej.
Użyte tu określenie „wyizolowany' oznacza, że dany materiał został pobrany z jego naturalnego środowiska np. komórki. Zatem, wyizolowany materiał biologiczny może nie zawierać niektórych lub wszystkich składników komórkowych, tj. składników komórkowych, w których natywny materiał występuje naturalnie (np. składnik cytoplazmatyczny lub błonowy). Materiał uważa się za wyizolowany, jeżeli
PL 205 955 B1 obecny jest w ekstrakcie komórkowym lub supernatancie. W przypadku cząsteczek kwasu nukleinowego, wyizolowany kwas nukleinowy obejmuje produkt PCR, wyizolowany mRNA, cDNA lub fragment restrykcyjny. W innym wykonaniu, wyizolowany kwas nukleinowy korzystnie jest oddzielony od chromosomu, na którym został znaleziony, a korzystniej nie jest połączony lub nie znajduje się w pobliżu rejonów niekodujących (ale może być połączony z naturalnie występującymi rejonami regulatorowymi lub ich fragmentami) lub z innymi genami położonymi powyżej lub poniżej względem genu znajdującego się w wyizolowanej cząsteczce kwasu nukleinowego pochodzącego z chromosomu. W innym wykonaniu, wyizolowany kwas nukleinowy nie posiada jednego lub więcej intronów. Wyizolowane cząsteczki kwasu nukleinowego obejmują sekwencje wstawione do plazmidów, kosmidów, sztucznych chromosomów i podobnych struktur tj. tworzących część chimerowych konstruktów zrekombinowanego kwasu nukleinowego. Zatem w konkretnym wykonaniu, zrekombinowany kwas nukleinowy jest wyizolowanym kwasem nukleinowym. Wyizolowane białko może być związane z innymi białkami lub kwasami nukleinowymi lub oboma tymi związkami, z którymi związane jest w komórce, albo z błonami komórkowymi jeżeli jest to białko związane z błoną. Wyizolowana organella, komórka lub tkanka, wyodrębniona jest z anatomicznego miejsca, w którym znajduje się w organizmie. Wyizolowany materiał może, ale nie musi być oczyszczony.
Użyte tu określenie „oczyszczony” odnosi się do materiału wyizolowanego w warunkach ograniczających lub eliminujących obecność niezwiązanych materiałów tj. zanieczyszczenia, w tym natywne materiały, z których pozyskano dany materiał. Na przykład, oczyszczony wirion korzystnie zasadniczo nie zawiera składników pochodzących z komórki gospodarza lub z hodowli, włączając hodowle tkankowe, białka jaja, niespecyficzne patogeny i tym podobne. Użyte tu określenie „zasadniczo nie zawiera” jest wykorzystane w razie potrzeby, w kontekście materiału testowanego analitycznie. Korzystnie, oczyszczony materiał zasadniczo pozbawiony zanieczyszczeń jest co najmniej w 50% oczyszczony, korzystniej co najmniej w 90% oczyszczony, korzystniej co najmniej w 99% oczyszczony. Czystość może zostać określona za pomocą chromatografii, elektroforezy na żelu, oznaczenia immunologicznego, analizy składników, oznaczenia biologicznego i innych metod znanych w nauce.
Metody oczyszczania są dobrze znane w nauce. Cząsteczki wirusowe mogą być oczyszczane za pomocą ultrafiltracji, ultrawirowania, korzystnie ciągłego wirowania (patrz Furminger, poniżej). Inne metody oczyszczania są także możliwe i zostały tutaj rozważone. Oczyszczony materiał może zawierać mniej niż około 50%, korzystniej mniej niż około 75%, najkorzystniej mniej niż około 90% składników komórkowych, pożywki, białek i innych niepożądanych składników lub zanieczyszczeń (według kontekstu), z którymi był pierwotnie związany. Określenie „zasadniczo czysty” wskazuje na najwyższy poziom czystości, który można osiągnąć za pomocą konwencjonalnych technik oczyszczania znanych w nauce.
W konkretnym wykonaniu, określenie „około” lub „w przybliżeniu” oznacza w granicach 20%, korzystniej w granicach 10%, korzystniej w granicach 5% danej wartości lub zakresu.
Alternatywnie, w logarytmicznych terminach stosowanych w biologii, określenie „około” może oznaczać „w granicach rzędu wielkości danej wartości”, a korzystniej „w granicach jednej połowy rzędu wielkości danej wartości”.
Inżynieria genetyczna układów opartych na plazmidzie
W niniejszym wynalazku mogą być wykorzystane konwencjonalne techniki biologii molekularnej i rekombinacji DNA, w zakresie umiejętności w nauce. Techniki takie są w pełni wyjaśnione w literaturze. Patrz np. Sambrook, Fritsh & Maniatis, Molecular Cloning: A Labolatory Manual, drugie wydanie (1989) Cold Spring Harbor Labolatory Press, Cold Spring Harbor, New York (tutaj określane jako “Sambrook i wsp., 1989”); DNA Cloning: A Practical Approach, tom I i II (D.N. Glover wyd. 1985); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait wyd. 1984); Nucleic Acid Hybridization [B.D. Hames & S.J.Higgins wyd.(1985)]; Transcription and Translation [B.D. Hames & S.J.Higgins (1984)]; Animal Cell Culture [R.I. Freshney, wyd. (1986)]; Immobilized Cells And Enzymes [IRL Press, (1986)]; B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); F.M. Ausubel i wsp. (wyd.) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (1994).
Te rutynowe techniki odnoszą się do procedury przygotowania układów plazmidu pol I-pol II, izolacji klonów cDNA wirusowych segmentów genów, wstawiania takich cząsteczek DNA do plazmidów, a także transfekcji komórek układem opartym na plazmidzie według wynalazku. W szczególności, rutynowe techniki miejscowo kierowanej mutagenezy lub modyfikacji genu pozwalają na modyfikację wirusowego RNA, korzystnie - wirusowych genów segmentowanego RNA zbudowanego z ujemnej nici, celem uzyskania osłabionego wirusa, jak zostało to zestawione poniżej; bądź białek wiruso20
PL 205 955 B1 wych, zawierających inkorporowane nowe epitopy, np., rdzenia neuraminidazy; bądź celem wytworzenia wirusów uszkodzonych.
Użyty tu termin „amplifikacja” DNA oznacza zastosowanie łańcuchowej reakcji polimerazy (PCR) w celu zwiększenia ilości danej sekwencji DNA obecnej w mieszaninie sekwencji DNA. Opis PCR, patrz. Saiki i wsp., Science 1988, 239:487.
Pojęcie „cząsteczki kwasu nukleinowego” odnosi się do polimerycznych form estrów fosforanowych rybonukleozydów (adenozyny, guanozyny, urydyny lub cytydyny; „cząsteczki RNA”) czy też deoksyrybonukleozydów (deoksyadenozyny, deoksyguanozyny, deoksytymidyny lub deoksycytydyny; „cząsteczki DNA”) bądź jakichkolwiek ich fosfoestrowych analogów, takich, jak fosfosiarczany lub tioestry, posiadających formę zarówno nici pojedynczej, jak i helisy o nici podwójnej. Pojęcie „cząsteczka zrekombinowanego DNA” oznacza cząsteczkę DNA, która została poddana biologicznej manipulacji molekularnej.
Termin „polinukleotydy” bądź „sekwencja nukleotydowa” oznacza ciąg zasad nukleotydowych (zwanych również „nukleotydami”) w cząsteczce DNA i RNA, przez co rozumie się jakikolwiek łańcuch składający się z dwóch lub więcej nukleotydów. Zazwyczaj sekwencja nukleotydowa jest nośnikiem informacji genetycznej, włączając w to informację, zastosowaną przez mechanizmy komórkowe do wytwarzania białek.
Polinukleotydy mogą być flankowane przez sekwencje heterologiczne obejmujące promotory, wewnętrzne miejsca wiązania rybosomów (IRES; Ghattas i wsp., Mol. Cell. Biol. 11:5848-5859, 1991), a także inne sekwencje będące miejscami wiązania rybosomów, enhancery, elementy odpowiedzi, supresory, sekwencje sygnałowe, sekwencje poliadenylacji, introny, rejony niekodujące 5' i 3' i temu podobne. Kwasy nukleinowe można poddawać go modyfikacjom stosując wiele znanych metod naukowych. Nieograniczonymi przykładami takich modyfikacji są metylacja, „czapeczki”, takie jak czapeczki 5'-7-metylo-G(5')ppp(5')N, podstawienie analogu w miejsce jednego bądź więcej spośród naturalnie występujących nukleotydów oraz modyfikacje wewnątrznukleotydowe. Polinukleotydy mogą zawierać jedną lub więcej dodatkowych kowalencyjnie związanych cząsteczek takich, jak na przykład białka (np., nukleazy, toksyny, przeciwciała, peptydy sygnałowe, poli-L-lizyna itp.), cząsteczki interkalujące DNA (np., akrydyna, psoralen itp.), związki chelatowe (np., metale, metale radioaktywne, żelazo, metale utleniające itp.) oraz alkilatory. Polinukleotydy mogą tworzyć pochodne przez formowanie metylowych bądź etylowych fosfotriestrów lub alkilowych wiązań fosforoamidowych. Co więcej, polinukleotydy można również modyfikować za pomocą znacznika dostarczającego sygnał wykrywalny bądź bezpośrednio bądź pośrednio. Do przykładowych znaczników zalicza się radioizotopy, cząsteczki fluorescencyjne, biotynę i temu podobne.
Pojęcie „sekwencja kodująca” produkt ekspresji taki, jak polipeptyd, oznacza sekwencję nukleotydowa, która gdy podlega ekspresji, daje w jej wyniku polipeptyd, tj. sekwencja nukleotydowa kodująca sekwencję aminokwasową tego polipeptydu. Sekwencja kodująca białka może zawierać kodon start (zazwyczaj kodon ATG) i kodon stop.
Pojęcie „gen”, określane także jako „gen strukturalny” oznacza sekwencję DNA kodującą lub odpowiadającą określonej sekwencji aminokwasowej, która zawiera całość lub część jednego lub więcej polipeptydów i może zawierać lub nie zawierać sekwencje regulatorowe DNA, takie jak sekwencje promotorowe, które określają warunki, w jakich dany gen ulega ekspresji.
Niniejszy wynalazek dodatkowo umożliwia wykorzystanie różnych mutantów, konserwatywnych wariantów sekwencji i funkcjonalnie konserwatywnych wariantów segmentów genowych wirusa RNA o ujemnej nici, pod warunkiem, że wszystkie takie warianty zachowują wymagany efekt immunoochronny. Rzeczywiście, wynalazek korzystnie umożliwia mutagenezę w celu otrzymania antenuowanych szczepów wirusowych w uporządkowany sposób.
Pojęcia „mutant” i „mutacja” oznaczają jakąkolwiek wykrywalną zmianę w materiale genetycznym np. DNA lub jakikolwiek proces, mechanizm lub wynik takiej zmiany. Obejmuje to mutacje genowe, w których zmianie uległa struktura genu (np. sekwencja DNA), każdy gen lub DNA powstały na skutek procesu mutacji, każdy produkt ekspresji (np. białko) wyrażony przez zmodyfikowany gen lub sekwencję DNA. Pojęcie „wariant” może być także zastosowane do oznaczenia zmodyfikowanego lub zmienionego genu, sekwencji DNA, enzymu, komórki itd. tj. jakiegokolwiek rodzaju mutanta. Mutacje mogą powstać na skutek zastosowania technik losowej mutagenezy lub przez mutagenezę ukierunkowaną włączając modyfikację sekwencji opartą na procesie PCR. Jak to zostało uprzednio stwierdzone i szczegółowo omówione poniżej, mutagezneza jednego lub więcej poszczególnych segmentów genowych wirusa RNA (np. ujemnej nici segmentowanego wirusa RNA) umożliwia otrzymanie
PL 205 955 B1 wirusów atenuowanych, jak również wyjaśnienie mechanizmów atenuacji. Ponadto, układ oparty na plazmidzie według wynalazku, pokonuje trudności napotkane podczas wcześniejszych prób, mających na celu otrzymanie przez mutagenezę wirusów atenuowanych, takie jak ograniczenia wydajnego układu selekcji (patrz Bilsel and Kawaoka, W: Nicholson, Webster and May (wyd.), Textbook of Influenza, rozdział 32, str. 422-434, w szczególności str. 423-425).
„Konserwatywne warianty sekwencji” polinukleotydowych to takie, które posiadają zmiany jednego lub więcej nukleotydów w danej pozycji kodonu nie wpływające na zmianę aminokwasu kodowanego przez ten kodon. Warianty alleliczne mogą być konserwowanymi wersjami sekwencji.
„Funkcjonalnie konserwatywne warianty” to takie, w których dany aminokwas w białku lub enzymie uległ zmianie bez wpływu na całkowity kształt i funkcję polipeptydu, włączając, ale nie jedynie, zamianę aminokwasu na taki, który posiada podobne właściwości (takie jak np. polarność, możliwość tworzenia wiązań wodorowych, kwasowość, zasadowość, hydrofobowość, aromatyczność i tym podobne). Niektóre różnice alleliczne powodują powstanie funkcjonalnie konserwatywnych wariantów, w których substytucja aminokwasu nie wpływa dramatycznie na funkcję białka. Podobnie białka homologiczne mogą być wariantami funkcjonalnie konserwatywnymi. Aminokwasy o podobnych właściwościach są dobrze znane w nauce. Na przykład arginina, histydyna i lizyna są hydrofilowo-zasadowymi aminokwasami i mogą być stosowane zamiennie. Podobnie izoleucyna będąca aminokwasem hydrofobowym może być zastępowana przez leucynę, metioninę lub walinę. Oczekuje się, że takie zmiany mają mały lub nie mają wcale wpływu na widoczny ciężar cząsteczki lub punkt izoelektryczny białka lub polipeptydu. Aminokwasy odmienne od tych, które uważane są za konserwowane, mogą różnić się w biał ku bą dź w enzymie tak, ż e procent podobień stwa biał ek lub sekwencji aminokwasowych pomię dzy danymi dwoma białkami o podobnej funkcji może być zmienny i wynosić, na przykład od 70% do 99%, co określa się według schematu przyrównania takiego, jak Metoda Klastrów (Cluster Method), w której wyliczenie podobień stwa oparte jest na algorytmie MEGALIGN. „Funkcjonalnie konserwatywny wariant” obejmuje również polipeptyd bądź enzym posiadający co najmniej 60% zgodność aminokwasowej określonej przez algorytmy BLAST lub FASTA, gdzie parametry wybierane są tak, aby uzyskać największe dopasowanie testowanych sekwencji względem całkowitej długości sekwencji stanowiącej odniesienie, wynoszące korzystnie co najmniej 75%, korzystniej co najmniej 85%, zaś najkorzystniej co najmniej 90% oraz posiadające te same lub w sposób istotny podobne właściwości bądź działanie jak białko natywne lub rodzicielskie czy też enzym, do którego jest on porównywany.
Użyte tutaj pojęcie „homologiczny” we wszystkich swych formach gramatycznych i odmianach pisowni odnosi się do związku pomiędzy białkami mającymi „wspólne ewolucyjnie pochodzenie”, wliczając w to białka należące do ponadrodzin (np., nadrodzina immunoglobulin) oraz białka homologiczne pochodzące z różnych gatunków (np., łańcuch lekki miozyny itp.) (Reeck i wsp., Cell 50:667, 1987). Białka takie (i kodujące je geny) wykazują homologię sekwencji, co odzwierciedla podobieństwo ich sekwencji, czy to w warunkach procentowego podobieństwa czy też obecności specyficznych reszt lub motywów.
Odpowiednio, pojęcie „podobieństwo sekwencji” we wszystkich swych formach gramatycznych odnosi się do stopnia tożsamości bądź zgodności pomiędzy sekwencjami kwasów nukleinowych czy sekwencjami aminokwasów budujących białka mających lub nie wspólne ewolucyjnie pochodzenie (patrz. Reeck i wsp., jw.). Jednakże, w powszechnym użyciu oraz niniejszym zastosowaniu termin „homologiczny”, o ile towarzyszy mu przysłówek taki jak „wysoce”, może odnosić się do podobieństwa sekwencji, a także może lub nie dotyczyć wspólnego ewolucyjnie pochodzenia.
W specyficznym wykonaniu, dwie sekwencje DNA są „znacząco homologiczne” bą d ź „znaczą co podobne”, jeśli dostateczna liczba nukleotydów jest identyczna lub podobna (funkcjonalnie identyczna) względem określonej długości sekwencji DNA w taki sposób, że odróżnia to te sekwencje od pozostałych sekwencji, co określa się za pomocą algorytmów porównujących sekwencje takich, jak BLAST, FAST, DNA Strider i inne, w których parametry wybierane są tak, aby uzyskać największe dopasowanie testowanych sekwencji względem pełnej długości sekwencji stanowiącej odniesienie. Sekwencje będące znacząco homologiczne można identyfikować przez porównywanie sekwencji za pomocą standardowego oprogramowania dostępnego w bankach sekwencji, bądź doświadczalnie z wykorzystaniem hybrydyzacji typu Southern, na przykład w ostrych warunkach, jak określono to dla niniejszego układu. Takie ostre warunki znane są osobom o podstawowej znajomości metod badań naukowych, a ich opis znaleźć można w Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. Przykładem ostrych warunków hybrydyzacji, ale nie jedynym, jest hybrydyza22
PL 205 955 B1 cja w 6 X chlorku sodu/cytrynian sodu (SSC) w około 45°C, po której następuje jedno lub więcej płukań w 0,2 X SSC, 0,1% SDS w 50°C, korzystnie w 55°C, a najkorzystniej w 60°C lub 65°C.
Podobnie, w szczególnym wykonaniu, dwie sekwencje aminokwasowe są „znacząco homologiczne” lub „znacząco podobne”, jeśli na określonej długości jest wystarczająco dużo aminokwasów identycznych bądź podobnych (funkcjonalnie identycznych) tak, że odróżnia je to od innych sekwencji. Korzystnie, identyfikacji sekwencji podobnych bądź homologicznych dokonuje się przez dopasowanie, na przykład, za pomocą programu zestawiającego GCG (Genetics Computer Group, Program Manual for the GCG Package, Version 7, Madison, Wisconsin) lub dowolnego programu spośród powyżej opisanych (BLAST, FASTA itp.). Jako odnośniki do literatury załączono tu następujące odnośniki rozpatrujące algorytm BLAST: BLAST ALGORITHMS: Altschul, S.F., Gish, W., Miller, W., Myers, E.W. & Lipman, D.J., J.Mol.Biol. 215:403-410, 1990; Gish, W. & States, D.J., Nature Genet. 3:266-272, 1993; Madden, T.L., Tatusov, R.L. & Zhang, J., Meth. Enzymol. 266:131-141, 1996; Altschul, S.F., Madden, T.L., Schaffer, A.A., Zhang, J., Zhang, Z., Miller, W. & Lipman, D.J., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1997; Zhang, J. & Madden, T.L., Genome Res. 7:649-656, 1997; Woottnon, J.C. & Federhen, S., Comput. Chem. 17:149-163, 1993; Hancock, J.M. & Armstrong, J.S., Comput. Appl. Biosci. 10:67-70, 1994; UKŁADY OCENY DOPASOWANIA: Dayhoff, M.O., Schwartz, R.M. & Orcutt, B.C. (1978) „A model of evolutionary change in proteins” w „Atlas of Protein Sequence and Structure” tom 5 suplement 3 M.O. Dayhoff (wyd.), str. 345-352, Natl. Biomed. Res. Found., Washington, DC; Schwartz, R.M. & Dayhoff, M.O. (1987) „Matrices for detecting distant relationship” „Atlas of Protein Sequence and Structure” tom 5 suplement 3. M.O. Dayhoff (wyd.) str.353-358, Natl. Biomed. Res. Found., Washington, DC; Altschul, S.F., J.Mol.Biol. 219:555-565, 1991; States, D.J., Gish, W., Altschul, S.F., Methods 3:66-70, 1991; Heinkoff, S. & Heinkoff, J.G., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915--10919, 1992; Altschul, S.F., J. Mol. Evol. 36:290-300, 1993; STATYSTYKI DOPASOWANIA: Karlin, S. & Altschul, S.F., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268, 1990; Karlin, S. & Altschul, S.F., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877, 1993; Dembo, A., Karlin S. & Zeitouni, O., Ann. Prob. 22:2022-2039, 1994 i Altschul, S.F. (1997) „Evaluating the statistical significance of multiple distinct local alignments” „Theoretical and Computational Methods in Genome Research”. (S. Shuai, wyd.) str. 1-14, Plenum, New York.
„Sekwencja promotorowa” jest regulatorowym regionem DNA, zdolnym do przyłączania polimerazy RNA w komórce i rozpoczęcia transkrypcji danej sekwencji. W celu określenia niniejszego wynalazku, sekwencja promotorowa znajdująca się powyżej względem cDNA połączona jest swoim 3' końcem przez miejsce rozpoczęcia transktypcji i rozciąga się powyżej (w kierunku 5') obejmując minimalną liczbę par zasad lub elementów niezbędnych do zapoczątkowania transkrypcji na poziomie wykrywalnym powyżej tła. Sekwencja promotorowa znajdująca się poniżej względem cDNA (w celu wyrażania (-)RNA) połączona jest swoim 5' końcem poprzez miejsce rozpoczęcia transkrypcji i rozciąga się poniżej (w kierunku 3') obejmując minimalną liczbę par zasad lub elementów niezbędnych do zapoczątkowania transkrypcji na poziomie wykrywalnym powyżej tła. Układ dwukierunkowy według wynalazku obejmuje zarówno promotory położone w kierunku 5' jak i 3'; układ jednokierunkowy obejmuje jedynie promotory położone w kierunku 5'. W obrębie sekwencji promotorowej znajduje się miejsce inicjacji (dogodnie określane za pomocą np. mapowania z użyciem nukleazy S1), jak również domeny łączące białko (sekwencje konsensusowe) odpowiedzialne za przyłączanie polimerazy.
Każdy znany promotor może być zastosowany w niniejszym wynalazku tak długo jak tylko zapewnione zostaną zasadnicze elementy wynalazku. Na przykład do promotorów pol II, które mogą być wykorzystane do kontrolowania ekspresji genu zaliczane są, ale nie wyłącznie, promotor cytomegalowirusa (CMV) (U.S. Patent Nos. 5,385,839 i 5,168,062), wczesny region promotorowy SV40 (Benoist i Chambon, Nature 290:304-310, 1981), promotor zawarty w długich końcowych powtórzeniach 3' wirusa mięsaka Rous'a (Yamamoto, i wsp., Cell 22:787-797, 1980), promotor kinazy tymidynowej wirusa herpes (Wagner i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:1441-1445, 1981), sekwencje regulatorowe genu matalotioneiny (Brinster i wsp., Naturę 296:39-42, 1982); promotory polimerazy RNA wirusa T7; promotory polimerazy RNA wirusa T3; promotory polimerazy RNA wirusa SP6 i inne promotory skuteczne w badanych komórkach gospodarza. Promotory pol I wykorzystywane do uzyskania ekspressji RNA nie mającego czapeczki, są powszechnie obecne we wszystkich organizmach eukariotycznych wliczając w to ludzką polimerazę RNA I (patrz Molecular Cell Biology, Darnell i wsp., wyd. 1986, ss. 311, 365-6). W niniejszym wynalazku mogą być także zastosowane promotory polimerazy RNA III.
PL 205 955 B1
Sekwencja kodująca „znajduje się pod kontrolą”, „jest funkcjonalnie związana z” lub „czynnościowo związana z” sekwencjami kontrolnymi dla transkrypcji i translacji w komórce (np. promotorem pol I lub pol II), jeżeli polimeraza RNA transkrybuje sekwencję kodującą do RNA np., mRNA lub vRNA.
Pojęcia „wyrażać” i „ekspresja” oznaczają umożliwienie lub spowodowanie wyrażenia informacji zawartej w genie lub sekwencji DNA, na przykład wytworzenia RNA (wliczając cRNA, vRNA i wirusowy mRNA) lub białka przez aktywowanie funkcji komórkowych zaangażowanych w proces transkrypcji oraz translacji odpowiedniego genu bądź sekwencji DNA. Sekwencja DNA jest wyrażana w lub przez komórkę aby wytworzyć „produkt ekspresji” taki jak białko. Sam produkt ekspresji np. będące jej wynikiem białko można określić jako „ wyrażone przez komórkę”.
Pojęcie „transfekcji” oznacza wstawienie obcego kwasu nukleinowego do komórki w taki sposób, że komórka gospodarza będzie wyrażać wstawiony gen lub sekwencję w celu wytwarzania żądanego polipeptydu kodowanego przez ten wstawiony gen lub sekwencję. Wstawiony gen lub sekwencja mogą być także określane jako „sklonowany” lub „obcy” gen bądź sekwencja, mogą zawierać regulatorowe lub kontrolne sekwencje, takie jak sygnał start, stop, promotor, sygnał sekrecyjny lub inne sekwencje wykorzystywane przez mechanizm genetyki komórkowej. Gen lub sekwencja mogą obejmować obszary niefunkcjonalne lub o nieznanej funkcji. Komórka gospodarza, która otrzymała i wyraża wprowadzony DNA lub RNA, została „stransformowana” i określana jest jako „transformat” albo „klon”. Wprowadzony do komórki gospodarza DNA lub RNA może mieć różne pochodzenie, włączając komórki tego samego rodzaju lub gatunku, co komórka gospodarza, bądź komórki innego rodzaju lub gatunku.
Pojęcia „wektor”, „wektor klonujący” i „wektor ekspresyjny” oznaczają nośnik, w którym sekwencja DNA lub RNA (np. obcy gen) może zostać wprowadzona do komórki gospodarza celem jej tranformacji i spowodowania ekspresji (np. transkrypcji i translacji) wprowadzonej sekwencji. Korzystnymi postaciami wektorów według wynalazku są plazmidy.
Zazwyczaj, wektory zawierają DNA nośnika, do którego wprowadzony został obcy DNA. Powszechny sposób na wstawienie jednego segmentu DNA do innego segmentu DNA, polega na wykorzystaniu enzymów zwanych enzymami restrykcyjnymi, które przecinają DNA w specyficznych miejscach (specyficznych grupach nukleotydów) zwanych miejscami restrykcyjnymi. Pojęcie „kasety” odnosi się do sekwencji kodującej DNA lub segmentu DNA kodującego produkt ulegający ekspresji, który może być wstawiony do wektora w zdefiniowanych miejscach restrykcyjnych. Miejsca restrykcyjne w kasecie są tak zaprojektowane, aby zapewnić wstawienie kasety w odpowiedniej ramce odczytu. Zazwyczaj, obcy DNA jest wstawiany w jedno lub więcej miejsc restrykcyjnych wektorowego DNA, a następnie ulega przeniesieniu, za pomocą wektora, do komórki gospodarza razem z przenośnym DNA wektora. Segment bądź sekwencja DNA posiadająca wstawiony lub dodany DNA, taki jak wektor ekspresyjny, może być także określana mianem „konstruktu DNA”. Powszechnym rodzajem wektora jest „plazmid”, który zazwyczaj jest samodzielną cząsteczką dwuniciowego DNA, zwykle pochodzenia bakteryjnego, która może z łatwością przyjąć dodatkowe (obce) DNA i którą można z łatwością wprowadzić do odpowiedniej komórki gospodarza. Wektor plazmidowy często zawiera DNA kodujący oraz DNA promotorowy i ma jedno lub więcej miejsc restrykcyjnych odpowiednich do wstawienia obcego DNA. Kodujące DNA to sekwencja kodująca określoną sekwencję aminokwasową danego białka bądź enzymu. DNA promotorowy to sekwencja rozpoczynająca, regulująca bądź pośrednicząca lub w inny sposób kontrolująca ekspresję kodującego DNA. Promotorowy DNA oraz DNA kodujący może pochodzić z tego samego lub z różnych genów oraz z tego samego lub różnych organizmów. Rekombinowane wektory klonujące często zawierać będą jeden lub więcej układów replikacyjnych do klonowania bądź ekspresji, jeden lub więcej markerów służących do selekcji (np. oporności na antybiotyk) w gospodarzu i jedną lub więcej kaset ekspresyjnych.
Pojęcie „układu ekspresyjnego” oznacza komórkę gospodarza i kompatybilny do niej wektor w odpowiednich warunkach, dobrane np. celem uzyskania ekspresji białka kodowanego przez obcą sekwencję DNA, przenoszoną przez wektor i wprowadzoną do komórki gospodarza.
Pojęcie „heterologiczny” odnosi się do naturalnie nie występującej kombinacji elementów. Na przykład, heterologiczny DNA odnosi się do DNA nie znajdującego się naturalnie w komórce lub w locus chromosomowym danej komórki. Korzystnie, heterologiczny DNA obejmuje obcy dla danej komórki gen. Heterologiczny składnik regulacji ekspresji to taki, który jest czynnościowo związany z innym niż naturalnie związanym genem. W kontekście niniejszego wynalazku, gen kodujący polipeptyd zawierający sekwencję pochodzącą z biblioteki sekwencyjnej jest heterologiczny względem wektorowego DNA, do którego został wstawiony celem klonowania lub uzyskania ekspresji oraz jest heterologiczny względem komórki gospodarza posiadającej taki wektor, w którym następuje ekspresja tego genu.
PL 205 955 B1
Jak zwrócono uwagę powyżej, wynalazek umożliwia wytwarzanie wirusów przearanżowanych za pomocą heterologicznych genów wirusowych. Oprócz możliwości włączania genów dla antygenów wirusowych w genetyczne zaplecze wirusowego szczepu przystosowanego do dobrego wzrostu w hodowli, wynalazek umożliwia rearanżacje międzygatunkowe, np. w przypadku antygenu wirusa grypy typu B wykorzystującego genetyczne zaplecze wirusa grypy typu A.
Szczepionki
Jak zwrócono uwagę powyżej, niniejszy wynalazek dostarcza wydajnej i ekonomicznej strategii wytwarzania szczepionek stosowanych w leczeniu bądź zapobieganiu infekcjom wirusem RNA, korzystnie, infekcjom wirusem RNA o nici ujemnej. Układ oparty na minimalnej liczbie plazmidów według wynalazku, eliminuje potrzebę selekcji i zapewnia ścisłą kontrolę nad przearanżowanymi wirusami. W celu produkcji szczepionki z inaktywowanym wirusem grypy, sześć plazmidów pochodzących z wysoko wydajnego szczepu (np. PR/8/34 (H1N1)), zawierających nieglikoproteinowe segementy (np. PS1, PS2, PA, NP, M i NS) można poddać kotransfekcji z dwoma plazmidami ekspresyjnymi posiadającymi cDNA dla HA i NA zalecanego podtypu szczepionkowego. Ponieważ stosowanie wirusa pomocniczego nie jest wymagane, wytworzony wirus jest wirusem grypy o żądanym ułożeniu genów. Analogiczne podejście można zastosować do wytwarzania jakiejkolwiek odmiany inaktywowanego, przereanżowanego wirusa RNA, w celu wykorzystania go do zastosowania w szczepionce. Plazmidy ekspresyjne zawierające segmenty wirusowego genu dla wirusa docelowego (np. segmenty nie-glikoproteinowe), mogą być kotransfekowane z innymi plazmidami ekspresyjnymi kodującymi białka odpowiadające danym podtypom wirusów zakaźnych (np. podtypowi wirusowemu, który aktualnie krąży w populacji). Wytworzony według wynalazku wirus, może być stosowany na zasadzie tradycyjnej lub nowoczesnej metody szczepienia (patrz Bilsel i Kawaoka, w Nicolson, Webster and May (wyd.), Textbook of Influenza, rozdział 32, ss. 422-434), a zwłaszcza w pozyskiwaniu żywych, atenuowanych szczepionek (przedyskutowane bardziej szczegółowo poniżej). W szczególności niniejszy wynalazek omija wady współczesnej technologii w odniesieniu do pozyskiwania przearanżowanych wirusów charakteryzujących się ograniczoną liczbą gospodarzy bądź nieprzewidywalnych atenuacji (idem).
Włożono wiele wysiłku w wytworzenie szczepionki przeciw grypie (patrz Wood i Williams, w: Nicholson, Webster and May (wyd.), Textbook of Influenza, rozdział 23, ss. 317-323). Aczkolwiek w części tej wiele uwagi poświęcono szczepionkom grypy, wszystkie szczepionki przeciwko wirusom RNA, korzystnie, szczepionki przeciw wirusom o segmentowanej ujemnej nici RNA, a zwłaszcza szczepionki przeciw Orthomyxoviridae.
Obecnie dostępne są trzy rodzaje inaktywowanych szczepionek przeciw grypie: szczepionki na bazie całych wirusów, produktów ich rozdziału oraz antygenów powierzchniowych (patrz. Wood, w: Nicholson, Webster and May (wyd.), Textbook of Influenza, Chapter 25, pp. 333-345). Ponieważ niniejszy wynalazek pozwala na szybkie uzyskanie żądanego przearanżowanego wirusa o dopuszczalnych parametrach wzrostu w hodowli, w korzystny sposób umożliwia on wytwórcy szczepionek produkowanie dostatecznych ilości szczepionki w stosunku do społecznego zapotrzebowania zapewniając jednocześnie jej standaryzację, co jest istotnym wymogiem obecnie w mniejszym stopniu egzekwowanym z powodu konieczności produkowania klinicznych ilości szczepionki, zazwyczaj w ciągu 8 do 9 miesięcy (Wood, jw., p.333).
Problemem jest także bezpieczeństwo szczepionki (patrz. Wiselka, w: Nicholson, Webster i May (wyd.), Textbook of Influenza, Chapter 26, pp. 346-357). Ponieważ wytwarzanie szczepionek możliwe jest w określonych układach hodowli komórkowych, pozwala to na uniknięcie niespecyficznych patogenów, bakterii oraz białek uczulających, które mogą być obecne w, przygotowywanych na zarodkach jaj, szczepionkach komercyjnych.
Wraz ze szczepionką (np., szczepionką przeciw grypie) stosuje się adiuwanty (Wood i Williams, jw.). Termin „adiutant” odnosi się do związku bądź mieszaniny wzmacniającej odpowiedź immunologiczną na antygen. Adiuwant może służyć jako tkankowy, powoli uwalniający antygenowy depot, a także jako aktywator układu limfatycznego wzmacniający odpowiedź immunologiczną w sposób niespecyficzny (Hood i wsp., Immunology, Second Ed., 1984, Benjamin/Cummings: Menlo Park, California, p. 384). Często, wystawienie na działanie samego antygenu przy braku adiuwanta nie spowoduje wywołania immunologicznej odpowiedzi humoralnej bądź komórkowej. Do adiuwantów zalicza się, między innymi, kompletny adiuwant Freunda, niekompletny adiuwant Freunda, saponinę, żele mineralne, takie jak wodorotlenek glinu, substancje powierzchniowo czynne, takie jak lizolecytyna, liczne polijony, polianiony, peptydy, emulsje olejowe bądź węglowodorowe, a także potencjalnie użyteczne adiuwanty ludzkie, takie jak BCG (bacille Calmette-Guerin) oraz Corynebacterium parvum. PrzykłaPL 205 955 B1 dem korzystnego adiuwanta syntetycznego jest QS-21. W sposób alternatywny lub dodatkowy wprowadzić można, opisane poniżej, immunostymulujące białka, w charakterze adiuwantów bądź celem zwiększenia odpowiedzi immunologicznej na szczepionkę. Korzystnie, adiuwant jest środkiem farmaceutycznie dopuszczalnym.
Pojęcie „farmaceutycznie dopuszczalny” odnosi się do związków oraz kompozycji, które są fizjologicznie tolerowane i zazwyczaj nie powodują u ludzi alergicznych bądź zbliżonych, niekorzystnych reakcji, takich jak zaburzenia żołądkowe, zawroty głowy i tym podobne objawy. Korzystnie, zastosowane tutaj pojęcie „farmaceutycznie dopuszczalny” oznacza - zaakceptowany przez agencję nadzoru rządu federalnego lub stanowego bądź wymieniony na liście U.S. Pharmacopea lub innej powszechnie znanej farmakopei, jako przeznaczony do stosowania u zwierząt, a zwłaszcza u ludzi. Termin „nośnik” odnosi się do rozpuszczalnika, adiuwanta, substancji pomocniczej bądź podłoża, z którym związek jest podawany. Korzystnie stosowane nośniki, zwłaszcza roztworów iniekcyjnych, to woda sterylna bądź roztwory soli fizjologicznej oraz roztwory wodne glukozy i glicerolu. Dogodne nośniki farmaceutyczne opisano w „Remington's Pharmaceutical Science” E.W.Martina.
Skuteczność szczepienia można podwyższyć przez jednoczesne podanie wraz ze szczepionką, zwłaszcza zaś ze szczepionką wektorową, cząsteczek immunostymulujących (Salgaller i Lodge, J. Surg. Oncol. 1998, 68:122), takich jak immunostymulujące, wzmagające odpowiedź układu odpornościowego lub prozapalne cytokiny, limfokiny bądź chemokiny. Można stosować na przykład, cytokiny lub geny dla cytokin, takich jak IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-12, IL-13, czynnik pobudzający powstawanie kolonii granulocytówmakrofagów (GM) (colony stimulating factor-CSF), jak również inne czynniki pobudzające powstawanie kolonii, czynniki powodujące reakcję zapalną makrofagów, ligand Flt3 (Lyman, Curr. Opin. Hematol., 5:192, 1998) oraz niektóre kluczowe współstymulujące cząsteczki lub ich geny (np., B7.1, B7.2). Takie immunostymulujące cząsteczki dostarczyć można układowo bądź miejscowo w formie białek lub przez ekspresję wektora kodującego cząsteczki podlegające ekspresji.
Celowanie w komórki dendrytyczne
Szczepienia można dokonać przez celowanie (targeting) w komórki dendrytyczne (Steinman, J. Lab.Med., 128:531, 1996; Steinman, Exp. Hematol., 24:859, 1996; Taite i wsp., Leukemia, 13:653, 1999; Avigan, Blood Rev., 13:51, 1999; DiNicola i wsp., Cytokines Cell.Mol.Ther., 4:265, 1998). Komórki dendrytyczne odgrywają decydującą rolę w aktywacji odporności zależnej od limfocytów T. Dzielące się komórki dendrytyczne mogą być stosowane do zdobycia antygenów białkowych w formie immunogennej in situ, a następnie prezentowania tych antygenów w postaci, która jest rozpoznawana i powoduje stymulację limfocytów T (patrz Steinman, Exper.Hematol. 24:859-862, 1996; Inaba i wsp., J.Exp. Med., 188:2163-73, 1998 i U.S. Pat.nr 5,851,756). W celu przeprowadzenia stymulacji ex vivo, komórki dendrytyczne umieszczone są na płytkach hodowlanych i poddawane działaniu (pulsacji z) wirionów w ilości i w czasie wystarczającym, na przyłączenie się antygenów wirusowych do komórek dendrytycznych. Tak potraktowane komórki można następnie z powrotem przeszczepić osobnikowi poddawanemu kuracji np. za pomocą zastrzyku dożylnego. Korzystnie, stosowane są autologiczne komórki dendrytyczne tj. komórki dendrytyczne pozyskane od osobnika poddawanego kuracji, jednakże możliwe jest także wykorzystanie komórek dendrytycznych dopasowanych w zakresie cząsteczek MHC klasy II, które mogą pochodzić od donora dopasowanego pod względem typu tych cząsteczek, bądź mogą być otrzymane dzięki inżynierii genetycznej komórek dendrytycznych celem uzyskania ekspresji żądanych cząsteczek MHC (i korzystnie, tłumią ekspresję niepożądanych cząsteczek MHC).
Korzystnie, komórki dendrytyczne są w specyficzny sposób nakierowywane in vivo, w celu pobierania wirusa lub wirusowych podjednostek. Dostępne są rozmaite strategie służące do nakierowywania komórek dendrytycznych in vivo przez wykorzystanie receptorów pośredniczących w prezentowaniu antygenów, takich jak DEC-205 (Swiggard i wsp., Cell. Immunol., 165:302-11, 1995; Steinman, Exp.Hematol., 24:859, 1996) oraz receptorów Fc.
Szczepionki inaktywowane
Szczepionki z inaktywowanym wirusem są dobrze opracowane dla szczepień przeciwko infekcjom wywołanym wirusem RNA (np. wirusem grypy) (patrz Nichol, w Nicholson, Webster i May (wyd.), Textbook of Influenza, rozdział 27, str.358-372). W celu przygotowania inaktywowanego wirusa stansfekowany wirus jest hodowany w hodowli komórkowej lub zapłodnionych jajach kurzych. Wirus może ulec inaktywacji przez traktowanie go formaldehydem, beta-propiolaktonem, eterem bądź eterem z detergentem (takim jak Tween-80), cetylo trimetylo bromkiem amonu (CTAB) i Tritonem N101, deoksycholanem sodu i tri(n-butylo)fosforanem (Furmingen, powyżej; Wood i Williams, powyżej). Inaktywacja może pojawić się po lub przed oczyszczaniem płynu omoczniowego (z wirusa hodowanego
PL 205 955 B1 w jajach); wiriony są izolowane i oczyszczane przez odwirowywanie (Furminger, powyżej, patrz s. 326). W celu oszacowania siły działania szczepionki, można zastosować test pojedynczej immunodyfuzji radialnej (SRD) (Schild i wsp., Bull. World Health Organ. 1975, 52:43-50 i 223-31 Mastow i wsp., J. Clin.Microbiol. 1975, 2:531). Dawka wymagana do wywołania zadowalającej odpowiedzi odpornościowej została wystandaryzowana i wynosi 15 μg HA/szczep/dawkę. Inaktywowaną szczepionkę można podawać domięśniowo przez iniekcję.
Szczepionki zawierające żywego atenuowanego wirusa grypy
Otrzymano szczepionki (szczepionki przeciw grypie) zawierające przystosowane do niskiej temperatury, atenuowane, żywe wirusy RNA (patrz Keitel i Piedra, w: Nicolson, Webster i May (wyd.) Textbook of Influenza, rozdział 28 ss.373-390; Ghendon w: Nicolson, Webster i May (wyd.) Textbook of Influenza, rozdział 29, str. 391-399). Zdolność do wytworzenia wirusa grypy wyłącznie z ośmiu plazmidów pozwala na dopasowanie atenuacji szczepu stosowanego do szczepionek i umożliwia pozyskiwanie szczepionki zawierającej szczep w sposób optymalny dostosowanej do potrzeb dowolnej populacji docelowej (patrz, Bilsel i Kawaoka, jw.). Ponieważ szczepy grypy A/Ann Arbor/6/60 (H2N2) lub wirusa grypy B/Ann Arbor/1/66 są obecnie stosowane do wytwarzania szczepionek zawierających żywe atenuowane wirusy, do plazmidu, takiego jak pHW2000 wstawić można każdą z sześciu cząsteczek cDNA genów wewnętrznych (PB2, PB1, PA, NP, M, NS) grypy. Następnie można skonstruować dwa plazmidy zawierające glikoproteiny HA i NA stosownego szczepu grypy i dokonać kontransfekcji sześcioma plazmidami głównymi kodującymi nieglikozylowane białka grypy.
Oprócz tego, że genetyczna modyfikacja kodującego lub niekodującego regionu genów wewnętrznych umożliwia pozyskanie atenuowanego wirusa, powinna ona także podwyższyć stopień bezpieczeństwa, infekcyjności, immunogenności oraz skuteczności ochrony szczepionki.
Dzięki manipulacji w obrębie genu HA podwyższeniu może ulec również bezpieczeństwo szczepu służącego do wytwarzania szczepionki. Na przykład, bezpieczeństwo szczepionki podwyższyć można przez usunięcie podstawowych aminokwasów znalezionych w peptydzie wiążącym glikoproteiny H5 lub H7 u wysoce patogennych ptasich wirusów grypy typu A.
Szczepienie śluzówkowe
Sposoby szczepienia śluzówkowego dają szczególnie dobre rezultaty w przypadku wielu patogennych wirusów, ponieważ zakażenie często następuje przez śluzówkę. Śluzówka jest siedliskiem komórek dendrytycznych, które stanowią ważnymi celami dla szczepionek EBNA-1 oraz immunoterapii. Rozważa się zatem strategie szczepień śluzówkowych szczepionką inaktywowanego i atenuowanego wirusa.
Podczas, gdy do śluzówki dotrzeć można za pomocą miejscowego podania szczepionki, opracowano szereg rozmaitych metod celem dostarczenia do śluzówki imunogennych białek.
W konkretnym wykonaniu, szczepionkę można podawać jako domieszkę lub koniugat bądź chimeryczne białko fuzyjne z toksyną cholery, taką jak toksyna B czy toksyna chimeryczna A/B cholery (Hajishengallis, J Immunol., 154:4322-32, 1995; Jobling i Holmes, Infect Immun., 60:4915-24, 1992). Szczepionki działające na błony śluzowe oparte na zastosowaniu podjednostki toksyny B cholery zostały już opisane (Lebens i Holmgren, Dev Biol Stand 82:215-27, 1994). W innym wykonaniu, do przygotowania szczepionki działającej na błony śluzowe można się posłużyć domieszką zawierającą enterotoksynę wrażliwą na wysoką temperaturę (heat labile enterotoxin, LT).
Inne strategie immunizacji śluzówki obejmują enkapsulację wirusa (USA patenty nr nr 5,075,109, 5,820,883 i 5,853,763) oraz wykorzystywanie błonowego nośnika o działaniu wzmagającym odpowiedź immunologiczną (WO 98/0558). Immunogenność doustnie podawanych immunogenów można wzmocnić stosując krwinki czerwone (rbc) lub „duchów” krwinek czerwonych (USA Patent nr 5,643,577) czy wykorzystując antygen sinego języka (blue tongue antigen; USA Patent nr 5,690,938).
Przykłady
Niniejszy wynalazek będzie lepiej zrozumiany w odniesieniu do następujących przykładów, które ilustrują wynalazek bez jego ograniczania.
P r z y k ł a d 1 „Ambisensowne” podejście do wytwarzania wirusa grypy typu A: synteza vRNA i mRNA z jednej matrycy
Jako pierwszy krok w ograniczeniu liczby plazmidów, przykład ten opisuje konstruowanie i transfekcję plazmidów zawierających zarówno promotor pol I jak i pol II na tym samym plazmidzie i przedstawia dowody, że układ taki umożliwia ekspresję vRNA i białka na podstawie jednej matrycy. Przykład ten został opublikowany (Hoffmann i wsp., Virology 2000, 267:310).
PL 205 955 B1
Materiały i Metody
Klonowanie plazmidów. Wszystkie procesy klonowania i reakcje PCR przeprowadzano według standardowych protokołów. W skrócie, plazmidy ekspresyjne dla genów kompleksu polimerazy A/WSN/33 pochodziły z pcDNA3 (Invitrogen) zawierającego wczesny promotor ludzkiego cytomegalowirusa (CMV) i miejsce poli A genu kodującego bydlęcy hormon wzrostu (BGH). Wirusowy cDNA dostarczono z plazmidów pWNP143, pWSNPA3, pWSNPB2-14, pGW-PB1 w celu uzyskania ekspresji konstruktów pHW25-NP, pHW23-PA, pHW21-PB2, pHW22-PB1. Plazmid pHW12 uzyskano poprzez wstawienie sekwencji promotora i terminatora ludzkiej pol I pomiędzy promotor pol II i miejsce poli A. Plazmid pHW52 uzyskano z pHW12 przez wstawienie oligonukleotydów zawierających rejon niekodujący PB1 powiększony o miejsca restrykcyjne dla Hindlll i Xhol, a następnie wstawienie w te miejsca rejonu kodującego PB1 z pHW22-PB1. Plazmid pHW82-PB1 uzyskano z pHW52-PB1 poprzez delecje sekwencji promotorowych CMV. Rejon kodujący białka wzmocnionej zielonej fluorescencji (EGFP) w konstrukcie reporterowym pHW72-EGFP otrzymano po amplifikacji metodą PCR, wykorzystując jako matrycę pEGFP-N1 (Clontech) i wstawiając cDNA, po trawieniu enzymami Sacl/Xhol, do plazmidu pWH72 zawierającego promotor ludzkiej pol I i mysi terminator oraz rejon niekodujący segmentu M oddzielony przez miejsca restrykcyjne dla Sacl/Xhol. Plazmidy pHW127-M i pHW128-NS skonstruowano za pomocą amplifikacji RT-PCR wirusowego RNA ze starterami zawierającymi sekwencje specyficzne dla segmentu i miejsca restrykcyjne BsmBI wykorzystane do insercji w strawiony enzymem BsmBI wektor pHH21 (E.Hoffmann, Ph.D. Thesis 1997, Justus Liebig University, Giessen, Germany; Neumann i wsp., Proc.Natl. Acad.Sci USA 1999, 96:9345). Konstuowanie plazmidów pPolI-WSN-PB1; pPolI-WSN-PB2, pPolI-WSN-PA, pPolI-WSN-NP, pPolI-WSN-HA, pPolI-WSN-NA, pEWSN-HA i pCAGGS-WNA15 opisano w innym miejscu (Neumann i wsp., jw.).
Hodowla komórkowa i transfekcja
Komórki nerki psa Madin-Darby (MDCK) trzymano w zmodyfikowanej pożywce Eagle (MEM) zawierającej 10% osocza płodu bydlęcego (FBS), embrionalne ludzkie komórki nerki 293T hodowano w zmodyfikowanej pożywce Eagle Dulbecco (DMEM) zawierającej 10% FBS. Do transfekcji 1 x 106 komórek 293T używano TransIT LT-1 (Panvera, Madison, Wisconsin) zgodnie z instrukcją producenta. Różne ilości plazmidów (tab. 1) mieszano z TransIT LT-1 (2 μl TransIT LT-1 na 1 μg DNA), inkubowano w temperaturze pokojowej przez 45 min i dodawano do komórek. Sześć godzin później mieszaninę stransfekowanego DNA zastępowano OptiMEM (Gibco/BRL, Gaithersburg, Maryland) zawierającą 0,3% bydlęcego białka osocza (BSA) i 0,01% FBS. Czterdzieści osiem godzin po transfekcji, supernatant zawierający wirusa miareczkowano w komórkach MDCK.
Izolacja RNA i RT-PCR
Wirusowy RNA izolowano z cząsteczek wirusa za pomocą zestawu RNeasy-Kit (Qiagen, Valencia, California) zgodnie z instrukcją producenta. W celu charakteryzacji zrekombinowanych wirusów grypy zastosowano zestaw Access RT-PCR (Promega, Madison, Winsconsin) zgodnie z dostarczonym protokołem. W doświadczeniach z użyciem RT-PCR wykorzystano następujące startery: Seq-PB1#1:5'-AGG ATG GGA TTC CTC AAG G-3' (Sek nr id.:1); Seq-PB1#2: 5'-GCT ATG GTT TCC AGA GCC CG3' (Sek.nr id.:2); Bm-PBl-1: 5'-TAT TCG TCT CAG GGA GCG AAA GCA GGC A-3' (Sek.nr id.:3); BmPB1-2341R: 5'-ATA TCG TCT CGT ATT AGT AGA AAC AAG GCA TTT-3' (Sek.nr id.:4). Doświadczenia z RT-PCR przeprowadzano za pomocą maszyny PTC-200 DNA (MJ Research, Watertown, Massachusetts). Program amplifikacji rozpoczynał się 1 cyklem w 48°C przez 45 min (synteza pierwszej nici cDNA) i 1 cyklem w 94°C przez 2 min (inaktywacja odwrotnej transkryptazy AMV i denaturacja cDNA). Następnie przeprowadzano 40 cykli w 94°C przez 20 sek, 52°C przez 30 sek i 72°C przez 30 sek (amplifikacja PCR); program kończył się jednym cyklem w 72°C przez 5 min. Produkty PCR analizowano za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym i sekwencjonowano ze starterem Seq-PB1#1 lub Seq-PB1#2.
Cytometria przepływowa
Czterdzieści osiem godzin po transfekcji, komórki 293T przemywano roztworem soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS), odzyskiwano w formie osadu i ponownie zawieszano w PBS z 5% FBS. Analizę cytometrii przepływowej przeprowadzano za pomocą cytometru przepływowego FACS Calibur (Becton Dickinson), a dane analizowano za pomocą oprogramowania CellQuest. Do analizy ekspresji EGFP użyto fali emisyjnej o długości 530 nm (FL1) w celu uzyskania wysokiej czułości detekcji fluorescencji z udziałem EGFP.
PL 205 955 B1
Rezultaty i Dyskusja
Konstrukcja i właściwości wektora klonującego pHW12 zawierającego dwa promotory eukariotyczne
Wirusy grypy typu A są wirusami segmentowanymi zawierającymi cząsteczki RNA o ujemnej polarności. Podczas cyklu replikacyjnego, rozpoznanie struktur 5' i 3' ośmiu segmentów vRNA przez białka kompleksu rybonukleoproteidowego (PB2, PB1, PA, NP) powoduje replikację i transkrypcję genów wirusa grypy. Fakt, że elementy sekwencji terminatorowej są silnie konserwowane wskazuje, że transkrybowane sztuczne RNA powinno posiadać sekwencje takie same jak te znajdujące się na końcach 5' i 3' (Luo i wsp., J.Virol. 1991, 65:2861; Flick i wsp., RNA 1996, 2:1046). Wektor klonujący pHW12 skonstruowano tak, by możliwe było wstawienie danej sekwencji pomiędzy promotor i terminator pol I za pomocą endonukleazy restrykcyjnej BsmBl. Jednostka transkrypcyjna pol I flankowana jest przez promotor pol II z cytomegalowirusa (CMV) i sygnał poliadenylacji genu kodującego bydlęcy hormon wzrostu. Promotor CMV, miejsce poli A oraz szkielet plazmidu pochodzą z wektora klonującego pcDNA3.
Ekspresja białka PB1 w dwukierunkowym układzie transkrypcyjnym pol I/pol II
W celu przetestowania jednoplazmidowego układu transkrypcji pol I/pol I, do wektora klonującego pHW12 wstawiono cDNA genu PB1 wirusa A/WSN/33 celem uzyskania plazmidu pHW52-PB1. Do 5' i 3' niekodujących rejonów tego genu wstawiono miejsca restrykcyjne dla HindlII i XhoI. Te genetyczne wskaźniki zostały umieszczone, aby upewnić się, że wytworzony zrekombinowany wirus może być zidentyfikowany za pomocą RT-PCR. Oczekiwano, że ludzkie komórki stransfekowane takim plazmidem będą wytwarzać dwa rodzaje RNA: PB1-vRNA syntetyzowane przez komórkową pol I i mRNA z 5' czapeczką syntetyzowane przez pol II. Translacja mRNA powinna prowadzić do wytworzenia białka PB1.
W celu zbadania czy białko PB1 jest wytwarzane przez taki konstrukt, sprawdzano replikację i transkrypcję sztucznego vRNA pod kontrolą promotora CMV poprzez konstruowanie plazmidów ekspresyjnch pHW21-PB2, pHW23-PA i pHW25-NP, które zawierały cDNA kodujące białka PB2, PA oraz NP wirusa A/WSN/33. W celu wytworzenia sztucznego vRNA in vivo, skonstruowano plazmid reporterowy pHW72-EGFP, zawierający cDNA EGFP flankowane rejonem niekodującym segmentu M i sekwencją promotora ludzkiej pol I oraz mysią sekwencję terminatorową. Komórki 293T tranfekowano pięcioma plazmidami (2 μg pHW21-PB2, 2 μg pHW52-PB1 (konstrukt promotorowy pol I/pol II), 2 μg pHW23-PA, 2 pg pHW25-NP i 1 μg pHW72-EGFP). Dwadzieścia cztery i 48 godzin po transfekcji, komórki analizowano pod mikroskopem fluorescencyjnym. Po 24 godz. obserwowano komórki emitujące fluorescencję. Rezultat ten pokazuje, że w czasie 24 godz. białka polimerazy są syntetyzowane w stężeniu wystarczającym do rozpoznania specyficznych dla wirusa grypy końców vRNA EFGP. Białka te syntetyzują mRNA, który ulega translacji do EGFP.
W celu ustalenia wydajności tego układu wyrażającą się liczbą komórek fluorescencyjnch przeprowadzono analizę metodą cytometrii przepływowej. Czterdzieści osiem godzin po transfekcji pięcioma plazmidami, 18,72% populacji komórkowej wykazywało fluorescencję. Przy braku plazmidu pHW52-PB1 widoczny był jedynie poziom tła komórek fluorescencyjnych (0,06%); rezultat ten zgodny jest z tymi spośród wcześniejszych badań, w których wykazano, że wszystkie cztery kompleksy białek RNP są niezbędne dla amplifikacji vRNA (Huang i wsp., J. Virol. 1990, 64:5669). Wyniki wskazują, że transkrypcja cDNA dla PB1 oraz będące jej rezultatem stężenie białka PB1 oraz innych białek kompleksu RNP jest wystarczające do zapoczątkowania wirusowych procesów transkrypcji/replikacji.
Wytwarzanie rekombinowanego wirusa grypy typu A
Dla celów wytwarzania infekcyjnego wirusa grypy typu A koniecznym jest, by plazmid pHW52-PB1 dostarczał nie tylko mRNA dla PB1 oraz samego białka PB1, lecz także wystarczających ilości PB1-vRNA, które mogłyby być przekazane do wirusa potomnego. Do pozostałych siedmiu cząsteczek vRNA użyto plazmidów zawierających cząsteczki cDNA dla pełnej długości cząsteczek RNA wirusa A/WSN/-33, flankowane sekwencjami promotora ludzkiej polimerazy I oraz terminatora mysiej pol I. Rezultatem transfekcji tych plazmidów powinna być synteza wszystkich ośmiu wirusowych cząsteczek RNA podlegających replikacji i transkrypcji w wyniku działania białek polimerazy i tworzących nowe cząsteczki vRNP. Po zsyntetyzowaniu białek strukturalnych cząsteczki RNP byłyby pakowane do nowych cząsteczek wirusa.
Do transfekcji komórek 293T użyto różnych ilości plazmidu pHW52-PB1 (0, 2, 4 μg) oraz plazmidów pPolI-WSN-PB2, pPolI-WSN-PA, pPolI-WSN-HA, pPolI-WSN-NP, pPolI-WSN-NA, pHW127-M, pHW128-NS (każdego w ilości 1 μg). Dokonano kotransfekcji wyrażających białka plazmidów pHW21-PB2 (1 pg), pHW23-PA (0,1 pg), pHW25-NP (1 pg), pEWSN-HA (1 pg) oraz pCAGGS-WNA15 (1 pg).
PL 205 955 B1
Celem podwyższenia wydajności uzyskiwania transfekowanego wirusa dołączono również plazmidy ekspresyjne dla hemaglutyniny (HA) oraz neuraminidazy (NA).
Po upływie 48 godzin od transfekcji supernatant najpierw transfekowanych komórek 293T przeniesiono na komórki MDCK. We wszystkich doświadczeniach opartych na transfekcji, w których dodawano plazmid pHW52-PB1, w 24 godziny po pasażu obserwowano spowodowany przez wirus efekt cytopatogenny. Efekt taki nie był widoczny o ile przy reakcji transfekcji pominięto plazmid ekspresyjnego PB1. Miano wirusa określono poprzez miareczkowanie supernatantu pochodzącego z komórek transfekowanych na komórkach MDCK; supernatant zawierał 2 x 104 - 2 x 105 pfu/ml. Wynik ten pokazuje, że po transfekcji plazmidem PB1-polI/promotor polII (wraz z plazmidami ekspresyjnymi) w komórkach ludzkiej linii 293T vRNA dla PB1 oraz białko PB1 syntetyzowane są na poziomie wystarczającym do celów wytwarzania infekcyjnych wirusów grypy typu A. W doświadczeniach opartych na kotransfekcji z użyciem dwóch plazmidów (pHW82-PB1 i pHW22-PB1) zawierających rozdzielone cDNA dla PB1, miano wirusa wynosiło 2 x 104 pfu/ml; w analogicznym doświadczeniu, w którym użyto plazmidów zawierających sekwencje PB1 dzikiego typu (pPol I-WSN-PB1 i pHW22-PB1) miano wirusa wynosiło 3 x 106 pfu/ml.
W odróżnieniu od stosowanego w poprzednich badaniach konstruktu ekspresyjnego wyposażonego w promotor pol II (Neumann i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1999, 96:9345), wykorzystano plazmid pHW52-PB1 zawierający sekwencje uzyskane z jednostki transkrypcyjnej pol I, wstawione pomiędzy promotor CMV a miejsce poliadenylacji. Ekspresja genu reporterowego EGFP pokazuje, że całkowita ekspresja białka PB1 w tym układzie wystarcza do tworzenia kompleksów EGFP-RNP. Pomimo, że rejon promotora pol I/terminatora zawiera sekwencje rozpoznawane przez czynniki transkrypcji i termiancji specyficzne dla pol I (Beckmann i wsp., Science 1995, 270:1560; Bell i wsp., Science 1988, 241:1192; Kuhn i wsp., EMBO J. 1994, 13:416), nie wydaje się, aby owe białka wiążące się z DNA hamowały transkrypcję z udziałem pol II. Wyniki te zgodne są z faktem, że większe ilości specyficznych względem pol I białek wiążących DNA występują w jąderku, a więc miejscu, w którym zachodzi komórkowa transkrypcja rDNA (Evers i wsp., EMBO J. 1995, 14:1248). Wyniki te wskazują, że po transfekcji komórki konstruktem pol I/pol II niektóre plazmidy dostarczane są do jąderka, gdzie następuje transkrypcja z udziałem pol I, a niektóre pozostają w jądrze, w którym podlegają transkrypcji w wyniku działania polimerazy RNA typu II.
Ponieważ konstrukt reporterowy pHW52-PB1 zawierał dodatkowe sekwencje nie pochodzące z wirusa grypy (miejsca restrykcyjne) w rejonie niekodującym przed kodonem start i po kodonie stop, interesujące było czy sekwencje te były stabilnie zachowywane w segmencie PB1 wirusowego RNA. Zatem, po drugim pasażu transfekcyjnego wirusa na komórki MDCK wyizolowano vRNA i przeprowadzono analizę metodą PCR o odwrotnej transkrypcji. W wyniku amplifikacji vRNA za pomocą starterów specyficznych względem PB1 uzyskano fragmenty cDNA o oczekiwanych rozmiarach. W przypadku stosowania tego samego wirusowego RNA oraz starterów, lecz z pominięciem odwrotnej transkryptazy nie uzyskiwano produktu amplifikacji, co wykazuje, że cDNA pochodziło z wirusowego RNA, a nie z DNA plazmidowego przeniesionego z supernatantu komórek transfekowanych.
W wyniku sekwencjonowania produktów PCR okazało się, że obie sekwencje miejsc restrykcyjnych obecne są w cząsteczce RNA. Wyniki wskazują, że układ transkrypcyjny pol I/pol II pozwala na uzyskanie zakaźnego zrekombinowanego wirusa oraz, że wirus posiadający obce sekwencje w niekodującym rejonie genu PB1, jest żywotny. Zmodyfikowany segment PB1 nadal ulega replikacji, transkrypcji i pakowaniu do cząsteczek wirusowych. Uprzednio, za pomocą układu transfekcyjnego RNP, zmieniono rejon niekodujący segmentów wirusa grypy typu A. Poprzez zastąpienie rejonu niekodującego genu NA odpowiadającą sekwencją segmentu NS wirusa grypy typu B, otrzymano stransfekowane wirusy grypy (Muster i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci USA 1991,88:5177; Bergmann i Muster, J.Gen.Virol. 1995, 76:3211). Taki rodzaj wirusa posiadającego chimerowy segment NA charakteryzuje się atenuowanym fenotypem u myszy i chroni myszy szczepione dawką nie powodującą zgonu, przed zakażeniem dzikim rodzajem wirusa grypy. Wyniki te uwidaczniają, że genetyczna zmiana niekodującego rejonu segmentu RNA może zmienić biologiczne właściwości wirusa wykorzystywanego do transfekcji. Tu, po raz pierwszy pokazano, że nawet sekwencja nie pochodząca od wirusa grypy, może zostać wstawiona w niekodujący rejon segmentu PB1.
Za pomocą układu transkrypcyjnego poll/polll obecnie możliwe jest systematyczne dokonywanie modyfikacji tych elementów sekwencyjnych w niekodującym rejonie segmentu PB1 oraz określanie czy zmiany genetyczne powodują zmiany biologicznych właściwości zrekombinowanych wirusów.
PL 205 955 B1
W rzeczy samej, niższa wydajność wirusów ze zmutowanym segmentem PB1, w porównaniu do wirusa dzikiego typu, wskazuje, że wstawione sekwencje wpływają negatywnie na wzrost wirusa.
Pomimo, że otrzymany ostatnio układ oparty na plazmidzie (Neumann i wsp., powyżej) charakteryzuje się wysoką wydajnością wytwarzania wirusa grypy, wymaga on klonowania 14-17 plazmidów. W tym badaniu zmniejszono do 13 liczbę plazmidów wymaganych do wydajnego uzyskania wirusa grypy szczepu A/WSN/33. Zmniejszenie liczby plazmidów osiągnięte tym sposobem, rokuje nadzieję na wzrost wydajności transfekcji linii komórkowych innych niż komórki 293T, a tym samym pozwala na dostarczenie genów do linii komórkowych, do których dostarczenie 14 plazmidów jest trudne do osiągnięcia. Fodor i wsp.,(J.Virol. 1999, 73:9676) byli w stanie uzyskać wirusa grypy po transfekcji 12 plazmidami, ale wydajność wirusa w tym badaniu wynosiła jedynie 1-2 zakaźnych wirusów na 106 stransfekowanych komórek Vero.
P r z y k ł a d 2
Konstruowanie zrekombinowanych wirusów grypy typu A z wykorzystaniem układu opartego na minimalnej liczbie plazmidów
Przykład ten opisuje zastosowanie układu transfekcyjnego opartego na plazmidzie do uzyskania wirusa grypy typu A w całości ze sklonowanego cDNA. W przeciwieństwie do ustanowionych układów opartych na plazmidzie, ten układ do wytwarzania wirusa grypy typu A wymaga konstruowania i transfekcji tylko ośmiu plazmidów ekspresyjnych, z których każdy zawiera jedna kopię odmiennego wirusowego cDNA odpowiadającego wirusowym segmentom genowym. Ten układ odwrotnej genetyki zmniejsza liczbę plazmidów wymaganych do odzyskania wirusów grypy typu A i pozwala na przewidywalne i wydajne wytwarzanie rearanżowanych wirusów.
Materiały i Metody
Klonowanie plazmidów
Plazmid pHW2000 (fig. 3A) otrzymano z plazmidu pHW12 (przykład 1). Wektor klonujący pHW2000 zawiera 225 pz ludzkiego promotora pol I i 33 pz mysiej sekwencji terminatorowej oddzielonych dwoma miejscami restrykcyjnymi BsmBl. Promotor pol I i element terminatorowy flankowane są przez skrócony wczesny promotor ludzkiego cytomegalowirusa (poczynając w przybliżeniu od 350 pz w kierunku 5' miejsca rozpoczęcia transkrypcji, jak opisano dla pcDNA3, Invitrogen, Carlsband, California) oraz przez sekwencję sygnału poliadenylacji genu kodującego bydlęcy hormon wzrostu. Osiem plazmidów zawierających cDNA wirusa A/WSN/33 (H1N1) (pHW181-PB2, pHW182-PB1, pHW183-PA, pHW184-HA, pHW185-NP, pHW186-NA, pHW187-M oraz pHW188-NS) zostało skonstruowanych poprzez wstawienie fragmentów Apal-Sall (wraz z cząsteczką wirusowego cDNA oraz sekwencjami promotora pol I i terminatora) plazmidów pPolI-WSN-PB2, pPolI-WSN-PB1, pPolI-WSN-PA, pPolI-WSN-NP, pPoll-WSN-HA, pPolI-WSN-NA (Neumann i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1999, 96:9345), pHW127-M oraz pHW128-NS (przykład 1) do wektorowego fragmentu Apal-Sall plazmidu pHW2000. Osiem plazmidów zawierających cDNA A/Teal/HK/W312/97 (H6N1) (pHW241-PB2, pHW242-PB1 pHW243-PA, pHW244-HA, pHW245-NP, pHW246-NA, pHW247-M oraz pHW248-NS) zostało skonstruowanych dzięki amplifikacji wirusowego RNA metodą łańcuchowej reakcji polimerazy o odwróconej transkrypcji (RT-PCR). Zastosowane w reakcji PCR startery zawierały segmentowo-specyficzne sekwencje na swych końcach 3' oraz sekwencje miejsc restrykcyjnych BsmBl lub Bsal na swych końcach 5'. Po strawieniu produktów PCR za pomocą BsmBl lub Bsal, fragmenty klonowano do wektora pHW2000 (fig. 3A). Poniżej przedstawiono sekwencje starterów zastosowanych do amplifikacji genomu A/teal/HK7W312/97 (H6N1). Startery pokazano w orientacji od lewej do prawej, co odpowiada końcom 5' oraz 3'. Nukleotydy specyficzne dla grypy typu A zostały podkreślone.
NS:
Bm-NS#1: TATTCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGGTG (SEQ ID NO:5)
Bm-NS#2: ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGGTGTTT (SEQ ID NO:6)
M:
Bm-M#1: TATTCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGTAG (SEQ ID NO:7)
Bm-M#2: ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGTAGTTTTTT (SEQ ID NO:8)
NA:
Bm-NA1-1: TATTCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGAGTTTAACATG (SEQ ID NO:9)
Bm-NA-1413R: ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGAGTTTTT (SEQ ID NO:10)
PL 205 955 B1
HA:
Bm-H6-1: TATTCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGGGAAAATG (SEQ ID NO: 11)
Bm-NS#2: ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGGTGTTT (SEQ ID NO:12) (zwraca się uwagę, że segmenty HA oraz NS mają identyczną sekwencję w tej części rejonu niekodującego)
NP:
Ba-NP-1: TATTGGTCTCAGGGAGCGAAAGCAGGGTA (SEQ ID NO:13)
Ba-NP1565R: ATATGGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGGTATT (SEQ ID NO:14)
PA:
Bm-PA1-1: TATTCGTCTCAGGGAGCGAAAGCAGGTACTGATCC (SEQ ID NO:15)
Bm-PA1-2231R: ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGTACTTTTT (SEQ ID NO:16)
PB1:
Bm-PB1a-1: TATTCGTCTCAGGGAGCGAAAGCAGGCAAACC (SEQ ID NO:17)
Bm-PB1-2341R: ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGCATTT (SEQ ID NO:18)
PB2:
Ba-PB2-1: TATTGGTCTCAGGGAGCGAAAGCAGGTCAATTATATTC (SEQ ID NO: 19)
Ba-PB2-2341R: ATATGGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGTCGTTTTT (SEQ ID NO:20)
Reakcję RT przeprowadzono z użyciem starteru 5' -AGCAAAAGCAGG-3' (Sek. o nr id.:21). W celu upewnienia się, że wirusowy cDNA otrzymany z reakcji amplifikacji RT-PCR i znajdujący się w plazmidach ekspresyjnych nie zawiera niepożądanych mutacji, został on poddany sekwencjonowaniu.
Wirusy i hodowla komórkowa
Wirusy grypy typu A/WSN/33 (H1N1) i A/Teal/HK/W312/97 (H6N1) rozprzestrzeniano w 10 dniowych jajach. Psie komórki nerkowe Madin-Darby (MDCK) utrzymywano w zmodyfikowanej pożywce Eagle (MEM) zawierającej 10% FBS. Ludzkie embrionalne komórki nerkowe 293T hodowano w pożywce Opti-MEM I (Life Technologies, Gaithersburg, Maryland) zawierającej 5% FBS. W eksperymencie trnasfekcyjnym wykorzystywano sześcio-studzienkowe płytki do hodowli tkankowej. Dzień przed transfekcją zlewające się komórki 293T i MDCK znajdujące się w 75 cm2 kolbach były poddawane działaniu trypsyny, a 10% każdej linii komórkowej mieszano w 18 ml OptiMEM I; 3 ml tak zawieszonych komórek umieszczano w jednej studzience na płytce sześciostudzienkowej. Wspólnie hodowane komórki MDCK i 293T (0,2-1 x 106 na studzienkę) wykorzystywano do eksperymentów transfekcyjnych. Do transfekcji komórek wykorzystano TransIT LT-1 (Panvera, Madison, Wisconsin) zgodnie z instrukcjami producenta. W skrócie, mieszano 2 μl TransIT LT-1 na 1 μg DNA, inkubowano w temperaturze pokojowej przez 45 min i dodawano do komórek. Sześć godzin później mieszaninę transfekcyjnego DNA zastępowano pożywką Opti-MEM I. Trzydzieści godzin po transfekcji do komórek dodawano 1 ml Opti-MEM I zawierającej trypsynę-TPCK; końcowe stężenie trypsyny-TPCK w komórkowym supernatancie wynosiło 0,5 μg/ml. Miano wirusa w supernatancie komórkowym oznaczano przez miareczkowanie supernatantu na komórkach MDCK.
Izolacja RNA i RT-PCR
Wirusowy RNA izolowano z cząsteczek wirusa za pomocą zestawu RNeasy-Kit (Qiagen, Valencia, California), którego używano zgodnie z instrukcją producenta. W celu charakterystyki zrekombinowanych wirusów grypy użyto zestawu Access RT-PCR (Promega, Madison, Wisconsin) zgodnie z zawartym protokołem. W eksperymentach RT-PCR wykorzystano następujące startery: Bm-NS#1 (5' TAT TCG TCT CAG GGA GCA AAA GCA GGG TG-3'; Sek. o nr.id.:5) i Bm-NS#2 (5' ATA TCG TCT CGT ATT AGT AGA AAC AAG GGT GTT TT-3'; Sek. o nr.id.:12). Eksperymenty RT-PCR przeprowadzano z użyciem maszyny PTC-200 DNA (MJ Research, Watertown, Massachusetts). Program amplifikacji rozpoczynał się 1 cyklem w 48°C przez 45 min i 1 cyklem 94°C przez 2 min. Po tych cyklach następowało 40 cykli w 94°C przez 20 sek, 52°C przez 30 sek, 72°C przez 40 sek; program kończył się jednym cyklem w 72°C przez 5 min. Produkty PCR analizowano za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym i sekwencjonowano ze starterem Bm-NS#1. W Center for Biotechnology w St.Jude Children's Research Hospital oznaczono sekwencję matrycy DNA za pomocą rodaminy lub gotowych zestawów do sekwencjnowania dRhodamine dye-terminator cycle z polimerazą FS AmpliTaqR DNA (Perkin-Elmer, Applied Biosystems, Inc. [PE/ABI], Foster City, CA) i syntetycznych oligonukleotydów. Próbki poddawane były elektroforezie, detekcji i analizie na sekwencerze PE/ABI modelu 373, modelu 373 Stretch lub modelu 377 DNA.
PL 205 955 B1
Wyniki
Opracowanie układu poll-polll celem wytwarzania A/WSN/33 (H1N1)
Wnioskowano, że ponieważ genom wirusa grypy typu A zawiera osiem segmentów, wstawienie wszystkich ośmiu cDNA wirusa grypy typu A pomiędzy promotor pol I i pol II, powinno spowodować transkrypcję ośmiu vRNA, wszystkich wirusowych w RNA, oraz syntezę wszystkich 10 białek wirusowych (fig. 1). Po złożeniu wszystkich wirusowych rybonukleoproteidów z białkami strukturalnymi, tworzenie infekcyjnego wirusa grypy typu A powinno być zatem ukończone (fig. 2).
Aby sprawdzić czy zakaźny wirus grypy typu A można odzyskać za pomocą układu dwukierunkowej transkrypcji cDNA, skonstruowano osiem plazmidów ekspresyjnych (pHW181-PB2, pHW182-PB1, pHW183-PA, pHW184-HA, pHW185-NP, pHW186-NA, pHW187-M oraz pHW188-NS) zawierających osiem cząsteczek cDNA pochodzących z A/WSN/33 (H1N1). Osiem plazmidów (po 1 μg każdego plazmidu) (tab. 1) poddano kotransfekcji do czasowo wspólnie prowadzonej hodowli komórek 293T-MDCK. Komórki pochodzące z obu linii komórkowych hodowano razem w jednej studzience hodowlanej na dzień przed transfekcją celem zapewnienia odpowiednich warunków dla uzyskania wysokiej skuteczności transfekcji DNA (komórek 293T) oraz replikacji (komórek MDCK) wirusa grypy typu A. Po upływie 48 i 72 godzin komórki MDCK wykazywały efekt cytopatogenny wywołany wirusem, takiego efektu nie obserwowano jednak, jeśli transfekowano siedmioma plazmidami z pominięciem konstruktu ekspresyjnego PB1 (tab. 1). Miano wirusa w supernatancie określano w różnym czasie, który upłynął od momentu transfekcji metodą miareczkowania komórek MDCK. Supernatant komórek otrzymany w 24 godziny po transfekcji zawierał 1 x 103 cząsteczek wirusa na ml; po upływie 72 godzin od transfekcji miano wynosiło 2 x 107 cząsteczek infekcyjnego wirusa na ml (tab. 1). Uzyskany wirus dwukrotnie poddano procedurze pasażowania na komórkach MDCK. Celem sprawdzenia czy uzyskany wirus był zaprojektowanym wirusem A/WSN, metodą RT-PCR wytworzono cDNA dla genu NS (fig. 4A, ścieżka 8). Pojawienie się dwóch fragmentów po trawieniu restrykcyjną endonukleazą Ncol (fig. 4B, ścieżka 8) oraz analiza sekwencji amplifikowanego fragmentu potwierdziła, że uzyskany wirus był rzeczywiście zaprojektowanym wirusem A/WSN. Rezultaty te są dowodem na to, że dzięki przeprowadzanej przez pol I i pol II syntezie vRNA i mRNA z ośmiu matryc uzyskuje się infekcyjny wirus grypy typu A.
T a b e l a 1
Zestawy plazmidów wykorzystywanych do pozyskiwania wirusów A/WSN/33 (H1N1) i A/Teal/HK/W312/97 (H6N1)
Segment A/WSN/33 (H1N1) A/Teal/HK/W312/97 (H6N1)
1 pHW181-PB2 pHW181-PB2 pHW241-PB2 pHW241-PB2
2 - pHW182-PB1 - pHVV242-PB1
3 pHW183-PA pHW183-PA pHW243-PA pHVV243-PA
4 pHW184-HA pHW184-HA pHW244-HA pHW244-HA
5 pHW185-NP pHW185-NP pHW245-NP pHW245-NP
6 pHW186-NA pHW186-NA pHW246-NA pHW246-NA
7 pHW187-M pHW187-M pHW247-M pHW247-M
8 pHW188-NS pHW188-NS pHW248-NS pHVV248-NS
Miano wirusa §
T = 24 godz. 0 1 x 103 0 0
T = 48 godz. 0 2 x 106* 0 2 x 103
T = 72 godz. 0 2 x 107* 0 2 x 105*
§ Liczby odpowiadają zakaźnym cząsteczkom wirusa przeliczonym na ml supernatantu stranfekowanych komórek, co okreś lano po upływie 24 godz., 48 godz. oraz 72 godz. od transfekcji.
* Obserwowano efekt cytopatologiczny we wspólnie hodowanych komórkach MDCK.
Pozyskiwanie wirusa A/Teal/HK/W312/97 (H6N1) za pomocą kotransfekcji ośmioma plazmidami
Wirus grypy typu A/WSN/33 (H1N1) początkowo pochodzący z pandemicznego szczepu ludzkiej grypy z roku 1918 (Goto i Kawaoka, Proc. Natl. Acad. Sci USA 1998,95:10224; Reid i wsp., Proc.
PL 205 955 B1
Natl.Acad.Sci USA 1999, 96:1651) pasażowany był w mózgu myszy i cechuje się dobrym przystosowaniem do wzrostu w hodowlach komórkowych. W celu określenia wydajności układu ośmiu plazmidów do wytwarzania ze sklonowanego cDNA wirusa, który nie jest jeszcze przystosowany do wzrostu w hodowli komórkowej, próbowano wytworzyć wirus A/Teal/HK/W312/97 (H6N1) jedynie ze sklonowanego cDNA. Wirus H6N1 został wyizolowany z martwej cyraneczki (ang. teal, gatunek kaczki) podczas wybuchu epidemii H5N1 w Hong Kongu w 1997. Analiza genetyczna tego wirusa ujawniła, że posiada on siedem segmentów o homologii nukleotydowej większej niż 97% w stosunku do patogennego szczepu wirusa H5N1. Z zakażonego płynu omoczniowego wyekstrahowano RNA, a zamplifikowane za pomocą RT-PCR cDNA wstawiono do pHW200; wstawienie to doprowadziło do powstania ośmiu plazmidów ekspresyjnych (fig. 3). Siedemdziesiąt dwie godziny po transfekcji plazmidami pHW241-PB2, pHW242-PB1, pHW243-PA, pHW244-HA, pHW245-NP, pHW246-NA, pHW247-M oraz pHW248-NS (po 1 μg każdego) wspólnie hodowanych komórek 293T-MDCK, w komórkach MDCK zaobserwowano efekt cytopatologiczny indukowany obecnością wirusa (tab. 1). Wydajność wirusa wynosiła 2 x 105 zakaźnych wirusów na ml supernatantu ze stransfekowanych komórek. Jak to zostało przedstawione na fig. 4 (A i B, linia 2), identyczność odzyskanego wirusa sprawdzano poprzez weryfikację charakterystyki segmentu NS. Wyniki te pokazują, że omawiany układ plazmidowy wymaga klonowania jedynie ośmiu cząsteczek cDNA do jednego wektora plazmidowego oraz, że transfekcja ośmioma plazmidami ekspresyjnymi pozwala na pozyskanie wirusa grypy typu A o antygenowości wirusa nie przystosowanego jeszcze do wzrostu w komórkach ssaczych.
Odzyskiwanie przearaniowanych wirusów grypy typu A
Testowano możliwość wykorzystania układu ośmio-plazmidowego do celu wytwarzania wirusów przearanżowanych. Ponieważ ten układ transfekcji DNA nie wymaga żadnego układu selekcji, odzyskanie wyselekcjonowanych wirusów powinno być osiągnięte za pomocą odpowiednich kombinacji plazmidów ekspresyjnych stosowanych w reakcjach transfekcji. Siedem plazmidów ekspresyjnych zawierających cDNA wirusa A/Tael/HK/W312/97 (H6N1) podlegało kotransfekcji z jednym plazmidem ekspresyjnym zawierającym cDNA wirusa A/WSN/33 (H1N1) (tab. 2). Uzyskano wysoką wirusową wydajność dla przearanżowanych wirusów zawierających siedem segmentów wirusa cyraneczki oraz segment M bądź NS wirusa WSN. Mniejszą wydajność wirusową uzyskano dla przearanżowanych wirusów NA i HA (tab. 2). Ponieważ pojedyncze przearanżowane wirusy odzyskiwano za pomocą układu ośmio-plazmidowego, kolejnym etapem było określenie czy wirus odzyskać można z wielu segmentów pochodzących z jednego wirusa. Zatem, cztery plazmidy ekspresyjne zawierające cDNA genów kompleksu RNP wirusa H6N1 (pHW241-PB2, pHW242-PB1, pHW243-PA oraz pHW245-NP) transfekowano razem z plazmidami pHW184-HA, pHW186-NA, pHW187-M i pHW188-NS, zawierającymi cDNA wirusa WSN (tab. 2). Na ml supernatantu komórkowego odzyskano 4 x 106 wirusów. Jak to pokazano na fig. 4 (ścieżka 10), zamplifikowany segment NS poczwórnego przearanżowanego wirusa został strawiony Ncol; w ten sposób segment NS pozyskano z wirusa WSN. Wyniki te pokazują, że ośmioplazmidowy układ transfekcyjny pozwala na odzyskiwanie pojedynczych i poczwórnych przearanżowanych wirusów.
T a b e l a 2
Wytwarzanie przearanżowanych wirusów grypy typu A pomiędzy A/Teal/HK/W312 (H6N1) i A/WSN/33 (H1N1) za pomocą kotransfekcji ośmioma plazmidami Miano wirusa
Segment HA NA M NS HA-NA-M-NS
1 2 3 4 5 6
1 pHW241-PB2 pHW241-PB2 pHW241-PB2 pHW241-PB2 pHW241-PB2
2 pHW242-PB1 pHW242-PB1 pHW242-PB1 pHW242-PB1 pHW242-PB1
3 pHW243-PA pHW243-PA pHW243-PA pHW243-PA pHW243-PA
5 pHW245-NP pHW245-NP pHW245-NP pHVV245-NP pHW245-NP
4 pHW184-HA pHW244-HA pHW244-HA pHW244-HA pHW184-HA
6 pHW246-NA pHW186-NA pHW245-NA pHVV246-NA pHW186-NA
PL 205 955 B1 cd. tabeli
1 2 3 4 5 6
7 pHW247-M pHW247-M pHW187-M pHW247-M pHW187-M
8 pHW248-NS PHW248-NS pHW248-NS pHW188-NS pHW188-NS
Miano wirusa S 2 x 102 2 x 103 2 x 105 2 x 107 4 x 106
• plazmidy zawierające cDNA wirusa A/WSN/33 (H1N1) zostały wyróżnione tłustym drukiem § Liczby przedstawiają zakaźne cząsteczki wirusa przeliczone na 1 ml supernatantu stransfekowanych komórek, co określono po upływie 72 godz. od transfekcji.
Dyskusja
Możliwość odzyskania wirusa grypy typu A po transfekcji ośmioma plazmidami ekspresyjnymi zawierającymi cDNA wirusa A/Teal/HK/W312 (H6N1) lub A/WSN/33 (H1N1), dowodzi, że układ transkrypcyjny pol I-pol II zapewnia wystarczającą ilość vRNA oraz białek wirusowych potrzebnych do tworzenia zakaźnego wirusa grypy typu A. Zsyntetyzowano dwa rodzaje mRNA różniące się swoimi rejonami niekodującymi (fig. 1). mRNA kodujący wszystkie białka wirusowe jest bezpośrednio transkrybowane przez pol II. Oprócz rejonów niekodujących (NCR) sekwencji wirusa grypy, takie cząsteczki mRNA zawierają sekwencje pochodzące z rejonów promotora pol I i mysiego terminatora. Ważne jest, że opracowany układ ekspresyjny pol I-pol II zawierał jedynie 33 pz mysiej sekwencji terminatorowej. Wcześniejsze badania z użyciem genów reporterowych takich, jak acetylaza chloramfenikolu (CAT) i zielone fluorescencyjne białko (GFP) pokazały, że sekwencje znajdujące się w 174 pz rejonie terminatorowym obniżają ekspresję białka, w której pośredniczy pol II (Hoffmann, E., Ph.D. Thesis 1997, Justus Liebig University, Giessen, Germany). Drugi rodzaj mRNA wytwarzany jest po rozpoczęciu procesu wirusowej replikacji i transkrypcji (fig. 2). Ten mRNA syntetyzowany jest przez białka wirusowej polimerazy i zawiera strukturę czapeczki na 5' końcu pochodzącą z komórkowych RNA, a pobraną przy pomocy mechanizmu chwytania czapeczki przez niekodujące sekwencje wirusa grypy. Białka strukturalne pochodzące z obu mRNA wiążą się z kompleksami RNP w celu tworzenia nowych cząsteczek wirusowych. Po procesie pączkowania transfekcyjnych wirusów, wytwarzane cząsteczki wirusowe mogą ulec replikacji w komórkach 293T i w wspólnie z nimi hodowanych komórkach MDCK.
W przeciwieństwie do sposobów dyskutowanych w Tle Wynalazku, powyżej, w metodzie natychmiastowego wynalazku stosuje się osiem cDNA znajdujących się w ośmiu plazmidach zawierających 225 pz sekwencji promotora pol I i 33 pz sekwencji terminatorowej. W układzie pol I-pol II ekspresja wszystkich 10 białek wirusowych zachodzi ze skróconego wczesnego promotora ludzkiego cytomegalowirusa. Fakt, że ekspresja wszystkich strukturalnych białek w układzie 17-plazmidowym (Neumann i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1999, 96:9345) oraz w układzie 8-plazmidowym (niniejsze badania) prowadziła do wyższej wydajności uzyskiwania wirusa niż w wyniku kotransfekcji plazmidów eksprymujących zespół białek RNP (Neumann i wsp., jw.; Fodor i wsp., J. Virol. 1999, 73:9679), stanowi poparcie koncepcji, zakładającej że wytwarzanie infekcyjnego wirusa grypy typu A wzmagane jest poprzez dostarczanie białek HA, NA, M1, M2 oraz NS2 wkrótce po przeprowadzeniu procesu transfekcji.
Cykl replikacji wirusa obejmuje kompleksowe oddziaływania białek wirusa między sobą oraz z czynnikami komórkowymi (Ludwig i wsp., Virol. Immunol. 1999, 12:175). Zatem, w celu wytworzenia infekcyjnego wirusa, uruchamiana przez plazmid synteza wirusowych cząsteczek powinna dostarczać wirusowych białek w stężeniu optymalnym dla zapoczątkowania cyklu replikacji i tworzenia cząsteczek wiruso-podobnych. Mimo, że dowiedziono wydajności układu ośmio-plazmidowego, dalsze zwiększenie produkcji wirusa jest prawdopodobnie możliwe. Wykazano, że stosunek transfekowanych plazmidów eksprymujących zespół białek RNP względem ekspresji białka M1 ma wpływ na aktywność transkryptazy (Pleschka i wsp., J. Virol. 1996, 70:4188; Perez i Donis, Virology 1998, 249:52). Wydajność wytwarzania cząsteczek wiruso-podobnych zależy również od stężenia wirusowych białek strukturalnych (Mena i wsp., J. Virol. 1996, 70:5016; Gomez-Puertas i wsp., J. Gen. Virol., 1999, 80:1635; Neumann i wsp., J. Virol. 2000, 74:547). Wydajność wytwarzania infekcyjnego wirusa za pomocą układu pol I-pol II może zatem być w przyszłości zwiększana poprzez stosowanie zmiennych stężeń plazmidu używanego do reakcji transfekcji, bądź poprzez wykorzystywanie plazmidów ekspresyjnych o różnych promotorach pol II. Ponieważ skuteczność procesu splicingu, w którym uczestniczą czynniki komórkowe, wpływa na zdolność wirusa grypy typu A do replikacji (Lau i Scholtissek, Virology 1995, 212:225), wykorzystanie linii komórkowych innych niż 293T może zwiększyć wirusową wydajność w przypadku pewnych szczepów grypy typu A. Wysoka wirusowa wydajność poczwórnej rearanżacji (tab. 2) jest
PL 205 955 B1 zgodna z odkryciem, że szybka replikacja wirusa A/WSN/33 (H1N1) w hodowanych komórkach przebiega za pośrednictwem segmentów HA, NA, M (Goto i Kawaoka, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1998, 95:10224; Schulman i Palese, J.Virol. 1997, 24:170; Yesuda i wsp., J.Virol. 1994, 68:8141).
Wytwarzanie żywotnych przearanżowanych wirusów (tab. 2) pomiędzy ptasim wirusem H6N1 i ludzkim wirusem H1N1 wykazuje, że wirus H6N1 może uzyskać segmenty genowe z daleko spokrewnionego wirusa. Analiza genetyczna sugerowała, że patogenne wirusy H5N1 powstały przez przearanżowanie (Xu i wsp., Virology 1999, 261:15). Segmenty genowe podobne do tych pochodzących z H5N1 znaleziono w podtypach H6N1 i H9N2 (Guan i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1999, 96:9363), odkrycie wykazuje, że wirusy te mogą stanowić prekursory patogennych wirusów H5N1. Zjawisko rearanżacji mogące wytworzyć nowe zakaźne wirusy grypy, może z dużym prawdopodobieństwem wystąpić w przyszłości. Jednakże możliwość wytworzenia i manipulacji tych wirusów za pomocą uproszczonego sposobu rozwiniętego w tym badaniu, pomoże badaczom lepiej zrozumieć biologiczne właściwości tych nowych wirusów i wytworzyć wydajne szczepionki do ochrony populacji przeciw nim. Czas przypadający na okres pomiędzy pojawieniem się nowego patogennego szczepu a przygotowaniem szczepionki, stanowi decydujący czynnik w skuteczności programu szczepień. Zdolność do wytworzenia wirusów za pomocą klonowania jedynie ośmiu plazmidów zmniejsza czas potrzebny do wytworzenia potencjalnych szczepionkowych kandydatów i ulepsza istniejące układy odwrotnej genetyki poprzez uproszczenie tworzenia wirusa i obniżenia całkowitych kosztów produkcji szczepionki.
Koncepcję wstawiania wirusowego cDNA pomiędzy promotor pol I a promotor pol II w komórkach eukariotycznych do celu uzyskania wirusa, można także zastosować do wytwarzania innych wirusów należących do rodziny Orthomyxoviridae. Strategia pozyskania wirusa grypy typu B wymagałaby skonstruowania i przeprowadzenia kotransfekcji ośmiu plazmidów; wirusa grypy typu C - siedmiu; zaś Thogotowirusa - sześciu. Metoda transkrypcji in vivo mRNA posiadającego strukturę czapeczki na końcu 5', jak również vRNA z tej samej matrycy cDNA może także uprościć stosowanie układów opartych na plazmidach u innych wirusów RNA, czy nawet ułatwić opracowanie układów pol I-pol II dla wirusów należących do innych rodzin (np., Arenaviridae, Sunyaviridae).
P r z y k ł a d 3
Stosowanie układu RNA pol I/pol II do celów wytwarzania wirusa grypy typu B całkowicie ze sklonowanego cDNA
Zarówno wirus grypy typu A, jak i B zawiera osiem segmentów jednoniciowego RNA o ujemnej polaryzacji (patrz. Lamb i Krug, „Orthomyxoviridae: The viruses and their replication”; w Fields (Ed.), Virology; p1353-1395). W odróżnieniu od wirusa grypy typu A, osiem segmentów wirusa grypy typu B koduje 11 białek. Trzy największe geny kodują składowe polimerazy RNA - PB1, PB2 oraz PA; segment 4 koduje hemaglutyninę. Segment 5 koduje nukleoproteinę, główny składnik strukturalny związany z RNA wirusa, segment 6 koduje neuraminidazę (NA) oraz białko NB. Translacja obu białek, NB oraz NA, zachodzi z nakładających się ramek odczytu dwucistronowego mRNA. Segment 7 wirusa grypy typu B również koduje dwa białka: BM1 i BM2. Najmniejszy segmentu koduje dwa produkty: NS1, którego translacja zachodzi z całej długości cząsteczki RNA oraz NS2, dla którego matrycą do translacji jest cząsteczka mRNA powstała w wyniku splicingu.
Konstruowanie plazmidów ekspresyjnych zawierających cDNA wirusa grypy typu B obejmuje tę samą strategię jak ta, którą opisano dla celów wytwarzania wirusa grypy typu A A/teal/HK/W312/97 (H6N1). Najpierw, z cząsteczek wirusa uzyskanych z zakażonego płynu omoczniowego, np., B/Lee/40, izolowany jest RNA. Na podstawie konserwowanych sekwencji rejonu niekodującego przygotowuje się startery do reakcji RT-PCR i syntezy cDNA. Na swych końcach 5' startery te posiadają sekwencje rozpoznawane przez restrykcyjne endonukleazy Ssml oraz Ssal. Trawienie produktów PCR enzymami SsmI lub Ssal umożliwia wstawienie ich do wektora klonującego pHW2000 (bądź pHW11), poddanego procesowi linearyzacji za pomocą SsmBl. Aby upewnić się, że cDNA w plazmidach nie zawiera niepożądanych mutacji spowodowanych błędami polimerazy popełnionymi podczas reakcji PCR, konstrukty należy poddać sekwencjonowaniu.
Wytwarzanie zakaźnego wirusa grypy typu B zachodzi poprzez kotransfekcję wspólnie hodowanych komórek 293T-MDCK (bądź komórek COS-1-MDCK) i dodanie trypsyny. Supernatanty pochodzące ze stransfekowanych komórek są następnie przenoszone na nowe komórki MDCK. Uzyskane miano wirusa można ustalić za pomocą standardowych metod np. oznaczenia HA oraz testu łysinkowego. Przeprowadzony z użyciem starterów, specyficznych względem każdego segmentu genu, RT-PCR
PL 205 955 B1 pozwala na amplifikację RNA pochodzącego ze zrekombinowanego wirusa grypy typu B. Sekwencjonowanie otrzymanych produktów potwierdza, że wytworzony wirus rzeczywiście jest pożądanym wirusem grypy typu B.
P r z y k ł a d 4
Ośmioplazmidowy układ do odzyskiwania głównego szczepu wirusa grypy typu A
W celu określenia handlowej użyteczności układu opartego na plazmidzie do produkcji szczepionek, stworzono główny szczep A/PR/8/34 (H1N1) - wykorzystywany obecnie do produkcji szczepionek z wirusem inaktywowanym, w całości ze sklonowanego cDNA, jak zostało to opisane w przykładzie 2. Wydajność produkcji wirusa ustalona za pomocą oznaczenia HA po pasażowaniu zrekombinowanego wirusa do jaj, była tak wysoka jak wydajność produkcji rodzicielskiego wirusa typu dzikiego. Wyniki te dowodzą, że wytworzony zrekombinowany wirus ma takie same zdolności wzrostu jak wirus rodzicielski hodowany w jaju i wykazują że ośmiopłazmidowy metoda transfekcji może usprawnić aktualnie wykorzystywane metody produkcji wirusów stosowanych w szczepionkach.
Materiały i Metody
Wirusy oraz transfekcja
Wirus grypy A/PR/8/34 (H1N1) otrzymano ze szpitala St.Jude Children's Research Hospital i rozmnożono w 10 dniowych zapłodnionych jajach kurzych. Komórki Madin-Darby z nerek psa (MDCK) trzymano w pożywce MEM zawierającej 10% FBS. Ludzkie embrionalne komórki nerkowe 293T oraz komórki Vero hodowano w pożywce Opti-MEM (Life Technologies, Gaithersburg, MD) zawierającej 5% płodowej surowicy bydlęcej (FBS). Do transfekcji wykorzystywano sześcio-studzienkowe płytki do hodowli tkankowej. W doświadczeniu tym użyto wspólnie hodowanych komórek MDCK i 293T (0,21 x 106 każdego rodzaju komórek na studzienkę). W celu transfekcji komórek zastosowano TransIT-LT-1 (Panvera, Madison, WI) zgodnie z instrukcją producenta. W skrócie, mieszano 2 μl TransIT LT-1 na 1 μg DNA, inkubowano w temperaturze pokojowej przez 45 min i dodawano do komórek. Sześć godzin później mieszanina transfekcyjna DNA zastępowana była przez Opti-MEM I. Dwadzieścia cztery godziny po transfekcji do komórek dodawano 1 ml Opti-MEM I zawierającej trypsynę-TPCK; końcowe stężenie trypsyny-TPCK w supernatancie komórkowym wynosiło 0,5 μg/ml. Za pomocą testu łysinkowego określano miano wirusa przez pasażowanie supernatantu komórkowego na komórki MDCK.
RT-PCR i konstruowanie plazmidów
Za pomocą zestawu Qiagen RNeasy wirusowe RNA ekstrahowano z 200 wirusa zawierającego płyn omoczniowy pochodzący z zapłodnionego jaja. Do amplifikacji każdego wirusowego segmentu genowego wykorzystano dwuetapowy RT-PCR. W skrócie, RNA był transkrybowany do cDNA przy użyciu odwrotnej transkryptazy AMV (Roche Diagnostics, Germany) zgodnie z dostarczonym protokołem, po czym amplifikowano cDNA za pomocą układu PCR Expand High Fidelity (Roche Diagnostics, Germany). Program amplifikacyjny rozpoczynał się 1 cyklem w 94°C trwającym 2 min; po czym następowało 30 cykli w 94°C przez 20 sek, w 54°C przez 30 sek, 72°C przez 3 min; program kończył się jednym cyklem w 72°C trwającym 5 min. Zastosowane startery zawierały sekwencję dla enzymu Bsal bądź BsmBl, aby możliwe było precyzyjne wstawienie strawionych fragmentów PCR do wektora klonującego pHW2000 (patrz przykład 2).
W celu klonowania genów HA, NP, NA, M, NS, fragmenty PCR trawiono BsmBl lub Bsal i ligowano z wektorem klonującym pHW2000. W celu klonowania genów P, dwa (PB2, PA) lub trzy (PB1) fragmenty były izolowane, trawione i ligowane z pHW2000-BsmBl. Aby upewnić się, że geny nie zawierają niepożądanych mutacji, fragmenty otrzymane za pomocą metody PCR były sekwencjonowane. Osiem plazmidów zawierających pełnej długości cDNA wirusa A/PR/8/34 (H1N1) oznaczono jako pHW191-PB2, pHW192-PB1, pHW193-PA, pHW194-HA, pHW195-NP, pHW196-NA, pHW197-M oraz pHW198-NS. W Center of Biotechnology szpitala St.Jude Children's Research Hospital określono sekwencję matrycowego DNA za pomocą gotowych zestawów reakcyjnych do cykli sekwencyjnych z barwnikiem rodaminowym bądź dRodaminowym znakującym terminator (rhodamine or dRhodamine dye-terminator cycle sequencing ready reaction kits) i FS polimerazy DNA AmpliTaq® (Perkin-Elmer, Applied Biosystems, Inc. [PE/AB10, Foster City, CA) oraz syntetycznych oligonukleotyów. Próbki poddawano detekcji elektroforetycznej oraz analizie na sekwencerach DNA PE/ABI model 373, model 373 Stretch lub model 377.
Wyniki
W celu umożliwienia syntezy wirusopodobnych cząsteczek vRNA oraz mRNA stworzono układ ekspresyjny poll-polll RNA (patrz przykład 2). W układzie tym wirusowy cDNA ulega wstawieniu pomiędzy sekwencje promotora i terminatora ludzkiej polimerazy RNA I (polI). Ta całkowita jednostka
PL 205 955 B1 transkrypcyjna polI flankowana jest przez promotor polimerazy RNA II (polII) oraz miejsce poliA. Orientacja dwóch jednostek transkrypcyjnych pozwala na syntezę ujemnego wirusowego RNA oraz dodatniego mRNA na podstawie jednej matrycy wirusowego cDNA. Układ poll-polll rozpoczyna się inicjacją transkrypcji dwóch komórkowych polimeraz z ich własnych promotorów, przypuszczalnie w różnych przedziałach jądrowych (patrz fig. 1). Transfekcja ośmiu plazmidów do komórek 293T powoduje wzajemne oddziaływanie wszystkich cząsteczek pochodzących z komórkowego i wirusowego mechanizmu transkrypcji i translacji, prowadząc ostatecznie do powstania zakaźnego wirusa grypy typu A. Udowodniono, że układ ten jest wysoce wydajny w tworzeniu wirusów grypy typu A/WSN/33 (H1N1) oraz A/Teal/HK/W312/97 (H6N1) (przykład 2).
Ponieważ aktualnie głównym szczepem do produkcji szczepionek z inaktywowanym wirusem grypy jest A/PR/8/34 (H1N1), podjęto próbę wytworzenia tego wirusa całkowicie ze sklonowanego cDNA. Cząsteczki cDNA reprezentujące osiem segmentów RNA wstawiano do wektora pHW2000. Otrzymane plazmidy (pHW191-PB2, pHW192-PB1, pHW193-PA, pHW194-HA, pHW195-NP, pHW196-NA, pHW197-M oraz pHW198-NS) transfekowano do wspólnie hodowanych komórek 293T-MDCK lub komórek Vero-MDCK. Siedemdziesiąt dwie godziny po transfekcji ustalano miano wirusa za pomocą miareczkowania komórek MDCK. Supernatant wspólnie hodowanych komórek Vero-MDCK zawierał 1 x 104 pfu, zaś supernatant wspólnie hodowanych komórek 293T-MDCK zawierał 2 x 104 pfu na ml. Wyższa wydajność w komórkach 293T-MDCK jest prawdopodobnie spowodowana wyższą wydajnością transfekcji komórek 293T w porównaniu z komórkami Vero. Wyniki te wykazują, że układ ośmioplazmidowy umożliwia wytwarzanie wirusa A/PR/8/34 (H1N1) ze sklonowanego cDNA.
Aby porównać wzrost pomiędzy dzikim typem wirusa i wytworzonym wirusem zrekombinowanym, zaszczepiono nimi zapłodnione jaja kurze. Czterdzieści osiem godzin po infekcji zbierano płyn omoczniowy. Wydajność wirusową określano za pomocą oznaczania-HA. Pomimo, że miano-HA różniło się pomiędzy poszczególnymi jajami, odkryto, że oba wirusy posiadają miano HA wahające się pomiędzy 5120 i 10240 jednostek hemaglutynacyjnych, co wskazuje na to, że oba wirusy są izolatami o wysokiej wydajności. Zatem, zrekombinowany wirus, który został wytworzony metodą transfekcji DNA ma taki sam silny hodowlany fenotyp jak izolat rodzicielski.
Dyskusja
Układ ośmiu plazmidów według wynalazku umożliwia pominięcie stosowania oddzielnych plazmidów do ekspresji białka (patrz Podstawa Wynalazku), przez co uproszczeniu ulega metoda wytwarzania wirusa grypy typu A całkowicie ze sklonowanego cDNA. Produkcja szczepionek obejmuje wytwarzanie wirusa, który jest następnie wykorzystywany do uzyskiwania wirusów szczepionkowych w jajach kurzych bądź w hodowli komórkowej. Skuteczność programu szczepień zależy od wyselekcjonowania takiego podtypu, który łączy w sobie cechy patogennych szczepów krążących w populacji, dzięki czemu stymuluje powstawanie wysoce specyficznego miana przeciwciał wśród szczepionej populacji, co daje w wyniku skuteczną ochronę. Sześć głównych plazmidów szczepu A/PR/8/34 (pHW191-PB2, pHW192-PB1, pHW193-PA, pHW195-NP, pHW197-M oraz pHW198-NS) kodujących wewnętrzne geny wirusa grypy typu A może być teraz stosowanych w procesie kotransfekcji wraz z plazmidami kodującymi glikoproteiny HA i NA obecnie krążącego szczepu grypy. Możliwość manipulowania każdym segmentem genu pozwoli także na oszacowanie, który(e) segment(y) genu(ów) mają istotne znaczenie dla wysokiej wydajności wzrostu przearanżowanych wirusów tak w jajach kurzych, jak i hodowli komórkowej.
Fakt, że udało się nam stworzyć dwa laboratoryjne szczepy wirusa grypy (A/WSN/33 (H1N1) i A/PR/8/34 (H1N1)) oraz jeden wyizolowany (A/Teal/HK/W312/97 (H6N1)) poprzez kotransfekcję zaledwie ośmiu plazmidów, świadczy o tym, że istnieje możliwość stosowania tego układu do pozyskiwania żywych, osłabionych szczepionek wirusa grypy. Szczepionki żywego, osłabionego wirusa grypy podawane donosowo wzbudzają miejscową, śluzowkową komórkową bądź humoralną odpowiedź immunologiczną. Adaptowane do zimna (ca) przearanżowane wirusy (CR) zawierające sześć wewnętrznych genów żywego, osłabionego wirusa grypy A/Ann Arbor/6/60 (H2N2) oraz hemaglutyninę (HA) i neuraminidazę (NA) współcześnie występujących dzikich typów wirusa grypy, wydają się być osłabione w sposób niezawodny. Wykazano, że szczepionka ta jest skuteczna u dzieci i osób dorosłych w młodym wieku (Keitel & Piedra w Textbook of Influenza, Nicholson i wsp., wyd. 1998, 373-390). Jednakże może się ona okazać zbyt osłabiona, by zdołała wzbudzić pełną odpowiedź immunologiczną u osób w podeszłym wieku, które stanowią największą grupę spośród 20 000 do 40 000 osób umierających rocznie w USA z powodu zakażenia wirusem grypy. Nadal nie zdołano dokładnie określić udziału każdego spośród segmentów genów w powstawaniu fenotypu osłabionego wirusa (Keitel
PL 205 955 B1 & Piedra, jw.). Informacja ta może być uzyskana jedynie drogą sekwencyjnego wprowadzania do wirusa określonych, specyficznych mutacji osłabiających. Jako, że szczegółowe analizy wymagają przebadania ogromnej liczby wirusów poddanych manipulacjom, skontruowanie i transfekcja jedynie ośmiu plazmidów jest uproszczeniem tego zadania, a zarazem zmniejsza ilość czasu oraz koszty niezbędne do osiągnięcia celu tego przedsięwzięcia.
P r z y k ł a d 5
Wykorzystanie jednokierunkowego układu transkrypcyjnego polimeraza I-polimeraza II do wytwarzania wirusa grypy typu A za pomocą ośmiu plazmidów
Poprzednie przykłady opisują układ wytwarzania wirusa grypy typu A poprzez kotransfekcję zaledwie ośmiu plazmidów, z których przebiega ekspresja ujemnego vRNA oraz dodatniego mRNA (praca ta została opublikowana; patrz. Hoffmann i wsp., 2000, Proceedings of National Academy of Sciences, USA 97, 6108-6113). Przykład ten opisuje ustalenie odmiennego układu transkrypcyjnego do ekspresji wirusopodobnych cząsteczek RNA, który umożliwia wewnątrzkomórkową syntezę, z jednej matrycy, pozbawionych czapeczki, dodatnich cząsteczek cRNA oraz mRNA posiadającego strukturę czapeczki na końcu 5'. Dzięki kotransfekcji ośmiu plazmidów posiadających podwójny układ promotorów RNA pol I-pol II zawierających cDNA wirusa A/WSN/33 (H1N1) otrzymano zakaźny wirus grypy typu A, choć z mniejszą wydajnością niż w przypadku układu dwukierunkowego. Nasze osiągnięcie w postaci wyprodukowania bądź vRNA i mRNA bądź cRNA i mRNA wewnątrzkomórkowo za pomocą minimalnego zestawu plazmidów, jest pomocne do celów ustalania czy optymalizacji układów odwrotnej genetyki pozostałych wirusów RNA.
Wyniki, o których mowa w tym przykładzie opublikowano (patrz. Hoffmann i Webster, J.Gen.Virol. 2000, 81:2843).
Do wytworzenia wirusa z ujemną nicią RNA, jako matrycą może służyć zarówno ujemne vRNA jak i dodatnie cRNA. Aby zmniejszyć liczbę plazmidów potrzebnych do uzyskania wirusa, uważano, że możliwym jest wytwarzanie cRNA i mRNA z jednej matrycy przy pomocy komórkowej polimerazy RNA I i polimerazy RNA II. Zatem starano się wytworzyć dwukierunkowy układ transkrypcyjny poll-polll (fig. 5).
Wirusowe cDNA wstawiane jest w pozytywnej orientacji pomiędzy promotor polimerazy RNA I a sekwencję terminatorową. Całkowita jednostka transkrypcyjna pol I ulega wstawieniu w pozytywnej orientacji pomiędzy promotor pol II i miejsce poliadenylacji (fig. 5). Spodziewano się, że nastąpi synteza dwóch rodzajów pozytywnego RNA w przeciwieństwie do dwukierunkowego układu transkrypcyjnego wytwarzającego negatywny vRNA i pozytywny mRNA (fig. 1). W nukleopazmie z promotora pol II powinna zachodzić transkrypcja mRNA ze strukturą czapeczki na 5' końcu. Transkrypt ten powinien ulegać translacji do białka. Spodziewano się, że w jąderku, komórkowa pol I będzie syntetyzować całej długości pozytywne cRNA wirusa grypy z grupą trzyfosforanową na 5' końcu (fig.5). Skonstruowano wektor klonujący pHW11, który może być zastosowany do wstawienia dowolnego fragmentu cDNA (fig. 6). Plazmid ten zawiera promotor pol II (wczesny promotor ludzkiego cytomegalowirusa) oraz ludzki promotor pol I, które położone są w kierunku 5' w stosunku do sekwencji terminatorowej pol I i miejsca poli A.
Skonstruowano osiem plazmidów, aby sprawdzić czy możliwe jest wytwarzanie zakaźnego wirusa grypy typu A przez syntezę cRNA i mRNA z pojedynczej matrycy. Plazmidy pHW171-PB2, pHW172-PB1, pHW173-PA, pHW174-HA, pHW175-NP, pHW176-NA, pHW177-M oraz pHW178-NA zawierają cDNA reprezentujące osiem segmentów genowych wirusa grypy typu A szczepu A/WSN/33 (H1N1). Wszystkie cDNA znajdują się w pozytywnej orientacji względem promotorów polI i polII. Osiem plazmidów (1 ąg każdego plazmidu) transfekowano do komórek 293T lub COS-1 hodowanych razem lub bez komórek MDCK, jak to zostało opisane w przykładzie 2.
Wydajność wirusowa w supernatancie stransfekowanych komórek w różnych punktach czasowych, określana była za pomocą testu łysinkowego po przeniesieniu wirusa na komórki MDCK. Czterdzieści osiem godzin po transfekcji wyprodukowanych zostało 2-5 x 103 zakaźnych wirionów (tab. 3). Siedemdziesiąt dwie godziny po transfekcji supernatant zawierał 4 x 104 pfu/ml w przypadku transfekcji komórek 293T oraz 2 x 104 pfu/ml w przypadku transfekcji komórek COS-1. Wydajność wirusową po 72 godz. można zwiększyć hodując komórki MDCK wspólnie z komórkami 293T lub COS-1. (tab. 3).
Wytwarzanie wirusa dowodzi, że po transfekcji ośmioma plazmidami, pol RNA I wytwarza osiem pozytywnych cRNA nie posiadających struktury czapeczki. Cztery białka wirusowej polimerazy, które uległy translacji z transkryptów powstałych przy pomocy komórkowej pol RNA II, łączą się z nagim wiruso-podobnym cRNA w celu wytworzenia cRNP. Podjednostka PB1 polimerazy odgrywa ważną rolę w rozpoznawaniu struktury terminalnej i łączeniu wiruso-podobnych cRNA (Gonzales & Ortin
PL 205 955 B1
EMBO J. 1999, 18:3767; Gonzales & Ortin, J.Virol. 1999, 73:631 i 1999b; Li i wsp., EMBO J. 1998, 17:5844). Oddziaływanie z innymi białkami polimerazy rozpoczyna cykl replikacyjno-transkrypcyjny, w wyniku którego następuje synteza vRNP oraz wirusowych mRNA (Toyoda i wsp., J.Gen.Virol. 1996, 77:2149, Gonzales i wsp., Nucl.Acids Res. 1996, 29:4456). W układzie transkrypcyjnym poll-polll syntetyzowane są dwa różne rodzaje mRNA. Jeden jest bezpośrednio transkrybowany z plazmidowego DNA za pomocą pol RNA II i zawiera 225 pz sekwencji promotorowej pol I na 5' końcu oraz sekwencję terminatorową polI na 3' końcu. Drugi rodzaj mRNA syntetyzowany jest za pomocą wirusowego kompleksu białek polimerazy, który wykorzystuje vRNA jako matrycę. Struktura czapeczki tego mRNA pobierana jest za pomocą mechanizmu łapania czapeczki, gdzie podjednostka PB2 polimerazy pobiera czapeczkę z komórkowych RNA (Ulmanen i wsp., Proc.Natl.Acad.Sci. USA 1981, 21:3607). Pomimo, że oba rodzaje mRNA różnią się swoimi 5' i 3' rejonami niekodującymi, zawierają takie same otwarte ramki odczytu dla wszystkich białek wirusowych. Powstałe w wyniku translacji białka strukturalne łączą się razem z vRNP w celu tworzenia zakaźnego wirusa grypy typu A.
T a b e l a 3
Zestaw plazmidów wykorzystywanych do produkcji szczepu A/WSN/33 (H1N1) Plazmidy*
Nr segmentu genowego Układ jednokierunkowy Układ dwukierunkowy
1 PHW171- PB2 pHW171- PB2 pHW171- PB2 pHW171- -PB2 pHW181- PB2 pHW181- PB2 pHW181- PB2 pHW181- PB2
2 PHW172- pHW172- pHW172- pHW172- pHW182- pHW182- pHW182- pHW182-
PB1 PB1 -PB1 -PB1 PB1 -PB1 PB1 PB1
3 PHW173- pHW173- pHW173- pHW173- pHW183- pHW183- pHW183- pHW183-
-PA -PA -PA -PA PA -PA -PA -PA
4 pHW174- pHW174- pHW174- pHW174- pHW184- pHW184- pHW184- pHW184-
-HA -HA -HA -HA -HA -HA -HA -HA
5 pHW175- pHW175- pHW175- pHW175- pHW185- pHW185- pHW185- pHW185-
NP. -NP -NP. -NP. NP. -NP -NP -NP
6 pHW176- pHW176- pHW176- pHW176- pHW186- pHW186- pHW186- pHW186-
-NA -NA -NA -NA -NA -NA -NA -NA
7 pHW177-M pHW177-M pHW177-M pHW177-M pHW187-M pHW187-M pHW187-M pHW187-M
8 pHW178- pHW178- pHW178- pHW178- pHW188- pHW188- pHW188- pHW188-
-NS -NS -NS -NS -NS -NS -NS -NS
Transfe- 293T 293T COS-1 COS-1 293T 293T COS-1 COS-1
kowane +MDCK +MDCK +MDCK +MDCK
kom.#
Transkrypty cRNA i mRNA vRNA i mRNA
Miano wirusa pfu/ml)§
t = 24 h 0 0 0 0 5 x 102 4 x 102 1 x 103 1 x 103
t = 48 h 4 x 103 5 x 103 2 x 103 5 x 103 8 x 106 1 x 107 6 x 106 1 x 107
t = 72 h 4 x 104 2 x 105 2 x 104 4 x 105 1 x 107 2 x 108 1 x 107 3 x 108
Plazmidy z jednokierunkowymi jednostkami transkrypcyjnymi oraz plazmidy z dwukierunkowymi jednostkami transkrypcyjnymi (fig. 1) zawierają cDNA reprezentujące osiem segmentów genowych wirusa A/WSN/33 (H1N1).
# komórki 293T lub COS-1 były transfekowane w obecności lub braku obecności komórek MDCK.
t Transkrypty RNA syntetyzowane przez polI lub polII.
§ Miano wirusa w supernatancie okreś lano w oznaczonych czasach (24 godz., 48 godz., 72 godz.) po transfekcji, za pomocą testu łysinkowego na komórkach MDCK.
Chociaż dowiedziono, że pozyskiwanie wirusa WSN z komórek transfekowanych ośmioma plazmidami zawierającymi podwójny promotor jest bardzo skuteczne, wydajność produkcji wirusa przy
PL 205 955 B1 podejściu wykorzystującym cRNA-mRNA była niższa niż uzyskana w układzie dwukierunkowym, w wyniku którego otrzymuje się transkrypty vRNA oraz mRNA (tab. 3). Po upływie siedemdziesięciu dwóch godzin od transfekcji komórek 293T lub COS-1 ośmioma plazmidami zawierającymi dwukierunkowy układ transkrypcji pol I-pol II (fig. 1; przykład 2; patrz. Hoffmann i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2000, 97:6108; pHW181-PB2, pHW182-PB1, pHW183-PA, pHW184-HA, pHW185-NP, pHW186-NA, pHW187-M oraz pHW188-NS), miano wirusa wynosiło 1 x 107 pfu/ml (tab. 3). Po upływie dwudziestu czterech godzin od transfekcji komórek COS-1 bądź 293T miano to w supernatancie wynosiło 0,4-1 x 103 pfu/ml. Dane te pokazują, że dwukierunkowy układ ośmiu plazmidów charakteryzuje się taką samą wydajnością produkcji wirusa posiadającą podobną kinetykę, co bardziej skomplikowane i kłopotliwe układy wieloplazmidowe, które wymagają kotransfekcji z wykorzystaniem 12 bądź 17 plazmidów (Neumann i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1999, 96:9345).
W przypadku zastosowania ośmiu plazmidów zawierających podwójny promotor po upływie 24 godz. od transfekcji nie znaleziono infekcyjnego wirusa (tab. 3). Wynik ten sugeruje iż różnice w wydajności produkcji wirusa pomiędzy podejściem wykorzystującym vRNA-mRNA a cRNA-mRNA są spowodowane odmienną polarnością pierwotnych transkryptów pol I. W układzie dwukierunkowym początkowym etapem jest wewnątrzkomórkowa synteza vRNA, co przypomina infekcję grypy typu A w warunkach naturalnych, w których cząsteczki vRNP transportowane są do jądra, a cząsteczki vRNA początkowo służą jako matryce do syntezy mRNA oraz cRNA. W układzie jednokierunkowym cząsteczki cRNP produkowane są jako pierwsze jednostki replikacyjnie kompetentne. Celem uzyskania cząsteczek mRNA, cząsteczki cRNA muszą ulec replikacji do cząsteczek vRNA, a cząsteczki vRNP są w końcowym etapie pakowane do cząstek wirusa potomnego (Hsu i wsp., J.Gen.Virol. 1987, 77:2575). Ponieważ do uzyskania cząsteczek vRNP z cRNP konieczne są reakcje dodatkowe, wytworzenie wirusa w układzie jednokierunkowym trwa dłużej niż w przypadku układu dwukierunkowego.
Inne możliwe przyczyny różnic w wydajności produkcji wirusa pomiędzy oboma układami to fakt, że pewne elementy sekwencji w cDNA zmniejszają skuteczność transkrypcji poprzez terminację tego procesu, bądź że istnieją sekwencje w transkryptach RNA, które redukują stabilny poziom transkryptów pol I lub pol II. Niższe stężenie zaledwie jednego spośród ośmiu wiruso-podobnych cząsteczek cRNA lub mRNA obniża całkowitą wydajność tego układu, ponieważ wszystkie cząsteczki vRNP oraz białka strukturalne muszą być syntetyzowane w optymalnych dla replikacji i montażu wirusa stężeniach.
Wysoka wydajność wytwarzania wirusa grypy typu A w układzie ośmioplazmidowy wskazuje, że układ ten stosować można w przypadku pozostałych ortomyxowirusow, np., wirusa grypy typu B, typu C czy togotowirusa. Wyniki otrzymane w niniejszych badaniach sugerują, że układ vRNA-mRNA stanowi najbardziej wydajny sposób wytwarzania tych wirusów całkowicie z plazmidów. Niniejszy wynalazek umożliwia ustalenie układów opartych na pol I dla celów uzyskiwania wirusów RNA innych niż należące do rodziny Orthomyxoviridae, np. należących do Paramyxoviridae, Arenaviridae czy Bunyaviridae (Roberts, A. & Rose J.K., Virology 1998, 247:1-6; Bridgen & Elliot, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996, 93:15400; Lee i wsp., J. Virol 2000, 74:3470). W odróżnieniu od ortomyxowrusow, proces replikacji u większości wirusów RNA zachodzi w cytoplazmie zakażonych komórek. W trakcie ewolucji cząsteczki RNA tych wirusów nie ulegały presji selekcyjnej, jaka charakterystyczna jest dla jądra, np. procesowi splicingu. Ogólnie rzecz biorąc, podstawą układów odwrotnej genetyki dla wirusów RNA o ujemnej niesegmentowanej nici jest wewnątrzkomórkowy proces transkrypcji zapoczątkowywany przez promotor T7, jak po raz pierwszy zostało to zbadane przez Conzelmanna i wspólników dla celów uzyskania wirusa wścieklizny (Schnell i wsp., EMBO J. 1994, 13:4195). Ekspresja wirusopodobnych cząsteczek vRNA przeprowadzana jest przez T7 polimerazę RNA, dostarczonej bądź w procesie infekcji z użyciem szczepionki zrekombinowanego wirusa bądź poprzez zastosowanie linii komórkowych, w których ekspresja T7 polimerazy RNA zachodzi konstytutywnie. W odróżnieniu od transkrypcji z udziałem pol I, która zachodzi w jądrze, transkrypcja z udziałem polimerazy RNA T7 ma miejsce na terenie cytoplazmy. Zastosowanie układu transkrypcyjnego pol I dla celów otrzymywania cytoplazmatycznych wirusów RNA wymagałoby przeniesienia transkryptów RNA poza jądro. To, że rzeczywiście zachodzi transport produktów transkrypcji pol I poza jądro, poparte zostało dzięki stwierdzeniu procesu produkcji białek w komórkach zawierających transkrypty pol I wyposażone w wewnętrzne miejsce wejścia rybosomów, wstawione w niekodujący rejon końca 5' (Palmer i wsp., Nuci. Acids. Res. 1993, 21:3451). Ponieważ informacja na temat sekwencji kluczowych dla procesu przenoszenia poza jądro bądź zatrzymywania w jego wnętrzu transkryptów pol I jest niepełna, wynikiem syntezy ujemnych lub dodatnich cząsteczek RNA może być różna wydajność przenoszenia transkryptów poza jądro. Dodatkowo, fakt, że możliwy jest proces eksportu poza jądro dużych, wytworzonych z udziałem pol II tranPL 205 955 B1 skryptów koronowirusopodobnych (posiadających więcej niż 30000 nukleotydów, nts) (Almazan i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2000, 97:5516), wskazuje iż to raczej istnienie specyficznych sekwencji RNA niż długość transkryptu jest decydujące dla zajścia tego procesu. Opracowane przez nas wektory klonujące pol I-pol II, a także skuteczna metoda klonowania oparta na zastosowaniu endonukleaz restrykcyjnych typu II umożliwi, dzięki syntezie dodatniego i ujemnego RNA w jądrze, wytworzenie cytoplazmatycznych wirusów RNA nakładem umiarkowanych kosztów i czasu.
Zakres niniejszego wynalazku nie jest zawężany jedynie do jego specyficznych wykonaniach tu opisanych. Możliwe będzie przeprowadzenie rozmaitych modyfikacji wynalazku poza tutaj opisanymi, co oczywiste będzie dla osób o podstawowej znajomości metod badań naukowych po zapoznaniu się z powyższym opisem oraz załączonymi figurami. Modyfikacje takie w założeniu wchodzą w zakres zastrzeżeń.
Zrozumiałe jest, że wszystkie wartości są przybliżone i przytoczone dla celów opisu.
Wszystkie patenty, wnioski patentowe, publikacje oraz inne materiały tutaj cytowane są w swej całości niniejszym załączone w formie odnośników do literatury.
LISTA SEKWENCJI <110> St. Jude Children's Hospital Hoffmann, Erich <120> Układ transfekcji DNA służący do wytwarzania zakaźnego wirusa grypy <130> 2427/2G772WO <140> PCT/US01/13656 <141> 2001-04-27 <160> 21 <170> Patentln version 3.1 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Starter PCR (Seq-PB1#1) <400> 1 aggatgggat tcctcaagg 19 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Starter PCR (Seq-PB1#2) <400> 2 gctatggttt ccagagcccg 20 <210> 3 <211> 28 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Starter PCR (Bm-PB1-1) <400> 3 tattcgtctc agggagcgaa agcaggca 28 <210> 4 <211> 33 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja
PL 205 955 B1 <220>
<223> Starter PCR (Bm-PB1-2341R) <400> 4 atatcgtctc gtattagtag aaacaaggca ttt 33 <210> 5 <211> 29 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Starter PCR (Bm-NS#1) <400> 5 tattcgtctc agggagcaaa agcagggtg 29 <210> 6 <211>34 <212> DNA <213>Sztuczna sekwencja <220>
<223> Starter PCR (Bm-NS#2) <400> 6 atatcgtctc gtattagtag aaacaagggt gttt 34 <210> 7 <211> 29 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Starter PCR (Bm-M#1) <400> 7 tattcgtctc agggagcaaa agcaggtag 29 <210> 8 <211> 37 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Starter PCR(Bm-M#2) <400> 8 atatcgtctc gtattagtag aaacaaggta gtttttt 37 <210> 9 <211> 37 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Starter PCR (Bm-NA1-1) <400> 9 tattcgtctc agggagcaaa agcaggagtt taacatg 37 <210> 10 <211> 35 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Starter PCR (Bm-NA-1413R)
PL 205 955 B1 <400> 10 atatcgtctc gtattagtag aaacaaggag ttttt 35 <210> 11 <211> 34 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Starter PCR (Bm-H6-1) <400> 11 tattcgtctc agggagcaaa agcaggggaa aatg 34 <210> 12 <211> 34 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Starter PCR (Bm-NS#2) <400> 12 atatcgtctc gtattagtag aaacaagggt gttt 34 <210> 13 <211> 29 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> PCR primer (Ba-NP-1)
400> 13 tattggtctc agggagcgaa agcagggta 29 <210> 14 <211> 33 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Starter PCR (Ba-NP1565R) <400> 14 atatggtctc gtattagtag aaacaagggt att 33 <210> 15 <211> 35 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Starter PCR- (Bm-PA1-1) <400> 15 tattcgtctc agggagcgaa agcaggtact gatcc 35 <210> 16 <211> 36 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Starter PCR (Bm-PA1-2231R) <400> 16 atatcgtctc gtattagtag aaacaaggta cttttt 36
PL 205 955 B1 <210> 17 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial seąuence <220>
<223> Starter PCR (Bm-PB1a-1) <400> 17 tattcgtctc agggagcgaa agcaggcaaa cc 32 <210> 18 <211> 33 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Starter PCR (Bm-PB1-2341R) <400> 18 atatcgtctc gtattagtag aaacaaggca ttt 33 <210> 19 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial sequence <220>
<223> starter PCR (Ba-PB2-1) <400> 19 tattggtctc agggagcgaa agcaggtcaa ttatattc 38 <210> 20 <211> 36 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> PCR starter(Ba-PB2-2341R) <400> 20 atatggtctc gtattagtag aaacaaggtc gttttt 36 <210> 21 <211> 12 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> PCR starter <400> 21 agcaaaagca gg 12

Claims (42)

  1. Zastrzeżenia patentowe
    1. Układ oparty na minimalnej liczbie plazmidów do wytwarzania infekcyjnych wirusów RNA o ujemnej nici ze sklonowanego wirusowego cDNA, obejmujący zestaw plazmidów, znamienny tym, że każdy z plazmidów obejmuje wirusowy cDNA będący jednym wirusowym segmentem genomowym, wstawiony pomiędzy sekwencję promotora polimerazy I RNA (pol I) i sekwencję terminatora, które są zdolne do kierowania syntezą vRNA, i które są wstawione pomiędzy promotor polimerazy II RNA (pol II) i sygnał poliadenylacji, które są zdolne do kierowania syntezą wirusowego mRNA.
  2. 2. Układ według zastrz. 1, znamienny tym, że sekwencja terminatora jest sekwencją terminatora polimerazy I RNA (pol I).
    PL 205 955 B1
  3. 3. Układ według zastrz. 1 lub 2, znamienny tym, że jest dwukierunkowym układem transkrypcyjnym cDNA.
  4. 4. Układ według zastrz. 1 lub 2, znamienny tym, że promotor pol I jest położony w pobliżu sygnału poliadenylacji, a sekwencja terminatora pol I leży w pobliżu promotora pol II.
  5. 5. Układ według zastrz. 1 - 4, znamienny tym, że wirus RNA jest ortomyksowirusem.
  6. 6. Układ według zastrz. 5, znamienny tym, że ortomyksowirusem jest wirus grypy.
  7. 7. Układ według zastrz. 6, znamienny tym, że wirusem grypy jest wirus grypy typu A.
  8. 8. Układ według zastrz. 6, znamienny tym, że wirusem grypy jest wirus grypy typu B.
  9. 9. Układ według zastrz. 7, znamienny tym, że segment genomowy wirusa (i) koduje białko wybrane z grupy składającej się z białka kompleksu polimerazy wirusa, białka M i białka NS, i (ii) pochodzi ze szczepu dobrze przystosowanego do wzrostu w hodowli komórkowej bądź ze szczepu atenuowanego lub z obu ź róde ł .
  10. 10. Układ według zastrz. 7, znamienny tym, że wirusowy segment genomowy zawiera gen hemaglutyniny (HA) lub gen neuraminidazy (NA), przy czym geny te pochodzą z patogennego wirusa grypy.
  11. 11. Układ według zastrz. 7, znamienny tym, że zawiera jeden lub więcej plazmidów mających mapę wybraną z grupy składającej się z plazmidu kodującego PB2, plazmidu kodującego PB1, plazmidu kodującego PA, plazmidu kodującego HA, plazmidu kodującego NP, plazmidu kodującego NA, plazmidu kodującego M oraz plazmidu kodującego NS.
  12. 12. Komórka gospodarza zawierająca układ oparty na minimalnej liczbie plazmidów określony w zastrz. 1 - 11.
  13. 13. Komórka gospodarza według zastrz. 12, znamienna tym, że jest wybrana z grupy składającej się z komórki psiej nerki Madin-Darby (MDCK), komórki VERO, komórki CV1, komórki COS-1, komórki COS-7 i komórki BHK-1.
  14. 14. Sposób wytwarzania wiriona wirusa RNA o ujemnej nici, znamienny tym, że obejmuje hodowlę komórki gospodarza określonej w zastrz. 12 lub 13 w warunkach pozwalających na wytwarzanie białek wirusowych oraz vRNA i cRNA, z wytworzeniem zakaźnego wirusa RNA o ujemnej nici.
  15. 15. Sposób według zastrz. 14, znamienny tym, że wirus RNA jest patogenny.
  16. 16. Sposób według zastrz. 14, znamienny tym, że wirus RNA jest ortomyksowirusem.
  17. 17. Sposób według zastrz. 16, znamienny tym, że ortomyksowirusem jest wirus grypy A.
  18. 18. Sposób według zastrz. 16, znamienny tym, że ortomyksowirusem jest wirus grypy B.
  19. 19. Sposób według zastrz. 14, znamienny tym, że komórka gospodarza jest wybrana z grupy składającej się z komórki psiej nerki Madin-Darby (MDCK), komórki VERO, komórki CV1, komórki COS-1, komórki COS-7 i komórki BHK-1.
  20. 20. Sposób według zastrz. 19, znamienny tym, że komórką gospodarza jest komórka Vero.
  21. 21. Sposób według zastrz. 14-17 i 1 9-20, znamienny tym, że co najmniej jeden plazmid w układzie opartym na plazmidzie obejmuje segment genomowy wirusa szczepu grypy A/PR/8/34.
  22. 22. Sposób według zastrz. 14-17 i 19-20, znamienny tym, że co najmniej jeden plazmid w układzie opartym na plazmidzie obejmuje segment genomowy wirusa szczepu grypy A/AnnArbor/6/60.
  23. 23. Sposób według zastrz. 14-16 i 18-20, znamienny tym, że co najmniej jeden plazmid w układzie opartym na plazmidzie obejmuje wirusowy segment genomowy szczepu grypy B/AnnArbor/6/60.
  24. 24. Sposób wytwarzania atenuowanego wirusa RNA o ujemnej nici, znamienny tym, że obejmuje:
    (a) zmutowanie jednego lub więcej genów wirusowych w układzie opartym na plazmidzie określonym w zastrz. 1-11 i
    b) oznaczenie, czy zakaźne wirusy RNA o ujemnej nici wytwarzane przez układ oparty na plazmidzie po wprowadzeniu do odpowiedniej komórki gospodarza, są atenuowane.
  25. 25. Sposób według zastrz. 24, znamienny tym, że wirus RNA jest ortomyksowirusem.
  26. 26. Sposób według zastrz. 25, znamienny tym, że ortomyksowirusem jest wirus grypy A.
  27. 27. Sposób według zastrz. 25, znamienny tym, że ortomyksowirusem jest wirus grypy B.
  28. 28. Sposób według zastrz. 24, znamienny tym, że komórka gospodarza jest wybrana z grupy składającej się z komórki psiej nerki Madin-Darby (MDCK), komórki VERO, komórki CV1, komórki COS-1, komórki COS-7 i komórki BHK-1.
  29. 29. Sposób według zastrz. 28, znamienny tym, że komórką gospodarza jest komórka Vero.
  30. 30. Sposób według zastrz. 24-26 i 28-29, znamienny tym, że co najmniej jeden plazmid w układzie opartym na plazmidzie obejmuje segment genomowy wirusa szczepu grypy A/PR/8/34.
    PL 205 955 B1
  31. 31. Sposób według zastrz. 24-26 i 28-29, znamienny tym, że co najmniej jeden plazmid w układzie opartym na plazmidzie obejmuje segment genomowy wirusa szczepu grypy A/Ann-Arbor/6/60.
  32. 32. Sposób według zastrz. 24-25 i 28-29, znamienny tym, że co najmniej jeden plazmid w układzie opartym na plazmidzie obejmuje segment genomowy wirusa szczepu grypy B/AnnArbor/6/60.
  33. 33. Sposób wytwarzania zakaźnego wirusa o ujemnej nici do stosowania w szczepionkach, znamienny tym, że obejmuje:
    (a) hodowanie komórki gospodarza zawierającej układ oparty na plazmidzie określony w zastrz. 1-11 do wytwarzania tego wirusa, i (b) oczyszczanie wirusa wytworzonego przez komórkę gospodarza.
  34. 34. Sposób według zastrz. 33, znamienny tym, że wirus RNA jest ortomyksowirusem.
  35. 35. Sposób według zastrz. 34, znamienny tym, że ortomyksowirusem jest wirus grypy A.
  36. 36. Sposób według zastrz. 34, znamienny tym, że ortomyksowirusem jest wirus grypy B.
  37. 37. Sposób według zastrz. 33, znamienny tym, że komórka gospodarza jest wybrana z grupy składającej się z komórki psiej nerki Madin-Darby (MDCK), komórki VERO, komórki CV1, komórki COS-1, komórki COS-7 i komórki BHK-1.
  38. 38. Sposób według zastrz. 37, znamienny tym, że komórką gospodarza jest komórka Vero.
  39. 39. Sposób według zastrz. 33 i 37-38, znamienny tym, że co najmniej jeden plazmid w układzie opartym na plazmidzie obejmuje segment genomowy wirusa szczepu grypy A/PR/8/34.
  40. 40. Sposób według zastrz. 33 i 37-38, znamienny tym, że co najmniej jeden plazmid w układzie opartym na plazmidzie obejmuje segment genomowy wirusa szczepu grypy A/AnnArbor/6/60.
  41. 41. Sposób według zastrz. 33 i 36-38, znamienny tym, że co najmniej jeden plazmid w układzie opartym na plazmidzie obejmuje segment genomowy wirusa szczepu grypy B/AnnArbor/6/60 .
  42. 42. Zastosowanie układu opartego na minimalnej liczbie plazmidów określonego w zastrz. 1-11 do wytwarzania leku do leczenia lub zapobiegania zakażeniu wirusowemu, przy czym zakażenie wirusowe jest zakażeniem wirusem grypy.
PL366064A 2000-04-28 2001-04-27 Układ oparty na minimalnej liczbie plazmidów do wytwarzania infekcyjnych wirusów RNA o ujemnej nici, komórka gospodarza zawierająca taki układ, sposób wytwarzania wiriona wirusa RNA o ujemnej nici, sposób wytwarzania atenuowanego wirusa RNA o ujemnej nici, sposób wytwarzania zakaźnego wirusa o ujemnej nici do stosowania w szczepionkach i zastosowanie układu opartego na minimalnej liczbie plazmidów PL205955B1 (pl)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US20067900P 2000-04-28 2000-04-28

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL366064A1 PL366064A1 (pl) 2005-01-24
PL205955B1 true PL205955B1 (pl) 2010-06-30

Family

ID=22742710

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL366064A PL205955B1 (pl) 2000-04-28 2001-04-27 Układ oparty na minimalnej liczbie plazmidów do wytwarzania infekcyjnych wirusów RNA o ujemnej nici, komórka gospodarza zawierająca taki układ, sposób wytwarzania wiriona wirusa RNA o ujemnej nici, sposób wytwarzania atenuowanego wirusa RNA o ujemnej nici, sposób wytwarzania zakaźnego wirusa o ujemnej nici do stosowania w szczepionkach i zastosowanie układu opartego na minimalnej liczbie plazmidów

Country Status (26)

Country Link
US (6) US6951754B2 (pl)
EP (2) EP1317559B1 (pl)
JP (3) JP2004500842A (pl)
KR (2) KR100848719B1 (pl)
CN (2) CN100489107C (pl)
AT (1) ATE420189T1 (pl)
AU (3) AU5921101A (pl)
BR (1) BRPI0110607B8 (pl)
CA (1) CA2406100C (pl)
CY (1) CY1108735T1 (pl)
DE (2) DE122011100039I1 (pl)
DK (1) DK1317559T3 (pl)
EA (1) EA006311B1 (pl)
ES (1) ES2319864T3 (pl)
HK (1) HK1055992A1 (pl)
HU (1) HU229101B1 (pl)
IL (1) IL152426A (pl)
MX (1) MXPA02010642A (pl)
NO (1) NO332080B1 (pl)
NZ (1) NZ521840A (pl)
PL (1) PL205955B1 (pl)
PT (1) PT1317559E (pl)
SI (1) SI1317559T1 (pl)
UA (1) UA84254C2 (pl)
WO (1) WO2001083794A2 (pl)
ZA (1) ZA200208065B (pl)

Families Citing this family (132)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8715940B2 (en) 1999-04-06 2014-05-06 Wisconsin Alumni Research Foundation Method of making recombinant influenza virus
WO2001083794A2 (en) * 2000-04-28 2001-11-08 St. Jude Children's Research Hospital Dna transfection system for the generation of infectious influenza virus
AU2003231083A1 (en) * 2002-04-26 2003-11-10 Medimmune, Llc Multi plasmid system for the production of influenza virus
US7465456B2 (en) 2002-04-26 2008-12-16 Medimmune, Llc Multi plasmid system for the production of influenza virus
ES2427139T3 (es) 2002-06-20 2013-10-29 Institut Pasteur Virus recombinantes del sarampión que expresan epítopos de antígenos de virus de ARN y uso de los virus recombinantes para la preparación de composiciones de vacuna
EP2110382A1 (en) 2002-06-20 2009-10-21 Institut Pasteur Infectious cDNA of an improved vaccine strain of measles virus, use for immunogenic compositions
DE10248301A1 (de) * 2002-10-16 2004-04-29 Philipps-Universität Marburg Herstellung eines Lebend-Impfstoffes gegen Influenza-Viren
EP1597400B8 (en) 2003-02-25 2013-10-09 MedImmune, LLC Methods of producing influenza vaccine compositions
US20060110406A1 (en) * 2003-02-25 2006-05-25 Medimmune Vaccines, Inc. Refrigerator-temperature stable influenza vaccine compositions
CA2432738A1 (en) 2003-02-26 2004-08-26 Philippe Despres New dengue and west nile viruses proteins and genes coding the foregoing, and their use in vaccinal, therapeutic and diagnostic applications
AU2004274860A1 (en) * 2003-05-28 2005-03-31 Wisconsin Alumni Research Foundation Recombinant influenza vectors with a polII promoter and ribozymes
EP1631663B1 (en) * 2003-05-28 2016-08-24 Wisconsin Alumni Research Foundation High titer recombinant influenza viruses for vaccines and gene therapy
WO2005018539A2 (en) 2003-06-16 2005-03-03 Medimmune Vaccines, Inc. Influenza hemagglutinin and neuraminidase variants
US7037707B2 (en) * 2003-09-04 2006-05-02 St. Jude Children's Research Hospital Method for generating influenza viruses and vaccines
DE602004027537D1 (pl) * 2003-12-23 2010-07-15 Medimmune Inc
DE202005022108U1 (de) 2004-03-09 2013-11-12 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. Influenza-Virus-Impfstoffe
DE102004013335A1 (de) * 2004-03-17 2005-10-13 TransMIT Gesellschaft für Technologietransfer mbH Impfstoff gegen Influenza basierend auf Geflügelpestviren
EP1766034B1 (en) * 2004-05-21 2014-03-19 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Alphavirus vectors for influenza virus vaccines
DK1748790T3 (en) 2004-05-24 2015-10-19 Medimmune Llc Multiplasmidsystem for the production of influenza
CA2822895A1 (en) 2004-05-25 2005-12-08 Medimmune, Llc Influenza hemagglutinin and neuraminidase variants
KR101346989B1 (ko) 2004-10-06 2014-02-06 메디뮨 엘엘씨 냉장 온도 안정성 인플루엔자 백신 조성물
MX2007005818A (es) 2004-11-19 2007-07-20 Wisconsin Alumni Res Found Vectores recombinantes de la influenza con unidades de transcripcion en tandem.
US7510719B2 (en) * 2004-12-08 2009-03-31 Medimmune, Llc Methods of producing influenza vaccine compositions
JP5414178B2 (ja) 2004-12-23 2014-02-12 メディミューン，エルエルシー ウイルス増殖用の非腫瘍形成性ｍｄｃｋ細胞株
US7959930B2 (en) 2004-12-24 2011-06-14 Abbott Biologicals B.V. Rescue of influenza virus
ES2527503T3 (es) 2005-03-08 2015-01-26 Medimmune, Llc Virus influenza reordenantes
BRPI0612268A2 (pt) * 2005-06-21 2009-01-27 Medimmune Vaccines Inc Ácido nucleico isolado, vetor de expressço, mÉtodos para produzir um rna genâmico da influenza, para produzir um vÍrus da influenza recombinante, para gerar um vÍrus de rna segmentado de filamento negativo recombinante nas cÉlulas caninas cultivadas e para gerar partÍculas virais da influenza infecciosa em cÉlulas caninas cultivadas, cÉlula, e, vÍrus
US7790434B2 (en) * 2005-06-21 2010-09-07 Medimmune, Llc Methods and compositions for expressing negative-sense viral RNA in canine cells
EP2614836A3 (en) 2005-10-17 2013-10-23 MedImmune, LLC High growth reassortant influenza A virus
US11707520B2 (en) 2005-11-03 2023-07-25 Seqirus UK Limited Adjuvanted vaccines with non-virion antigens prepared from influenza viruses grown in cell culture
US20090304742A1 (en) 2005-11-04 2009-12-10 Novartis Vaccines And Diagnostics Srl Influenza vaccines with reduced amount of emulsion adjuvant
CA2628424A1 (en) 2005-11-04 2007-05-10 Novartis Vaccines And Diagnostics S.R.L. Adjuvanted influenza vaccines including cytokine-inducing agents
WO2007052061A2 (en) 2005-11-04 2007-05-10 Novartis Vaccines And Diagnostics Srl Emulsions with free aqueous-phase surfactant as adjuvants for split influenza vaccines
NZ568211A (en) 2005-11-04 2011-11-25 Novartis Vaccines & Diagnostic Influenza vaccines including combinations of particulate adjuvants and immunopotentiators
PT2368572T (pt) 2005-11-04 2020-06-16 Seqirus Uk Ltd Vacinas com adjuvante dotadas de antigénios não-virião preparados a partir de vírus da gripe cultivado em cultura celular
NZ568212A (en) * 2005-11-04 2012-03-30 Novartis Vaccines & Diagnostic Changing Th1/Th2 balance in split influenza vaccines with adjuvants
KR20080089663A (ko) 2006-01-27 2008-10-07 노바티스 백신즈 앤드 다이아그노스틱스 게엠베하 운트 콤파니 카게 적혈구응집소 및 기질 단백질을 함유한 인플루엔자 백신
AU2007231027B2 (en) 2006-03-24 2013-10-03 Novartis Influenza Vaccines Marburg Gmbh Storage of influenza vaccines without refrigeration
AU2007245192B2 (en) 2006-03-31 2012-04-12 Wisconsin Alumni Research Foundation High titer recombinant influenza viruses for vaccines
AU2014202470B2 (en) * 2006-03-31 2016-08-04 Wisconsin Alumni Research Foundation High titer recombinant influenza viruses for vaccines
AU2012204138B2 (en) * 2006-03-31 2014-02-06 Wisconsin Alumni Research Foundation High titer recombinant influenza viruses for vaccines
WO2007124327A2 (en) 2006-04-19 2007-11-01 Medimmune Llc. Methods and compositions for expressing negative-sense viral rna in canine cells
US9072701B2 (en) 2006-04-21 2015-07-07 St. Jude Children's Research Hospital Avian influenza viruses, vaccines, compositions, formulations, and methods
US7507411B2 (en) * 2006-06-23 2009-03-24 University Of Saskatchewan Attenuated influenza NS1 variants
GB0614460D0 (en) 2006-07-20 2006-08-30 Novartis Ag Vaccines
WO2008133701A1 (en) * 2006-07-21 2008-11-06 Medimmune, Llc. Methods and compositions for increasing replication capacity of an influenza virus
CN104278014A (zh) * 2006-08-09 2015-01-14 米迪缪尼有限公司 流感血凝素和神经氨酸酶变体
AU2007297178B2 (en) 2006-09-11 2014-07-24 Novartis Ag Making influenza virus vaccines without using eggs
CN101627113B (zh) 2006-09-15 2013-04-24 米迪缪尼有限公司 支持病毒生长到高效价的mdck细胞系和采用该细胞系的生物反应器方法
US8202967B2 (en) 2006-10-27 2012-06-19 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. H5 proteins, nucleic acid molecules and vectors encoding for those, and their medicinal use
WO2008068631A2 (en) 2006-12-06 2008-06-12 Novartis Ag Vaccines including antigen from four strains of influenza virus
WO2008080091A2 (en) * 2006-12-21 2008-07-03 Vical Incorporated Activation of rig-i pathway
WO2008153236A1 (en) * 2007-06-15 2008-12-18 Protheon Co., Ltd An attenuated influenza virus and a live vaccine comprising the same
EP2674486A1 (en) 2007-06-18 2013-12-18 MedImmune, LLC Influenza B viruses having alterations in the hemaglutinin polypeptide
WO2008156778A2 (en) 2007-06-18 2008-12-24 Tokiko Watanabe Influenza m2 protein mutant viruses as live influenza attenuated vaccines
NZ582595A (en) 2007-06-27 2012-07-27 Novartis Ag Low-additive influenza vaccines
EP2045323A1 (en) * 2007-10-05 2009-04-08 Avir Green Hills Biotechnology Research Development Trade Ag Linear expression constructs for production of influenza virus particles
SG10201606120XA (en) 2007-10-02 2016-09-29 Theranos Inc Modular Point-Of-Care Devices And Uses Thereof
GB0810305D0 (en) 2008-06-05 2008-07-09 Novartis Ag Influenza vaccination
MX2010005701A (es) * 2007-11-26 2010-08-31 London School Of Hygiene & Tro Metodo para producir cepa viral vacunal de un virus de la familia reoviridae.
NZ587798A (en) 2008-03-18 2013-06-28 Novartis Ag Improvements in the preparation of influenza virus vaccine antigens utilising a phosphate buffer
CA2730408A1 (en) 2008-07-11 2010-01-14 Chin-Fen Yang Influenza hemagglutinin and neuraminidase variants
KR20110074563A (ko) 2008-09-24 2011-06-30 메디뮨 엘엘씨 바이러스의 정제 방법
EP2233568A1 (en) * 2009-03-19 2010-09-29 Avir Green Hills Biotechnology Research Development Trade AG Novel method for generation of RNA virus
CN102307590A (zh) 2009-02-10 2012-01-04 诺华有限公司 具有减少量的角鲨烯的流感疫苗
CA2752039A1 (en) 2009-02-10 2010-08-19 Novartis Ag Influenza vaccine regimens for pandemic-associated strains
WO2010092477A1 (en) 2009-02-10 2010-08-19 Novartis Ag Influenza vaccines with increased amounts of h3 antigen
EP2396033B1 (en) 2009-02-12 2016-09-28 MedImmune, LLC Influenza hemagglutinin and neuraminidase variants
CA2787099A1 (en) 2009-03-30 2010-10-14 Anice C. Lowen Influenza virus hemagglutinin polypeptides containing stem domains, vaccines and uses thereof
DE102010018462A1 (de) 2009-04-27 2011-04-07 Novartis Ag Impfstoffe zum Schutz gegen Influenza
WO2010144797A2 (en) 2009-06-12 2010-12-16 Vaccine Technologies, Incorporated Influenza vaccines with enhanced immunogenicity and uses thereof
WO2011014504A1 (en) 2009-07-27 2011-02-03 Mount Sinai School Of Medicine Of New York University Recombinant influenza virus vectors and uses thereof
CA2805505C (en) 2009-07-30 2021-08-03 Mount Sinai School Of Medecine Chimeric influenza viruses having reduced ability to reassort with other influenza viruses and uses thereof
CN102666860B (zh) 2009-07-31 2015-06-17 诺华股份有限公司 反向遗传系统
US20120237536A1 (en) 2009-09-10 2012-09-20 Novartis Combination vaccines against respiratory tract diseases
PL2491117T3 (pl) * 2009-10-20 2014-05-30 Novartis Ag Udoskonalone sposoby odzyskiwania wirusa wykorzystujące odwrotną genetykę
WO2011056591A1 (en) 2009-10-26 2011-05-12 Warf - Wisconsin Alumni Research Foundation High titer recombinant influenza viruses with enhanced replication in vero cells
CN102051345B (zh) * 2009-11-09 2013-04-17 中国医学科学院医药生物技术研究所 一种抗流行性感冒病毒药物的筛选方法
MX342716B (es) * 2010-02-18 2016-10-11 Sinai School Medicine Vacunas para su uso en la profilaxis y tratamiento de la enfermedad del virus de influenza.
US10130697B2 (en) 2010-03-23 2018-11-20 Wisconsin Alumni Research Foundation (Warf) Vaccines comprising mutant attenuated influenza viruses
CA2792537A1 (en) 2010-03-30 2011-10-06 Mount Sinai School Of Medicine Influenza virus vaccines and uses thereof
EA201201620A1 (ru) 2010-06-02 2013-07-30 Авир Грин Хилз Байотекнолоджи Рисерч Дивелопмент Трейд Аг Способ получения рнк-вируса
AR083533A1 (es) 2010-10-22 2013-03-06 Boehringer Ingelheim Vetmed Proteinas de hemaglutinina 5 (h5) para el tratamiento y prevencion de las infecciones de gripe
SG192069A1 (en) 2011-01-21 2013-08-30 Theranos Inc Systems and methods for sample use maximization
US8911975B2 (en) 2011-02-08 2014-12-16 Mie University Method for producing virus vector for gene transfer
US20130189303A1 (en) 2011-08-02 2013-07-25 Yan Zhou Recombinant swine influenza virus and uses thereof
AR088028A1 (es) 2011-08-15 2014-05-07 Boehringer Ingelheim Vetmed Proteinas h5, de h5n1 para un uso medicinal
EP2747778B1 (en) 2011-08-26 2017-12-06 Wisconsin Alumni Research Foundation Influenza viruses with mutant pb2 gene segment as live attenuated vaccines
US8475739B2 (en) 2011-09-25 2013-07-02 Theranos, Inc. Systems and methods for fluid handling
US20140170735A1 (en) 2011-09-25 2014-06-19 Elizabeth A. Holmes Systems and methods for multi-analysis
US9632102B2 (en) 2011-09-25 2017-04-25 Theranos, Inc. Systems and methods for multi-purpose analysis
US9664702B2 (en) 2011-09-25 2017-05-30 Theranos, Inc. Fluid handling apparatus and configurations
EP2758075B1 (en) 2011-09-20 2023-05-03 Icahn School of Medicine at Mount Sinai Influenza virus vaccines and uses thereof
US10012664B2 (en) 2011-09-25 2018-07-03 Theranos Ip Company, Llc Systems and methods for fluid and component handling
US9810704B2 (en) 2013-02-18 2017-11-07 Theranos, Inc. Systems and methods for multi-analysis
WO2013130132A1 (en) 2011-10-07 2013-09-06 Medimmune, Llc Influenza hemagglutinin variants
US20140248320A1 (en) 2011-10-20 2014-09-04 Novartis Ag Adjuvanted influenza b virus vaccines for pediatric priming
WO2014019990A1 (en) 2012-08-03 2014-02-06 Sanofi Pasteur Production of infectious influenza viruses
GB201218195D0 (en) 2012-10-10 2012-11-21 Istituto Zooprofilattico Sperimentale Delle Venezie Composition
NZ627796A (en) 2012-12-18 2017-07-28 Icahn School Med Mount Sinai Influenza virus vaccines and uses thereof
US11008628B1 (en) 2013-02-18 2021-05-18 Labrador Diagnostics Llc Systems and methods for analyte testing and laboratory oversight
US10401373B1 (en) 2013-02-18 2019-09-03 Theranos Ip Company, Llc Systems and methods for analyte testing and laboratory oversight
ES2689878T3 (es) 2013-02-21 2018-11-16 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Proteínas H5 del virus de la gripe H5N1 para su uso como un medicamento
WO2014159960A1 (en) 2013-03-14 2014-10-02 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Antibodies against influenza virus hemagglutinin and uses thereof
EP3022296B1 (en) 2013-07-15 2022-12-28 Wisconsin Alumni Research Foundation High titer recombinant influenza viruses with enhanced replication in mdck or vero cells or eggs
US10422806B1 (en) 2013-07-25 2019-09-24 Theranos Ip Company, Llc Methods for improving assays of biological samples
CA2931637C (en) 2013-12-09 2023-10-10 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for treating hemophilia
CN103757032B (zh) * 2014-01-28 2017-06-06 中国人民解放军第三0二医院 一种以流感病毒为载体的hcv嵌合疫苗及其制备方法
US10370680B2 (en) 2014-02-24 2019-08-06 Sangamo Therapeutics, Inc. Method of treating factor IX deficiency using nuclease-mediated targeted integration
US11360107B1 (en) 2014-02-25 2022-06-14 Labrador Diagnostics Llc Systems and methods for sample handling
CN106459894B (zh) 2014-03-18 2020-02-18 桑格摩生物科学股份有限公司 用于调控锌指蛋白表达的方法和组合物
WO2015196150A2 (en) 2014-06-20 2015-12-23 Wisconsin Alumni Research Foundation (Warf) Mutations that confer genetic stability to additional genes in influenza viruses
MA40772A (fr) * 2014-10-02 2017-08-08 Vertex Pharma Variants du virus de la grippe a
MA40773A (fr) * 2014-10-02 2017-08-08 Vertex Pharma Variants du virus influenza a
CN104450695B (zh) * 2014-11-26 2017-08-25 扬州大学 A型流感病毒基因pcr扩增引物及其快速克隆方法
US10889834B2 (en) 2014-12-15 2021-01-12 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for enhancing targeted transgene integration
JP2018504412A (ja) 2015-01-23 2018-02-15 アイカーン スクール オブ メディシン アット マウント サイナイ インフルエンザウイルスワクチン接種レジメン
US10633422B2 (en) 2015-06-01 2020-04-28 Wisconsin Alumni Research Foundation (Warf) Influenza virus replication by inhibiting microRNA lec7C binding to influenza viral cRNA and mRNA
WO2016207853A2 (en) 2015-06-26 2016-12-29 Seqirus UK Limited Antigenically matched influenza vaccines
US9890363B2 (en) 2015-07-06 2018-02-13 Wisconsin Alumni Research Foundation (Warf) Influenza virus replication for vaccine development
WO2017005880A1 (en) 2015-07-07 2017-01-12 Seqirus UK Limited Influenza potency assays
JP6624736B2 (ja) * 2015-11-18 2019-12-25 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構 インフルエンザウイルス解析装置、インフルエンザウイルス解析方法及びインフルエンザウイルス解析プログラム
JP2019510481A (ja) 2016-02-19 2019-04-18 ウィスコンシン アルムニ リサーチ ファンデイション ワクチン開発のための改善されたｂ型インフルエンザウイルス複製
US10844097B2 (en) 2016-06-02 2020-11-24 Sanofi Pasteur Inc. Engineered influenza antigenic polypeptides and immunogenic compositions thereof
US11266734B2 (en) 2016-06-15 2022-03-08 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Influenza virus hemagglutinin proteins and uses thereof
BR112019010830A2 (pt) 2016-11-30 2019-10-01 Boehringer Ingelheim Animal Health Usa Inc vacinas atenuadas de influenza suína e métodos de produção e uso das mesmas
WO2018187706A2 (en) 2017-04-07 2018-10-11 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Anti-influenza b virus neuraminidase antibodies and uses thereof
US11241492B2 (en) 2019-01-23 2022-02-08 Wisconsin Alumni Research Foundation (Warf) Mutations that confer genetic stability to genes in influenza viruses
US11851648B2 (en) 2019-02-08 2023-12-26 Wisconsin Alumni Research Foundation (Warf) Humanized cell line
US11390649B2 (en) 2019-05-01 2022-07-19 Wisconsin Alumni Research Foundation (Warf) Influenza virus replication for vaccine development
EP4022046A2 (en) 2019-08-27 2022-07-06 Wisconsin Alumni Research Foundation (WARF) Recombinant influenza viruses with stabilized ha for replication in eggs
KR102614346B1 (ko) * 2020-12-14 2023-12-14 서울대학교산학협력단 Ｈ5ｎ6 재조합 인플루엔자 바이러스, 이의 제조용 조성물, 및 이를 포함하는 백신 조성물

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3992522A (en) * 1973-01-24 1976-11-16 The United States Of America As Represented By The Department Of Health, Education And Welfare Temperature-sensitive recombinant mutant viruses and a process for producing same
US5854037A (en) 1989-08-28 1998-12-29 The Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York Recombinant negative strand RNA virus expression systems and vaccines
US5840520A (en) 1989-08-28 1998-11-24 Aviron Recombinant negative strand RNA virus expression systems
US5786199A (en) 1989-08-28 1998-07-28 The Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York Recombinant negative strand RNA virus expression systems and vaccines
US5166057A (en) 1989-08-28 1992-11-24 The Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York Recombinant negative strand rna virus expression-systems
JPH11509081A (ja) 1994-11-16 1999-08-17 セント ジュード チルドレンズ リサーチ ホスピタル 新規の複製プロセス
DK1185615T3 (da) 1999-04-06 2007-11-05 Wisconsin Alumni Res Found Rekombinante influenzavirus til vacciner og genterapi
WO2001083794A2 (en) * 2000-04-28 2001-11-08 St. Jude Children's Research Hospital Dna transfection system for the generation of infectious influenza virus
US7465456B2 (en) * 2002-04-26 2008-12-16 Medimmune, Llc Multi plasmid system for the production of influenza virus
AU2003231083A1 (en) 2002-04-26 2003-11-10 Medimmune, Llc Multi plasmid system for the production of influenza virus
DE602004027537D1 (pl) 2003-12-23 2010-07-15 Medimmune Inc

Also Published As

Publication number Publication date
EA006311B1 (ru) 2005-10-27
WO2001083794A2 (en) 2001-11-08
DK1317559T3 (da) 2009-03-23
US20050186563A1 (en) 2005-08-25
US20080233560A1 (en) 2008-09-25
JP5837891B2 (ja) 2015-12-24
PT1317559E (pt) 2009-02-12
US20020164770A1 (en) 2002-11-07
CN101580849B (zh) 2012-11-21
AU2001259211B2 (en) 2006-07-13
DE122011100039I1 (de) 2011-12-08
PL366064A1 (pl) 2005-01-24
CA2406100A1 (en) 2001-11-08
SI1317559T1 (sl) 2009-04-30
EP1317559B1 (en) 2009-01-07
WO2001083794A3 (en) 2003-03-27
EA200201164A1 (ru) 2003-10-30
NO332080B1 (no) 2012-06-18
UA84254C2 (ru) 2008-10-10
US8309099B2 (en) 2012-11-13
BR0110607A (pt) 2004-06-22
KR100862758B1 (ko) 2008-10-13
MXPA02010642A (es) 2004-05-17
CN101580849A (zh) 2009-11-18
BRPI0110607B1 (pt) 2020-08-11
IL152426A0 (en) 2003-05-29
HK1055992A1 (en) 2004-01-30
HUP0303036A2 (hu) 2003-12-29
HUP0303036A3 (en) 2004-10-28
CN1856575A (zh) 2006-11-01
IL152426A (en) 2011-07-31
CN100489107C (zh) 2009-05-20
JP2010042030A (ja) 2010-02-25
DE60137345D1 (de) 2009-02-26
AU2006228054B2 (en) 2010-04-29
US20080311149A1 (en) 2008-12-18
ZA200208065B (en) 2003-11-12
US7312064B2 (en) 2007-12-25
AU5921101A (en) 2001-11-12
BRPI0110607B8 (pt) 2021-05-25
US6951754B2 (en) 2005-10-04
US20110250232A1 (en) 2011-10-13
JP2004500842A (ja) 2004-01-15
KR100848719B1 (ko) 2008-07-25
AU2006228054A1 (en) 2006-11-02
ATE420189T1 (de) 2009-01-15
CA2406100C (en) 2010-11-02
JP5745758B2 (ja) 2015-07-08
EP1317559A2 (en) 2003-06-11
EP2085468A1 (en) 2009-08-05
KR20030072209A (ko) 2003-09-13
HU229101B1 (en) 2013-07-29
US7972843B2 (en) 2011-07-05
CY1108735T1 (el) 2014-04-09
NO20025171D0 (no) 2002-10-28
ES2319864T3 (es) 2009-05-14
NZ521840A (en) 2004-11-26
US20080311148A1 (en) 2008-12-18
JP2013116112A (ja) 2013-06-13
KR20070086094A (ko) 2007-08-27
NO20025171L (no) 2002-12-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US7312064B2 (en) DNA transfection system for the generation of infectious influenza virus
AU2001259211A1 (en) DNA transfection system for the generation of infectious influenza virus
IL151426A (en) Compounds of 4,3 - Dihydro - H1 - Pyrimido [D - 4, 5] Pyrimidine - 2 - On-converted at position 1.5 and their use in the preparation of drugs for the treatment of diseases caused by 38P / CSBP kinase
US8012736B2 (en) Multi plasmid system for the production of influenza virus
NZ536260A (en) Development of a multi-plasmid pol I - pol II based system for the generation of infectious influenza RNA viruses from cloned DNA
CA2712368A1 (en) Dna transfection system for the generation of infectious influenza virus
AU2012201931B2 (en) Multi-plasmid system for the production of influenza virus
CA2827114A1 (en) Multi plasmid system for the production of influenza virus

Legal Events

Date Code Title Description
RECP Rectifications of patent specification